JP2022001048A - B型肝炎治療用組成物、及びb型肝炎ウイルスの複製活性の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1−1.概要
本発明の第1の態様は、B型肝炎ウイルスポリメラーゼ(本明細書では、しばしば「HBV-Pol」と表記する)の活性阻害剤である。本発明のHBV-Pol阻害剤は、HBV-Polにおける活性化部位のリン酸化を阻害するリン酸化阻害剤からなる。本発明のHBV-Pol阻害剤によれば、HBV-Pol活性を阻害することで、HBVの複製を阻害することができる。
1−2.定義
「B型肝炎ウイルス(hepatitis B virus:HBV)」は、ヘパドナウイルス科オルソヘパドナウイルス属に属するDNAウイルスで、B型肝炎の原因ウイルスである。HBVは、遺伝子配列の違いにより8種類の遺伝子型(ジェノタイプ A、B、C、D、E、F、G、及びH)が知られている。これらの遺伝子型には、地域分布や病態面で差異が見られる。例えば、日本では、従来ジェノタイプC(本明細書では、しばしば「HBV/C」と表記する。他のジェノタイプについても同様とする。)感染者が大半を占め、次いでHBV/B感染者が多くみられていたが、近年ではHBV/A感染者が増加している。一方、欧米ではHBV/AやHBV/Dの感染者が多くみられる。HBV/Aでは、急性肝炎罹患後の約20〜30%が慢性肝炎に移行することが知られているが、HBV/BやHBV/Cは急性肝炎罹患後の慢性化率は低い。
1−3.構成
本発明のHBV-Pol活性阻害剤は、HBV-Polにおける活性化部位のリン酸化を阻害するリン酸化阻害剤からなる。
本発明の第2の態様は、B型肝炎ウイルス複製阻害方法(HBV複製阻害方法)である。本発明の方法は、HBV-Polの末端タンパク質領域内に存在するTxYモチーフのスレオニン残基及びチロシン残基におけるリン酸化を阻害する工程(阻害工程)を含む。
3.B型肝炎ウイルス複製阻害用組成物(HBV複製阻害用組成物)
3−1.概要
本発明の第3の態様は、B型肝炎ウイルス複製阻害用組成物(HBV複製阻害用組成物)である。本発明のHBV複製阻害用組成物は、第1態様に記載のHBV-Pol活性阻害剤、特にMAPキナーゼ阻害物質を必須の有効成分とし、HBVのゲノムDNAの複製を阻害してHBVの増殖を抑制できる。それ故、抗HBV用組成物として利用することができる。
3−2.構成
3−2−1.構成成分
本発明のHBV複製阻害用組成物の構成成分について説明をする。
(1)有効成分
本発明のHBV複製阻害用組成物は、必須の有効成分として第1態様に記載のHBV-Pol活性阻害剤、特にMAPKキナーゼ阻害物質を包含する。
(2)溶媒
本発明のHBV複製阻害用組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な溶媒中に溶解することができる。「薬学的に許容可能な溶媒」とは、製剤技術分野において通常使用する溶媒をいう。例えば、水若しくは水溶液、又は有機溶剤が挙げられる。水溶液には、例えば、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助剤を含む等張液、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液が挙げられる。補助剤には、例えば、D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウム、その他にも低濃度の非イオン性界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。有機溶剤には、エタノールが挙げられる。
(3)担体
本発明のHBV複製阻害用組成物は、必要に応じて薬学的に許容可能な担体を含むことができる。「薬学的に許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、滑沢剤、ヒト血清アルブミン等が挙げられる。
3−2−2.剤形
本発明のHBV複製阻害用組成物の剤形は、特に限定しない。被験体の体内で有効成分を失活させることなく目的の部位にまで送達される形態であればよい。
3−2−3.適用方法
本発明のHBV複製阻害用組成物の適用方法は、経口投与でも、非経口投与でもよい。一般に経口投与法は全身投与であるが、非経口投与法は、さらに局所投与と全身投与に細分できる。局所投与には、例えば、筋肉内投与、皮下投与、組織投与、及び器官投与が該当し、全身投与には、循環器内投与、例えば、静脈内投与(静注)、動脈内投与及びリンパ管内投与が該当する。本発明のHBV複製阻害用組成物を局所投与する場合には、注射等で肝臓に直接投与すればよい。また、全身投与する場合には、静注等の循環器内に投与すればよい。投与量は、有効成分が奏効する上で有効な量であればよい。有効量は、前述のように被験体情報に応じて適宜選択される。
