KR101080185B1 - 자성 나노 클러스터를 이용한 자기력 기반 생체분자 분석 방법 - Google Patents

자성 나노 클러스터를 이용한 자기력 기반 생체분자 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적분자와 특이적으로 결합하는 제1생체분자로 각각 수식화된 마이크로비드와 자성 재료의 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법에 대한 것으로, 보다 구체적으로 상기 자성 재료가 (A) ① 상기 제1생체분자 및 ② 제2생체분자가 함께 이중 수식화된 자성 나노 입자를 준비하는 단계; (B) 상기 제2생체분자와 특이결합하는 복수개의 제3생체분자로 수식화된 링커와 상기 이중 수식화된 자성 나노 입자를 반응시켜 자성 나노 클러스터를 형성하는 단계; 및 (C) 제3생체분자와 결합하지 않은 제2생체분자의 결합 위치를 마스킹하는 단계;에 의해 형성된 자성 나노 클러스터(MNCs)인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 자기영동에 의한 표적분자의 분석에 자성 나노 물질 대신 자성 나노 클러스터를 이용하여 분석 한도를 크게 낮출 수 있으므로, 낮은 농도의 질병 biomarker를 포함한 표적분자의 분석에 용이하게 응용할 수 있다.
자기영동, 자성 나노 클러스터, 마이크로비드, 생체분자, 분석, 자기력

Description

자성 나노 클러스터를 이용한 자기력 기반 생체분자 분석 방법{Magnetophoretic assay of biomolecules using magnetic nanocluster}
본 발명은 매우 낮은 농도의 생체물질을 고감도로 검출 및 정량할 수 있는 자기력 기반의 생체분자 분석 방법에 관한 것이다.
신약개발이나 의료 진단을 위한 의학 및 생명과학 분야에서 대사산물이나 질병의 바이오마커(biomarker)와 같은 생체분자를 고감도로 검출하고 정량하는 방법의 개발이 강력하게 요구되고 있다. 이러한 생체분자의 분석을 위해서 결합 에세이(binding assay) 방법이 널리 사용되고 있으며, 면역분석(imMunoassay), DNA 혼성화(hybridization)나 수용체 기반 분석(receptor-based assay)이 이에 해당한다. 생체분자의 결합여부를 직접적으로 관측할 수 없기 때문에 결합 에세이에서는 표적분자(target molecule)의 존재 여부를 측정 가능한 신호로 나타낼 수 있도록 표지물질을 사용한다. 표지물질로는 방사성 물질, 형광물질, 효소표지(enzymatic label)나 자성물질 등을 사용할 수 있다.
자성물질(magnetic particles, MPs)은 자성에 의한 용이한 control, 높은 생체적합성(biocompatibility) 및 높은 감지능과 같은 장점으로 인하여 결합 에세이의 표지물질로 많은 주목을 받고 있다. 미국 특허 제5,981,297호에는 표적분자를 선택적으로 고정한 인식물질이 자성물질과 결합되는 경우 자기저항이 변화하는 것을 이용하여 표적분자를 분석하는 방법이 개시되어 있다. 또한, Kotitz 등(41차 annual conference on Magnetism and Magnetic Materials, Nov. 1996, abstract book p.73)은 자기입자들이 생물학적 인식과정에 의해 고정되었는지 여부를 초전도 양자 간섭소자(SQUID)를 이용하여 잔류자기, 이완시간(relaxation time) 및 자화율을 측정하여 분석하는 방법을 소개하였다. 이러한 방법들은 자기 나노입자의 자기장의 자속을 직접 측정하는 것으로 자속을 측정하기 위한 복잡한 고가의 장비가 필수적이며, 소형화가 어려운 문제가 있다.
자성을 띠고 있는 분자들에 자기장을 가해주는 경우 자성 물질의 이동 경로가 자기장에 의해 변화하는 것을 이용하여 자성물질을 검출하고 더 나아가 정량할 수 있으며 이러한 방법을 자기영동(magnetophoresis)라 한다. 보다 구체적으로, 도 1에 도시되어 있는 것과 같이 마이크로비드(12)와 자성 나노 입자(11)에 표적분자(14)와 특이적으로 결합할 수 있는 수용체 분자(13)를 각각 도입하면, 표적분자의 존재시에 자성 나노 입자-마이크로비드-표적분자의 반응물이 형성되며 이 반응물이 외부 자기장의 존재시에 경로가 변경되는 것을 이용하여 표적분자를 분석하는 것이다. 특히, 최근들어 자기영동(magnetophoresis)과 미세유체공학(microfluidic) 시스템과 융합하여 미세한 자기력의 형성만으로도 향상된 감도와 표적분자에 대한 높은 선택성으로 생체물질을 분석할 수 있게 되었다. 그러나, 더욱 낮은 농도의 생체물질을 검출하고 정량하는데 자기영동 방법을 활용할 수 있도록 하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하며, 자성 물질의 구조와 형태의 변형은 자성물질을 기반으로 한 생체 물질의 분석 성능을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.
