JP2005521411A - Dna−結合タンパク質の検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、転写因子活性をプロファイル解析するための組成物および方法を提供する。特に、本発明は、タンパク質結合部位を含む核酸構成物、ならびにタンパク質そして特に転写因子のこれら構成物中の結合部位への結合を検出および測定するための方法を提供する。
真核生物は、組織および器官に組織される特殊化された細胞型で構成されている。細胞型および機能に関係なく、個々の真核生物内の全ての細胞はゲノムと称される同一組の遺伝子を含む。細胞間の差異は、遺伝子の特異的発現から生じる。個々の遺伝子の発現は、プロモーターおよびレプレッサーなどのゲノム中のDNAの調節配列へのタンパク質の結合によって制御される。そのような制御配列へのタンパク質結合は、遺伝子の転写速度の増加または減少を引き起こすことができる。転写因子と呼ばれるこれらDNA結合タンパク質は、遺伝子転写を調節し、それによって、細胞の再生、発達および分化、環境的刺激への応答、ならびに正常および病的状態における組織ホメオスタシスを含む細胞の必須特性の全てを制御する。転写因子は、転写の開始および持続において酵素RNAポリメラーゼを促進あるいは阻害することによって遺伝子発現を調節する数百の特殊化されたタンパク質からなる。
本発明のさらなる目的は、転写因子などの配列特異的DNA結合タンパク質の複数を同時検出するための方法を提供することである。
本発明のさらなる目的、特徴、局面、使用および利点は、後述する好ましい実施例の詳細な説明から明らかになるであろう。
タンパク質またはDNA結合タンパク質
ここでいう「タンパク質」および「DNA結合タンパク質」とは、一定の核酸配列に特異的に結合し得るペプチド、ポリペプチド、ペプチド含有物質または複合体を意味する。DNA結合タンパク質は、二つまたはそれ以上の個々の分子の複合体であってもよい。そのようは複合体は通常、「ホモダイマー」、「ヘテロダイマー」、「ホモ型複合体」および「ヘテロ型複合体」と称される。そのような複合体は共有結合または非共有相互作用によって合体したいくつかの個々の構成要素を含んでなる。DNA結合タンパク質は、天然物でも合成物でもよく、特定の形状である必要はない。よく知られたDNA結合タンパク質の例としては、AP−1、Jum、Fos、CREB、ATF−1、Myc、Max、NF−カッパB、PPARγおよびUbxが挙げられる。ポリメラーゼ、テロメラーゼ複合体のタンパク質、ジャイレース、およびスプライシングタンパク質などのあらゆる種類の核酸結合タンパク質もまたこの定義に含まれる。
ここでいう「試料」とは、DNA結合タンパク質を含むと思われるあらゆる材料、例えば、ヒトおよび動物組織、培養細胞、培養または天然の微生物、体液、血液、血清などを指すが、これらには限定されない。試料は生物学的材料のみを含む必要はない。試料はまた、身体マトリックス上またはその中のDNA結合タンパク質含有材料から成ってもよい。
ここでいう「検出デュプレックス」(ditection duplex(検出二本鎖DNA分子))とは、タンパク質結合部位を含んでなる二本鎖領域を含むDNA分子を指す。検出デュプレックスは、一部は一本鎖で一部は二本鎖でもよく、ギャップおよびニックを含むことができる。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成することができ、ヘアピンループを形成する一つまたはそれ以上の自己ハイブリダイズされた領域を含んでもよい。検出デュプレックスは天然および非天然ヌクレオチドのいかなる組合せを含んでもよく、ヌクレオチド間に非天然結合を含んでもよい。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上の検出可能な標識を含むことができる。検出デュプレックスは一つまたはそれ以上の結合部を含んでもよい。検出デュプレックスは、一本鎖または二本鎖DNAの安定化に影響する一つまたはそれ以上の修飾を含んでもよい。そのような修飾には、逆向き「T」残基、チオール化残基、ペプチド核酸結合、キメラまたはRNAおよびDNAなどが含まれ得る。検出デュプレックスは支持体上に固定化されてもよく、結合部を介してまたは支持体上の相補的配列への検出デュプレックスの一本鎖部分のハイブリダイゼーションを介して固定化が可能であってもよい。検出デュプレックスはまた、意図的または非意図的ミスマッチを含んでもよい。検出デュプレックスの例を図1に示す。当業者は、本発明において広範囲の適切な検出デュプレックスが使用でき、図1に示された例は本発明の限定を意図するものではないことを認識するであろう。
ここでいう「捕捉タグ」(capture tag)とは、デュプレックスを支持体上に捕捉するために用い得る検出デュプレックス内の配列を意味する。
ここでいう「結合部」とは、DNAまたはタンパク質などの物質を固体支持体に付するために用い得る化学または生化学的部分を意味する。結合部は、物質と固体支持体との間で非共有結合、可逆的共有結合、または非可逆的共有結合を形成することができる。化学的結合部の例としては、当業者に十分公知の技術を用いて物質を固体支持体に化学的に結合し得るアルデヒド部(CHO)およびアミノ部(−NH2)があげられる。当業者は、他の適切な結合部は当業者に公知であって、本発明に使用し得ることを認識するであろう。生化学的結合部の例としては、ビオチン、IgGおよびDNAがあげられる。ビオチンで標識された物質は、アビジン被覆した固体支持体と強力な非共有結合を形成する。IgGはプロテインGで被覆した固体支持体に結合し、DNAは相補的RNAまたはDNA配列で被覆した固体支持体に結合する。本発明での使用に適する他のそのような結合相互作用は、当業者に公知である。
