WO2008066136A1 - Primer set for amplification of ugt1a1 gene, reagent for amplification of ugt1a1 gene comprising the same, and use of the same - Google Patents

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ugt1a1
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Mitsuharu Hirai
Satoshi Majima
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    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays

Definitions

  • UGT1A1 gene amplification primer set UGT1A1 gene amplification primer set, UGT1A1 gene amplification reagent containing the same, and use thereof
  • the present invention relates to a primer set for amplifying the UGT1A1 gene, a UGT 1A1 gene amplification reagent containing the primer set, and a use thereof.
  • Glucuronosyltransferase is an enzyme that catalyzes the reaction of adding glucuronic acid to drugs, foreign substances, endogenous substances such as bilirubin, steroid hormones, and bile acids. Known as an enzyme.
  • UGTs multiple isozymes classified as UGT1 family and UGT2 family are reported. Among these isozymes, the gene encoding UGT1A1 belonging to the UGT1 family (UGT1A1 gene) has a gene polymorphism, and is generally said to be involved in the development of side effects of irinotecan hydrochloride, an anticancer drug. Yes.
  • UGT1A1 is also involved in bilirubin conjugation by glucuronic acid in vivo, and its polymorphism also causes constitutional yellow scars such as Gilbert syndrome. Therefore, examining multiple polymorphisms of the UGT1A1 gene is extremely important for predicting the degree of side effects caused by anticancer drugs and predicting the onset of side effects.
  • Tm melting temperature
  • the hybrid is subjected to a heat treatment, and the dissociation (melting) of the hybrid accompanying an increase in temperature is detected by a change in signal such as absorbance. And it is a method of judging the presence or absence of point mutation by determining ⁇ ⁇ ⁇ straight based on this detection result.
  • the higher the homology of the hybrid the lower the Tm value.
  • a Tm value evaluation reference value
  • a hybrid formed of a detection target sequence containing a point mutation and a complementary probe and the target single-stranded DNA of the detection sample, the probe and Measure Tm value (measured value) of Determine.
  • the measured value is comparable to the evaluation reference value, it can be determined that a match, that is, a point mutation exists in the target DNA, and if the measured value is lower than the evaluation reference value, a mismatch, that is, a point mutation exists in the target DNA. It can be judged not to. According to this method, gene analysis can be automated.
  • the detection method using such Tm analysis also has a problem that it is necessary to specifically and efficiently amplify a region including a target site in PCR.
  • the coding genes of isozymes other than UGT1A1 may be amplified in PCR.
  • the code genes of other isozymes are amplified in this way, for example, analysis of a specific polymorphism (UGT1A1 * 28, UGT1A1 * 6 or UGT1A1 * 27) of the UGT1A1 gene (Non-patent Document 1) In this case, the reliability of the analysis result may be reduced.
  • UGT1A1 * 28, UGT1A1 * 6 or UGT1A1 * 27 analysis of a specific polymorphism of the UGT1A1 gene
  • Non-Patent Document 1 PMID: 11156391 Cancer Res. 2000 Dec 15; 60 (24): 69 21-6.
  • an object of the present invention is to provide a primer set for specifically amplifying a target region of the UGT1A1 gene by a gene amplification method.
  • the primer set of the present invention comprises U
  • a primer set for amplifying the GT1A1 gene is A primer set for amplifying the GT1A1 gene.
  • a pair of primer sets including a forward primer composed of the oligonucleotide (F1) below and a reverse primer composed of the oligonucleotide (R1) below
  • the 2120th adenine base in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 (A) is directed toward the 5 'direction, and is the same as the region from base 18 to base 22. At least one oligonucleotide in a row, wherein the adenine base (A) is 3 'end and
  • R1 At least one oligo complementary to the region from the 17th to the 27th base in the 3 'direction starting from the 2226th guanine base (G) in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • a pair of primer sets including a forward primer consisting of the oligonucleotide (F2) below and a reverse primer consisting of the oligonucleotide (R2) below
  • the UGT1A1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has the same sequence as the region from the 15th to the 27th base in the 5 'direction starting from the 2622nd guanine base (G) as the first base.
  • a pair of primer sets including a forward primer composed of the oligonucleotide (F3) below and a reverse primer composed of the oligonucleotide (R3) below
  • R3 At least one oligo complementary to the region from the 16th to the 20th base in the 3 'direction starting from the 1928th cytosine base (C) in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene amplification reagent of the present invention is a reagent for amplifying the UGT1A1 gene by a gene amplification method, and is characterized by including the above-described primer set for amplification of the UGT1A1 gene of the present invention.
  • the method for producing an amplification product of the present invention is a method for producing an amplification product of the UGT1A1 gene by a gene amplification method, which comprises the following step (I).
  • the polymorphism analysis method of the present invention is a method for analyzing a polymorphism of a detection target site in the UGT1A1 gene, and includes the following steps (i) to (iv).
  • a target region including a site where a polymorphism (UGT1A1 * 28, UGT1A1 * 6 or UGT1A1 * 27) for detection purposes in the UGT1A1 gene is generated in a reaction solution.
  • Amplification can be performed with high efficiency. Therefore, unlike the conventional method as described above, it is possible to reduce labor and cost.
  • the ability to specifically amplify a region including a detection target site where a specific polymorphism of the UGT1A1 gene occurs in this way for example, a probe complementary to the detection target sequence including the detection target site.
  • the target region can be amplified and polymorphic typing can be performed with one reaction solution, the operation can be automated.
  • the primer set of the present invention for example, even a sample containing impurities (for example, whole blood, oral mucosa, etc.), pretreatment can be omitted, so that an amplification reaction can be performed more quickly and easily.
  • the power to do is S.
  • an amplification reaction can be performed with an amplification efficiency superior to that of the prior art, so that the amplification reaction can be shortened.
  • the primer set of the present invention a reagent containing the primer set, and a method for producing an amplification product and a polymorphism analysis method using these, the ability to quickly and easily analyze the polymorphism of the UGT1A1 gene is It is extremely effective.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 1 of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of Tm analysis in Example 2 of the present invention.
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention includes at least one primer set selected from the group consisting of the primer sets (1) to (3).
  • at least one primer set for example, it is possible to specifically amplify a specific target region in the UGT1A1 gene
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention may include, for example, any one of the primer sets (1) to (3), only one type, or any two types or primers All of the sets (1) to (3) may be included.
  • the target region that can be specifically amplified by the primer set (1) is a region including a site where the polymorphism UGT1A1 * 6 occurs in the UGT1A1 gene, and is specifically amplified by the primer set (2).
  • the target region obtained is a region including the site where polymorphism UGT1A1 * 27 occurs in the UGT1A1 gene.
  • the target region that can be specifically amplified by the primer set (3) is the polymorphism UGT1A1 * in the UGT1 A1 gene. This is a region including a site where 28 occurs.
  • these three polymorphisms of the UGT1A1 gene are all known as polymorphisms that affect drug metabolism. It is important to examine all types of polymorphisms.
  • the conventional method has a problem that it is not possible to analyze a plurality of sequences in one reaction system. As described above, since many isozymes exist in UGT, it is considered that PCR also amplifies even the coding genes of isozymes other than UGT1A1.
  • the region containing the site where each polymorphism occurs is It is necessary to amplify each in a separate reaction system and analyze the resulting amplification product separately.
  • the UGT1A1 gene is a cocoon-shaped UGT gene, and only two or three types of target regions each containing the site where the polymorphism occurs in the UGT1A1 gene are specifically identified. It is extremely difficult to amplify.
  • each of the primer sets (1) to (3) includes a deviation force, two types, or all three types.
  • the target region can be amplified simultaneously and specifically in the same reaction solution. For this reason, unlike the conventional method described above, it is possible to reduce labor and cost.
  • two or three target areas are specific in the same reaction solution. For example, by using a probe complementary to the sequence to be detected in each target region, Tm analysis is performed as it is using the reaction solution, and the two or three polymorphisms are obtained. Each can be typed.
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention is, for example, a primer set (1) to Of course, it is also preferable to include 2 or 3 types of V, displacement. Using such a UGT1A1 gene primer set, it is possible to perform polymorphism analysis of UGT1A1 gene more efficiently than before by amplifying two or three target regions simultaneously as well as one target region. Can do.
  • the forward primer may be referred to as F primer and the reverse primer as R primer.
  • the primer set (1) is a pair of primer sets including a forward primer composed of the following oligonucleotide (F1) and a reverse primer composed of the following (R1) oligonucleotide.
  • the 2120th adenine base (A) in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 has the same sequence as the region from the 18th to 22nd base in the 5 'direction with the first base as the first base.
  • At least one oligonucleotide that has the same sequence as the region from the 18th to the 34th base in the 5 'direction with the 2140th cytosine base (C) in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base And having a cytosine base (C) as the 3 ′ end
  • R1 At least one complementary to the region from the 17th to the 27th base in the 3 'direction with the 2226th guanine base (G) as the first base in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the full-length sequence of UGT1 family UG T1A1 gene derived from human (Homo sapiens), and is registered in, for example, NCBI Accession No. AY603772.
  • the primer set (1) is a region from the 2121st to 2225th region in IJ No. 1;
  • the 2160th base in this region (2160th base in SEQ ID NO: 1) is known to have a point mutation (2160G, 216 OA) that affects UGT1A1 function.
  • the polymorphism at this site can be represented by 2060G / G and 2160A / A in the case of a homozygote and 2160G / A in the case of a heterozygote.
  • this primer set (1) is also referred to as “primer set for U GT1A1 * 6”.
  • the primer set for UGT1A1 * 6 should be used.
  • the F1 primer and R1 primer of the primer set (1) only need to satisfy the above-described conditions for the 3 ′ terminal base that plays a role in determining the starting point of amplification by DNA polymerase. .
  • the primer set (1) can bind to other similar isozyme genes (for example, UGT1A3 gene, UGT1A4 gene, etc.). It can be sufficiently prevented.
  • the length of each primer is not particularly limited, and is suitable for a general length. You can power to adjust.
  • the length of the primer for example, 13-50mer It is a range, Preferably it is 14-45mer, More preferably, it is 15-40mer.
  • the F1 primer is directed toward the 5 ′ direction with the 2120th adenine base (A) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base, ie, the 18th to 22nd bases (preferably 19- At least one oligonucleotide having the same sequence as the region from the 22nd base, more preferably the 19th to 21st base), or the 2140th cytosine base (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base.
  • At least one oligonucleotide having the same sequence as the region from the 18th to the 34th base preferably, 2;! To the 33rd base, more preferably the 24th to 31st base) in the 5 'direction. It is preferable.
  • the R1 primer is the 17th to 27th base (preferably the 19th to 26th base, more preferably the 3rd direction starting from the 2226th guanine base (G) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base. From the 19th to the 23rd base), or the 2198th cytosine base (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base, and the 3 'direction. It is preferable that the oligonucleotide is complementary to at least one oligonucleotide up to the 22-39th base (preferably the 23-36th base, more preferably the 25-34th base).
  • the region extending from the primer is, for example, the region from 2121 to 2225, 2141 to 2197 in SEQ ID NO: 1, as described above.
  • the second region, 2121st to 2197th region, or 2141st to 2225th region S the total length of the resulting amplification product varies depending on the length of the primer used To do.
  • the R1 primer may not be an oligonucleotide that is completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the F1 primer is not completely complementary to the complementary strand of the base sequence. That is, in a part excluding the base at the 3 ′ end in each primer, the completely complementary oligonucleotide and 1 to 5 bases may be different.
  • F1 primer and R1 primer consisting of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 81 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 91
  • F1 ′ primer consisting of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 81 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 13 or SEQ ID NO: 91
  • a primer set (1 ′) comprising R 1 ′ primer.
  • Tm (° C) is the Tm (.C) when the sequence shown in the table below and a completely complementary sequence are hybridized. Parameters are set by MELTCALC software (http://www.meltcalc.com/).
  • Tm value is a value calculated with an oligonucleotide concentration of 0 ⁇ , sodium equivalent (Na eq.) 50 mM (hereinafter the same).
  • the Tm value can be calculated by, for example, conventionally known MELTCA LC software (http: ZZwww. Meltcalc. Com /) or the like, and can also be determined by a neighbor method (hereinafter the same).
  • the primer set (2) is a pair of primer sets including the following (F2) oligonucleotide force, the following forward primer, and the following (R2) oligonucleotide reverse primer. It is.
  • the UGT1A1 gene consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 has the same sequence as the region from the 15th to the 27th base in the 5 'direction starting from the 2622nd guanine base (G) as the first base.
  • R2 At least one oligo complementary to the region from the 17th to 26th bases in the 3 'direction starting from the 2687th cytosine base (C) of the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • the primer set (2) is a primer set for amplifying a DNA strand containing the regions 2623 to 2686 in IJ No. 1 and its complementary strand.
  • the 2635th base in this region (the 2635th base in SEQ ID NO: 1) is known to have a point mutation (2635C, 2635A) that affects the function of UGT1A1. * 27.
  • the polymorphism at this site can be expressed as 2635C / C, 26359A / A in the case of a homozygote and 2635C / A in the case of a heterozygote.
  • this primer set (2) is also referred to as “primer set for UGT1A1 * 27”.
  • the F2 primer and the R2 primer of the primer set (2) have the 3 ′ end that plays the role of determining the starting point of amplification by DNA polymerase for the same reason as the primer set (1).
  • the base only needs to satisfy the above-described conditions. Therefore, the lengths of the F2 primer and the R2 primer are not particularly limited, and the same lengths as described above can be exemplified.
  • the F2 primer is the 15th to 27th base (preferably the 16th to 27th base) toward the 5 ′ direction with the 2622nd guayun base (G) as the first base in the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the R2 bra Imah is the 17th to 26th base (preferably the 18th to 26th base, more preferably the 19th base to the 3 'direction starting from the 2687th cytosine base (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base. It is preferably at least one oligonucleotide complementary to the region up to the 26th base).
  • the region extending from the primer is amplified, for example, from the 2623th to 2686th region in SEQ ID NO: 1 as described above. The overall length of the product will vary depending on the length of the primer used.
  • the R2 primer may not be an oligonucleotide that is completely complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the F2 primer is not completely complementary to the complementary strand of the base sequence. That is, in a part excluding the base at the 3 ′ end in each primer, the completely complementary oligonucleotide and 1 to 5 bases may be different.
  • F2 primer and R2 primer consisting of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 92 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 98
  • F2 ′ primer consisting of the oligonucleotide of SEQ ID NO: 21 or SEQ ID NO: 92 and the oligonucleotide of SEQ ID NO: 29 or SEQ ID NO: 98
  • a primer set (2 ′) comprising the R2 ′ primer.
  • the primer set (3) includes a pair of primer sets including the following (F3) oligonucleotide force, the following forward primer and the following (R3) oligonucleotide reverse primer. It is.
  • R3 At least one oligo complementary to the region from the 16th to the 20th base in the 3 'direction starting from the 1928th cytosine base (C) in the UGT1A1 gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the primer set (3) is a primer set for amplifying a DNA strand containing the 1864th to 1927th region in SEQ ID NO: 2 and its complementary strand. Within this region, mutations in TATAbox starting from position 1895 of SEQ ID NO: 1 (6 TA repeats and 7 TA repeats) are known as point mutations affecting UGT1A1 function. The type is UGT1A1 * 28 as described above.
  • the polymorphism at this site can be represented by 1895-TA7 / TA7, 1895-TA6 / TA6 in the case of homozygote, and 1859- ⁇ 6 / ⁇ 7 in the case of heterozygote.
  • SEQ ID NO: 1 is the sequence of polymorphism UGT1A1 * 28 having 7 repeats.
  • this primer set (3) is also referred to as “primer set for UGT1A1 * 28”.
  • primer set for UGT1A1 * 28 When analyzing only UGT1A1 * 28 polymorphism, only the primer set for UGT1A1 * 28 should be used.
  • the F3 primer and the R3 primer of the primer set (3) have a 3 'end that plays a role in determining the starting point of amplification by DNA polymerase for the same reason as the primer set (1).
  • the base only needs to satisfy the above-described conditions.
  • the lengths of the F3 primer and the R3 primer are not particularly limited, and can be exemplified by the same lengths as described above.
  • the F3 primer is 17 to 31 bases in the 5 ′ direction starting from the 1863th cytosine base (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base.
  • the oligonucleotide is at least one oligonucleotide having the same sequence as that of the region (preferably, the 18th to 28th bases, more preferably the 19th to 24th bases).
  • the R3 primer is the 16th to 20th bases (preferably the 17th to 20th bases) in the 3 ′ direction with the 1928th cytosine base (C) in the base sequence of SEQ ID NO: 1 as the first base. More preferably, it is at least one oligonucleotide complementary to the region from the 17th to the 19th base).
