CN116113710A - 核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒 - Google Patents

核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒 Download PDF

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CN116113710A CN202180061861.9A CN202180061861A CN116113710A CN 116113710 A CN116113710 A CN 116113710A CN 202180061861 A CN202180061861 A CN 202180061861A CN 116113710 A CN116113710 A CN 116113710A
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宫内祐树
田口朋之
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Yokogawa Electric Corp
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Abstract

使用具有检测部的检测探针(10)、标记分子A(20)和具有与所述标记分子A(20)的核酸序列互补的核酸序列的标记分子B(30)，在所述标记分子A(20)和所述标记分子B(30)中的任一者上附加荧光分子，使所述标记分子A(20)与所述标记分子B(30)在至少两处以上结合，形成所述标记分子A(20)与所述标记分子B(30)的分支结构体，由此测定样本中包含的具有特定核酸序列的靶标(50)，其中，所述检测部具有与靶标(50)的核酸序列互补的核酸序列，所述标记分子A(20)具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标(50)的核酸序列互补的、并与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列。

Description

核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒
技术领域
本发明涉及一种通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒。
背景技术
作为测定样本中包含的具有特定核酸序列的靶标的方法，使用DNA微阵列(具有特定核酸序列的互补序列的检测探针设置在基板等固相面上)的方法广为人知。该方法是利用添加到DNA微阵列中的样本所包含的靶标通过杂交反应被DNA微阵列的检测探针捕获的性质来测定靶标的方法。在该方法中，除了靶标是否包含在样本中之外，还可以测定样本中包含的靶标的量。在以下的非专利文献1和专利文献1中，公开了使用DNA微阵列来测定靶标的以往的测定方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：平山幸一等，UGT1A1の遺伝子多型を判別するDNAチップキットの開発、東洋鋼鈑Vol.38,51-56
专利文献
专利文献1：日本专利第4482557号公报
发明内容
发明所要解决的技术问题
然而，上述非专利文献1和专利文献1中公开的方法都需要在进行靶标的检测前对DNA微阵列进行清洗的工序。如果进行这样的清洗，则存在测定结果的再现性降低的问题。
本发明是鉴于上述情况而完成的发明，提供通过简单的工序使得样本中包含的靶标的测定结果的再现性优异的核酸序列测定方法、以及核酸序列测定用试剂盒。
解决技术问题的技术手段
为了实现上述目的，本发明采用以下构成。
[1]一种核酸序列测定方法，其特征在于，所述核酸序列测定方法是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标的核酸序列测定方法，所述核酸序列测定方法包括：
(a)向包含所述靶标的样本溶液中添加标记分子A的步骤；
(b)在所述样本溶液中，使所述靶标与所述标记分子A进行杂交反应的步骤；
(c)向所述样本溶液中添加标记分子B的步骤；
(d)向固定有检测探针的基板的固相面供给所述样本溶液的步骤；
(e)使所述检测探针与所述靶标、所述标记分子A和所述标记分子B进行杂交反应的步骤；
(f)从所述固相面分离出如下物质的步骤：由未与所述检测探针结合的所述靶标与所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体、以及由所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体；以及
(g)向所述固相面照射激发光，测定来自所述固相面的荧光量的步骤，
所述检测探针具有检测部，所述检测部为与所述靶标的核酸序列互补的序列，
所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B具有与所述标记分子A互补的核酸序列，
所述标记分子A和所述标记分子B在至少两处以上结合，
所述荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的至少一者的规定位置上。
