CN111518800B - 一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用 - Google Patents

一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用，非淬灭型寡核苷酸满足以下条件：①与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段局部错配；②调整寡核苷酸探针长度；③在变异位点附近的特定位置进行修饰；④探针不标记荧光基团和淬灭基团；⑤探针3’末端进行修饰；⑥变异为单个或者多个碱基变异；⑦探针可单独或者联合使用。该探针在抑制野生型基因扩增与不影响变异型基因扩增上取得平衡，最大限定抑制野生型基因的扩增同时避免影响变异型基因的扩增，对变异型基因具有良好的富集效果。同时，还具有成本低，富集后的检测方式灵活性大以及效果稳定的优点。

Description

一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及 其应用
本申请要求2019年5月21日提交中国专利局、申请号为CN2019104222174、发明名称为“一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及基因检测领域，具体而言，涉及一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用。
背景技术
基因变异(mutation)是指遗传物质的变化及其引起的表型改变，包括点突变、缺失、重复、重排等。目前市场上已有多种技术可以用于检测和分析基因突变，例如ARMS-PCR(amplification refractory mutation system PCR)，NGS(next generationsequencing)，dd-PCR(droplet digital-PCR)等都可以从野生型中检测出突变型的序列，但均存在不足。其中，ARMS-PCR的检测灵敏度较低；NGS和dd-PCR的检测灵敏对较高，但dd-PCR和NGS具有检测成本高、设备昂贵，操作复杂，易污染，造成临床推广困难等缺陷。另外，目前的基因检测试剂往往都是针对血清和组织样本进行检测，缺乏能够兼容循环肿瘤细胞(CTC)样本检测的试剂或试剂盒。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供靶向扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针、试剂和/或试剂盒、混合反应体系、扩增方法及其应用，其中，所述探针在扩增反应过程中能够持续、有效地阻断野生型基因片段扩增，却对变异型基因片段基本无影响，从而实现变异型基因片段的有效富集，有利于检测基因变异，尤其是低频率基因变异，具有检测灵敏高、操作简单、成本低、性价比高的优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针，其中，(1)所述非淬灭型寡核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段在变异位置处发生错配；
(2)所述非淬灭型寡核苷酸探针的长度为24～50bp长，其中在变异位置及其两侧1～5bp范围内，至少有1～6个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性，优选地，所述修饰为锁核酸修饰或者肽核酸修饰；所述非淬灭型寡核苷酸探针的3’末端经过修饰以阻断探针在扩增过程中延伸，优选地，所述修饰为双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰；
(3)所述非淬灭型寡核酸探针在退火时可结合野生型靶基因片段和变异型靶基因片段，在延伸时仅结合野生型靶基因片段。
本发明设计前述非淬灭型寡核苷酸探针，满足以下条件：①与野生型靶基因片段完全互补配对，与变异型靶基因片段错配；②调整寡核苷酸探针长度；③在特定位置进行修饰以增强探针与互补连的热稳定性。使得该探针在退火状态下能够以高结合力与野生型模板结合，以低结合力与变异型模板结合，而在延伸状态下，仅与野生型模板结合，从而在抑制野生型基因片段扩增与不影响变异基因片段扩增上取得平衡，最大限定抑制野生型基因片段的扩增同时避免对影响变异型基因片段的扩增。
本发明前述探针还满足以下条件：④所述探针为非淬灭型寡核苷酸探针；⑤探针3’末端受双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰等。与一般的荧光淬灭型探针相比，本发明所述非淬灭型寡核苷酸探针具有成本低，富集后的检测方式灵活性大以及效果稳定的优点。具体而言，首先，该探针不需荧光基团和淬灭基团的标记修饰，降低探针成本。其次，本发明所述非淬灭型寡核苷酸探针的应用范围广，适合各种不同平台。例如，所述非淬灭型寡核苷酸探针在PCR扩增阶段可与双链DNA染料(例如SYBR Green或者EvaGreen)配合使用，获得变异基因检测结果；或者，扩增富集后的PCR产物可直接用于测序；或者，使用其他低灵敏度基因变异检测试剂盒对富集样品进行检测。最后，本发明所述探针的3’末端受双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰等，可避免探针3’端在扩增过程中延伸，防止探针由于长度增加而Tm升高，对变异型基因的扩增产生抑制作用。
在一些具体的实施方式中，所述探针的长度为24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp、30bp、31bp、32bp、33bp、34bp、35bp、36bp、37bp、38bp、39bp、40bp、41bp、42bp、43bp、44bp、45bp、46bp、47bp、48bp、49bp或50bp；优选地，所述探针的长度为24bp、28bp、30bp、32bp、33bp、43bp、48bp或49bp。
在一些具体的实施方式中，所述变异包括单个碱基变异或者多个碱基变异。
优选地，所述单个碱基变异包括EGFR-T790M、EGFR-L858R、K-ras、ESR1-D538G、PIK3CA-E542K、PIK3CA-E545K、PIK3CA-H1047R、PIK3CA-H1047L或Braf-V600E；
优选地，所述多个碱基变异包括EGFR-19Del；。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增EGFR-T790M变异的探针1、探针2或探针3；所述探针1的核苷酸序列为TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC(SEQ ID NO：1)，所述探针2的核苷酸序列为GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT(SEQ ID NO：2)，所述探针3的核苷酸序列为GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT(SEQ ID NO：3)，其中，所述探针1、探针2或探针3中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定的核苷酸。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增K-ras变异的探针4或探针5；所述探针4的核苷酸序列为GGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG(SEQ ID NO：4)，所述探针5的核苷酸序列为TGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTG(SEQ ID NO：5)，其中，所述探针4或探针5中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增EGFR-L858R变异的探针6或探针7；所述探针6的核苷酸序列为CACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTG(SEQID NO：6)，所述探针7的核苷酸序列为ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGG(SEQ ID NO：7)，其中，所述探针6或探针7中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增EGFR-19Del缺失变异的探针8或探针9；所述探针8的核苷酸序列为GCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACA(SEQ ID NO：8)，所述探针9的核苷酸序列为GTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGG(SEQ ID NO：9)，其中所述探针8或探针9中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增ESR1-D538G变异的探针18；所述探针18的核苷酸序列为GTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATG(SEQ ID NO:26)，其中所述探针18中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰优选为经过LNA修饰。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异的探针19；所述探针19的核苷酸序列为CTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGG(SEQ ID NO.27)，其中所述探针19中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰优选为经过LNA修饰。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异的探针20；所述探针20的核苷酸序列为AACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAA(SEQ ID NO.28)，其中所述探针20中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰优选为经过LNA修饰。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增Braf-V600E变异的探针21；所述探针21的核苷酸序列为GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGG(SEQ ID NO.29)，其中所述探针21中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰优选为经过LNA修饰。
奥希替尼已知的耐药机制包括EGFR基因本身的再次突变(在靶On Target突变)、其他基因突变(靶外Off Target突变)、病理类型转化等。BRAF突变与多种癌症有关。比如黑色素瘤、淋巴瘤、甲状腺癌和非小细胞肺癌等癌症中都有，其中在非小细胞肺癌(鳞癌和腺癌中都有)患者中发生率约有1-3％，其中约50％的患者是在V600E位点；BRAF导致的非小细胞肺癌中，非亚裔的吸烟群体发病率更高一些。除了造成三代TKI耐药，也有研究表明部分KRAS基因野生型患者对帕尼单抗单药治疗效果不理想，与其下游基因——BRAF的突变有关。通过应用BRAF抑制剂(索拉非尼和多吉美)患者可恢复对西妥昔单抗或帕尼单抗的敏感性。同时BRAF基因突变往往是预后不良的指标。
PIK3CA基因突变常见于肝癌(约36％)，乳腺癌(约26％)，结直肠癌(9％)等癌种，常见的突变包括第九外显子的E542K，E545K和E545D突变，以及20外显子的H1047R，H1047L等突变。PI3K基因作为EGFR下游信号分子被激活时，可导致肿瘤细胞对EGFR-TKI药物耐药，例如PIK3CA基因突变可导致西妥昔单抗，帕尼单抗对转移性结直肠癌治疗的耐药，导致吉非替尼，厄洛替尼对NSCLC和食道癌晚期患者的治疗耐药。同时PIK3CA突变对于乳腺癌个体化靶向药物曲妥珠单抗治疗无效，而野生型治疗有效。