  • the region extending from the primer is amplified, for example, from the 1864th to 1927th regions in SEQ ID NO: 2 as described above.
  • the overall length of the product will vary depending on the length of the primer used.
  • the R3 primer may not be an oligonucleotide that is completely complementary to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the F3 primer is not completely complementary to the complementary strand of the nucleotide sequence. That is, in a part excluding the base at the 3 ′ end in each primer, the completely complementary oligonucleotide and 1 to 5 bases may be different.
  • each primer of the primer sets (1) to (3) described above may have, for example, a conventionally known arbitrary sequence added to the 5 'end in order to increase the reaction temperature of the amplification reaction.
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention including at least one of such primer sets (1) to (3) is used, for example, when a UGT1A1 gene in a biological sample such as a whole blood sample is amplified. It is preferable to use for.
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention is used together with a polymorphism detection probe as described later, the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution for gene amplification is 0. It is preferably 5% by volume. This point will be described later.
  • the UGT1A1 gene amplification reagent of the present invention is a reagent for amplifying the UGT1A1 gene by the gene amplification method, and is characterized by including the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention.
  • the reagent for amplifying UGT1A1 gene of the present invention is characterized by including the primer set of the present invention, and the composition other than this is not limited at all.
  • the UGT1A1 gene amplification reagent of the present invention can be further hybridized to the detection target site of the UGT1A1 gene, for example, in order to detect an amplification product obtained by the gene amplification method using the primer set of the present invention.
  • Various probes may be included.
  • the primer set for UGT1A1 gene amplification of the present invention for example, depending on the types of primer sets (1) to (3) contained therein, one to 3 in the UGT1A1 gene can be obtained by gene amplification. An amplification product of one target region is obtained.
  • the reagent for amplifying UGT1A1 gene of the present invention is preferably used when amplifying UGT1A1 gene in a biological sample such as whole blood.
  • the UGT1A1 gene amplification reagent of the present invention is used with the above-mentioned probe, the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution for gene amplification is set to 0 .;! To 0.5% by volume. It is preferable.
  • the “detection target sequence” means a sequence including a site where a polymorphism occurs (detection target site).
  • the form of the reagent for amplifying UGT1A1 gene of the present invention is not particularly limited, and for example, it may be a liquid reagent containing the primer set for amplifying UGT1A1 gene of the present invention, or may be dried by suspending in a solvent before use. It may be a reagent. Further, the content of the UGT1A1 gene amplification primer set is not particularly limited.
  • the method for producing an amplification product of the present invention is a method for producing an amplification product of the UGT1A1 gene by a gene amplification method, and includes the following step (I).
  • the target region of the UGT1A1 gene can be amplified as described above by performing the amplification reaction using the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention.
  • the primer set for amplifying UGT1A1 gene of the present invention contains two or more of the above primer sets (1) to (3), it includes two detection target sites in the UGT1A1 gene, respectively. The ability to simultaneously amplify two target areas in the same reaction solution.
  • the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention includes all of the primer sets (1) to (3), three target regions each including three detection target sites in the UGT1A1 gene, Can be amplified simultaneously in the same reaction solution.
  • the target region to be amplified according to the present invention is a region containing each detection target site where each polymorphism (UGT1A 1 * 28, UGT1A1 * 6 and UGT1A1 * 27) occurs.
  • the amplification product production method of the present invention is characterized by using the primer set of the present invention, and the type and conditions of the gene amplification method are not limited at all.
  • the gene amplification method is not particularly limited as described above.
  • PCR Polym erase Chain Reaction
  • NASBA Nucleic acid sequence based amplification
  • TMA Transcription-mediated amplification
  • SDA String and Displacement Amplification
  • the sample to which the present invention is applied is not particularly limited as long as it contains, for example, a basket-like nucleic acid, but for example, it is preferably applied to a sample containing impurities.
  • Samples containing the contaminants include, for example, whole blood, oral cells (eg, oral mucosa), somatic cells such as nails and hair, germ cells, sputum, amniotic fluid, paraffin-embedded tissue, urine, gastric fluid (eg, Gastric lavage fluid) and suspensions thereof.
  • gastric fluid eg, Gastric lavage fluid
  • the target region of the difficult UGT1A1 gene can be specifically amplified. For this reason, according to the present invention, even a sample with many impurities, which has been difficult with the conventional method, can be used as it is without performing a pretreatment such as purification. Therefore, it can be said that the amplification product can be prepared more rapidly than the conventional method also from the viewpoint of sample pretreatment.
  • the addition ratio of the sample in the reaction solution is not particularly limited! /.
  • the lower limit of the addition ratio in the reaction solution is preferably 1S, for example, 0.01% by volume or more, more preferably 0.05 volume. % Or more, more preferably 0.1% by volume or more.
  • the upper limit of the addition ratio is not particularly limited, but is preferably 2% by volume or less, more preferably 1% by volume or less, and still more preferably 0.5% by volume or less.
  • the addition ratio of a biological sample such as a whole blood sample in the reaction solution is, for example, , 0 .;! To 0.5% by volume is preferable.
  • heat treatment is usually applied for DNA denaturation (dissociation into single-stranded DNA). This heat treatment denatures sugars and proteins contained in the sample, resulting in insoluble precipitates and Turbidity may occur. For this reason, when the presence or absence of amplification products and the genotype (polymorphism) of the site to be detected are confirmed by optical techniques, the occurrence of such precipitates and turbidity may affect the measurement accuracy.
  • the addition ratio of the whole blood sample in the reaction solution is set within the above-mentioned range, the mechanism is unknown, but for example, it is possible to sufficiently prevent the influence of the generation of precipitates due to denaturation. Measurement using optical techniques Accuracy can be improved. In addition, since PCR inhibition by contaminants in the whole blood sample is sufficiently suppressed, amplification efficiency can be further improved. Therefore, in addition to the use of the primer set of the present invention, the necessity for pretreatment of the sample can be further eliminated by setting the addition ratio of the sample such as the whole blood sample within the aforementioned range.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution, the volume fraction as described above (e.g., 0.1;! ⁇ 0.5 volume 0/0), the nag hemoglobin (hereinafter, referred to as "Hb") can also be expressed as a weight ratio.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is preferably in the range of, for example, 0.565 to 113 g / L, more preferably (converted to 2.825-55.5 g / L) in terms of the amount of Hb. More preferably, it is in the range of 5.65-28.25 g / L
  • the addition rate of the whole blood sample in the reaction may satisfy both the volume ratio and the Hb weight ratio, for example. However, either one may be satisfied.
  • the whole blood is, for example, hemolyzed whole blood, unhemolyzed whole blood, anticoagulated whole blood, whole blood containing a coagulated fraction or the like!
  • the target nucleic acid contained in the sample is, for example, DNA.
  • the DNA may be, for example, DNA originally contained in a sample such as a biological sample, or may be amplification product DNA amplified by a gene amplification method. In the latter case, cDNA generated by reverse transcription reaction (for example, RT-PCR (Reverse Transcription PCR)) from RNA (total RNA, mRNA, etc.) originally contained in the sample can be mentioned.
  • RT-PCR Reverse Transcription PCR
  • albumin it is preferable to add albumin to the reaction solution prior to the start of the gene amplification reaction.
  • albumin for example, it is possible to further reduce the influence of the generation of precipitates and turbidity as described above, and to further improve the amplification efficiency.
  • albumin it is preferable to add albumin before the amplification reaction in the step (I) or the dissociation step into single-stranded DNA.
  • the addition ratio of albumin in the reaction solution is, for example, in the range of 0.0;! To 2% by weight, preferably 0 .;! To 1% by weight, and more preferably 0.2 to 0%. 8% by weight.
  • the albumin is not particularly limited, and examples thereof include ushi serum albumin (BSA), human serum albumin, rat serum albumin, horse serum albumin and the like, and any one of them may be used. You can use the above together.
  • BSA ushi serum albumin
  • the primer set for UGT1A1 gene amplification of the present invention including the above primer sets (1) to (3) is used for whole blood samples, using DNA as a target nucleic acid.
  • An example of producing amplified products of the three target regions of the UGT1A1 gene by PCR was described.
  • the present invention is characterized by using the primer set of the present invention, and other configurations and conditions are not limited at all.
  • the addition ratio of the primer set of the present invention is not particularly limited, but it is preferable to add the F primer of the primer set (;!) To (3) so as to be 0 ⁇ 1 to 2 11101 / L ⁇ preferably More preferably, it is 0.25-1.5.5 mol / L, and particularly preferably 0.5-1111101 /.
  • R primers of primer sets (1) it is more preferable to add R primers of primer sets (1) to (3) so as to be 0 ⁇ 1 to 2 11101 / respectively (between 0.25 and 1.5 to 11101). It is particularly preferable (or 0.5-1 mol / L.
  • the addition ratio of F primer to R primer (F: R, molar ratio) in each primer set is not particularly limited, For example, 1: 0.25 to; 1: 4 force S is preferable, more preferably 1: 0.5 to 1: 2.
  • the ratio of the whole blood sample in the reaction solution is not particularly limited, but the above-mentioned range is preferable.
  • the whole blood sample may be added to the reaction solution as it is, or it may be diluted with a solvent such as water or buffer in advance and then added to the reaction solution.
  • the dilution rate is not particularly limited.
  • the power can be set so that the final whole blood addition ratio in the reaction solution falls within the above range. It is 2000 times, preferably (it is 200 to 000 times).
  • composition components in the reaction liquid are not particularly limited, and examples thereof include conventionally known components, and the ratios thereof are not particularly limited.
  • the composition component include DNA polymerase, nucleotide (nucleoside triphosphate (dNTP)), and solvent.
  • the reaction solution preferably further contains albumin. Note that the order of addition of each composition component is not limited at all to the reaction solution! /.
  • the DNA polymerase is not particularly limited, and for example, a conventionally known polymerase derived from thermostable bacteria can be used. Specific examples include DNA polymerases derived from Thermus aauaticus (US Pat. Nos. 4,889,818 and 5,079,352) (trade name Taq polymerase), Thermus thermus mophilus) DNA polymerase (WO 91/09950) (rTth DNA polymerase), Pyrococcus furiosus (Pyrococcus DNA polymerase (WO 9)
  • thermostable DNA polymerase from Thermus aauaticus is preferred! / ⁇
  • the addition rate of DNA polymerase in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 1 to 100 U / mL, preferably 5 to 50 U / mL, more preferably 20 to 30 U / mL. It is.
  • the DNA polymerase activity unit (U) is generally an acid-insoluble precipitate of activated salmon sperm DNA as a saddle primer and lOnmol of all nucleotides in a reaction solution for activity measurement at 74 ° C for 30 minutes.
  • S1U which is the active power to be taken into
  • 25 mM TAPS buffer pH 9.3, 25.C
  • 50 mM KC1 2 mM MgCl
  • ImM menorecaptoethanolate 200 ⁇ M dATP, 200 ⁇ M dGTP.
  • nucleoside triphosphates examples include dNTP (dATP, dCTP, dTTP).
  • the addition rate of dNTP in the reaction solution is not particularly limited, but is, for example, 0.01 to 1 mmol / L, preferably 0.05 to 0.5 mmol / L, and more preferably 0 to! Measure with ⁇ 0.3mmolZL.
  • Examples of the solvent include buffers such as Tris-HCl, Tricine, MES, MOPS, HEPES, and CAPS. Commercially available buffers for PCR, buffers for commercially available PCR kits, and the like can be used. .
  • the PCR reaction solution further contains heparin, betaine, KC1, MgCl, MgSO, glycerin.
  • the ratio of addition of cerol and the like may be set within a range not inhibiting the PCR reaction, for example.
  • the total volume of the reaction solution is not particularly limited, and is, for example, a force that can be appropriately determined according to the equipment used (thermal cycler) and the like. Usually, it is 1 to 500, and preferably 10 to 100. It is.
  • PCR cycle conditions are not particularly limited.
  • (1) dissociation of double-stranded DNA from whole blood into single-stranded DNA, (2) primer annealing, and (3) primer extension (polymerase reaction) are as follows.
  • the number of cycles is not particularly limited, but the following three steps (1) to (3) are considered as one cycle, and for example, 30 cycles or more are preferable.
  • the upper limit is not particularly limited.
  • the total is 100 cycles or less, preferably 70 cycles or less, and more preferably 50 cycles or less.
  • the temperature change at each step may be automatically controlled using, for example, a thermal cycler.
  • the primer set of the present invention is used, the amplification efficiency is excellent as described above. Therefore, according to the conventional method, about 3 hours were required for 50 cycles, whereas according to the present invention, about 1 It is possible to complete 50 cycles in about an hour (preferably within 1 hour).
  • the primer set for amplifying UGT1A1 gene of the present invention may be used, which includes two types of primer sets corresponding to the deviation, deviation force, one or! /, Deviation.
  • the method for producing an amplification product of the present invention may further include a step of detecting the amplification product of the target region obtained by the amplification reaction described above.
  • a step of detecting the amplification product of the target region obtained by the amplification reaction described above the presence or absence of amplification products and the genotype in the target region of the UGT1A1 gene (polymorphism UGT1A1 * 6, UGT1 Al * 27 or UGTIAI * 28) can also be detected.
  • the presence or absence of the amplification product can be confirmed by a conventionally known method.
  • a probe for example, a fluorescently labeled probe
  • the reaction solution can be confirmed by measuring the fluorescence intensity of the fluorescent label in the probe.
  • a probe for example, a fluorescent label
  • the reaction solution can be confirmed by measuring the fluorescence intensity of each fluorescent label in each probe.
  • the detection of polymorphisms UGTIAI * 6, UGT1A1 * 27, and UGT1A1 * 28 in the UGT1A1 gene will be described below as an embodiment of the present invention.
  • the UGT1A1 gene polymorphism analysis method of the present invention is a method for analyzing a polymorphism of a detection target site in the UGT1A1 gene, comprising the following steps (i) to (iv):
  • the polymorphism (UGT1A1 * 6, UGTIAI * 27 or UGTIAI * 28) in the UGT1A1 gene is detected as described above.
  • the target region including the target region can be amplified, and the polymorphism of the detection target region in the target region can be analyzed.
  • the probe in the step (ii) is not particularly limited. For example, a probe that hybridizes to the site of polymorphism UGT1A1 * 6 (hereinafter also referred to as "UGT1A1 * 6 probe"!
  • Probes that hybridize to the UGT1A1 * 27 site (hereinafter also referred to as “UGT1 A1 * 27 probe”! /), And probes that hybridize to the UGT1A1 * 28 site (hereinafter referred to as “UGT1A1 * 28”) Also referred to as “probe”.
  • These probes are preferably probes complementary to the detection target sequence including the detection target sequence. Any one of these probes may be used, or any two, or all three may be used.For example, the type of target region amplified by the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention. Can be determined according to When two or three types of probes are used, for example, the polymorphism of any two detection target sites or all three detection target sites can be analyzed using the same reaction solution.
  • the probe for detecting the polymorphism is not particularly limited, and can be set by a conventionally known method.
  • the detection target sequence including the polymorphic detection target site may be designed based on the sense strand sequence of the UGT1A1 gene, or may be designed based on the antisense strand sequence.
  • the base of the polymorphism detection target site can be appropriately determined according to the type of each polymorphism.
  • Each probe can be added to the amplification reaction solution after the step (i), that is, after performing the amplification reaction on the target region of the UGT1A1 gene. Therefore, prior to the amplification reaction in the step (i), it is preferably added in advance to the reaction solution.
  • the addition ratio of the probe in the reaction solution is not particularly limited! /, For example, it is preferable to add each probe in a range of 10 to 400 nmol, more preferably 20 to 200 nmol. It is.
  • this unlabeled probe may be used together with an unlabeled probe having the same sequence as the labeled probe.
  • phosphoric acid may be added to the 3 ′ end.
  • the molar ratio of the labeled probe to the unlabeled probe is preferably, for example, 1: 10-10: 1.
  • the length of the probe is not particularly limited, and is, for example, 5 to 50 mer, preferably 10 to 30 mer.
  • the Tm value will be described. As the solution containing double-stranded DNA is heated, the absorbance at 260 nm increases. This is because hydrogen bonds between both strands in double-stranded DNA are unwound by heating and dissociated into single-stranded DNA (DNA melting). When all double-stranded DNA is dissociated into single-stranded DNA, the absorbance is about 1.5 times the absorbance at the start of heating (absorbance of double-stranded DNA alone). Therefore, it can be judged that melting has been completed. Based on this phenomenon, the melting temperature Tm is generally defined as the temperature at which the absorbance reaches 50% of the total increase in absorbance.
  • the measurement of the signal indicating the dissolved state of the hybrid formed product of the amplification product and the probe may be performed by measuring the absorbance at 260 nm as described above. It may be a signal measurement.
