CN105101999B - 用在病毒性疾病的治疗中的mek抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够显示一种或多种有益的治疗效果的MEK抑制剂。该MEK抑制剂能够用于预防和/或治疗病毒性感染中。MEK抑制剂与神经氨酸苷酶抑制剂化合物相结合在病毒性疾病的治疗中能够显示一种或多种有益的治疗效果。

Description

用在病毒性疾病的治疗中的MEK抑制剂
技术领域
本发明涉及能够表现一种或多种有益的治疗效果的MEK抑制剂。该MEK抑制剂可用在预防和/或治疗病毒性感染中。MEK抑制剂与神经氨酸苷酶抑制剂化合物相结合能够在病毒性疾病的治疗中表现一种或多种有益的治疗效果。
背景技术
RNA或DNA病毒感染对人类和动物的健康是重大威胁。举例来说，流感病毒感染至今仍居于人类大型传染病之列，并且每年都会造成大量死亡。在国民经济方面，比如因不适宜工作，因而它们是一个极大的成本因素。主要影响马和羊但也已被针对人类隔离并与神经性疾病相关的博尔纳病病毒(BDV)感染，同样具有重大的经济重要性。
控制尤其是RNA病毒的问题是由高故障率的病毒聚合酶引起的病毒的适应性，这使得生产合适的疫苗以及开发抗病毒物质十分艰难。另外，已经发现应用直接针对病毒功能的抗病毒物质在治疗初期显示好的抗病毒效果，但很快就将导致基于突变而选择抗性变体。一个例子是直接针对病毒的跨膜蛋白的抗流感制剂金刚烷胺及其衍生物，应用后短时间内，就会产生病毒的抗性变体。其他的例子是针对流感病毒感染抑制流感病毒表面蛋白神经氨酸苷酶的新的治疗药物，比如瑞乐砂(Relenza)就属于这样的治疗药物。已经在病人中发现抗瑞乐砂的变体(Gubareva等，J infect Dis 178，1257-1262，1998)，寄予这种治疗的期望因此无法满足。
由于病毒具有较小的基因组，以及由此导致对于用于复制所必需的功能有限的编码能力，因此，所有的病毒都高度依赖于其宿主细胞的功能。通过影响病毒复制所必需的这种细胞功能，就有可能对被感染的细胞内的病毒复制产生不利的影响。在此，为避免选择压力，病毒不可能通过适应，特别是突变来代替缺失的细胞功能。这在以相对非选择性抑制剂对抗细胞激酶和转甲基酶的甲型流感病毒中可能已有所显现(Scholtissek和Müller,ArchVirol 119,111-118,1991)。
本领域已知细胞具有大量的信号传导路径，作用于细胞的信号通过这些路径被传送到细胞核内。因此，细胞能够对外部刺激做出反应，并通过细胞增殖、细胞活化、分化或控制细胞死亡(controlled cell death)的方式做出反应。这些信号传导路径往往至少包含一种通过磷酸化作用激活至少一种蛋白质随即传导信号的激酶。当观察病毒感染后引发的细胞进程时，发现大多数DNA和RNA病毒倾向于在被感染的宿主细胞内激活某一确定的信号传导路径，也就是所谓的Raf/MEK/ERK激酶信号传导路径(Benn等人,J Virol 70,4978-4985,1996；Bruder和Kovesdi,J Virol 71,398-404,1997；Popik和Pitha,Virology 252,210-217,1998；Rodems和Spector,J Virol 72,9173-9180,1998)。该信号传导路径是细胞内最重要的信号传导路径之一，并在细胞增殖和分化过程中起到重要作用。生长因子诱导的信号通过连续的磷酸化作用从丝氨酸/苏氨酸激酶Raf传导到双特异性激酶MEK(MAP激酶激酶/ERK激酶)，并且最终传导到激酶ERK(细胞外信号调节激酶)。然而，作为Raf的激酶底物，仅MEK是已知的，ERK亚型被认定为MEK唯一的底物，ERK能够将全部底物磷酸化。属于这一类的诸如转录因子，细胞的基因表达由此直接受到了影响。(Cohen,Trends in CellBiol 7,353-361,1997；Robinson and Cobb,Curr.Opin.Cell Biol 9,180-186,1997；Treisman,Curr.Opin.Cell Biol 8,205-215,1996)。
现有技术中抗病毒类活性物质的不足之处在于，其要么直接对抗病毒成分因而会快速导致耐药性(参见金刚烷胺)，要么作用太广且以非特异性的方式对抗细胞因子(如转甲基酶抑制剂)，显著的副作用是可以预期的。因此，已知已经被开发的治疗病毒性疾病的物质中没有一种对于细胞因子具有活性。另一方面，其他激酶抑制剂，如MEKK/SEK/JNK信号传输路径中的JNK激酶抑制剂，能够增加病毒增殖。另外，众所周知，增强其他激酶的活化作用，比如蛋白激酶C(PKC)，会抑制病毒的复制(Driedger和Quick,WO 92/02484)。关于病毒感染后诱导的细胞进程，发现大多数DNA和RNA病毒会激活被感染的宿主细胞内某一确定的信号传导通路，也就是所谓的Raf/MEK/ERK激酶流。
该激酶流属于细胞内最重要的信号通路并在增殖和分化过程中起着必要作用。
生长因子诱导的信号通过连续的磷酸化作用从丝氨酸/苏氨酸激酶Raf传递到双特异性激酶MEK(MAP激酶激酶/ERK激酶)，并且最终传递到激酶ERK(细胞外信号调节激酶)。然而，作为Raf的激酶底物，仅MEK是已知的，ERK亚型已经被认定为MEK唯一的底物，ERK能够使相当数量的底物磷酸化。比如转录因子的磷酸化就属于此类，其会直接修改细胞的基因表达。
对细胞决策过程的该信号通路的调查已经导致识别了一些药理学上的抑制剂，这些抑制剂根据MEK水平在其他位置，即激酶流的“瓶颈”处会抑制信号路径。
MEK抑制剂PD98059通过Raf激酶抑制MEK的活化。
MEK抑制剂PD184352，又叫(2-(2-氯-4-碘苯基氨基)-氮-环丙基甲氧基-3,4-二氟-苯甲酰胺)，其在小鼠模型口服给药中可有效抑制结肠癌的增长。
MEK抑制剂AZD6244(司美替尼(Selumetinib))是一种被研究用于治疗各种癌症的药物，如非小细胞性肺炎(NSCLC)。
AZD8330是一种口服活性、选择性MEK抑制剂，其IC50为7nM。AZD8330具有潜在的抗肿瘤活性。AZD8330特别抑制丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MEK或MAP/ERK激酶1)，从而抑制生长因子调节的细胞信号以及肿瘤细胞增殖。
已经显示MEK抑制剂RDEA-119(BAY-869766)为有效的、具有选择性的用于癌症治疗的MEK1/2的变构抑制剂。
MEK抑制剂GSK-1120212(Trametinib)是一种有效的、具有选择性的MEK1和MEK2(MEK1/2)酶的变构抑制剂，在一期临床试验(ASCO2010)中表现出抗肿瘤活性。
TAK-733是一种有效的、具有选择性的ATP-非竞争性MEK变构部位抑制剂，IC50为3.2nM。
MEK抑制剂RO5126766是一种特别针对Raf和MEK丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)的具有潜在的抗肿瘤活性的蛋白激酶抑制剂。Raf/MEK双重激酶抑制剂RO5126766特别抑制Raf和MEK的激酶活性，以致抑制促进细胞恶性转化的靶基因的转录。
MEK抑制剂AS703026是一种新型的、高选择性和有效的MEK1/2的变构抑制剂，该抑制剂当前处于急性髓性白血病二期临床试验阶段。
市售的MEK抑制剂PLX-4032((Vemurafenib))用于治疗晚期黑色素瘤的。MEK抑制剂CI-1040,PD0325901,AZD6244,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,AZD8330,RO5126766,RO4987655,TAK-733and AS703026在本领域内是已知的，如Fremin和Meloche(2010),J.Hematol.Oncol.11；3:8在表1所描述的和图4所示出的。
神经氨酸苷酶(又叫唾液酸酶，受体破坏酶以及EC 3.2.1.18)是动物和许多微生物中常见的酶。它是一种切割连接末端α-糖苷键的唾液酸与糖蛋白、糖脂和低聚糖的糖水解酶。包含神经氨酸苷酶的许多微生物对人类和包括家禽、马、猪和海豹在内的其他动物都具有致病性。这些致病菌就包括流感病毒。
