WO2022059462A1

WO2022059462A1 - 核酸配列計測方法、および核酸配列計測用キット

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Publication number: WO2022059462A1
Application number: PCT/JP2021/031566
Authority: WO
Inventors: 崇蓼沼; 祐樹宮内; 朋之田口
Original assignee: 横河電機株式会社
Priority date: 2020-09-17
Filing date: 2021-08-27
Publication date: 2022-03-24
Also published as: CN116113710A; JPWO2022059462A1; EP4215620A1; EP4215620A4; US20230323448A1

Abstract

ターゲット（５０）の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出部を有する検出プローブ（１０）と、前記ターゲット（５０）の核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有するラベル分子Ａ（２０）と、前記ラベル分子Ａ（２０）の核酸配列と相補的な核酸配列を有するラベル分子Ｂ（３０）と、を用い、前記ラベル分子Ａ（２０）と前記ラベル分子Ｂ（３０）のいずれか一方に蛍光分子を付加し、前記ラベル分子Ａ（２０）と前記ラベル分子Ｂ（３０）とを、少なくとも２個所以上で結合させて、前記ラベル分子Ａ（２０）と前記ラベル分子Ｂ（３０）との分岐構造体を形成させることにより、サンプル中に含まれる前記特定核酸配列を有するターゲット（５０）を計測する。

Description

核酸配列計測方法、および核酸配列計測用キット

　本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法および核酸配列計測用キットに関する。

　サンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する方法として、ＤＮＡマイクロアレイ（特定の核酸配列の相補配列を有する検出プローブが基板等の固相面に設けられたもの）を用いる方法が広く知られている。この方法は、ＤＮＡマイクロアレイに添加されたサンプルに含まれるターゲットが、ハイブリダイズ反応よりＤＮＡマイクロアレイの検出プローブに捕集される性質を利用してターゲットを計測する方法である。この方法では、ターゲットがサンプルに含まれるか否かに加えて、サンプルに含まれるターゲットの量を計測することができる。以下の非特許文献１及び特許文献１には、ＤＮＡマイクロアレイを用いてターゲットを計測する従来の計測方法が開示されている。

平山幸一ら、ＵＧＴ１Ａ１の遺伝子多型を判別するＤＮＡチップキットの開発、東洋鋼鈑　Ｖｏｌ．３８，５１－５６

特許第４４８２５５７号公報

　ところで、上記非特許文献１及び特許文献１に開示された方法はいずれも、ターゲットの検出を行う前にＤＮＡマイクロアレイを洗浄する工程が必要である。このような洗浄を行うと、計測結果の再現性が低下してしまうという問題がある。

　本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、簡易な工程で、サンプルに含まれるターゲットの計測結果の再現性に優れる核酸配列計測方法、及び核酸配列計測用キットを提供することにある。

　上記の目的を達成するために、本発明は以下の構成を採用した。
［１］　ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
　（ａ）前記ターゲットを含むサンプル溶液中に、ラベル分子Ａを添加するステップ、
　（ｂ）前記サンプル溶液中で、前記ターゲットと前記ラベル分子Ａとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｃ）前記サンプル溶液にラベル分子Ｂを添加するステップ、
　（ｄ）検出プローブが固定された基板の固相面に前記サンプル溶液を供給するステップ、
　（ｅ）前記検出プローブと、前記ターゲット、前記ラベル分子Ａ、及び前記ラベル分子Ｂとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｆ）前記固相面から、前記検出プローブに結合していない前記ターゲットと、前記ラベル分子Ａ及び前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体、及び前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体を分離するステップ、
および
　（ｇ）前記固相面に励起光を照射し、前記固相面からの蛍光量を計測するステップ、を含み、
　前記検出プローブは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列である検出部を有し、
　前記ラベル分子Ａは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、前記ラベル分子Ａと相補的な核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、
　前記蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている、
ことを特徴とする核酸配列計測方法。
［２］　前記ラベル分子Ａは、３’末端近傍にｘ部と、５’末端近傍にｙ部と、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部と、を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、３’末端近傍にＸ部と、５’末端近傍にＹ部とを有し、
　前記ｘ部の核酸配列は、前記Ｘ部の核酸配列と相補的であり、前記ｙ部の核酸配列は、前記Ｙ部の核酸配列と相補的であり、
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、又は、前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設け、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けることを特徴とする［１］に記載の核酸配列計測方法。
［３］　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｙ部を２以上設けることを特徴とする［２］に記載の核酸配列計測方法。
［４］　前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｙ部を２以上設けることを特徴とする［２］又は［３］に記載の核酸配列計測方法。
［５］　前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする［１］～［４］のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
［６］　前記蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの両方に付加されていることを特徴とする［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
［７］　金属微粒子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置に付加されていることを特徴とする［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
［８］　前記金属微粒子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする［７］に記載の核酸配列計測方法。
［９］　前記分離が、遠心分離であることを特徴とする［１］～［８］のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
［１０］　前記検出プローブと、前記ターゲット、前記ラベル分子Ａ、及び前記ラベル分子Ｂとのハイブリダイゼーション反応前後の蛍光量の変化から、ハイブリダイズした前記ターゲットの分子数を算出することを特徴とする［１］～［９］のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
［１１］　ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用キットにおいて、
　前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出部を有する検出プローブと、
　前記検出プローブが固定される固相面を有する基板と、
　前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有するラベル分子Ａと、
　前記ラベル分子Ａの核酸配列と相補的な核酸配列を有するラベル分子Ｂと、
を含み、
　前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、
　蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている、
ことを特徴とする核酸配列計測用キット。
［１２］　前記ラベル分子Ａは、３’末端近傍にｘ部と、５’末端近傍にｙ部と、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部と、を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、３’末端近傍にＸ部と、５’末端近傍にＹ部とを有し、
　前記ｘ部の核酸配列は、前記Ｘ部の核酸配列と相補的であり、前記ｙ部の核酸配列は、前記Ｙ部の核酸配列と相補的であり、
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、又は、前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設け、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けることを特徴とする［１１］に記載の核酸配列計測用キット。
［１３］　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｙ部を２以上設けることを特徴とする［１２］に記載の核酸配列計測用キット。
［１４］　前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｙ部を２以上設けることを特徴とする［１２］又は［１３］に記載の核酸配列計測用キット。
［１５］　前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする［１１］～［１４］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
［１６］　前記蛍光分子が、前記ラベル分子Ａ及び前記ラベル分子Ｂの両方に付加されていることを特徴とする［１１］～［１５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
［１７］　金属微粒子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置に付加されていることを特徴とする［１１］～［１５］のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
［１８］　前記金属微粒子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする［１７］に記載の核酸配列計測用キット。