[2]根据[1]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，
所述标记分子A在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B在3'末端附近具有X部，在5'末端附近具有Y部，
所述x部的核酸序列与所述X部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述Y部的核酸序列互补，
在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者。
[3]根据[2]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子A中设有两个以上的所述y部。
[4]根据[2]或[3]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子B中设有两个以上的所述Y部。
[5]根据[1]-[4]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
[6]根据[1]-[5]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B的两者上。
[7]根据[1]-[5]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的任一者的规定位置上。
[8]根据[7]所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
[9]根据[1]-[8]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述分离为离心分离。
[10]根据[1]-[9]中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，根据所述检测探针与所述靶标、所述标记分子A和所述标记分子B的杂交反应前后的荧光量的变化，计算出杂交后的所述靶标的分子数。
[11]一种核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定用试剂盒，所述核酸序列测定用试剂盒中包含：
具有检测部的检测探针，所述检测部具有与所述靶标的核酸序列互补的核酸序列；
具有固定所述检测探针的固相面的基板；
标记分子A，所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列；以及
标记分子B，所述标记分子B具有与所述标记分子A的核酸序列互补的核酸序列，
所述标记分子A和所述标记分子B在至少两处以上结合，
荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的至少一者的规定位置上。
[12]根据[11]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，
所述标记分子A在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B在3'末端附近具有X部，在5'末端附近具有Y部，
所述x部的核酸序列与所述X部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述Y部的核酸序列互补，
在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者。
[13]根据[12]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子A中设有两个以上的所述y部。
[14]根据[12]或[13]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子B中设有两个以上的所述Y部。
[15]根据[11]-[14]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
[16]根据[11]-[15]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B的两者上。
[17]根据[11]-[15]中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的任一者的规定位置。
[18]根据[17]所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
发明效果
本发明具有如下效果：提供通过简单的工序使得包含在样本中的测定结果的再现性优异的核酸序列测定方法、以及核酸序列测定用试剂盒。
附图说明
[图1]表示标记分子A的构成例的图。
[图2]表示标记分子B的构成例的图。
[图3]表示重复具有通过标记分子A与标记分子B结合而形成的分支结构的结构的图。
[图4]示意性地表示检测靶标的原理的图。
[图5]表示荧光读取装置的构成图。
[图6]表示实施例中使用的标记分子A的构成的图。
[图7]表示实施例中使用的标记分子B的构成的图。
[图8]表示在实施例中使包含靶标的样本和不包含靶标的样本进行杂交反应时的点光量的图。
[图9]表示在实施例中对微阵列进行离心分离之前和之后的溶液的背景光的光量的图。