神经氨酸苷酶与流感病毒的致病性有关，认为其会促进新合成的病毒体从被感染的细胞中洗脱出来并有助于病毒(通过其水解酶活性)通过呼吸道的粘液移动。
一类特定的抗流感病毒药物——神经氨酸苷酶抑制剂已表现出同时对流感病毒A和B具有抑制作用。奥司他韦(Oseltamivir)用于病毒性感染的治疗；然而，其并不能治疗鼻塞。奥司他韦是碳环过渡态唾液酸类似物RO 64-0802(GS4071)的乙酯前药，是一种有效的、具有选择性的流感A病毒和B病毒神经氨酸苷酶的抑制剂。美国已于1999年批准口服奥司他韦来治疗重型流感。其在治疗和预防流感类疾病上已经显示功效。
奥司他韦磷酸盐是奥司他韦羧酸盐(奥司他韦)的前药，是一种流感A病毒和B病毒在复制过程中所必需的神经氨酸苷酶糖蛋白的抑制剂。奥司他韦可从罗氏制药公司(RochePharma.TM.AG)(瑞士)获得。或者，奥司他韦可根据Bischofberger等人的US5763483以及Lew等人的US5866601中所描述的方法来制备。大约10-15％的服用奥司他韦的患者会经历恶心和呕吐的症状。肾功能障碍的患者应减小剂量。
扎那米韦(Zanamivir)(瑞乐砂(Relenza))是一种口服吸入粉末，目前已在19个国家批准用于治疗流感A病毒和B病毒，在两个国家批准用于预防流感A病毒和B病毒。扎那米韦是神经氨酸苷酶糖蛋白的一种竞争性抑制剂，其在流感病毒的感染周期中是必要的。其紧密模仿唾液酸——神经氨酸苷酶的自然底物。在过去的几年中，大量事件已经引发了扎那米韦处方信息的改变，现在的处方包含对支气管痉挛、呼吸困难、皮疹、荨麻疹和过敏性反应(包括面部水肿和咽喉水肿)的警告信息。
帕拉米韦(Peramivir)是一种神经氨酸苷酶抑制剂，其用作流感神经氨酸苷酶的过渡态类似物抑制剂，从而会防止被感染的细胞产生新的病毒。
众所周知，神经氨酸苷酶抑制剂并非对所有的流感病毒都有效，耐药性会由新产生的流感病毒株而发展。
考虑到现有技术，很明确我们需要能够有效治疗病毒性疾病，特别是由流感病毒所引起的疾病的化合物和组合物。
发明内容
通过使用本发明的MEK抑制剂化合物或其与一种或多种，诸如一种、两种、三种等神经氨酸苷酶抑制剂结合可消除上述需求。
当本文使用时，“MEK抑制剂”也可认定为丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)激酶抑制剂。已知在MAPK通路中，MAPK激酶激酶(MAPKKK)活化MAPK激酶(MAPKK)，该MAPK激酶转而活化MAPK，该MAPK将信号转换至，比如转录因子或其他激酶或效应器/信号转导蛋白；例如参看上文所引用的Fremin和Meloche的图1。本发明的MEK抑制剂优选抑制主体，例如本文所述的哺乳动物或者鸟的MEK1/2。然而，可能本发明的MEK抑制剂不仅抑制MEK、优选MEK1/2，还抑制其上游激酶(即MAPKKK)，从而发挥双重抑制作用。不受理论约束，PLX-4032可能是这样的双重抑制剂。因此，根据一个优选的方面，本发明的MEK抑制剂可能是双重抑制剂，从而抑制MEK、优选抑制MEK1/2以及相应的上游激酶MAPKKK。MEK1/2是Ras/Raf通路中的MAPKK，因此，Ras/Raf作为MAPKKK，ERK1/2作为MAPK。
当本文使用时，术语“MEK抑制剂”包括一种MEK抑制剂，比如本文所公开的MEK抑制剂中的一种，但是一种或多种MEK抑制剂，比如两种、三种、四种、五种或更多种MEK抑制剂例如选自本文所公开的MEK抑制剂。
神经氨酸苷酶抑制剂是一种针对流感病毒的抗病毒药，其通过封锁病毒神经氨酸苷酶蛋白的功能，进而防止病毒结合到其意欲感染的细胞上和/或者防止病毒通过在宿主细胞发芽而繁殖来发挥作用，这是因为新生病毒不能在其进行复制的细胞中发芽成长。优选的神经氨酸苷酶抑制剂是奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦或这些物质中任何一个的药学上可接受的盐，比如奥司他韦磷酸盐、奥司他韦羧酸盐等。
发明概述
本发明内容可概括为以下几条：
1.一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，包括向有需要的患者施用MEK抑制剂或其药学上可接受的盐。
2.根据第1条所述的方法，其中所述病毒性疾病是由负RNA链病毒引起的感染。
3.根据第2条所述的方法，其中所述病毒是流感病毒。
4.根据第1、2或3条所述的方法，其中所述MEK抑制剂选自以下组：PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐。
5.根据前述任意一条所述的方法，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合施用。
6.根据第5条所述的方法，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与所述神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐同时施用或在其之前或之后施用。
7.根据第5条或第6条所述的方法，其中所述神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
8.一种药物组合物，包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
9.一种药物组合物，包含用作药剂的MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
10.根据第8条或第9条所述的药物组合物，其中所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐。
11.根据第8、9或10条所述的药物组合物，其中所述神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦。
12.如第8、10或11条所述的药物组合物用在预防和/或治疗病毒性疾病中。
13.一种用在预防和/或治疗病毒性疾病中的MEK抑制剂化合物。
14.选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐的化合物用在预防和/或治疗病毒性疾病中。
15.根据第14条使用的所述化合物选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,RO51267766,RO4987655,TAK-733和AS703026或其药学上可接受的盐。
16.根据第14条或15条使用的所述化合物，其中所述病毒性疾病是由负RNA链病毒引起的感染。
17.根据第16条使用的所述的化合物，其中所述病毒是流感病毒。
18.根据第13、14、15、16或17条使用的所述化合物，其中所述化合物与神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合施用。
19.根据第18条使用的所述化合物，其中所述神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦。
20.用在预防和/或治疗病毒性疾病的方法中的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐。
21.根据权利要求20使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述病毒性疾病是由负RNA链病毒引起的感染。
22.根据权利要求21使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述病毒是流感病毒。
23.根据权利要求22使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述流感病毒是流感A病毒或流感B病毒。
24.根据前述任一权利要求使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合施用。
