CN1804034A - 一种低变性温度聚合酶链式反应方法 - Google Patents

一种低变性温度聚合酶链式反应方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1804034A
CN1804034A CN 200510023297 CN200510023297A CN1804034A CN 1804034 A CN1804034 A CN 1804034A CN 200510023297 CN200510023297 CN 200510023297 CN 200510023297 A CN200510023297 A CN 200510023297A CN 1804034 A CN1804034 A CN 1804034A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polymerase chain
denaturation
chain reaction
denaturation temperature
nucleic acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 200510023297
Other languages
English (en)
Inventor
徐定邦
朱德芬
谢文凯
陈有容
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN 200510023297 priority Critical patent/CN1804034A/zh
Publication of CN1804034A publication Critical patent/CN1804034A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种能够在45－70℃变性温度下完成扩增的聚合酶链式反应方法。PCR反应液含有强核酸变性试剂和对DNA聚合酶有保护作用的试剂。

Description

一种低变性温度聚合酶链式反应方法
技术领域
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及低变性温度聚合酶链式方法。
技术背景
聚合酶链式反应是一种高效的扩增特定DNA的方法，反应的每一个循环包括变性，退火和延伸三个步骤。其中，变性使原始模板或扩增产物的DNA双链解开然后进入下一轮退火和延伸，变性步骤是整个扩增过程中不可或缺的一环。PCR方法的常规变性温度在94℃左右。Fuller(美国专利5432065，1995)和洪国藩(中国专利<申请号>01117603，<公告号>1384203，)在反应液中添加20％左右的高浓度甘油来降低核酸变性温度。Lakobashvili等(Nucleic-Acid-Research，1999.，Vol.27(6)：1566-1568)和Wijnhoven等(美国专利，6277605，2001)分别采用添加高浓度脯氨酸和铜离子或锌离子来降低核酸的变性温度。上述方法公开的变性温度範圍为70℃以上，能够用中温DNA聚合酶完成扩增。本发明提供了一种在45-70℃变性温度下完成PCR的方法，既使PCR扩增专一性大大增强，同时又可能在反应管内预加和PCR技术密切关联的酶如：核酸内切酶、核酸外切酶、连接酶、反转录酶、不耐热的抗体和酶等PCR检测试剂，为拓展PCR技术的应用创造了条件。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明提供一种能在45-70℃变性温度下完成扩增的聚合酶链式反应方法，突破现有PCR方法中模板变性温度的常规和范围，既克服常规PCR反应不能利用调节变性温度来排除非专一扩增产物以及排除假阴性结果的缺陷，又为在PCR反应液中加入其他不耐受高温的酶、抗体和其他试剂创造了条件。
发明构思
許多類化合物如吡烙烷酮类化合物、甲酰胺类化合物和烷基及环砜类有比甘油等試劑更强對降核酸变性温度對作用。例如10％甘油使Lambda-DNA变性温度降低3℃，而同样浓度二甲亚砜(DMSO)、甲酰胺和N-甲基2-吡烙烷酮(NMP)能使变性温度分别降低5.8、6.6和10.6℃。但是，这些强核酸变性剂又会严重破坏DNA聚合酶的耐热性。例如10％甲酰胺和5％NMP使TaqDNA聚合酶在97.5C时的半衰期从11分钟降低至1.5分钟和零分钟(Landre等：PCR-Strategies，M.A.Innis等编，Academic-Press，1995，P1-16)。所以上述强核酸变性试剂未能应用于PCR反应或只能应用相当低的浓度，使核酸變性溫度降低的數值相當有限。本发明发现上述强核酸变性剂试对DNA聚合酶耐热性的破坏作用随温度降低而显著减弱，在较低的变性温度下即使上述強变性试剂的浓度超过20％，TaqDNA聚合酶仍能经历反复的变性—退火和延伸步驟而仍保持足够的活力完成扩增。添加高浓度强核酸变性剂使核酸变性温度降低20℃以上，针对不同的扩增产物可在45-70℃变性温度下完成扩增。
技术方案
本发明提供一种低变性温度聚合酶链式反应方法，PCR反应步骤依次包括：
(1)DNA模板变性解链；