　本発明によれば、簡易な工程で、サンプルに含まれる計測結果の再現性に優れる核酸配列計測方法、及び核酸配列計測用キットを提供することができるという効果がある。

ラベル分子Ａの構成例を示す図である。ラベル分子Ｂの構成例を示す図である。ラベル分子Ａとラベル分子Ｂとが結合することにより形成された分岐構造を繰り返し持つ構造を示す図である。ターゲットを検出する原理を模式的に示す図である。蛍光読取装置を示す構成図である。実施例で用いたラベル分子Ａの構成を示す図である。実施例で用いたラベル分子Ｂの構成を示す図である。実施例において、ターゲットを含むサンプル及びターゲットを含まないサンプルをハイブリダイゼーション反応させたときのスポット光量を示す図である。実施例において、マイクロアレイを遠心分離する前と後の溶液の背景光の光量を示す図である。

　以下、図面を参照して本発明の実施形態による核酸配列計測方法および核酸配列計測用キットについて詳細に説明する。以下では、まず本発明の実施形態の概要について説明し、続いて本発明の実施形態の詳細について説明する。

〔概要〕
　本発明の実施形態は、簡易な工程で、サンプルに含まれるターゲットの計測結果の再現性を向上させることができるようにするものである。上述した非特許文献１には、ＤＮＡサンプルに蛍光修飾プライマーを用いてＰＣＲを行った蛍光修飾されたＰＣＲ産物を、ＤＮＡマイクロアレイに添加してハイブリダイズ反応させ、サンプル中のターゲットを検出する方法が開示されている。また、上述した特許文献１には、検出光量を増加させる手段として、多数の蛍光分子をラベリングして検出光量を増加させる方法が開示されている。

　しかしながら、上述した非特許文献１に開示された方法では、ターゲットとなるＤＮＡサンプルへの蛍光分子の修飾が必要であり、また、検出の前に、ＤＮＡマイクロアレイの洗浄工程が必要であるため、工程が煩雑となる。また、ＤＮＡマイクロアレイの洗浄の仕方によっては、シグナルの低下やバックグラウンドの光量増加が生じたり、洗浄のムラによる固相面内でのシグナルのムラが発生したりする。これらは、計測結果の再現性を低下させる要因となる。また、特許文献１の方法では、検出前の固相面の洗浄が必要であり、上述した非特許文献１と同様に、洗浄に伴う計測結果の再現性の低下の問題がある。

　本実施形態のターゲット計測方法は、まず、ターゲットを含むサンプル溶液中にラベル分子Ａを添加して、ターゲットとラベル分子Ａとをハイブリダイゼーション反応させる。次に、サンプル溶液にラベル分子Ｂを添加する。次いで、検出プローブが固定された基板の固相面にサンプル溶液を供給し、検出プローブと、ターゲット、ラベル分子Ａ、及びラベル分子Ｂとをハイブリダイゼーション反応させる。続いて、固相面から、検出プローブに結合していないターゲットと、ラベル分子Ａ及びラベル分子Ｂとからなる凝集体、及びラベル分子Ａとラベル分子Ｂとからなる凝集体を分離する。そして、固相面に蛍光を照射し、固相面からの蛍光量を計測する。

　ここで、検出プローブは、ターゲットの核酸配列と相補的な配列である検出部を有している。また、ラベル分子Ａは、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有しており、ラベル分子Ｂは、ラベル分子Ａと相補的な核酸配列を有している。ラベル分子Ａとラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、蛍光分子が、ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている。