4.B型肝炎治療用組成物
4−1.概要
本発明の第4の態様は、B型肝炎治療用組成物である。本発明のB型肝炎治療用組成物は、第1態様に記載のHBV-Pol活性阻害剤、特にMAPKキナーゼ阻害物質を必須の有効成分とし、HBV感染後のHBVの複製を阻害することでHBVの増殖を抑制し、B型肝炎を治療することができる。
4−2.構成
第3及び第4態様は、用途のみが異なる。すなわち、第3態様に記載のHBV複製阻害用組成物が宿主細胞内におけるHBVの複製阻害を目的とするのに対して、本態様のB型肝炎治療用組成物は、そのHBVの複製阻害を通して、B型肝炎感染者における治療を目的とする。したがって、本態様における基本構成は、第3態様のHBV複製阻害用組成物における「3−2.構成」に記載の内容と実質的に同一である。それ故、ここでは、その具体的な説明は省略する。
4−3.B型肝炎治療方法
本発明のB型肝炎治療用組成物を被験体に投与することで、B型肝炎を治療することができる。このようなB型肝炎治療用組成物を用いたB型肝炎治療方法は、B型肝炎治療用組成物の有効成分である第1態様に記載のHBV-Pol活性阻害剤、特にMAPキナーゼ阻害物質の活性を利用しており、それ故に、前記第2態様のHBV複製阻害方法と同様に、HBV-Polの末端タンパク質領域内に存在するTxYモチーフのスレオニン残基及びチロシン残基におけるリン酸化を阻害する工程(阻害工程)を含む。
5.B型肝炎ウイルスポリメラーゼ活性促進剤(HBV-Pol活性促進剤)
5−1.概要
本発明の第5の態様は、B型肝炎ウイルスポリメラーゼ活性促進剤(HBV-Pol活性促進剤)である。本態様のHBV-Pol活性促進剤は、第1態様のHBV-Pol活性阻害剤とは逆の作用効果を示すものであって、HBV-Polの末端タンパク質領域に存在する活性部位をリン酸化する化合物からなる。
5−2.構成
本発明のHBV-Pol活性促進剤は、HBV-Polにおける活性化部位、すなわちTxYモチーフにおけるT残基及び/又はY残基をリン酸化する化合物からなる。
6.B型肝炎ウイルス複製活性化剤
6−1.概要
本発明の第6の態様は、B型肝炎ウイルス複製活性化剤(HBV複製活性化剤)である。本態様のHBV複製活性化剤は、第5態様に記載のHBV-Pol活性促進剤を必須の有効成分とし、HBV感染後の宿主細胞内でのHBVゲノムDNAの複製を促進して、その増殖を増強できる。したがって、本発明のHBV複製活性化剤は、第3態様のHBV複製阻害用組成物とは逆の作用効果を有する。
6−2.構成
本発明のHBV複製活性化剤は、有効成分として第5態様に記載のHBV-Pol活性促進剤を包含する。
7.B型肝炎ウイルス複製活性評価核酸(HBV複製活性評価核酸)
7−1.概要
本発明の第7の態様は、B型肝炎ウイルスにおける複製活性を評価することのできる核酸分子(HBV複製活性評価核酸)である。本発明のHBV複製活性評価核酸は、HBVのプレゲノムRNA(pgRNA)をコードする遺伝子の構造を模したレポーター遺伝子であって、pgRNAを鋳型としたHBV-Polの逆転写活性によるマイナス鎖DNAの合成量を定量できるように構築されている。
7−2.HBVの複製機構について
HBVのゲノムは、図1Aで示すようにプラス鎖((+)鎖)がマイナス鎖((-)鎖)に対して短く、それ故に、一部に一本鎖構造を有する約3.2Kbの不完全二本鎖環状DNA(relaxed circular DNA:rcDNA)を有する。HBVは、HBV特異的な未知のレセプターを介して宿主肝細胞内に侵入し、感染が成立した後、宿主細胞の核内で内在性のDNAポリメラーゼによって一本鎖部分が修復されて完全二本鎖DNA(covalently closed circular DNA:cccDNA)となる。このcccDNAの(-)鎖が鋳型となり、宿主細胞由来のRNAポリメラーゼII(RNA pol II)により、長さの異なる4種(3.5kb、2.4kb、2.1kb、及び0.7kb)のmRNAが合成される。このうち最長の3.5kb mRNAは、プレゲノムRNA(pgRNA)と呼ばれ、HBVゲノムDNAの鋳型となる。
7−3.構成
本発明のHBV複製活性評価核酸の構造の一例を図2Aで示す。HBV複製活性評価核酸は、HBVのレポーターpgRNA(図2B)をコードする遺伝子あり、その基本構成はHBVゲノムDNAに基づく。本発明のHBV複製活性評価核酸は、必須の構成要素として、HBVのpgRNAに由来するイプシロン配列(ε配列)、及びその3’末端側に位置し、イントロンを含む任意のレポーター配列を含む。また、選択的構成要素として、HBVのpgRNAに由来するダイレクトリピート1配列を含む。さらに、必要に応じてダイレクトリピート2配列、及び/又は別のイプシロン配列を含むこともできる。