(2)引物与模板退火；
(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行合成反应；
其特征在于步骤(1)DNA模板变性解链温度为45-70℃。反应液含有4种脱氧核糖核苷酸、DNA聚合酶、缓冲液、引物、模板核酸和至少一种强核酸变性剂如吡咯烷酮类的N-甲基2-吡咯烷酮(NMP)和2-吡咯烷酮等，酰胺类的二甲基甲酰胺(DMF)和甲酰胺等，砜基类的二甲基亚砜(DMSO)和甜菜硷等。反应液中还可添对DNA聚合酶活性和耐热性有保护作用的试剂如多元醇类的甘油和乙二醇等。
有益效果：
使用强核酸变性剂在45-70℃低温下变性提高了扩增的专一性，同时为在PCR反应管内预加或PCR反应液内添加不耐高温的酶和其他试剂，建立PCR反应与其他酶联用的技术扩展PCR应用创开了新路。
具体实施
实施例1
实施例1目标基因为人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045。采用ClonTech公司的Advantage2-PCR试剂盒，每管反应体积为5ul。核酸模板为人基因组DNA(1ug/100ul)，引物浓度0.4uM。引物顺序和特性如表1所示
表1，实施例1引物顺序和特性
名称 位置 长度   解链温度(℃)   与模板结合强度 顺序(5’至3’)
A1正   1132-1159 28 81.3 462   CAG CAG ATG TGG ATC AGC AAGCAG GAG T
A1反   1399-1426 28 79.5 532   AAT CAA AGT CCT CGG CCA CATTGT GAA C
以基因组DNA为模板时扩增产物长295碱基，扩增产物解链温度84℃，在不加核酸变性剂的对照条件下能够在85℃变性温度下完成扩增。表2显示反应液添加10％核酸变性剂对TaqDNA聚合酶耐热性的影响。试验初次变性80-95℃5分钟，循环变性80℃10秒，退火60℃30秒，延伸65℃30秒。共35循环。
表2，核酸变性试剂对DNA聚合酶耐热性的影响
  试验项目   不同首次变性温度(℃)下扩增产物的形成
  80   82.5   84.2   86.5   89   91.2   92.8   94   95
  对照   -   -   -   +   +   +   +   +   +
  10％二甲基亚砜   +   +   +   +   +   +   -   -   -
  10％甜菜硷   +   +   +   +   +   +   +   -   -
  10％二甲基甲酰胺   +   +   +   +   +   +   -   -   -
  10％甲酰胺   +   +   +   +   +   +   -   -   -
  10％N-甲基2-吡咯烷酮   +   +   +   +   -   -   -   -   -
  10％2-吡咯烷酮   +   +   +   +   +   -   -   -   -
表2说明10％浓度的核酸变性试剂都显著降低聚合酶在95℃左右时的耐热性在该变性温度下不能完成扩增，但在80-90℃下连续加热5分钟DNA聚合酶均能保持足够活性完成扩增。
实施例2
实施例2的目标基因，核酸模板等与实施例1相同。表3显示不同变性试剂对完成扩增的最低允许变性温度的影响。变性剂浓度为10％，试验初次变性85℃1分钟，循环变性70-80℃10秒，退火55℃30秒，延伸65℃30秒。共35循环。
表3，不同变性试剂对完成扩增的最低允许变性温度的影响
  试验项目   不同变性温度(℃)下扩增产物的形成
  70   71.7   72.9   74.4   76   77.5   78.5   79.3   80
  对照   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  10％二甲基亚砜   -   -   -   -   -   -   -   +   +
  10％甜菜硷   -   -   -   -   -   -   -   +   +
  10％二甲基甲酰胺   -   -   -   -   -   +   +   +   +
  10％甲酰胺   -   -   -   -   -   -   +   +   +
  10％N-甲基2-吡咯烷酮   -   -   -   -   +   +   +   +   +
  10％2-吡咯烷酮   -   -   -   -   -   +   +   +   +
表3说明10％浓度的表述的各种核酸变性试剂使完成扩增所需的变性温度降低5度以上。
实施例3
实施例3的目标基因，核酸模板等与实施例1相同。表4显示不同浓度二甲基甲酰胺(DMF)或N-甲基2-吡咯烷酮(NMP)对完成扩增的最低允许变性温度的影响。试验初次变性75℃1分钟，循环变性60-70℃10秒，退火45℃30秒，延伸60℃30秒。共35循环。
表4，不同浓度DFM或NMP对完成扩增的最低允许变性温度的影响
  试验项目   不同变性温度(℃)下扩增产物的形成
  60   61.7   62.9   64.3   66   67.5   68.5   69.3   70