25.根据权利要求24使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与所述神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐同时施用，或者在其之前或之后施用。
26.根据权利要求24或25使用的所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐，其中所述神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
27.一种药物组合物，包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐和神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
28.一种药物组合物，包含用作药剂的MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐。
29.根据权利要求27或28所述的药物组合物，其中所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐。
30.根据权利要求27、28或29所述的药物组合物，其中所述神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦。
31.如权利要求27至30中任一项所述的药物组合物用在预防和/或治疗病毒性疾病中。
治疗方法
本发明的目的在于提供用于预防或治疗病毒性疾病，特别是预防和/或治疗细胞内和/或细胞核内复制的负链RNA病毒的药物，此种药物并非直接针对病毒的功能，而是选择性地抑制细胞内的酶，并经由该选择性作用抑制病毒的病毒复制。
出乎意料的是，已经发现该目的能够通过根据本发明的激酶流抑制剂或特别是通过包含MEK抑制剂化合物的药物来实现。
因此，一方面，本发明提供一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用MEK抑制剂。
一方面，本发明的方法用于预防和/或治疗由负RNA链病毒而引起的感染的病毒性疾病。更优选地，该病毒性疾病由流感病毒引起，特别优选地，该病毒性疾病由流感A病毒或B病毒引起。流感病毒例如为H1N1,H5N1,H7N7,H7N9。
本发明的MEK抑制剂优选地选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352。
更优选地，它们选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,RO51267766,RO4987655,TAK-733和AS703026。特别优选地，它们选自AZD6244,AZD8330,GSK1120212和PLX-4032或选自PD-0325901,AZD-6244,AZD-8330以及RDEA-119。这些MEK抑制剂在本领域内为公众所知，如Fremin和Meloche(2010),J.Hematol.Oncol.11；3:8的表1所述。
确实，如所附实施例所示的，MEK抑制剂AS-703026,AZD-6244,AZD-8033,PLX-4032,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,CI-1040,PD-0325901作为单剂对抗流感A病毒或B病毒是高活性的。而且，如所附实施例所示的，本文公开的MEK抑制剂与诸如奥司他韦的神经氨酸苷酶联合对抗流感A病毒和/或流感B病毒显示协同效应。
本发明的主体或病患是哺乳动物或鸟。合适的哺乳动物的实例，包括但不限于，小鼠、大鼠、奶牛、山羊、绵羊、猪、狗(dog)、猫、马、豚鼠、犬(canine)、仓鼠、貂、海豹、鲸、骆驼、黑猩猩、猕猴和人。合适的鸟的例子，包括但不限于，火鸡、鸡、鹅、鸭子、水鸭、野鸭、八哥、北方针尾鸭、鸥、天鹅、珍珠鸡或水鸟，仅举几例。人类患者是本发明的具体的实施方式。
根据本发明的方法，MEK抑制剂可口服给药、静脉注射给药、胸腔给药、局部给药或经由吸入的方式给药。优选地，所述MEK抑制剂通过鼻腔吸入或口服方式给药。
包括MEK抑制剂的药物组合物可以是可口服的混悬液或片剂；鼻用喷雾、无菌可注射制剂(通过静脉注射、胸腔注射、肌内注射)，如无菌可注射的水性或油性混悬液或栓剂。以混悬液形式口服给药时，这些组合物根据制药配方领域可用的技术进行制备，并可以包含本领域内熟知的用于膨胀体积的微晶纤维素，作为悬浮剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素以及甜味剂/矫味剂。作为速释片，这些组合物可包含微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或其他本领域内熟知的赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。可注射液或混悬液可以使用适当的无毒的、不经肠道的可接受的稀释剂或溶剂，如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏溶液或生理盐溶液；或合适的分散剂或润湿剂以及混悬剂，如无菌温和的固定油，包括合成的单/双甘醇；以及脂肪酸，包括油酸根据已知技术进行配制。
根据本发明的方法，MEK抑制剂以治疗有效量被施用。
供使用的MEK抑制剂化合物
一方面，本发明提供用在预防和/或治疗病毒性疾病(的方法)中的MEK抑制剂。
一方面，本发明提供用在包含向有需要的主体或患者施用MEK抑制剂来预防和/或治疗病毒性疾病(的方法)中的MEK抑制剂。
优选地，该病毒性疾病是由负RNA链病毒引起的感染。更优选地，该病毒性疾病由流感病毒引起，特别优选地，该病毒性疾病由流感A病毒或B病毒引起。流感病毒比如H1N1,H5N1,H7N7,H7N9。
本发明的MEK抑制剂优选地选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352。更优选地，选自AZD6244,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,AZD8330,RO51267766,RO4987655,TAK-733,PLX-4032和AS703026。特别优选地，选自GSK1120212,AZD6244,PLX-4032或选自PD-0325901,AZD-6244,AZD-8330和RDEA-119。
本发明使用的MEK抑制剂可以口服给药、静脉注射给药、胸腔内给药、肌内给药、局部给药或经由吸入给药。优选地，所述MEK抑制剂经由鼻腔吸入或口服给药。
使用的MEK抑制剂以治疗有效量进行施用。
包含所使用的MEK抑制剂的药物组合物可以是可口服的混悬液或片剂；鼻用喷雾、无菌可注射制剂(通过静脉注射、胸腔注射、肌内注射)，如无菌可注射的水性或油性混悬液或栓剂。以混悬液形式口服给药时，这些组合物根据制药配方领域可用的技术进行制备，并可以包含本领域内熟知的用于膨胀体积的微晶纤维素，作为悬浮剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素以及甜味剂/矫味剂。作为速释片，这些组合物可包含微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或其他本领域内熟知的赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。可注射液或混悬液可以使用适当的无毒的、不经肠道的可接受的稀释剂或溶剂，如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏溶液或生理盐溶液；或合适的分散剂或润湿剂以及混悬剂，如无菌温和的固定油，包括合成的单/双甘醇；以及脂肪酸，包括油酸根据已知技术进行配制。
供使用的药物组合物
一方面，本发明提供包含MEK抑制剂的药物组合物，其用在预防和/或治疗病毒性疾病中。
一方面，本发明提供包含MEK抑制剂的药物组合物，其用在包含向有需要的主体或患者施用MEK抑制剂来预防和/或治疗病毒性疾病。
优选地，该病毒性疾病是由负RNA链病毒引起的感染。更优选地，该病毒性疾病由流感病毒引起，特别优选地，该病毒性疾病由流感A病毒或B病毒引起。流感病毒比如H1N1,H5N1,H7N7,H7N9。
