KR20210142125A - 바이러스 질환의 치료에서의 ｒｓｋ 억제제 - Google Patents

바이러스 질환의 치료에서의 ｒｓｋ 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 유익한 치료 효과를 나타낼 수 있는 RSK 억제제에 관한 것이다. RSK 억제제는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. RSK 억제제는 단독으로 또는 다른 항바이러스 억제제 화합물과 조합하여 바이러스 질환의 치료에서 하나 이상의 유익한 치료 효과를 나타낼 수 있다.

Description

바이러스 질환의 치료에서의 ＲＳＫ 억제제
본 발명은 하나 이상의 유익한 치료 효과를 나타낼 수 있는 RSK 억제제에 관한 것이다. RSK 억제제는 바이러스 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 다른 항바이러스 화합물(antiviral compound)과 조합된 RSK 억제제는 바이러스 질환의 치료에서 하나 이상의 유익한 치료 효과를 나타낼 수 있다.
바이러스로에 의한 감염은 사람과 동물의 건강에 중대한 위협이 된다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스로의 감염은 여전히 인류의 큰 전염병에 속하며 해마다 많은 사상자를 발생시킨다.
특히 RNA 바이러스를 방제하는데 있어서의 문제는 적합한 백신의 생산 뿐만 아니라 항바이러스 물질의 개발을 어렵게 만드는 바이러스 중합효소의 높은 결함률(error rate)에 의해 유발되는 바이러스의 적응성(adaptability)이다. 게다가, 바이러스의 기능에 대해 지시된 항바이러스제의 사용은 머지 않아 돌연변이에 기초한 내성 변이체의 도태로 이어지는 것으로 밝혀졌다. 예는 바이러스의 막관통 단백질(transmembrane protein)에 대해 지시된 항인플루엔자제(anti-influenza agent)인 아만타딘 및 이의 유도체이다. 적용 후 짧은 시간 내에, 바이러스의 내성 변이체가 생성된다. 다른 예는 오셀타미비르(oseltamivir)와 같은 인플루엔자-바이러스 표면 단백질 뉴라미니다제를 억제하는 인플루엔자 감염용 항바이러스제이며, 여기서도 내성 변이체가 또한 과거에 광범위하게 출현하였다.
매우 작은 게놈 및 이에 따라 복제에 필요한 기능에 대한 제한된 코딩 능력(coding capability) 때문에, 모든 바이러스는 이들의 숙주 세포의 기능에 고도로 의존한다. 바이러스 복제에 필요한 이러한 세포 기능에 대한 영향을 발휘함으로써, 감염된 세포에서 바이러스 복제에 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 본원에서, 선택압(selective pressure)으로부터 벗어나기 위해, 바이러스가 적응에 의해, 특히 돌연변이에 의해 부족한 세포 기능을 대체할 가능성은 없다. 이것은 세포 키나제 및 메틸 트랜스퍼라제에 대해 상대적으로 비특이적인 억제제를 사용하여 인플루엔자 A 바이러스에 대해 이미 밝혀졌다(Scholtissek and Muller, Arch Virol 119, 111-118, 1991).
임의의 다른 바이러스와 마찬가지로, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포를 포획하여 복제한다. 바이러스 단백질은 자신과 상호작용할 뿐만 아니라 세포 성분과도 상호작용한다. 따라서, 이러한 구성 요소의 차단은 광범위한 항바이러스 수준에서 복제를 억제할 수 있을 뿐만 아니라 바이러스가 누락된 세포 기능을 치환할 수 없기 때문에 내성 바이러스 변이체의 발생을 감소시킬 수 있다(Ludwig, 2003) (Ludwig, 2011).
인플루엔자 바이러스 수명 주기 동안 바이러스 게놈을 포함하는 새로 합성된 리보핵단백질 복합체(vRNP)는 바이러스 게놈 복제가 일어나는 핵에서 세포질로 외수송(export)되어 세포막으로 수송되고 감염된 세포에서 방출된 자손 바이러스에 패키징되어야 한다. CRM1-억제제 렙토마이신 B에 의해 세포질 축적이 차단되기 때문에 RNP는 Crm1-매개된 핵 외수송 경로를 통해 핵 밖으로 외수송된다(Elton, 2001) (Watanabe, 2001). vRNP 핵 외수송 복합체의 조직은 현재까지 완전히 이해되지 않았다. 하나의 추정 모델은 기질 단백질 1에 대한 지지 결합 부위를 생성하기 위해 핵 외수송 단백질(NEP)과 바이러스 중합효소 복합체의 상호작용을 가정한다. Crm1-상호작용은 NEP N-말단을 통해 매개된다(Brunotte, 2014). vRNP 외수송이 M1의 부재하에서 발생하지 않지만 크게 감소된 양의 NEP 양은 이러한 과정에 영향을 미치지 않는다는 점을 고려하면, RNP 외수송에 대한 M1 및 NEP의 정확한 기여는 여전히 파악하기 어렵다(Wolstenholme, 1980) (Smith, 1985) (Martin, 1991) (Bui, 2000). RNP 외수송 복합체는 밀집하는 염색질에서 조립되어 세포 외수송 기구에 접근하는 것으로 나타났다. 이러한 조립체는 RCC1(Ran nucleotide exchange factor; 원형 뉴클레오티드 교환 인자)-위치된 영역 내에서 발생하여. RNP와 재생된 Crm1-RanGTP-복합체의 직접적인 상호작용을 보장한다(Nemergut, 2001) (Chase, 2011).
또한, 바이러스는 성공적인 핵 외수송을 보장하기 위해 Raf/MEK/ERK 신호 전달 경로를 활성화할 필요가 있다(Pleschka, 2001) (Ludwig, 2004). 이러한 신호전달 캐스케이드(cascade)는 종래의 미토겐-활성화 단백질 키나제(MAPK) 캐스케이드의 구성원이며 증식, 분화 및 세포 생존을 조절한다(Lewis, 1998) (Yoon, 2006). 인플루엔자 바이러스 감염은 감염 직후 및 후기 단계에서 2상 방식으로 경로 활성화를 유발한다. MEK-특이 억제제는 두 활성화 단계를 모두 억제할 뿐만 아니라 새로 합성된 RNP의 핵 보유에 의해 유발된 바이러스 역가를 크게 감소시킨다. 이러한 효과는 인플루엔자 A 및 B 바이러스에 대해 나타난다(Pleschka, 2001) (Ludwig, 2004) (Haasbach, 2017). 아만타딘 치료와 달리 U0126과 같은 MEK 억제제를 사용한 후에는 도주 돌연변이체가 발견되지 않았다(Ludwig, 2004). 또한, 오셀타미비르 내성 인플루엔자 균주는 여전히 MEK-억제제 치료로 억제할 수 있다(Haasbach, 2017). 또한, 호흡기 세포융합 바이러스로의 감염 후 경로의 억제가 바이러스 역가를 감소시킨다는 것이 최근에 발표되었다(Preugschas, 2018). 이러한 발견은 바이러스가 누락된 세포 기능을 보완하고 새로운 항바이러스 전략을 가능하게 할 수 없음을 나타낸다. 현재까지, 이 경로가 어떻게 인플루엔자 RNP 외수송을 유발하는지 정확한 메커니즘은 알려져 있지 않다.
상기 언급된 바와 같이, 인플루엔자 바이러스는 감염된 세포의 핵으로부터의 새로 합성된 게놈(vRNP라고 하는 RNA-단백질 복합체 형태)의 외수송을 지원하기 위해 세포 Raf/MEK/ERK 신호전달 경로를 이용한다. 이전 연구에서, Raf/MEK/ERK 경로의 중심 키나제인 MEK의 억제제는 부작용 및 내성 발달에 대한 높은 장벽 없이 시험관내 및 생체내에서 바이러스 복제를 차단하는 것으로 나타났다(제WO 2014/056894호).
그러나, 활성화된 Raf/MEK/ERK 경로와 vRNP 복합체의 외수송 사이의 직접적인 연관성은 불분명한 채로 남아 있었다. 일반적으로, Raf/MEK/ERK 경로는 암에서의 역할에 대해 연구되어 왔으며, ERK와 RSK는 MEK의 다운스트림에서 작용하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 선행 기술에서 Rsk 억제, 특히 Rsk2 녹다운이 바이러스 지원 효과를 발휘하는 것으로 밝혀졌다(Kakugawa et al. (2009) J Virol.;83(6):2510-7).
그럼에도 불구하고, 선행 기술에 비추어 볼 때, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되는 질환에서 바이러스 질환의 치료에 효과적인 추가의 화합물 및 조성물이 필요하다는 것이 명백하다.
본 발명은 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료 방법에 사용하기 위한 RSK 억제제에 관한 것이다. 구체적으로, RSK 억제제는 BI-D1870, SL0101-1, LJH685, LJI308, BIX 02565, FMK 및 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 선택적 RSK1 억제제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역에 상응하는 Rsk1 mRNA를 선택적으로 표적화하는 si-RNA, shRNA 또는 mi-RNA, 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역에 결합하는 항체일 수 있다.
바이러스 질환은 양성 또는 음성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 감염일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 음성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 질환은 인플루엔자 바이러스, 예를 들어 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1 유형의 인플루엔자 바이러스, 또는 야마가타(Yamagata) 또는 빅토리아(Victoria) 유형과 같은 다른 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스이다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴라미다제 억제제, 또는 파비피라비르, 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 그룹으로부터 선택된 바이러스 중합효소 복합체의 억제제에 내성이 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 양성 가닥 RNA 바이러스에 의해 유발되는 바이러스 질환은 SARS, MERS 또는 Covid-19와 같은 호흡기 감염을 유발하는 코로나바이러스이다.
일부 경우에, RSK 억제제는 뉴라미다제 억제제, 중합효소 복합체 억제제, 엔도뉴클레아제 억제제, 헤마글루티닌 억제제, 비구조 단백질(non-structurla protein) 1 억제제, 핵단백질 억제제 또는 MEK 억제제와 같은 제2 항바이러스제와 조합하여 투여된다.
뉴라미다제 억제제는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
중합효소 복합체 억제제는 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 파비피라비르 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
MEK 억제제는 CI-1040, PD-0184264, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059 또는 PD184352, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
본 발명은 또한 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK1에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK2, 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK3 및 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK4에 대한 결합 친화력이 없거나 낮은 결합 친화력을 나타내는 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 선택적 RSK1 억제제는 si-RNA, shRNA, mi-RNA, 항체, 또는 소분자일 수 있다. RSK1 억제제는 단독으로 또는 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료를 위해 상기 정의된 바와 같은 제2 항바이러스제와 조합하여 약제학적 조성물에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK1에 대한 결합에 대해 잠재적인 억제제의 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 단계, RSK1에 결합하는 것으로 밝혀진 억제제를 선택하고 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK2, 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK3 및 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK4에 대한 결합에 대해 이들을 스크리닝하는 단계; 및 RSK2, RSK3 또는 RSK4에 결합하지 않는 단계 (ii)로부터의 억제제를 특이 RSK1 억제제로서 선택하는 단계를 포함하여, 특이 RSK1 억제제를 확인하는 방법에 관한 것이다.
정의
본 명세서 및 뒤따르는 청구범위 전체에 걸쳐, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 용어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(comprises)"와 "포함하는(comprising)"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 제외하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우 용어 "포함하는(comprising)"은 "함유하는(containing)"이라는 용어로 대체될 수 있거나, 또는 때때로 본원에서 사용되는 경우 "갖는(having)"이라는 용어로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 경우, "구성되는(consisting of)"은 청구항 요소에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원에서 사용되는 경우, "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"은 청구범위의 기본적이고 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본원의 각 경우에 용어 "포함하는(comprising)", "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)" 및 "구성되는(consisting of)"은 다른 두 용어 중 어느 하나로 대체될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 다수의 인용된 요소들 사이의 접속 용어 "및/또는"은 개별 및 조합된 옵션 둘 다를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우 첫 번째 옵션은 두 번째 요소 없이 첫 번째 요소를 적용할 수 있음을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소를 적용할 수 있음을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소를 함께 적용할 수 있음을 나타낸다. 이들 옵션 중 어느 하나는 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족한다. 옵션 중의 하나 이상이 동시에 적용 가능한 것도 의미 내에 속하는 것으로 이해되며, 따라서 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"의 요건을 충족한다.