자성입자는 외부 자기장의 존재 하에서 인접한 물 분자의 양자(proton)의 횡축 이완 시간(transverse relaxation time)을 크게 단축시킨다. 이러한 횡축 이완 속도는 자성 물질의 단면적과 비례하기 때문에 유효 단면적이 큰 자성 나노 입자의 다중체(multimer)나 자기조립체(self-assembly)와 같은 클러스터는 횡축 이완 속도가 훨씬 크고, 따라서 횡축 이완 시간의 단축 정도도 현저하게 짧아진다. 이렇게 MRI에서 단분산 자성입자와 클러스터의 횡축 이완 시간의 차이를 이용하여 표적분자를 분석하는 방법이 보고된 바 있다(Nat. Biotechnol. 2002, 20, 816~820; J. Am. Chem. Soc. 2002, 124, 2856~2857; J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 10192~10193) 즉, 분석하고자 하는 표적분자와 특이결합하는 생체물질이 결합된 자성입자는 표적분자가 존재하지 않는 경우에는 단분산 상태로 존재하나, 표적분자가 존재하면 클러스터를 형성하므로 횡축 이완 시간의 변화 여부를 측정하여 표적분자를 분석할 수 있다.
한편, 전립선특이항원(prostate specific antigen, PSA)은 전립선 암의 표지 자(biomarker)로서 널리 알려져 있으며, 최근 유방암의 잠재 표지자로 활용될 수 있음이 보고되고 있다. 그러나, 여성 혈청에서 PSA 수준(<40pg/mL)은 남성에서보다 1000배정도 낮으며, 통상적인 방법에 의해 이를 분석하는 것은 매우 어렵기 때문에 표지자로 활용하기 위해서는 보다 감도 높은 분석 방법이 필요하다.
본 발명은 대사산물이나 질병의 바이오마커와 같이 매우 낮은 농도로 존재하는 소량의 생체물질을 고감도로 빠르고 정밀하게 검출 및 정량할 수 있는 생체분자 분석 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
전술한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 표적분자와 특이적으로 결합하는 제1생체분자로 각각 수식화된 마이크로비드와 자성 재료의 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법에 있어서, 상기 자성 재료가 (A) ① 상기 제1생체분자 및 ② 제2생체분자가 함께 이중 수식화된 자성 나노 입자를 준비하는 단계; (B) 상기 제2생체분자와 특이결합하는 복수개의 제3생체분자로 수식화된 링커와 상기 이중 수식화된 자성 나노 입자를 반응시켜 자성 나노 클러스터를 형성하는 단계; 및 (C) 제3생체분자와 결합하지 않은 제2생체분자의 결합 위치를 마스킹하는 단계;에 의해 형성된 자성 나노 클러스터(MNCs)인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 '표적분자의 분석'이라 함은 단순히 시료 내에 표적분자가 존재하는지 여부에 대한 '검출'과 시료 내 생체분자 농도의 '정량'을 모두 일컫는다. 자기영동에 의한 표적분자의 분석은 종래 기술에 따라, 검출은 편향 속도(deflection velocity)의 변화 여부로, 정량은 각 실험 조건에서의 표적분자의 농도에 대한 deflection velocity의 표준곡선으로부터 이루어질 수 있다.
본 발명의 실시예의 MNCs를 이용한 자기영동 에세이(assay) 시스템을 도 1에 도시하였다. 도 1 및 실시예에서 상기 제1생체분자는 모노클로날 PSA 항체, 제2생체분자는 뉴트라비딘(neutravidin), 제3생체분자는 바이오틴(biotine)에 해당한다. 자성 나노 입자의 neutravidin은 BSA에 수식화된 biotine과 특이 결합에 의해 자성 나노 클러스터를 형성한다. 도 1에서 표적분자인 PSA가 존재하는 경우, 마이크로비드와 자성 나노 입자의 모노크로날 PSA 항체와 특이결합에 의해 마이크로비드-PSA-자성 나노 클러스터의 복합체를 형성하고, 자기영동시 외부 자기장의 영향으로 경로가 변경되게 된다. 따라서, 자기영동에서 deflection velocity의 변화 여부로 표적분자인 PSA를 검출하는 것이 가능하며, deflection velocity가 표적분자의 농도와 비례하므로 더 나아가 이를 정량할 수 있다.