雌激素受体包括雌激素受体α和雌激素受体β两种亚型，其中雌激素受体α蛋白由ESR1基因编码，与乳腺癌的发生、发展密切相关。ESR1突变引起的非配体依赖通路激活是AI内分泌耐药的重要原因，主要突变热点Y537S与D583G，在未接受过治疗的原发乳腺癌患者中十分少见，突变率仅为3％，但在晚期乳腺癌患者尤其是曾接受过芳香酶抑制药治疗的患者中ESR1突变比例升高，3期临床研究PALOMA3中，ESR1突变率在既往内分泌治疗进展的患者和曾接受过芳香酶抑制药治疗的患者中分别为25％和29％。SoFFA研究中，ESR1突变率在芳香酶抑制药治疗敏感的患者中约为39％。对于ER阳性且ESR1突变的MBC患者，可选择阿培利西与内分泌治疗药氟维司群联合使用以及单药或联合疗法等治疗方案。
检测EGFR-T790M、K-ras、EGFR-L858R、EGFR-19Del、ESR1-D538G、PIK3CA-E542K、PIK3CA-E545K、PIK3CA-H1047R、PIK3CA-H1047L和Braf-V600E的突变状态对癌症靶向治疗具有重要意义，检测EGFR-T790M、K-ras、EGFR-L858R和EGFR-19Del，PIK3CA-E542K,PIK3CA-E545K，PIK3CA-H1047L，PIK3CA-H1047R,Braf-V600E的突变状态尤其是对肺癌患者使用酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物的靶向治疗具有重要意义。本发明设计优化并获得前述非淬灭型寡核苷酸探针，用于扩增EGFR-T790M、K-ras、EGFR-L858R、EGFR-19Del、ESR1-D538G、PIK3CA-E542K、PIK3CA-E545K、PIK3CA-H1047R、PIK3CA-H1047L和Braf-V600E变异基因，上述探针能有效地抑制野生型基因的扩增而基本不影响变异型基因的扩增，从而可高效地对前述变异基因进行富集，适合多变异位点(K-ras)、低变异率、低丰度的样本。然而，值得注意的是，本发明在优化过程中发现，探针长度以及锁核酸的修饰位置对非淬灭型寡核苷酸探针的效果存在显著影响。以EGFR-T790M为例，探针1与探针3的锁核酸修饰位置相同，探针长度不同，尽管都能够抑制野生型基因的扩增，但探针1的抑制作用显著优于探针3。以K-ras为例，探针4与探针5的长度基本相当，锁核酸修饰位置不同，二者均对野生型K-ras表现出阻断效果，但探针4对G12V和G13D均无扩增抑制作用，而探针5抑制G13D的扩增。
本发明还涉及：一种用于扩增变异型靶基因片段的试剂和/或试剂盒，所述试剂和/或试剂盒包括前述的非淬灭型寡核苷酸探针、其他扩增试剂和/或扩增耗材。
在一些具体的实施方式中，所述非淬灭型寡核苷酸探针为一条或多条，优选地，多条寡核苷酸探针针对同一变异型靶基因，或者不同变异型靶基因。
在一些具体的实施方式中，所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者所述探针与所述其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供。
在一些具体的实施方式中，所述其他扩增试剂包括引物对、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、无菌水和双链DNA染料中的一种或多种；进一步可选地，所述其他扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者所述其他扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供。
在一些具体的实施方式中，所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和下游引物组成，所述引物对与所述非淬灭型寡核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或者部分重叠；进一步可选地，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1:0.75～1.25，优选为1:1。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增EGFR-T790M变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：CATGCGAAGCCACACTGAC(SEQ ID NO：10)和GTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGG(SEQ ID NO：11)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增K-ras变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：AAGCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAAT(SEQ ID NO：12)和GTTGGATCATATTCGTCCACAA(SEQ ID NO：13)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增EGFR-L858R变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：TACTTGGAGGACCGTCGCTT(SEQ ID NO：14)和GCTGACCTAAAGCCACCTCCTTA(SEQ ID NO：15)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增EGFR-19Del缺失变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATA(SEQ ID NO：16)和GCCAGACATGAGAAAAGGT(SEQ ID NO：17)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增ESR1-D538G变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-538:CAGTAACAAAGGCATGGAGCAT(SEQ ID NO.30)和RP-538：CCCTCCACGGCTAGTGGG(SEQ ID NO：31)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-542：AATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA(SEQ ID NO.32)和RP-542：TTAGCACTTACCTGTGACTCCAT(SEQID NO.33)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-1047：TCGAAAGACCCTAGCCTTAGAT(SEQ ID NO.34)和RP-1047：TTGTGTGGAAGATCCAATCCAT(SEQ IDNO.35)。
在一些具体的实施方式中，所述试剂和/或试剂盒用于扩增Braf-V600E变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-600：TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGT(SEQ ID NO.36)和RP-600：AGCCTCAATTCTTACCATCCACA(SEQ ID NO.37)。
本发明所述方法进一步限定在扩增EGFR-T790M、K-ras、EGFR-L858R、EGFR-19Del、ESR1-D538G、PIK3CA-E542K、PIK3CA-E545K、PIK3CA-H1047R、PIK3CA-H1047L和Braf-V600E变异基因时与所述寡核苷酸探针配合使用的引物对，所述引物对的扩增片段覆盖靶基因的变异位置，且具有特异性好，无非特异性扩增和引物二聚体等优点。
本发明还涉及：用于扩增变异型靶基因片段的混合反应体系，所述混合反应体系包括前述试剂和待测样本；可选地，所述待测样本为低拷贝数样本或低变异频率样本，优选地，所述低拷贝数为800～20000个拷贝，例如，1000个拷贝，4000个拷贝，8000个拷贝或者16000个拷贝，所述低变异频率为0.03％～5％变异率，例如0.05％变异率、0.075％变异率、0.1％变异率、0.15％变异率、0.25％变异率、0.3％变异率、0.5％变异率、1％变异率、1.2％变异率或者4％变异率；
可选地，所述待测样本为低拷贝数且低变异率样本；优选地，所述低拷贝数为800～20000个拷贝，例如，1000个拷贝，4000个拷贝，8000个拷贝或者16000个拷贝，所述低变异频率为0.03％～5％变异率，例如0.05％变异率、0.075％变异率、0.1％变异率、0.15％变异率、0.25％变异率、0.3％变异率、0.5％变异率、1％变异率、1.2％变异率或者4％变异率；更优选地，所述低拷贝数为800～1200个拷贝(例如1000个拷贝)，所述低变异频率为0.3％～5％，(例如0.4％、1.2％或4％)；或者，所述低拷贝数为3000～5000个拷贝(例如4000个拷贝)，所述低变异频率为0.075％～1.25％(例如，0.1％、0.3％或1％)；或者，所述低拷贝数为7000～9000个拷贝数(例如，8000个拷贝数)，所述低变异频率为0.03％～1％，例如(0.05％、0.15％或者0.5％)；或者，所述低拷贝数为15000～17000个拷贝数(例如，6000个拷贝)1，所述低变异频率为0.05％～0.3％，(例如，0.075％或者0.25％)。
在一些具体的实施方式中，样本的野生型基因拷贝数为1000-16000个拷贝数，突变型基因为12-40个拷贝数。
本发明还涉及：一种用于扩增变异型靶基因片段的方法，所述方法包括以下步骤：(1)配制前述混合反应体系；(2)进行PCR反应，所述PCR反应包括变性、退火和延伸；其中，退火时，非淬灭型寡核苷酸探针与野生型靶基因片段和变异型靶基因片段结合；延伸时，所述非淬灭型寡核苷酸探针仅与野生型靶基因片段结合。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增EGFR-T790M变异基因片段，所述非淬灭型核苷酸探针为探针1、探针2或探针3；所述探针1～3的退火温度优选为56℃～60℃，更优选为56.5℃～57.5℃，最优选为57℃；延伸温度优选为66℃～69℃，更优选为67.5～68.5℃，最优选为68℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增K-ras变异基因片段，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针4，退火温度优选为61℃～63℃，更优选为61.5℃～62.5℃，最优选为62℃，延伸温度优选为71℃～73℃，更优选为71.5℃～72.5℃，最优选为72℃；或者，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针5，退火温度优选为65℃～67℃，更优选为65.5℃～66.5℃，最优选为66℃，延伸温度优选为67℃～69℃，更优选为67.5℃～68.5℃，最优选为68℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增EGFR-L858R变异，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针6或探针7，所述探针6～7的退火温度优选为58℃～61℃，更优选为59.5℃～60.5℃，最优选为60℃，延伸温度优选为67℃～70℃，更优选为68.5℃～69.5℃，最优选为69℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增EGFR-19-Del，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针8或探针9，所述探针8～9的退火温度优选为59℃～61℃，更优选为59.5℃～60.5℃，最优选为60℃，延伸温度优选为65℃～68℃，更优选为65.5℃～66.5℃，最优选为66℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增ESR1-D538G变异，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针18，所述探针18的退火温度优选为56℃～60℃，更优选为56.5℃～57.5℃，最优选为57℃；延伸温度优选为66℃～70℃，更优选为67～69℃，最优选为68℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针19，所述探针的退火温度优选为56℃～60℃，更优选为56.5℃～57.5℃，最优选为57℃；延伸温度优选为56℃～60℃，更优选为56℃～58℃，最优选为56℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针20；所述探针的退火温度优选为56℃～60℃，更优选为56.5℃～57.5℃，最优选为57℃；延伸温度优选为60℃～68℃，更优选为60℃～65℃，最优选为62℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法用于扩增Braf-V600E变异，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针21；所述探针的退火温度优选为56～60℃，更优选为56～58℃，最优选为56℃；延伸温度优选为58℃～62℃，更优选为59℃～61℃，最优选为60℃。