본원에서 사용되는 용어 "RSK"는 RSK1(서열 번호 1 및 2), RSK2(서열 번호 3 및 4), RSK3(서열 번호 5 및 6) 및 RSK4(서열 번호 7 및 8)로 명명되는 4개의 상이한 이소형으로 존재하는 인간 RSK(p90 리보솜 S6 키나제)를 지칭한다. 아미노산 수준에서 도 1 및 뉴클레오티드 수준에서 도 2로서 나타낸 4개의 이소형의 정렬은 이러한 4가지 형태가 고도로 보존되지만 또한 특정 다양성 영역을 가짐을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "RSK 억제제"는 RSK를 억제하는 제제를 지칭한다. 제제는 모든 4가지 RSK 이소형 또는 적어도 RSK1을 억제할 수 있다. RSK 억제제는 BI-D1870, SL0101-1, LJH685, LJI308, BIX 02565, FMK 및 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 선택적 RSK1 억제제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역에 상응하는 Rsk1 mRNA를 선택적으로 표적화하는 si-RNA, shRNA 또는 mi-RNA 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역에 결합하는 항체일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염, 유도체 또는 대사산물"은 화합물의 무기 또는 유기 산 부가염을 포함하여 활성 화합물의 비교적 무독성인 유기 또는 무기 염, 뿐만 아니라 명명된 억제제로서 RSK 억제제와 동일한 기능을 보이는 청구된 RSK 억제제의 유도체 및 대사산물을 지칭한다.
이와 같이, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 이러한 감염을 수반하는 증상을 개선 또는 향상시킬 목적으로 바이러스 질환을 앓고 있는 대상체에게 바람직하게는 약제 형태의 RSK 억제제를 투여함을 포함한다.
또한, 본원에서 사용되는 용어 "예방(prophylaxis)"은 본원에 기술된 의학적 상태를 방지하는 것을 목적으로 하는 임의의 의료 또는 공중 보건 절차를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "방지하다(prevent)", "방지(prevention)" 및 "방지하는(preventing)"은 주어진 상태, 즉 본원에 기술된 바와 같은 바이러스 질환을 획득하거나 발병할 위험의 감소를 지칭한다. 또한 "예방"이란 대상체에서 바이러스 질환의 재발의 감소 또는 억제를 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "바이러스 질환"은 바이러스에 의해 유발되는 질환, 예를 들면 양성 또는 음성 RNA 가닥 바이러스에 의해 유발되는 질환을 포함한다. 예를 들면 인플루엔자 바이러스는 음성 RNA 가닥 바이러스; 예를 들면 인플루엔자 A 및 B 바이러스이다. 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 균주는 하나 이상의 뉴라미니다제 억제제(예를 들어, 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르 또는 페라미비르)에 대한 내성을 나타내거나 발달시켰을 수 있거나 본 발명에 따른 인플루엔자 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 균주는 하나 이상의 뉴라미니다제 억제제(예를 들어, 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르 또는 페라미비르)에 대한 내성을 나타내지 않거나 발달시키지 않을 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스일 수 있고, 바람직하게는 인플루엔자 A 바이러스는 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8 또는 H5N1이다. 일부 실시양태에서, 인플루엔자 바이러스는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴라미다제 억제제, 또는 파비피라비르, 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 그룹으로부터 선택된 바이러스 중합효소 복합체의 억제제에 내성이 있다.
양성 가닥 RNA 바이러스는, 예를 들면, SARS, MERS 또는 Covid-19와 같은 호흡기 감염을 유발하는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "제2 항바이러스제"는 뉴라미다제 억제제, 중합효소 복합체 억제제, 엔도뉴클레아제 억제제, 헤마글루티닌 억제제, 핵단백질 억제제 또는 MEK 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 공지된 항바이러스제를 지칭한다.
"뉴라미니다제 억제제"는, 새로 생성된 바이러스는 이들이 복제된 세포로부터 발아할 수 없기 때문에, 바이러스성 뉴라미니다제 단백질의 기능을 차단하여 감염된 숙주 세포로부터 바이러스가 방출되는 것을 방지함으로써 작용하는 인플루엔자 바이러스에 표적화된 항바이러스 약물이다. 뉴라미니다제 억제제의 약제학적으로 허용되는 염이 또한 포함된다. 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르, 라니나미비르 또는 이들 성분 중의 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 예를 들어 오셀타미비르 포스페이트, 오셀타미비르 카복실레이트 등이다. 뉴라미다제 억제제는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 가장 바람직한 뉴라미니다제 억제제는 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 오셀타미비르 또는 페라미비르이다.
바이러스 중합효소 복합체의 성분, PB1, PB2, PA 또는 NP를 방해함으로써 중합효소 또는 엔도뉴클레아제 활성을 표적화하는 화합물은 예를 들면 NP 차단제 뉴클레오진 또는 중합효소 억제제 T-705(파비피라비르)이다. 바람직한 "중합효소 복합체 억제제"는 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 파비피라비르 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
"MEK 억제제"는 MEK(미토겐-활성화 단백질 키나제)를 억제함으로써 세포 또는 대상체에서 유사분열 신호전달 키나제 캐스케이드 Raf/MEK/ERK를 억제한다. 이러한 신호전달 캐스케이드는 다수의 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스에 의해 장악되어 바이러스 복제를 촉진한다. 따라서 병목 MEK에서 Raf/MEK/ERK 경로의 특이적 차단은 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스의 성장을 손상시킨다. 또한, MEK 억제제는 인체에서 낮은 독성을 보이고 부작용이 거의 없다. 또한 바이러스 내성을 유도하는 경향이 없다(Ludwig, 2009). MEK 억제제는 CI-1040, PD-0184264, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059 또는 PD184352, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. CI-1040 또는 PD-0184264와의 조합물이 하나의 특정한 실시양태로 간주된다.
발명의 상세한 설명
상기 언급된 바와 같이, 바이러스 감염은 감염된 세포에서 다양한 신호전달 과정의 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있다. 이러한 활성 중 일부는 효율적인 바이러스 복제에 필요하다. 세포 신호전달 경로에 대한 바이러스, 특히 인플루엔자 A 바이러스(IAV)의 의존성은 바이러스 복제에 필수적인 숙주 인자를 표적화함으로써 새로운 항바이러스 전략의 기회를 야기한다. IAV 감염은 새로 합성된 바이러스 리보핵단백질(vRNP)의 효율적인 핵 외수송을 위해 Raf/MEK/ERK 키나제 캐스케이드를 유도하고 이 메커니즘은 특정 MEK-억제제로 차단될 수 있다. 이러한 항바이러스 전략은 바이러스 내성을 유도할 가능성을 줄이고 추가 항바이러스 치료를 위한 더 긴 기간을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 세포 키나제 캐스케이드가 바이러스 게놈의 핵 외수송에 어떻게 기여하는지 자세한 메커니즘은 여전히 불가사의하다. 이러한 이유로, CI-1040(Haasbach et al., (2017) Antiviral. Res. 2017 142:178-184)과 같은 특정 MEK 억제제 및 BI-D1870과 같은 RSK-억제제를 사용하여 염색질에서 vRNP와 바이러스 M1 단백질의 상호작용에서의 Raf/MEK/ERK/RSK 신호전달 경로의 역할이 본 발명에서 연구되었다.
본 발명은 바이러스 질환의 예방 또는 치료, 특히 세포내 및/또는 핵내-복제(intranuclear-replicating) 음성 가닥 RNA 바이러스에 대한 예방 및/또는 치료법에 사용하기 위한 물질을 제공하는 목적에 기초하며, 이러한 물질은 바이러스의 기능에 대해 즉시 지시되는 것이 아니라 세포 효소를 선택적으로 억제하고 이러한 선택적 효과를 통해 바이러스의 바이러스 복제를 억제한다.
본 발명으로 이어지는 연구에서, RSK의 분자적 작용 방식은 MEK(CI-1040) 및 RSK(BI-D1870)에 대한 특정 억제제 뿐만 아니라 ERK 및 RSK에 대한 siRNA를 사용함으로써 염색질에서 vRNP와 바이러스 기질 단백질(M1)의 상호작용을 고려하여 분석되었다. 바이러스 단백질의 핵 분포에 대한 통찰력을 얻기 위해, 실시예로부터 알 수 있는 바와 같이 염색질 분획 분석법 및 확률론적 광학 재구성 현미경법(STORM)이 사용되었다. 바이러스 단백질에서 경로의 추정 인산화 표적을 분석하기 위해, 억제제 처리 후 vRNP를 정제하고 질량 분광법을 통해 이들의 인산화 패턴을 분석하였다.
경로의 억제는 RanBP1의 방해받지 않는 외수송에 의해 예시되는 바와 같이 vRNP의 외수송을 특이적으로 차단하고 다른 세포 단백질의 CRM1 의존성 핵 외수송에 일반적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 보여줄 수 있다. 이것은 vRNP의 바이러스 단백질이 Raf/MEK/ERK 경로를 통해 변형되어 핵 외수송을 촉진할 수 있음을 나타낸다. 감염되고 억제된 세포의 핵 내에서의 vRNP 복합체의 위치를 조사하였으며 염색질에서의 보유가 발견되었다. vRNP 복합체의 면역정제 결과, 키나제 억제제의 존재하에서 M1 단백질에 대한 결합 능력이 감소된 것으로 드러났다. 이러한 결과는 바이러스 핵단백질(NP) 내의 2개의 세린 잔기 269 및 392의 인산화 누락에 의해 설명될 수 있으며, 이것은 정상적인 조건하에서는 M1 단백질이 vRNP에 결합하도록 유도할 수 있다. Raf/MEK/ERK 경로의 다운스트림 이펙터인 키나제 RSK가 외수송-향상 기능의 매개인자라는 것으로 추가로 나타났다. RSK의 억제는 2009년 유행성 돼지독감 H1N1, 고병원성 조류 독감 바이러스 H5N1 및 H7N9, 뿐만 아니라 인플루엔자 B 바이러스를 포함하여 시험된 모든 인플루엔자 바이러스에 대한 vRNP의 핵 보유로 인해 역가 감소(titer reduction)를 초래하였다.
이러한 결과는 Raf/MEK/ERK 경로가 인플루엔자 바이러스에 의해 활성화되어 NP 단백질의 RSK-의존적 인산화 및 바이러스 M1 단백질에 대한 상호작용 부위를 제공함으로써 염색질(chromatin)에서 vRNP 핵 외수송 복합체를 성공적으로 조립함을 나타낸다.
실시예 1에서 Raf/MEK/ERK-경로가 핵단백질 내의 특정 모티프(motif)의 인산화에 의존적인 것으로 나타났다. 생리학적 조건하에서 Raf/MEK/ERK 키나제 캐스케이드는 세포 내에서 세포외 신호를 전송하여 증식 및 분화와 같은 세포 과정을 촉진한다. 신호는 단백질 키나제의 순차적인 인산화를 통해 전달된다(Yoon, 2006). 도 3에 도시된 바와 같이, MEK 억제제 CI-1040으로 경로를 억제한 후 2개의 세린 잔기가 감소된 인산화 상태를 보이는 것으로 밝혀졌다. RNA가 결합된 vRNP의 결정학적 구조는 2개의 세린 잔기 269와 392가 서로 매우 근접해 있음을 보여주었다. 도 3b로부터 알 수 있는 바와 같이, NP 단백질 내의 확인된 영역(LILRGS 269V, AIRTRS 392G)은 세린/트레오닌-키나제 ERK의 컨센서스(consensus) 서열(Pro-Xaa-Ser/Thr-Pro)과 유사성을 나타내지 않았다((Gonzalez, 1991). 따라서 확인된 세린 잔기가 ERK 키나제에 의해 직접 인산화되지는 않을 것이다. 다운스트림 키나제 90kDa 리보솜 S6 키나제(RSK)의 컨센서스 서열(Arg/Lys-Xaa_Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr; Arg-Arg-Xaa-Ser/Thr)은 확인된 NP 영역에 대해 더 높은 동일성을 보여주었다(Romeo, 2012).