　これにより、簡易な工程で、サンプルに含まれるターゲットの計測結果の再現性を向上させることができる。具体的には、ターゲットとなる核酸のラベリング工程が不要なうえ、検出工程前の洗浄工程を省略することによって、洗浄工程の不備による性能悪化、光量低下、背景光上昇、あるいはバラつきの発生等を回避することが可能となる。従来の手法では、洗浄の仕方や、洗浄度、洗浄のムラなどに起因するシグナルや背景光の上昇とバラつきのリスクが発生するが、本発明によればこのようなリスクを回避できる。それによりアレイ面上でより均一な結果を得ることができ、検出の再現性も向上する。また、ターゲットがハイブリダイズした検出プローブに結合する蛍光分子の数を増加させることにより、検出光量を増加させることができることにより、検出感度を向上させることができる。

〔実施形態〕
〈核酸配列計測方法〉
　本発明の核酸配列計測方法は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
　（ａ）前記ターゲットを含むサンプル溶液中に、ラベル分子Ａを添加するステップ、
　（ｂ）前記サンプル溶液中で、前記ターゲットと前記ラベル分子Ａとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｃ）前記サンプル溶液にラベル分子Ｂを添加するステップ、
　（ｄ）検出プローブが固定された基板の固相面に前記サンプル溶液を供給するステップ、
　（ｅ）前記検出プローブと、前記ターゲット、前記ラベル分子Ａ、及び前記ラベル分子Ｂとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｆ）前記固相面から、前記検出プローブに結合していない前記ターゲットと、前記ラベル分子Ａ及び前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体、及び前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体を分離するステップ、
および
　（ｇ）前記固相面に励起光を照射し、前記固相面からの蛍光量を計測するステップ、を含み、
　前記検出プローブは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列である検出部を有し、
　前記ラベル分子Ａは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、前記ラベル分子Ａと相補的な核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、
　蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている、
ことを特徴とする。

　ラベル分子Ａは、３’末端近傍にｘ部と、５’末端近傍にｙ部と、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部と、を有する。ラベル分子Ｂは、３’末端近傍にＸ部と、５’末端近傍にＹ部とを有する。前記ｘ部の核酸配列は、前記Ｘ部の核酸配列と相補的であり、前記ｙ部の核酸配列は、前記Ｙ部の核酸配列と相補的である。

　なお、本発明において相補的であるとは、一方の核酸配列が、他方の核酸配列と２本鎖状態を形成することのできる核酸配列を持つことを意味し、必ずしも完全に相補的である必要はなく、いくつかのミスマッチ塩基対を含んでいてもよい。

　ｘ部は、ラベル分子Ａの３’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ａの３’末端から数塩基に位置する。
　ｙ部は、ラベル分子Ａの５’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ａの５’末端から数塩基に位置する。
　Ｘ部は、ラベル分子Ｂの３’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ｂの３’末端から数塩基に位置する。
　Ｙ部は、ラベル分子Ｂの５’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ｂの５’末端から数塩基に位置する。

　ラベル分子Ａにおいて、ｚ部は、ｘ部又はｙ部の全部又は一部と重複していても、重複していなくてもよい。

　ラベル分子Ａが、ターゲットの核酸配列と相補的な配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部を有していることによって、ラベル分子Ａのｚ部に結合したターゲットが、固相上に固定された検出プローブの検出部に結合することができる。

　ラベル分子Ａ中には、ｘ部とｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けているか、ラベル分子Ｂ中には、Ｘ部とＹ部のいずれか一方又は両方を２以上設けているか、又は、ラベル分子Ａ中に、ｘ部とｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設け、ラベル分子Ｂ中に、Ｘ部とＹ部のいずれか一方又は両方を２以上設けている。例えば、ラベル分子Ａにｙ部を２以上設けてもよく、ラベル分子Ｂ中にＹ部を２以上設けてもよく、ラベル分子Ａにｙ部を２以上設け、ラベル分子ＢにＹ部を２以上設けてもよい。
　ｘ部の核酸配列はＸ部と相補的であり、ｙ部の核酸配列はＹ部と相補的であるため、ラベル分子Ａのｘ部がラベル分子ＢのＸ部と結合し、ラベル分子Ａのｙ部がラベル分子ＢのＹ部と結合する結果、複数のラベル分子Ａとラベル分子Ｂとが分岐構造を繰り返し持つ構造を形成する。

　ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置には、蛍光分子が付加されている。蛍光分子は、ラベル分子Ａ又はラベル分子Ｂの先端に付加されていなくてもよく、ラベル分子Ａ又はラベル分子Ｂの途中に位置していてもよい。また、蛍光分子は、複数種類・複数個所に付加されていてもよい。蛍光分子を複数個所に付加することにより、検出する際の蛍光量を増加させることができ、より高感度な検出が可能となる。

　蛍光分子としては、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加することができるものであれば、特に制限はないが、例えば、ＥＤＡＮＳ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、ＦＡＭ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ２（登録商標）、ＴＦ２、ＴＦ３、ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＴＥＴ、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　５３２、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６１０、Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（登録商標）　６４７、ＡＴＴＯ５３２、ＡＴＴＯ６３３、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５８５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、ｉＦｌｕｏｒＴＭ５３２、ｉＦｌｕｏｒＴＭ６４７等の公知の蛍光分子が挙げられる。

　図１は、ラベル分子Ａの構造の一例を示した図である。図１では、ラベルＡ分子は、ｘ部２２、ｙ部２３がそれぞれ１つ設けられており、３’末端に蛍光分子２１が付加されている。
　図２は、ラベル分子Ｂの構造の一例を示す図である。図２では、ラベル分子ＢにＸ部３２が１つ、Ｙ部３３が２つ設けられており、５’末端に金属微粒子３１が付加されている。