在一些具体的实施方式中，所述方法的检测样品为血液、体液、组织、循环肿瘤细胞、cfDNA或者胎儿早检样本。
在一些具体的实施方式中，所述胎儿早检样本选自孕妇血液、绒毛穿刺样本或羊水穿刺样本。
在一些具体的实施方式中，所述方法为非诊断目的。
本发明还涉及：前述寡核苷酸探针、前述试剂和/或试剂盒、前述混合反应体系或前述方法在靶基因变异的检测或富集中的应用，优选地，所述富集为测序前的建库。
术语定义
本发明所述“匹配”，是指二者的核苷酸序列相同，或者满足反向互补配对。
本发明所述“非淬灭型寡核苷酸探针”是指所述探针未标记荧光基团和淬灭基团。
本发明所述变异包括但不限于点突变、缺失突变、移码突变和插入突变。
本发明所述探针1、Ins、BL27为同一探针；探针2和BL26为同一探针；探针3和BL28为同一探针；探针4与K-ras-bock-36为同一探针；探针6与L8-BL3为同一探针；探针7与L8-BL4为同一探针；探针8与19D-BL1为同一探针；探针9与19D-BL2为同一探针；探针16与Blocker1为同一探针；探针17与Blocker2为同一探针；探针18和BL1-538为同一探针；探针19和BL1-542为同一探针；探针20和BL1-1047为同一探针；探针21和BL1-600为同一探针。
有益效果
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供用于靶向扩增含单碱基变异或多碱基变异的的靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针、试剂和/试剂盒、混合反应体系、扩增方法以及应用，其中，所述寡核苷酸探针在抑制野生型基因扩增与避免抑制变异型基因的扩增上取得平衡，最大限定抑制野生型基因的扩增，同时避免影响变异型基因的扩增，起到变异型基因富集效率高和检测灵敏度好的作用，尤其适合丰度低的样本，例如CTC细胞，或者低变异率的样本(例如变异率为0.05-0.5％的样本)。
(2)本发明所述探针为非淬灭型寡核苷酸探针，其不标记荧光基团和/或淬灭基团，且3’末端受双脱氧修饰、氨基修饰或磷酸化修饰等，具有成本低，富集后的检测方式灵活性大以及效果稳定的优点。
(3)针对EGFR-T790M、K-ras、EGFR-L858R、EGFR-19Del、ESR1-D538G、PIK3CA-E542K、PIK3CA-E545K、PIK3CA-H1047R、PIK3CA-H1047L和Braf-V600E变异基因，本发明设计和优化探针序列、引物对、延伸及退火温度，在低丰度样本或低变异率(例如0.1％变异率，甚至0.05％变异率)的样本中实现上述变异基因的富集和检测，可用于测序前的建库以及提高低灵敏度PCR试剂盒的检测限。通过使用本发明提供的试剂和/或试剂盒富集，可以阻断野生型模板的扩增，使得含有少量突变型模板的样本中模板大量富集，用于后续的Sanger测序分析，0.1％突变的样本经过建库后，可以被Sanger测序检出。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明所述寡核苷酸探针抑制野生型基因PCR扩增的原理示意图(EGFR-T790M为例)，其中抑制子即本发明所述寡核苷酸探针；
图2不同情况下(野生型样本或变异型样本、加入或不加入探针1、64℃/68℃/72℃/76℃)的PCR扩增结果，其中抑制子即实施例1所述探针1；
图3为实施例1所述探针1～3(即BL26/27/28)对EGFR-T790M野生型基因扩增的影响；
图4为实施例1所述探针1～3(即BL26/27/28)对EGFR-T790M变型基因扩增的影响，根据Ct值由小到大，曲线分别表示无探针对照(即无Block对照)、BL26(即，探针2)、BL27(即，探针1)和BL28(即，探针3)；
图5为不同变异率以及不同拷贝数的EGFR-T790M模板的PCR产物的测序结果(实施例1)；
图6为探针1(即BL27)对CTC回收样本的扩增影响(实施例1)；
图7为探针10-12对EGFR-T790M野生型扩增结果的影响(实施例1)；
图8为探针10-12对EGFR-T790M变异型扩增结果的影响(实施例1)；
图9为探针4(即Kras-block-36)对野生型K-ras基因扩增结果的影响(实施例2)；
图10为探针4(即Kras-block-36)对变异型K-ras基因(G12V)扩增结果的影响(实施例2)；
图11为探针4即Kras-block-36)对变异型K-ras基因(G13D)扩增结果的影响(实施例2)；
图12为72℃延伸条件下，野生型K-ras基因的扩增结果(实施例2)；
图13为73℃延伸条件下，野生型K-ras基因的扩增结果(实施例2)；
图14为73℃延伸条件下，变异型K-ras基因(G12V)的扩增结果(实施例2)；
图15为73℃延伸条件下，变异型K-ras基因(G12V)的扩增结果(实施例2)；
图16为72℃延伸条件下，变异型K-ras基因(G13D)的扩增结果(实施例2)；
图17为73℃延伸条件下，变异型K-ras基因(G13D)的扩增结果(实施例2)；
图18为荧光PCR对经富集后的K-ras基因变异样本(变异率为0.5％)的扩增结果(实施例2)；
图19为荧光PCR对经富集后的K-ras基因变异样本(变异率为0.5％)的Ct值数据(实施例2)；
图20为荧光PCR对经富集后的K-ras基因变异样本(变异率为0.25％)的扩增结果(实施例2)；
图21为荧光PCR对经富集后的K-ras基因变异样本(变异率为0.25％)的Ct值数据(实施例2)；
图22为不同拷贝数的质粒S009的PCR扩增结果(实施例2)；
图23为标准曲线图(实施例2)；
图24为探针13～15对野生型K-ras基因的阻断效果(实施例2)；
图25为探针5对野生型K-ras基因的阻断效果(实施例2)；
图26为探针5对变异型G12V的阻断效果(实施例2)；
图27为探针5对变异型G13D的阻断效果(实施例2)；
图28为探针6(即L8-BL3)和探针13(L8-BL4)对野生型EGFR-L858R基因的阻断效果(实施例3)；
图29为探针6(即L8-BL3)和探针13(L8-BL4)对变异型EGFR-L858R基因的阻断效果(实施例3)；
图30为探针7(L8-BL4)在反应条件优化后对变异型EGFR-L858R基因的阻断效果(实施例3)；
图31为EGFR-L858R野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例3)；
图32为变异率为0.1％的EGFR-L858R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例3)；
图33为变异率为0.2％的EGFR-L858R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例3)；
图34为变异率为0.5％的EGFR-L858R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例3)；
图35为变异率为1％的EGFR-L858R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例3)；
图36为探针16～17(即Bloker1和Blocker2)对EGFR-L858R野生型模板的扩增影响(实施例3)；
图37为探针16～17(即Bloker1和Blocker2)对EGFR-L858R变异型模板的扩增影响(实施例3)；
图38为探针8～9(即19D-BL1、19D-BL2)对EGFR-19Del野生型模板的扩增影响(实施例4)；
图39为探针8～9(即19D-BL1、19D-BL2)对EGFR-19Del变异型模板的扩增影响(实施例4)；
图40为EGFR-19Del野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图41为变异率为0.1％的EGFR-19Del变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图42为变异率为0.2％的EGFR-19Del变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图43为变异率为0.5％的EGFR-19Del变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图44为变异率为1％的EGFR-19Del变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图45为探针18(即BL1-538)对野生型ESR1-D538G基因的阻断效果(实施例5)；
图46为探针18(即BL1-538)对变异型ESR1-D538G基因的阻断效果(实施例5)；
图47为ESR1-D538G野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例5)；
图48为变异率为0.5％的ESR1-D538G变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图49为变异率为0.2％的ESR1-D538G变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图50为变异率为0.1％的ESR1-D538G变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例4)；
图51为探针19(即BL1-542)对野生型PIK3CA基因的阻断效果(实施例6)；
图52为探针19(即BL1-542)对变异型PIK3CA-E545K基因的阻断效果(实施例6)；
图53为探针19(即BL1-542)对变异型PIK3CA-E542K基因的阻断效果(实施例6)；
图54为PIK3CA-E545K野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图55为变异率为0.5％的PIK3CA-E545K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图56为变异率为0.2％的PIK3CA-E545K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图57为变异率为0.1％的PIK3CA-E545K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图58为PIK3CA-E542K野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图59为变异率为0.5％的PIK3CA-E542K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图60为变异率为0.2％的PIK3CA-E542K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图61为变异率为0.1％的PIK3CA-E542K变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例6)；
图62为探针20(即BL1-1047)对野生型PIK3CA基因的阻断效果(实施例7)；
图63为探针20(即BL1-1047)对变异型PIK3CA-H1047R基因的阻断效果(实施例7)；
图64为探针20(即BL1-1047)对变异型PIK3CA-H1047L基因的阻断效果(实施例7)；