실시예 2에서, RSK1이 Raf/MEK/ERK-경로와 vRNP 외수송 간의 링크로서 역할을 하는 것으로 입증된다. RSK가 Raf/MEK/ERK 신호전달 경로의 활성화와 새로 합성된 vRNP의 핵 외수송 간의 링크인지 여부를 밝히기 위해, 바이러스 수명 주기 동안 이의 활성화를 분석하였다. 감염의 후기 단계에서 ERK 뿐만 아니라 RSK와 이의 다운스트림 표적 GSK-3β가 인산화되고 활성화되었다(도 4a). 이러한 활성화는 RSK 억제제 BI-D1870과의 배양에 의해 차단될 수 있으며, 이것은 바이러스 유도된 RSK 활성화가 Raf/MEK/ERK 경로에 의해 매개됨을 나타낸다(도 4b). 또한, CI-1040 치료와 BI-D1870 및 CI-1040 병용 치료 간에 자손 바이러스 역가에 유의한 차이가 없었으며, 이것은 RSK가 바이러스 유도된 Raf/MEK/ERK 경로에 의해 직접 활성화된다는 것을 추가로 보여준다(도 4j). 바이러스 감염 후 특정 억제제 BI-D1870으로 RSK를 억제하면 GSK-3β 인산화가 농도 의존적으로 감소하여 바이러스 수명 주기 동안 RSK 활성화에 대한 억제 효과가 확인되었다. 또한, 본 발명자들은 RSK의 억제 후 ERK 활성화의 증가를 발견하였으며, 이것은 정상적인 조건하에서 경로의 과활성화를 방지하는 음성 피드백 루프의 억제에 의해 설명될 수 있다(도 4k). 억제제 BI-D1870의 농도 증가는 vRNP 핵 외수송에 부정적인 영향을 미쳤다.
또한, RSK 억제제의 표적외 효과를 배제하기 위해, RSK1 및 RSK2 녹다운을 A549 세포에 도입하고 바이러스 수명 주기에 대한 영향을 분석하였다(도 4). RSK1 녹다운은 새로 합성된 vRNP의 핵 보유를 야기하는 반면 RSK2 녹다운은 핵 외수송에 영향을 미치지 않았다(도 4f-i). 다중 복제 분석 내에서 RSK1 녹다운은 바이러스 역가의 감소로 나타나는 항바이러스 효과를 가졌다. 그러나 RSK2 녹다운은 도 5에 도시된 바와 같이 프로바이러스 효과를 갖는 것으로 보였다. 바이러스 복제에 대한 RSK2 녹다운의 이러한 지원 효과는 2009년에 Kakugawa 등에 의해 이미 기술되었다. 이것은 두 가지 RSK 아형 RSK1과 RSK2가 인플루엔자 바이러스 수명 주기 내에서 상이한 역할을 한다는 것을 지적한다.
또한, 실시예 3에서, MEK- 및 RSK- 억제제는 다른 단백질의 외수송을 방해하지 않으면서 vRNP 외수송을 특이적으로 차단하는 것으로 나타났다. 핵 외수송 경로를 매우 특이적으로 차단하는 렙토마이신 B와 달리, RSK 및 MEK 억제제는 핵 외수송 경로에 일반적인 영향을 미치지 않지만 도 6에 도시된 바와 같이 vRNP의 외수송에 대해 더 특이적인 것으로 밝혀졌다.
마지막으로, 실시예 4에서 RSK 억제제 BI-D1870은 광범위한 항인플루엔자 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 여기에서 돼지 기원 유행성 바이러스 및 조류 독감 바이러스를 포함한 상이한 인플루엔자 A 아형(subtype), 및 인플루엔자 B 바이러스에 대해 광범위한 항바이러스 활성을 결정하였다. 시험된 모든 바이러스는 새로 합성된 vRNP의 핵 보유 및 약 80 내지 90%의 자손 바이러스 역가 감소를 보여주었다. 이러한 결과는 Raf/MEK/ERK/RSK 경로에 대한 인플루엔자 바이러스의 의존성(도 7)과 이러한 캐스케이드에서 이펙터로서의 RSK의 역할을 명확히 한다.
이러한 실험으로부터, 키나제 Rsk, 특히 이소형 Rsk1(서열 번호 1 및 2)이 Raf/MEK/ERK 경로의 다운스트림 매개인자이며 vRNP 복합체의 주요 구성성분인 바이러스 핵단백질을 직접 인산화할 가능성이 가장 높다고 결론지어졌다. 이러한 번역후 변형은 vRNP 외수송에 필요한 것으로 보인다. 따라서 Rsk의 억제제는 핵으로부터 바이러스 게놈의 외수송을 방지함으로써 바이러스에 대한 항바이러스 활성을 갖는다. 기존 문헌에서 Rsk 억제, 특히 Rsk2 녹다운이 바이러스 지원 효과를 발휘한다고 하였기 때문에 이것은 예상치 못한 발견이다(Kakugawa et al. (2009) J Virol.;83(6):2510-7).
놀랍게도, 이러한 목적은 본 발명에 따른 RSK 억제제, 특히 RSK1 억제제 화합물을 포함하는 약제학적 조성물에 의해 달성될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 언급된 바와 같이, 인간 RSK(p90 리보솜 S6 키나제)는 RSK1, RSK2, RSK3 및 RSK4로 명명되는 4가지 상이한 이소형으로 존재한다. 아미노산 수준에서 도 1 및 아미노산 수준에서 도 2로서 나타낸 4개의 이소형의 정렬은 이러한 4가지 형태가 고도로 보존되지만 또한 특정 다양성 영역을 가짐을 나타낸다. RSK 계열 구성원은 일반적으로 Ras/MAPK 경로의 다기능 이펙터로 간주되지만, 개별 이소형은 중복 기능과 특정 기능 둘 다를 갖는 것으로 보인다. RSK1 및 RSK2는 세포 성장 및 증식에서 역할을 하는 반면 RSK3 및 RSK4는 세포 주기 정지 및 세포자멸사와 관련이 있다. 본 발명에서, RSK1 단독의 억제는 항바이러스 효과를 갖는 반면 RSK2 단독의 억제는 프로바이러스 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나, BI-D1870 또는 SL0101과 같은 일반 RSK 억제제가 사용되는 경우, 억제가 항바이러스 효과가 있어, RSK1의 프로바이러스 활성이 RSK2의 항바이러스 효과보다 우세한 것으로 보인다. 이것은 RSK2가 아닌 RSK1만이 vRNP의 핵 외수송에 관여한다는 실험적 증거와 일치한다. 따라서 특정 RSK1 억제제와 일반 RSK 억제제 모두 항바이러스 효과를 갖는다.
이러한 실험은 바이러스 수명 주기에 대한 이소형 RSK1 및 RSK2의 상이한 기여를 나타내었다. RSK2는 항바이러스 효과를 갖는 반면 RSK1은 분명히 바이러스를 지원하는 작용을 하는 것으로 보인다. 원형질막과 세포질에서 활성화되면, RSK1은 핵으로 전위된다. RSK1이 NP를 인산화하는 키나제인 경우, Raf/MEK/ERK 경로의 바이러스 유도 활성화에 따라 바이러스 수명 주기 동안 이의 세포 분포가 변경되어야 한다. 이 가설을 다루기 위해, 실시예 5에 기술된 바와 같이, A549 세포를 모의 감염(mock infection)시키거나 WSN/H1N1 바이러스로 감염시키고 NP 및 RSK1의 국소화를 면역형광 염색에 의해 분석하였다. 예상대로, 감염의 후기 시점에서 RSK1의 핵 국소화 증가를 볼 수 있다(도 8a). 3개의 독립적인 실험의 정량화는 RSK1의 핵 농도가 9시간 후(도 8b), 특히 NP 외수송이 발생했을 때(도 8a,c) 모의 감염에 대해 35.58% ± 0.59%에서 바이러스 감염에 대해 57.73% ± 1.47%로 유의한 변화를 보여주었으며, 이것은 바이러스가 RSK1의 핵 수입을 유도함을 나타낸다.
RSK1이 바이러스 수명 주기 동안 핵으로 들어가는 것이 확인된 후, Raf/MEK/ERK 경로의 바이러스 유도된 활성화가 항바이러스 RSK2의 핵 국소화를 초래하는지 여부에 대한 질문이 해결되었다. 일반적으로, Raf/MEK/ERK-경로의 활성화는 RSK1 및 RSK2의 핵으로의 전위를 초래한다. 따라서, 실시예 5에 기술된 바와 동일한 실험을 수행하였지만, 실시예 6에 기술된 바와 같이 RSK2의 국소화를 분석하였다. RSK1과 대조적으로, 바이러스 감염 동안의 시점과 무관하게 RSK2의 세포하 분포의 변화는 발견되지 않았다(도 9a,b). 이러한 결과는 바이러스가 항바이러스 작용 RSK2의 세포 분포에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 지원 RSK1의 전위를 특이적으로 유도한다는 것을 보여준다.
RSK1의 특정 전위가 발견된 후, RSK 업스트림 키나제 ERK1/2가 바이러스 경로 유도로 인해 핵으로 들어갈 수 있는지에 대한 의문이 제기되었다. 놀랍게도, 실시예 7에 기술된 바와 같이, 분석된 시점과 무관하게 바이러스 감염 후에 ERK1/2 국소화에 대한 어떠한 효과도 볼 수 없다(도 10a,b).
RSK2 및 ERK1/2의 비특이적 염색을 배제하기 위해 Raf/MEK/ERK-경로를 실시예 8에 기술된 바와 같이 TPA로 자극하였다. TPA와 함께 배양하면 Raf/MEK/ERK-경로가 활성화되어 자극 후 수 분 이내에 ERK1/2 및 RSK의 핵 국소화가 초래되는 것으로 알려져 있다. 1시간 동안 100nM TPA와 함께 배양한 후 핵에서 두 키나제가 모두 발견되어, 염색이 특이적임을 확인하였다(도 11a,c). 정량화한 결과 자극되지 않은 샘플의 경우 27.99% ± 1.97%에서 TPA 자극된 샘플의 경우 48.02% ± 2.25%까지 ERK1/2의 핵 축적이 나타났다. RSK2 키나아제에 대한 효과는 자극되지 않은 샘플의 경우 29.37% ± 1.15%, TPA 자극된 샘플의 경우 34.89% ± 0.67%로 ERK1/2만큼 두드러지지 않았다(도 11b,d).
종합하면, 바이러스 수명 주기 동안 RSK1은 감염된 세포의 핵으로 들어가 아마도 NP의 인산화를 통해 바이러스를 지원하는 역할을 한다. 이러한 전위는 Raf/MEK/ERK-경로의 활성화에 의해 매개된다. 또한, 바이러스는 ERK1/2 및 항바이러스 RSK2의 핵 국소화를 방지하는 것으로 보인다.
바이러스 입자를 직접 표적화하는 항바이러스 전략의 주요 문제는 내성 바이러스 변이체의 도입이다. 이러한 항바이러스 약물에의 장기간 노출은 약물 감수성을 감소시키는 돌연변이의 출현을 일으킨다. 항바이러스 약물 중 한 그룹은 오셀타미비르와 같은 뉴라미니다제 억제제로 대표된다. 이것은 감염된 세포 표면에 노출된 뉴라미니다제에 결합하여 결합 포켓을 생성함으로써 활성 부위의 구조적 변화를 유도한다. 억제 효과는 뉴라미니다제 내의 돌연변이, 예를 들어 H275Y, E119D, I223R에 의해 감소된다. 두 번째 그룹은 발록사비르와 같은 중합효소 억제제이다. 이러한 캡-의존성 엔도뉴클레아제 억제제는 PA 서브유닛의 캡-탈취(cap-snatching) 과정을 차단한다. 발록사비르 마르복실에 대한 감수성 감소는 특히 아미노산 치환 I38T 후에 발생할 수 있다.