하기 실시예 및 도 1에서는 표적분자로서 항원(단백질)인 PSA를 예로 설명하였으나 이에 한정되는 것은 아니며, DNA, RNA, 펩타이드, 지방, 탄수화물이나 호르몬, 치료제, 살충제와 같은 화학물질 역시 동일한 원리로 분석이 가능하다. 제1생 체분자 역시 표적분자와의 특이 결합이 가능한 것이라면 그 종류에 무관하게 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물 어느 것이라도 사용이 가능하며 이에 한정되는 것이 아님은 당연하다.
상기 제2생체분자는 제3생체분자와 특이결합에 의해 자성 나노 입자의 클러스터를 형성할 수 있는 것이라면 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물 중 어느 것이라도 무방하다. 제2생체분자가 DNA/RNA인 경우 제3생체분자는 제2생체분자 또는 그 단편과 상보적인 서열을 갖는 DNA/RNA일 수 있다. 마찬가지로 제2생체분자가 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물이라면 이와 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 제3생체분자로 사용할 수 있다. 예를 들어 제3생체분자가 본 발명의 실시예에서처럼 바이오틴이라면, 제2생체분자는 바이오틴과 특이결합을 할 수 있는 것이라면 어느 것이라도 무방하며, 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘(avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡트아비딘(captavidin)을 사용할 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.
상기 자성 나노 입자는 수~수십 나노미터의 크기를 갖는 자성 재료로서 종래 기술에 의한 자기영동에 적용할 수 있는 것이라면 어느 것이든지 사용이 가능하며, 종래 알려진 Fe2O3, Fe3O4 이나 이후 개발되는 어떠한 것을 적용하여도 무방하다.
상기 제3생체분자가 복수개 수식화된 링커에서 링커에 제3생체분자가 한 개만 수식화되어 있다면, 자성입자를 서로 연결시킬 수 없음은 자명하므로 두 개 이상의 제3생체분자가 수식화되어 있어야 한다. 수식화된 제3생체분자의 수는 두 개 이상이면 족하며, 제3생체분자가 무한개 수식될 수 있는 것이 아니라 링커의 종류나 제조 조건에 따라 수식화될 수 있는 제3생체분자의 개수가 결정될 것이므로 상한은 큰 의미는 없다. 본 발명의 실시예에서는 링커로 소혈청 알부민을 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 펩타이드나 DNA, 단백질 또는 알칸 사슬 등을 링커로 사용할 수 있다.
MNCs는 제2생체분자와 제3생체분자의 특이결합에 의해 형성되므로 MNCs를 형성시킨 후 링커에 수식화된 제3생체분자와 결합하지 않은 제2생체분자의 결합위치를 마스킹하여야 한다. 제2생체분자의 결합위치가 마스킹되지 않으면 시간의 경과에 따라 MNCs의 크기가 추가적으로 성장할 수 있으므로, deflection velcocity의 변화가 표적분자의 존재에 의한 것인지 MNCs의 성장에 의한 것인지 명확하지 않게 된다. 제2생체분자의 결합위치의 마스킹은 과량의 제3생체분자 자체(실시예에서는 바이오틴)를 추가하는 것에 의해 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시예에서 바이오틴 첨가 후 시간의 경과에 따른 T2 이완 시간(relaxation time)의 변화를 측정한 결과 MNPs의 총 농도가 대조군과 동일하였음에도 불구하고, D-biotin 첨가 후 30분 배양 시 감소하였다(도 3). 이 결과는 MNPs가 클러스터를 형성함에 따라 협동적 자성 상호작용(cooperative magnetic interaction)에 의해 T2 이완 속도가 빨라지는 것을 의미하며, 바이오틴이 표지된(biotinylated) BSA의 존재하에서 MNCs가 형성되는 것을 명확히 보여준다. 또한, T2 이완 시간은 추가적인 24시간 배양 동안 주목할 만한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 바이오틴이 DMNPs의 바이오틴 결합 위치를 차단하는 것에 의해 MNCs가 추가적으로 응집되는 것을 차단하는 데 효과적임을 보여준다.