具体实施方式
以下，参考附图，对本发明的实施方式的核酸序列测定方法以及核酸序列测定用试剂盒进行详细地说明。以下，首先对本发明的实施方式的概要进行说明，然后对本发明的各实施方式的详细内容进行说明。
(概要)
本发明的实施方式能够通过简单的工序，来提高样本中包含的靶标的测定结果的再现性。上述非专利文献1中公开了一种方法，所述方法是将使用荧光修饰引物对DNA样本进行PCR后的、经荧光修饰的PCR产物添加到DNA微阵列中而使其进行杂交反应，从而检测样本中的靶标的方法。另外，上述的专利文献1中公开了一种作为使检测光量增加的手段对多个荧光分子进行标记而使检测光量增加的方法。
然而，上述非专利文献1所公开的方法中，需要对成为靶标的DNA样本进行荧光分子的修饰，另外，在检测之前需要DNA微阵列的清洗工序，因此工序繁杂。另外，根据DNA微阵列的清洗的方法，会产生信号的降低、背景的光量增加，会发生由清洗的不均导致的固相面内的信号的不均。这些成为使测定结果的再现性降低的主要原因。另外，在专利文献1的方法中，需要进行检测前的固相面的清洗，与上述非专利文献1同样地，存在伴随着清洗的测定结果的再现性降低的问题。
本实施方式的靶标测定方法首先向包含靶标的样本溶液中添加标记分子A，使靶标与标记分子A进行杂交反应。接着，向样本溶液中添加标记分子B。接着，向固定有检测探针的基板的固相面供给样本溶液，使检测探针与靶标、标记分子A和标记分子B进行杂交反应。接着，从固相面分离出：由未与检测探针结合的靶标与标记分子A和标记分子B构成的凝集体、以及由标记分子A和标记分子B构成的凝集体。然后，向固相面照射荧光，测定来自固相面的荧光量。
此处，检测探针具有作为与靶标的核酸序列互补的序列的检测部。另外，标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与靶标的核酸序列互补的、且与检测部的核酸序列不同的核酸序列，标记分子B具有与标记分子A互补的核酸序列。标记分子A和标记分子B在至少两处以上结合，荧光分子被附加在标记分子A和标记分子B中的至少一者的规定位置上。
由此，能够通过简单的工序，使样本中包含的靶标的测定结果的再现性得以提高。具体地，在不需要成为靶标的核酸的标记工序的基础上，通过省略检测工序前的清洗工序，能够避免由清洗工序的不完备导致的性能恶化、光量降低、背景光上升或偏差(バラつき)的发生等。在以往的手法中，发生由清洗的方法、清洗度、清洗的不均等引起的信号、背景光的上升和偏差的风险，但通过本发明能够避免这样的风险。由此能够在阵列面上得到更均匀的结果，检测的再现性也得以提高。另外，通过增加靶标与杂交后的检测探针结合的荧光分子的数量，能够增加检测光量，由此能够提高检测灵敏度。
[实施方式]
<核酸序列测定方法>
本发明的核酸序列测定方法的特征在于，所述核酸序列测定方法是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定方法，所述核酸序列测定方法包括：
(a)向包含所述靶标的样本溶液中添加标记分子A的步骤；
(b)在所述样本溶液中，使所述靶标与所述标记分子A进行杂交反应的步骤；
(c)向所述样本溶液中添加标记分子B的步骤；
(d)向固定有检测探针的基板的固相面供给所述样本溶液的步骤；
(e)使所述检测探针与所述靶标、所述标记分子A和所述标记分子B进行杂交反应的步骤；
(f)从所述固相面分离出如下物质的步骤：由未与所述检测探针结合的所述靶标与所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体、以及由所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体；以及
(g)向所述固相面照射激发光，测定来自所述固相面的荧光量的步骤，
所述检测探针具有检测部，所述检测部为与所述靶标的核酸序列互补的序列，
所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B具有与所述标记分子A互补的核酸序列，
所述标记分子A和所述标记分子B在至少两处以上结合，
荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的至少一者的规定位置上。
标记分子A在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列。标记分子B在3'末端附近具有X部，在5'末端附近具有Y部。所述x部的核酸序列与所述X部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述Y部的核酸序列互补。
另外，在本发明中，互补是指一者的核酸序列具有能够与另一者的核酸序列形成双链状态的核酸序列，并不必须需要完全互补，也可以包含几个错配碱基对。
x部位于标记分子A的3'末端的附近，并且位于距离标记分子A的3'末端数个碱基的位置。
y部位于标记分子A的5'末端的附近，并且位于距离标记分子A的5'末端数个碱基的位置。
X部位于标记分子B的3'末端的附近，并且位于距离标记分子B的3'末端数个碱基的位置。
Y部位于标记分子B的5'末端的附近，并且位于距离标记分子B的5'末端数个碱基的位置。
在标记分子A中，z部可以与x部或y部的全部或一部分重复，也可以不重复。