바이러스 입자를 직접 표적화하는 항바이러스 약물(오셀타미비르, 발록사비르) 또는 Raf/MEK/ERK/RSK 경로의 억제를 통해 항바이러스 작용을 하는 항바이러스 약물(CI-1040, BI-D1870)이 내성 바이러스 변이체를 유도하는 능력을 비교하기 위해, A549 세포를 실시예 9에 기술된 바와 같이 0.01의 MOI를 사용하여 WSN/H1N1 바이러스로 감염시켰다. 감염 직후, 세포를 다른 억제제 또는 DMSO로 처리하였다. 24시간 p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 적정에 의해 결정하였다. 다음 라운드를 위해 A549 세포를 이전 라운드의 바이러스 상청액(MOI 0.01)으로 감염시키고 역가를 24시간 p.i.에 결정하였다. 억제제 농도를 증가시켜 억제 효과를 증진시키고 돌연변이 발생을 일으켰다. CI-1040 및 BI-D1870의 농도가 증가하면 바이러스 역가가 감소하였다. DMSO 대조군과 비교하여, 역가는 1μM 억제제 농도를 사용한 첫 번째 라운드에서 CI-1040 또는 BI-D1870에 대해 각각 64.75% ± 0.32% 및 35.08% ± 3.20% 감소하였다. 억제제 농도가 증가함에 따라, 역가는 라운드 4까지 추가로 감소하였다. 이 시점에서, 두 억제제 모두 8μM의 농도로 사용되었다. 라운드 5에서 라운드 12까지 CI-1040 및 BI-D1870는 10μM의 농도로 사용되었다. 라운드 5 내지 라운드 12 내에서 CI-1040 처리의 평균 역가는 DMSO 대조군과 비교하여 8.45% ± 3.41%로 계산되었다. 라운드 5 내지 라운드 12 내에서 BI-D1870 처리의 평균 역가는 12.27% ± 6.36%로 계산되었다. 바이러스 역가의 지속적인 증가나 플라크 형태의 변화는 12 라운드 동안 어느 시점에서도 발견되지 않았으며, 이것은 돌연변이를 도입하는 내성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 5 라운드의 오셀타미비르 처리 후에 완전한 내성이 발견되었다. 이 시점에서, 16μM의 억제제 농도가 사용되었다. 라운드 9에서 역가는 48.30% ± 11.42%까지 감소하기 시작했다. 이 효과는 플라크 크기 감소의 증가에 의해 동반된다. 라운드 1에서 라운드 9까지의 발록사비르 처리의 평균 역가는 8.08% ± 4.10%로 계산되었다. 역가 증가의 경향은 평균 역가가 28.39% ± 1.88%인 라운드 10에서 시작되었다. 라운드 12에서 평균 역가는 46.94% ± 1.03%까지 추가로 증가하였다(도 12).
이러한 결과는 MEK- 또는 RSK-억제제로의 장기간 치료가 바이러스에 내성을 도입하지 않는다는 발견을 뒷받침한다.
이 연구 내에서 이러한 결과 및 이전 결과는 MEK- 및 RSK-억제제가 인플루엔자 바이러스 감염과 같은 바이러스 감염에 적합한 약물임을 나타낸다. 이들은 세포 독성 효과 없이 세포에 잘 견디며, 광범위한 항바이러스 활성을 나타내고 내성 바이러스 변이체의 발생을 촉진하지 않는 것으로 보인다.
따라서, 하나의 측면에서, 본 발명은 RSK 억제제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함을 포함하는 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
하나의 측면에서, 본 발명의 방법은 음성 RNA 가닥 바이러스에 의해 유발된 감염인 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다. 보다 바람직하게는, 바이러스 질환은 인플루엔자 바이러스에 의해 유발되고, 더욱 더 바람직하게는 인플루엔자 A 또는 B 바이러스에 의해 유발된다. 인플루엔자 A 바이러스는 예를 들면 H1N1, H3N2, H5N1, H7N7, H7N9 또는 H9N2이다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 방법은 양성 가닥 RNA 바이러스, 예를 들면, SARS, MERS 또는 Covid19와 같은 호흡기 감염을 유발하는 SARS-CoV, MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2와 같은 코로나바이러스에 의해 유발되는 감염인 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료를 위한 것이다.
본 발명의 RSK 억제제는 바람직하게는 BI-D1870, SL0101, LJH685, LJI308, BIX 02565, FMK 및 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택된다.
구체적으로, BI-D1870은 시험관내 및 생체내에서 p90 리보솜 S6 키나제(RSK) 이소형의 강력하고 특이적인 억제제로 알려져 있으며, 이것은 시험관내에서 RSK1, RSK2, RSK3 및 RSK4를 억제한다(IC50 값 각각 31nM, 24nM, 18nM 및 15nM). (GP Sapkota et al. BI-D1870 is a specific inhibitor of the p90 RSK (ribosomal S6 kinase) isoforms in vitro and in vivo. Biochem. J. 2007, 401, 29-38).
SL-0101은 p90 리보솜 S6 키나제의 N-말단 키나제 도메인을 표적으로 하고 선택적 가역성 ATP-경쟁적 (Ki = 1μM) 방식으로 RSK 키나제 활성(10μM ATP를 사용하여 IC50 = 89nM)을 억제하는 세포-투과성 캠페롤(Cat. No. 420345) 글리코시드이다. SL-0101은 MCF-7의 증식을 억제하지만 정상 유방 세포주 MCF-10A는 억제하지 않고, RSK 기질 p140의 PDB-유도 세포 인산화를 특이적으로 차단하지만 100μM 정도로 높은 농도에서도 RSK 또는 RSK 업스트림 키나제의 인산화는 차단하지 않는 것으로 나타났다.
상기 나열된 모든 알려진 RSK 억제제는 RSK의 4가지 이소형을 모두 억제한다. 그러나, 본 발명의 한 가지 목적은 RSK2, RSK3 또는 RSK4에 영향을 미치지 않으면서 RSK1을 차단할 수 있는 특이 RSK1 억제제를 제공하는 것이다. RSK1 억제제를 확인하는 방법은 RSK1(서열 번호 1 및 2)에 결합하지만 RSK2(서열 번호 3 및 4), RSK3(서열 번호 5 및 6) 또는 RSK4(서열 번호 7 및 8)에는 결합하지 않는 물질에 대한 스크리닝을 수행하는 것이다.
본 발명의 의학적 용도에서, RSK 억제제는 경구, 정맥내, 흉막내, 근육내, 국소 또는 흡입을 통해 투여될 수 있다. 바람직하게는, RSK 억제제는 비강 흡입을 통해 또는 경구로 대상체 또는 환자에게 투여된다.
본 발명의 대상체 또는 환자는 포유동물 또는 조류이다. 적합한 포유동물의 예는 마우스, 래트(rat), 소, 염소, 양, 돼지, 개(dog), 고양이, 말, 기니 피그(guinea pig), 개(canine), 햄스터, 밍크, 물개, 고래, 낙타, 침팬지, 붉은털 원숭이 및 인간을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 적합한 조류의 예는 몇 가지를 들자면 칠면조, 닭, 거위, 오리, 상오리, 청둥오리, 찌르레기, 고방오리, 갈매기, 백조, 뿔닭 또는 물새를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 인간 환자가 본 발명의 특정 실시양태이다.
RSK 억제제를 포함하는 약제학적 조성물은 경구 투여 가능한 현탁액 또는 정제; 비강 스프레이, 멸균 주사 가능한 제제(정맥내, 흉막내, 근육내), 예를 들면, 멸균 주사 가능한 수성 또는 유성 현탁액 또는 좌제의 형태일 수 있다. 현탁액으로서 경구 투여되는 경우, 이들 조성물은 약제학적 제형 분야에서 이용 가능한 기술에 따라 제조되고 벌크(bulk)를 부여하기 위한 미세결정질 셀룰로스, 현탁제로서의 알긴산 또는 알긴산나트륨, 점도 증강제로서의 메틸셀룰로스, 및 당업계에 공지된 감미제/방향제를 함유할 수 있다. 즉시 방출 정제로서, 이들 조성물은 미세결정질 셀룰로스, 인산이칼슘, 전분, 스테아르산마그네슘 및 락토스 및/또는 당업계에 공지된 기타 부형제, 결합제, 증량제(extender), 붕해제, 희석제 및 윤활제를 함유할 수 있다. 주사 가능한 용액 또는 현탁액은 만니톨, 1,3-부탄디올, 물, 링거 용액 또는 등장성 염화나트륨 용액과 같은 적합한 무독성, 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매, 또는 합성 모노- 또는 디글리세리드를 포함하는 멸균, 블랜드, 고정유, 및 올레산을 포함하는 지방산과 같은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다.
본 발명의 치료 방법 및 의학적 용도에서, RSK 억제제는 치료학적 유효량으로 투여된다. "치료학적 유효량"은, 숙련된 기술자에게 명백한 바와 같이, 사용된 화합물의 활성, 환자의 체내에서의 활성 화합물의 안정성, 완화시키고자 하는 상태의 중증도, 치료되는 환자의 총 체중, 투여 경로, 신체에 의한 화합물의 흡수, 분포 및 배설의 용이성, 치료하고자 하는 환자의 연령 및 민감성, 부작용 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 요인에 따라 달라질 수 있다. 투여량은 시간 경과에 따라 다양한 요인이 변화함에 따라 조정될 수 있다.
또한, RSK 억제제는 제2 항바이러스제와 함께 투여될 수 있다. 제2 항바이러스제는 RSK 억제제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 또한, RSK 억제제 및 제2 항바이러스제는 1개의 투여 형태 또는 2개의 별개의 투여 형태로 투여될 수 있다. RSK 억제제는 2개 이상의 항바이러스제와 함께 투여될 수 있는 것으로 또한 고려된다.
제2 항바이러스제는 임의의 공지된 항바이러스제일 수 있다. 제2 항바이러스제는 뉴라미다제 억제제, 중합효소 복합체 억제제, 엔도뉴클레아제 억제제, 헤마글루티닌 억제제, 핵단백질 억제제 및 MEK 억제제를 포함하는 그룹으로부터 선택될 수 있다.
바람직한 뉴라미다제 억제제는 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. 오셀타미비르와의 조합물이 하나의 특정 실시양태로 간주된다.
바람직한 중합효소 복합체 억제제는 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 파비피라비르 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다.
바람직한 MEK 억제제는 CI-1040, PD-0184264, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059 또는 PD184352, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염일 수 있다. CI-1040 또는 PD-0184264와의 조합물이 하나의 특정 실시양태로 간주된다.
도 1은 아미노산 수준에서 RSK1-4의 정렬(alignment)을 보여준다.
도 2는 뉴클레오티드 수준에서 RSK1-4의 정렬을 보여준다.
도 3: 실시예 1에 기술된 바와 같이 Raf/MEK/ERK-활성화시 인산화되는 잔기 S269 및 S392에서 NP의 인산화 부위를 보여준다(a, c). 또한, (b)는 ERK와 RSK 컨센서스 서열의 비교를 보여준다. 도 (d)는 실시예 1에 기술된 바와 같이 양으로 하전된 히스티딘을 갖는 M1 단백질의 RNA 결합 부위를 보여주고, 도 (f)는 구성적 비인산화(NP) 돌연변이체 대 야생형(wt)의 성장 역학을 보여주는 반면 도 (g)는 M1 히스티딘 돌연변이체 대 야생형(wt)의 성장 역학을 보여준다.
도 4 (a-h)는 실시예 2에서 입증된 바와 같이 RSK 억제시 감소된 M1-NP 결합 및 RSK 억제 또는 RSK1 녹다운시 자손 vRNP의 핵 보유(nuclear retention)를 보여준다. (i-p)는 특정 RSK-억제제 BI-D1870 및 SL0101-1이 실시예 2에 기술된 바와 같이 바이러스 증식을 억제한다는 것을 보여준다.
도 5는 실시예 2에 기술된 바와 같이 BI-D1870 처리가 자손 vRNP의 염색질 보유 및 M1 단백질과의 결합 속도 감소를 초래함을 보여준다.
도 6 (a, b)는 경로 억제가 바이러스 단백질의 핵 외수송에 특이적으로 작용하며, 특히 실시예 3에 기술된 바와 같이 Raf/MEK/ERK/RSK-경로 억제제 CI-1040 및 BI-D1870이 내성 바이러스 변이를 도입하지 않으면서 바이러스 단백질의 핵 외수송에 특이적으로 작용함을 보여준다. 또한, (c, d)는 증가하는 농도로 투여된 CI-1040, BI-D1870, 오셀타미비르 및 발록사비르의 비교를 보여준다.
도 7은 RSK 억제의 광범위한 항바이러스 효과(a-p) 뿐만 아니라 상이한 인플루엔자 바이러스의 NP 영역의 비교(q) 및 인플루엔자 A 및 B의 결정학적 구조(r)를 보여준다.
도 8은 WSN/H1N1 감염 동안 RSK1 핵 국소화를 보여준다. (a) A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 후 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 RSK1(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경(epifluorescence microscopy)으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 표시된다. 기준자(scale bar)는 50μm를 나타낸다. (b, c) (a)로부터의 NP 및 RSK1의 세포 국소화의 정량화. ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 NP 및 RSK1 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch의 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05; ** p < 0.01).
도 9는 WSN/H1N1 감염 동안 RSK2 세포 국소화에 변화가 없음을 보여준다. (a) A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 후 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 RSK1(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 표시된다. 기준자는 50μm를 나타낸다. (b, c) (a)로부터의 NP 및 RSK2의 세포 국소화의 정량화. ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 NP 및 RSK2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch의 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05; ** p < 0.05).