  • a labeled probe labeled with a labeling substance is used as the probe, and the signal of the labeling substance can be measured.
  • the labeled probe include a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal by hybrid formation, or a labeled probe that does not show a signal alone and shows a signal by hybridization. If the probe is like the former, it forms a hybrid (double-stranded DNA) with the sequence to be detected!
  • polymorphisms can also be confirmed for the amplification products of two or three target regions amplified in the same reaction solution.
  • two or three types of probes they are preferably labeled with different labels that are detected under different conditions.
  • the labeling substance in the labeled probe include a fluorescent dye (fluorophore).
  • a probe that is labeled with a fluorescent dye exhibits fluorescence alone, and fluorescence decreases (for example, quenches) by hybridization is preferable.
  • a probe that uses such a quenching phenomenon is generally called a fluorescence quenching probe.
  • the probe it is preferable that the 3 ′ end or 5 ′ end of the oligonucleotide is preferably labeled with a fluorescent dye, and the base at the end to be labeled is preferably C.
  • the base pairing with the terminal base C of the labeled probe or the base pairing from the paired base is preferable to design the base sequence of the labeled probe.
  • a probe is generally called a guanine quenching probe and is known as a so-called QProbe (registered trademark).
  • QProbe registered trademark
  • Such a guanine quenching probe has a hive in the target sequence.
  • the terminal C labeled with the fluorescent dye approaches G in the DNA to be detected, whereby the emission of the fluorescent dye becomes weak (fluorescent intensity decreases).
  • the fluorescent dye is not particularly limited, and examples thereof include fluorescein, phosphor, rhodamine, polymethine dye derivatives and the like, and commercially available fluorescent dyes include, for example, BODIPY FL (trademark, Molecular 'Probe Co., Ltd.). ), FluorePrime (trade name, manufactured by Amersham Almacia), Fluoredite (trade name, manufactured by Millipore), FAM (manufactured by ABI), Cy 3 and Cy5 (manufactured by Amersham Almacia), TAMRA (manufactured by Molecular Probes) ) Etc.
  • the combination of fluorescent dyes used for multiple probes is not particularly limited as long as it can be detected under different conditions.
  • Pacific Blue detection wavelength 450 to 480 nm
  • TAMRA detection wavelength 585 to 700 nm
  • BODIPY Combinations of FL detection wavelength 515 to 555 nm
  • probe sequences for detecting polymorphisms UGT1A1 * 6, UGT1A1 * 27 and UGT1A1 * 28 are shown below, but the present invention is not limited thereto.
  • the probe (1) below is an example of a probe for UGT1A1 * 6, and is a probe for detecting the antisense strand.
  • the following probe (2) is an example of a probe for UGT1A1 * 27, the following (2-1) is a probe for detecting the antisense strand, and the following (2-2) is for detecting the sense strand It is a probe for.
  • the following probe (3) is an example of a probe for UGT1A1 * 28, and is a probe for detecting an antisense strand.
  • At least one oligonucleotide having the same sequence as the region from the 17th to the 25th base in the 5 ′ direction with the 2173rd cytosine base (C) in SEQ ID NO: 1 as the first base, wherein the cytosine base is 3. Oligonucleotide at the end
  • At least one oligonucleotide having the same sequence as the region from the 25th to the 31st base in the 3 direction starting from the 1892st cytosine base (C) in SEQ ID NO: 1 and having the cytosine base 3 ′ End oligonucleotide
  • the base corresponding to the 2160th position of SEQ ID NO: 1 is represented by r, and the r is G or A.
  • the base corresponding to the 2635th position of SEQ ID NO: 1 is represented by m, and the m is C or A.
  • the base complementary to the 2635th position of SEQ ID NO: 1 is represented by k, and the k is G or T.
  • the region corresponding to TATAbox from position 1895 of SEQ ID NO: 1 is 7 TA repeats or 6 TA repeats.
  • Tm (° C) is the Tm (° C) when the sequence shown in the table below and a completely complementary sequence are hybridized.
  • MELTCALC software http: //www.meltcalc. com /
  • the parameters were calculated with the oligonucleotide concentration of 0.2 ⁇ ⁇ and the sodium equivalent (Na eq.) 50 mM.
  • Probe (1) in the above table consists of the same sequence as the region where the 2160th position in SEQ ID NO: 1 is A, and the upper case base indicates the 2160th base of SEQ ID NO: 1. .
  • the capital letter base can be replaced with r, and r can be either A or G.
  • the probe (2-1) represented by SEQ ID NOs: 59 to 66 is composed of the same sequence as the region where the 2635th position in SEQ ID NO: 1 is A, and the upper case base is 2635 of SEQ ID NO: 1. The second base is indicated.
  • the capital letter base can be replaced by m, and m can be either A or C.
  • the probe (2-2) represented by SEQ ID NO: 100 to 105 is composed of a sequence complementary to the region where the 2635th position is A in SEQ ID NO: 1, and the capital letter base is the sequence. A base complementary to the 2635th base in No. 1 is shown.
  • the capital letter base can be replaced with k, and k can be either T or G.
  • Probe (3) in the following table has the same sequence force as the region where TATAbox from the 1895th in SEQ ID NO: 1 is 7 times TA-peet, and the upper case base indicates 7 times TA repeat. In the probe (3), TA repeat may be performed 7 times or 6 times.
  • Probe device in the present invention As a body example, for example, as described above, it may be a complementary strand of the oligonucleotide shown in the above table.
  • the probe is an example, and the present invention is not limited to this.
  • a probe for UGT1A1 * 6 among probes (1), an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55 or an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56 is preferred.
  • the oligonucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62 or the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 102 is preferred as a probe for UGT1A1 * 28.
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 69 is preferred.
  • the UGT1A1 * 6 probe and the UGT1A1 * 27 probe have cytosine at the 3 ′ end with a fluorescent dye (for example, Pacific Blue, TAMRA, etc.)
  • the labeled UGT1A1 * 28 probe is preferable to label the cytosine at the 5 'end with a fluorescent dye as described above (for example, BODIPY FU.
  • the fluorescent dye is labeled at the 5' end.
  • a phosphate group may be further added to the 3 ′ end of the probe.
  • PCR is performed as described above using the reaction solution to which the three kinds of labeled probes are added, and the three regions of the UGT1A1 gene are amplified simultaneously in the same reaction solution.
  • the reaction solution contains, for example, the UGT1A1 gene amplification primer set of the present invention, a DNA polymerase, dNTP, a sample containing a nucleic acid to be a cage, and the above three types of probes.
  • various additives that can be used for nucleic acid amplification may be included.
  • the obtained amplification product is dissociated, and the single-stranded DNA obtained by the dissociation and the labeled probe are hybridized. This can be done, for example, by changing the temperature of the reaction solution.
  • the heating temperature in the dissociation step is not particularly limited as long as the amplification product can be dissociated, and is, for example, 85 to 95 ° C.
  • the heating time is not particularly limited, but is usually 1 second to 10 minutes, preferably 1 second to 5 minutes.
  • Hybridization between the dissociated single-stranded DNA and the labeled probe can be performed, for example, by lowering the heating temperature in the dissociation step after the dissociation step.
  • temperature conditions it is 40-50 degreeC, for example.
  • the temperature of the reaction solution is changed, and a signal value indicating the melting state of the hybrid former between the amplification product and the labeled probe is measured.
  • the reaction solution hybridized product of the single-stranded DNA and the labeled probe
  • the fluctuation of the signal value accompanying the temperature rise is measured.
  • a probe labeled with a C-terminal at the end (guanine quenching probe) is used, fluorescence is reduced or quenched in the hybridized state with single-stranded DNA. Then, it emits fluorescence.
  • a hybrid that has decreased or quenched fluorescence may be gradually heated to measure the increase in fluorescence intensity with increasing temperature.
  • the temperature range for measuring the fluctuation of the fluorescence intensity is not particularly limited.
  • the start temperature is room temperature to 85 ° C, preferably 25 to 70 ° C
  • the end temperature is, for example, 40-105 ° C.
  • the rate of temperature increase is not particularly limited, but is, for example, 0. ° C / second, preferably 0.3-5 ° C / second.
  • the Tm value is determined by analyzing the fluctuation of the signal. Specifically, the amount of change in fluorescence intensity per unit time at each temperature (1 d increase in fluorescence intensity / dt) is calculated from the obtained fluorescence intensity, and the temperature showing the lowest value can be determined as the Tm value. . In addition, the point where the amount of increase in fluorescence intensity per unit time (fluorescence intensity increase / 1) is the highest can also be determined as straight. If a probe that does not show a signal alone and that shows a signal by hybridization is used as a labeled probe, on the contrary, measure the decrease in fluorescence intensity.
  • Tm value for each of the three types of probes under the conditions appropriate for each label.
  • the genotype at each detection target site is determined.
  • a hybrid (match) that is completely complementary has a higher Tm value indicating dissociation than a hybrid (mismatch) that differs in one base. Therefore, in advance, the genotype at each detection target site can be determined by determining the Tm value of a hybrid that is completely complementary to the probe and the Tm value of a hybrid that differs by one base. it can.
  • the base of the detection target site is a mutant type (for example, the 2160th base in SEQ ID NO: 1 is A) and a probe complementary to the detection target sequence containing it is used
  • the Tm of the hybrid formed Value As long as the Tm value of a completely complementary hybrid is the same, the polymorphism of the amplification product can be judged as a mutant type.
  • the polymorphism of the amplification product is the wild type (for example, For example, it can be determined that the 2160th base in SEQ ID NO: 1 is G).
  • the method of measuring the signal fluctuation accompanying the temperature increase by increasing the temperature of the reaction solution containing the probe (by heating the noble body).
  • signal fluctuations during hybridization may be measured.
  • the hybrid is formed by lowering the temperature of the reaction solution containing the probe, the signal fluctuation accompanying the temperature drop may be measured.
  • a labeled probe that shows a signal alone and does not show a signal due to hybridization for example, a guanine quenching probe
  • the single-stranded DNA and the probe are dissociated.
  • the fluorescence is reduced or quenched. Therefore, for example, the temperature of the reaction solution may be gradually lowered to measure the decrease in fluorescence intensity as the temperature drops.
  • the single-stranded DNA and the probe dissociate!
  • fluorescence is emitted. Therefore, for example, if the temperature of the reaction solution is gradually lowered, and the increase in fluorescence intensity accompanying the temperature drop is measured,
  • the primer set (1) to (3) corresponds to the target region! /, Either one or any two primer sets including the primer set for UGT1A1 gene amplification of the present invention, and Any force to hybridize to the target site to be detected, one type of probe or! /, Displacement force, use two types of probes!
  • Measurement wavelengths were 450 to 480 nm (detection of fluorescent dye Pacific Blue), 515 to 555 nm (detection of fluorescent dye BODIPY FL), and 585 to 700 nm (detection of fluorescent dye TAMRA).
  • the time required for 50 cycles of PCR was about 1 hour.
  • Tm value of hybrid matching UGTIAI * 27 probe is 61 ° C
  • Tm value of mismatching hybrid is 56 ° C
  • Tm value of hybrid matching UGTIAI * 28 probe is 58 ° C
  • mismatched hybrid Tm value is 54 ° C
  • the PCR reaction solution was heated from 40 ° C. to 75 ° C. at a temperature increase rate of C / 3 seconds, and the change in fluorescence intensity over time was measured.
  • the measurement wavelengths were 450 to 480 nm (detection of fluorescent dye Pacific Blue), 515 to 555 nm (detection of fluorescent dye BODIPY FL), and 585 to 700 nm (detection of fluorescent dye TAMRA).
  • Tm value of hybrid that matches probe for UGT1A1 * 6 is 57 ° C
  • Tm value of hybrid for mismatch is 50 ° C
  • Tm value of hybrid that matches probe for UGT1A1 * 27 is 57 ° C
  • mismatch The Tm value of the hybrid is 50 ° C
  • the Tm value of the hybrid that matches the UGT1A1 * 28 probe is 53 ° C
  • the Tm value of the mismatched hybrid is 49 ° C.
  • a region including a site where a specific polymorphism (UGT1A1 * 28, UGT1A1 * 6 or UGT1A1 * 27) in the UGT1A1 gene occurs is specifically high. Can be amplified with efficiency. For this reason, it is possible to reduce labor and cost unlike the conventional method as described above.
  • the region including the polymorphic detection target site is specifically amplified in this manner, for example, by using a probe complementary to the detection target sequence including the detection target site, the reaction solution is Use as is Tm analysis can be performed and the polymorphism can be typed.
  • the operation can be automated.
  • the primer set of the present invention is used, for example, even a sample containing impurities (for example, whole blood, oral mucosa, etc.), pretreatment can be omitted, so that an amplification reaction can be performed more quickly and easily.
  • the power to do is S.
  • an amplification reaction can be performed with an amplification efficiency superior to that of the prior art, so that the amplification reaction can be shortened. Therefore, according to the primer set of the present invention, the reagent containing the primer set, and the production method of the amplification product using them, the polymorphism of UGT1A1 gene can be analyzed quickly and easily.

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Description

明 細 書
UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む UGT1A1遺伝子 増幅用試薬およびその用途
技術分野
[0001] 本発明は、 UGT1A1遺伝子を増幅するためのプライマーセット、それを含む UGT 1A1遺伝子増幅用試薬およびその用途に関する。
背景技術
[0002] グルクロン酸転移酵素（UDP— Glucuronosyl Transferase： UGT)は、薬物、 異物、内在性物質であるビリルビン、ステロイドホルモン、胆汁酸等にグルクロン酸を 付加する反応を触媒する酵素であり、薬物代謝酵素として知られている。 UGTとして は、 UGT1ファミリーと UGT2ファミリ一とに分類される複数のアイソザィムが報告され ている。これらのアイソザィムの中でも UGT1ファミリーに属する UGT1A1をコードす る遺伝子（UGT1A1遺伝子）には、遺伝子多型が存在し、一般に、抗癌剤である塩 酸イリノテカンの副作用の発現に関与していると言われている。具体的には、患者が UGT1A1遺伝子多型を有する場合、高!/、抗腫瘍活性を有するイリノテカン加水分 解物（SN— 38)を UGTにより解毒する機能が低下するため、白血球の減少や下痢 等の重篤な副作用が生じることが報告されている。このような副作用に関与する代表 的な遺伝子多型として、プロモーター領域の多型 UGT1A1 * 28、ェキソン 1の多型 UGT1A1 * 6および UGT1A1 * 27が知られている。特に、 日本人を含むアジア人 においては、最も重要な多型 UGT1A1 * 28に加えて、さらに、多型 UGT1A1 * 6 および UGT1A1 * 27の少なくとも一方をあわせ持つことにより、より強い副作用が現 れ易いことが報告されている。また、 UGT1A1は、生体内においてグルクロン酸によ るビリルビン抱合に関わっていることから、その多型は、ギルバート症候群等の体質 性黄痕の原因にもなつている。このため、 UGT1A1遺伝子について複数の多型を 調べることは、抗癌剤による副作用の程度を予測し、副作用の発症を予測するため に、極めて重要である。
[0003] 他方、あらゆる疾患の原因や、個体間の疾患易罹患性 (疾患のかかり易さ）、個体 間における薬効の違い等を遺伝子レベルで解析する方法として、点突然変異、いわ ゆる一塩基多型（SNP)の検出が広く行われて!/、る。点突然変異の一般的な検出方 法としては、（1)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領域を PCR ( Polymerase chain reaction)により増幅させ、その全遺伝子配列を解析する Dir ect Sequencing法、（2)試料の標的 DNAについて、検出対象配列に相当する領 域を PCRにより増幅させ、前記検出対象配列における目的の変異の有無により切断 作用が異なる制限酵素によってその増幅産物を切断し、電気泳動することでタイピン グを行う RFLP解析、（3) 3'末端領域に目的の変異が位置するプライマーを用いて PCRを行い、増幅の有無によって変異を判断する ASP— PCR法等があげられる。
[0004] しかしながら、これらの方法は、例えば、試料から抽出した DNAの精製、電気泳動 、制限酵素処理等が必須であるため、手間やコストがかかってしまう。また、 PCRを行 つた後、反応容器を一旦開封する必要があるため、前記増幅産物が次の反応系に 混入し、解析精度が低下するおそれがある。さらに、 自動化が困難であるため、大量 のサンプルを解析することができない。また、前記（3)の ASP— PCR法については、 特異性が低!/ヽとレ、う問題もある。
[0005] このような問題から、近年、点突然変異の検出方法として、標的核酸とプローブとか ら形成される二本鎖核酸の融解温度（Tm： melting temperature)を解析する方 法が実用化されている。このような方法は、例えば、 Tm解析、または、前記二本鎖の 融解曲線の解析により行われることから、融解曲線解析と呼ばれている。これは、以 下のような方法である。すなわち、まず、検出目的の点突然変異を含む検出対象配 列に相補的なプローブを用いて、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの ハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成させる。続いて、このハイブリッド形成体に加熱処 理を施し、温度上昇に伴うハイブリッドの解離 (融解）を、吸光度等のシグナルの変動 によって検出する。そして、この検出結果に基づいて Τιι^直を決定することにより、点 突然変異の有無を判断する方法である。 Tm値は、ハイブリッド形成体の相同性が高 い程高ぐ相同性が低い程低くなる。このため、点突然変異を含む検出対象配列とそ れに相補的なプローブとのハイブリッド形成体について予め Tm値 (評価基準値）を 求めておき、検出試料の標的一本鎖 DNAと前記プローブとの Tm値 (測定値）を測 定する。前記測定値が評価基準値と同程度であれば、マッチ、すなわち標的 DNA に点突然変異が存在すると判断でき、測定値が評価基準値より低ければ、ミスマッチ 、すなわち標的 DNAに点突然変異が存在しないと判断できる。そして、この方法に よれば、遺伝子解析の自動化も可能である。
[0006] しかしながら、このような Tm解析を利用した検出方法についても、 PCRにおいて、 検出目的部位を含む領域を特異的且つ効率的に増幅できなければならないという 問題がある。特に、 UGTには多くのアイソザィムが存在し、それらをコードする配列も 極めて類似しているため、 PCRにおいて、 UGT1A1以外のアイソザィムのコード遺 伝子までもが増幅されるおそれがある。また、このように他のアイソザィムのコード遺 伝子までも増幅された場合、例えば、 UGT1A1遺伝子の特定の多型（UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6または UGT1A1 * 27)の解析（非特許文献 1)において、解析結 果の信頼性を低下させる原因にもなる。そして、このように、 1つのサンプルを解析す るにも多大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないとい う問題もある。
非特許文献 1 : PMID : 11156391 Cancer Res. 2000 Dec 15 ; 60 (24) : 69 21 - 6.