8.B型肝炎ウイルス複製活性評価ベクター(HBV複製活性評価ベクター)
8−1.概要
本発明の第8の態様は、B型肝炎ウイルスにおける複製活性を評価することのできるベクター(HBV複製活性評価ベクター)である。本発明のHBV複製活性評価ベクターは、第7態様に記載のHBV複製活性評価核酸を発現可能な状態で含む発現ベクターで構成される。このHBV複製活性評価ベクターは、後述する第9態様のHBV複製活性評価システムにおける中心的な発現ベクターであり、この発現ベクターから発現されるレポーターpgRNAの逆転写によって生じるレポーターマイナス鎖DNAを検出することで、HBVの複製活性を定量することが可能となる。
8−2.構成
本態様におけるHBV複製活性評価ベクターは、発現ベクターであり、必須の構成要素として、プロモーター及び、第7態様に記載のHBV複製活性評価核酸を含んでいる。
9.B型肝炎ウイルス複製活性評価システム(HBV複製活性評価システム)
9−1.概要
本発明の第9の態様は、B型肝炎ウイルスにおける複製活性を評価することのできるシステム(HBV複製活性評価システム)である。本態様のHBV複製活性評価システムは、HBVの複製機構を模したアッセイ系で、第8態様に記載のHBV複製活性評価ベクターの他、いくつかの補助遺伝子を含む発現ベクターで構成される。それらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、培養後、細胞内の第8態様に記載のHBV複製活性評価ベクター由来のレポーターpgRNAの逆転写によって生じるレポーターマイナス鎖DNAを検出、定量することによって、HBVの複製活性を数値化して評価することができる。
9−2.構成
HBV複製活性評価システムは、第8態様に記載のHBV複製活性評価ベクター、及びHBVのC遺伝子及びP遺伝子の発現ベクターを必須構成要素とし、HBVのX遺伝子の発現ベクター及びレポーターマイナス鎖DNA検出用プライマーペアを選択的構成要素とする。以下、HBV複製活性評価ベクター、HBc発現ベクター、HBV-P発現ベクター、HBx発現ベクター、そしてレポーターマイナス鎖DNA検出用プライマーペアのそれぞれの構成要素について説明をする。
HBV複製活性評価ベクターの構成は、第8態様に記載の通りである。したがって、ここでの具体的な説明は省略する。
「HBc発現ベクター」は、HBVにおけるC遺伝子を発現可能な状態で包含する発現ベクターである。「C遺伝子」はHBVのヌクレオカプシドを構成するコアタンパク質HBcをコードするHBVの複製に必須の遺伝子である。C遺伝子もジェノタイプによって異なる塩基配列からなる。例えば、HBV/AのHBc(本明細書では、しばしば「HBc/A」と表記する。他のジェノタイプについても同様とする。)は配列番号16で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Bは配列番号17で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Cは配列番号18で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Dは配列番号19で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Eは配列番号20で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Fは配列番号21で示すアミノ酸配列からなり、HBc/Gは配列番号22で示すアミノ酸配列からなり、そしてHBc/Hは配列番号23で示すアミノ酸配列からなる。C遺伝子は、前記各HBcをコードする塩基配列で構成される。一例として、配列番号18で示すHBc/Cをコードする配列番号24で示す塩基配列からなるジェノタイプCのC遺伝子、又はそれに基づいて人工的に設計された配列番号25で示すヒトコドン最適化配列が挙げられる。
「HBV-P発現ベクター」は、HBVにおけるP遺伝子を発現可能な状態で包含する発現ベクターである。「P遺伝子」は、前述のようにHBVのDNAポリメラーゼHBV-PolをコードするHBVの複製に必須の遺伝子である。前述のように、HBV-Polには、A〜Hの8種のジェノタイプが知られており、それぞれのアミノ酸配列も配列番号1〜8で示すように異なるが、HBV-P発現ベクターが含むP遺伝子はいずれのHBV-Polをコードする塩基配列で構成されていてもよい。一例として、配列番号26で示すHBV/C-PolをコードするP遺伝子の塩基配列、又はそれに基づいて人工的に設計された配列番号27で示すヒトコドン最適化配列が挙げられる。