마이크로비드의 deflection velocity는 MNCs의 크기와 관련이 있으며, MNCs의 크기는 클러스터를 형성하는 자성 나노 입자의 수에 비례할 것이다. 자기영동에서 deflection velocity의 변화가 클수록 미량의 표적분자를 검출할 수 있을 것이므로 MNCs를 구성하는 자성 나노 입자의 수는 표적분자의 검출능에 영향을 미친다. 표적분자의 분석에 대한 최적의 MNCs에서 자성 나노 입자의 평균 수 또는 MNCs의 크기는 사용한 마이크로비드, 제1생체분자, 표적분자, 자성 나노 클러스터에 따라 달라질 것이다. 이에 대한 최적의 조건을 선정하는 것은 당업자에게 용이할 것이다. 자성 나노 입자의 평균 수가 너무 적은 경우에는 클러스터 형성에 의한 효과가 충분하지 않을 것이다. 반면, 수가 너무 많은 경우에는 표적분자와의 결합위치가 가려지므로 특이적 결합을 통한 복합체 형성에 저해되고, 표적분자의 농도를 측정할 수 있는 범위(dynamic range)가 너무 좁아진다.
본 발명의 표적분자의 분석방법은 더 나아가 표적분자의 농도와 deflection velocity에 대한 표준 곡선으로부터 표적분자의 농도를 정량하는 데 이용할 수 있다. 하기 실시예에서 최적화된 MNCs를 사용하여 PSA의 자기영동 assay를 수행하였다(도 6). 비교를 위하여, MNCs 대신 DMNPs만을 사용하여 마이크로비드의 deflection velocity를 함께 측정하였다. 본 발명에 의해 MNCs를 이용하여 PSA를 분석한 검출한계는 45fg/mL로 DMNPs(~8pg/mL)를 사용한 경우에 비해 약 100배정도 높았다. DMNPs를 사용한 경우, PSA가 없을 때의 배경 속도(background velocity)는 0.86±0.2㎛/s이고, 농도 측정에 유효한 PSA 농도 범위는 4에서 100pg/m였다. 반면, MNCs를 사용한 경우의 background velocity는 0.16±0.2㎛/s로 낮아졌고, deflection velocity는 50fg/mL로부터 1.0pg/mL까지 비례하여 매우 낮은 농도의 표적분자를 효과적으로 정량할 수 있음을 확인하였다.
이상과 같이 본 발명에 의하면 자기영동에 의한 표적분자의 분석에 자성 나노 물질 대신 자성 나노 클러스터를 이용하여 검출 한도를 크게 낮출 수 있으므로, 낮은 농도의 질병 biomarker를 포함한 표적분자의 분석에 용이하게 응용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적인 목적일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 자성 나노 클러스터의 제조
1) 이중 수식화된 자성 나노 입자 ( dually-modified magnetic nanoparticles, DMNPs)의 제조
DMNPs의 합성을 위하여, 9 nm의 dimercaptosuccinic acid가 코팅된 iron oxide 자성 나노 입자를 neutravidin과 goat polyclonal anti-PSA로 컨쥬게이션 시켰다.
먼저 9nm 크기의 초상자성(superparamagnetic) iron oxide 나노 입자는 종래기술에 따라 합성하였다(J. Cheon, J Am Chem Soc. 2005, 127 (16), 573).
394 ㎍의 neutravidin(Pierce Chemical)과 200 ㎍의 goat polyclonal anti-human PSA(Fitzgerald Industries International)를 10 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.2)에 가하고 분자량 컷오프(cut-off)가 30kD인 마이크로필터(microfilter)를 이용하여 200㎕로 농축하였다. 이후, 10 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.4)를 이용하여 새로 제조한 2mg/mL 농도의 sulfo-succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate(sulfo-SMCC) (Pierce Chemical) 링커 용액 16 ㎕를 상기 단백질 용액에 가하고 30분간 상온에서 반응시켰다. 반응 후, 덱스트란 제염 컬럼(dextran desalting column, Pierce Chemical)을 사용하여 반응하지 않은 과량의 sulfo-SMCC를 제거하였다. 막여과기(membrane filter)를 사용하여 용출액을 300㎕로 농축하고 교반하면서 280 ㎕의 1.8 mg/mL iron oxide 자성 나노 입자 용액과 혼합하고 4℃에서 천천히 밤새 교반하였다. 단백질과 반응하지 않은 말레이미드(maleimide)기를 차단(block)하기 위하여, β-mercaptoethanol 22 ㎕(27 mM) 를 반응액에 넣고 15분간 상온에서 반응하였다. 최종적으로, 반응액을 superdex G-200 column을 통과시켜 과량의 단백질을 제거하였다.
DMNPs는 10 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.4)에서 4℃에 보관하며 사용하였다. 브레드포트 정량 방법(Bradfordassay method)에 의해 DMNP에 컨쥬게이션된 단백질을 계산한 결과, 세 개의 PSA 항체와 15 neutravidin 분자가 DMAP에 고정화된 것으로 예상되었다.