発明の開示
[0007] そこで、本発明は、遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子の目的領域を特異的に 増幅するためのプライマーセットの提供を目的とする。
[0008] 前記目的を達成するために、本発明のプライマーセットは、遺伝子増幅法により U
GT1A1遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、下記プライマーセット（1
)〜（3)からなる群から選択された少なくとも 1つのプライマーセットを含むことを特徴 とする。
プライマーセット（1)
下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2120番目のアデ二 ン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜22塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3 '末 および、
配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2140番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 5'方向に向かって 18〜34塩基目までの領域と同じ配列である 少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3'末端とするォ リゴヌタレ才チド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2226番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 3 '方向に向かって 17〜27塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2226番目のグァニン塩基（G)に 相補的なシトシン塩基（C)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2198番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 22〜39塩基目までの領域に相補的な少な くとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2198番目のシトシン塩基（C)に相補的 なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プライマーセット（2)
下記（F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2622番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 5 '方向に向かって 15〜27塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グァニン塩基（G)を 3 '末
(R2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2687番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 17〜26塩基目までの領域に相補的 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット（3)
下記（F3)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R3)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1863番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かって 17〜31塩基目までの領域と同じ配列 である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3 '末端と するオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1928番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 16〜20塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 1928番目のシトシン塩基（C)に 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[0009] また、本発明の遺伝子増幅用試薬は、遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子を増 幅するための試薬であって、前記本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット を含むことを特徴とする。
[0010] 本発明の増幅産物の製造方法は、遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子の増幅産 物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット を用いて、反応液中で、前記 UGT1A1遺伝子の増幅を行う工程
[0011] 本発明の多型解析方法は、 UGT1A1遺伝子における検出対象部位の多型を解 析する方法であって、下記 (i)〜（iv)工程を含むことを特徴とする。
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 UGT1A1遺伝子における検出対象部位 を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ϋ)前記 ω工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[0012] 本発明のプライマーセットによれば、 UGT1A1遺伝子における検出目的の多型（ UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6または UGT1A1 * 27)が発生する部位を含む目的 領域を、反応液中で特異的且つ高効率で増幅することができる。このため、前述のよ うな従来法とは異なり、手間やコストを低減することが可能となる。また、このように UG T1A1遺伝子の特定の多型が発生する検出対象部位を含む領域を特異的に増幅 できること力、ら、例えば、さらに、検出対象部位を含む検出対象配列に相補的なプロ ーブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記多型をタ ィビングすることが可能となる。また、 1つの反応液で、前記目的領域の増幅ならびに 多型のタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明 のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料 (例えば、全血や口 腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行 うこと力 Sできる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効 率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明 のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法 および多型解析方法によれば、 UGT1A1遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析で きること力も、医療分野にぉレ、てきわめて有効とレ、える。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]図 1は、本発明の実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 2]図 2は、本発明の前記実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 3]図 3は、本発明の前記実施例 1における Tm解析の結果を示すグラフである。
[図 4]図 4は、本発明の実施例 2における Tm解析の結果を示すグラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0014] < UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット〉
本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットは、前述のように、前記プライマ 一セット（1)〜（3)からなる群から選択された少なくとも 1つのプライマーセットを含む ことを特徴とする。少なくともいずれかのプライマーセットを含むことによって、例えば 、 UGT1A1遺伝子における特定の目的領域を特異的に増幅することが可能である [0015] 本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、前記プライマーセ ット（1)〜（3)のうちいずれ力、 1種類のみを含んでもよいし、いずれか 2種類、または、 プライマーセット（1)〜（3)の全てを含んでもよい。後述するが、プライマーセット（1) により特異的に増幅し得る目的領域は、 UGT1A1遺伝子において、多型 UGT1A1 * 6が発生する部位を含む領域であり、プライマーセット（2)により特異的に増幅し得 る目的領域は、 UGT1A1遺伝子において、多型 UGT1A1 * 27が発生する部位を 含む領域であり、プライマーセット（3)により特異的に増幅し得る目的領域は、 UGT1 A1遺伝子において、多型 UGT1A1 * 28が発生する部位を含む領域である。
[0016] 前述のように、 UGT1A1遺伝子のこれら 3種類の多型は、全て薬剤代謝に影響を 与える多型として知られていることから、いずれ力、 1種類だけでなぐいずれか 2種類 もしくは 3種類全ての多型を調べることが重要視されている。し力もながら、従来法で は、 1つの反応系において複数の配列を解析することができないという問題がある。こ れは、前述のように、 UGTには多くのアイソザィムが存在するため、 PCRにおいて、 UGT1A1以外のアイソザィムのコード遺伝子までもが増幅されることが原因と考えら れる。このため、 UGT1A1遺伝子の 3種類の多型（UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6 および UGT1A1 * 27)のうち、 2種類または 3種類全てを調べるには、それぞれの多 型が生じる部位を含む領域を、別個の反応系において各々増幅させ、得られた増幅 産物を別個に解析する必要がある。このように、従来の方法では、 UGT遺伝子の中 でも UGT1A1遺伝子のみを铸型とし、且つ、 UGT1A1遺伝子において、前記多型 が生じる部位をそれぞれ含む 2種類または 3種類の目的領域のみを特異的に増幅さ せることは極めて困難である。そして、このように、 1つのサンプルを解析するにも多 大な労力を伴うため、大量のサンプルを解析することは実用的ではないという問題が ある。これに対して、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットによれば、前 記プライマーセット（1)〜（3)のうち 、ずれ力、 2種類または 3種類全てを含む場合であ つても、それぞれの目的領域を、同一反応液において同時に且つ特異的に増幅す ること力 Sできる。このため、前述の従来法とは異なり、手間やコストを低減することが可 能となる。また、このように同一反応液において 2つまたは 3つの目的領域が特異的 に増幅されることから、例えば、それぞれの目的領域における検出対象配列に相補 的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記 2種類または 3種類の多型をそれぞれタイピングすることが可能となる。このように、 U GT1A1遺伝子における 2種類もしくは 3種類の多型を同一反応液で解析することが 可能となることから、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットは、例えば、 プライマーセット（1)〜（3)の!/、ずれ力、 1種類を含む場合はもちろんのこと、 V、ずれか 2種類もしくは 3種類を含むことも好ましい。このような UGT1A1遺伝子プライマーセ ットを用いて、 1つの目的領域はもちろんのこと、 2つまたは 3つの目的領域を同時に 増幅すれば、従来よりも効率よぐ UGT1A1遺伝子の多型解析を行うことができる。
[0017] なお、以下、フォワードプライマーを Fプライマー、リバースプライマーを Rプライマー ということがある。
[0018] 前記プライマーセット（1)は、前述のように、下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなる フォワードプライマーおよび下記（R1)のオリゴヌクレオチドからなるリバースプライマ 一を含む一対のプライマーセットである。
(F1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2120番目のアデ二 ン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜22塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3 '末 および、
配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2140番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜34塩基目までの領域と同じ配列である 少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3'末端とするォ リゴヌタレ才チド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2226番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 3 '方向に向力 て 17〜27塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2226番目のグァニン塩基（G)に 相補的なシトシン塩基（C)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド、 および、
配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2198番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 22〜39塩基目までの領域に相補的な少な くとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2198番目のシトシン塩基（C)に相補的 なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[0019] 配列番号 1に示す塩基配列は、ヒト（Homo sapiens)由来 UGT1ファミリーの UG T1A1遺伝子の完全長配列であり、例えば、 NCBIァクセッション： No. AY603772 に登録されている。
[0020] 前記プライマーセット（1)は、酉己歹 IJ番号 1における 2121番目〜 2225番目の領域、
2141番目〜 2197番目の領域、 2121番目〜 2197番目の領域、または、 2141番 目〜2225番目の領域の!/、ずれかを含む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させる ためのプライマーセットである。この領域内の 2160番目の塩基（配列番号 1における 2160番目の塩基）は、 UGT1A1の機能に影響を与える点突然変異（2160G、 216 OA)の存在が知られており、この多型が、前述の UGT1A1 * 6である。本発明にお いて、この部位の多型は、ホモ接合体の場合、 2060G/G、 2160A/A,ヘテロ接 合体の場合、 2160G/Aで表すことができる。以下、このプライマーセット（1)を、「U GT1A1 * 6用プライマーセット」ともいう。なお、 UGT1A1 * 6の多型のみを解析す る場合には、 UGT1A1 * 6用プライマーセットのみを使用すればよい。
[0021] 本発明において、プライマーセット（1)の F1プライマーおよび R1プライマーは、 DN Aポリメラーゼによる増幅の開始点を決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述 の条件を満たしていればよい。このように各プライマーの 3'末端の塩基を固定するこ とによって、プライマーセット（1)が、例えば、類似する他のアイソザィムの遺伝子（例 えば、 UGT1A3遺伝子、 UGT1A4遺伝子等）に結合することを十分に防止すること ができる。
[0022] このように、 F1プライマーおよび R1プライマーは、その 3'末端の塩基が固定されて いればよいことから、各プライマーの長さ自体は特に制限されず、一般的な長さに適 宜調整すること力できる。プライマーの長さの一例としては、例えば、 13〜50merの 範囲であり、好ましくは 14〜45merであり、より好ましくは 15〜40merである。具体 例として、前記 F1プライマーは、配列番号 1の塩基配列における 2120番目のアデ二 ン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜22塩基目（好ましくは、 19-22 塩基目、より好ましくは 19〜21塩基目 )までの領域と同じ配列である少なくとも 1つの オリゴヌクレオチド、または、配列番号 1の塩基配列における 2140番目のシトシン塩 基（C)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜34塩基目（好ましくは、 2；!〜 33塩基 目、より好ましくは 24〜31塩基目）までの領域と同じ配列である少なくとも 1つのオリ ゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R1プライマーは、配列番号 1の塩基 配列における 2226番目のグァニン塩基（G)を 1塩基目として 3'方向に向かって 17 〜27塩基目（好ましくは、 19〜26塩基目、より好ましくは 19〜23塩基目）までの領 域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチド、または、配列番号 1の塩基配列に おける 2198番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向力、つて 22〜39塩 基目（好ましくは、 23〜36塩基目、より好ましくは 25〜34塩基目）までの領域に相補 的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。なお、 F1プライマーと R 1プライマーの 3'末端がそれぞれ固定されていることから、プライマーから伸長する 領域は、例えば、前述のように配列番号 1における 2121番目〜 2225番目の領域、 2141番目〜 2197番目の領域、 2121番目〜 2197番目の領域、または、 2141番 目〜 2225番目の領域のいずれかである力 S、得られる増幅産物の全体の長さは使用 するプライマーの長さに応じて変化する。
[0023] また、 R1プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F1プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、各プライマーにおける 3'末端の塩基を除く部分において、完全に相 補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0024] 以下に、 F1プライマーと R1プライマーの具体例を示す力 本発明は、これには限 定されない。また、これらの F1プライマーと R1プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 4または配列番号 81のオリゴヌクレオチドから なる F1 'プライマーと、配列番号 13または配列番号 91のオリゴヌクレオチドからなる R 1 'プライマーとを含むプライマーセット（1 ' )が特に好ましい。なお、下記表における「 Tm (°C)」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とがハイブリッドした場合の Tm ( 。C)であり、 MELTCALCソフトウェア（http : //www. meltcalc. com/)により、 パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度 0· 、ナトリウム当量（Na eq. ) 50mMと して算出した値である（以下、同様）。前記 Tm値は、例えば、従来公知の MELTCA LCソフトウェア（http : ZZwww. meltcalc. com/)等により算出でき、また、隣接 法（Nearest Neighbor Method)によって決定することもできる（以下、同様）。
[表 1] プライマ一 配列 Tm(。C) 配列番号
5'-gcagcagaggggacatgaaata-3' 56.2 2
5'-cagcagaggggacatgaaata-3' 53.4 3
5'-agcagaggggacatgaaata-3 51.9 4
o -gcagaggggacatgaaata-3' 50.4 5
5'~cagaggggacatgaaata_3 46.7 6
o -ggggacatgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 65.9 74
5'-gggacatgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 64.8 75
5'-ggacatgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 63.6 76
5T-gacatgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 62.4 77
5'-acatgaaatag tg cctagcacctgacgc-3' 62 78
F1プライマ一 5'-catgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 61.1 フ 9