「HBx発現ベクター」は、HBVにおけるX遺伝子を発現可能な状態で包含する発現ベクターである。「X遺伝子」はHBVにおける他の遺伝子の転写をトランス活性化するタンパク質HBxをコードする遺伝子である。X遺伝子もジェノタイプによって異なる塩基配列からなる。例えば、HBV/AのHBx(本明細書では、しばしば「HBx/A」と表記する。他のジェノタイプについても同様とする。)は配列番号28で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Bは配列番号29で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Cは配列番号30で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Dは配列番号31で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Eは配列番号32で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Fは配列番号33で示すアミノ酸配列からなり、HBx/Gは配列番号34で示すアミノ酸配列からなり、そしてHBx/Hは配列番号35で示すアミノ酸配列からなる。X遺伝子は、前記各HBxをコードする塩基配列で構成される。一例として、配列番号30で示すHBx/Cをコードする配列番号36で示す塩基配列、又はそれに基づいて人工的に設計された配列番号37で示すヒトコドン最適化配列が挙げられる。HBx発現ベクターは、HBV複製活性評価システムに必須の構成要素ではないが、HBxの存在により、HBc及びHBV-Polによる逆転写活性を促進することができるので、必要に応じてHBV複製活性評価システムに加えることができる。
「レポーターマイナス鎖DNA検出用プライマーペア」は、前記HBV複製活性評価ベクターに含まれるレポーター配列中のイントロンの有無を核酸増幅法によって検出可能なように構成されている。プライマーペアの設計は、特に限定はしない。例えば、レポーターマイナス鎖DNA中のレポーター配列のみが増幅されるようにデザインしてもよい。
10.B型肝炎ウイルス複製活性評価方法(HBV複製活性評価方法)
10−1.概要
本発明の第10の態様は、B型肝炎ウイルスにおける複製活性を評価するための方法(HBV複製活性評価方法)である。本発明のHBV複製活性評価方法によれば、感染性のあるHBVウイルスを使用することなく、ヒト以外の哺乳動物由来の、また肝細胞以外の様々な細胞を利用して、安全、安価かつ迅速に、ハイスループットでHBVの複製を解析することができる。
10−2.方法
本態様におけるHBV複製活性評価方法は、必須の工程として導入工程、培養工程、抽出工程、及び検出工程を含む。以下、それぞれの工程について説明をする。
(1)導入工程
「導入工程」は、第9態様に記載のHBV複製活性評価システムにおけるHBV複製活性評価ベクター及び各発現ベクターを宿主細胞内に導入する工程である。本工程で、HBV複製活性の評価が可能な細胞系が調製される。
(2)培養工程
「培養工程」は、導入後の宿主細胞を培養する工程である。本工程では、導入した発現ベクターよりHBc、HBV-Pol、及びHBxの各種タンパク質を発現させて、HBV複製活性評価核酸に由来するレポーターpgRNAを逆転写することで、細胞内にレポーターマイナス鎖DNAが生産されるようにする工程である。
(3)抽出工程
「抽出工程」は、培養工程後の宿主細胞からDNAを抽出する工程である。本工程では、宿主細胞からHBV複製活性評価核酸に由来するレポーターpgRNAの逆転写によって合成されたレポーターマイナス鎖DNAを含むDNAを抽出することを目的とする。
(4)検出工程
「検出工程」は、抽出工程で得られたレポーターマイナス鎖DNAにおけるイントロンが除去されたレポーター配列を検出する工程である。本工程で、イントロンが除去されたレポーター配列を検出し、定量することによって、HBV複製活性を定量解析することができる。
「核酸増幅法」とは、プライマーペアを用いて、標的核酸の特定の領域を核酸ポリメラーゼによって増幅させる方法をいう。例えば、PCR法、NASBA法、ICAN法、LAMP(登録商標)法(RT-LAMP法を含む)が挙げられる。好ましくはPCR法である。特に、抽出工程で得られたDNA中に存在するレポーターマイナス鎖DNAの量を測定する場合、リアルタイムPCR法のような定量的核酸増幅法を用いることが望ましい。