图65为PIK3CA-H1047R/L野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图66为变异率为0.5％的PIK3CA-H1047R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图67为变异率为0.2％的PIK3CA-H1047R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图68为变异率为0.1％的PIK3CA-H1047R变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图69为变异率为0.5％的PIK3CA-H1047L变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图70为变异率为0.2％的PIK3CA-H1047L变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图71为变异率为0.1％的PIK3CA-H1047L变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例7)；
图72为探针21(即BL1-600)对野生型Braf-V600E基因的阻断效果(实施例8)；
图73为探针21(即BL1-600)对变异型Braf-V600E基因的阻断效果(实施例8)；
图74为Braf-V600E野生型模板的PCR产物的测序结果(实施例8)；
图75为变异率为0.5％的Braf-V600E变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例8)；
图76为变异率为0.2％的Braf-V600E变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例8)；
图77为变异率为0.1％的Braf-V600E变异型模板的PCR产物的测序结果(实施例8)；
图78为BL2-538对野生型ESR1-D538G基因的阻断效果(对比例)；
图79为BL2-538对变异型ESR1-D538G基因的阻断效果(对比例)；
图80为变异率为0.5％的ESR1-D538G变异型模板的PCR产物的测序结果(对比例)；
图81为BL2-542对野生型PIK3CA基因的阻断效果(对比例)；
图82为BL2-542对变异型PIK3CA-E542K基因的阻断效果(对比例)；
图83为BL2-542对变异型PIK3CA-E545K基因的阻断效果(对比例)；
图84为BL2-1047对野生型PIK3CA-H1047R/L基因的阻断效果(对比例)；
图85为BL2-1047对变异型PIK3CA-H1047R基因的阻断效果(对比例)；
图86为BL2-1047对变异型PIK3CA-H1047L基因的阻断效果(对比例)；
图87为探针Blocker BL2-600对野生型Braf-V600E基因的阻断效果(对比例)；
图88为探针Blocker BL2-600对变异型Braf-V600E基因的阻断效果(对比例)。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。
实施例1EGFR-T790M
1.设计用于扩增EGFR-T790M变异基因的寡核苷酸探针，命名为探针1(又名Inhibitor Sequence,InS，或BL27)以及上游引物(FP)和下游引物(RP)。探针1的工作原理如图1所示：(I)LNA修饰的寡核苷酸与变异型出现错配，在低温退火时与模板链可以结合，但是错配使得结合不牢固。延伸阶段升温至一定温度时，寡核苷酸探针与变异模板链分离，因此变异DNA序列正常扩增；(II)LNA修饰的寡核苷酸酸探针与野生型序列完全匹配，在低温退火时与模板链牢固结合，即使延伸阶段升温至68℃时，寡核苷酸探针与模板链仍然无法分离，因此野生型DNA序列扩增受到抑制。
探针1具体核苷酸信息：
5'-TCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCC-3'(SEQ ID NO：1)，其中，下划线核苷酸经锁核酸修饰，3’末端经双脱氧修饰。
上游引物：5’-CATGCGAAGCCACACTGAC-3’(SEQ ID NO：10)；下游引物：5’-GTCTTTGTGTTCCCGGACATAGTCCAGG-3’(SEQ ID NO：11)。
2.检测探针1在不同情况下对EGFR-T790M变异基因的扩增效果的影响，包括以下步骤：
(1)模板提取：提取的EGFR-T790M变异型细胞系NCl-H1975细胞DNA，浓度7ng/μL，作为模板。提取的野生型健康人白细胞(WBC)DNA，浓度7ng/μL，作为模板。
(2)配制PCR反应体系：①+InS反应体系：2×PCR Multi Premix用量为25μL、5U/μLTaq酶用量为2μL、10μM上游引物用量为1.2μL、10μM下游引物用量为1.2μL、10μM探针1用量为1.2μL、20×EvaGreen用量为5μL、水用量为9.4μL和DNA模板用量为5μL。
②-Ins反应体系：2×PCR buffer Multi Premix用量为25μL、5U/μLTaq酶用量为2μL、10μM上游引物用量为1.2μL、10μM下游引物用量为1.2μL、20×EvaGreen用量为5μL、水用量为10.6μL和DNA模板用量为5μL。
(3)PCR反应程序：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，57℃，45sec；延伸(收集荧光信号)64/68/72/76℃，30sec；共计40个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
(4)结果分析：PCR反应过程的荧光信号如图2所示。根据图2所示结果可知：
①在反应体系中加入探针1，当延伸温度为64、68℃，探针1与野生型模板链结合，野生型DNA扩增受到抑制；当延伸温度为72℃、76℃时，探针1与野生型模板链解链，无法抑制野生型DNA序列的扩增，且温度越高，探针1与模板链解链程度越彻底。
②探针1在低温退火时也可以与变异型模板链结合，但是在延伸阶段温度升高至64℃时，探针与变异型模板链部分解链；延伸温度升高至68℃及以上时，抑制子与变异型模板完全解链，温度越高解链越彻底，变异型DNA得到扩增。
③综上所述，在延伸温度为68℃左右时，可以有效抑制野生型扩增，且基本不影响变异型扩增，因此选择延伸温度68℃为最佳延伸温度。
3、设计同类的寡核苷酸探针2～3(与探针1类似，长度相当，均受锁核酸修饰，且3’末端受双脱氧修饰)，寡核苷酸探针2～3的具体核酸信息如下所示：
探针2(又名BL26)：GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT(SEQ ID NO：2)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰。
探针3(又名BL28)：GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT(SEQ ID NO：3)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰。
4、检测探针1～3对EGFR-T790M变异基因的扩增效果，包括以下步骤：
(1)模板提取：提取的EGFR-T790M变异型细胞系NCl-H1975细胞DNA作为变异型模板。提取的野生型健康人白细胞(WBC)DNA作为野生型模板。
(2)配制PCR反应体系：2×PCR Multi Premix用量为12.5μL、SYBR Green用量为0.75μL、5U/μL Taq酶用量为0.8μL、10×Primer Mix(2.5μM)用量为2.5μL、DNA模板(7ng/μL)用量为2.5μL、水用量为3.45μL、1μM探针1/2/3的用量为2.5μL(注，加入与探针相同体积的水作为不加探针的对照组)。
(3)PCR反应程序：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，57℃，45sec；延伸(收集荧光信号)64/68/72/76℃，30sec；共计40个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
(4)扩增结果分析：图3-4为前述PCR反应过程中的荧光信号。根据图3所示结果可知，探针1～3均可以阻断野生型基因的扩增，以探针1的阻断效果最优。根据图4所示结果可知，探针1～3对变异型基因的扩增影响较小。
5、检测探针1对不同拷贝数、不同比例的EGFR-T790M基因变异样本的扩增影响，具体包括以下步骤：
(1)样本制备：EGFR-T790M突变型细胞系NCI-H1975 DNA，浓度100拷贝/μL，命名为C1；EGFR-T790M野生型细胞系HEK293T DNA，浓度1×105拷贝/μL，命名为D1；以上拷贝数均经过数字PCR仪(型号：Bio-Rad QX200)验证。按照下表配制测试样本：
表1
Figure BDA0002493205930000101
Figure BDA0002493205930000111
(2)配制PCR反应体系并设置PCR反应程序：2×PCR Multi Premix用量为25μL、20×Evagreen用量为5μL、5U/μL Taq酶用量为2μL、上游引物(10μM)用量为3μL、下游引物(10μM)用量为3μL、DNA模板用量为2μL、NF-水用量为4μL、10μM探针1的用量为6μL。
(3)PCR反应程序：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，57℃，45sec；延伸(收集荧光信号)68，30sec；共计40个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
(4)对PCR反应结果进行Sanger测序，具体测序结果如图5所示。根据图5所示Sanger测序结果可知，EGFR c.2369C>T(T790M)野生型从1000-16000个拷贝，本方法均可以保证结果为野生型，即EGFR c.2369处为野生型碱基“C”。当突变型为4个拷贝，野生型为1000到8000个拷贝时，本方法可以检测出EGFR c.2369处为T/C碱基共存状态的阳性；野生型扩大到16000拷贝，测序已经无法测到突变型信息，仅能得到野生型碱基“C”；当突变型扩大到12-40个拷贝，野生型背景从1000-16000拷贝，依然可以检测出阳性，且为单突变碱基“T”。综上所述，本方法可以检测出4个突变拷贝，8000拷贝野生型背景下的突变频率，即为0.05％突变频率。
6、检测探针1对CTC回收细胞样本的扩增影响，具体包括以下步骤：
(1)样本制备：在正常人的血液中加入200个SKBR-3细胞或200个NCI-H1975细胞，使用循环肿瘤细胞分离富集系统对样本进行富集，洗脱芯片中捕获的细胞，获得从血液中回收的SKBR-3细胞和NCI-H1975细胞，用细胞裂解液试剂盒对回收到的细胞进行裂解，分别作为野生型样本和变异型样本。
(2)配制PCR反应体系：2×PCR Multi Primix用量为12.5μL、SYBR Green用量为0.75μL、5U/μL Taq酶用量为0.8μL、10μM上游引物的用量为0.625μL、10μM下游引物的用量为0.625μL、裂解后的DNA样本用量为6.5μL、水用量为0.7μL、1μM探针1的用量为2.5μL(注，加入与探针相同体积的水作为不加探针的对照组)。
(3)设置PCR反应程序：参见本实施例第4小节，延伸温度选择68℃。
(4)扩增结果分析：PCR反应过程的信号如图6所示。根据图6所示结果可知，对于CTC样本，探针1可以阻断野生型模板的扩增，对变异型的影响不大，可以正常扩增，从而实现对变异型基因的富集。
7、检测探针1对变异产物的富集以及后续PCR试剂盒(EGFR-T790M变异型)的检测效率的影响，具体包括：
(1)制备变异富集产物：使用健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，NCI-H1975细胞提取的DNA作为变异型模板，配制不同变异比例的样本，样本信息如表2所示。
表2
Figure BDA0002493205930000112
Figure BDA0002493205930000121
(2))配制PCR反应体系：2×PCR Multi Premix用量为12.5μL、Taq酶用量为0.8μL(5U/μL)、10×Primer Mix(2.5μM)的用量为2.5μL、DNA模板(样本量：7ng/μL；5％变异样本，0.5％变异样本和野生型样本)用量为2.5μL、水用量为4.2μL、1μM探针1的用量为2.5μL；对于0.1％变异样本的用量为5μL、水用量为1.7μL、1μM探针1的用量为2.5μL。
(3)设置PCR反应程序：参见本实施例第4小节，延伸温度选择68℃，变性、退火和延伸的循环数设置为15个，PCR反应结束后的产物即为富集产物。