　図３は、図１に示したラベル分子Ａと図２に示したラベル分子Ｂが結合した状態を示す。ラベル分子Ａのｘ部がラベル分子ＢのＸ部と結合し、ラベル分子Ａのｙ部がラベル分子ＢのＹ部と結合した結果、図３に示すように、複数のラベル分子Ａとラベル分子Ｂとが分岐構造を繰り返し持つ構造を形成する。

　蛍光分子は、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの両方に付加されていてもよい。蛍光分子をラベル分子Ａとラベル分子Ｂの両方に付加することにより、検出する際の蛍光量を増加させることができる。
　ラベル分子Ａとラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置には、金属微粒子が付加されていてもよい。金属微粒子が、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂのいずれか一方に付加されていることにより、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂとが結合し、分岐構造を有する凝集体を形成したとき、該凝集体に重量を付加することができるため、遠心分離により分離しやすくなる。また、該凝集体に磁性を付与することができるため、磁力により該凝集体を分離することが可能になる。金属微粒子は、ラベル分子Ａ又はラベル分子Ｂの先端に付加されていても、途中の位置に付加されていてもよい。また、金属微粒子は、複数種類・複数個所に付加されていてもよい。金属微粒子を複数個所に付加することにより、該凝集体の重量や磁性を増加させることができ、遠心分離や磁力によって、より分離しやすくすることができる。

　金属微粒子としては、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置に付加できれば、特に制限はないが、例えば、金ナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄、黒色シリカ粒子等が挙げられる。金属微粒子の粒径は、金属微粒子が、溶液中で分散性が高く、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーション反応の障害にならず、遠心分離で沈殿可能な密度又は質量となる粒径であることが好ましい。溶液中で分散性が高いためには、酸化鉄粒子の場合は粒径が１００ｎｍ以下、金ナノ粒子の場合は粒径が１５ｎｍ以下であることが好ましいが、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーション反応の障害とならないためには、粒径は、小さい方が好ましい。

　以下に上記各ステップについて説明する。図４は、本発明の核酸配列計測方法の原理を模式的に示した図である。
　まず、目的とする特定の核酸配列を有するターゲット５０を含むサンプル溶液の調製を行う。サンプル溶液の調製において、特定の核酸配列を有する核酸（ターゲット５０）の増幅を行ってもよい。

　遺伝子の増幅を行った段階で、遺伝子が増幅されたか否かを確認する試験を行い、遺伝子が増幅されている場合にのみ、後述するハイブリダイゼーション反応を行うようにしてもよい。

　なお、遺伝子の存在の有無を検査するタイミングは、増幅終了後に限定されず、増幅反応中であってもよい。検査の手法としては、電気泳動、抗原抗体反応、質量分析やリアルタイムＰＣＲ法などを適宜、利用することができる。

　また、核酸（ターゲット５０）はタンパク質や糖鎖などに結合させても良い。この場合には、核酸（ターゲット５０）に対するタンパク質や糖鎖などの相互作用が確認できる。

　前記ターゲット５０を含むサンプル溶液中に、ラベル分子Ａ（２０）を添加する（ステップ（ａ））。その後、ターゲット５０を含むサンプル溶液中で、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させる（ステップ（ｂ））。

　ターゲット５０を含むサンプル溶液中で、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させると、ターゲット５０がラベル分子Ａ（２０）のｚ部２４に結合する。

　ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させた後、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とを含むサンプル溶液にラベル分子Ｂ（３０）を添加する（ステップ（ｃ））。その後、検出プローブ１０が固定された固相面１００に、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とを含むサンプル溶液にラベル分子Ｂ（３０）を添加した溶液を供給する（ステップ（ｄ））。

　次に、検出プローブ１０と、ターゲット５０、ラベル分子Ａ（２０）、及びラベル分子Ｂ（３０）とをハイブリダイゼーション反応させる（ステップ（ｅ））。検出プローブ１０と、ターゲット５０、ラベル分子Ａ（２０）、及びラベル分子Ｂ（３０）とをハイブリダイゼーション反応させると、ステップ（ｂ）において、ターゲット５０に結合したラベル分子Ａ（２０）のｘ部２２がラベル分子Ｂ（３０）のＸ部３２と結合し、ターゲット５０に結合したラベル分子Ａ（２０）のｙ部２３がラベル分子Ｂ（３０）のＹ部３３と結合する結果、複数のラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）が分岐構造を繰り返し持つ分岐構造体を形成し、この分岐構造体にターゲット５０が結合した、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる構造体が形成され、該構造体のターゲット５０が、固相面１００に固定された検出プローブ１０の検出部１３に結合する。

　ステップ（ｂ）で、ターゲット５０に結合しなかったラベル分子Ａ（２０）も、ラベル分子Ａ（２０）のｘ部２２がラベル分子Ｂ（３０）のＸ部３２と結合し、ラベル分子Ａ（２０）のｙ部２３がラベル分子Ｂ（３０）のＹ部３３と結合する結果、複数のラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）が分岐構造を繰り返し持つ分岐構造体を形成し、ラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を形成して溶液中に遊離状態で存在する。