도 10은 WSN/H1N1 감염 동안 ERK1/2 세포 국소화에 변화가 없음을 보여준다. ( a) A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 후 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 ERK1/2 (Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 표시된다. 기준자는 50μm를 나타낸다. (b, c) (a)로부터의 NP 및 ERK1/2의 세포 국소화의 정량화. ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 NP 및 ERK1/2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch의 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05).
도 11은 TPA로 자극하면 RSK2 및 ERK1/2의 핵 국소화가 초래됨을 보여준다. (a,c) A549 세포를 TPA(200nM)로 자극하였다. 용매 DMSO가 음성 대조군으로 작용하였다. 1시간 후 세포를 고정하고 RSK2 또는 ERK1/2(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 표시된다. 기준자는 50μm를 나타낸다. (b,d) (A,C)로부터의 RSK2 또는 ERK1/2의 세포 국소화의 정량화. ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 각 샘플의 15개의 표면형광 현미경 사진을 RSK2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 Welch의 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(** p < 0.01).
도 12는 MEK- 또는 RSK-억제제 CI-1040 또는 BI-D1870로의 장기간 치료가 WSN/H1N1에 내성을 도입하지 않음을 보여준다. ( a) A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)로 감염시키고 MEK-억제제 CI-1040, RSK-억제제 BI-D1870, 바이러스 NA-억제제 오셀타미비르 산 또는 중합효소 서브유닛 PA의 바이러스 캡-의존성 엔도뉴클레아제 억제제 발록사비르 마르복실로 처리하였다. 24시간 p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 적정에 의해 결정하였다. 다음 라운드 동안 신선한 A549 세포를 수집된 상청액(MOI 0.01)으로 감염시키고 증가하는 농도의 상이한 억제제로 처리하였다. 농도가 일정하게 유지된 라운드는 화살표로 표시된다. 용매 DMSO(1%)는 음성 대조군으로 작용하였다. 상대적인 바이러스 역가가 표시된다. DMSO 대조군의 역가는 임의적으로 100%로 설정하였다(점선으로 표시). 데이터는 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정(Bonferroni post-test)으로 계산하였다(*** p < 0.001). (b) 각 라운드에 사용된 억제제 농도의 개요. 라운드 5(CI-1040, BI-D1870) 또는 라운드 6(오셀타미비르, 발록사비르)에서 농도는 일정하게 유지되었다.
실시예
실시예 1: 핵단백질 내의 특정 모티프의 Raf /MEK/ ERK -경로 의존적 인산화
생리학적 조건하에서 Raf/MEK/ERK 키나제 캐스케이드는 세포 내에서 세포외 신호를 전송하여 증식 및 분화와 같은 세포 과정을 촉진한다. 신호는 단백질 키나제의 순차적인 인산화를 통해 전달된다(Yoon, 2006). 바이러스 NP 단백질 내의 추정 인산화 부위를 분석하기 위해, HEK293T 세포를 Strep-표지된 PB2 단백질(MOI 5)을 발현하는 재조합 WSN/H1N1 바이러스로 감염시키고 3 h p.i.(감염 후)에 DMSO(1%) 또는 CI-1040(10μM)로 처리하였다. 7 h p.i.에 vRNP를 총 단백질 용해물에서 정제하였다. DMSO 대조군과 CI-1040 샘플의 인산화 패턴을 질량분석계로 분석하였다. MEK 억제제 CI-1040으로 경로를 억제한 후 인산화 상태가 감소된 2개의 세린 잔기를 확인할 수 있었다. 결합된 RNA를 갖는 vRNP의 결정학적 구조는 2개의 세린 잔기 269 및 392가 NP의 핵 외수송 신호(NES) 및 RNA-결합 고랑 근처에서 서로 매우 근접하다는 것을 보여주었다. vRNA 루프(구로 표시된 vRNA)가 두 개의 아미노산 모두를 둘러싸고 있다. 또한 S269는 NES2 내에 위치하고 S392는 핵단백질의 NES2 및 NES3 근처에 위치한다(도 3a). 이 루프는 나선형 vRNP 복합체 내부로 향한다(도 3). 도 3c에 나타낸 인플루엔자 바이러스 A/Wilson-Smith(WSN)/1933(H1N1) 리보핵단백질의 나선 부분의 극저온-전자 재구성은 단백질 정보 은행(PDB) ID 4BBL에서 입수하였다(Arranz et al., 2012). NP 단백질 내에서 확인된 영역(LILRGS 269 V, AIRTRS 392 G)은 도 3b에 나타낸 바와 같이 세린/트레오닌-키나제 ERK의 컨센서스 표적 서열(Pro-Xaa-Ser/Thr-Pro)과 유사성을 보이지 않았으며, 이것은 확인된 인산화 모티프를 갖는 ERK(Gonzalez et al., 1991) 및 RSK(Romeo et al., 2012) 컨센서스 서열의 비교를 제공한다. 따라서 확인된 세린 잔기가 키나제 ERK에 의해 직접 인산화되지는 않을 것이다. 다운스트림 키나제 90kDa 리보솜 S6 키나제(RSK)의 컨센서스 서열(Arg/Lys-Xaa_Arg-Xaa-Xaa-Ser/Thr; Arg-Arg-Xaa-Ser/Thr)은 확인된 NP 영역에 대해 더 높은 동일성을 보였다(Romeo, 2012). 위치 269 및 392에 인산화되지 않는 아미노산(aa)을 갖는 WSN 돌연변이체(S269A, S392A, S269A/S392A)를 생성하여 바이러스 수명 주기에 대한 이들 잔기의 중요성을 연구하였다. 포스포-모방 돌연변이체(phospho-mimicking mutant)는 구출될 수 없다는 것을 고려해야 하며, 이것은 이러한 위치에서의 영구 음전하가 바이러스에 의해 허용되지 않음을 나타낸다. 도 3d로부터 알 수 있는 바와 같이, M1 단백질의 RNA-결합 부위는 확인된 vRNP 루프와 비슷한 모양을 나타냈다. 인산화된 세린 잔기와 상호작용할 수 있는 양으로 하전된 히스티딘(H110)이 하단 라인에 표시되고 도 3e에 도시되어 있다. 인플루엔자 바이러스 A/Puerto Rico/8/1934(H1N1) M1 단백질 N-말단 도메인의 결정학적 구조는 단백질 정보 은행(PDB) ID 1EA3에서 입수하였다(Arzt et al., 2001). M1 단백질의 RNA-결합 부위와 vRNA 루프의 구조적 비교는 양으로 하전된 히스티딘과 비슷한 모양을 보여주었다. 본 발명자들은 이러한 히스티딘이 인산화된 세린 잔기의 음전하와 상호작용할 수 있다고 가정한다. 중성(H110A) 및 음(H110D) 전하를 모방하는 WSN 돌연변이체가 생성되었고 결과는 도 3f 및 3g에 나타나 있으며, 여기서는 구성적 비인산화 WSN-NP(S269A, S392A, S269A/S392A) 및 WSN- M1(H110D, H110A) 돌연변이체의 성장 역학이 제시된다. 여기서, A549 세포를 상이한 WSN 바이러스 돌연변이체 또는 야생형 바이러스(MOI 0.01)로 감염시켰다. 8h, 24h 및 32h p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 결정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정으로 평가하였다.
실시예 2: Raf /MEK/ ERK -경로와 vRNP 외수송 간의 링크로서의 RSK1
RSK가 Raf/MEK/ERK 신호전달 경로의 활성화와 새로 합성된 vRNP의 핵 외수송 간의 링크인지 여부를 밝히기 위해, 바이러스 수명 주기 동안 이의 활성화를 분석하였다. 이러한 활성화는 MEK 억제제 CI-1040과의 배양에 의해 차단될 수 있으며, 이것은 바이러스 유도된 RSK 활성화가 Raf/MEK/ERK 경로에 의해 매개됨을 나타낸다. 구체적으로, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)으로 감염시켰다. 세포를 7h 및 9h p.i.에 용해시키고, 세포 용해물을 ERK1/2, RSK1 및 GSK-3β의 인산화 상태의 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)에 사용하였다. 바이러스 복제는 PB1, NP 및 M1의 단백질 발현에 의해 결정하였다. 튜불린을 로딩 대조군(loading control)으로 검출하였다. 2개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 도 4a에 나타나 있다. 감염의 후기 단계에서 ERK 뿐만 아니라 RSK와 이의 다운스트림 표적 GSK-3β가 인산화되고 활성화되었다(도 4a). 추가 실험에서, 세포를 3 h p.i.에 DMSO(1%) 또는 표시된 농도의 BI-D1870으로 처리하였다. 세포를 7h p.i.에 용해시키고, 세포 용해물을 ERK1/2 및 GSK-3β의 인산화 상태의 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 바이러스 복제는 PB1, NP 및 M1의 단백질 발현에 의해 결정하였다. 튜불린을 로딩 대조군으로 검출하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 도 4b에 나타나 있다.
추가 실험에서, 세포를 DMSO(1%), CI-1040(10μM) 또는 BI-D1870(15μM)로 3h p.i.에 처리하였으며 결과는 도 4c, 4d 및 4e에 나타나 있다. 9h p.i.에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa488) 및 (c) PA(Alexa-561), (d) M1(Alexa-561) 또는 (e) NEP(Alexa-561)의 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 단일 초점면의 표면형광 현미경 사진이 20μM을 나타내는 기준자를 사용하여 ( c,d ) 3개 또는 (e) 2개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지로서 도시되어 있다.
RSK 억제제의 표적외 효과를 배제하기 위한 추가 실험에서, A549 세포에서 siRNA-매개된 녹다운에 의해 RSK1 및 RSK2를 표적화하였으며 바이러스 수명 주기에 대한 효과를 도 4f에 도시된 바와 같이 분석하였다. 구체적으로, A549 세포를 RSK1 또는 RSK2에 대해 표시된 농도의 siRNA로 형질감염시켰다. 형질감염되지 않은 세포 및 형질감염된 대조군 세포가 음성 대조군으로 작용하였다. 형질감염 후(p.t.) 48시간에 RSK1, RSK2 및 ERK1/2의 총 단백질 양을 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정하였다. 튜불린을 로딩 대조군으로 검출하였다. 도 4g에 나타낸 바와 같이, 커버 유리 상의 A549 세포를 100nM의 siRNA 농도를 사용하여 형질감염시켰다. 48 h p.t.에 세포를 WSN/H1N1 (MOI 5)로 감염시켰다. 세포를 9 h p.i.에 고정하고 vRNP(NP-Alexa488) 및 M1(Alexa-561)의 국소화를 표면형광 현미경에 의해 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 단일 초점면의 표면형광 현미경 사진이 20μM을 나타내는 기준자를 사용하여 3개의 독립적인 실험의 대표적인 이미지로서 도시되어 있다. 데이터는, RSK1 녹다운만 발생하고 RSK2 녹다운은 발생하지 않으면 감염된 세포의 핵에서 vRNP가 유지됨을 보여준다.
또한, 도 4h에 나타낸 바와 같이, RSK1 또는 RSK2 녹다운을 100nM의 siRNA 농도를 사용하여 A549 세포에 도입하였다. 48 h p.t.에 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)로 감염시켰다. 자손(progeny) 바이러스 역가를 24 h p.i.에 표준 플라크 분석에 의해 결정하였다. 대조군 siRNA의 역가를 100%로 설정하였다. 또한, 절대 바이러스 역가는 PFU/ml로 표시된다. 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD가 표시된다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 쌍별 양측 t-검정으로 분석하였다(* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001). 핵 외수송에 대한 녹다운의 효과와 일치하게, 다중 복제 분석 내에서 RSK1 녹다운은 바이러스 역가의 감소로 나타나는 항바이러스 효과를 갖는 것으로 밝혀졌다. 그러나 RSK2 녹다운은 약간의 프로바이러스 효과를 갖는 것으로 보인다. 바이러스 복제에 대한 RSK2 녹다운의 이러한 지원 효과는 2009년에 Kakugawa 등에 의해 이미 기술되었다. 이것은 두 RSK 하위유형 RSK1 및 RSK2가 인플루엔자 바이러스 수명 주기 내에서 상이한 역할을 한다는 것을 나타낸다.