(4)评价富集产物对PCR试剂盒检测效率的影响：以10％变异的样本模拟血浆cfDNA样本，在该样本中添加3μL的富集产物，作为待测样本。使用江苏为真生物医药技术股份有限公司的EGFR基因变异检测试剂盒(荧光PCR)进行检测，其中样本信息如表3所示，检测结果如表4所示。根据表4所示结果可知，添加前述变异富集产物可以提高样本的CT值，表明低变异比例样本经过富集后，变异型基因比例显著提高，从而提高PCR试剂盒的检测效率。
表3
Figure BDA0002493205930000122
表4
Figure BDA0002493205930000123
对比例
设计其他不同类的寡核苷酸探针10-12作为对比(与探针1相比，长度相当，但未受锁核酸修饰，3’末端修饰相同或不同)，并评价其对变异基因扩增效果的影响：
(1)寡核苷酸探针10-12的具体核酸信息如下所示：
探针10：5’-GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT-3’(SEQ ID NO：18)，其3’端T采用C3spacer修饰。
探针11：5’-GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT-3’(SEQ ID NO：19)，其3’端T的C7位置采用氨基修饰。
探针12：5’-GTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCT-3’(SEQ ID NO：20)，其3’端T采用双脱氧修饰。
(2)检测探针10-12对EGFR-T790M野生型、变异型DNA的扩增影响：采用由健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，NCI-H1975细胞提取的DNA作为变异型模板，进行PCR反应，评价所述寡核苷酸对野生型DNA的阻断效果。其中，实验分组信息如表5所示，PCR反应体系参见本实施例第4小节，PCR反应程序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，57℃，45sec；延伸(收集荧光信号)72℃，30sec；共计40个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。扩增结果如图7-8所示。根据图7-8所示结果可知，探针10-12无法阻断EGFR-T790M野生型DNA的扩增。
实施例2K-ras
1.设计用于扩增K-ras变异基因的寡核苷酸探针，命名为探针4(又名K-rasblock-36)以及上游引物(FP)和下游引物(RP)，并检测其对野生型、变异型K-ras基因扩增的影响。其中：
(1)探针4具体核苷酸信息：5'-GGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAG-3'(SEQ IDNO：4)，其中，下划线核苷酸经锁核酸修饰，3’末端经双脱氧修饰。
(2)上游引物：5’-AAGCGTCGATGGAGGAGTTTGTAAAT-3’(SEQ ID NO：12)；下游引物：5’-GTTGGATCATATTCGTCCACAA-3’(SEQ ID NO：13)。
(3)采用由NCI-H1975细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，由SW620，MDA-MB231细胞提取的DNA作为变异型模板，进行PCR扩增，检测所述阻断用寡核苷酸对野生型和变异型K-ras基因扩增的影响。其中，PCR扩增使用的反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.6μL、Taq酶，5U/μL用量为0.6μL、5μM上游引物用量为1μL、5μM下游引物用量为1μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL)用量为2μL、水用量为4.3μL、5μM探针4用量为0.5μL(注：加入相同体积的水作为不加探针4的对照组)。PCR反应程序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，62℃，30sec；延伸(收集荧光信号)72℃，45sec；共计35个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
野生型DNA模板和变异型DNA模板的扩增结果分别如图9-11所示。根据图9-11所示结果可知，本实施例所述阻断用寡核苷酸对野生型K-ras基因的扩增具有极好的阻断效果，而对两种变异型K-ras基因(G12V和G13D)的扩增无不良影响。
2、检测在不同延伸条件下，探针4对野生型、变异型K-ras基因扩增的影响：采用由NCI-H1975胞提取的DNA作为野生型DNA模板，由SW620，MDA-MB231细胞提取的DNA作为变异型模板，进行PCR扩增，检测探针4对野生型和变异型K-ras基因扩增的影响。其中，PCR扩增过程中探针4与引物的使用情况、PCR反应体系和PCR反应程序如本实施例第1小节所示，区别仅在于，本实施例不但检测延伸温度为72℃条件下的PCR扩增效果，还检测延伸温度为73℃下的PCR扩增效果，具体检测结果如图12-17所示。根据图12-17所述扩增结果可知，在72℃或73℃的延伸条件下，本实施例所述探针4均对野生型K-ras基因的扩增具有良好的阻断效果，而对变异型K-ras基因的扩增无不良影响或影响极小。
3、检测本实施例探针4对不同比例、类型的变异型K-ras基因的扩增效果的影响，包括：
(1)分别合成不同类型的第二外显子发生变异的Kras变异基因：G12D，G12A，G12V，G12C，G12S，G12R，G13D变异及野生型质粒，配制成变异比例为0.5％和0.25％的样本，进行以富集扩增变异型K-ras基因为目的的PCR反应，其中具体的PCR反应体系PCR扩增使用的反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.6μL、Taq酶，5U/μL用量为0.6μL、Primer Mix(40μM)用量为0.5μL、DNA模板(不同变异比例的样本)用量为2μL、水用量为5.8μL、20μM探针4(即K-ras block-36)用量为0.5μL。PCR反应程序参照本实施例第1小节，区别仅在于变性、退火和延伸的循环数为15个。
(2)PCR反应结束后，将富集产物稀释25倍，使用《人类K-ras基因七种变异检测试剂盒(荧光PCR法)》(武汉海吉力生物科技有限公司，检测限为1％)进行荧光PCR检测，其中，变异率为0.5％的样本的荧光PCR检测结果如图18-19所示，变异率为0.25％的样本的荧光PCR检测结果如图20-21所示。图18和图20展示部分扩增结果，图19和图21展示七种不同变异型K-ras基因的扩增结果。根据图20-21所示检测结果可知，本发明实施例1所述探针4能够对含微量变异(0.25％)的DNA模板进行富集扩增，扩增后的富集产物通过荧光PCR检测试剂盒可检测出低丰度的变异。
4、检测探针4以及上、下游引物在PCR反应体系中的扩增效率：
将含K-ras第二外显子G12D变异片段的质粒S009稀释至108拷贝/μL，107拷贝/μL，106拷贝/μL，105拷贝/μL，104拷贝/μL作为样本，进行PCR反应。其中，PCR反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.6μL、Taq酶，5U/μL用量为0.6μL、5μM上游引物用量为2μL、5μM下游引物用量为2μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL)用量为2μL、水用量为0.8μL、探针4(即K-ras block-36，5μM)用量为2μL(注：加入相同体积的水作为不加探针4的对照组)。PCR反应程序参照本实施例第1小节。扩增结果如图22所示。根据图22所示扩增结果，以样本拷贝数的log值为横坐标，扩增曲线Ct值为纵坐标制成如图23所示的标准曲线及其公式y＝-3.387x+34.882，R2＝0.9974。使用扩增效率公式：斜率＝-1/lg(1+e)，计算得扩增效率e＝1.972，对应百分比扩增效率为97.2％。
5、设计其他修饰类型的寡核苷酸探针(探针13～15)，并评价其对K-ras变异型基因和野生型基因的扩增影响，其中：
(1)探针13：5’-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’(SEQ ID NO：21)，其3’末端采用C3spacer修饰；
探针14：5’-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’(SEQ ID NO：22)，其3’末端的C7位置采用氨基修饰；
探针15：5’-GGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCC-3’(SEQ ID NO：23)，其3’末端采用双脱氧修饰。
(2)采用由NCI-H1975提取的DNA作为野生型DNA模板，由SW620，MDA-MB231细胞提取的DNA作为变异型模板，通过PCR反应评价探针13-15对K-ras野生型和变异型基因的扩增影响。其中实验分组见表5，PCR反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBRGreen用量为0.6μL、Taq酶，5U/μL用量为0.6μL、Primer Mix(5μM)用量为2μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL)用量为2μL、水用量为2.8μL、探针13/14/15(即K-ras block-1/K-ras block-2/K-ras block-3，5μM)用量为2μL(注：加入相同体积的水作为不加探针4的对照组)。PCR反应程序参见本实施例第1小节，但退火温度为58℃，延伸温度为72℃。
(3)探针13～15的具体检测结果见图24。根据图24所示检测结果可知，反应组1中变异型DNA与野生型DNA的扩增曲线重叠，无法将二者区分(红色)，同理，反应组2(绿色)、反应组3(黄色)和反应组(紫红色)也无法将变异型DNA与野生型DNA的扩增曲线区分。由此可见，探针13～15对野生型K-ras基因没有阻断效果。
表5分组信息
Figure BDA0002493205930000141
Figure BDA0002493205930000151
6、设计锁核酸修饰的其他寡核苷酸探针(探针5)，并评价其对K-ras变异型基因和野生型基因的扩增影响，其中：
(1)探针5：5’-TGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTG-3’(SEQ ID NO：5)，其中，带下划线核苷酸经锁核酸修饰，3’末端采用C3spacer修饰。
(2)采用由NCI-H1975提取的DNA作为野生型DNA模板，由SW620、MDA-MB231细胞提取的DNA作为变异型模板，加入探针5，进行PCR反应，检测所述探针5对扩增效率的影响。其中，分组信息如表6所示。PCR反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBRGreen用量为0.6μL、Taq酶，5U/μL用量为0.6μL、Primer Mix(5μM)用量为2μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL)用量为2μL、水用量为2.8μL、探针5(5μM)用量为2μL(注：加入相同体积的水作为不加探针4的对照组)。PCR反应程序参见本实施例第1小节，区别仅在于退火温度为66℃，延伸温度为68℃。
表6分组信息
分组 样本 是否含blocker
1 野生型样本 探针5
1 K-ras G12V变异样本 探针5
1 K-ras G13D变异样本 探针5
对照 野生型样本 无Block对照
对照 K-ras G12V变异样本 无Block对照
对照 K-ras G13D变异样本 无Block对照
(3)探针5对PCR反应的具体影响参见说明书图25-27。图25-27所示结果表明，探针5对野生型K-ras基因样本具有阻断效果(参见图25)，对变异型G12V无抑制作用，G12V样本能够正常扩增(参见图26)，但变异型G13D样本的扩增被阻断(参见图27)。
实施例3EGFR-L858R
1、设计用于扩增EGFR-L858R变异基因的寡核苷酸探针(命名为探针6和探针7)、上游引物和下游引物，并检测其对EGFR-L858变异型基因和野生型基因的扩增效果的影响，
(1)探针6(又名L8-BL3)：CACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTG(SEQ ID NO：6)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰；