标记分子A具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的序列、且是与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，由此与标记分子A的z部结合的靶标可以与固定在固相上的检测探针的检测部结合。
在标记分子A中以两个以上设有x部和y部中的任一者或两者，或在标记分子B中以两个以上设有X部和Y部中的任一者或两者，或者，在标记分子A中以两个以上设有x部和y部中的任一者或两者，并在标记分子B中以两个以上设有X部和Y部中的任一者或两者。例如，可以在标记分子A中设有两个以上的y部，也可以在标记分子B中设有两个以上的Y部，也可以在标记分子A中设有两个以上的y部，并且在标记分子B中设有两个以上的Y部。
x部的核酸序列与X部互补，y部的核酸序列与Y部互补，因此标记分子A的x部与标记分子B的X部结合，标记分子A的y部与标记分子B的Y部结合，其结果是，形成多个标记分子A和标记分子B重复具有分支结构的结构。
荧光分子被附加在标记分子A和标记分子B中的至少一者的规定位置上。荧光分子可以不被附加在标记分子A或标记分子B的前端，也可以位于标记分子A或标记分子B的中途。另外，荧光分子也可以被附加在多个种类、多个部位上。通过在多个部位附加荧光分子，可以增加检测时的荧光量，可以进行更高灵敏度的检测。
作为荧光分子，只要可以附加在标记分子A和标记分子B中的至少一者的规定位置即可，没有特别限制，例如，可以举出以下公知的荧光分子：EDANS、Coumarin、FAM、FITC、Cy2(注册商标)、TF2、TF3、HEX、JOE、TET、Cy3(注册商标)、Cy5(注册商标)、Alexa Fluor(注册商标)532、Alexa Fluor(注册商标)610、Alexa Fluor(注册商标)647、ATTO532、ATTO633、Qdot(注册商标)565、Qdot(注册商标)585、Qdot(注册商标)605、Qdot(注册商标)705、iFluorTM532、iFluorTM647等。
图1是表示标记分子A的结构的一个示例的图。图1中，标记A分子分别设有一个x部22、一个y部23，在3'末端附加有荧光分子21。
图2是表示标记分子B的结构的一个示例的图。图2中，标记分子B设有一个X部32、两个Y部33，在5'末端附加有金属微粒31。
图3表示图1所示的标记分子A与图2所示的标记分子B结合的状态。标记分子A的x部与标记分子B的X部结合，标记分子A的y部与标记分子B的Y部结合，其结果是，如图3所示，形成多个标记分子A和标记分子B重复具有分支结构的结构。
荧光分子也可以被附加在标记分子A和标记分子B的两者上。通过在标记分子A和标记分子B的两者上附加荧光分子，可以增加检测时的荧光量。
也可以在标记分子A和标记分子B中的任一者的规定位置上附加金属微粒。通过将金属微粒附加在标记分子A和标记分子B中的任一者上，在标记分子A与标记分子B结合并形成具有分支结构的凝集体时，可以对该凝集体附加重量，因此通过离心分离而容易进行分离。另外，由于可以对该凝集体赋予磁性，因此可以利用磁力分离该凝集体。金属微粒可以被附加在标记分子A或标记分子B的前端，也可以被附加在中途的位置。另外，金属微粒也可以被附加在多个种类、多个部位上。通过在多个部位附加金属微粒，可以增加该凝集体的重量、磁性，通过离心分离、磁力，可以更容易地进行分离。
作为金属微粒，只要可以附加在标记分子A和标记分子B中的任一者的规定位置，则没有特别限制，例如可以举出：金纳米粒子、银纳米粒子、氧化铁、黑色二氧化硅粒子等。金属微粒的粒径优选的是，金属微粒在溶液中分散性高，不会成为DNA彼此之间的杂交反应的障碍，成为离心分离中可沉淀的密度或质量的粒径。为了在溶液中分散性高，优选的是，在氧化铁粒子的情况下粒径为100nm以下，在金纳米粒子的情况下粒径为15nm以下，但为了不成为DNA彼此之间的杂交反应的障碍，优选粒径较小。
以下对上述各步骤进行说明。图4是示意性地表示本发明的核酸序列测定方法的原理的图。
首先，进行包含靶标50的样本溶液的制备，所述靶标50具有作为靶标的特定核酸序列。在样本溶液的制备中，也可以进行具有特定核酸序列的核酸(靶标50)的扩增。
也可以在进行基因的扩增的阶段进行确认基因是否被扩增的试验，仅在基因被扩增的情况下，进行后述的杂交反应。
另外，检查有无基因存在的时机并不限于扩增结束后，也可以在扩增反应中。作为检查的手法，可以适当利用电泳、抗原抗体反应、质量分析、实时PCR法等。
另外，核酸(靶标50)也可以与蛋白质、糖链等结合。该情况下，可以确认蛋白质、糖链等对核酸(靶标50)的相互作用。
向包含所述靶标50的样本溶液中添加标记分子A(20)(步骤(a))。然后，在包含靶标50的样本溶液中，使靶标50和标记分子A(20)进行杂交反应(步骤(b))。
在包含靶标50的样本溶液中，使靶标50与标记分子A(20)进行杂交反应时，靶标50与标记分子A(20)的z部24结合。
使靶标50和标记分子A(20)进行杂交反应后，向包含靶标50和标记分子A(20)的样本溶液中添加标记分子B(30)(步骤(c))。然后，向固定有检测探针10的固相面100供给向包含靶标50和标记分子A(20)的样本溶液中添加了标记分子B(30)的溶液(步骤(d))。