추가 실험에서, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시켰다. 3 h p.i.에 세포를 DMSO(1%) 또는 CI-1040(10μM)로 처리하였다. 비처리된 세포가 음성 대조군으로서 작용하였다. 세포를 7h 및 9h p.i.에 용해시키고 세포 용해물을 ERK1/2 및 RSK1의 인산화 상태의 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 바이러스 복제는 PB1, NP 및 M1의 단백질 발현에 의해 결정하였다. 튜불린을 로딩 대조군으로 검출하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 도 4i에 나타나 있다. 또한, RSK의 억제 후 ERK 활성화의 증가가 발견되었으며, 이것은 정상적인 조건하에서 경로의 과활성화를 방지하는 음성 피드백 루프의 억제에 의해 설명될 수 있다(도 4i).
도 4j에 나타낸 또 다른 실험에서, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)로 감염시켰다. 감염 후 세포를 BI-D1870(10μM), CI-1040(10μM), 억제제 둘 다의 조합(각각 10μM), 또는 용매 대조군 DMSO(0.2%)으로 처리하였다. 24 h p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 결정하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 각 실험은 2회 수행하였다. 통계적 유의도는 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정으로 평가하였다(ns p > 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001). CI-1040 치료와 BI-D1870 및 CI-1040 병용 치료 간에 자손 바이러스 역가에 유의한 차이가 없는 것으로 나타났으며, 이것은 또한 MEK 및 RSK가 동일한 경로, 즉 바이러스 유도된 Raf/MEK/ERK 경로 내에서 순차적으로 활성화됨을 보여준다(도 4j).
바이러스 감염 후 특정 억제제 BI-D1870으로 RSK를 억제하면 GSK-3β 인산화가 농도 의존적으로 감소하여, 바이러스 수명 주기 동안 RSK 활성화에 대한 억제 효과가 확인되었다. 증가하는 농도의 억제제 BI-D1870은 vRNP 핵 외수송에 부정적인 영향을 미쳤다. RSK 억제제의 항바이러스 효과를 분석하기 위해 본 발명자들은 BI-D1870과 SL0101-1을 사용하였고 1.56μM에서 100μMM으로 증가하는 농도로 24 h 처리 후 자손 바이러스 역가를 결정하였다(도 4k, n). 두 억제제 모두 바이러스 역가를 감소시켰지만 BI-D1870(EC50=2.808μM)은 SL0101-1(EC50=10.54μM)보다 인플루엔자 감염에 대해 더 높은 효과를 보였다(도 4l, o). 구체적으로, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)로 감염시켰다. 감염 후 세포를 표시된 농도의 BI-D1870(I), SL0101-1(L) 또는 DMSO(0.1%)로 처리하였다. 24시간 p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 분석하였다. DMSO-처리된 세포의 역가를 100%로 설정하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 일원 ANOVA에 이어 Dunnett' 다중 비교 검정으로 평가하였다(*** p ≤ 0.001). 결과는 도 4k 및 4n)에 나타내어져 있다. 또한, 도 4l 및 4o에서, (I,L)로부터의 자손 바이러스 역가를 사용하여 EC50 값을 계산하였다. 마지막으로, 도 4m 및 4p에서, A549 세포를 표시된 농도(L)의 BI-D1870으로 처리하였다. 24 h p.i.에 세포 생존력 및 세포막 보존성을 LDH 세포독성 분석으로 측정하였다. 데이터를 (E)와 함께 사용하여 CC50 값을 계산하였다.
Strep-PB2-WSN 바이러스 감염 및 RSK 억제 후 염색질 분획 분석을 수행하여 vRNP-M1 상호작용에 대한 효과를 밝혀냈다. A549 세포를 Strep-PB2-WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시켰다. 감염후(p.i.) 2.5 h에 세포를 DMSO(1%) 또는 BI-D1870(10μM)와 함께 배양하였다. 7 h p.i.에 세포를 분획화하고 vRNP-복합체를 PB2-Strep-Tag에 의해 분획화된 용해물로부터 정제하였다. Strep-PB2, PB1, PA, NP 및 M1의 단백질 양은 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 나타내어져 있다. BI-D1870 처리는 도 5a에 나타낸 바와 같이 CI-1040 억제제와 비슷한 결과를 야기하였다. 도 5b에서, 도 5a로부터 분획화된 세포 용해물의 총 단백질 양을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 감소된 양의 M1 뿐만 아니라 ch500 조밀한 염색질 분획 내의 더 높은 단백질 양을 RSK 억제된 샘플에서 Strep-PB2-vRNP와 공동-정제하였다(도 5b). 또한, 도 5a로부터의 총 세포 용해물의 단백질 양을 웨스턴 블롯으로 분석하였다. ERK 특이 항체를 이용하여 ERK의 인산화 상태를 분석하였다. GSK-3β의 인산화 상태는 phospho-GSK와 GSK 특이 항체를 이용하여 분석하였다. 라민A/C를 로딩 대조군으로서 검출하였다. 도 5c의 phospho-ERK 블롯은 억제된 음성 피드백 루프로 인한 ERK1/2 인산화 상태의 유도를 보여준다(도 5c).
실시예 3: MEK- 및 RSK -억제제에 의한 특정 vRNP 외수송 차단
렙토마이신 B는 주요 세포 외수송 인자 Crm1을 알킬화하고 억제함으로써 활성 핵 외수송 경로를 광범위하게 차단한다. 억제된 세포는 죽지만 이 과정은 비가역적이다. 세포 Crm1 외수송 경로에 대한 대조군으로서 본 발명자들은 Ran 결합 단백질 RanBP1을 사용하였다. 23kDa RanBP1은 핵 내의 핵공을 통해 확산할 만큼 충분히 작다. RanBP1의 높은 핵 농도는 세포에 독성인 것으로 나타났다. 따라서 Crm1-경로에 의해 세포질로 영구적으로 다시 외수송되어야 한다. 렙토마이신 B는 RanBP1의 핵 축적을 야기하고 Crm1 외수송 경로의 일반적인 차단에 대한 대조군으로 사용될 수 있다(Plafker, 2000). 본 발명자들은 MEK 억제제 CI-1040 및 ATR-002와 RSK 억제제 BI-D1870 및 SL0101-1을 사용하여 Crm1 경로에 미치는 이들의 영향을 조사하였다. 세포를 인플루엔자 A/WSN(H1N1) 바이러스로 감염시키고 억제제로 처리하였다. 9 h p.i.에 면역형광 염색을 수행하였다. 구체적으로, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)으로 감염시켰다. 3 h p.i.에 세포를 MeOH(0.1%), 렙토마이신 B(LMB)(5nM), DMSO(1%), CI-1040(10μM) 또는 BI-D1870(15μM)으로 처리하였다. 9h p.i.에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa488) 및 RanBP1(Alexa561)의 세포 국소화를 도 6a에 나타낸 바와 같이 표면형광 현미경으로 분석하였으며, 여기서 핵은 Dapi로 염색되었고, 점선 사각형은 확대 영역을 나타내며 기준자는 20μM을 나타낸다. 정량 분석에서는 시험된 모든 억제제에 대한 바이러스 NP 단백질의 핵 보유가 밝혀졌다. 도 6a의 각 물질에 대해 약 1000개의 세포를 분석하고 ImageJ "Intensity Ration Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 단백질 국소화에 대해 점수를 매겼다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 도 6b에 표시된다. 도 6b에 나타낸 바와 같이 렙토마이신 B와 두 개의 MEK 억제제에 대해 가장 높은 보유율(retention rate)이 발견되었다. RanBP1의 핵 보유는 도 6b로부터 알 수 있는 바와 같이 렙토마이신 B 처리된 샘플에서만 검출되었다. 이것은 Raf/MEK/ERK/RSK 경로의 억제가 Crm1 외수송 경로에 일반적인 영향을 미치지 않지만 vRNP의 외수송에 대해 특이적으로 지시된다는 것을 나타낸다.
내성의 발달에 대해 시험하기 위해, 다중 계대 실험(multi passaging experiment)을 수행하였다. 도 6c 및 6d에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)으로 감염시키고 도 6d에 요약된 바와 같이 증가하는 농도의 CI-1040, BI-D1870, 오셀타미비르 또는 발록사비르로 처리하였다. 24 h p.i.에 상청액을 수집하고 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 결정하였다. 다음 라운드(round)를 위해 신선한 A549 세포를 상청액(MOI 0.01)으로 감염시키고 물질의 양을 증가시키면서 배양하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SD의 평균을 나타낸다. DMSO 대조군의 역가는 100%로 설정하였다. 각 실험은 3회 수행하였다. 각 물질을 DMSO와 비교하기 위해 이원 ANOVA에 이은 본페로니 사후 검정으로 통계적 유의도를 분석하였다(*** p<0.001). 도 6c에서 알 수 있는 바와 같이, CI-1040 및 BI-D1870 처리된 감염된 세포의 바이러스 역가는 증가하는 농도의 억제제와 계대배양시 감소하고 역가는 후속 계대에서 낮은 수준으로 유지되어, 내성 발달에 대한 높은 장벽을 나타낸다. 이것은 바이러스 역가가 이미 계대 3에서 시작하여 극적으로 증가되는 오셀타미비르와는 분명한 대조를 이룬다. 계대 5에서 역가는 대조군 수준으로 돌아갔으며, 이것은 완전히 내성이 있는 바이러스 집단을 나타낸다. 발록사비르는 오셀타미비르와 유사한 거동을 보이지 않았지만, 여기에서도 역가가 계대 6까지 농도가 증가함에 따라 증가했으며, 이것은 CI-1040 또는 BI-D1870과 비교하여 반대 경향이며, 이것은 약물에 대한 약간 감소된 민감도를 나타낸다. 요약하면, CI-1040 및 BI-D1870은 내성 바이러스 변이체를 빠르게 유도하는 오셀타미비르와 명백히 대조적으로 내성 발생에 대한 높은 장벽을 나타낸다.
또한, 도 6e 및 6f에서, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시켰다. 3 h p.i.에 세포를 DMSO(1%), ATR-002(150μM) 또는 SL0101-1(100μM)로 처리하였다. 9h p.i.에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa488) 및 RanBP1(Alexa561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. ImageJ "Intensity Ration Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 각 물질에 대해 대략 1000개의 세포를 분석하고 단백질 국소화에 대해 점수를 매겼다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 기준자: 20μm. 정량 분석에서는 ATR-002(MEK 억제제 PD-0184264) 및 SL0101에 대한 바이러스 NP 단백질의 핵 보유가 밝혀졌다. RanBP1의 핵 보유는 ATR-002 및 SL0101에 대해 검출되지 않았다. 이것은 일반적인 Crm1 매개된 외수송이 아니라 vRNP 핵 수축의 특이 억제가 pf MEK 및 RSK의 다른 억제제로 재현될 수 있으며 억제제 CI-1040 또는 BI-D1870에 제한되지 않음을 나타낸다.
실시예 4: BI-D1870의 광범위한 항-인플루엔자 활성
Raf/MEK/ERK/RSK-경로가 인플루엔자 바이러스 복제에 중요하기 때문에, 본 발명자들은 돼지 기원 H1N1 유행성 바이러스, 계절성 H3N2 바이러스, 상이한 고병원성 조류 인플루엔자 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스를 포함한 상이한 인플루엔자 A 하위유형을 사용하여 광범위한 항바이러스 활성을 결정하였다(도 7). 구체적으로, A549 세포(도 7a-o) 또는 MDCKII 세포(도 7p)를 인간 IAV(a-h)(WSN/H1N1, PR8M/H1N1, pdm09Hamburg/H1N1, Panama/H3N2), 조류 IAV(i-l)(KAN-1/H5N1, Anhui/H7N9), IAV/SC35M/H7N7(m-n) 또는 IBV(o-p)(B/Lee)로 감염시켰다(면역형광 분석의 경우 MOI 5(a,c,e,g,i,k,m,o), 다중 복제 주기 분석의 경우 MOI 0.01(b,d,f,h,j,l,n,p)). 3 h p.i.에 세포를 BI-D1870(15μM) 또는 DMSO(0.1%)로 처리하였다. (a, c, e, g, i, k, m) 9h p.i. 또는 (o) 12h p.i.에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa488)의 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 단일 초점면의 표면형광 현미경 사진이 도시되어 있다(b,d,f,h,j,l,n,p). 감염 직후 세포를 BI-D1870(15μM) 또는 DMSO(0.1%)로 처리하였다. 24 h p.i.에 p.i. 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 분석에 의해 분석하였다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. DMSO 대조군의 역가는 100%로 설정하였다. 또한, 절대 바이러스 역가는 PFU/ml로 표시된다. 3개의 독립적인 실험의 평균 + SD가 표시된다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 쌍별 양측 t-검정으로 분석하였다(* p ≤ 0.05; ** p ≤ 0.01, *** p ≤0.001). 기준자: 20μm. 도 7q에서, 상이한 바이러스에 대해 S269 및 S392를 포함하는 NP 영역의 순차 비교가 나타내어져 있으며, 이것은 NP의 인산화 부위가 이러한 모든 바이러스 중에서 보존됨을 나타낸다. 인플루엔자 연구 데이터베이스로부터 서열을 수득하고 Jalview를 사용하여 정렬하였다. 도 7r에서, 인플루엔자 A/WSN(H1N1) 및 인플루엔자 B/Lee NP 영역의 결정학적 구조는 유사한 구조를 나타냈다. 인플루엔자 B NP S327 및 S448은 인플루엔자 A와 유사한 잔기를 나타낼 수 있다. 결정학적 구조는 단백질 정보 은행으로부터 수득하였다(인플루엔자 바이러스 A/Wilson-Smith/1933 (H1N1) ID: 4BBL; Arranz et al., 2012; 인플루엔자 바이러스 B/HongKong/CUHK-24964/2004 ID: 3TJ0; Ng et al., 2012). 도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 시험된 모든 바이러스는 새로 합성된 vRNP의 핵 보유와 대략 80 내지 90%의 자손 바이러스 역가 감소를 보여주었다. 이러한 결과는 Raf/MEK/ERK/RSK 경로에 대한 인플루엔자 바이러스의 의존성을 명확히 한다.