探针7(又名L8-BL4)：ATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGG(SEQ ID NO：7)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰；
上游引物(5’-3’)：TACTTGGAGGACCGTCGCTT(SEQ ID NO：14)，下游引物(5’-3’)：GCTGACCTAAAGCCACCTCCTTA(SEQ ID NO：15)。
(2)采用由健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，NCI-H1975细胞提取的DNA作为变异型模板，检测探针6-7对EGFR-L858R变异型基因和野生型基因的扩增效果的影响。其中PCR反应体系如下所示：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.6μL、5U/μL Taq酶用量为0.4μL、10×Primer Mix(10μM)的用量为1μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL)用量为2μL、水用量为5.5μL、10μM探针6/7的用量为0.5μL(注，加入与探针相同体积的水作为不加探针的对照组)。PCR反应程序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，60℃，45sec；延伸(收集荧光信号)69℃，30sec；共计35个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
野生型模板的扩增结果如图28所示，变异型模板的扩增结果如图29所示。图28-29表明，探针6和探针7均可以阻断野生型基因的扩增，以探针7的阻断效果最优，探针6和探针7均对变异型的扩增影响均有一定的影响，探针7对变异型的扩增影响较小，但是仍有可优化的空间。对探针7进行反应条件优化后(延伸温度调整为66℃)，其对变异型模板的扩增结果如图30所示。
2、检测探针7在不同变异比例的样本中对变异型基因的富集效果：使用健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，NCI-H1975细胞提取的DNA作为变异型模板，配制不同变异比例的样本，样本信息如表7所示。PCR反应体系参见本实施例第1小节，PCR反应程序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，60℃，45sec；延伸(收集荧光信号)66℃，30sec；共计40个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。扩增产物送检，进行一代测序，检测结果如图31-35所示。图31-35显示，探针7能够对含微量变异(0.1％)的DNA模板进行富集扩增，可以通过一代测序可以检测出EGFR-L858R变异，虽然0.1％与0.2％的样本机器读取数据仍为T，但是G的强度随着变异浓度比例的升高而升高；野生型则为未检测出变异信息。
表7
样本 浓度0.07ng/μL NCI-H1975用量(μL) 浓度7ng/μL WBC用量(μL)
0.10％ 20 200
0.20％ 40 200
0.50％ 50 100
1％ 100 100
野生型 0 200
5、设计锁核酸修饰的其他寡核苷酸探针，命名为探针16-17，并评价探针16-17对变异型基因和野生型基因的扩增结果的影响，包括：
(1)探针16(又名Blocker1)：GATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGG(SEQ IDNO：24)；探针17(又名Blocker2)：GTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCG(SEQ IDNO：25)。
(2)采用由健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，NCI-H1975细胞提取的DNA作为变异型模板，通过PCR评价探针16-17对扩增结果的影响。其中PCR反应体系为：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.4μL、10×Primer Mix(10μM)的用量为1μL、DNA模板(7ng/μL,)用量为2μL、水用量为6.1μL、10μM探针16/17的用量为0.5μL(注，加入与探针相同体积的水作为不加探针的对照组)。PCR反应程序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，70℃20sec/60℃，35sec；延伸(收集荧光信号)70℃，30sec；共计35个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
(3)PCR反应的扩增曲线如图36-37所示。根据图36-37所示结果可知，探针16-17不但阻断野生型基因的扩增，同时还阻断变异型基因的扩增，特异性差，不适合作为探针使用。
实施例4 EGFR-19-Del
1.设计用于扩增EGFR-19-Del变异基因的寡核苷酸探针(探针8-9)、上游引物、下游引物并检测其对变异型基因和野生型基因的扩增结果的影响，包括：
(1)探针8(又名19D-BL1)：
GCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACA(SEQ ID NO：8)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰；
探针9(又名19D-BL2)：
GTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGG(SEQ ID NO：9)，下划线为锁核酸修饰，3’末端为双脱氧修饰。
上游引物(5’-3’)：ACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATA(SEQ ID NO：16)；下游引物(5’-3’)：GCCAGACATGAGAAAAGGT(SEQ ID NO：17)。
(2)采用由健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，HCC827细胞提取的DNA作为变异型模板，进行PCR反应，检测探针8-9对基因的扩增结果的影响。其中PCR反应体系：2×PCR Multi Premix用量为10μL、SYBR Green用量为0.6μL、5U/μL Taq酶用量为0.4μL、10×Primer Mix(10μM)的用量为1μL、DNA模板(野生型或变异型模板，7ng/μL,)用量为2μL、水用量为5.5μL、10μM探针8-9的用量为0.5μL(注，加入与探针相同体积的水作为不加探针的对照组)。PCR扩增测序如下所示：①热启动，95℃，5min，共计1个循环；②变性，95℃，30sec；退火，60℃，45sec；延伸(收集荧光信号)66℃，30sec；共计35个循环；③终延伸：72℃，7min，共计1个循环。
野生型基因的扩增结果如图38所示，表明：探针8-9均可以阻断野生型基因的扩增，以探针8的阻断效果最优。变异型基因的扩增结果如图39所示，表明：探针8-9均对变异型基因的扩增影响小。
(3)检测探针8在不同变异比例的样本中对变异型基因的富集效果：使用健康人白细胞提取的DNA作为野生型DNA模板，HCC827细胞提取的DNA作为变异型模板，配制不同变异比例的样本，样本信息如下，样本信息如表11所示。PCR反应体系参见本实施例第1小节，PCR反应程序参见本实施例第1小节，区别仅在于变性、退火和延伸的循环数为40个。扩增产物送检，进行一代测序，检测结果如图40-44所示。图40-44显示，探针8能够对含微量变异(0.1％)的DNA模板进行富集扩增，可以通过一代测序检测出变异型，而野生型则未检测出变异信息。
表11
Figure BDA0002493205930000171
实施例5ESR1-D538G
(1)BL1-538的阻断性能：
探针18(又名BL1-538)5’-GTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATG/3ddC/-3’(SEQ IDNO:26)，其中下划线核苷酸经LNA修饰，3’末端经双脱氧修饰。
PCR扩增引物为：FP-538:CAGTAACAAAGGCATGGAGCAT(SEQ ID NO.30)和RP-538：CCCTCCACGGCTAGTGGG(SEQ ID NO：31)。
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表12所示：
表12
Figure BDA0002493205930000172
Figure BDA0002493205930000181
按照表13表的配方配制体系：
表13
Figure BDA0002493205930000182
PCR程序如表14所示：
表14
Figure BDA0002493205930000183
结果如图45和图46所示，BL1-538阻断野生型模板的扩增，仅部分阻断突变型的扩增，且对突变型的阻断效果显著弱于对野生型的阻断效果。
(2)BL1-538对含0.5％，0.2％，0.1％突变混合模板的检测。使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表12所示。配制含0.5％，0.2％，0.1％突变模板的样本，按照表15配方配置反应体系：
表15
Figure BDA0002493205930000184
PCR程序如表16所示：
表16
Figure BDA0002493205930000185
Figure BDA0002493205930000191
产物送检，结果如图47～图50所示，图47为野生型样本，突变点测序为A，对应野生型序列；图48～50依次为ESR1-D538G 0.5％、0.2％、0.1％突变样本，突变点测序A>G，对应D538G突变型，加入BL1-538的反应体系，可有效富集低丰度突变样本中的突变信息，配合一代测序灵敏度可达0.1％。
实施例6PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异
(1)BL1-542的阻断性能
探针19(又名BL1-542)：5’-CTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGG/3ddC/-3’(SEQID NO.27)，其中下划线核苷酸经LNA修饰，3’末端经双脱氧修饰。
PCR扩增引物为：FP-542：AATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA(SEQ ID NO.32)和RP-542：TTAGCACTTACCTGTGACTCCAT(SEQ ID NO.33)。
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表17所示：
表17
名称 突变类型
质粒015 野生型(WT)
质粒016 突变型(E545K:G>A)
质粒017 突变型(E542K:G>A)
按照表18的配方配置体系：
表18
Figure BDA0002493205930000192
PCR程序如表19所示：
表19
Figure BDA0002493205930000193
结果如图51～图53所示，BL1-542显著阻断野生型模板的扩增，小幅度阻断突变型的扩增，对突变型的阻断效果显著弱于对野生型的阻断效果。
(2)BL1-542对含0.5％，0.2％，0.1％突变混合模板的检测。使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表17所示。
分别配制含E545K突变型和含E542K突变型0.5％，0.2％，0.1％的混合模板，按照表20的配方配制体系：
表20
Figure BDA0002493205930000201
PCR程序如表21所示：
表21
Figure BDA0002493205930000202
产物送检，结果如图54～图61所示。图54为E545K野生型结果，突变点位置为G；图55～图57依次为E545K 0.5％、0.2％、0.1％突变样本，突变位点测序G>A，对应E545K突变型。图58为E542K野生型结果，E542K突变位点测序结果为G；图59～图61依次为E542K0.5％、0.2％、0.1％突变样本，突变位点测序G>A，对应E542K突变型。从图54～图61可以看出，加入BL1-542的反应体系，可有效富集低丰度突变样本中的突变信息，配合一代测序E545K，E542K突变检测灵敏度均可达0.1％。