接着，使检测探针10与靶标50、标记分子A(20)和标记分子B(30)进行杂交反应(步骤(e))。当使检测探针10与靶标50、标记分子A(20)和标记分子B(30)进行杂交反应时，在步骤(b)中，与靶标50结合的标记分子A(20)的x部22与标记分子B(30)的X部32结合，与靶标50结合的标记分子A(20)的y部23与标记分子B(30)的Y部33结合，其结果是，形成多个标记分子A(20)和标记分子B(30)重复具有分支结构的分支结构体，形成靶标50与该分支结构体结合的、由靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的结构体，该结构体的靶标50与固定在固相面100的检测探针10的检测部13结合。
在步骤(b)中，未与靶标50结合的标记分子A(20)也同样，标记分子A(20)的x部22与标记分子B(30)的X部32结合，标记分子A(20)的y部23与标记分子B(30)的Y部33结合，其结果是，形成多个标记分子A(20)和标记分子B(30)重复具有分支结构的分支结构体，形成由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体并以游离状态存在于溶液中。
接着，从固相面100分离出如下物质：由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体(步骤(f))。作为从固相面100分离出所述凝集体的方法，优选离心分离。可以通过离心分离将由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体从固相面100分离。另外，在标记分子A(20)或标记分子B(30)中的任一者上附加有金属微粒31的情况下，可以通过磁力分离由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体。在步骤(f)中，由于能够不通过清洗而去除由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体，因此能够测定排除了清洗的影响的状态下的光量。
接着，向固相面100照射激发光，通过荧光读取装置60来测定来自固相面100的荧光(步骤(g))。
荧光读取装置60中，通过检测探针10是否呈现荧光可以确认样本中的对象核酸(靶标50)的有无，另外，可以对杂交后的对象核酸(靶标50)进行定量。
另外，通过使用荧光读取装置60，可以取得同一坐标的杂交前后的图像，另外，可以取得以同一时刻的波长分离的荧光图像，通过解析荧光图像，也可以计算出杂交反应后的靶标50的分子数。
另外，可以根据杂交反应前后的荧光分子21的荧光变化量计算出杂交反应后的靶标50的分子数。例如，使用具有已知分子数的靶标50的标准液进行杂交反应，测定反应前后的荧光分子21的荧光变化量，预先制作表示分子数和荧光变化量的关系的校准线。通过该校准线和使用样本的杂交反应前后的荧光分子21的荧光变化量，可以计算出杂交反应后的靶标50的分子数。
固定检测探针的固相面不限于基板上的平面。也可以将检测探针固定在珠粒(ビーズ)表面。通过在珠粒的表面固定检测探针，检测探针成为以珠粒为中心呈放射状扩散的形状。在此情况下，固定探针的固相面的表面积变大，可以增加每单位面积的探针量。另外，通过用其大小或磁力等回收捕获有检测对象分子的珠粒，也可以选择性地回收检测对象分子。回收的分子可以用于后工序中的其他试验等。
<核酸序列测定用试剂盒>
接着，对本发明的核酸序列测定用试剂盒进行说明。本发明的核酸序列测定用试剂盒可以用于本发明的核酸序列测定方法。
本实施方式的核酸序列测定用试剂盒包含：具有检测部13的检测探针10，检测部13具有与作为检测对象的核酸的靶标50的核酸序列互补的核酸序列；具有固定检测探针10的固相面100的基板；标记分子A，所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与靶标50的核酸序列互补的、且与检测部13的核酸序列不同的核酸序列；以及标记分子B，所述标记分子B具有与标记分子A的核酸序列互补的核酸序列。标记分子A和标记分子B在至少两处以上结合，荧光分子21被附加在标记分子A和标记分子B中的至少一者的规定位置上。作为荧光分子21，可以举出上述的荧光分子。
如图1所示，标记分子A在3'末端附近具有x部22，在5'末端附近具有y部23，并且具有z部24，z部24是与靶标50的核酸序列互补的、且与检测部13的核酸序列不同的核酸序列。如图2所示，标记分子B在3'末端附近具有X部32，在5'末端附近具有Y部33。x部22的核酸序列与X部32的核酸序列互补，y部23的核酸序列与Y部33的核酸序列互补。
x部22位于标记分子A的3'末端的附近，并且位于距离标记分子A的3'末端数个碱基的位置。
y部23位于标记分子A的5'末端的附近，并且位于距离标记分子A的5'末端数个碱基的位置。
X部32位于标记分子B的3'末端的附近，并且位于距离标记分子B的3'末端数个碱基的位置。
Y部33位于标记分子B的5'末端的附近，并且位于距离标记分子B的5'末端数个碱基的位置。
在标记分子A中，z部24可以与x部22或y部23的全部或一部分重复，也可以不重复。
标记分子A具有z部24，所述z部24是与靶标50的核酸序列互补的序列、且是与检测部13的核酸序列不同的核酸序列，由此与标记分子A的z部24结合的靶标50可以与固定在基板的固相面100上的检测探针的检测部13结合。
