CN109765324B - 一种mek1蛋白潜在抑制剂的筛选方法 - Google Patents

一种mek1蛋白潜在抑制剂的筛选方法 Download PDF

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本发明实施例公开了一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)获取高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜，再将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱；(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用洗涤液进行洗涤，再采用洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为MEK1蛋白潜在的抑制剂。本发明通过将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱，使得细胞膜色谱柱不仅具有色谱的分离能力，同时兼具生物活性，使得本发明筛选方法具有较强的特异性，能够实现对MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选。

Description

一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法
技术领域
本发明实施例涉及分析化学技术领域，具体涉及一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法。
背景技术
二十世纪以来人类的生活环境污染日趋加剧、生活环境不断恶化、人们与致癌因素的接触越来越紧密，恶性肿瘤的发明率液逐年递增，恶性肿瘤已经超过心脑血管成为人类健康的最大敌人。
据北美癌症中心的最新数据显示，美国2017年新增癌症患者173万例，死亡人数约为61万人。GLOBOCAN统计显示，2012年全球共新增癌症患者1410万例，死亡人数约为820万人。中国癌症中心的汇总数据显示，中国每年新增约300万例癌症患者，肺癌、胃癌、肝癌、食管癌、肠癌、乳腺癌、宫颈癌等是中国发病率较高的癌症类型。
目前，天然药物在癌症治疗中做出巨大的贡献，在抗癌药物中的占比高达27％左右，如紫杉醇、多西他赛、长春瑞滨、榄香烯等等。虽然，已发现诸多具有抗肿瘤活性的成分，但由于特定靶向筛选方法的匮乏，导致抗肿瘤活性成分的作用机制和抑制靶点的研究存在极大的不足。
发明内容
为此，本发明实施例提供一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，以解决现有技术中由于特定靶向筛选方法的匮乏而导致的抗肿瘤活性成分的作用机制和抑制靶点的研究存在极大的不足的问题。
为了实现上述目的，本发明的实施方式提供如下技术方案：
在本发明的实施方式的第一方面中，提供了一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
(a)获取高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜，再将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱；
(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用洗涤液进行洗涤，再采用洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；
(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为 MEK1蛋白潜在的抑制剂。
本发明上述筛选方法通过将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱，使得细胞膜色谱柱不仅具有色谱的分离能力，同时兼具生物活性，使得本发明筛选方法具有较强的特异性；此外，通过选择高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜，保障了细胞膜上MEK1蛋白的含量，提高了本发明筛选方法的灵敏度；另外，本发明筛选方法操作简单，并能够实现快速分离。
本发明对高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜的获取方法不做严格限制，例如可以通过本领域的常规方法获取得到；优选地，通过如下方法得到：
选取高表达MEK1蛋白的细胞悬液，在800-1200r/min、4℃下离心 8-12min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的细胞；再采用生理盐水清洗高表达MEK1蛋白的细胞2-3遍；随后，加入45-55mM Tris-Hcl溶液，超声处理25-35min进行细胞破碎；将破碎后的细胞悬液在800-1200r/min、 4℃下离心4-6min，收集上清液并在10000-14000r/min、4℃下离心 18-22min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜。
在本发明的一个实施例中，所述高表达MEK1蛋白的细胞株为A549 细胞株。
进一步地，所述高表达MEK1蛋白的细胞株通过如下步骤制备得到：
在表达MEK1蛋白的细胞中，采用基因工程方法得到表达MEK1蛋白的基因，将基因克隆至真核表达载体上，再将真核表达载体转染至表达MEK1蛋白的细胞中，对转染细胞进行稳定筛选得到高表达MEK1蛋白的细胞株。
进一步地，所述高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜中MEK1蛋白含量为不小于100pg/ml。
在本发明的另一个实施例中，所述细胞膜色谱柱通过采用磷酸盐缓冲液重悬细胞膜，随后，向细胞膜悬液中添加硅胶，搅拌均匀，静置过夜，湿法装柱得到所述细胞膜色谱柱。
进一步地，所述细胞膜中蛋白含量与硅胶质量比为1∶(80-100)。
在本发明的又一个实施例中，所述洗涤采用的洗涤液体积为3-5个柱体积且洗涤速度为1-2ml/min；