　次に、固相面１００から、検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を分離する（ステップ（ｆ））。固相面１００から前記凝集体を分離する方法としては、遠心分離が好ましい。検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体は、遠心分離により固相面１００から分離することができる。また、ラベル分子Ａ（２０）又はラベル分子Ｂ（３０）のいずれか一方に、金属微粒子３１を付加した場合は、磁力によって、検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を分離することができる。ステップ（ｆ）において、洗浄によらないで検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を除去できるため、洗浄の影響を排した状態での光量が計測できる。

　次に、固相面１００に励起光を照射し、固相面１００からの蛍光を蛍光読取装置６０で計測する（ステップ（ｇ））。
　蛍光読取装置６０で、検出プローブ１０が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット５０）の有無を確認することができ、またハイブリダイズした対象核酸（ターゲット５０）を定量することができる。
　また、蛍光読取装置６０を用いることにより、同一座標のハイブリダイズ前後の画像が取得でき、また同時刻の波長で分離された蛍光画像を取得することができ、蛍光画像を解析することにより、ハイブリダイゼーション反応したターゲット５０の分子数を算出することもできる。

　また、ハイブリダイゼーション反応前後の蛍光分子２１の蛍光変化量から、ハイブリダイゼーション反応したターゲット５０の分子数を算出することができる。例えば、既知の分子数を有するターゲット５０の標準液を用いてハイブリダイゼーション反応を行い、反応前後の蛍光分子２１の蛍光変化量を計測して、分子数と蛍光変化量の関係を示した検量線を予め作成しておく。この検量線と、サンプルを用いたハイブリダイゼーション反応前後の蛍光分子２１の蛍光変化量とから、ハイブリダイゼーション反応したターゲット５０の分子数を算出することができる。

　検出プローブが固定される固相面は基板上の平面に限られない。検出プローブをビーズ表面に固定してもよい。ビーズの表面に検出プローブを固定することにより、検出プローブがビーズを中心として放射状に広がった形状となる。この場合、プローブを固定する固相面の表面積が大きくなり、単位面積当たりのプローブ量を増やすことができる。また、検出対象分子を捕集したビーズをその大きさや磁気等で回収することで、検出対象分子の選択的な回収も可能となる。回収した分子は後工程における別の試験などに使用可能となる。

〈核酸配列計測用キット〉
　次に、本発明の核酸配列計測用キットについて説明する。本発明の核酸配列計測用キットは、本発明の核酸配列計測方法に用いることができる。

　本実施形態の核酸配列計測用キットは、検出対象となる核酸であるターゲット５０の核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出部１３を有する検出プローブ１０と、検出プローブ１０が固定される固相面１００を有する基板と、ターゲット５０の核酸配列と相補的な核酸配列であって、検出部１３の核酸配列とは異なる核酸配列を有するラベル分子Ａと、ラベル分子Ａの核酸配列と相補的な核酸配列を有するラベル分子Ｂと、を含む。ラベル分子Ａとラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、蛍光分子２１が、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている。蛍光分子２１としては、前記したものが挙げられる。

　ラベル分子Ａは、図１に示すように、３’末端近傍にｘ部２２と、５’末端近傍にｙ部２３と、ターゲット５０の核酸配列と相補的な核酸配列であって、検出部１３の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部２４と、を有する。ラベル分子Ｂは、図２に示すように、３’末端近傍にＸ部３２と、５’末端近傍にＹ部３３とを有する。ｘ部２２の核酸配列は、Ｘ部３２の核酸配列と相補的であり、ｙ部２３の核酸配列は、Ｙ部３３の核酸配列と相補的である。

　ｘ部２２は、ラベル分子Ａの３’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ａの３’末端から数塩基に位置する。
　ｙ部２３は、ラベル分子Ａの５’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ａの５’末端から数塩基に位置する。
　Ｘ部３２は、ラベル分子Ｂの３’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ｂの３’末端から数塩基に位置する。
　Ｙ部３３は、ラベル分子Ｂの５’末端の近傍に位置し、ラベル分子Ｂの５’末端から数塩基に位置する。

　ラベル分子Ａにおいて、ｚ部２４は、ｘ部２２又はｙ部２３の全部又は一部と重複していても、重複していなくてもよい。

　ラベル分子Ａが、ターゲット５０の核酸配列と相補的な配列であって、検出部１３の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部２４を有していることによって、ラベル分子Ａのｚ部２４に結合したターゲット５０が、基板の固相面１００に固定された検出プローブ１０の検出部１３に結合することができる。

　ラベル分子Ａ中には、ｘ部２２とｙ部２３のいずれか一方又は両方を２以上設けているか、ラベル分子Ｂ中には、Ｘ部３２とＹ部３３のいずれか一方又は両方を２以上設けているか、又は、ラベル分子Ａ中に、ｘ部２２とｙ部２３のいずれか一方又は両方を２以上設け、ラベル分子Ｂ中に、Ｘ部３２とＹ部３３のいずれか一方又は両方を２以上設けている。例えば、ラベル分子Ａにｙ部２３を２以上設けてもよく、ラベル分子Ｂ中にＹ部３３を２以上設けてもよく、ラベル分子Ａにｙ部２３を２以上設け、ラベル分子ＢにＹ部３３を２以上設けてもよい。
　ｘ部２２の核酸配列はＸ部３２と相補的であり、ｙ部２３の核酸配列はＹ部３３と相補的であるため、ラベル分子Ａのｘ部２２がラベル分子ＢのＸ部３２と結合し、ラベル分子Ａのｙ部２３がラベル分子ＢのＹ部３３と結合する結果、複数のラベル分子Ａとラベル分子Ｂが分岐構造を繰り返し持つ構造を形成する。

　ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置には、蛍光分子２１が付加されている。蛍光分子２１は、ラベル分子Ａ又はラベル分子Ｂの先端に付加されていなくてもよく、ラベル分子Ａ又はラベル分子Ｂの途中に位置していてもよい。また、蛍光分子２１は、複数種類・複数個所に付加されていてもよい。蛍光分子２１を複数個所に付加することにより、検出する際の蛍光量を増加させることができ、より高感度な検出が可能となる。

　蛍光分子２１は、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂの両方に付加されていてもよい。蛍光分子２１をラベル分子Ａとラベル分子Ｂの両方に付加することにより、検出する際の蛍光量を増加させることができる。
　ラベル分子Ａとラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置には、金属微粒子３１が付加されていてもよい。金属微粒子３１が、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂのいずれか一方に付加されていることにより、ラベル分子Ａとラベル分子Ｂとが結合し、分岐構造を有する凝集体を形成したとき、該凝集体に重量を付加することができるため、遠心分離により分離しやすくなる。また、該凝集体に磁性を付与することができるため、磁力により該凝集体を分離することが可能になる。金属微粒子３１は、ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの先端に付加されていても、途中の位置に付加されていてもよい。また、金属微粒子３１は、複数種類・複数個所に付加されていてもよい。金属微粒子３１を複数個所に付加することにより、該凝集体の重量や磁性を増加させることができ、遠心分離や磁力によって、より分離しやすくすることができる。金属微粒子３１としては、前記したものが挙げられる。

　本発明の核酸配列計測用キットは、さらに、ターゲットを定量するために必要な標準液、必要な緩衝液、製品説明書等を含んでいてもよい。

〈核酸配列計測用キットの使用方法〉
　次に、本発明の核酸配列計測用キットの使用方法について説明する。

（１）溶液調製
　まず、検出プローブ１０を含むプローブ溶液を調製し、プローブ濃度を調整する。

（２）固相面への固定
　次に、プローブ溶液を基板の固相面１００にスポットして、検出プローブ１０を基板の固相面１００に固定化する。

（３）洗浄
　次に、固相面１００を洗浄し、固定化されていない余剰のプローブを除去する。以上の手順により、検出プローブが固相面１００に固定された基板が製造される。

（４）サンプル溶液の調製
　次に、目的とする特定の核酸配列を有するターゲット５０を含むサンプル溶液の調製を行う。サンプル溶液の調製において、特定の核酸配列を有する核酸（ターゲット５０）の増幅を行ってもよい。

（５）ターゲットとラベル分子Ａのハイブリダイゼーション反応
　次に、（４）で調製したターゲット５０を含むサンプル溶液中に、ラベル分子Ａ（２０）を添加する。その後、ターゲット５０を含むサンプル溶液中で、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させる。ターゲット５０を含むサンプル溶液中で、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させると、ターゲット５０がラベル分子Ａ（２０）のｚ部２４に結合する。

（６）検出プローブとターゲットとラベル分子Ａとラベル分子Ｂとのハイブリダイゼーション反応
　ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とをハイブリダイゼーション反応させた後、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とを含むサンプル溶液にラベル分子Ｂ（３０）を添加する。その後、検出プローブ１０が固相面１００に固定された基板に、（４）で調製したターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とを含むサンプル溶液にラベル分子Ｂ（３０）を添加した溶液を供給し、固相面１００に固定された検出プローブ１０と、ターゲット５０、ラベル分子Ａ（２０）、及びラベル分子Ｂ（３０）とをハイブリダイゼーション反応させる。固相面１００に固定された検出プローブ１０と、ターゲット５０、ラベル分子Ａ（２０）、及びラベル分子Ｂ（３０）とをハイブリダイゼーション反応させると、ターゲット５０に結合したラベル分子Ａ（２０）のｘ部２２がラベル分子Ｂ（３０）のＸ部３２と結合し、ターゲット５０に結合したラベル分子Ａ（２０）のｙ部２３がラベル分子Ｂ（３０）のＹ部３３と結合する結果、複数のラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）が分岐構造を繰り返し持つ分岐構造体を形成し、この分岐構造体にターゲット５０が結合した、ターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる構造体が形成され、該構造体のターゲット５０が、固相面１００に固定された検出プローブ１０の検出部１３に結合する。

（７）凝集体の分離除去
　次に、固相面１００から、検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を分離する。固相面１００から前記凝集体を分離する方法としては、遠心分離が好ましい。ラベル分子Ａ（２０）又はラベル分子Ｂ（３０）のいずれか一方に、金属微粒子３１を付加した場合は、遠心分離の他、磁力によって、検出プローブ１０に結合していないターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体、及びラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とからなる凝集体を分離することができる。