本发明的药物组合物使用的MEK抑制剂优选地选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352。更优选地，选自AZD6244,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,AZD8330,RO51267766,RO4987655,TAK-733,PLX-4032和AS703026。特别优选地，选自GSK1120212,AZD6244,PLX-4032或选自PD-0325901,AZD-6244,AZD-8330和RDEA-119。
本发明使用的包含MEK抑制剂的药物组合物施用于哺乳动物或鸟类患者。合适的哺乳动物的实例，包括但不限于，小鼠、大鼠、奶牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬、仓鼠、貂、海豹、鲸、骆驼、黑猩猩、猕猴和人，其中优选人。合适的鸟的例子，包括但不限于，火鸡、鸡、鹅、鸭子、水鸭、野鸭、八哥、北方针尾鸭、鸥、天鹅、珍珠鸡或水鸟，仅举几例。人类患者是本发明的具体的实施方式。
所述药物组合物可以是可口服的混悬液或片剂；喷鼻剂，无菌注射制剂(静脉注射剂、胸腔内注射剂、肌内注射剂)，如无菌可注射的水性或油性混悬液或栓剂。以混悬液形式口服给药时，这些组合物根据制药配方领域可用的技术进行制备，并可以包含本领域内熟知的用于膨胀体积的微晶纤维素，作为悬浮剂的海藻酸或海藻酸钠，作为粘度增强剂的甲基纤维素以及甜味剂/矫味剂。作为速释片，这些组合物可包含微晶纤维素、磷酸氢钙、淀粉、硬脂酸镁和乳糖和/或其他本领域内熟知的赋形剂、粘合剂、填充剂、崩解剂、稀释剂和润滑剂。可注射液或混悬液可以使用适当的无毒的、不经肠道的可接受的稀释剂或溶剂，如甘露醇、1，3-丁二醇、水、林格氏溶液或生理盐溶液；或合适的分散剂或润湿剂以及混悬剂，如无菌温和的固定油，包括合成的单/双甘醇；以及脂肪酸，包括油酸根据已知技术进行配制。优选地，MEK抑制剂通过口服或鼻腔吸入给药。
联合治疗
本发明人意外地进一步发现，联合施用MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂在预防和/或治疗病毒性疾病中产生了意想不到的协同作用，特别是MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂的组合产生了抑制流感A病毒和/或流感B病毒的协同作用。的确，本文所示的MEK抑制剂，如CI-1040,GSK-1120212,PD-0325901,AZD-6244,AZD-8330,RDEA-119,PLX-4032都是可口服的，并且至少处于一期临床试验阶段，其中一些甚至处于二期临床试验阶段，或甚至已被批准上市，比如PLX-4032，其与诸如奥司他韦的神经氨酸苷酶抑制剂结合显示出对抗癌症的抗病毒作用，并可同时对抗流感A病毒和/或流感B病毒。联合治疗显著地提高了奥司他韦的抗病毒作用，并产生了由本文所述的Chou-Talalay法确定的协同抗病毒效应。综上所述，奥司他韦在与MEK抑制剂联合后显示提高的抗病毒作用。这些数据结果对通往开发对抗流感病毒的新型抗病毒治疗方案的道路的进一步临床前体内和体外调查是有价值的。
因此，本发明提供一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括向患者施用MEK抑制剂以及神经氨酸苷酶抑制剂。
根据本发明的方法，MEK抑制剂与神经氨酸苷酶抑制剂同时施用或者在其之前或之后施用。优选地，同时施用MEK抑制剂与神经氨酸苷酶抑制剂。二者可以作为单个制剂施用，也可以以分离的制剂施用。
优选地，通过本发明的MEK抑制剂与神经氨酸苷酶抑制剂联合施用预防或治疗的病毒性疾病由负RNA链病毒引起。更优选地，该病毒性疾病由流感病毒引起。特别优选地，该病毒性疾病由流感A病毒或B病毒引起。流感病毒如H1N1,H5N1,H7N7,H7N9。优选地，该病毒未显现或已经产生对抗神经氨酸苷酶抑制剂的耐药性。更优选地，该病毒未显现或已经产生对抗选自奥司他韦羧酸盐(奥司他韦)、奥司他韦磷酸盐或扎那米韦或帕拉米韦(优选奥司他韦羧酸盐或奥司他韦磷酸盐)的神经氨酸苷酶抑制剂的耐药性。
本发明中与神经氨酸苷酶抑制剂联合使用的MEK抑制剂优选地选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352。更优选地，选自AZD6244,GDC-0973,RDEA119,GSK1120212,AZD8330,RO51267766,RO4987655,TAK-733,PLX-4032和AS703026。特别优选地，它们选自GSK1120212,AZD6244,PLX-4032或选自PD-0325901,AZD-6244,AZD-8330和RDEA-119。
优选地，神经氨酸苷酶抑制剂选自奥司他韦羧酸盐(奥司他韦)、奥司他韦磷酸盐或扎那米韦或帕拉米韦，优选为奥司他韦羧酸盐或奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的方法，其中MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂联合施用，患者为哺乳动物或鸟。合适的哺乳动物的实例，包括但不限于，小鼠、大鼠、奶牛、山羊、绵羊、猪、狗、猫、马、豚鼠、犬、仓鼠、貂、海豹、鲸、骆驼、黑猩猩、猕猴和人。合适的鸟的例子，包括但不限于，火鸡、鸡、鹅、鸭子、水鸭、野鸭、八哥、北方针尾鸭、鸥、天鹅、珍珠鸡或水鸟，仅举几例。人类患者是本发明的具体的实施方式。
因此，本发明提供一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用MEK抑制剂结合奥司他韦或奥司他韦磷酸盐。
因此，本发明提供一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用MEK抑制剂结合扎那米韦。
因此，本发明提供一种用于预防和/或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括向有需要的患者施用MEK抑制剂结合帕拉米韦。
根据本发明的一种组合是Cl-1040或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是PD0325901或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是GSK-1120212与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是RO5126766或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是PLX-4032或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是AZD6244或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是GDC-0973或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是RDEA119或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是AZD8330或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是RO4987655或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是TAK-733或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是AS703026或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是PD98059或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是PD184352或其药学上可接受的盐与奥司他韦，优选奥司他韦磷酸盐。