「ハイブリダイゼーション法」とは、検出すべき標的核酸の塩基配列の全部又は一部に相補的な配列を有する核酸断片をプローブとして用い、その核酸と該プローブ間の塩基対合を利用して、標的核酸若しくはその断片を検出、定量する方法である。ハイブリダイゼーション法には検出手段の異なるいくつかの方法が知られているが、標的核酸のレポーターマイナス鎖DNAがDNAであることから、例えば、サザンハイブリダイゼーション法、RNAマイクロアレイ法、表面プラズモン共鳴法又は水晶振動子マイクロバランス法が好適である。
(目的)
感染性のあるHBVを用いることなく、一般的な細胞を使用してHBVのゲノム複製を短時間で可視化、及び数値化できる安全、安価、かつ迅速なHBV複製活性評価方法を構築する。
(方法)
(1)HBV複製活性評価ベクター(pBB-intron)の作製
ジェノタイプCのHBV pgRNAにおける第1DR1配列及び第1ε配列を含む5'末端の99塩基(HBV pgRNAの32位〜130位に相当)と、DR2配列、第2DR1配列及び第2ε配列を含む3'末端の349塩基(HBV pgRNAの3013位〜3215位及び1位〜146位に相当)の間、すなわち第1ε/DR2配列(HBV pgRNAの131位〜3012位に相当)を、イントロンを含む320塩基のレポーター配列と置換して、本発明の第7態様に記載の配列番号15で示すHBV複製活性評価核酸を作製した(図2A)。このレポーター配列は、pCRE-MetLuc2ベクター(Clontech社)の483部位〜453部位(31塩基対)、pCIベクター(Promega社)の857部位〜989部位(133塩基対)及びpCRE-MetLuc2ベクターの452部位〜337部位(116塩基対)の塩基配列に由来する。
(2)HBV-P発現ベクターの(pCI-HBV-P)作製
HBVの配列番号26で示すP遺伝子に基づいて人工的に設計された配列番号27で示す配列をpCIベクター(Promega社)のCMVプロモーター制御下に挿入して本発明の第8態様に記載のHBV-P発現ベクターであるpCI-HBV-Pを作製した(図3B)。
(3)HBc発現ベクター(pCI-HBc)の作製
HBVの配列番号24で示すC遺伝子に基づいて人工的に設計された配列番号25で示す配列をpCIベクター(Promega社)のCMVプロモーター制御下に挿入して本発明の第8態様に記載のHBV-C発現ベクターであるpCI-HBcを作製した(図3C)。
(4)HBx発現ベクター(pCI-HBx)の作製
HBVの配列番号36で示すX遺伝子に基づいて人工的に設計された配列番号37で示す配列をpCIベクター(Promega社)のCMVプロモーター制御下に挿入して本発明の第8態様に記載のHBx発現ベクターであるpCI-HBxを作製した(図3D)。
(5)HBV複製活性評価方法
HeLa細胞にHBV複製活性評価ベクターと、HBV-P発現ベクター、HBc発現ベクター及びHBx発現ベクターを様々な組み合わせで導入した(導入工程)。組み合わせのパターンは、図4Aに記載の通りである。HeLa細胞への遺伝子導入には、エレクトロポレーション法を用いた。エレクトロポレーターNepa21(ネッパジーン社)により、10 μgのDNAを125V/2.5ms plus lengthの条件で、約1×106個のHeLa細胞に導入した。HBc発現ベクター:HBV-P発現ベクター:HBx発現ベクターの比率は9:3:1とし、組み合わせにより導入しない発現ベクターがある場合には、その導入しない発現ベクターと同比率の空ベクター(pCI)を導入した。HBV複製活性評価ベクターと他の発現ベクターの総和の比率は、1:1(5μg:5μg)とし、導入しない発現ベクターについては、その比率分のpCIを導入した。
(結果)
図4に実施例1の結果を示す。
<実施例2:エンテカビルを用いたHBV複製活性評価方法の検証>
(目的)
本発明のHBV複製活性評価システムを用いて、既存の抗HBV薬であるエンテカビルの効果を検証する。
(方法)
実施例1に記載のHBV複製活性評価方法に準じて、HeLa細胞にHBV複製活性評価ベクターと、HBV-P発現ベクター、HBc発現ベクター及びHBx発現ベクターを導入した。HBc:HBV-P:HBxの各発現ベクターの導入比率は9:3:1とし、HBV複製活性評価ベクターとHBc+HBV-P+HBxの発現ベクターの導入比率は、1:1(5μg:5μg)とした。導入工程後のHeLa細胞に2mLの10% FBS添加したDMEMを加え、0.1mL/wellで96 well-plateに分注した後、各培地に0.04μM/well、0.08μM/well、0.16μM/well、0.31μM/well、0.63μM/well、1.25μM/well、2.50μM/well、及び5.00μM/wellのエンテカビルを加え、5%CO2存在下にて37℃で24時間培養した。エンテカビルは、強力な核酸アナログ製剤であり、HBV-Polに作用して逆転写を阻害することが知られている(Billich A., 2001, Curr Opin Investig Drugs., 2(5):617-21)。