UGT1 A1 6用 5'-atgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 60.4 80
5'-tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 60.4 81
5'-gaaatagttKtcctagcacctgacgc-3' 59.3 82
5'~aaatagttgtcctagcacctgacgc-3' 58.7 83
5'-aatagttgtcctagcacctgacgc-3' 58.4 84
5'-atagttgtcctagcacctgacgc-3' 58.1 85
5'-tagttgtcctagcacctgacgc-3' 57.9 86
5'-agttgtcctagcacctgacgc-3' 58.3 87
5'~gttgtcctagcacctgacgc-3' 57.2 88
5'-ttgtcctagcacctgacgc-3' 56 89
5'—tfftcctagcacctgacgc_3' 55.4 90
5'-ctcaaaaacattatgcccgagactaac-3' 56.4 フ
5'-tcaaaaaca atgcccgagactaac-3' 55.7 3
5'-caaaaacattatgcccgagactaac-3' 54フ 9
5'-aaaaacattatgcccgagactaac-3' 53.5 10
5'-aaaacattatgcccgagactaac-3' 53 1 1
R1プライマ一 5'-aaacattatgcccgagactaac-3' 52.4 12
UGT1 A1 6用 5'-aacattatgcccgagactaac-3' 51.8 13
5'-acattatgcccgagactaac-3' 51.1 14
5'-cattatgcccgagactaac-3' 49.3 15
5'-attatgcccgagactaac-3' 47.4 16
5'-ttatgcccgagactaac-3' 46.6 17
5'-ccgagactaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 65 106
5'-cgagactaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' -64 107
5'-gagactaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 62.7 108
5'-agactaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 62.4 109
5'-gactaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 61.8 1 10
5'-actaacaaaagactctttcacatcctccctttgg~3' 61.5 1 1 1
5'-ctaacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 60.6 1 12
5'-taacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 60.2 1 13
5'-aacaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 60.6 114
5'-acaaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 60.4 115
5'-caaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 59.4 91
5'-aaaagactctttcacatcctccctttgg-3' 58.7 116
5'-aaagactctttcacatcctccctttgg-3' 58.4 1 17
5'-aagactctttcacatcctccctttgg-3' 58.1 1 18
5'-agactctttcacatcctccctttgg-3' 57.8 1 19
5'-gactctttcacatcctccctttgg-3' 56.8 120
5'-actctttcacatcctccctttgg-3' 55.9 121
5'-ctctttcacatcctccctttfifi-3' 54.5 122 [0026] つぎに、前記プライマーセット（2)は、前述のように、下記（F2)のオリゴヌクレオチド 力、らなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリゴヌクレオチドからなるリバース プライマーを含む一対のプライマーセットである。
(F2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2622番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 5 '方向に向かって 15〜27塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グァニン塩基（G)を 3 '末
(R2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2687番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 17〜26塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2687番目のシトシン塩基（C)に 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[0027] 前記プライマーセット（2)は、酉己歹 IJ番号 1における 2623番目〜 2686番目の領域を 含む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領 域内の 2635番目の塩基（配列番号 1における 2635番目の塩基）は、 UGT1A1の 機能に影響を与える点突然変異（2635C、 2635A)の存在が知られており、この多 型力 前述の UGT1A1 * 27である。本発明において、この部位の多型は、ホモ接 合体の場合、 2635C/C, 26359A/A,ヘテロ接合体の場合、 2635C/Aで表す こと力 Sできる。以下、このプライマーセット（2)を、「UGT1A1 * 27用プライマーセット 」ともいう。なお、 UGT1A1 * 27の多型のみを解析する場合には、 UGT1A1 * 27 用プライマーセットのみを使用すればよ!/、。
[0028] 本発明において、プライマーセット（2)の F2プライマーおよび R2プライマーは、前 記プライマーセット（1)と同様の理由から、 DNAポリメラーゼによる増幅の開始点を 決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このた め、 F2プライマーおよび R2プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の 長さが例示できる。具体例として、前記 F2プライマーは、配列番号 1の塩基配列にお ける 2622番目のグァユン塩基（G)を 1塩基目として 5'方向に向かって 15〜27塩基 目（好ましくは、 16〜27塩基目、より好ましくは 17〜27塩基目）までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R2ブラ イマ一は、配列番号 1の塩基配列における 2687番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目 として 3'方向に向かって 17〜26塩基目（好ましくは、 18〜26塩基目、より好ましくは 19〜26塩基目）までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであること が好ましい。なお、 F2プライマーと R2プライマーの 3'末端が固定されていることから 、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号 1における 2623番 目〜2686番目の領域である力 得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライ マーの長さに応じて変化する。
[0029] また、 R2プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F2プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、各プライマーにおける 3'末端の塩基を除く部分において、完全に相 補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0030] 以下に、 F2プライマーと R2プライマーの具体例を示す力 本発明は、これには限 定されない。また、これらの F2プライマーと R2プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 21または配列番号 92のオリゴヌクレオチドか らなる F2'プライマーと配列番号 29または配列番号 98のオリゴヌクレオチドからなる R2'プライマーとを含むプライマーセット（2' )が特に好ましい。
[0031] [表 2] プライマー 配列 Tm (°C) 配列番号
-ccttttcacagaactttctgtgcgacg-3' 60.5 92
5'-cttttcacagaactttctgtgcgacg~3' 58.9 93
5T-ttttcacagaactttctgtgcgacg 58.3 94
5'-tttcacagaactttctgtgcgacg-3' 58 95
5 -ttcacagaactttctgtgcgacg-j' 57.7 96
F2プライマ一 5'-tcacagaactttctgtgcgacg-3' 57.3 97
UGT1 A1 * 27ffl 5'-cacagaactttctgtgcgacg-3' 56.2 18
5'-acagaactttctgtgcgacg-3' 55 19
5'-cagaactttctgtgcgacg-3' 53.4 20
5 '-agaa ctttctgtgcgacg-3 ' 51.9 21
5'-gaactttctgtgcgacg-3' 50.3 22
5'-aactttctgtgcgacg-3' 48.7 23
5'—actttctgtgcgacg - 3' 47.6 24
5'-gccagacagatgcagagctcaatagg-3' 60.7 98
5'-ccagacagatgcagagctcaatagg-3' 58.6 99
5'-cagacagatgcagagctcaatagg~3' 56.7 25
5'-agacagatgcagagctcaatagg-3' 55.7 26
R2プライマー 5'-gacagatgcaga gctcaata g- 3 ' 54.5 27
UGT1 A1 * 27用 5'-aca ga tgca gage tea at a gg-3 ' 53.5 28
5'-ca gatgcagagc tea at a gg- 3 ' 51.9 29
5'-agatgcagagctcaatagg-3' 50.3 30
5 ' - ga tgca gage tea at a gg-3 ' 48.7 31
5し atgcagagctcaatagg - 3' 47 32 [0032] つぎに、前記プライマーセット（3)は、前述のように、下記（F3)のオリゴヌクレオチド 力、らなるフォワードプライマーおよび下記（R3)のオリゴヌクレオチドからなるリバース プライマーを含む一対のプライマーセットである。
(F3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1863番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かって 17〜31塩基目までの領域と同じ配列 である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3 '末端と するオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1928番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 16〜20塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 1928番目のシトシン塩基（C)に 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[0033] 前記プライマーセット（3)は、配列番号 2における 1864番目〜 1927番目の領域を 含む DNA鎖ならびにその相補鎖を増幅させるためのプライマーセットである。この領 域内には、 UGT1A1の機能に影響を与える点突然変異として、配列番号 1の 1895 番目から始まる TATAboxにおける変異（6回の TAリピート、 7回の TAリピート）が知 られており、この多型が、前述の UGT1A1 * 28である。本発明において、この部位 の多型は、ホモ接合体の場合、 1895— TA7/TA7、 1895— TA6/TA6、ヘテロ 接合体の場合、 1859— ΤΑ6/ΤΑ7で表すことができる。なお、配列番号 1は、 7回 の ΤΑリピートを有する多型 UGT1A1 * 28の配列である。以下、このプライマーセッ ト（3)を、「UGT1A1 * 28用プライマーセット」ともいう。なお、 UGT1A1 * 28の多型 のみを解析する場合には、 UGT1A1 * 28用プライマーセットのみを使用すればよ い。
[0034] 本発明において、プライマーセット（3)の F3プライマーおよび R3プライマーは、前 記プライマーセット（1)と同様の理由から、 DNAポリメラーゼによる増幅の開始点を 決定する役割を果たす 3'末端の塩基が、前述の条件を満たしていればよい。このた め、 F3プライマーおよび R3プライマーの長さ自体は特に制限されず、前述と同様の 長さが例示できる。具体例として、前記 F3プライマーは、配列番号 1の塩基配列にお ける 1863番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かって 17〜31塩基 目（好ましくは、 18〜28塩基目、より好ましくは 19〜24塩基目）までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであることが好ましい。また、前記 R3プラ イマ一は、配列番号 1の塩基配列における 1928番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目 として 3'方向に向かって 16〜20塩基目（好ましくは、 17〜20塩基目、より好ましくは 17〜： 19塩基目）までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであること が好ましい。なお、 F3プライマーと R3プライマーの 3'末端が固定されていることから 、プライマーから伸長する領域は、例えば、前述のように配列番号 2における 1864番 目〜 1927番目の領域である力 得られる増幅産物の全体の長さは、使用するプライ マーの長さに応じて変化する。
[0035] また、 R3プライマーは、配列番号 1に示す塩基配列に対して、 F3プライマーは、前 記塩基配列の相補鎖に対して、それぞれ完全に相補なオリゴヌクレオチドでなくとも よい。すなわち、各プライマーにおける 3'末端の塩基を除く部分において、完全に相 補なオリゴヌクレオチドと 1個〜 5個の塩基が異なっていてもよい。
[0036] 以下に、 F3プライマーと R3プライマーの具体例を示す力'、本発明は、これには限 定されない。また、これらの F3プライマーと R3プライマーとの組み合わせは何ら制限 されないが、これらの中でも、配列番号 42または配列番号 123のオリゴヌクレオチド 力、らなる F2'プライマーと配列番号 46または配列番号 48のオリゴヌクレオチドからな る R3'プライマーとを含むプライマーセット（3， )が特に好まし!/、。
[0037] [表 3] ブライマー 配列 Tm (°C) 配列番号
5'-agctttttatagtcacgtgacacag caaac-3' 59.5 123
5'-gctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3' 58.7 124
o -ctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-ύ' 56.8 33
5'-tttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3' 56.1 34
5'-ttttatagtcacgtgacacag caaac-3' 55.8 35
5 -tttatagtcacg gacacagtcaaac-j' 55.4 36
5'-ttatagtcacgtgacacagtcaaac-3' 55 37
F3プライマー 5' - tatagtcacgtgacacagtcaaac— 3' 54.5 38
UGT1 A1 用 5'-atagtcacgtgacacagtcaaac-3' 54.8 39
5'-tagtcacgtgacacagtcaaac-3' 54.5 40
5'-ag cacgtgacacagtcaaac-3' 54.8 41
5'-gtcacgtgacacagtcaaac-3' 53.5 42
5'-tcacgtgacacagtcaaac-3' 52.1 43
5'~cacgtgacacagtcaaac-3' 50.6 44
5' - acgtgacacastcaaac - 3' 48.7 45
5'-cgcctttgctcctgccagag-3' 59.9 46
R3プライマー 5'-gc ctttgctcctgcca gag-3' 57.3 4フ
UGT1 A1 * 28用 5 ' - c c tttgctc ctgc c aga g~ 3 ' 54.1 48
5'-ctttgctcctgccagag-3' 51.3 49
5'-tttEctcctgccagag-3' 49.7 50 [0038] また、前述したプライマーセット（1)〜（3)の各プライマーは、例えば、増幅反応の 反応温度を上げるために、従来公知の任意の配列を 5'末端に付加したものでもよい
〇
[0039] このようなプライマーセット（1)〜（3)の少なくとも 1つを含む本発明の UGT1A1遺 伝子増幅用プライマーセットは、例えば、全血試料等の生体試料における UGT1A1 遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に、本発明の UGT1A1遺伝子 増幅用プライマーセットを、後述するような多型の検出用プローブとともに使用する際 には、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を 0. ；!〜 0. 5体積％とす ることが好ましい。この点については、後述する。
[0040] < UGT1A1遺伝子増幅用試薬〉
本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬は、前述のように、遺伝子増幅法により UG T1A1遺伝子を増幅するための試薬であって、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プ ライマーセットを含むことを特徴とする。本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬は、 本発明のプライマーセットを含むことが特徴であり、これ以外の組成等については何 ら制限されない。
[0041] 本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬は、例えば、本発明のプライマーセットを用 いた遺伝子増幅法により得られる増幅産物を検出するために、さらに、 UGT1A1遺 伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブを含んでもよい。前述のように 本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットによれば、例えば、それに含まれ るプライマーセット（1)〜（3)の種類に応じて、遺伝子増幅法によって UGT1A1遺伝 子における 1つ〜 3つの目的領域の増幅産物が得られる。このため、前記各目的領 域における検出対象配列に相補的なプローブを共存させることによって、例えば、増 幅の有無や検出対象部位の遺伝子型（多型）等を、後述する方法によって検出する ことが可能である。このようなプローブやその利用方法に関しては、後の多型の解析 方法において説明する。また、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬は、全血等の 生体試料における UGT1A1遺伝子を増幅させる際に使用することが好ましい。特に 、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬を、前述のプローブとともに使用する際に は、遺伝子増幅用反応液における全血試料の添加割合を 0.；!〜 0. 5体積％とする ことが好ましい。なお、本発明において、「検出対象配列」とは、多型が発生する部位 (検出対象部位)を含む配列を意味する。
[0042] 本発明の UGT1A1遺伝子増幅用試薬の形態は、特に制限されず、例えば、本発 明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを含有する液体試薬でもよいし、使用 前に溶媒で懸濁する乾燥試薬であってもよい。また、 UGT1A1遺伝子増幅用プライ マーセットの含有量も、特に制限されない。
[0043] <増幅産物の製造方法〉
本発明の増幅産物の製造方法は、前述のように、遺伝子増幅法により UGT1A1遺 伝子の増幅産物を製造する方法であって、下記 (I)工程を含むことを特徴とする。
(I)試料中の核酸を铸型として、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット を用いて、反応液中で、前記 UGT1A1遺伝子の増幅を行う工程
[0044] このように本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを用いて増幅反応を 行うことによって、前述のように、 UGT1A1遺伝子の目的領域を増幅させることがで きる。また、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットが、前記プライマーセ ット（1)〜（3)のうち!/、ずれか 2種類を含む場合は、 UGT1A1遺伝子における 2つの 検出対象部位をそれぞれ含む 2つの目的領域を、同一反応液中で同時に増幅させ ること力 Sできる。また、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットが、前記プ ライマーセット（1)〜（3)の全てを含む場合には、 UGT1A1遺伝子における 3つの検 出対象部位をそれぞれ含む 3つの目的領域を、同一反応液中で同時に増幅させる こと力 Sできる。本発明により増幅させる目的領域は、前述のように、各多型 (UGT1A 1 * 28、 UGT1A1 * 6および UGT1A1 * 27)が発生する検出対象部位をそれぞれ 含む領域である。なお、本発明の増幅産物の製造方法においては、本発明のプライ マーセットを使用することが特徴であって、遺伝子増幅法の種類や条件等は何ら制 限されない。