在标记分子A中以两个以上设有x部22和y部23中的任一者或两者，或在标记分子B中以两个以上设有X部32和Y部33中的任一者或两者，或者，在标记分子A中以两个以上设有x部22和y部23中的任一者或两者，并在标记分子B中以两个以上设有X部32和Y部33中的任一者或两者。例如，可以在标记分子A中设有两个以上的y部23，也可以在标记分子B中设有两个以上的Y部33，也可以在标记分子A中设有两个以上的y部23，并且在标记分子B中设有两个以上的Y部33。
x部22的核酸序列与X部32互补，y部23的核酸序列与Y部33互补，因此标记分子A的x部22与标记分子B的X部32结合，标记分子A的y部23与标记分子B的Y部33结合，其结果是，形成多个标记分子A和标记分子B重复具有分支结构的结构。
荧光分子21被附加在标记分子A和标记分子B中的至少一者的规定位置。荧光分子21可以不被附加在标记分子A或标记分子B的前端，也可以位于标记分子A或标记分子B的中途。另外，荧光分子21也可以被附加在多个种类、多个部位上。通过在多个部位附加荧光分子21，可以增加检测时的荧光量，能够进行更高灵敏度的检测。
荧光分子21可以附加在标记分子A和标记分子B的两者上。通过在标记分子A和标记分子B的两者上附加荧光分子21，能够增加检测时的荧光量。
也可以在标记分子A和标记分子B中的任一者的规定位置上附加金属微粒31。通过将金属微粒31附加在标记分子A和标记分子B中的任一者上，在标记分子A与标记分子B结合并形成具有分支结构的凝集体时，能够对该凝集体附加重量，因此通过离心分离而容易进行分离。另外，由于能够对该凝集体赋予磁性，因此能够利用磁力分离该凝集体。金属微粒31可以被附加在标记分子A或所述标记分子B的前端，也可以被附加在中途的位置。另外，金属微粒31也可以被附加在多个种类、多个部位上。通过在多个部位附加金属微粒31，能够增加该凝集体的重量、磁性，通过离心分离、磁力，能够更容易地进行分离。作为金属微粒31，可以举出上述的金属微粒。
本发明的核酸序列测定用试剂盒可以进一步包含用于对靶标进行定量的必要的标准液、必要的缓冲液、产品说明书等。
<核酸序列测定用试剂盒的使用方法>
接着，对本发明的核酸序列测定用试剂盒的使用方法进行说明。
(1)溶液制备
首先，制备含有检测探针10的探针溶液，调整探针浓度。
(2)向固相面的固定
接着，将探针溶液点样到基板的固相面100上，将检测探针10固定在基板的固相面100上。
(3)清洗
接着，对固相面100进行清洗，去除未被固定的剩余的探针。通过以上的步骤，制造在固相面100上固定有检测探针的基板。
(4)样本溶液的制备
接着，进行包含靶标50的样本溶液的制备，所述靶标50具有作为靶标的特定核酸序列。在样本溶液的制备中，也可以进行具有特定核酸序列的核酸(靶标50)的扩增。
(5)靶标与标记分子A的杂交反应
接着，向(4)中制备的包含靶标50的样本溶液中添加标记分子A(20)。然后，在包含靶标50的样本溶液中，使靶标50和标记分子A(20)进行杂交反应。在包含靶标50的样本溶液中，当使靶标50与标记分子A(20)进行杂交反应时，靶标50与标记分子A(20)的z部24结合。
(6)检测探针、靶标、标记分子A以及标记分子B的杂交反应
使靶标50和标记分子A(20)进行杂交反应后，在包含靶标50和标记分子A(20)的样本溶液中添加标记分子B(30)。然后，向在固相面100上固定有检测探针10的基板供给向(4)中制备的包含靶标50和标记分子A(20)的样本溶液中添加了标记分子B(30)的溶液，使固定在固相面100上的检测探针10与靶标50、标记分子A(20)和标记分子B(30)进行杂交反应。当使固定在固相面100上的检测探针10与靶标50、标记分子A(20)和标记分子B(30)进行杂交反应时，与靶标50结合的标记分子A(20)的x部22与标记分子B(30)的X部32结合，与靶标50结合的标记分子A(20)的y部23与标记分子B(30)的Y部33结合，其结果是，形成多个标记分子A(20)和标记分子B(30)重复具有分支结构的分支结构体，形成靶标50与该分支结构体结合的、由靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的结构体，该结构体的靶标50与固定在固相面100的检测探针10的检测部13结合。
(7)凝集体的分离去除
接着，从固相面100分离出：由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体。作为从固相面100分离出所述凝集体的方法，优选离心分离。在标记分子A(20)或标记分子B(30)中的任一者上附加有金属微粒31的情况下，除了离心分离以外，还可以通过磁力对如下进行分离：由未与检测探针10结合的靶标50与标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体、以及由标记分子A(20)和标记分子B(30)构成的凝集体。
(8)荧光的检测
接着，向在检测探针10上结合有靶标50、标记分子A(20)和标记分子B(30)的固相面100照射激发光，通过荧光读取装置60来测定从固相面100放射出的荧光。
根据荧光读取装置60，通过检测探针10是否呈现荧光可以确认样本中的对象核酸(靶标50)的有无，另外，可以对杂交后的对象核酸(靶标50)进行定量。
另外，通过使用荧光读取装置60，可以取得同一坐标的杂交前后的图像，另外，可以取得以同一时刻的波长分离的荧光图像，通过解析荧光图像，也可以计算出杂交反应后的靶标50的分子数。