2) biotin이 수식화된 BSA(Biotinylated BSA)의 제조
자성 나노크러스터(MNCs)의 형성을 위한 멀티-암드 링커(multi-armed linker)로 사용하기 위하여, NHS-PEO4-Biotin(Pierce Chemical)으로 BSA를 biotin으로 수식하였다. NHS-PEO4-Biotin는 일차 아민과 반응하는 수용성 바이오틴 표지(biotinylation) 시약으로, 2.9 nm 길이의 친수성 폴리에틸렌 옥사이드 스페이서 암(polyethylene oxide spacer arm)을 갖는다.
보다 구체적으로, 100mM sodium phosphate 완충액(pH 7.4)에 20mg/mL 농도로 용해되어 있는 Bovine serum albumin(BSA, IgG free, Sigma-Aldrich) 용액 12㎕를 동일 완충액을 사용하여 2mg/mL의 농도로 사용 직전에 제조한 NHS-PEO4-Biotin 동일 부피와 혼합하였다. 반응 혼합물을 상온에서 서서히 흔들어주며 30분간 인큐베이션(incubation)하고 반응하지 않고 남은 과량의 NHS-PEO4-Biotin을 제거하기 위하여 5mL dextran desalting column(Pierce Chemical)에 로딩하였다. NHS-PEO4-Biotin를 완전히 제거하기 위하여 biotinylated BSA를 함유하는 용출액을 분자량 30 kD cut-off의 Microcon YM-30 micrfilter(Millipore Billerica, MA)로 5회 여과하였다. 바이오틴 결합 에세이(biotin binding assay, HABA; Sigma-Aldrich) 결과, 약 6개의 biotin 분자가 각각의 BSA에 컨쥬게이션된 것을 확인하였다.
3) 자성 나노 클러스터의 제조
DMNPs:biotynylated BSA=1:100인 경우, 560㎕의 10 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.4)을 100 ㎕의 410 nM DMNPs에 가하고 잘 혼합한 뒤 190 ㎕의 22 μM biotinylated BSA를 가하였다. 혼합 용액을 10분 간격으로 흔들어주며 30분간 인큐베이션 하였다. MNCs의 추가적인 성장을 차단하기 위하여, 150 ㎕의 1 mM D-biotin(Sigma-Aldrich) 용액을 가하여 반응하지 않은 biotin 결합 위치를 마스킹하였다.
과량의 D-biotin으로 반응하지 않은 biotin 결합위치를 2시간 동안 반응시킨 후, 4℃에 보관하며 사용하였다.
4) 시간의 경과에 따른 MNCs의 형성 확인
상기 실시예에서 시간의 경과에 따른 MNCs의 형성을 확인하기 위하여, D-biotin의 첨가 후 MNCs의 T2 relaxation time의 변화를 용액상에서 일정 시간 간격으로 측정하고 그 결과를 도 3에 도시하였다.
T2 relaxation time을 측정하기 위하여, 72mM 마이크로 코일(micro coil)의 4.7T BioSpin MRI (Bruker, Billerica, MA)로 하기 변수를 사용하여 MR 이미징 실험을 실시하여 MNCs 샘플의 T2-강조 MR 이미지(T2-weighted MR image)를 측정하였다; fast spin echo mode, point resolution 469㎛×469㎛; section thickness = 2.0mM; echo time (TE) = 2.878, 14.39, 29.78, 48.10, 66.19, 83.46, 103.61, 118.00, 132.39, 146.78, 161.17, 75.56, 189.95, 204.34ms; repetition time (TR) = 5,000 ms; number of acquisition = 1.
도 3에서 A1과 A2는 대조군으로서 각각 완충액과 DMNPs를, A3~A5, B1~B5 및 C1~C2는 순서대로 D-biotin 첨가 후 30min, 1h, 3h, 6h, 9h, 12h, 15h, 18h, 21h 및 24시간 후의 T2 relaxation을 측정한 결과이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이 MNCs의 T2 relaxation time은 용액에서 MNPs의 총 농도가 대조군과 동일하였음에도 불구하고, D-biotin 첨가 후 30분 배양 시 크게 감소하여 MNPs가 biotinylated BSA의 존재하에서 클러스터(MNCs)를 형성함을 나타내었다. 또한, T2 relaxation time은 추가적인 24시간 배양 동안 주목할 만한 변화를 나타내지 않았는데, 이는 D-biotin이 DMNPs의 biotin 결합 위치를 차단하는 것에 의해 MNCs가 추가적으로 응집(aggregation) 되는 것을 방해하는 데 효과적임을 나타낸다.
5) 자성 나노 클러스터의 크기 측정
상기 실시예에서 제조된 MNCs의 크기에 대해 더욱 상세한 정보를 얻기 위하여 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM, JEOL JEM-2100F)을 사용하여 MNCs의 이미지를 관측하였다.