根据本发明的一种组合是Cl-1040或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD0325901或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是GSK-1120212或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RO5126766或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种结合是PLX-4032或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AZD6244或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是GDC-0973或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RDEA119或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AZD8330与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RO4987655或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是TAK-733与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AS703026或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD98059或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD184352或其药学上可接受的盐与扎那米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是Cl-1040或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD0325901或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是GSK-1120212或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RO5126766或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PLX-4032或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AZD6244或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是GDC-0973或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RDEA119或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AZD8330或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是RO4987655或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是TAK-733或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是AS703026或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD98059或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
根据本发明的一种组合是PD184352或其药学上可接受的盐与帕拉米韦或其药学上可接受的盐。
本发明的MEK抑制剂可通过口服、静脉注射给药、胸腔内给药、肌内给药、局部给药或经由吸入给药。优选地，MEK抑制剂通过吸入给药或口服给药。
本发明的神经氨酸苷酶抑制剂可通过口服、静脉注射给药、胸腔内给药、肌内给药、局部给药或经由吸入给药。优选地，神经氨酸苷酶抑制剂通过吸入给药或口服给药。
如果MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂作为单剂时，该制剂可通过口服给药、静脉注射给药、胸腔内给药、肌内给药、局部给药或经由吸入给药。优选地，该制剂通过口服或经由吸入给药。
因此，本发明提供一种通过联合疗法来治疗病毒性疾病，特别是感染是由负RNA链引起的病毒性疾病，更特别是病毒是流感A病毒或B病毒的疾病的方法。在本发明的优选的实施方案中，该病毒未显现或已经产生对抗神经氨酸苷酶抑制剂的耐药性。
本方法包括以治疗有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐来治疗需要治疗的患者，同时或依次施用下述的神经氨酸苷酶抑制剂。
一方面，本发明提供治疗患者病毒性疾病的方法，其包括：(1)向需要治疗的患者施用治疗有效量的化合物，该化合物为MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；同时或依次(2)向所述患者施用治疗有效量的奥司他韦或奥司他韦磷酸盐。换句话说，根据这一方面，该方法包括向接受奥司他韦或其磷酸盐治疗的患者施用治疗有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；或者向接受MEK抑制剂或其药学上可接受的盐治疗的患者施用治疗有效量的奥司他韦或其磷酸盐。优选地，所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐，其同时或依次与诸如奥司他韦或奥司他韦磷酸盐的神经氨酸苷酶抑制剂联合使用来用于治疗或预防病毒性疾病。
一方面，本发明提供治疗患者病毒性疾病的方法，其包括：(1)向需要治疗的患者施用治疗有效量的化合物，该化合物为MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；同时或依次(2)向所述患者施用治疗有效量的扎那米韦或其药学上可接受的盐。换句话说，根据这一方面，该方法包括向接受扎那米韦或其药学上可接受的盐治疗的患者施用治疗有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；或者向接受MEK抑制剂或其药学上可接受的盐治疗的患者施用治疗有效量的扎那米韦或其药学上可接受的盐。优选地，所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐，其同时或依次与诸如扎那米韦或其药学上可接受的盐的神经氨酸苷酶抑制剂联合使用来用于治疗或预防病毒性疾病。
一方面，本发明提供治疗患者病毒性疾病的方法，其包含：(1)向需要治疗的患者施用治疗有效量的化合物，该化合物为MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；同时或依次(2)向所述患者施用治疗有效量的帕拉米韦或其药学上可接受的盐。换句话说，根据这一方面，该方法包括向接受帕拉米韦或其药学上可接受的盐治疗的患者施用治疗有效量的MEK抑制剂或其药学上可接受的盐；或者向接受MEK抑制剂或其药学上可接受的盐治疗的患者施用治疗有效量的帕拉米韦或其药学上可接受的盐。优选地，所述MEK抑制剂选自PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐，其同时或依次与诸如帕拉米韦或其药学上可接受的盐的神经氨酸苷酶抑制剂联合使用来用于治疗或预防病毒性疾病。