[0045] 前記遺伝子増幅法としては、前述のように特に制限されず、例えば、 PCR(Polym erase Chain Reaction)法、 NASBA (Nucleic acid sequence based amp lification)法、 TMA (Transcription— mediated amplification)法、 SDA(Str and Displacement Amplification)法等があげられ、中でも、 PCR法が好ましい 。以下、 PCR法を例にあげて、本発明を説明するが、これには制限されない。
[0046] 本発明を適用する試料としては、例えば、铸型となる核酸を含んでいればよぐ特 に制限されないが、例えば、夾雑物が含まれる試料に適用することが好ましい。前記 夾雑物が含まれる試料としては、例えば、全血、口腔内細胞（例えば、口腔粘膜）、 爪や毛髪等の体細胞、生殖細胞、喀痰、羊水、パラフィン包埋組織、尿、胃液 (例え ば、胃洗浄液）等や、それらの懸濁液等があげられる。本発明のプライマーセットを用 いた増幅産物の製造方法によれば、例えば、様々な夾雑物が含まれる試料 (特に、 全血や口腔内細胞等の生体試料)であっても、その影響を受け難ぐ UGT1A1遺伝 子の前記目的領域を特異的に増幅することができる。このため、本発明によれば、従 来法では困難であった夾雑物の多い試料であっても、例えば、精製等の前処理を行 うことなく、そのまま使用することが可能である。したがって、試料の前処理の観点から も、従来法よりさらに迅速に増幅産物を調製することが可能といえる。
[0047] 前記反応液における試料の添加割合は、特に制限されな!/、。具体例として、前記 試料が生体試料 (例えば、全血試料）の場合、前記反応液における添加割合の下限 1S 例えば、 0. 01体積％以上であることが好ましぐより好ましくは 0. 05体積％以上 、さらに好ましくは 0. 1体積％以上である。また、前記添加割合の上限も、特に制限 されないが、例えば、 2体積％以下が好ましぐより好ましくは 1体積％以下、さらに好 ましくは 0. 5体積％以下である。
[0048] また、後述するような光学的検出を目的とする場合、特に、標識化プローブを用い た光学的検出を行う場合、前記反応液における全血試料等の生体試料の添加割合 は、例えば、 0.；!〜 0. 5体積％に設定することが好ましい。 PCR反応においては、 通常、 DNA変性（一本鎖 DNAへの解離）のために熱処理が施される力 この熱処 理によって、試料に含まれる糖やタンパク質等が変性し、不溶化の沈殿物や濁り等 が発生するおそれがある。このため、増幅産物の有無や検出対象部位の遺伝子型（ 多型）を光学的手法により確認する場合、このような沈殿物や濁りの発生が、測定精 度に影響を及ぼす可能性がある。し力、しながら、反応液における全血試料の添加割 合を前述の範囲に設定すれば、メカニズムは不明であるが、例えば、変性による沈殿 物等の発生による影響を十分に防止することができるため、光学的手法による測定 精度を向上できる。また、全血試料中の夾雑物による PCRの阻害も十分に抑制され るため、増幅効率をより一層向上することができる。したがって、本発明のプライマー セットの使用に加えて、さらに、全血試料等の試料の添加割合を前述の範囲に設定 することによって、より一層、試料の前処理の必要性を排除できる。
[0049] また、前記反応液中の全血試料の割合は、前述のような体積割合 (例えば、 0. ；!〜 0. 5体積0 /0)ではなぐヘモグロビン（以下、「Hb」という）の重量割合で表すこともで きる。この場合、前記反応液における全血試料の割合は、 Hb量に換算して、例えば 、0. 565〜； 113g/Lの範囲カ好ましく、より好ましく (ま 2. 825-56. 5g/Lの範囲、 さらに好ましくは 5. 65-28. 25 g/Lの範囲である。なお、前記反応中における 全血試料の添加割合は、例えば、前記体積割合と Hb重量割合の両方を満たしても よいし、いずれか一方を満たしてもよい。
[0050] 全血としては、例えば、溶血した全血、未溶血の全血、抗凝固全血、凝固画分を含 む全血等の!/、ずれであってもよ!/、。
[0051] 本発明にお!/、て、試料に含まれる標的核酸は、例えば、 DNAである。前記 DNA は、例えば、生体試料等の試料に元来含まれる DNAでもよいし、遺伝子増幅法によ り増幅させた増幅産物 DNAであってもよい。後者の場合、前記試料に元来含まれて いる RNA (トータル RNA、 mRNA等）から逆転写反応（例えば、 RT— PCR(Revers e Transcription PCR) )により生成させた cDNAがあげられる。
[0052] 本発明の増幅産物の製造方法において、遺伝子増幅反応の開始に先立ち、前記 反応液にさらにアルブミンを添加することが好ましい。このようなアルブミンの添加によ つて、例えば、前述のような沈殿物や濁りの発生による影響をより一層低減することが でき、且つ、増幅効率もさらに向上することができる。具体的には、前記 (I)工程の増 幅反応や、一本鎖 DNAへの解離工程前に、アルブミンを添加することが好ましい。
[0053] 前記反応液におけるアルブミンの添加割合は、例えば、 0. 0；!〜 2重量％の範囲で あり、好ましくは 0. ；!〜 1重量％であり、より好ましくは 0. 2〜0. 8重量％である。前記 アルブミンとしては、特に制限されず、例えば、ゥシ血清アルブミン（BSA)、ヒト血清 アルブミン、ラット血清アルブミン、ゥマ血清アルブミン等があげられ、これらはいずれ か一種類でもよレ、し 2種類以上を併用してもょレ、。 [0054] つぎに、本発明の増幅産物の製造方法に関し、全血試料について、 DNAを標的 核酸とし、前記プライマーセット（1)〜（3)を含む本発明の UGT1A1遺伝子増幅用 プライマーセットを用いた PCRにより、 UGT1A1遺伝子の 3つの目的領域の増幅産 物を製造する例をあげて説明する。なお、本発明は、本発明のプライマーセットを使 用することが特徴であり、他の構成ならびに条件は何ら制限されない。
[0055] まず、 PCR反応液を調製する。本発明のプライマーセットの添加割合は、特に制限 されないが、プライマーセット（；！）〜（3)の Fプライマーを、それぞれ 0· 1〜2 11101/ Lとなるように添カロすること力《好ましく、より好ましくは 0. 25-1. 5〃mol/Lであり、 特に好ましくは 0· 5〜1 11101/しである。また、プライマーセット（1)〜（3)の Rプライ マーを、それぞれ 0· 1〜2 11101/しとなるように添加することが好ましぐより好ましく (ま 0. 25—1. 5〃11101/しであり、特に好ましく (ま 0. 5〜1〃 mol/Lである。各プライ マーセットにおける Fプライマーと Rプライマーとの添加割合（F : R、モル比）は、特に 制限されないが、例えば、 1 : 0. 25〜； 1 : 4力 S好ましく、より好ましくは 1 : 0. 5〜； 1 : 2で ある。
[0056] 反応液における全血試料の割合は、特に制限されないが、前述の範囲が好ましい 。全血試料は、そのまま反応液に添加してもよいし、予め、水や緩衝液等の溶媒で希 釈してから反応液に添加してもよい。全血試料を予め希釈する場合、その希釈率は 特に制限されず、例えば、反応液での最終的な全血添加割合が前記範囲となるよう に設定できる力 ί列え (ま、、 100〜2000倍で り、好ましく (ま 200〜 000倍である。
[0057] 前記反応液における他の組成成分は、特に制限されず、従来公知の成分があげら れ、その割合も特に制限されない。前記組成成分としては、例えば、 DNAポリメラー ゼ、ヌクレオチド (ヌクレオシド三リン酸 (dNTP) )および溶媒があげられる。また、前 述のように前記反応液はさらにアルブミンを含有することが好ましい。なお、前記反応 液にぉレ、て、各組成成分の添加順序は何ら制限されな!/、。
[0058] 前記 DNAポリメラーゼとしては、特に制限されず、例えば、従来公知の耐熱性細菌 由来のポリメラーゼが使用できる。具体例としては、テルムス ·アクアティカス（Therm us aauaticus)由来 DNAポリメラーゼ（米国特許第 4, 889, 818号および同第 5, 079, 352号）（商品名 Taqポリメラーゼ）、テルムス'テルモフィラス（Thermus ther mophilus)由来 DNAポリメラーゼ（WO 91/09950) (rTth DNA polymerase )、ピロコッカス ·フリオサス（Pyrococcus 由来 DNAポリメラーゼ（WO 9
2/9688) (Pfu DNA polymerase： Stratagenes社製）、テルモコッカス'リトラリ ス (Thermococcus litoralis)由来 DNAポリメラーゼ（EP— A 455 430) (商標 V ent : Biolab New England社製）等が商業的に入手可能であり、中でも、テルムス •アクアティカス (Thermus aauaticus)由来の耐熱性 DNAポリメラーゼが好まし!/ヽ
〇
[0059] 前記反応液中の DNAポリメラーゼの添加割合は、特に制限されないが、例えば、 1 〜； 100U/mLであり、好ましくは 5〜50U/mLであり、より好ましくは 20〜30U/m Lである。なお、 DNAポリメラーゼの活性単位（U)は、一般に、活性化サケ精子 DN Aを铸型プライマーとして、活性測定用反応液中、 74°Cで、 30分間に lOnmolの全 ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性力 S1Uである。前記活性測定用反応 液の糸且成は、例えば、 25mM TAPS buffer (pH9. 3、 25。C)、 50mM KC1、 2 mM MgCl 、 ImMメノレカプトエタノーノレ、 200 μ M dATP、 200 μ M dGTP、 2
2
00 Μ dTTP、 100 M「 α— 32P」dCTP、 0. 25mg/mL活性化サケ精子 DNA である。
[0060] 前記ヌクレオシド三リン酸としては、通常、 dNTP (dATP、 dCTP、 dTTP)があげら れる。前記反応液中の dNTPの添加割合は、特に制限されないが、例えば、 0. 01 〜； lmmol/Lであり、好ましくは 0· 05—0. 5mmol/Lであり、より好ましくは 0· ；!〜 0. 3mmolZLでめる。
[0061] 前記溶媒としては、例えば、 Tris-HCl, Tricine, MES、 MOPS, HEPES、 CA PS等の緩衝液があげられ、市販の PCR用緩衝液や市販の PCRキットの緩衝液等が 使用できる。
[0062] また、前記 PCR反応液は、さらに、へパリン、ベタイン、 KC1、 MgCl 、 MgSO、グリ
2 4 セロール等を含んでもよぐこれらの添加割合は、例えば、 PCR反応を阻害しない範 囲で設定すればよい。
[0063] 反応液の全体積は、特に制限されず、例えば、使用する機器 (サーマルサイクラ一 )等に応じて適宜決定できる力 通常、 1〜500 しであり、好ましくは 10〜； 100 し である。
[0064] つぎに、 PCRを行う。 PCRのサイクル条件は特に制限されないが、例えば、（1)全 血由来二本鎖 DNAの 1本鎖 DNAへの解離、（2)プライマーのアニーリング、（3)プ ライマーの伸長（ポリメラーゼ反応）は、それぞれ以下の通りである。また、サイクル数 も特に制限されないが、下記（1)〜（3)の 3ステップを 1サイクルとして、例えば、 30サ イタル以上が好ましい。上限は特に制限されないが、例えば、合計 100サイクル以下 、好ましくは 70サイクル以下、さらに好ましくは 50サイクル以下である。各ステップの 温度変化は、例えば、サーマルサイクラ一等を用いて自動的に制御すればよい。本 発明のプライマーセットを使用した場合、前述のように増幅効率に優れるため、従来 の方法によれば 50サイクルに 3時間程度を要していたのに対して、本発明によれば、 約 1時間程度（好ましくは 1時間以内）で 50サイクルを完了することも可能である。
[0065] [表 4]
Figure imgf000024_0001
[0066] 以上のようにして、 UGT1A1遺伝子の 3つの目的領域に相補的な増幅産物を製造 すること力 Sできる。なお、 3つの目的領域のうちいずれ力、 1つまたはいずれ力、 2つに相 補的な増幅産物を製造する場合には、例えば、プライマーセット（1)〜（3)のうち目 的領域に対応するレ、ずれ力、 1種類または!/、ずれか 2種類のプライマーセットを含む、 本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを使用すればよい。
[0067] 本発明の増幅産物の製造方法は、さらに、前述の増幅反応によって得られた目的 領域の増幅産物を検出する工程を含んでもよい。これによつて、増幅産物の有無や 、 UGT1A1遺伝子の前記目的領域における遺伝子型（多型 UGT1A1 * 6、 UGT1 Al * 27、または、 UGTIAI * 28)を検出することもできる。増幅産物の有無は、従 来公知の方法により確認できる。具体的には、例えば、前記 (I)工程において、前記 反応液に、さらに、 UGT1A1遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプロ一 ブ（例えば、蛍光標識化プローブ）を添加しておき、さらに、（Π)工程として、前記反応 液について、前記プローブにおける蛍光標識の蛍光強度を測定することによって確 認できる。また、増幅させる目的領域が 2つまたは 3つの場合には、例えば、前記 (I) 工程において、前記反応液に、さらに、 UGT1A1遺伝子の各検出対象部位にハイ ブリダィズ可能なプローブ (例えば、蛍光標識化プローブ）を 2種類または 3種類添カロ しておき、さらに、（Π)工程として、前記反応液について、各プローブにおける各蛍光 標識の蛍光強度を測定することによって確認できる。なお、 UGT1A1遺伝子におけ る多型 UGTIAI * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28の検出については、 本発明の一形態として、以下に説明する。
[0068] < UGT1A1遺伝子の多型解析方法〉
本発明の UGT1A1遺伝子の多型解析方法は、 UGT1A1遺伝子における検出対 象部位の多型を解析する方法であって、下記 (i)〜（iv)工程を含むことを特徴とする
〇
(i)本発明の増幅産物の製造方法により、 UGT1A1遺伝子における検出対象部位 を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ϋ)前記 ω工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[0069] このように本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを用いて増幅産物を 製造することによって、前述のように UGT1A1遺伝子における多型（UGT1A1 * 6 、 UGTIAI * 27または UGTIAI * 28)の検出対象部位を含む目的領域を増幅し 、前記目的領域における検出対象部位の多型を解析することができる。 [0070] 前記（ii)工程におけるプローブは、特に制限されず、例えば、多型 UGT1A1 * 6 の発生部位にハイブリダィズするプローブ（以下、「UGT1A1 * 6用プローブ」とも!/ヽ う）、多型 UGT1A1 * 27の発生部位にハイブリダィズするプローブ（以下、「UGT1 A1 * 27用プローブ」とも!/、う）、および、多型 UGT1A1 * 28の発生部位にハイブリ ダイズするプローブ（以下、「UGT1A1 * 28用プローブ」ともいう）があげられる。これ らのプローブは、前記検出対象配列を含む検出対象配列に相補的なプローブであ ることが好ましい。これらのプローブは、いずれ力、 1種類でもよいし、いずれか 2種類ま たは 3種類全てであってもよぐ例えば、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマ 一セットによって増幅させた目的領域の種類に応じて決定できる。 2種類または 3種 類のプローブを用いた場合、例えば、同一反応液を用いて、いずれか 2つの検出対 象部位または前記 3つ全ての検出対象部位の多型を解析することができる。
[0071] 前記多型を検出するためのプローブは、特に制限されず、従来公知の方法によつ て設定できる。例えば、多型の検出対象部位を含む検出対象配列として、 UGT1A1 遺伝子のセンス鎖の配列に基づいて設計してもよいし、アンチセンス鎖の配列に基 づいて設計してもよい。また、多型の検出対象部位の塩基は、各多型の種類に応じ て適宜決定できる。すなわち、 UGT1A1 * 6の場合、酉己歹 IJ番号 1における 2160番目 の塩基に「G」および「A」の多型が知られていることから、例えば、 2160番目が Gで ある検出対象配列、および、 2160番目が Aである検出対象配列のいずれかに相補 的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的 なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）があげられる。また、 UGT1A1 * 27 の場合、配列番号 1における 2635番目の塩基に「C」および「A」の多型が知られて いることから、例えば、 2635番目力 である検出対象酉己列、および、 2635番目力 である検出対象配列のいずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ） や、そのアンチセンス鎖の配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プロ一 ブ）があげられる。また、 UGT1A1 * 28の場合、酉己歹 IJ番号 1における 1895番目力、ら 始まる TATAboxの塩基に「 6回の TA ピート： TA6」および「 7回の TA ピート： TA 7」の多型が知られていることから、例えば、 1895番目力もの TAリピートが 6回である 検出対象配列、および、 1895番目力もの TAリピートが 7回である検出対象配列のい ずれかに相補的なプローブ（センス鎖の検出用プローブ）や、そのアンチセンス鎖の 配列に相補的なプローブ（アンチセンス鎖の検出用プローブ）等があげられる。この ように、多型が生じる検出対象部位の塩基を前述のようないずれかの塩基に設定し てプローブを設計しても、後述するような方法により、 UGT1A1遺伝子の各検出対 象部位においてどのような多型を示すかを判断することが可能である。
[0072] 前記各プローブは、前記（i)工程の後、すなわち、 UGT1A1遺伝子の目的領域に ついて増幅反応を行った後、増幅反応液に添加することもできる力 容易且つ迅速 に解析を行えることから、前記 (i)工程の増幅反応に先立って、予め反応液に添加し ておくことが好ましい。
[0073] 前記反応液におけるプローブの添加割合は、特に制限されな!/、が、例えば、各プ ローブを 10〜400nmolの範囲となるように添加することが好ましぐより好ましくは 20 〜200nmolである。また、プローブの標識として蛍光色素を用いている場合、例えば 、検出する蛍光強度を調整するために、標識化プローブと同じ配列である未標識プ ローブを併用してもよぐこの未標識プローブは、その 3'末端にリン酸が付加されても よい。この場合、標識化プローブと非標識プローブのモル比は、例えば、 1： 10-10 : 1が好ましい。前記プローブの長さは、特に制限されず、例えば、 5〜50merであり 、好ましくは 10〜30merである。
[0074] Tm値について説明する。二本鎖 DNAを含む溶液を加熱していくと、 260nmにお ける吸光度が上昇する。これは、二本鎖 DNAにおける両鎖間の水素結合が加熱に よってほどけ、一本鎖 DNAに解離 (DNAの融解）することが原因である。そして、全 ての二本鎖 DNAが解離して一本鎖 DNAになると、その吸光度は加熱開始時の吸 光度（二本鎖 DNAのみの吸光度）の約 1. 5倍程度を示し、これによつて融解が完了 したと判断できる。この現象に基づき、融解温度 Tmとは、一般に、吸光度が、吸光度 全上昇分の 50%に達した時の温度と定義される。
[0075] 前記（iii)工程にお!/、て、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形成体の融 解状態を示すシグナルの測定は、前述した、 260nmの吸光度測定でもよいが、標識 物質のシグナル測定であってもよい。具体的には、前記プローブとして、標識物質で 標識化された標識化プローブを使用し、前記標識物質のシグナル測定を行うことが 好ましい。前記標識化プローブとしては、例えば、単独でシグナルを示し且つハイブ リツド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さ ず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブがあげられる。前者の ようなプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成して!/、る 際にはシグナルを示さず、加熱によりプローブが遊離するとシグナルを示す。また、 後者のプローブであれば、検出対象配列とハイブリッド（二本鎖 DNA)を形成するこ とによってシグナルを示し、加熱によりプローブが遊離するとシグナルが減少（消失） する。したがって、この標識によるシグナルをシグナル特有の条件（吸収波長等）で検 出することによって、前記 260nmの吸光度測定と同様に、ハイブリッド形成体の融解 の進行ならびに Tm値の決定等を行うことができる。
[0076] 本発明においては、前述のように、同一反応液で増幅させた 2つまたは 3つの目的 領域の増幅産物について多型を確認することもできる。このため、 2種類または 3種 類のプローブを使用する際には、それぞれ異なる条件で検出される異なる標識によ つて標識化されていることが好ましい。このように異なる標識を使用することによって、 同一反応液であっても、検出条件を変えることによって、各増幅産物を別個に解析 すること力 S可倉 となる。