300 메쉬 carbon-coated grid를 0.2mg/mL bacitracin 용액으로 90초간 전처리하고 즉시 용액으로부터 제거하여 파라핀 필름 위에 올려 놓았다. 동일 농도의 자성 나노 입자를 함유하는 DMNPs와 MNCs의 각 용액을 카본 격자(carbon grid)에 떨어드리고 90초간 인큐베이션하였다. 90초 후, 용액을 여과지로 carbon grid 가장자리에서 흡수하여 즉시 제거하였다. carbon grid를 상온에서 60분간 건조한 후 TEM image를 얻어 그 결과를 도 4에 도시하였다.
도 4의 (a)에서 확인할 수 있듯이 MNCs의 형성이 명확하게 관측되었으며 그 크기와 형태는 클러스터의 임의의 몰포로지(morphology)에 따라 주로 변화함을 알 수 있었다. 도 4의 (b)는 고배율로 관측한 이미지이다. MNCs의 TEM 이미지로부터, D-biotin의 첨가 24시간 후 MNCs의 크기는 60~80nm 범위이며 각 MNC 당 MNPs의 평균 수는 18±5(n=17)이었다. Biotinylated BSA가 없는 경우(c)에는 클러스터는 관측되지 않았다.
실시예 2 : 인간 PSA 항체가 컨쥬게이션된 마이크로비드의 제조
마우스 단일크로날 항-인간 PSA를 카르복실레이트(carboxylate)가 수식화된 적색 형광 마이크로 비드 (FluoSpheres, excitation 580 nm / emission 605 nm) (Molecular Probes)에 일반적인 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)cabodiimide (EDC, Sigma Aldrich) 와 Sulfo-N-hydroxysuccinimide (NHS, Peirce Chemical)에 의한 컨쥬게이션에 사용되는 방법을 이용하여 컨쥬게이션하였다. 즉, 20 ㎕의 적색 형광 마이크로비드(5.46×108 마이크로비드)를 100 mM MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 완충액(pH 6.0)에서 20 mM EDC와 60 mM Sulfo-NHS 170 ㎕로 상온에서 30분간 활성화 하였다. 반응 혼합물에 β-mercaptoethanol을 최종 농도가 400mM이 되도록 넣고 상온에서 5분간 인큐베이션하여 과량의 EDC를 소거(quenching)하였다. quenching 후 4℃에서 13,000g로 원심분리하고 상등액을 조심스럽게 따라낸 후 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4)로 3회 세척하여 마이크로비드를 수집하였다.
수집한 마이크로비드를 다시 6.7 mg/mL의 mouse monoclonal anti-human PSA(Fitzgerald Industries International)와 0.6 mg/mL의 BSA(Sigma-Aldrich)를 함유하는 50 mM sodium phosphate 완충액 (pH 7.4) 60㎕에 현탁하였다. 20초간 소니케이션한 후, 마이크로비드를 80rpm의 속도로 작동하는 자동화 믹서(automated mixer, Intelli Mixer, Korea)에 넣고 상온에서 4시간 인큐베이션한 후 4℃에서 밤새 교반하였다. 수집된 마이크로비드를 500 ㎕의 PBS(phosphate buffered saline)-TBN 완충액(1x PBS, 0.02% Tween 20, 1% BSA 및 0.05% sodium azide (NaN3), pH 7.4)로 5회 세척하고 동일 완충액에서 4℃에서 보관하며 사용하였다.
실시예 3 : 자기영동 assay
1) 미세유체 장비의 구축
마이크로비드의 deflection velocity를 측정하기 위한 미세유체 장비를 미세채널과 니켈 미세구조를 이용하여 하기의 방법에 의해 구축하였다.
미세유체 장비는 두개의 주입구와 하나의 배출구를 갖는 미세채널을 갖도록 고안되었다. 두개의 주입구에는 구멍을 통해 튜브가 삽입되어 있으며, 각각의 튜브에는 10㎕와 50㎕의 마이크로시린지(1700 series gastight syringes; Hamilton Company, Reno, NV)가 연결되어 듀얼 시린지 펌프(Pump 11 Pico Plus; Harvard Apparatus, Boston, MA)를 사용하여 수용액을 미세유체 채널로 펌핑할 수 있도록 한다. NdFeB 35 영구자석(50×25×10 mM3 and Br = 12,000 gauss (Magtopia, Seoul, Korea))를 미세채널로부터 2 mm 떨어진 위치에 위치시켜 자기장을 제공하였다. 미세유체 장비를 광원으로 50W 수은 램프가 있는 역상현미경(inverted microscope, Nikon, Tokyo, Japan)에 장착하였다. 역상 현미경에는 charge-coupled device (CCD) camera (Nikon, Tokyo, Japan)를 장착시켰다.