  对照   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  10％NMP.   -   -   -   -   -   -   -   -   -
  15％NMP   -   -   -   -   -   -   -   +   +
 20％NMP - - -  +  +  +   +  +  +
 15％DMF - - -  -  -  -   -  -  -
 20％DMF - - -  -  +  +   +  +  +
 10％NMP和10％DMF - - -  -  +  +   +  +  +
表4说明随核酸变性剂浓度提高能完成扩增的最低允许温度下降。20％DMF和20％NMP使最低允许变性温度比对照分别下降19℃和21℃以上。二种不同的核酸变性剂对降低核酸变性温度有协同作用。
实施例4
实施例4的目标基因为人第六染色体中一个基因片段。(美国国家生物信息中心基因库编号GI29801752)。试验试剂和条件与实施例1相同。引物顺序和特性示于表5
表5，实施例3引物顺序和特性
名称 位置 长度   解链温度(℃)   与模板结合强度 顺序(5’至3’)
C6正   2699-2728 30 64.4 396   CAT TTA CAT CTT TCA ATT ATGTAT ATT CTT
C6反   2800-2829 30 65.3 402   ATG CAA ATA CTT CAT TAG TAAAAT TTA CTT
扩增产物长131碱基，扩增产物解链温度70.7℃，在不加核酸变性剂的对照条件下能在72℃变性温度下完成扩增。实施例3的初次变性80℃2分钟，循环变性55-70℃30秒，退火35℃30秒，延伸55℃2分钟，共35循。表6显示变性剂NMP与甘油合用对完成扩增最低允许变性温度的影响。
表6，5-10％NMP和甘油联用对最低允许变性温度的影响
 试验项目   不同变性温度(℃)下扩增产物的形成
 NMP％   甘油％   55   57.5   59.2   61.4   63.9   66.1   67.7   68.9   70
 0   0   -   -   -   -   -   -   -   -   -
 0   10   -   -   -   -   -   -   -   -   +
 0   20   -   -   -   -   -   +   +   +   +
 0   25   -   -   -   -   -   +   +   +   +
 0   30   -   -   -   -   +   +   +   +   +
 0   35   -   -   -   -   +   +   +   +   +
 5   20   -   -   -   +   +   +   +   +   +
 5   25   -   -   +   +   +   +   +   +   +
 10   20   +   +   +   +   +   +   +   +   +
表6说明应用10％NMP和20％甘油可以在55℃变性温度下完成扩增。
表7显示应用更高浓度变性剂时的试验结果。试验条件为初次变性80℃2分钟，循环变性45-60℃30秒，退火30℃30秒，延伸45℃5分钟。共35循环。
表7，10-15％NMP和甘油联用对最低允许变性温度影响
 试验项目   不同变性温度(℃)下扩增产物的形成
 NMP％   甘油％   45   47.5   49.2   51.4   53.9   56.0   57.7   58.8   60
 10   20   -   -   -   -   -   +   +   +   +
 10   25   -   -   -   -   +   +   +   +   +
 12.5   20   -   -   -   -   +   +   +   +   +
 15   20   -   -   -   +   +   +   +   +   +
表7说明应用15％NMP和20％甘油能在约50℃变性温度下完成扩增。
实施例5
实施例5目标基因为人beta肌动球蛋白基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)。引物顺序和特性示于表8
表8，实施例4引物顺序和特性
  引物名称 序列5′-3′   引物长度   引物Tm(℃)
  A2 5′A2 3′   CTT TCG TGT AAA TTA TGT AAT GCA AAAA ATA AAA AAG TAT TAA GGC GAA GAT   2527   65.866.0
扩增产物长62碱基，扩增产物解链温度67.9℃，在不加变性剂的对照条件下能够在68℃变性温度下完成扩增。实施例4的核酸模板为cDNA，由人组织总RNA用ClonTech公司的cDNA合成试剂盒用Oligo(dT)经反转录合成。PCR的试剂和条件与实施例3相同。结果表明当在PCR反应液中加15％NMP和20％甘油，初次变性75℃2分钟，循环变性46℃30秒，退火30℃30秒，延伸40℃5分钟的条件下，经共35循环扩增得到目标扩增产物。