(結果)
リアルタイムPCRで増幅した後、実施例1で作成した検量線(図4B)でレポーターマイナス鎖DNAを定量解析した結果を図5に示す。レポーターマイナス鎖DNAは、エンテカビルの濃度に依存してその量を減じた。この結果は、エンテカビルの濃度依存的にHBV DNAの複製が阻害されたことを示唆している。したがって、本発明のHBV複製活性評価システムを用いることで、感染性を有するHBV粒子を使用することや、またHBVを産生することなく、従来法に比して24時間という極めて短時間にHBVの複製過程を定量化できることが立証された。
<実施例3:HBVの複製を選択的に阻害する糸状菌由来天然化合物の探索>
(目的)
本発明のHBV複製活性評価システムを用いて、HBVの複製を阻害する新規の抗HBV化合物を探索する。
(方法)
(1)抗HBV活性を有する天然化合物の探索
本発明のHBV複製評価システムを用いて、糸状菌培養抽出物ライブラリー(ExMyco:ハイファジェネシス社)から抗HBV活性を有する天然化合物の探索を実施した。
(結果)
図6に結果を示す。前記化合物は、HBV DNAの複製を濃度依存的に阻害した(図6A)。しかし、ゲノムDNA (G3PDH exon8)やミトコンドリアDNA (ND5)の量には影響しなかった(図6B,C)。そこで、この化合物をHBV DNAの複製阻害剤として選択した。
<実施例4:HBV DNA複製阻害剤の同定>
(目的)
実施例3で得られたHBV DNA複製阻害剤の化学構造を同定する。
(方法)
NMR試料を10mg/CDCl3 35mm heightで約0.4 mL調製した。続いて、各種NMR(H-1, C-13, DEPT, COSY, HSQC, HMBC, 及びNOESY)をJEOL ECA 500(JEOL RESONANCE社)にて測定した。
(結果)
NMRの測定結果及び参考文献に記載の文献値との比較結果を表1に示す。表中、litは、参考文献(Agatsuma T., et al. 1993, Chem. Pharm. Bull., 41: 373-375)を意味する。
(目的)
実施例4でHBV DNA複製阻害剤として同定されたハイポセマイシンは、古典的MAPK経路で重要な役割を担うMEK、すなわちMAPK/ERKキナーゼ(MAPKK)の阻害剤として知られている(Fukazawa H, et al., 2010, Biol Pharm Bull., 33(2):168-73)。しかしながら、MAPKK阻害剤に抗HBV薬としての薬効があることは、これまで全く知られていない。
(方法)
HeLa細胞にHBV複製活性評価ベクター、及びHBV-P、HBc及びHBxの各発現ベクターを実施例2に記載のHBV複製活性評価方法の比率で導入後、MAPKK阻害剤を5μM添加して、5%CO2下にて37℃で培養した。MAPKK阻害剤には、ハイポセマイシンの他、PD98059、PD184352、及びトラメチニブの4種を用いた。また、MAPKK阻害剤無添加を陰性対照とし、MAPKK阻害剤ではないが、抗HBV薬として公知のエンテカビルをHBV複製阻害活性の陽性対照として、5μM添加し、同条件で培養した。24時間後に培養液から実施例1に記載の方法に準じてDNAを抽出し、リアルタイムPCRを行った。
(結果)
図7に結果を示す。検討した4種のMAPKK阻害剤は、いずれも5μMの濃度で有意なHBV DNA複製阻害活性を示した。この結果から、MAPKK阻害剤が抗HBV薬として有効であるという新規知見が確認された。
<実施例6:MAPKキナーゼのHBV DNA複製に対する作用効果>
(目的)
実施例5の結果からMAPKK阻害剤がHBV DNA複製阻害活性を有することが明らかとなった。この結果は、MAPKキナーゼ活性がHBV DNA複製において重要な役割を担っていることを強く示唆している。そこで、MAPKキナーゼのHBV DNA複製に対する影響について検証する。
(方法)