미세채널의 제작 과정은 도 5에 도시하였다. 미세채널은 통상의 poly(dimethylsiloxane) (PDMS) (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI) 몰딩(molding) 공정을 이용하여 제조하였으며, Ni 미세구조는 Pyrex 유리(glass) 와이퍼에 Ni을 전기도금하여 제조하였다.
먼저 Ni 미세구조 제조를 위하여, 크롬(500 Å) / 금(3000 Å) 씨앗층을 스퍼터링에 의해 glass 와이퍼에 순차적으로 증착하였다. THB-151N 네거티브 포토레지스트(negative photoresist) (JSR, Tokyo, Japan)를 사용하여 Ni 전기도금을 위한 몰드를 제조하고 UV를 조사한 뒤 THB-D2 현상액에서 현상한 후, 금 패턴 상에 Ni을 전기도금하였다. 전기도금 후, 약 40㎛ 높이로 Ni 미세구조를 만들기 위해 화학-기계적 연마(chemical mechanical polishing, CMP)를 행하였다. 이후, JSR THB-S1 박리액(stripper)에 의해 60℃에서 2시간 동안 PR을 박리하였다. 니켈 나노구조 주변의 glass 와이퍼를 열압축(thermal-compression method) 방법에 의해 제조한 40㎛ 두께의 PDMS 필름으로 코팅하였다. PDMS 필름의 높이는 Ni 나노구조와 같았다.
미세채널은, negative photoresist SU-8 2050 (MicroChem Corp, MA)를 PDMS 몰딩으로 사용하여 제조하였다. SU-8 PR의 패터닝 후, 제조된 PDMS 혼합물을 몰드에 붓고 100℃에서 2시간 동안 경화하였다. 생성된 미세채널은 넓이가 100㎛이고, 높이가 80㎛였다.
위의 방법으로 제조된 미세채널을 벗겨내어 공기 플라즈마 처리에 의해 PDMS 필름이 코팅된 니켈 나노구조상에 결합시켰다. 도 6은 제작된 미세채널의 현미경 사진이다.
2) 자기영동 assay를 위한 MNCs의 최적화
마이크로비드의 deflection velocity는 MNCs의 크기와 관련이 있으며, MNCs의 크기는 클러스터를 형성하는 자성 나노 입자의 수에 비례할 것이다. 자기영동에서 deflection velocity의 변화가 클수록 미량의 표적분자를 분석할 수 있을 것이므로 자기영동 assay에 응용하기 위한 MNCs의 형성을 최적화하기 위해, biotinylated BSA에 대한 DMNPs의 몰비를 변화시켜가며 MNCs를 제조하였다.
비율을 변화시키기 위하여, DMNP의 농도는 최종 농도 41nM로 고정하고, DMNP에 대한 biotylated BSA의 양을 1:1, 1:12, 1:25, 1:50 및 1:100으로 조정한 것을 제외하고는 실시예 1의 3)과 동일한 방법으로 MNCs를 구축하였다.
deflection velocity의 측정을 위하여, 실시예 2에서 제조한 인간 PSA 항체가 수식화된 마이크로비드 5㎕(약 5.7×104 비드)를 반응 완충액(1× PBS, 0.5 M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 7) 65㎕에 넣고 볼텍스(vortex)로 혼합한 후 15초간 소니케이션하였다. 10 pg/mL human PSA(Fitzgerald Industries International) 용액 10㎕를 첨가한 후 상온에서 10분간 인큐베이션하고, 위에서 제조한 MNCs 용액 5㎕을 넣어 10분간 추가로 인큐베이션 하였다.
결과의 마이크로비드를 함유하는 반응 혼합물을 1)에서 구축한 미세유체 장비의 주입구 중 한 곳으로, 완충 용액(1× PBS containing 0.5 M NaCl, 0.02% Tween 20, pH 7.4)을 다른 주입구로 듀얼 시린지 펌프(Pump 11 Pico Plus; Harvard Apparatus, Boston, MA)를 이용하여 2㎕/h로 동시 주입하였다. 마이크로비드의 움직임을 역상 현미경에 장착된 CCD 카메라를 사용하여 기록하였으며, 상품화된 측정 프로그램(i-Solution, IMT i-Solution Inc., Korea)으로 캡춰된 이동 파일을 이미지 프레임의 시리즈로 분리하였다. 얻어진 미세채널 이미지의 마이크로비드 위치로부터 deflection velocity를 결정하고 그 결과를 도 5에 도시하였다. deflection velocity는 도 2에서 자기장이 놓여진 방향, 즉, x 방향으로의 속도를 의미한다. 속도를 측정하기 위하여 약 15 마이크로비드의 운동을 기록하였으며 평균 속도와 표준편차를 계산하고 Vavg±σ의 범위로 마이크로비드의 속도를 다시 평균하였다. 세 번의 반복 실험으로부터 평균 속도를 구하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이, DMNP에 대한 biotylated BSA의 양이 점점 증가 할수록 deflection velocity가 증가하여 1:100일 때 가장 큰 값을 나타내었다.