Claims (11)

1，一种低变性温度聚合酶链式反应方法，反应依次包括如下步骤：
(1)DNA模板变性解链；
(2)引物与模板退火；
(3)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；
其特征在于步骤(1)DNA模板变性解链温度为45-70℃。
2，根据权利要求1所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的反应液含有至少一种核酸变性试剂。
3，根据权利要求1和2所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂包括但不限于吡烙烷酮类化合物。
4，根据权利要求1至3所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂为2-吡烙烷酮和N-甲基2-吡烙烷酮。
5，根据权利要求1和2所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂包括但不限于酰胺类化合物。
6，根据权利要求1、2和5所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂为甲酰胺和二甲基甲酰胺。
7，根据权利要求1和2所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂包括但不限于砜基类化合物。
8，根据权利要求1、2和7所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的核酸变性试剂为甜菜硷和二甲基亚砜。
9，根据权利要求1至8所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的反应液含有至少一种DNA聚合酶保护剂。
10，根据权利要求1至9所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的反应液保护剂包括但不限于多元醇类化合物。
11，根据权利要求1至10所述的低变性温度聚合酶链式反应方法的反应液保护剂为甘油和乙二醇
CN 200510023297 2005-01-13 2005-01-13 一种低变性温度聚合酶链式反应方法 Pending CN1804034A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510023297 CN1804034A (zh) 2005-01-13 2005-01-13 一种低变性温度聚合酶链式反应方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 200510023297 CN1804034A (zh) 2005-01-13 2005-01-13 一种低变性温度聚合酶链式反应方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1804034A true CN1804034A (zh) 2006-07-19

Family

ID=36866180

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 200510023297 Pending CN1804034A (zh) 2005-01-13 2005-01-13 一种低变性温度聚合酶链式反应方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1804034A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022651A (zh) * 2017-06-02 2017-08-08 辽宁润基生物科技有限公司 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022651A (zh) * 2017-06-02 2017-08-08 辽宁润基生物科技有限公司 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法
CN107022651B (zh) * 2017-06-02 2021-01-29 辽宁润基生物科技有限公司 一种快速检测丙型肝炎病毒核酸的试剂盒及其检测方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Power RAPD typing in microbiology—a technical review
US7662594B2 (en) Helicase-dependent amplification of RNA
CN104685066B (zh) 用于量化样品中核酸序列的组合物和方法
CA2964559C (en) Reduced inhibition of one-step rt-pcr
US20060063175A1 (en) Method of polymerase chain reaction with ultra-low denaturing temperatures and applications thereof
KR102295290B1 (ko) Dna 증폭 기술
US20200299741A1 (en) Selective enrichment of a population of dna in a mixed dna sample through targeted suppression of dna amplification
WO2003033724A3 (en) Nucleic acid amplification
WO2017185766A1 (zh) 一种用于扩增低浓度突变靶序列的引物和探针的设计方法
EP1833995B1 (en) Identification of rna targets using helicases
EP2744901A1 (en) Composition and methods for rt-pcr comprising an anionic polymer
CA2778449A1 (en) Amplification primers with non-standard bases for increased reaction specificity
CN109652410A (zh) 一种检测低丰度突变序列的核酸扩增阻断剂及应用
AU2019371797A1 (en) Exponential base-3 nucleic acid amplification with reduced amplification time using nested overlapping primers
WO2017143873A1 (zh) 一种等温核酸扩增的方法
EP3129499B1 (en) Universal controls for sequencing assays
CN117343999B (zh) 基于左侧探针退火和右侧探针退火延伸的核酸扩增方法
WO2022121658A1 (zh) 用于提高具有二级结构的单链核酸分子的复制效率的试剂、核酸片段复制方法、应用
Kubista et al. Light-up-probe-based real-time Q-PCR
CN1804034A (zh) 一种低变性温度聚合酶链式反应方法
CN111850100B (zh) 核酸扩增方法及其应用
US20110111462A1 (en) Composition and Method for Synthesizing a Deoxyribonucleotide Chain Using a Double Stranded Nucleic Acid Complex with a Thermostable Polymerase
KR102151657B1 (ko) 멀티플렉스 시스템을 이용한 인간 객체의 y str 유전좌위 분석방법 및 이를 이용한 분석 키트
CN111826421A (zh) 一种pcr随机引物和使用其构建靶向测序文库的方法
AU2002247654B9 (en) Ammonium sulfate for neutralization of inhibitory effects

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Open date: 20060719