（８）蛍光の検出
　次に、検出プローブ１０にターゲット５０とラベル分子Ａ（２０）とラベル分子Ｂ（３０）とが結合した固相面１００に励起光を照射し、固相面１００から放射される蛍光を蛍光読取装置６０で検出する。
　蛍光読取装置６０により、検出プローブ１０が蛍光を呈するか否かでサンプル中の対象核酸（ターゲット５０）の有無を確認することができ、またハイブリダイズした対象核酸（ターゲット５０）を定量することができる。
　また、蛍光読取装置６０を用いることにより、同一座標のハイブリダイズ前後の画像が取得でき、また同時刻の波長で分離された蛍光画像を取得することができ、蛍光画像を解析することにより、ハイブリダイゼーション反応したターゲット５０の分子数を算出することもできる。

　図５は蛍光読取装置６０を示す構成図である。蛍光読取装置６０はＤＮＡチップ４０のターゲット５０が検出プローブ１０にハイブリダイズする前後の画像を取得するため、ハイブリダイズ前の画像を取得後、温調ステージ８２によりＤＮＡチップ４０の温度を上昇させてハイブリダイゼーション反応を進行させ、再び常温に下げた状態でハイブリダイズ後の画像を取得する。

　温調ステージ８２は、ターゲット５０と検出プローブ１０とのハイブリダイゼーションを促進するために、ターゲット５０と検出プローブ１０との反応中に、振とうまたはＤＮＡチップ４０の回転、ボルテックスミキサー等による撹拌機能があることが好ましい。

　蛍光読取装置６０の光学系では、レーザー光源６１から出射されたレーザー光はミラー７３を介してダイクロイックミラー７４で反射されＤＮＡチップ４０を照射する。照射された光がＤＮＡチップ４０上にある蛍光分子２１に対する励起光となり、レーザー光源６１の波長と蛍光分子２１の励起波長が重なる場合、蛍光分子２１が励起状態になる。

　ＤＮＡチップ４０から放出された蛍光は、ダイクロイックミラー７４を透過し結像光学系８１を介して、ＣＣＤカメラ６３の検出素子上に結像し検出される。ここで検出光中に励起光が漏れ入るのを防ぐ目的で、励起光側に励起光波長に合わせたバンドパスフィルタを設置してもよく、検出光側に検出したい蛍光波長に合わせたバンドパスフィルタを設置してもよい。

　蛍光読取装置６０により得られる蛍光画像は、同一スポットのターゲット５０と検出プローブ１０のハイブリダイズ反応前後の画像を取得することができる。そのため、固相間、スポット間の光量のばらつきの影響を受けない。また、ハイブリダイズ反応前後の蛍光画像から蛍光変化量を演算し、結合反応した分子数を算出することができる。蛍光変化量の演算は、スポット全体の平均光量を使用してもよいし、スポット画像の各ピクセルの蛍光変化量を使用してもよい。

　蛍光読取装置６０は、ＣＣＤカメラ６３をコントロールするコンピュータと、画像の光量を計算する演算装置、画像と光量等を保存する記録装置を備えていてもよい。

　本発明の適用範囲は上記実施形態に限定されることはない。本発明は、ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法、及び前記核酸配列計測方法を用いる核酸配列計測用キットに対し、広く適用することができる。

　以下、実施例に基づき本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。

　黄色ブドウ球菌株（ＮＢＲＣ１２７３２）から抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとし、１６Ｓ　ｒＤＮＡ領域を増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲ増幅した。得られたＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ濃度を２０ｎＭに希釈し、これをサンプル溶液とした。
　次に、サンプルに図６に示すラベル分子Ａを添加し、６５℃で１時間インキュベートし、ＰＣＲ増幅産物とラベル分子Ａを結合させた。なお、本実施例で用いたラベル分子Ａは、図６に示すように、その５’末端が蛍光分子Ｃｙ３（登録商標）で修飾され、１個所のｘ部と２個所のｙ部とを有しており、ｘ部とｙ部とがｚ部となっている。

　次に、サンプル溶液に図７に示すラベル分子Ｂを添加後、検出プローブを基板の固相面に複数配置したマイクロアレイに供給し、６０℃で３時間インキュベートした。なお、本実施例で用いたラベル分子Ｂは、図７に示すように、その５’末端がＣｙ３（登録商標）で修飾され、１個所のＸ部と２個所のＹ部を有している。

　次に、マイクロアレイを遠心分離機により３０００ｇで遠心分離し、検出プローブに結合していない凝集体を沈殿させた。遠心分離後、蛍光読取装置よりスポット光量を計測した。また、陰性コントロールとして、上記１６Ｓ　ｒＤＮＡ領域を増幅可能なプライマーに結合しない、大腸菌から抽出したゲノムＤＮＡ（ｎｏｎ－ｔａｒｇｅｔ　ｃｏｎｔｒｏｌ；以下、ＮＴＣと称する）を含む溶液をサンプル溶液として上記と同様に行い、スポット光量を計測した。その結果を図８に示す。図８に示したように、黄色ブドウ球菌株のゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅産物からは、ＮＴＣと比較して有意な蛍光増加が確認された。

　図９に、マイクロアレイを遠心分離する前後の背景光の光量を示す。図９に示したように、マイクロアレイの遠心分離により、背景光を５％以下に低減することができた。
　以上の結果から、本発明の核酸配列計測方法は、ターゲットとなる核酸への蛍光の修飾工程及び検出前の固相の洗浄工程を必要とせずに、ターゲットを検出することが可能であり、且つ、検出感度に優れることが確認された。