細胞内で様々なヒトMEK1を強制発現させてMAPKキナーゼのHBV DNA複製に対する影響を検証した。具体的には、HeLa細胞に実施例2に記載のHBV複製活性評価方法の比率でHBV複製活性評価ベクター、及びHBV-P、HBc及びHBxの各発現ベクターを導入すると共に、野生型(Wild type:「Wt」と表記)、恒常的活性型(S218E/S222E:「2E」と表記、S218D/S222D:「2D」と表記)、又はドミナントネガティブ変異型(K97A/S222A:「2A」と表記)の各種ヒトMEK1発現ベクターをそれぞれ導入した。各種発現ベクターを導入後、5%CO2下にて37℃で培養した。培養24時間後に各培養液から実施例1に記載の方法に準じてDNAを抽出し、リアルタイムPCRを行い、MAPKキナーゼ(MEK)の発現によるHBV DNA量、ゲノムDNA量、ミトコンドリアDNA量に及ぼすMEK1発現の影響を検証した。
(結果)
図8に結果を示す。恒常的活性型ヒトMEK1を強制発現させた細胞(2D、2E)では、HBV複製が10倍近く促進されることが明らかとなった(図8A)。特に恒常的活性型の2Dでは45倍以上も促進された。一方、ヒトMEKの強制発現は、ゲノムDNA(図8B)及びミトコンドリアDNA(図8C)の量には影響しなかった。さらにレポーターpgRNAや宿主mRNA(G3PDH)の転写にも影響を与えなかった。
<実施例7:MAPKキナーゼによるHBVタンパク質のリン酸化>
(目的)
MAPKキナーゼがHBV DNAの複製を促進する機序を解明するために、MAPKキナーゼ活性がのHBV DNAの複製のどこで作用しているかを検証する。
(方法)
MAPKキナーゼであるMEKは、古典的MAPKシグナル伝達経路において重要な役割を果たすリン酸化酵素である。MEKの基質であるMAPKファミリー(ERK、JNK1及びp38)には、「TxYモチーフ」と呼ばれる3アミノ酸からなる保存された配列が存在し、このモチーフ内のT残基とY残基がMEKによってリン酸化を受けることでMAPKファミリーが活性化される(Morrison D.K., 2012, MAP kinase pathways. Cold Spring Harb Perspect Biol., 4(11))。したがって、HBVにおいてもHBV DNAの複製に関与するいずれかのHBVタンパク質がMEKによるリン酸化を受けていることが推測された。
(結果)
図10Bにその結果を示す。末端タンパク質領域の120TKY122に変異を導入したTAYF-1及びTAYF-1/2では、野生型(Wt)のHBV/C-Pを導入した時の恒常活性型MEK1の強制発現によるHBV複製の促進活性と比較して、その活性が顕著に抑制されることが明らかとなった。一方、スペーサー領域の284AAF286のみに変異を導入したTAYF-2では、そのような抑制は認められなかった。これらの結果から、HBV-Polは、末端タンパク質領域に位置する120TKY122が宿主細胞のMAPKキナーゼによってリン酸化されることにより活性化されることが示唆された。
<実施例8:HBV DNA複製阻害における公知抗HBV薬とMAPKK阻害剤による相乗効果>
(目的)
公知の抗HBV薬とMAPKK阻害剤を組み合わせて用いたときの、HBV DNAの複製阻害効果を検証する。
(方法)
公知の抗HBV薬には、HBV複製時における逆転写阻害剤として知られるエンテカビルを用いた。また、MAPKK阻害剤には、ハイポセマイシンを用いた。
(結果)
図11に相乗効果の結果を示す。いずれの濃度であってもエンテカビル単独、又はハイポセマイシン単独で添加したときよりも、両者を添加した場合には濃度異存的にHBV DNAの複製阻害効果が増強することが判明した。この結果から、ハイポセマイシンとエンテカビルはHBV DNAの複製阻害効果を相乗的に増強することが明らかとなった。
<実施例9:核酸アナログ薬剤耐性HBVに対するMAPKK阻害剤のHBV DNA複製阻害効果>
(目的)
核酸アナログ耐性HBVの出現原因となる変異型HBV-Polに対するMAPKK阻害剤のHBV DNA複製阻害効果を検証する。
(方法)
背景技術の章で記載したように、エンテカビルやラミブジンのような核酸アナログからなる従来の抗HBV薬は、長期投与により薬剤耐性HBVの出現を引き起こす。このような薬剤耐性HBVの出現原因として、HBV-Polにおける逆転写酵素(RT)領域内の変異が報告されている。例えば、図12Aで示すように、RT領域内に位置する204位のメチオニン(M)がイソロイシン(I)にアミノ酸置換したM204I変異を有するラミブジン耐性HBV(LAMr)、RT領域内に位置する180位のロイシン(L)がメチオニンに、184位のTがグリシン(G)に、202位のセリン(S)がIに、そして204位のMがIに、計4アミノ酸置換したL180M/T184G/S202I/M204I変異を有するエンテカビル耐性HBV(ETVr)等が知られている。
(結果)