实施例7PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异
(1)BL1-1047的阻断性能
探针20(又名BL1-1047)：
5’-AACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAA/3ddC/-3’(SEQ ID NO.28)，其中下划线核苷酸经LNA修饰，3’末端经双脱氧修饰。
PCR扩增引物为：FP-1047：TCGAAAGACCCTAGCCTTAGAT(SEQ ID NO.34)和RP-1047：TTGTGTGGAAGATCCAATCCAT(SEQ ID NO.35)。
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表22所示：
表22
名称 突变类型
质粒012 野生型(WT)
质粒013 突变型(H1047R:A>G)
质粒014 突变型(H1047L:A>T)
按照表23的配方配制体系：
表23
Figure BDA0002493205930000211
PCR程序如表24所示：
表24
Figure BDA0002493205930000212
结果如图62～64所示，BL1-1047显著阻断野生型模板的扩增，小幅度阻断突变型的扩增，对突变型的阻断效果显著弱于对野生型的阻断效果。
(2)BL1-1047对含0.5％，0.2％，0.1％突变混合模板的检测。
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表22所示。
分别配制含H1047R突变型和含H1047L突变型0.5％，0.2％，0.1％的混合模板，按照表25的配方配制体系：
表25
Figure BDA0002493205930000213
PCR程序如表26所示：
表26
Figure BDA0002493205930000214
Figure BDA0002493205930000221
产物送检，结果如图65～图71所示。图65为H1047R/L位点野生型结果，突变点位置为A；图66～图68依次为PIK3CA-H1047R 0.5％、0.2％、0.1％突变样本，突变点测序A>G，对应H1047R突变型；图69～图71依次为PIK3CA-H1047L 0.5％、0.2％、0.1％突变样本，突变点测序A>T，对应H1047L突变型。从图65～图71可以看出，加入BL1-1047的反应体系，可有效富集低丰度突变样本中的突变信息，配合一代测序PIK3CA基因H1047R，H1047L突变检测灵敏度均可达0.1％。
实施例8Braf-V600E变异
(1)BL1-600的阻断性能
探针21(又名BL1-600)5’-GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGG/3ddC/-3’(SEQ IDNO.29)，其中下划线核苷酸经LNA修饰，3’末端经双脱氧修饰。
PCR扩增引物为：FP-600：TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGT(SEQ ID NO.36)和RP-600：AGCCTCAATTCTTACCATCCACA(SEQ ID NO.37)
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表27所示：
表27
名称 突变类型
质粒008 野生型(WT)
质粒009 V600E T>A
按照表28的配方配制体系：
表28
Figure BDA0002493205930000222
PCR程序如表29所示：
表29
Figure BDA0002493205930000223
结果如图72和图73所示，BL1-600阻断野生型模板的扩增，仅部分阻断突变型的扩增，且对突变型的阻断效果显著弱于对野生型的阻断效果。
(2)BL1-600对含0.5％，0.2％，0.1％突变混合模板的检测。
使用带有不同突变信息的质粒DNA作为模板，质粒DNA信息如表27所示。配制含0.5％，0.2％，0.1％突变模板的样本，按照表30配方配制体系：
表30
Figure BDA0002493205930000231
PCR程序如表31所示：
表31
Figure BDA0002493205930000232
产物送检，结果如图74～图77所示，图74为野生型样本，突变点测序为T，对应野生型序列；图75和图76依次为Braf-V600E 0.5％、0.2％突变样本，突变点测序T>A，对应V600E突变型，图77为Braf-V600E 0.1％突变样本，突变点测序T/A双峰，对应V600E突变型。从图74～图77可以看出，加入BL1-600的反应体系，可有效富集低丰度突变样本中的突变信息，配合一代测序灵敏度可达0.1％。
对比例
(1)针对ESR1基因的blocker BL2-538，对野生型阻断效果偏弱导致0.5％突变样本无法检出，PCR扩增体系及反应程序同实施例5，扩增结果如图78和图79所示，结果显示blocker BL2-538对野生型抑制效果较弱。产物检测结果如图80所示，blocker BL2-538无法检出0.5％的ESR1基因D538G突变样本，0.5％突变样本经测序为D538G野生型，灵敏度无法达到要求。
(2)针对PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异位点的blocker BL2-542对野生型，突变型均明显抑制。结果如图81～图83所示，PCR扩增体系及反应程序同实施例6。
(3)针对PIK3CA H1047R/L位点的Blocker BL2-1047，对野生型无抑制效果。结果如图84～图86所示，PCR扩增体系及反应程序同实施例7。
(4)针对Braf V600E位点的Blocker BL2-600，对野生型和突变型均明显抑制，结果如图87～88所示，PCR扩增体系及反应程序同实施例8。
探针序列如下：
BL2-538：5’-GCCCCTCTATGACCTGCTGCTGG/3ddC/-3’(SEQ ID NO.38)；
BL2-542：5’-CGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTT/3ddC/-3’(SEQ IDNO.39)；
BL2-1047：5’-CCACCATGATGTGCATCATTC/3ddC/-3’(SEQ ID NO.40)；
BL2-600：5’-GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGGAGTGGGTCCC/3ddC/-3’(SEQ IDNO.41)。
其中下划线核苷酸经LNA修饰，3’末端经双脱氧修饰。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 珠海圣美生物诊断技术有限公司
<120> 一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针及其应用
<160> 41
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcacctccac cgtgcagctc atcacgcagc tcatgccctt cggctgcc 48
<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtgcagctca tcacgcagct catgccct 28
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgcagctca tcacgcagct catgccct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtagttgga gctggtggcg taggcaagag 30
<210> 5
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tggtagttgg agctggtggc gtaggcaaga gtg 33
<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacagatttt gggctggcca aactgctggg tg 32
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
attttgggct ggccaaactg ctgg 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gctatcaagg aattaagaga agcaacatct ccgaaagcca aca 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtcgctatca aggaattaag agaagcaaca tctccgaaag ccaacaagg 49
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
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catgcgaagc cacactgac 19
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gtctttgtgt tcccggacat agtccagg 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
aagcgtcgat ggaggagttt gtaaat 26
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttggatcat attcgtccac aa 22
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tacttggagg accgtcgctt 20
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gctgacctaa agccacctcc tta 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
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acgtcttcct tctctctctg tcata 25
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<213> 人工序列
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gccagacatg agaaaaggt 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgcagctca tcacgcagct catgccct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gtgcagctca tcacgcagct catgccct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtgcagctca tcacgcagct catgccct 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ggagctggtg gcgtaggcaa gagtgcc 27
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggagctggtg gcgtaggcaa gagtgcc 27
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<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggagctggtg gcgtaggcaa gagtgcc 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gatcacagat tttgggctgg ccaaactgct gggtgcgg 38
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
gtcaagatca cagattttgg gctggccaaa ctgctgggtg cg 42