另外，可以根据杂交反应前后的荧光分子21的荧光变化量计算出杂交反应后的靶标50的分子数。例如，使用具有已知分子数的靶标50的标准液进行杂交反应，测定反应前后的荧光分子21的荧光变化量，预先制作表示分子数和荧光变化量的关系的校准线。通过该校准线和使用样本的杂交反应前后的荧光分子21的荧光变化量，可以计算出杂交反应后的靶标50的分子数。
图5是表示荧光读取装置60的构成图。对于荧光读取装置60，为了取得DNA芯片40的靶标50与检测探针10进行杂交前后的图像，在取得杂交前的图像后，通过调温台82使DNA芯片40的温度上升使其进行杂交反应，在再次下降到常温的状态下取得杂交后的图像。
为了促进靶标50与检测探针10的杂交，调温台82优选在靶标50与检测探针10的反应中具有利用振荡或DNA芯片40的旋转、涡流混合器(ボルテックスミキサー)等的搅拌功能。
在荧光读取装置60的光学系统中，从激光光源61射出的激光经由镜子73被分色镜74反射而照射DNA芯片40。照射的光成为对DNA芯片40上的荧光分子21的激发光，在激光光源61的波长和荧光分子21的激发波长重叠的情况下，荧光分子21成为激发状态。
从DNA芯片40发出的荧光透过分色镜74并经由成像光学系统81在CCD摄像机63的检测元件上成像并被检测。在此，出于防止激发光漏入检测光中的目的，可以在激发光侧设置与激发光波长匹配的带通滤波器(バンドパスフィルタ)，也可以在检测光侧设置与期望检测的荧光波长匹配的带通滤波器。
通过荧光读取装置60得到的荧光图像能够取得同一点的靶标50与检测探针10的杂交反应前后的图像。因此，不会受到固相之间、点之间的光量偏差的影响。另外，可以根据杂交反应前后的荧光图像运算出荧光变化量，计算出结合反应后的分子数。荧光变化量的运算可以使用点整体的平均光量，也可以使用点图像的各像素的荧光变化量。
荧光读取装置60也可以具备控制CCD摄像机63的计算机、计算图像的光量的运算装置以及保存图像和光量等的存储装置。
本发明的适用范围并不限于上述实施方式。对于通过杂交对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定方法、以及使用所述核酸序列测定方法的核酸序列测定用试剂盒，本发明可以广泛适用。
实施例
以下，基于实施例对本发明更详细地进行说明，但本发明并不限定于以下的实施例。
以从金黄色葡萄球菌株(NBRC12732)提取的基因组DNA为模板，使用可扩增16SrDNA区域的引物进行PCR扩增。将得到的PCR扩增产物的DNA浓度稀释至20nM，将其作为样本溶液。
接着，在样本中添加图6所示的标记分子A，在65℃下孵育1小时，使PCR扩增产物与标记分子A结合。此外，如图6所示，本实施例中使用的标记分子A的5'末端由荧光分子Cy3(注册商标)修饰，具有一处的x部和两处的y部，x部与y部形成z部。
接着，在样本溶液中添加图7所示的标记分子B后，供给到在基板的固相面上配置有多个检测探针的微阵列，在60℃下孵育3小时。此外，如图7所示，本实施例中使用的标记分子B的5'末端由Cy3(注册商标)修饰，具有一处的X部和两处的Y部。
接着，利用离心分离机以3000g对微阵列进行离心分离，使未与检测探针结合的凝集体沉淀。在离心分离后，通过荧光读取装置测定点光量。另外，作为阴性对照，以不与可扩增上述16S rDNA区域的引物结合的、含有从大肠杆菌中提取的基因组DNA(non-targetcontrol；以下称为NTC)的溶液作为样本溶液，以与上述同样的方式进行，测定点光量。其结果示于图8。如图8所示，从金黄色葡萄球菌株的基因组DNA的PCR扩增产物确认到与NTC相比荧光显著增加。
图9中示出了离心分离微阵列前后的背景光的光量。如图9所示，通过微阵列的离心分离，能够将背景光降低至5％以下。
由以上结果确认到：本发明的核酸序列测定方法不需要对成为靶标的核酸进行荧光修饰的工序以及检测前的固相的清洗工序，就能够检测靶标，并且检测灵敏度优异。
附图标记说明
10：检测探针
13：检测部
20：标记分子A
21：荧光分子
22：x部
23：y部
24：z部
30：标记分子B
31：金属微粒
32：X部
33：Y部
40：DNA芯片
50：靶标
60：荧光读取装置
61：激光光源
63：CCD摄像机
73：镜子
74：分色镜
81：成像光学系统
82：调温台
100：固相面

Claims (18)

1.一种核酸序列测定方法，其特征在于，所述核酸序列测定方法是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定方法，所述核酸序列测定方法包括：
(a)向包含所述靶标的样本溶液中添加标记分子A的步骤；
(b)在所述样本溶液中，使所述靶标与所述标记分子A进行杂交反应的步骤；
(c)向所述样本溶液中添加标记分子B的步骤；
(d)向固定有检测探针的基板的固相面供给所述样本溶液的步骤；
(e)使所述检测探针与所述靶标、所述标记分子A和所述标记分子B进行杂交反应的步骤；
(f)从所述固相面分离出如下物质的步骤：由未与所述检测探针结合的所述靶标与所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体、以及由所述标记分子A和所述标记分子B构成的凝集体；以及
(g)向所述固相面照射激发光，测定来自所述固相面的荧光的步骤，
所述检测探针具有检测部，所述检测部为与所述靶标的核酸序列互补的序列，