[0077] 前記標識化プローブにおける標識物質の具体例としては、例えば、蛍光色素（蛍 光団）があげられる。前記標識化プローブの具体例としては、例えば、蛍光色素で標 識され、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が減少（例えば、消光）す るプローブが好ましい。このような蛍光消光現象（Quenching phenomenon)を禾 lj 用したプローブは、一般に、蛍光消光プローブと呼ばれる。中でも、前記プローブとし ては、オリゴヌクレオチドの 3 '末端もしくは 5 '末端が蛍光色素で標識化されているこ とが好ましぐ標識化される前記末端の塩基は、 Cであることが好ましい。この場合、 前記標識化プローブがハイブリダィズする検出対象配列において、前記標識化プロ ーブの末端塩基 Cと対をなす塩基もしくは前記対をなす塩基から;!〜 3塩基離れた塩 基が Gとなるように、前記標識化プローブの塩基配列を設計することが好ましい。この ようなプローブは、一般的にグァニン消光プローブと呼ばれ、いわゆる QProbe (登録 商標）として知られている。このようなグァニン消光プローブが検出対象配列にハイブ リダィズすると、蛍光色素で標識化された末端の Cが、前記検出対象 DNAにおける Gに近づくことによって、前記蛍光色素の発光が弱くなる（蛍光強度が減少する）とい う現象を示す。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダ ィズと解離とを容易に確認すること力 Sできる。
[0078] 前記蛍光色素としては、特に制限されないが、例えば、フルォレセイン、リン光体、 ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、 BODIPY FL (商標、モレキュラー 'プローブ社製）、 FluorePrime (商品名、アマシ ャムフアルマシア社製）、 Fluoredite (商品名、ミリポア社製）、 FAM (ABI社製）、 Cy 3および Cy5 (アマシャムフアルマシア社製）、 TAMRA (モレキュラープローブ社製） 等があげられる。複数のプローブに使用する蛍光色素の組み合わせは、例えば、異 なる条件で検出できればよぐ特に制限されないが、例えば、 Pacific Blue (検出波 長 450〜480nm)、 TAMRA (検出波長 585〜700nm)および BODIPY FL (検 出波長 515〜555nm)の組み合わせ等があげられる。
[0079] 以下に、多型 UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28を検出するた めのプローブの配列の具体例を示すが、本発明は、これには制限されない。下記プ ローブ（1)は、 UGT1A1 * 6用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するた めのプローブである。下記プローブ（2)は、 UGT1A1 * 27用プローブの一例であり 、下記（2-1)は、アンチセンス鎖を検出するためのプローブであり、下記（2— 2)は、 センス鎖を検出するためのプローブである。また、下記プローブ（3)は、 UGT1A1 * 28用プローブの一例であり、アンチセンス鎖を検出するためのプローブである。
[0080] プローブ（1)
配列番号 1における 2173番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かつ て 17〜25塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドで あって、前記シトシン塩基を 3，末端とするオリゴヌクレオチド
プローブ（2)
(2— 1)配列番号 1における 2645番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に 向かって 15〜22塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオ チドであって、前記シトシン塩基を 3'末端とするオリゴヌクレオチド、 および、
(2- 2)配列番号 1における 2625番目のグァニン塩基 (G)を 1塩基目として 3'方向 に向かって 17〜22塩基目までの領域に相補的な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチド であって、前記グァニン塩基に相補的なシトシン塩基（C)を 3'末端とするオリゴヌタレ ォチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プローブ（3)
配列番号 1における 1892番目のシトシン塩基（C)を 1塩基目として 3方向に向かって 25〜31塩基目までの領域と同じ配列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであつ て、前記シトシン塩基を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[0081] 前記プローブ（1)において、配列番号 1の 2160番目にあたる塩基は、 rで表され、 前記 rは、 Gまたは Aである。前記プローブ（2— 1)において、配列番号 1の 2635番 目にあたる塩基は、 mで表され、前記 mは、 Cまたは Aである。前記プローブ（2— 2) において、配列番号 1の 2635番目に相補的な塩基は、 kで表され、前記 kは、 Gまた は Tである。前記プローブ（3)において、配列番号 1の 1895番目からの TATAbox にあたる領域は、 7回の TAリピートまたは 6回の TAリピートである。
[0082] さらに、前記プローブ（1)、プローブ（2)およびプローブ（3)の具体例を下記表に示 す。なお、下記表における「Tm(°C)」は、下記表の配列と完全に相補的な配列とが ハイブリッドした場合の Tm (°C)であり、 MELTCALCソフトウェア（http： //www . meltcalc. com/)により、パラメーターをオリゴヌクレオチド濃度 0· 2 ^ Μ、ナトリウ ム当量（Na eq. ) 50mMとして算出した値である。
[0083] [表 5] 配列 Tm (°C) 配列番号
5'-catcagagacAgagcattttacac-3' 53.7 51
5'-atcagagacAgagcattttacac-3' 52.4 52
5'-tcagagacAgagcattttacac-3' 52.1 53
プローブ (1 ) o -cagagacAgagcattttacac-3' 50.7 54
UGT1 A1 * 6用 5'-agagacAgagcattttacac-3' 49.1 55
5'-gagacAgagcattttacac-3' 47.6 56
5' - agacAgagcattttacac - 3' 45.6 57
5'-gacAgagcattttacac-3' 44.1 58
5'-tggtttattcccAgtatgcaacc-3' 53.2 59
5'~ggtttattcccAgtatgcaacc-3' 50.9 60
5'-tttattcccAgtatgcaacc-3' 49.3 61
5'-ttattcccAgtatgcaacc-3' 48.5 62
5'-tattcccAgtatgcaacc-3T 47.5 63
5'-attcccAg atgcaacc-3' 47.5 64
プローブ (2) 5'-ttcccAgtatgcaacc-3' 46.5 65
UGT1 A1 *27用 5'-tcccAgtatgcaacc-3' 45.4 66
5'-gggttgcatacTgggaataaac"3' 53.2 100
5'-ggttgcatacTgggaataaac-3' 50.9 101
5'-gttgcatacTgggaataaac-3' 48.4 102
5'— ttgcatacTgggaataaac— 3' 46.4 103
5'-tgcatacTgggaataaac-3' 45.5 104
5'-gcatacTgggaataaac-3' 43.2 105
5 -ccaTATATATATATATAtaagtaggagaggg-3' 49.5 67
5'-ccaTATATATATATATAtaafftaggagagg-3' 47.7 68 プローブ (3) 5'-ccaTATATATATATATAtaagtaggagag-3' 45.8 69
UGT1 A1 * 28用 5'-ccaTATATATATATATAtaagtaggaga-3' 44.6 フ 0
5'-ccaTATATATATATATAtaagtaggag-3' 43.3 71
5'-ccaTATATATATATATAtaagtagga-3' 41.9 72
5'-ccaTATATATATATATAtaafftagg-3' 40.5 73 前記表におけるプローブ（1)は、配列番号 1における 2160番目が Aである領域と 同じ配列からなり、大文字の塩基が、配列番号 1の 2160番目の塩基を示す。なお、 前記プローブ（1)において、前記大文字の塩基は、 rに置き換えることができ、前記 r は、 Aおよび Gのいずれでもよい。下記表において、配列番号 59〜66で表されるプ ローブ（2— 1)は、配列番号 1における 2635番目が Aである領域と同じ配列からなり 、前記大文字の塩基が、配列番号 1の 2635番目の塩基を示す。なお、前記プロ一 ブ（2— 1)において、前記大文字の塩基は、 mに置き換えることができ、前記 mは、 A および Cのいずれでもよい。下記表において、配列番号 100〜； 105で表されるプロ一 ブ（2— 2)は、配列番号 1における 2635番目が Aである領域に相補的な配列からな り、大文字の塩基が、配列番号 1における 2635番目の塩基に相補的な塩基を示す。 なお、前記プローブ（2— 2)において、前記大文字の塩基は、 kに置き換えることがで き、前記 kは、 Tおよび Gのいずれでもよい。下記表におけるプローブ（3)は、配列番 号 1における 1895番目からの TATAboxが 7回の TA ピートである領域と同じ配列 力らなり、大文字の塩基が、 7回の TAリピートを示す。なお、前記プローブ（3)におい て、 TAリピートは、 7回および 6回のいずれでもよい。本発明におけるプローブの具 体例としては、例えば、前述のように、前記表に示すオリゴヌクレオチドの相補鎖であ つてもよい。
[0085] 前記プローブは一例であって、本発明はこれには限定されない。 UGT1A1 * 6用 プローブとしては、プローブ（1)の中でも、配列番号 55の塩基配列からなるオリゴヌク レオチド、または、配列番号 56の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましぐ U GT1A1 * 27用プローブとしては、プローブ（2)の中でも、配列番号 62の塩基配列 力もなるオリゴヌクレオチド、または、配列番号 102の塩基配列からなるオリゴヌクレオ チドが好ましぐ UGT1A1 * 28用プローブとしては、プローブ（3)の中でも、配列番 号 69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。
[0086] そして、これらのプローブは、 2種類以上を使用する際には、前述のように、それぞ れ異なる蛍光色素（異なる波長で検出される蛍光色素）で標識化することが好ましレヽ 。例えば、前記表に示すプローブをグァニン消光プローブとする場合、 UGT1A1 * 6用プローブおよび UGT1A1 * 27用プローブは、 3'末端のシトシンを前述のような 蛍光色素（例えば、 Pacific Blue, TAMRA等）で標識化し、 UGT1A1 * 28用プ ローブは、 5'末端のシトシンを前述のような蛍光色素（例えば、 BODIPY FUで標 識化すること力 S好ましい。また、 5'末端に蛍光色素を標識化したプローブは、例えば 、プローブ自体が伸長することを予防するために、その 3'末端に、さらにリン酸基が 付加されてもよい。
[0087] 次に、本発明の検出方法について、一例として、下記プローブを用いて、 UGT1A 1遺伝子における 3つの多型 UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6および UGT1A1 * 27 を検出する方法を説明する。なお、本発明はこれには制限されない。
[0088] (プローブ）
UGT1A1 * 6用プローブ
5 —agagacaGagcattttacac (Pacific Blue;—3 (酉歹1 J番号 55)、まには、
5 gagacaGagcattttacac (Pacific Blue) 3 (酉歹1 J番号! 56)
UGT1A1 * 27用プローブ
5， - ttattcccAgtatgcaacc - (TAMRA) - 3 ' (配列番号 62)、または、 5， - gttgcatacTgggaataaac - (TAMRA) - 3 ' (配列番号 102) UGT1A1 * 28用プローブ
5' -(BODIPY FL) - ccaTATATATATATATAtaagtaggagag - 3 ' (配列番号 69
)
[0089] まず、前記 3種類の標識化プローブを添加した反応液を用いて、前述のように PCR を行い、同一反応液中で、 UGT1A1遺伝子の 3つの領域を同時に増幅させる。前 記反応液は、例えば、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット、 DNAポリ メラーゼ、 dNTP、铸型となる核酸を含む試料、および、前記 3種類のプローブを含 む。この他に、核酸増幅に使用できる種々の添加剤を含んでもよい。
[0090] 次に、得られた増幅産物の解離、および、解離により得られた一本鎖 DNAと前記 標識化プローブとのハイブリダィズを行う。これは、例えば、前記反応液の温度変化 によって fiうことができる。
[0091] 前記解離工程における加熱温度は、前記増幅産物が解離できる温度であれば特 に制限されないが、例えば、 85〜95°Cである。加熱時間も特に制限されないが、通 常、 1秒〜 10分であり、好ましくは 1秒〜 5分である。
[0092] 解離した一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリダィズは、例えば、前記解 離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことがで きる。温度条件としては、例えば、 40〜50°Cである。
[0093] そして、前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記標識化プローブとの ハイプリッド形成体の融解状態を示すシグナル値を測定する。具体的には、例えば、 前記反応液（前記一本鎖 DNAと前記標識化プローブとのハイブリッド形成体）を加 熱し、温度上昇に伴うシグナル値の変動を測定する。前述のように、末端の C塩基が 標識化されたプローブ（グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAとのハ イブリダィズした状態では、蛍光が減少ほたは消光）し、解離した状態では、蛍光を 発する。したがって、例えば、蛍光が減少ほたは消光）しているハイブリッド形成体を 徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定すればよい。
[0094] 蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始 温度が室温〜 85°Cであり、好ましくは 25〜70°Cであり、終了温度は、例えば、 40〜 105°Cである。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、 0. ；!〜 20 °C /秒であり、好ましくは 0. 3〜5°C/秒である。
[0095] 次に、前記シグナルの変動を解析して Tm値を決定する。具体的には、得られた蛍 光強度から、各温度における単位時間当たりの蛍光強度変化量（一 d蛍光強度増加 量/ dt)を算出し、最も低い値を示す温度を Tm値として決定できる。また、単位時間 当たりの蛍光強度増加量 (蛍光強度増加量/ 1)が最も高い点を Τι^直として決定す ることもできる。なお、標識化プローブとして、消光プローブではなぐ単独でシグナル を示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、 反対に、蛍光強度の減少量を測定すればょレ、。
[0096] 本発明においては、 3つの多型 UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1
* 28を検出するため、 3種類のプローブの各標識に応じた条件で、それぞれの Tm 値を決定する。 UGT1A1 * 6用プローブの Pacific Blueは、例えば、検出波長 45 0〜480nm、 UGT1A1 * 27用プローブの TAMRAは、例えば、検出波長 585〜7 OOnm、 UGT1A1 * 28用プローブの BODIPY FLは、例えば、検出波長 515〜5 55nmで検出することができる。
[0097] そして、これらの Tm値から、各検出対象部位における遺伝子型を決定する。 Tm解 析において、完全に相補であるハイブリッド（マッチ）は、一塩基が異なるハイブリッド（ ミスマッチ）よりも、解離を示す Tm値が高くなるという結果が得られる。したがって、予 め、前記プローブについて、完全に相補であるハイブリッドの Tm値と、一塩基が異な るハイブリッドの Tm値とを決定しておくことにより、各検出対象部位における遺伝子 型を決定することができる。例えば、検出対象部位の塩基を変異型 (例えば、配列番 号 1における 2160番目の塩基が A)と仮定し、それを含む検出対象配列に相補的な プローブを使用した場合、形成したハイブリッドの Tm値力 完全に相補なハイブリツ ドの Tm値と同じであれば、前記増幅産物の多型は、変異型と判断できる。また、形 成したハイブリッドの Tm値力 S、一塩基異なるハイブリッドの Tm値と同じ（完全に相補 なハイブリッドの Tm値より低い値）であれば、前記増幅産物の多型は、野生型（例え ば、配列番号 1における 2160番目の塩基が G)と判断できる。さらに、両方の Tm値 が検出された場合には、ヘテロ接合体と決定できる。このようにして、各標識化プロ一 ブに対する 3つの Tm値から、多型 UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28の遺伝子型を判断することができる。
[0098] また、本発明においては、前述のように、前記プローブを含む反応液の温度を上昇 させて (ノヽイブリツド形成体を加熱して）、温度上昇に伴うシグナル変動を測定する方 法に代えて、例えば、ハイブリッド形成時におけるシグナル変動の測定を行ってもよ い。すなわち、前記プローブを含む反応液の温度を降下させてハイブリッド形成体を 形成する際に、前記温度降下に伴うシグナル変動を測定してもよい。
[0099] 具体例として、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さな い標識化プローブ (例えば、グァニン消光プローブ）を使用した場合、一本鎖 DNAと プローブとが解離している状態では蛍光を発している力 S、温度の降下によりハイブリツ ドを形成すると、前記蛍光が減少ほたは消光）する。したがって、例えば、前記反応 液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光強度の減少を測定すればよい。 他方、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プ ローブを使用した場合、一本鎖 DNAとプローブとが解離して!/、る状態では蛍光を発 していないが、温度の降下によりハイブリッドを形成すると、蛍光を発するようになる。 したがって、例えば、前記反応液の温度を徐々に降下させて、温度下降に伴う蛍光 強度の増加を測定すればょレ、。
[0100] なお、 UGT1A1遺伝子の 3種類の多型（UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6および U GT1A1 * 27)のうちいずれ力、 1つまたはいずれ力、 2つの多型を解析する場合には、 例えば、プライマーセット（1)〜（3)のうち目的領域に対応する!/、ずれか 1種類または いずれか 2種類のプライマーセットを含む、本発明の UGT1A1遺伝子増幅用プライ マーセットを使用し、さらに、 目的の検出対象部位にハイブリダィズするいずれ力、 1種 類のプローブまたは!/、ずれ力、 2種類のプローブを使用すればよ!/、。
[0101] つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により 制限されない。
実施例 1
[0102] 被検者 9人からへパリンリチウム採血管を用いて採血を行った（サンプル 1〜9)。得 られた血液 10 H Lと蒸留水 90 H Lとを混合し、さらに、この混合液 10 H Lと蒸留水 90 Lとを混合した。これら混合液 10 μ Lを、下記組成の PCR反応液 40 μ Lに添加し、 サーマルサイクラ一を用いて PCRを行った。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した 後、 95°C1秒および 54°C10秒を 1サイクルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前 記 PCR反応液を 40°Cから 95°Cに加熱していき、経時的な蛍光強度の変化を測定し た。測定波長は、 450〜480nm (蛍光色素 Pacific Blueの検出）、 515〜555nm( 蛍光色素 BODIPY FLの検出）、および、 585〜700nm (蛍光色素 TAMRAの検 出）とした。なお、 50サイクルの PCRに要した時間は、約 1時間であった。
[表 6]
(P CR反応液：単位; u I )
蒸留水 1 9. 8
5% N a N 0. 5
20% BS A 1
40% グリセロール 3. 1
1 0 G e n e T a q b u f f e r ^ 5
2. 5mM d N T P s 4
1 0 OmM M g C I 1
5 / M U GT 1 A 1 * 6用プローブ 1
5 iM U G T 1 A 1 * 27用プローブ 1 0. 5
5 Μ U G T 1 A 1 * 27用プローブ 2 1
5 jt/ M U G T 1 A 1 * 28用プロ一ブ 0. 5
1 0 O M U G T 1 A 1 i^ 6 F 1プライマ一 0. 2
1 00 U G T 1 A 1 ^ 6 R 1プライマー 0. 5
1 00 M U GT 1 A 1 ^ ^ 27 F 2プライマ一 0. 2
1 O O jU U GT 1 A 1 ^ (= 27 R 2プライマ一 0. 5
1 00 jt M U GT 1 A 1 ^ κ 28 F 3プライマ一 0. 2
1 00 jU U GT 1 A 1 ^ ^ 28 R3プライマ一 0. 5
Figure imgf000036_0001
T o t a l Α Ο μし
* 商品名 G e n e T a q F P ： 二ッポンジーン社製 (プローブ）