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<212> DNA
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gtgcccctct atgacctgct gctggagatg 30
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctttctcctg ctcagtgatt tcagagagag g 31
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<212> DNA
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aacaaatgaa tgatgcacat catggtggct ggacaacaa 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtctagcta cagtgaaatc tcgatgg 27
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cagtaacaaa ggcatggagc at 22
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ccctccacgg ctagtggg 18
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aatgacaaag aacagctcaa agcaa 25
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tcgaaagacc ctagccttag at 22
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agcctcaatt cttaccatcc aca 23
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggtctagcta cagtgaaatc tcgatggagt gggtccc 37

Claims (21)

1.一种用于扩增变异型靶基因片段的非淬灭型寡核苷酸探针，其特征在于：
（1）所述非淬灭型寡核苷酸探针的核苷酸序列与野生型靶基因片段完全匹配，与变异型靶基因片段在变异位置处发生错配；
（2）所述非淬灭型寡核苷酸探针的长度为24~50bp长，其中在变异位置及其两侧1~5bp范围内，至少有1~6个核苷酸经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性；
（3）所述非淬灭型寡核酸探针在退火时可结合野生型靶基因片段和变异型靶基因片段，在延伸时仅结合野生型靶基因片段；
所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增ESR1-D538G变异的探针18；所述探针18的核苷酸序列为GTGCCCCTCTATGACCTGCTGCTGGAGATG（SEQ ID NO:26），其中所述探针18中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰为经过LNA修饰；
或者，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异的探针19；所述探针19的核苷酸序列为CTTTCTCCTGCTCAGTGATTTCAGAGAGAGG（SEQ IDNO.27），其中所述探针19中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰为经过LNA修饰；
或者，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异的探针20；所述探针20的核苷酸序列为AACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAA（SEQ ID NO.28），其中所述探针20中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰为经过LNA修饰；
或者，所述非淬灭型寡核苷酸探针为用于扩增Braf-V600E变异的探针21；所述探针21的核苷酸序列为GGTCTAGCTACAGTGAAATCTCGATGG（SEQ ID NO.29），其中所述探针21中加下划线的核苷酸为所述经过修饰以增强所述探针与互补链的热稳定性的核苷酸；所述经过修饰为经过LNA修饰；
所述探针18~21的3’末端经双脱氧修饰。
2.一种用于扩增变异型靶基因片段的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒包括权利要求1所述的非淬灭型寡核苷酸探针和其他扩增试剂。
3.根据权利要求2所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述非淬灭型寡核苷酸探针为一条或多条。
4.根据权利要求3所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，多条寡核苷酸探针针对同一变异型靶基因，或者不同变异型靶基因。
5.根据权利要求2所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述探针与所述其他扩增试剂以单独包装的形式提供，或者所述探针与所述其他扩增试剂以混合的单一试剂的形式提供。
6.根据权利要求2所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述其他扩增试剂包括引物对、DNA聚合酶、缓冲液、dNTPs、无菌水和双链DNA染料中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述其他扩增试剂为多种时，以单独包装的方式提供，或者所述其他扩增试剂中的至少两种以混合的单一试剂的形式提供。
8.根据权利要求6所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述引物对由用于扩增包含所述变异型靶基因片段的变异位置的上游引物和下游引物组成，所述引物对与所述非淬灭型寡核苷酸探针在与靶基因片段结合的结合位点上无重叠或者部分重叠。
9.根据权利要求8所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1:0.75~1.25。
10.根据权利要求9所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述上游引物和所述下游引物的摩尔比为1:1。
11.根据权利要求2所述的试剂和/或试剂盒，其特征在于，所述试剂和/或试剂盒用于扩增ESR1-D538G变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-538:CAGTAACAAAGGCATGGAGCAT（SEQ ID NO.30）和RP-538：CCCTCCACGGCTAGTGGG（SEQ ID NO：31）；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于扩增PIK3CA-E542K变异和PIK3CA-E545K变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-542：AATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA（SEQ ID NO.32）和RP-542：TTAGCACTTACCTGTGACTCCAT（SEQ ID NO.33）；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于扩增PIK3CA-H1047R变异和PIK3CA-H1047L变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-1047：TCGAAAGACCCTAGCCTTAGAT（SEQ ID NO.34）和RP-1047：TTGTGTGGAAGATCCAATCCAT（SEQ ID NO.35）；
或者，所述试剂和/或试剂盒用于扩增Braf-V600E变异，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示：FP-600：TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGT（SEQ ID NO.36）和RP-600：AGCCTCAATTCTTACCATCCACA（SEQ ID NO.37）。
12.用于扩增变异型靶基因片段的混合反应体系，其特征在于，所述混合反应体系包括权利要求2~11任一项所述试剂和待测样本。
13.根据权利要求12所述的混合反应体系，其特征在于，所述待测样本为低拷贝数样本和/或低变异频率样本。
14.根据权利要求13所述的混合反应体系，其特征在于，所述低拷贝数为800~20000个拷贝。
15.根据权利要求14所述的混合反应体系，其特征在于，所述低拷贝数为1000个拷贝，4000个拷贝，8000个拷贝或者16000个拷贝。
16.根据权利要求13所述的混合反应体系，其特征在于，所述低变异频率为0.03%~5%变异率。
17.根据权利要求16所述的混合反应体系，其特征在于，所述低变异频率为0.05%变异率、0.075%变异率、0.1%变异率、0.15%变异率、0.25%变异率、0.3%变异率、0.5%变异率、1%变异率、1.2%变异率或者4%变异率。
18.一种用于扩增变异型靶基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）配制权利要求12所述混合反应体系；（2）进行PCR反应，所述PCR反应包括变性、退火和延伸；其中，退火时，非淬灭型寡核苷酸探针与野生型靶基因片段和变异型靶基因片段结合；延伸时，所述非淬灭型寡核苷酸探针仅与野生型靶基因片段结合；
所述方法用于变异型靶基因片段检测前富集；
所述变异型靶基因为ESR1-D538G，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针18，PCR所用引物为：FP-538:CAGTAACAAAGGCATGGAGCAT（SEQ ID NO.30）和RP-538：CCCTCCACGGCTAGTGGG（SEQID NO：31）；所述探针18的退火温度为57℃；所述延伸温度为68℃；
或者，所述变异型靶基因为PIK3CA-E542K和PIK3CA-E545K，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针19，PCR所用引物为：FP-542：AATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAA（SEQ ID NO.32）和RP-542：TTAGCACTTACCTGTGACTCCAT（SEQ ID NO.33）；所述探针的退火温度为57℃；所述延伸温度为56℃；
或者，所述变异型靶基因为PIK3CA-H1047R和PIK3CA-H1047L，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针20；PCR所用引物为：FP-1047：TCGAAAGACCCTAGCCTTAGAT（SEQ ID NO.34）和RP-1047：TTGTGTGGAAGATCCAATCCAT（SEQ ID NO.35）；所述探针的退火温度为57℃；所述延伸温度为62℃；
或者，所述变异型靶基因为Braf-V600E，所述非淬灭型寡核苷酸探针为探针21；PCR所用引物为：FP-600：TGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGT（SEQ ID NO.36）和RP-600：AGCCTCAATTCTTACCATCCACA（SEQ ID NO.37）；所述探针的退火温度为56℃；所述延伸温度为60℃。
19.根据权利要求12~17任一项所述的混合反应体系，或者根据权利要求18所述的方法，其特征在于，待测样本为血液、体液、组织、循环肿瘤细胞、cfDNA或者胎儿早检样本。
20.根据权利要求12~17任一项所述的混合反应体系，或者根据权利要求18所述方法，其特征在于，所述胎儿早检样本选自孕妇血液、绒毛穿刺样本或羊水穿刺样本。
21.根据权利要求18~20任一项所述的方法，其特征在于，所述富集为测序前的建库。
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