실시예 5: 인플루엔자 A 감염 후 RSK1의 특이 핵 국소화
이전 실험에서는 바이러스 수명 주기에 대한 이소형 RSK1 및 RSK2의 상이한 기여가 밝혀졌다. RSK2는 항바이러스 효과를 갖는 반면 RSK1은 분명히 바이러스를 지원하는 작용을 하는 것으로 보인다. 원형질막과 세포질에서 활성화시, RSK1은 핵으로 전위한다. RSK1이 NP를 인산화하는 키나제인 경우, Raf/MEK/ERK 경로의 바이러스 유도된 활성화에 따라 바이러스 수명 주기 동안 세포 분포가 변경되어야 한다. 이 가설을 해결하기 위해 A549 세포를 모의 감염시키거나 5의 MOI를 사용하여 WSN/H1N1 바이러스로 감염시켰다. 3h, 6h 및 9h p.i.에 NP 및 RSK1의 국소화를 면역형광 염색으로 분석하였다. 구체적으로, 도 8a에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 이후에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 RSK1(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 표시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 나타내어져 있다. 기준자는 50μm를 나타낸다. 도 8b 및 c는 도 8a로부터의 NP 및 RSK1의 세포 국소화의 정량화를 보여준다. 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 NP 및 RSK1 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch's 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05; ** p ≤ 0.01). 감염의 후기 시점에서 예상되는 바와 같이 RSK1의 핵 국소화의 증가는 도 8a에서 알 수 있다. 3개의 독립적인 실험의 정량화에서는 RSK1의 핵 농도가 모의 감염의 경우 35.58% ± 0.59%에서 9시간 후 바이러스 감염의 경우 57.73% ± 1.47%로(도 8b), 특히 NP 외수송이 일어날 때(도 8a,c) 유의하게 변하는 것으로 나타났으며, 이것은 바이러스가 RSK1의 핵 수입을 유도함을 나타낸다.
실시예 6: 인플루엔자 A 감염 후 RSK2의 특이 핵 국소화 없음
RSK1이 바이러스 수명 주기 동안 핵으로 들어가는 것이 확인된 후, 바이러스 유도된 Raf/MEK/ERK 경로의 활성화가 항바이러스 RSK2의 핵 국소화를 초래하는지 여부에 대한 의문이 해결되었다. 일반적으로, Raf/MEK/ERK-경로의 활성화는 RSK1 및 RSK2를 핵으로 전위시킨다. 따라서, 실시예 5에 기술된 바와 동일한 실험을 수행하되 RSK2의 국소화를 분석하였다. 구체적으로, 도 9a에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 후에 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 RSK2(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 나타내어져 있다. 기준자는 50μm를 나타낸다. 도 9b,c는 도 9a로부터의 NP 및 RSK2의 세포 국소화의 정량화를 보여준다. 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 NP 및 RSK2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch's 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05; ** p ≤ 0.05).
RSK1과 대조적으로, 바이러스 감염 동안의 시점과 무관하게 RSK2의 세포하 분포의 변화는 발견되지 않았다(도 9a,b). 이 결과는 바이러스가 항바이러스 작용성 RSK2의 세포 분포에 영향을 미치지 않으면서 바이러스 지원 RSK1의 전위를 특이적으로 유도한다는 것을 보여준다.
실시예 7: 인플루엔자 A 감염 후 ERK 1/2 국소화에 대한 영향 없음
RSK1의 특정 전위가 발견된 후, RSK 업스트림(upstream) 키나제 ERK1/2가 바이러스 경로 유도로 인해 핵으로 들어갈 수 있는지에 대한 의문이 제기되었다. 따라서 실시예 5 및 6에서와 동일한 실험을 ERK로 반복하였다. 구체적으로, 도 10a에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 5)로 감염시키거나 모의 감염시켰다. 표시된 시점 후 세포를 고정하고 vRNP(NP-Alexa-488) 및 ERK1/2(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 나타내어져 있다. 기준자는 50μm를 나타낸다. 도 10b,c는 도 10a로부터의 NP 및 ERK1/2의 세포 국소화의 정량화를 보여준다. 각 샘플의 10개의 표면형광 현미경 사진을 ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 NP 및 ERK1/2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 각 시점에 대해 개별적으로 Welch의 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(ns p > 0.05). 놀랍게도, 분석된 시점과 무관하게 바이러스 감염 후에 ERK1/2 국소화에 대한 영향을 볼 수 없다(도 10 a,b).
실시예 8: TPA로 자극하면 RSK2 및 ERK1 /2의 핵 국소화가 야기된다
RSK2 및 ERK1/2의 비특이적 염색을 배제하기 위해 Raf/MEK/ERK-경로를 TPA로 자극하였다. TPA와의 배양이 Raf/MEK/ERK-경로의 활성화를 야기하여 자극 후 수 분 이내에 ERK1/2 및 RSK의 핵 국소화를 초래하는 것으로 알려져 있다. 도 11a,c에 나타낸 바와 같이, A549 세포를 TPA(200nM)로 자극하였다. 용매 DMSO가 음성 대조군으로 작용하였다. 1시간 후 세포를 고정하고 RSK2 또는 ERK1/2(Alexa-561)의 세포 국소화를 표면형광 현미경으로 분석하였다. 핵을 Dapi로 염색하였다. 점선 사각형은 확대 영역을 나타낸다. 단일 초점면의 대표적인 표면형광 현미경 사진이 도시된다. 3개의 독립적인 실험 중 하나의 결과가 나타내어져 있다. 기준자는 50μm를 나타낸다. 도 11b 및 d에 나타낸 바와 같이, 각 샘플의 15개의 표면형광 현미경 사진으로부터의 RSK2 또는 ERK1/2의 세포 국소화의 정량화를 ImageJ "Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool"을 사용하여 RSK2 국소화 측면에서 분석하였다. 결과는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD로 표시된다. 통계적 유의도는 Welch's 보정과 함께 비쌍별 t-검정으로 분석하였다(** p ≤ 0.01). 1시간 동안 100nM TPA와 함께 배양한 후 핵에서 두 키나제가 모두 발견되어 염색이 특이적임을 확인하였다(도 11a,c). 정량화에서는 자극되지 않은 샘플의 경우 27.99% ± 1.97% 내지 TPA 자극된 샘플의 경우 48.02% ± 2.25%의 ERK1/2의 핵 축적이 나타났다. RSK2 키나제에 대한 효과는 ERK1/2만큼 두드러지지 않았으며, 자극되지 않은 샘플의 경우 29.37% ± 1.15%, TPA 자극된 샘플의 경우 34.89% ± 0.67%였다(도 11b,d).
실시예 9: MEK- 또는 RSK -억제제 CI-1040 또는 BI-D1870으로의 장기간 치료는 WSN / H1N1에 내성을 도입하지 않는다.
바이러스 입자를 직접 표적화하는 항바이러스 약물(오셀타미비르, 발록사비르) 또는 Raf/MEK/ERK/RSK 경로의 억제를 통해 항바이러스 작용을 하는 항바이러스 약물(CI-1040, BI-D1870)이 내성 바이러스 변이체를 유도하는 능력을 비교하기 위해, A549 세포를 WSN/H1N1(MOI 0.01)로 감염시키고 MEK 억제제 CI-1040, RSK 억제제 BI-D1870, 바이러스 NA-억제제 오셀타미비르 산 또는 중합효소 서브유닛 PA의 바이러스 캡-의존성 엔도뉴클레아제 억제제 발록사비르 마르복실로 처리하였다. 24시간 p.i.에 자손 바이러스 역가를 표준 플라크 적정에 의해 결정하였다. 다음 라운드 동안 신선한 A549 세포를 수집된 상청액(MOI 0.01)으로 감염시키고 증가하는 농도의 상이한 억제제로 처리하였다. 농도가 일정하게 유지된 라운드는 화살표로 표시된다. 용매 DMSO(1%)는 음성 대조군으로 작용하였다. 상대적인 바이러스 역가가 표시된다. DMSO 대조군의 역가는 임의적으로 100%로 설정하였다(점선으로 표시). 도 12a에 나타낸 데이터는 2개의 독립적인 실험의 평균 ± SD를 나타낸다. 각 실험은 3회 수행하였다. 통계적 유의도는 이원 ANOVA에 이어 본페로니 사후 검정으로 계산하였다(*** p ≤ 0.001). 억제제 농도를 증가시켜 억제 효과를 향상시키고 돌연변이 발생을 유발하였다. CI-1040 및 BI-D1870의 농도가 증가하면 바이러스 역가가 감소하였다. DMSO 대조군과 비교하여, 역가는 1μM 억제제 농도를 사용한 첫 번째 라운드에서 CI-1040 또는 BI-D1870에 대해 각각 64.75% ± 0.32% 및 35.08% ± 3.20% 감소하였다. 억제제 농도가 증가함에 따라, 역가는 라운드 4까지 추가로 감소하였다. 이 시점에서, 두 억제제 모두 8 μM의 농도로 사용되었다. 라운드 5에서 라운드 12까지 CI-1040 및 BI-D1870을 10μM의 농도로 사용하였다. 라운드 5 내지 라운드 12 내에서 CI-1040 처리의 평균 역가는 DMSO 대조군과 비교하여 8.45% ± 3.41%로 계산되었다. 라운드 5 내지 라운드 12 내의 BI-D1870 처리의 평균 역가는 12.27% ± 6.36%로 계산되었다. 바이러스 역가의 지속적인 증가나 플라크 형태의 변화는 12 라운드 동안 어느 시점에서도 발견되지 않았으며, 이것은 돌연변이를 도입하는 내성이 발생하지 않았음을 나타낸다. 5 라운드의 오셀타미비르 처리 후에 완전한 내성이 발견되었다. 이 시점에서, 16μM의 억제제 농도가 사용되었다. 라운드 9에서 역가는 48.30% ± 11.42%까지 감소하기 시작하였다. 이 효과는 플라크 크기 감소의 증가를 동반하였다. 라운드 1부터 라운드 9까지 발록사비르 처리의 평균 역가는 8.08% ± 4.10%로 계산되었다. 역가 증가의 경향은 평균 역가가 28.39% ± 1.88%인 라운드 10에서 시작되었다. 라운드 12에서 평균 역가는 46.94% ± 1.03%까지 추가로 증가하였다(도 12a). 도 12b는 각 라운드에 사용된 억제제 농도의 개요를 보여준다. 라운드 5(CI-1040, BI-D1870) 또는 라운드 6(오셀타미비르, 발록사비르)에서 농도는 일정하게 유지되었다.