在另一个实施方案中，本发明提供神经氨酸苷酶抑制剂，如奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦或其药学上可接受的盐，与MEK抑制剂如PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352或其药学上可接受的盐联合使用用于治疗和/或预防病毒性疾病。优选地，该MEK抑制剂是GSK1120212或AZD6244或PLX-4032。
在本发明的联合治疗方法中，MEK抑制剂如PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,CI-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059以及PD184352和神经氨酸苷酶抑制剂如奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦可以同时施用或依据其各自的剂量日程或方案分别施用。当大致同时施用时，MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂可以以相同的药物组合物被施用或者以分离的剂量单位形式被施用。
例如，在本发明的联合方法的一个实施方案中，化合物MEK抑制剂可以以有效的治疗剂量通过口服或吸入的方式给药，而神经氨酸苷酶抑制剂可以以经批准的处方信息中所述的剂量和剂量日程给药或以更少的剂量给药。优选以更低的剂量给药。例如，根据达菲(Tamiflu)的标签，达菲可以以30mg、45mg或75mg的胶囊剂的形式给药。成年人或青少年的标准剂量是每天两次75mg的剂量。当达菲与MEK抑制剂联合应用时，可以使用较低的剂量。
在以上所述的顺序联合治疗法中，优选地，顺序联合所用药物依据其药代动力学分布给药，以使第二种药物在第一种药物的血药浓度大幅度下降或消失之后给药。
以上所述的MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂的药代动力学分布一般是本领域已知的。
每种活性化合物的治疗有效量随着但不限于以下因素而变化：所用化合物的活性、该活性化合物在患者体内的稳定性、待缓解的症状的严重程度、被治疗患者的总重量、给药途径、该活性化合物在体内吸收、分布、排泄的容易程度、被治疗患者的年龄和敏感性、不良反应等，这些对于本领域的技术人员而言都是显而易见的。给药量可以随时间依照这些因素进行调整。
本发明方法中使用的药物化合物能够以任何合适的单位剂量形式给药。合适的口服剂型可以是片剂、胶囊剂、混悬液、糖浆剂、口香糖、薄片(wafer)、酏剂等。该口服药物组合物中可以包括药学上可接受的载体，如粘结剂、赋形剂、润滑剂、甜味剂和矫味剂。如果需要，还可以包括常规的改良特殊形式的味道、颜色及形状的制剂。
对于可注射类制剂，该药物组合物可以是冻干粉混合有适当的赋形剂置于适宜的药瓶或管中。临床使用前，该药物可通过将冻干粉溶解在适宜的溶剂体系中进行重建，以形成适宜静脉注射或肌内注射的组合物。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物包含治疗有效量的MEK抑制剂以及选自奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦和帕拉米韦的治疗有效量的神经氨酸苷酶抑制剂。
在一个实施方案中，如前所述，该组合物可以是可口服给药的形式(如片剂、胶囊剂或糖浆剂)，包含治疗有效量(如0.1-2000mg、0.1-1000mg、0.1-500mg、0.1-200mg、30-300mg、0.1-75mg、0.1-30mg)的MEK抑制剂以及治疗有效量(如0.1-2000mg、0.1-1000mg、0.1-500mg、0.1-200mg、30-300mg、0.1-75mg、0.1-30mg)的神经氨酸苷酶抑制剂。例如，根据达菲的标签，达菲可以以30mg、45mg或75mg的胶囊剂施用。成年人或青少年的标准剂量是每天两次75mg的剂量。如果达菲与MEK抑制剂联合施用，则应采取较低剂量。
根据本发明的另一个方面，本发明提供试剂盒，该试剂盒包括(1)单剂量形式的MEK抑制剂，诸如PLX-4032,AZD6244,AZD8330,AS-703026,GSK-1120212,RDEA-119,RO-5126766,RO-4987655,Cl-1040,PD-0325901,GDC-0973,TAK-733,PD98059和PD184352；以及(2)单剂量形式的神经氨酸苷酶抑制剂，诸如奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦。可选地，该试剂盒进一步包括根据本发明的联合疗法使用该试剂盒的说明。
本发明的发明人已经发现，本发明的组合方法在预防和/或治疗病毒性疾病中，特别是预防和/或治疗由负RNA链病毒引起的感染中，更特别地，由流感病毒引起的病毒性疾病中产生了协同作用。更特别地，在预防和/或治疗流感A病毒或流感B病毒(引起的疾病)中产生了协同作用。
本发明的组合可以以协同量进行给药。
“协同作用”或“协同效应”可以定义为：多于加和的效果(Chou,2006,Pharmacolog,58:621-681)。药物组合协同交互作用被高度认可且广受欢迎，这是因为临床使用时可提高功效、减小剂量、降低毒副作用并使耐药性的发展最小化(Chou,2006)。两个最流行的评估联合治疗药物相互作用的方法是等效线法和复合指数法(CI)(Zhao等人,2004,Clinical Cancer Res 10:7994-8004)。在癌症治疗领域和抗病毒治疗领域(其中通过药物联合来对抗药物耐药性的产生以及使药物剂量最小化)，大量研究使用了CI指数来评估协同作用。CI是基于Chou和Talalay 1984(Adv.Enzyme Regul.22:27-55)的方法，并依赖中效原理以及多重药物作用方程(the multiple-drug effect equation)。CI能够很容易地使用CompuSyn程序(CompuSyn,Paramus,N.J.)计算出来。Chou本人(Chou,2006)如下界定相互作用：如果CI值为0.85-0.9为略有协同作用，如果CI值为0.7-0.85为中协同作用，如果CI值为0.3-0.7为协同作用，如果CI值为0.1-0.3为强协同作用，如果CI值小于0.1为极强协同作用。在癌症治疗领域，界定协同作用的CI值可能有变动，如在Lin等人，2007,Carcinogenesis 28:2521-2529中，药物之间的协同作用被界定为CI<1，而在Fischel等人，2006,Preclinical Report 17:807-813中，协同作用被界定为CI<0.8。抗病毒治疗领域使用了类似的数值。如在Wyles等人,2008,Antimicrob Agents Chemotherapy 52:1862-1864中，协同作用被界定为CI<0.9，在Gantlett等人,2007,Antiviral Res 75:188-197中，协同作用被界定为CI<0.9。基于这些参考资料，协同作用可被界定为CI值≤0.9。以上所有以上参考文献通过引用的方式整体明确地并入本文。
本发明的MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂在治疗病毒性疾病中可以产生比MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂各自单独施用的加和效果或者预期的两者结合的简单加和效果更强的协同效应。在这样的情况下，MEK抑制剂的协同有效量低于在没有神经氨酸苷酶抑制剂的情况下施用MEK抑制剂治疗病毒性感染所需的量。同样地，神经氨酸苷酶抑制剂的协同有效量低于在没有MEK抑制剂的情况下施用神经氨酸苷酶抑制剂治疗病毒性感染所需的量。MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂的协同量可以由协同因子(CI值)来确定。如果用协同因子(CI值)来确定，则CI小于约0.9，可选地小于约0.85，可选地小于约0.8，可选地小于约0.75，可选地小于约0.7，可选地小于约0.65，可选地小于约0.6，可选地小于约0.55，可选地小于约0.5，可选地小于约0.45，可选地小于约0.4，可选地小于约0.35，可选地小于约0.3，可选地小于约0.25，可选地小于约0.2，可选地小于约0.15，可选地小于约0.1。