进一步地，所述洗涤液为pH7.0的磷酸盐缓冲液。
本发明通过洗涤液即洗涤条件的限定，能够充分去除与细胞膜非特异性结合的物质，提高本发明筛选方法的准确性。
在本发明的再一个实施例中，所述洗脱采用洗脱液的体积为3-5个柱体积，洗脱速度为1-2ml/min。
进一步地，所述洗脱液为pH3-4的酸性磷酸盐缓冲液。
本发明通过上述特定的洗脱液和洗脱条件的限定，能够更好地将与细胞膜特异性结合的物质洗脱下来，提高本发明筛选方法的灵敏度。
根据本发明的实施方式，本发明具有如下优点：
(1)本发明上述筛选方法通过将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱，使得细胞膜色谱柱不仅具有色谱的分离能力，同时兼具生物活性，使得本发明筛选方法具有较强的特异性。
(2)本发明通过选择高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜，保障了细胞膜上MEK1蛋白的含量，提高了本发明筛选方法的灵敏度；另外，本发明筛选方法操作简单，筛选分离速度快。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
图1为本发明实验例1中浓度为1mg/ml的抑制剂AZD6244溶液采用实施例4的筛选方法得到的色谱图；
图2为本发明实验例1中抑制剂AZD6244标准液的色谱图；
图3为本发明实验例1中洗涤后溶液的色谱图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。
实验材料和设备：
A549细胞：来源苏州科技大学生物实验中心保存，馈赠；
抑制剂AZD6244：来源购自selleck公司；
高效液相色谱仪：型号1260；来源安捷伦公司。
实施例1
本实验例为一种高表达MEK1蛋白的细胞株的制备方法，该制备方法包括如下步骤：
(1)采用RNAzol试剂在A549细胞中提取总RNA，经微量紫外分光光度计测定浓度；随后，采用M-MLV反转录试剂盒，以oligo d(T)15 为引物，进行反转录，获得cDNA，并在-20℃下保存；再采用Taq酶进行PCR扩增，其中，上游扩增引物为5’-atgcccaagaagaagccgacgccca-3’；下游扩增引物为5’-gacgccagcagcatgggttggtgtg-3’；PCR反应条件为：95℃ 40s、61℃30s、72℃90s，共35个循环；然后，将PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，并回收，利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ在37℃下酶切1h；再将pEGFP-C1质粒经限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行处理，并回收酶切产物；采用T4-DNA连接酶将回收的酶切产物在16℃下连接过夜；再将连接产物，转化至大肠杆菌DH5α，并采用卡那霉素进行抗性筛选，获得单菌落，摇菌，抽提质粒；
(2)将处于对数生长期的A549细胞，消化，按106个细胞/ml，注 6孔板；待细胞处于对数生长期时，按照pEGFP-C1-MEK质粒1μg，阳离子脂质体转染试剂X-fect 0.3μl进行转染，转染48h，采用荧光倒置显微镜检测绿色荧光；随后，向转染细胞中加入1000ng/ml G418进行稳定筛选；获得高表达MEK1蛋白的A549细胞株。
实施例2
本实施例公开一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(a)收集高表达MEK1蛋白的A549细胞悬液，在800r/min、4℃下离心8min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的A549细胞；再采用生理盐水清洗高表达MEK1蛋白的A549细胞3遍；随后，加入55mM Tris-Hcl溶液，超声处理25min进行细胞破碎；将破碎后的细胞悬液在1200r/min、4℃下离心6min，收集上清液并在14000r/min、4℃下离心18min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜；采用磷酸盐缓冲液重悬细胞膜，再按照细胞膜中蛋白含量与硅胶质量比为1∶80，向细胞膜悬液中添加硅胶，搅拌均匀，静置过夜，湿法装柱得到细胞膜色谱柱；
(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用体积为3个柱体积的 pH7.0的磷酸盐缓冲液以2ml/min洗涤速度进行洗涤，再采用体积为5个柱体积的pH3的酸性磷酸盐缓冲液以1ml/min洗脱速度进行洗脱，并收集洗脱液；
(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为 MEK1蛋白潜在的抑制剂。
采用BCA法测定高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜中蛋白含量，具体测定步骤为：(a)加2μl样品到96孔板的样品孔中，采用标准品稀释液补足到20μl；(b)在样品孔中加入200μl BCA工作液，37℃放置 30分钟；(c)采用酶标仪测定570nm波长的吸光度；(e)根据标准曲线计算蛋白含量；根据上述方法计算得到高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜蛋白含量为103.6pg/ml。
实施例3
本实施例公开一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(a)收集高表达MEK1蛋白的A549细胞悬液，在1200r/min、4℃下离心12min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的A549细胞；再采用生理盐水清洗高表达MEK1蛋白的A549细胞2遍；随后，加入45mM Tris-Hcl溶液，超声处理35min进行细胞破碎；将破碎后的细胞悬液在800r/min、4℃下离心4min，收集上清液并在10000r/min、4℃下离心22min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜；采用磷酸盐缓冲液重悬细胞膜，再按照细胞膜中蛋白含量与硅胶质量比为1∶100，向细胞膜悬液中添加硅胶，搅拌均匀，静置过夜，湿法装柱得到细胞膜色谱柱；