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SEQUENCE LISTING <110> ATRIVA Therapeutics GmbH GmbH, ATRIVA Therapeutics Ludwig, Stephan <120> RSK inhibitors in the treatment of virus diseases <130> OLP16685LU <160> 8 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 735 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Pro Leu Ala Gln Leu Lys Glu Pro Trp Pro Leu Met Glu Leu Val 1 5 10 15 Pro Leu Asp Pro Glu Asn Gly Gln Thr Ser Gly Glu Glu Ala Gly Leu 20 25 30 Gln Pro Ser Lys Asp Glu Gly Val Leu Lys Glu Ile Ser Ile Thr His 35 40 45 His Val Lys Ala Gly Ser Glu Lys Ala Asp Pro Ser His Phe Glu Leu 50 55 60 Leu Lys Val Leu Gly Gln Gly Ser Phe Gly Lys Val Phe Leu Val Arg 65 70 75 80 Lys Val Thr Arg Pro Asp Ser Gly His Leu Tyr Ala Met Lys Val Leu 85 90 95 Lys Lys Ala Thr Leu Lys Val Arg Asp Arg Val Arg Thr Lys Met Glu 100 105 110 Arg Asp Ile Leu Ala Asp Val Asn His Pro Phe Val Val Lys Leu His 115 120 125 Tyr Ala Phe Gln Thr Glu Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Asp Phe Leu 130 135 140 Arg Gly Gly Asp Leu Phe Thr Arg Leu Ser Lys Glu Val Met Phe Thr 145 150 155 160 Glu 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15 Val Phe Ser Gly Gly Gly Ala Ser Ser Gly Glu Val Asn Gly Leu Lys 20 25 30 Met Val Asp Glu Pro Met Glu Glu Gly Glu Ala Asp Ser Cys His Asp 35 40 45 Glu Gly Val Val Lys Glu Ile Pro Ile Thr His His Val Lys Glu Gly 50 55 60 Tyr Glu Lys Ala Asp Pro Ala Gln Phe Glu Leu Leu Lys Val Leu Gly 65 70 75 80 Gln Gly Ser Phe Gly Lys Val Phe Leu Val Arg Lys Lys Thr Gly Pro 85 90 95 Asp Ala Gly Gln Leu Tyr Ala Met Lys Val Leu Lys Lys Ala Ser Leu 100 105 110 Lys Val Arg Asp Arg Val Arg Thr Lys Met Glu Arg Asp Ile Leu Val 115 120 125 Glu Val Asn His Pro Phe Ile Val Lys Leu His Tyr Ala Phe Gln Thr 130 135 140 Glu Gly Lys Leu Tyr Leu Ile Leu Asp Phe Leu Arg Gly Gly Asp Val 145 150 155 160 Phe Thr Arg Leu Ser Lys Glu Val Leu Phe Thr Glu Glu Asp Val Lys 165 170 175 Phe Tyr Leu Ala Glu Leu Ala Leu Ala Leu Asp His Leu His Gln Leu 180 185 190 Gly Ile Val Tyr Arg Asp Leu Lys Pro Glu Asn Ile Leu Leu Asp Glu 195 200 205 Ile Gly His Ile Lys Leu Thr Asp Phe Gly Leu Ser Lys Glu Ser Val 210 215 220 Asp Gln Glu Lys Lys Ala Tyr Ser Phe Cys Gly Thr Val Glu Tyr Met 225 230 235 240 Ala Pro Glu Val Val Asn Arg Arg Gly His Ser Gln Ser Ala Asp Trp 245 250 255 Trp Ser Tyr Gly Val Leu Met Phe Glu Met Leu Thr Gly Thr Leu Pro 260 265 270 Phe Gln Gly Lys Asp Arg Asn Glu Thr Met Asn Met Ile Leu Lys Ala 275 280 285 Lys Leu Gly Met Pro Gln Phe Leu Ser Ala Glu Ala Gln Ser Leu Leu 290 295 300 Arg Met Leu Phe Lys Arg Asn Pro Ala Asn Arg Leu Gly Ser Glu Gly 305 310 315 320 Val Glu Glu Ile Lys Arg His Leu Phe Phe Ala Asn Ile Asp Trp Asp 325 330 335 Lys Leu Tyr Lys Arg Glu Val Gln Pro Pro Phe Lys Pro Ala Ser Gly 340 345 350 Lys Pro Asp Asp Thr Phe Cys Phe Asp Pro Glu Phe Thr Ala Lys Thr 355 360 365 Pro Lys Asp Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ser Ala Asn Ala His Gln Leu 370 375 380 Phe Lys Gly Phe Ser Phe Val Ala Thr Ser Ile Ala Glu Glu Tyr Lys 385 390 395 400 Ile Thr Pro Ile Thr Ser Ala Asn Val Leu Pro Ile Val Gln Ile Asn 405 410 415 Gly Asn Ala Ala Gln Phe Gly Glu Val Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Ile 420 425 430 Gly Val Gly Ser Tyr Ser Val Cys Lys Arg Cys Ile His Ala Thr Thr 435 440 445 Asn Met Glu Phe Ala Val Lys Ile Ile Asp Lys Ser Lys Arg Asp Pro 450 455 460 Ser Glu Glu Ile Glu Ile Leu Met Arg Tyr Gly Gln His Pro Asn Ile 465 470 475 480 Ile Thr Leu Lys Asp Val Phe Asp Asp Gly Arg Tyr Val Tyr Leu Val 485 490 495 Thr Asp Leu Met Lys Gly Gly Glu Leu Leu Asp Arg Ile Leu Lys Gln 500 505 510 Lys Cys Phe Ser Glu Arg Glu Ala Ser Asp Ile Leu Tyr Val Ile Ser 515 520 525 Lys Thr Val Asp Tyr Leu His Cys Gln Gly Val Val His Arg Asp Leu 530 535 540 Lys Pro Ser Asn Ile Leu Tyr Met Asp Glu Ser Ala Ser Ala Asp Ser 545 550 555 560 Ile Arg Ile Cys Asp Phe Gly Phe Ala Lys Gln Leu Arg Gly Glu Asn 565 570 575 Gly Leu Leu Leu Thr Pro Cys Tyr Thr Ala Asn Phe Val Ala Pro Glu 580 585 590 Val Leu Met Gln Gln Gly Tyr Asp Ala Ala Cys Asp Ile Trp Ser Leu 595 600 605 Gly Val Leu Phe Tyr Thr Met Leu Ala Gly Tyr Thr Pro Phe Ala Asn 610 615 620 Gly Pro Asn Asp Thr Pro Glu Glu Ile Leu Leu Arg Ile Gly Asn Gly 625 630 635 640 Lys Phe Ser Leu Ser Gly Gly Asn Trp Asp Asn Ile Ser Asp Gly Ala 645 650 655 Lys Asp Leu Leu Ser His Met Leu His Met Asp Pro His Gln Arg Tyr 660 665 670 Thr Ala Glu Gln Ile Leu Lys His Ser Trp Ile Thr His Arg Asp Gln 675 680 685 Leu Pro Asn Asp Gln Pro Lys Arg Asn Asp Val Ser His Val Val Lys 690 695 700 Gly Ala Met Val Ala Thr Tyr Ser Ala Leu Thr His Lys Thr Phe Gln 705 710 715 720 Pro Val Leu Glu Pro Val Ala Ala Ser Ser Leu Ala Gln Arg Arg Ser 725 730 735 Met Lys Lys Arg Thr Ser Thr Gly Leu 740 745 <210> 8 <211> 2238 <212> DNA <213> human <400> 8 atgctaccat tcgctcctca ggacgagccc tgggaccgag aaatggaagt gttcagcggc 60 ggcggcgcga gcagcggcga ggtaaatggt cttaaaatgg ttgatgagcc aatggaagag 120 ggagaagcag attcttgtca tgatgaagga gttgttaaag aaatccctat tactcatcat 180 gttaaggaag gctatgagaa agcagatcct gcacagtttg agttgctcaa ggttcttggt 240 caggggtcat ttggaaaggt ttttcttgtt agaaagaaga ccggtcctga tgctgggcag 300 ctctatgcaa tgaaggtgtt aaaaaaagcc tctttaaaag ttcgagacag agttcggaca 360 aagatggaga gggatatact ggtggaagta aatcatccat 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tgatgtgtca 2100 catgttgtta agggagcaat ggttgcaaca tactctgccc tgactcacaa gacctttcaa 2160 ccagtcctag agcctgtagc tgcttcaagc ttagcccagc gacggagcat gaaaaagcga 2220 acatcaactg gcctgtaa 2238

Claims (16)

  1. 바이러스 질환(viral disease)의 예방 및/또는 치료를 위한 방법에서 사용하기 위한 RSK 억제제.
  2. 제1항에 있어서, RSK 억제제가 BI-D1870, SL0101-1, LJH685, LJI308, BIX 02565, FMK 및 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 RSK 억제제.
  3. 제2항에 있어서, 선택적 RSK1 억제제가 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역(conserved region)에 상응하는 Rsk1 mRNA를 선택적으로 표적화하는 si-RNA, shRNA 또는 mi-RNA 또는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 갖는 RSK1의 보존된 영역에 결합하는 항체인 RSK 억제제.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 질환이 음성 가닥 RNA 바이러스, 바람직하게는 인플루엔자 바이러스에 의해 유발된 감염인 RSK 억제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 바이러스 질환이 양성 가닥(positive strand) RNA 바이러스, 바람직하게는 호흡기 감염을 유발하는 코로나 바이러스에 의해 유발된 감염인 RSK 억제제.
  6. 제4항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르, 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴라미다제 억제제, 또는 파비피라비르, 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염의 그룹으로부터 선택된 바이러스 중합효소 복합체의 억제제에 내성이 있는 RSK 억제제.
  7. 제4항 또는 제6항에 있어서, 인플루엔자 바이러스가 유형 H1N1, H2N2, H3N2, H5N1, H5N6, H5N8, H6N1, H7N2, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7, N10N8의 인플루엔자 바이러스, 또는 야마가타(Yamagata) 또는 빅토리아(Victoria) 유형과 같은 다른 인플루엔자 A 바이러스 또는 인플루엔자 B 바이러스인 RSK 억제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, RSK 억제제가 제2 항바이러스제와 조합하여 투여되는 RSK 억제제.
  9. 제8항에 있어서, 제2 항바이러스제가 뉴라미다제 억제제, 중합효소 복합체 억제제, 엔도뉴클레아제 억제제, 헤마글루티닌 억제제, 비구조 단백질(non-structural protein) 1 억제제, 핵단백질(nucleoprotein) 억제제 및 MEK 억제제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 RSK 억제제.
  10. 제9항에 있어서, 뉴라미니다제 억제제가 오셀타미비르, 오셀타미비르 포스페이트, 자나미비르, 페라미비르 또는 라니나미비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는 RSK 억제제.
  11. 제9항에 있어서, 중합효소 복합체 억제제가 발록사비르, 발록사비르 포스페이트, 발록사비르 마르복실, 파비피라비르 또는 피모디비르 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염인 RSK 억제제.
  12. 제9항에 있어서, MEK 억제제가 CI-1040, PD-0184264, PLX-4032, AZD6244, AZD8330, AS-703026, GSK-1120212, RDEA-119, RO-5126766, RO-4987655, PD-0325901, GDC-0973, TAK-733, PD98059 및 PD184352 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 RSK 억제제.
  13. 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK1에 결합하고 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK2, 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK3 및, 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK4에 대한 결합 친화력이 없거나 낮은 결합 친화력을 나타내는 선택적 RSK1 억제제 또는 이의 유도체, 대사산물 또는 약제학적으로 허용되는 염.
  14. 제13항에 있어서, 억제제가 si-RNA, shRNA, mi-RNA, 항체, 또는 소분자인 선택적 RSK1 억제제.
  15. 제13항 또는 제14항에 따르는 선택적 RSK1 억제제를 단독으로 또는 바이러스 질환의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제2 항바이러스제와 조합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  16. (i) 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 서열 번호 2의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK1에 대한 결합에 대해 잠재적인 억제제의 라이브러리를 스크리닝(screening)하는 단계;
    (ii) 단계 (i)에서 RSK1에 결합하는 것으로 밝혀진 억제제를 선택하고 서열 번호 3의 아미노산 서열 또는 서열 번호 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK2, 서열 번호 5의 아미노산 서열 또는 서열 번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK3 및 서열 번호 7의 아미노산 서열 또는 서열 번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 RSK4에 대한 결합에 대해 이들을 스크리닝하는 단계; 및
    (iii) RSK2, RSK3 또는 RSK4에 결합하지 않는 단계 (ii)로부터의 억제제를 특이 RSK1 억제제로서 선택하는 단계를 포함하여, 특이 RSK1 억제제를 확인하는 방법.
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