优选地，观察针对对神经氨酸苷酶抑制剂不显示或已经产生耐药性的病毒的协同效应。
根据本发明MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂的联合使用在病毒或病毒株显示或已经产生耐药性，特别是对神经氨酸苷酶抑制剂显示或已经产生耐药性的病毒性疾病病例中提供了有益的治疗效果。此外，联合使用可以保持两种药物随时间变化的药效，这是因为在该时间内根本没有观察到产生耐药性或者耐药性的产生被延迟了。
定义
纵观本发明说明书及接下来的权利要求书，除非语境需要，词语“包括(comprise)”及其变形“包括(comprises)”、“包括(comprising)”都将被理解为意指内含所述整体或步骤或整体或步骤的组，但是不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。本文所使用的术语“包括(comprising)”可以以“包含(containing)”替换，或者有时可以以“具有(having)”替换。
本文所使用的“由…组成(consisting of)”排除了未在权利要求部分(claimelement)中指定的任何元素、步骤或成分。本文所使用的“基本上由…组成consistingessentially of”未排除对权利要求的基本特征和新颖性特征没有实质影响的材料或步骤。在本文的各实施方式中，“包括(comprising)”、“由…组成(consisting of)”、“基本上由…组成(consisting essentially of)”中的任何一个可用另外两个术语中的一个替换。
本文多个列举的元素(elements)之间的连词“和/或”理解为既包含个体也包含组合选项。例如，如果用连词“和/或”连接两个元素，第一种选项是指仅第一个元素适用而第二个元素不适用；第二种选项是指仅第二个元素适用而第一个元素不适用；第三种选项是指第一个元素和第二个元素一起适用。这些选项中的任一情况都可以理解为落入该含义中，因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。同时适用多个选项也可以理解为落入该含义中，因此满足本文使用的术语“和/或”的要求。
本文使用的术语“病毒性疾病”包括由病毒引起的疾病，如由负RNA链病毒引起的疾病。流感病毒是负RNA链病毒，如流感A病毒和流感B病毒。根据本发明的流感病毒或流感病毒株可以对一种或多种神经氨酸苷酶抑制剂(如奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦)显示或已经产生耐药性，也可以对一种或多种神经氨酸苷酶抑制剂(如奥司他韦、奥司他韦磷酸盐、扎那米韦或帕拉米韦)不显示或没有产生耐药性。
本文所使用的“药学上可接受的盐”指活性化合物的相对无毒性的有机或无机盐，包括该化合物的无机或有机酸加成盐。
附图说明
图1显示AS-703026、AZD-6244、PLX-4032、GSL-1120212RDEA-119和RO-5126766对甲型流感病毒增殖的抑制作用。
图2a-b显示奥司他韦、Cl-1040和奥司他韦+Cl-1040对流感病毒的抗病毒活性。
图3a-c显示奥司他韦、PLX-4032和1：1和1：10比例的奥司他韦+PLX-4032对流感病毒的抗病毒活性。
图4a-b显示奥司他韦、GSK-1120212和1：10比例的奥司他韦+GSK-1120212对流感病毒的抗病毒活性。
图5a-c显示奥司他韦、AZD-6244和1：10和1：100比例的奥司他韦+AZD-6244对流感病毒的抗病毒活性。
图6显示MEK抑制剂CI-1040对抗H5N1流感病毒的体外研究。
图7显示MEK抑制剂PD-0325901对抗H5N1流感病毒的体外研究。
图8显示口服CI-1040或PD-03250901治疗感染流感病毒的小鼠的结果。
图9显示双重Raf-MEK抑制剂(the dual Raf-MEK-Inhibitor)PLX-4032对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
图10显示MEK抑制剂AZD-8330对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
图11显示CI-1040与奥司他韦联合对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
图12显示口服PLX-4032结合奥司他韦治疗感染流感病毒的小鼠的结果。
图13显示PLX-4032(Vemurafenib)对抗H7N9流感病毒的体外研究。
图14显示同时用MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂对抗流感B病毒的协同效应。
实施例
抗病毒化合物
奥司他韦羧酸盐(奥司他韦)获自多伦多研究化学品公司(Toronto ResearchChemicals,lnc.)，并溶解于无菌PBS中。在体外研究中，测试了MEK抑制剂CI-1040、PD-0325901、AS-703026、AZD-6244、AZD-8330、PLX-4032、GSL-1120212、RDEA-119和RO-5126766。每种MEK抑制剂以10mM的储备液浓度溶解于DMSO或适宜的溶剂中，由该溶液制备稀释组(dilution series)，以得到所需的MEK抑制剂浓度。由于DMSO会影响细胞活性，因此仅给培养基1％的MEK抑制剂/DMSO溶液。更多MEK抑制剂，诸如本文所公开的那些，可以以与本文提到的相同的方式进行测试，或单独测试或与神经氨酸苷酶抑制剂，如奥司他韦结合测试。
细胞活性(细胞毒性)分析
为了确定用于实验的MEK抑制剂的浓度是否会影响细胞活性，进行了化合物毒性分析。将MDCK II细胞接种于96孔培养板中，密度为每孔8x104个细胞，最小必需培养基(MEM)包含10％的热灭活的胎牛血清(FCS)、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素。在37℃以5％的CO2孵育细胞过夜。而后，用PBS清洗细胞两次。将包含不同浓度MEK抑制剂(0.001-1000μM)的MEM加入细胞中，添加MEK抑制剂后，再在37℃和5％CO2下孵育细胞48小时。然后，在4℃下以100μl 4％多聚甲醛(PFA)孵育30分钟来固定细胞。在室温下加入100μl结晶紫30分钟给活细胞染色。染色后清洗培养板并干燥。为从活细胞提取结晶紫，每孔加入100μl 100％的甲醇。室温下孵育30分钟后，用OD＝490nm的酶联免疫吸附试验(ELISA)读取器测量消灭情况(extinction)。以抗病毒药物治疗后的细胞活性比例的计算如下：抑制率＝100/[(OD490)细胞对照品x(OD 490)经处理的样品]。用GraphPad Prism 5软件通过绘制细胞活性百分率随化合物浓度的变化曲线来确定CC50值(即细胞活性降低50％的化合物的浓度)。
流感病毒效价(噬斑试验)
已经用在在临床试验中对抗癌症的不同MEK抑制剂都是可用的(Lorusso等人,2005；Haura等人,2010)。因此，我们研究了AS-703026、AZD-6244、PLX-4032、GSL-1120212、RDEA-119和RO-5126766在MDCK II细胞培养中是否也作为抗病毒药物对抗流感病毒。
MDCK II细胞和A549细胞生长于补充有10％的小牛血清和抗生素(青霉素和链霉素)的MEM中。感染细胞在96孔培养板中(每孔8x104个细胞)生长过夜。细胞感染前用PBS清洗，随后用不同的流感A病毒在MOI为0.01处37℃下孵育30分钟。30分钟孵育期过后，培养液吸气，用MEM或包含不同MEK抑制剂浓度(1-100μM)的MEM孵育细胞。感染后第24小时收集上清液。为评估收集的细胞培养基上清液和小鼠肺匀浆中感染性颗粒数(噬斑/病灶效价(plaque/focus titers)；pfu)，在96孔板中进行了前述的Avicel噬斑试验(Matrosovich等人，2006)。感染病毒的细胞通过以下过程被免疫染色：用流感A病毒核蛋白(AbD Serotec)特异性单克隆抗体孵育1h，而后用过氧物酶标记的抗鼠抗体(DIANOVA)孵育30分钟，以及用True BlueTM过氧物酶底物(KPL)孵育10分钟。用自来水终止该反应后，将培养基干燥并用分辨率1200dpi的CANONFCAN 8800F(佳能)扫描仪进行扫描。为了确定上清液的病毒效价，对96孔培养板中每个孔的每个样品中被感染的细胞的噬斑/病灶(plaques/foci)进行计数。病毒效价取噬斑/病灶平均值(pfu)(plaques/foci mean value)以10为底的对数值。本试验的检出限小于1.7log 10pfu/ml。如图1所示，测试的MEK抑制剂能够降低感染MDCKII细胞后的子代病毒效价。