図12BにHBV複製活性の阻害効果の結果を示す。エンテカビルは、野生型HBV-Polによる逆転写を濃度依存的に抑制した(b)が、ラミブジン耐性変異型HBV-Polの逆転写活性に対する抑制効果は弱く(d)、またエンテカビル耐性変異型HBV-Polの逆転写活性はほとんど抑制できなかった(f)。一方、ハイポセマイシンは、野生型(a)と2種の薬剤耐性変異型HBV-Pol(HBV-Pol-LAMr(c)、及びHBV-Pol-ETVr(e))による逆転写活性をいずれも濃度依存的に抑制した。これらの結果から、ハイポセマイシン等のMAPKK阻害剤によるHBV複製阻害作用は、核酸アナログによる抗HBV活性、すなわちHBV-Polの逆転写活性の抑制に基づくHBV複製阻害作用とは、作用機序が異なることを立証している。
<実施例10:欠失型HBV複製活性評価ベクターを用いたHBV複製評価実験>
(目的)
各種欠失型HBV複製活性評価ベクター(ΔpBB-intron)を用いてHBV複製評価実験を実施し、pBB-intronに含まれるHBVゲノム由来配列の中で、pgRNAの逆転写に重要な役割を担う配列を特定する。
(方法)
以下に示す4種類のΔpBB-intronを調製した。
(2)pBB-intron(ΔDR2):実施例1で作成したpBB-intronからDR2配列を欠失させたDR2欠失型pBB-intron
(3)pBB-intron(ΔDR1(2)):実施例1で作成したpBB-intronから第2DR1を欠失させたDR1(2)欠失pBB-intron
(4)pBB-intron(Δε2):実施例1で作成したpBB-intronから第2ε配列を欠失させた第2ε欠失型pBB-intron
pBB-intron(ΔpBB-intronに対して野生型pBB-intronと表記する)及び前記4種類のΔpBB-intronのいずれか1つをHBVタンパク質CP(C:HBc、P:HBV-Pol)又はCPX(C:HBc、P:HBV-Pol、X:HBx)と共にHeLa細胞に遺伝子導入し、培養24時間後にDNAを抽出してリアルタイムPCRにより逆転写されたレポーターHBV DNA量を定量した。数値は、リアルタイムPCRで定量した宿主(HeLa細胞)のゲノムDNA量(G3PDH exon8)との比率で表す。
(結果)
図13に結果を示す。5'末端側に位置する第1ε配列を欠失させたpBB-intron(Δε1)では、レポーターHBV DNAがほぼ完全に消失しており、第1ε配列がpgRNAの逆転写に必須の要素であることが示された。また、3'末端側に位置する第2DR1配列を欠失させたpBB-intron(ΔDR1(2))では、産生されるレポーターHBV DNAの量が減少していることから、第2DR1配列はpgRNAの逆転写に必須ではないものの、重要な役割を果たす可能性が示された。一方、DR2配列を欠失させたpBB-intron(ΔDR2)や第2ε配列を欠失させたpBB-intron(Δε2)では、産生されるレポーターHBV DNAの量が野生型pBB-intron(wt)と有意差がなかった。この結果は、DR2配列及び第2ε配列は、少なくともpgRNAの逆転写において、特段重要ではないことが明らかとなった。
Claims (3)
- B型肝炎ウイルス複製活性を評価するためのB型肝炎ウイルスにおける複製活性の評価システムであって、
宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び、B型肝炎ウイルス由来のイプシロン配列を含む核酸、を含むベクターであって、
前記核酸は、前記イプシロン配列の3’末端側にイントロンを含む任意のレポーター配列を含み、前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されている、
前記ベクター、
宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、B型肝炎ウイルスのP遺伝子が発現可能な状態で配置されたB型肝炎ウイルスポリメラーゼ発現ベクター、並びに、
宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、B型肝炎ウイルスのC遺伝子が発現可能な状態で配置されたB型肝炎ウイルスコアタンパク質発現ベクター
を含む、前記評価システム。 - 宿主細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーターの下流に、B型肝炎ウイルスのX遺伝子が発現可能な状態で配置されたB型肝炎ウイルスXタンパク質発現ベクターをさらに含む、請求項1に記載の評価システム。
- イントロンが除去されたレポーター配列を検出可能なように設計されたプライマーペアをさらに含む、請求項1又は2に記載の評価システム。
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