UGT1A1 * 6用プローブ
5 ― agagacagagcattttacac― (Pacific Blue)— 3' (酉 ΰ列番号! 55)
UGT1A1 * 27用プローブ 1
5， - ttattcccagtatgcaacc - (TAMRA) - 3 ' (配列番号 62)
UGT1A1 * 27用プローブ 2 5，一 ttattcccagtatgcaacc— P— 3， （酉己歹番号 62)
UGTIAI * 28用プローブ
5'— (BODIPY FL)― ccatatatatatatatataagtaggagag— P— 3 ' (酉己歹 lj番号 69)
[0105] (プライマーセット）
UGTIAI * 6 F1プライマー
5 -agcagaggggacatgaaata-3 (配列番号 4)
UGTIAI * 6 R1プライマー
5 -aacattatgcccgagactaac-3' (配列番号 13)
UGTIAI * 27 F2プライマー
5 '-agaactttctgtgcgacg-3 ' (配列番号 21)
UGTIAI * 27 R2プライマー
5'-cagatgcagagctcaatagg-3' (配列番号 29)
UGTIAI * 28 F3プライマー
5 '-gtcacgtgacacagtcaaac-3 ' (配列番号 42)
UGTIAI * 28 R3プライマー
5'-cctttgctcctgccagag-3' (配列番号 48)
[0106] UGTIAI * 6用プローブ ，m値は 63°C、
'm値は 56°C、 UGTIAI * 27用プローブとマッチするハイブリッドの Tm 値は 61°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 56°C、 UGTIAI * 28用プローブと マッチするハイブリッドの Tm値は 58°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 54°Cであ
[0107] サンプル 1〜9の結果を図 1〜3に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の 変化を示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は「一 d蛍光強度増加量/ dt」を 示し、横軸は温度を示す（以下、同様)。これらの図に示すように、シグナルのピーク から、各サンプルにおける UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28の 遺伝子型を決定した。これらの実施例の結果を裏付けるために、被検者 9人につい て、 RFLP法およびシークェンス法によって、 UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28の遺伝子型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このよう に、本発明のプライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料 を使用して、 UGT1A1遺伝子の 3つの領域を同一反応液中で同時に増幅し、且つ 、前記同一反応液を用いて 3種類の多型を解析することができた。
実施例 2
[0108] 被検者 2人から EDTA採血管を用いて採血を行った（サンプル;!〜 2)。得られた血 液 10 11 Lと下記希釈液 A 7011 Lとを混合し、さらに、この混合液 10 Lと下記希釈 液 Β 70 μ Lとを混合した。得られた混合液 10 Lを 95°Cで 5分間加熱処理した後、 下記組成の PCR反応液 46 μ Lに添加し、サーマルサイクラ一を用いて PCRを行つ た。 PCRの条件は、 95°Cで 60秒処理した後、 95°C1秒および 60°C15秒を 1サイク ルとして 50サイクル繰り返し、さらに 95°Cで 1秒、 40°Cで 60秒処理した。そして、続 けて、温度の上昇速度を C/3秒として、前記 PCR反応液を 40°Cから 75°Cに加熱 していき、経時的な蛍光強度の変化を測定した。測定波長は、 450〜480nm (蛍光 色素 Pacific Blueの検出）、 515〜555nm (蛍光色素 BODIPY FLの検出）、お よび、 585〜700nm (蛍光色素 TAMRAの検出）とした。
[0109] (希釈液 A)
10mM Tris— HCl (pH8)、 0. ImM EDTA, 0. 05% NaN
3、 0. 3% SDS
(希釈液 B)
lOmM Tris— HCl (pH8)、 0· ImM EDTA, 0. 05% NaN
3
[0110] [表 7]
(PCR反応液：単位〃 I )
蒸留水 1 5
5% N a N 0. 5
20% BS A 0. 5
40% グリセロール 1 2. 5
1 0 X G e n e T a q b u f f e 5
2. 5mM d N T P s 4
5 jWM UGT 1 A 1 * 6用プロ一ブ 2
5^M UGT 1 A 1 * 27用プローブ 2
5 jL/M UGT 1 A 1 * 28用プローブ 2
1 O OjUM UGT 1 A 1 ^ 6 F 1プライマ一 0. 2
1 00 jL M UGT 1 A 1 ^ 6 R 1プライマ一 0. 5
1 00 UGT 1 A 1 27 F 2プライマ一 0. 5
1 0 UGT 1 A 1 27 R2プライマ一 0. 2
1 OOjUM UGT 1 A 1 ^ ^ 28 F 3プライマ一 0. 2
1 O O jWM UGT 1 A 1 ^ ^ 28 R3プライマ一 0. 5
5 I G e n e T 3 q F 0. 2
T o t a l 46 jWし
* 商品名 G e n e T a q FP ： ニッポンジ一ン社製
[0111] (プローブ）
UGTIAI * 6用プローブ
5 ― gagacagagcattttacac― (Pacific Blue)— 3 (酉 列番号! 56)
UGT1A1 * 27用プローブ
5， - gttgcatacTgggaataaac - (TAMRA) - 3 ' (配列番号 102)
UGT1A1 * 28用プローブ
5'— (BODIPY FL)― ccatatatatatatatataagtaggagag— P— 3 ' (酉己歹 IJ番号 69) [0112] (プライマーセット）
UGTIAI ^ 6 F1プライマー
5 -tgaaatagttgtcctagcacctgacgc-3 (目 列番^ "81)
UGTIAI ^ 6 R1プライマー
5— caaaagactctttcacatcctccctttgg— 3' (目 ΰ歹1 J畨^ "91)
UGT1A1*27 F2プライマー
5 -ccttttcacagaactttctgtgcgacg-3' (酉己列番号 92)
UGT1A1*27 R2プライマー (配列番号 98)
UGT1A1 * 28 F3プライマ
5 -agctttttatagtcacgtgacacagtcaaac-3 (配列番号 123)
UGT1A1 * 28 R3プライマ
Figure imgf000040_0001
(配列番号 46)
[0113] UGT1A1 * 6用プローブとマッチするハイブリッドの Tm値は 57°C、ミスマッチのハ イブリツドの Tm値は 50°C、 UGT1A1 * 27用プローブとマッチするハイブリッドの Tm 値は 57°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 50°C、 UGT1A1 * 28用プローブと マッチするハイブリッドの Tm値は 53°C、ミスマッチのハイブリッドの Tm値は 49°Cであ
[0114] サンプル 1〜2の結果を図 4に示す。これらの図は、温度上昇に伴う蛍光強度の変 化を示す Tm解析のグラフであり、縦軸の微分値は「一 d蛍光強度増加量 /dt」を示 し、横軸は温度を示す。これらの図に示すように、シグナルのピークから、各サンプノレ における UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28の遺伝子型を決定 した。これらの実施例の結果を裏付けるために、被検者 2人について、 RFLP法およ びシークェンス法によって、 UGT1A1 * 6、 UGT1A1 * 27および UGT1A1 * 28 の遺伝子型を確認した結果、実施例と同じ結果が得られた。このように、本発明のプ ライマーセットを使用することにより、前処理を施していない全血試料を使用して、 U GT1A1遺伝子の 3つの領域を同一反応液中で同時に増幅し、且つ、前記同一反応 液を用いて 3種類の多型を解析することができた。
産業上の利用可能性
[0115] 以上のように、本発明のプライマーセットによれば、 UGT1A1遺伝子における特定 の多型（UGT1A1 * 28、 UGT1A1 * 6または UGT1A1 * 27)が生じる部位を含 む領域を、特異的に高効率で増幅することができる。このため、前述のような従来法 とは異なり手間やコストを低減することが可能となる。また、このように多型の検出対象 部位を含む領域が特異的に増幅されることから、例えば、前記検出対象部位を含む 検出対象配列に相補的なプローブを使用することで、前記反応液を用いてそのまま Tm解析を行い、前記多型をタイピングすることが可能となる。また、一つの反応液で 増幅やタイピングが可能であることから、操作の自動化も可能になる。さらに、本発明 のプライマーセットを用いれば、例えば、夾雑物が含まれる試料 (例えば、全血や口 腔粘膜等）であっても、前処理を省略できるため、より迅速且つ簡便に増幅反応を行 うこと力 Sできる。また、本発明のプライマーセットを用いれば、従来よりも優れた増幅効 率で増幅反応が行えるため、増幅反応も短縮化が可能である。したがって、本発明 のプライマーセットやこれを含む試薬、ならびにこれらを用いた増幅産物の製造方法 によれば、 UGT1A1遺伝子の多型を迅速かつ簡便に解析できることから、医療分野 にお!/、てきわめて有効と!/、える。

Claims

請求の範囲 遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子を増幅するためのプライマーセットであって、 下記プライマーセット（1)〜（3)からなる群から選択された少なくとも 1つのプライマ 一セットを含むことを特徴とする UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット。 プライマーセット（1) 下記（F1)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット (F1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2120番目のアデ二 ン塩基 (A)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜22塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記アデニン塩基 (A)を 3 '末 および、 配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2140番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 5'方向に向力、つて 18〜34塩基目までの領域と同じ配列である 少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3'末端とするォ リゴヌタレ才チド の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R1)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2226番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 3 '方向に向力 て 17〜27塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2226番目のグァニン塩基（G)に 相補的なシトシン塩基（C)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド、
および、
配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2198番目のシトシン塩基 (C)を 1塩基目として 3'方向に向力 て 22〜39塩基目までの領域に相補的な少な くとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2198番目のシトシン塩基（C)に相補的 なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
の少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
プライマーセット（2) 下記（F2)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2622番目のグァニ ン塩基（G)を 1塩基目として 5 '方向に向かって 15〜27塩基目までの領域と同じ配 列である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記グァニン塩基（G)を 3 '末
(R2)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 2687番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 17〜26塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 2687番目のシトシン塩基（C)に 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
プライマーセット（3)
下記（F3)のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R3)のオリ ゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1863番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 5'方向に向かって 17〜31塩基目までの領域と同じ配列 である少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記シトシン塩基（C)を 3 '末端と するオリゴヌクレオチド
(R3)配列番号 1の塩基配列からなる UGT1A1遺伝子における 1928番目のシトシ ン塩基（C)を 1塩基目として 3'方向に向かって 16〜20塩基目までの領域に相補的 な少なくとも 1つのオリゴヌクレオチドであって、前記 1928番目のシトシン塩基（C)に 相補的なグァニン塩基 (G)を 3'末端とするオリゴヌクレオチド
[2] 前記プライマーセット（1)〜（3)が、それぞれ下記プライマーセット（1 ' )〜（3' )であ る、請求の範囲 1記載の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセット。
プライマーセット '） 下記（F1 ' )のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R1 ' )の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F1 ' )配列番号 4の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 81の塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド (Rl ' )配列番号 13の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 91の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド プライマーセット（2' )
下記（F2，）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R2，）の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F2' )配列番号 21の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 92の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R2' )配列番号 29の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 98の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド プライマーセット（3，）
下記（F3，）のオリゴヌクレオチドからなるフォワードプライマーおよび下記（R3，）の オリゴヌクレオチドからなるリバースプライマーを含む一対のプライマーセット
(F3' )配列番号 42の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 123の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(R3' )配列番号 46の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 48の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
[3] 前記 UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットが、生体試料中の UGT1A1遺伝子 を増幅するためのプライマーセットである、請求の範囲 1記載の UGT1A1遺伝子増 幅用プライマーセット。
[4] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 3記載の UGT1A1遺伝子増幅用ブラ イマ一セット。
[5] 遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子を増幅するための試薬であって、
請求の範囲 1記載の UGT1A1遺伝子増幅用プライマーセットを含むことを特徴と する UGT1A1遺伝子増幅用試薬。
[6] さらに、 UGT1A1遺伝子の検出対象部位にハイブリダィズ可能なプローブを含む
、請求の範囲 5記載の UGT1A1遺伝子増幅用試薬。
[7] 前記プローブが、下記 (Ρ1 ' )〜（Ρ3' )に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選 択された少なくとも 1つのプローブである、請求の範囲 6記載の UGT1A1遺伝子増 幅用試薬。
(PI ' )配列番号 55の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 56の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ2' )配列番号 62の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 102の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ3' )配列番号 69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
[8] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 6記載の UGT1A1遺伝 子増幅用試薬。
[9] 遺伝子増幅法により UGT1A1遺伝子の増幅産物を製造する方法であって、 下記 (I)工程を含むことを特徴とする増幅産物の製造方法。
(I)試料中の核酸を铸型として、請求の範囲 1記載の UGT1A1遺伝子増幅用プライ マーセットを用いて、反応液中で、前記 UGT1A1遺伝子の増幅を行う工程
[10] 前記 (I)工程において、前記反応液に、さらに、 UGT1A1遺伝子の検出対象部位 にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 9記載の増幅産物の製造 方法。
[11] 前記プローブが、下記 (Ρ1 ' )〜（Ρ3' )に示すオリゴヌクレオチドからなる群から選 択された少なくとも 1つのプローブである、請求の範囲 10記載の増幅産物の製造方 法。
(ΡΙ ' )配列番号 55の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 56の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ2' )配列番号 62の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、および、配列番号 102の 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの少なくとも一方のオリゴヌクレオチド
(Ρ3' )配列番号 69の塩基配列からなるオリゴヌクレオチド
[12] 前記プローブが、蛍光標識化プローブである、請求の範囲 10記載の増幅産物の 製造方法。
[13] さらに、下記 (II)工程を含む、請求の範囲 12記載の増幅産物の製造方法。
(II)前記反応液について、前記蛍光標識化プローブにおける蛍光標識の蛍光強度 を測定する工程
[14] 前記試料が、生体試料である、請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法。
[15] 前記生体試料が、全血である、請求の範囲 14記載の増幅産物の製造方法。
[16] 前記反応液における全血試料の添加割合力 0. ；!〜 0. 5体積％である、請求の範 囲 15記載の増幅産物の製造方法。
[17] UGT1A1遺伝子における検出対象部位の多型を解析する方法であって、
下記 ω〜（iV)工程を含むことを特徴とする多型解析方法。
(i)請求の範囲 9記載の増幅産物の製造方法により、 UGT1A1遺伝子における検出 対象部位を含む領域を反応液中で増幅させる工程
(ϋ)前記 ω工程における増幅産物と、前記検出対象部位にハイブリダィズ可能なプ ローブとを含む反応液を準備する工程
(iii)前記反応液の温度を変化させ、前記増幅産物と前記プローブとのハイブリッド形 成体の融解状態を示すシグナル値を測定する工程
(iv)温度変化に伴う前記シグナル値の変動から、前記検出対象部位の多型を決定 する工程
[is] 前記 ω工程において、増幅反応に先立って、前記反応液に、前記検出対象部位 にハイブリダィズ可能なプローブを添加する、請求の範囲 17記載の多型解析方法。
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