协同作用
为了测试神经氨酸苷酶抑制剂和MEK抑制剂之间的协同作用，评估了不同MEK抑制剂结合神经氨酸苷酶抑制剂对抗人肺腺癌上皮细胞上的流感A病毒(A549)的IC50。
(1)奥司他韦羧酸盐、CI-1040以及奥司他韦羧酸盐与CI-1040以1：1的比率(基于浓度μg/ml)混合(见图2a-b)；
(2)奥司他韦羧酸盐、PLX-4032以及奥司他韦羧酸盐与PLX-4032以1：1和1：10的比率(基于浓度μg/ml)混合(见图3a、3b和3c)；
(3)奥司他韦羧酸盐、GSK-1120212以及奥司他韦羧酸盐与GSK-1120212以1：10的比率(基于浓度μg/ml)混合(见图4a和4b)；
(4)奥司他韦羧酸盐、AZD-6244以及奥司他韦羧酸盐与AZD-6244以1：10和1：100的比率(基于浓度μg/ml)混合(见图5a、5b和5c)
每个实验都计算了药物组合在ED50,ED75,ED90和ED95(生效的药物组合的剂量，如降低细胞上清液中病毒效价50％、75％、90％和95％的剂量)下的CI值。不同药物组合的协同因子(CI值)总结于下表1和图2b、3b至3c、4b、5b和5c。用CompuSyn程序计算CI值(CompuSyn,Paramus,N.J.)。奥司他韦羧酸盐在所有情况下的CI值都≤0.53，这表明奥司他韦羧酸盐与所有的MEK抑制剂都表现出显著的协同作用。这种协同作用在抗流感病毒的药物领域是意想不到的也是独一无二的。
表1
进一步的体内和体外研究
MEK抑制剂CI-1040对抗H5N1流感病毒的体外研究。
用A/Mallard/Bavaria/01/2006(MB1,H5N1)在MOI为0.001下感染MDCK II细胞。30分钟后，用CI-1040处理细胞24小时。
从图6可以看到，MEK抑制剂CI-1040高效地抵抗了细胞培养基中不同的流感病毒株。
MEK抑制剂PD-0325901对抗H5N1流感病毒的体外研究。
用A/Mallard/Bavaria/01/2006(MB1,H5N1)在MOI为0.001下感染MDCK II细胞。30分钟后，用PD-0325901处理细胞24小时。
从图7可以看到，MEK抑制剂PD-0325901高效地抵抗了细胞培养基中H5N1和其他不同的流感病毒株。PD-0325901还可高效对抗panH1N1(RB1)和FPV。
以CI-1040和PD-0325901口服治疗感染病毒的小鼠。
感染前8小时用CI-1040、PD-03250901(25mg/kg)或溶剂治疗BL/6小鼠(口服)。在感染的时间点(A/Regensburg/D6/09,H1N1pdm09,RB1,5-fold MLD50)，小鼠被再次处理，在之后所有的8小时(总计4次)。感染24小时后，检测肺病毒效价(n＝5)。
从图8可以看到MEK抑制剂CI-1040和PD-03250901可以高效降低感染H1N1pdm09的小鼠的肺病毒效价。
Raf-MEK双重抑制剂PLX-4032对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
在MOI为0.001下用H1N1pdm09(RB1)感染A549细胞。30分钟后，用PLX-4032或OC处理细胞24小时。用GraphPad计算IC50值。
从图9可以看到Raf-MEK双重抑制剂PLX-4032可以高效对抗H1N1pdm09流感病毒。
MEK抑制剂AZD-8330对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
在MOI为0.001下用H1N1pdm09(RB1)感染A549细胞。30分钟后，用AZD-8330或OC处理细胞24小时。用GraphPad计算IC50值。
从图10可以看到MEK抑制剂AZD-8330可以高效对抗细胞培养基中的H1N1pdm09。
CI-1040和奥司他韦的组合对抗H1N1pdm09流感病毒的体外研究。
在MOI为0.001下用H1N1pdm09(RB1)感染A549细胞。30分钟后，单独用CI-1040或奥司他韦，或用二者的组合处理细胞24小时。
从图11可以看到，CI-1040和奥司他韦的组合可以高效对抗细胞培养基中的H1N1pdm09。
用PLX-4032和奥司他韦的组合口服治疗感染流感病毒的小鼠。
感染前12小时单独用PLX-4032(50mg/kg),达菲(Tamiflu)(5mg/kg)或溶剂，或用其结合(PLX-4032+达菲)治疗BL/6小鼠。在感染的时间点(H1N1pdm09,RB1,5-fold MLD50)，小鼠被再次处理，在之后所有的12小时(共计3次)，感染后24小时检测肺病毒效价(n＝5)。
从图12可以看到，与单独的奥司他韦(达菲)治疗相比，PLX-4032和奥司他韦(达菲)的组合显著降低了肺病毒效价。
PLX-4032(Vemurafenib)对抗H7N9流感病毒的体外研究。
用A/Anhui/1/2013(H7N9)(MOI＝0.001)感染A549细胞30分钟，随后用指定数量的Vemurafenib治疗24小时。图13A所示的数据显示了使用两组生物样本进行至少3次独立实验的平均值±SD。用t检验方法评价统计学显著性(**p<0.01)。
在图13B中用如图13A描述的剂量响应数据以GraphPad Prism5软件确定EC50曲线，EC50＝12μM。
从图13A和B可以看到PLX-4032可以高效对抗H7N9。不受理论约束，PLX-4032还可以高效对抗其他甲型流感病毒亚型。
同时用MEK抑制剂和神经氨酸苷酶抑制剂对抗流感B型病毒的协同作用。
在MOI为1下用流感病毒B/Lee/40感染MDCK-II细胞。吸收(室温下1h)后，加入指定浓度的含有或不含化合物(MEK抑制剂AZD-8330，神经氨酸苷酶抑制剂奥司他韦)的培养基(见图14)，在33℃下孵育被感染细胞30hh，此时收集上清液并通过集落分析法(focusassay)测定被感染病毒颗粒的效价。
从图14可以看到，MEK抑制剂(如AZD-8330)和神经氨酸苷酶抑制剂(如奥司他韦)的组合在抑制流感B病毒上具有协同作用。

Claims (6)

1.MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合用在制备用于预防和/或治疗病毒性疾病的药物中的用途，其中所述MEK抑制剂选自：PLX-4032、AZD6244、AZD8330、GSK-1120212和CI-1040或其药学上可接受的盐；其中所述神经氨酸苷酶抑制剂为奥司他韦、奥司他韦磷酸盐，其中所述病毒为流感病毒。
2.根据权利要求1的用途，其中所述病毒是流感A病毒或流感B病毒。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐联合施用。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述MEK抑制剂或其药学上可接受的盐与所述神经氨酸苷酶抑制剂同时或者前后施用。
5.一种药物组合物，该药物组合物包含MEK抑制剂或其药学上可接受的盐以及神经氨酸苷酶抑制剂或其药学上可接受的盐；其中所述MEK抑制剂选自：PLX-4032、AZD6244、AZD8330、GSK-1120212、和CI-1040或其药学上可接受的盐；其中所述神经氨酸苷酶抑制剂为奥司他韦、奥司他韦磷酸盐。
6.如权利要求5所述的药物组合物用在制备预防和/或治疗病毒性疾病的药物中的用途。
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