所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B具有与所述标记分子A互补的核酸序列，
所述标记分子A和所述标记分子B在至少两处以上结合，
荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的至少一者的规定位置上。
2.根据权利要求1所述的核酸序列测定方法，其特征在于，
所述标记分子A在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B在3'末端附近具有X部，在5'末端附近具有Y部，
所述x部的核酸序列与所述X部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述Y部的核酸序列互补，
在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者。
3.根据权利要求2所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子A中设有两个以上的所述y部。
4.根据权利要求2或3所述的核酸序列测定方法，其特征在于，在所述标记分子B中设有两个以上的所述Y部。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B两者上。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的任一者的规定位置上。
8.根据权利要求7所述的核酸序列测定方法，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，所述分离为离心分离。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的核酸序列测定方法，其特征在于，根据所述检测探针与所述靶标、所述标记分子A和所述标记分子B的杂交反应前后的荧光量的变化，计算出杂交后的所述靶标的分子数。
11.一种核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，
所述试剂盒是通过杂交来对样本中包含的具有特定核酸序列的靶标进行测定的核酸序列测定用试剂盒，所述核酸序列测定用试剂盒中包含：
具有检测部的检测探针，所述检测部具有与所述靶标的核酸序列互补的核酸序列；
具有固定所述检测探针的固相面的基板；
标记分子A，所述标记分子A具有核酸序列，所述核酸序列是与所述靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列；以及
标记分子B，所述标记分子B具有与所述标记分子A的核酸序列互补的核酸序列，
所述标记分子A和所述标记分子B在至少两处以上结合，
荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的至少一者的规定位置上。
12.根据权利要求11所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，
所述标记分子A在3'末端附近具有x部，在5'末端附近具有y部，并且具有z部，所述z部是与靶标的核酸序列互补的、且与所述检测部的核酸序列不同的核酸序列，
所述标记分子B在3'末端附近具有X部，在5'末端附近具有Y部，
所述x部的核酸序列与所述X部的核酸序列互补，所述y部的核酸序列与所述Y部的核酸序列互补，
在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，或在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者，或者，在所述标记分子A中以两个以上设有所述x部和所述y部中的任一者或两者，并在所述标记分子B中以两个以上设有所述X部和所述Y部中的任一者或两者。
13.根据权利要求12所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子A中设有两个以上的所述y部。
14.根据权利要求12或13所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，在所述标记分子B中设有两个以上的所述Y部。
15.根据权利要求11-14中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述荧光分子的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
16.根据权利要求11-15中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，所述荧光分子被附加在所述标记分子A和所述标记分子B的两者上。
17.根据权利要求11-15中任一项所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，金属微粒被附加在所述标记分子A和所述标记分子B中的任一者的规定位置上。
18.根据权利要求17所述的核酸序列测定用试剂盒，其特征在于，附加有所述金属微粒的所述规定位置是所述标记分子A或所述标记分子B的中途。
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