3) PSA의 자기영동 assay에 의한 정량
MNCs를 사용한 PSA의 자기영동 assay를 위하여 PSA 용액을 농도별로 준비하였다. 즉, 0.1% BSA를 함유하는 PBS 완충액(pH 7.4)에 28㎍/mL의 PSA를 함유하도록 PSA 저장 용액(stock solution)을 제조한 후 저장 용액을 % BSA를 함유하는 pH 7.4의 PBS 완충액으로 순차적으로 희석하여 표준 농도의 PSA 용액을 제조하였다.
상기 방법으로 제조한 PSA 용액을 사용하여 반응용액을 제조하고, 2)와 동일한 방법에 의해 deflection velocity를 측정하였다. 비교를 위하여, 동일한 방법에 따라 MNCs 대신 DMNPs를 사용하였다. 미세유체 장비에 주입(injection)한 후, 속도를 측정하기 위하여 약 15 마이크로비드의 운동을 기록하였다. 각각 다른 PSA 농도에서 세 번의 반복 실험으로부터 평균 속도를 구하여 상관 곡선(correlation curve)를 구하였으며 그 결과를 도 6에 도시하였다.
도 6에서 확인할 수 있듯이, MNCs를 사용하였을 경우 마이크로비드의 deflection velocity는 DMNPs 첨가 시보다 민감도가 크게 증가하여 여성의 PSA 농도의 분석에 적합한 50fg/mL로부터 1.0pg/mL까지 비례하였다. 그러나 DMNPs가 첨가되면, 유사한 양상이 관측되었으나 dynamic range는 4에서 100pg/m로 변화하였다.
도 1은 종래기술의 자기영동에 의한 생체분자의 분석에서 마이크로비드와 자성 나노 입자가 표적분자의 존재하에 결합되는 것을 보여주는 모식도.
도 2는 본 발명의 자기영동에 의한 표적분자의 분석 과정을 보여주는 개요도.
도 3은 자성 나노 클러스터의 형성을 보여주는 전자투과현미경 사진.
도 4는 자성 나노 클러스터의 형성 반응에 의한 횡축 이완 시간의 변화를 보여주는 그래프.
도 5는 본 발명의 일실시예에 의한 미세채널의 제작 과정을 보여주는 순서도.
도 6은 본 발명의 일실시예에 의해 제조된 미세채널의 현미경 사진.
도 7은 DMNPs과 biotinylated BSA의 비율에 따른 deflection velocity의 변화를 보여주는 그래프.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 PSA의 정량 표준

Claims (6)

  1. 표적분자와 특이적으로 결합하는 제1생체분자로 각각 수식화된 마이크로비드와 자성 재료의 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법에 있어서,
    상기 자성 재료가,
    (A) ① 상기 제1생체분자 및 ② 제2생체분자가 함께 이중 수식화된 자성 나노 입자를 준비하는 단계;
    (B) 상기 제2생체분자와 특이결합하는 복수개의 제3생체분자로 수식화된 링커와 상기 이중 수식화된 자성 나노 입자를 반응시켜 자성 나노 클러스터를 형성하는 단계; 및
    (C) 제3생체분자와 결합하지 않은 제2생체분자의 결합 위치를 마스킹하는 단계;
    에 의해 형성된 자성 나노 클러스터(MNCs)인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 자성 나노 입자는 Fe2O3 또는 Fe2O4인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2생체분자는 DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 지방 또는 탄수화물인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 제2생체분자는 스트렙트아비딘(streptavidin), 아비딘 (avidin), 뉴트라비딘(neutravidin) 또는 캡트아비딘(captavidin)이고,;
    상기 제3생체분자는 바이오틴인 것을 특징으로 하는 자기영동에 의한 표적분자의 분석 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 링커는 펩타이드, DNA, 단백질 또는 알칸 사슬인 것을 특징으로 하는 표적분자의 분석 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 표적분자가 전립선특이항원(PSA)인 것을 특징으로 하는 표적분자의 분석 방법.
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