(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用体积为5个柱体积的 pH7.0的磷酸盐缓冲液以1ml/min洗涤速度进行洗涤，再采用体积为3个柱体积的pH4的酸性磷酸盐缓冲液以2ml/min洗脱速度进行洗脱，并收集洗脱液；
(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为 MEK1蛋白潜在的抑制剂。
采用实施例2的检测方法，对上述得到的高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜上的蛋白含量进行检测，检测结果为102.3pg/ml。
实施例4
本实施例公开一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，该筛选方法包括如下步骤：
(a)收集高表达MEK1蛋白的A549细胞悬液，在1000r/min、4℃下离心10min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的A549细胞；再采用生理盐水清洗高表达MEK1蛋白的A549细胞3遍；随后，加入50mM Tris-Hcl溶液，超声处理30min进行细胞破碎；将破碎后的细胞悬液在1000r/min、4℃下离心5min，收集上清液并在12000r/min、4℃下离心20min，收集沉淀得到高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜；采用磷酸盐缓冲液重悬细胞膜，再按照细胞膜中蛋白含量与硅胶质量比为1∶90，向细胞膜悬液中添加硅胶，搅拌均匀，静置过夜，湿法装柱得到细胞膜色谱柱；
(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用体积为4个柱体积的 pH7.0的磷酸盐缓冲液以1.5ml/min洗涤速度进行洗涤，再采用体积为4 个柱体积的pH3.3的酸性磷酸盐缓冲液以1.5ml/min洗脱速度进行洗脱，并收集洗脱液；
(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为 MEK1蛋白潜在的抑制剂。
采用实施例2的检测方法，对上述得到的高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜上的蛋白含量进行检测，检测结果为103.1pg/ml。
实验例1
选取抑制剂AZD6244，并将抑制剂AZD6244配置成浓度为1mg/ml的溶液；
将上述溶液分别按照实施例4的筛选方法进行筛选；其中，高效液相色谱条件为：Dikma C18柱(150mm，4.6mm，5μm)；流动相为甲醇：5mM 磷酸盐缓冲液(60：40)；检测波长为203nM；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；高效液相色谱检测结果如图1所示：图1色谱图中分别在1.659min、 1.937min、2.659min、2.801min、6.523min和7.319min时出现色谱峰。
采用上述相同检测条件对抑制剂AZD6244标准品进行检测，检测结果如图2所示；图2色谱图中分别在1.655min、1.946min、2.657min、2.826min、 6.523min和7.319min时出现色谱峰。
采用上述相同检测条件对洗涤后的磷酸盐洗涤液进行检测，检测结果如图3所示；图3色谱图中分别在1.665min、1.927min、2.777min、3.041min、 5.444min、6.521min、7.317min、14.001min和14.959min时出现色谱峰。
由图1-3可知，本发明的筛选方法中能够筛选得到特异性结合的抑制剂AZD6244，而且未有其他非特异性结合物质，因此，本发明的筛选方法具有较强的特异性。
实验例2
本发明将抑制剂AZD6244分别配置成0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、 0.6mg/ml、0.8mg/ml浓度的溶液，并且分别采用实验例1的方法进行筛选检测，检测结果为，当抑制剂AZD6244浓度为0.2mg/ml及以下浓度时，在得到的色谱图7-8min时未见明显出峰；然而当抑制剂AZD6244浓度为 0.4mg/ml及以上浓度时，在得到的色谱图7-8min时具有明显出峰；由此可知，本发明筛选方法的灵敏度为0.4mg/ml。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种MEK1蛋白潜在抑制剂的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)获取高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜，再将细胞膜和硅胶制备得到细胞膜色谱柱；
(b)将待测样品置入细胞膜色谱柱内，采用洗涤液进行洗涤，再采用洗脱液进行洗脱，并收集洗脱液；
(c)采用高效液相色谱法分离检测洗脱液中物质，所得物质即为MEK1蛋白潜在的抑制剂；
所述细胞膜色谱柱通过采用磷酸盐缓冲液重悬细胞膜，随后，向细胞膜悬液中添加硅胶，搅拌均匀，静置过夜，湿法装柱得到所述细胞膜色谱柱，所述细胞膜中蛋白含量与硅胶质量比为1∶(80-100)；
所述洗涤采用的洗涤液体积为3-5个柱体积且洗涤速度为1-2ml/min，所述洗涤液为pH7.0的磷酸盐缓冲液；
所述洗脱采用洗脱液的体积为3-5个柱体积且洗脱速度为1-2ml/min，所述洗脱液为pH3-4的磷酸盐缓冲液；
所述高表达MEK1蛋白的细胞株为A549细胞株；
所述高表达MEK1蛋白的细胞株通过如下步骤制备得到：
在表达MEK1蛋白的细胞中，采用基因工程方法得到表达MEK1蛋白的基因，将基因克隆至真核表达载体上，再将真核表达载体转染至表达MEK1蛋白的细胞中，对转染细胞进行稳定筛选得到高表达MEK1蛋白的细胞株；
所述高表达MEK1蛋白的细胞株的细胞膜中MEK1蛋白含量为不小于100pg/ml。
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