　１０　　検出プローブ
　１３　　検出部
　２０　　ラベル分子Ａ
　２１　　蛍光分子
　２２　　ｘ部
　２３　　ｙ部
　２４　　ｚ部
　３０　　ラベル分子Ｂ
　３１　　金属微粒子
　３２　　Ｘ部
　３３　　Ｙ部
　４０　　ＤＮＡチップ
　５０　　ターゲット
　６０　　蛍光読取装置
　６１　　レーザー光源
　６３　　ＣＣＤカメラ
　７３　　ミラー
　７４　　ダイクロイックミラー
　８１　　結像光学系
　８２　　温調ステージ
　１００　固相面

Claims

　ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測方法であって、
　（ａ）前記ターゲットを含むサンプル溶液中に、ラベル分子Ａを添加するステップ、
　（ｂ）前記サンプル溶液中で、前記ターゲットと前記ラベル分子Ａとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｃ）前記サンプル溶液にラベル分子Ｂを添加するステップ、
　（ｄ）検出プローブが固定された基板の固相面に前記サンプル溶液を供給するステップ、
　（ｅ）前記検出プローブと、前記ターゲット、前記ラベル分子Ａ、及び前記ラベル分子Ｂとをハイブリダイゼーション反応させるステップ、
　（ｆ）前記固相面から、前記検出プローブに結合していない前記ターゲットと、前記ラベル分子Ａ及び前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体、及び前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとからなる凝集体を分離するステップ、
および
　（ｇ）前記固相面に励起光を照射し、前記固相面からの蛍光を計測するステップ、を含み、
　前記検出プローブは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な配列である検出部を有し、
　前記ラベル分子Ａは、前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、前記ラベル分子Ａと相補的な核酸配列を有し、
　前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、
　蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている、
ことを特徴とする核酸配列計測方法。
　前記ラベル分子Ａは、３’末端近傍にｘ部と、５’末端近傍にｙ部と、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部と、を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、３’末端近傍にＸ部と、５’末端近傍にＹ部とを有し、
　前記ｘ部の核酸配列は、前記Ｘ部の核酸配列と相補的であり、前記ｙ部の核酸配列は、前記Ｙ部の核酸配列と相補的であり、
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、又は、前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設け、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けることを特徴とする請求項１に記載の核酸配列計測方法。
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｙ部を２以上設けることを特徴とする請求項２に記載の核酸配列計測方法。
　前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｙ部を２以上設けることを特徴とする請求項２又は３に記載の核酸配列計測方法。
　前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
　前記蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの両方に付加されていることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
　金属微粒子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置に付加されていることを特徴とする請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
　前記金属微粒子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする請求項７に記載の核酸配列計測方法。
　前記分離が、遠心分離であることを特徴とする請求項１～８のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
　前記検出プローブと、前記ターゲット、前記ラベル分子Ａ、及び前記ラベル分子Ｂとのハイブリダイゼーション反応前後の蛍光量の変化から、ハイブリダイズした前記ターゲットの分子数を算出することを特徴とする請求項１～９のいずれか１項に記載の核酸配列計測方法。
　ハイブリダイゼーションによりサンプルに含まれる特定の核酸配列を有するターゲットを計測する核酸配列計測用キットにおいて、
　前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列を有する検出部を有する検出プローブと、前記検出プローブが固定される固相面を有する基板と、
　前記ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列を有するラベル分子Ａと、
　前記ラベル分子Ａの核酸配列と相補的な核酸配列を有するラベル分子Ｂと、
を含み、
　前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂとは、少なくとも２個所以上で結合し、
　蛍光分子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂの少なくとも一方の所定の位置に付加されている、
ことを特徴とする核酸配列計測用キット。
　前記ラベル分子Ａは、３’末端近傍にｘ部と、５’末端近傍にｙ部と、ターゲットの核酸配列と相補的な核酸配列であって、前記検出部の核酸配列とは異なる核酸配列であるｚ部と、を有し、
　前記ラベル分子Ｂは、３’末端近傍にＸ部と、５’末端近傍にＹ部とを有し、
　前記ｘ部の核酸配列は、前記Ｘ部の核酸配列と相補的であり、前記ｙ部の核酸配列は、前記Ｙ部の核酸配列と相補的であり、
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けるか、又は、前記ラベル分子Ａ中に、前記ｘ部と前記ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設け、前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｘ部と前記Ｙ部のいずれか一方又は両方を２以上設けることを特徴とする請求項１１に記載の核酸配列計測用キット。
　前記ラベル分子Ａ中に、前記ｙ部を２以上設けることを特徴とする請求項１２に記載の核酸配列計測用キット。
　前記ラベル分子Ｂ中に、前記Ｙ部を２以上設けることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の核酸配列計測用キット。
　前記蛍光分子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする請求項１１～１４のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
　前記蛍光分子が、前記ラベル分子Ａ及び前記ラベル分子Ｂの両方に付加されていることを特徴とする請求項１１～１５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
　金属微粒子が、前記ラベル分子Ａと前記ラベル分子Ｂのいずれか一方の所定の位置に付加されていることを特徴とする請求項１１～１５のいずれか１項に記載の核酸配列計測用キット。
　前記金属微粒子が付加される前記所定の位置は、前記ラベル分子Ａ又は前記ラベル分子Ｂの途中であることを特徴とする請求項１７に記載の核酸配列計測用キット。