ここでいう「検出試薬」とは、二次物質に結合して直接または間接的に二次物質の検出を可能にする検出可能な物質を意味する。検出試薬は、標識を含むまたは含まない核酸、タンパク質、ペプチドまたは他の生物分子であることができる。検出試薬の例としては、ペプチド、オリゴヌクレオチド、モノおよびポリクローナル抗体、抗体断片、レクチン、着色料、染料など、およびこれら物質のキメラ型があげられる。直接検出ができない検出試薬は標識を含むか、標識を含む二次検出試薬によって検出することができる。例えば、抗体は標識されたプロテインGを用いて検出できる。
ここでいう「標識」とは、検出可能なシグナル部分またはレポーターである。本発明では多様な標識またはレポーターが使用できるが、これには放射性同位元素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識などが含まれる。標識は直接または間接的に結合させることができる。標識はまた、抗体やペプチドなどの二次試薬、直接的化学的相互作用および当業者に十分公知の他の方法によって認識され得るハプテンでもよい。標識はまた、当業者に十分公知の方法によるハイブリダイゼーション、重合化、ライゲーションおよび/または増幅によって検出できるオリゴヌクレオチドまたは核酸でもよい。標識を用いてシグナル読み出しの増加または減少を生じさせてもよい。標識はまた、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)と称される現象を利用するために近接して結合する二つの発色団を含んでもよい。適当な波長の光で照射されると、一つに発色団がフォトンを吸収して、励起状態で存在する。発色団と受容体が空間的に相互近接している場合には、励起された発色団からのエネルギーは受容体分子に移動する。このエネルギー移動によって、励起された発色団の光フィトンの形でのエネルギー放出が妨げられ、その結果として発色団の蛍光が抑制される。受容体分子が空間的に十分近接していない場合は、エネルギー移動は起きず、したがって、励起された発色団は蛍光を発し得る。適当な相互作用シグナル部の対は当業者に十分公知である。ルミネッセンス共鳴エネルギー移動(LRET)と称される同様の現象は、感作されたランタニド金属と受容体染料との間で起き、本発明で使用し得る。さらに、ナノクリスタルのミクロまたはナノトランスポンダーも標識として使用し得る。さらに、検出を促進するために使用し得る他の標識には、化学発光標識、c−mycのような免疫親和性タグ、セルロース結合ドメインのような親和性タグ、ストレプトアビジン、ビオチン、ストレプトアビジンまたはマッチングフィットを有する全部または部分マクロ分子、発色、発光、蛍光または他の追跡能を有するレポーター酵素などが含まれる。
ここでいう「支持体」は、タンパク質、ペプチド、核酸などを付するに適する多孔性または非多孔性の材料またはマトリックスであることができる。タンパク質、ペプチド、核酸などは、当業者に十分公知の技術または技術の組合せによって支持体に共有または非共有結合することができる。本発明の支持体は、ナイロン、ニトロセルロース、ジアゾニトロセルロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、塩化ポリビニール、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、セファロース、寒天、澱粉、または生物分子の固定化が可能な他のいかなる材料から成ってもよい。材料は、フィルター、膜、平坦面、管、導管、ウェル、シート、粒子、ビーズ、マイクロスフェア(微粒子)、カラム、ファイバー(例えば、光ファイバー)などに形成することができる。支持体はまた、12−ウェル、24−ウェル、48−ウェル、96−ウェル、384−ウェル、および1537−ウェルプレートのような複数ウェル方式(例えば、マイクロタイタープレート)で構成されてもよい。粒子またはビーズは、ガラス、ラテックス、磁性材料(磁性、常磁性、または超磁性ビーズ)または他の適切な材料で作ることができる。本発明に使い得る支持体の一例は、例えばLuminex Corporation(テキサス州、オースチン)によって製造販売されている色コードされた一組のマイクロスフェアがある。
ここで用いる用語「アレイ」とは、支持体上の一定の分子または物質の整然配列を意味し、これには支持体に配列または固定化されたDNA、RNA、タンパク質などの生物分子または化学物質が含まれるが、これらには限定されない。オリゴヌクレオチド、プローブ、受容体、抗体などの生物分子または標的と反応する物質のアレイは、バイオテクノロジー産業および関連分野においてますます重要なツールとなってきた。多数の生物分子からなるアレイは、薬物スクリーニング、核酸配列決定、突然変異解析、ゲノムおよびプロテオーム適用などを含む多様な適用での使用が可能である。そのようなアレイは、マイクロプレート、ガラススライド、ビーズ、マイクロスフェア、マイクロ流体デバイスまたは標準ブロッティング用膜上に形成することができ、「アレイ」、マイクロアレイまたはチップと称される。捕捉分子を、共有または非共有的相互作用を介して支持体に結合させてもよい。平らな表面に結合される場合、捕捉分子は、特定の捕捉分子のいずれもがアレイ上のその位置によって確認され得るように整然と結合される。
本発明において「捕捉試薬」とは、一つまたはそれ以上の生物分子を含む溶液からDNA結合タンパク質または検出デュプレックスを特異的に捕捉するような分子を意味する。捕捉試薬の例としては、ポリおよびモノクローナル抗体ならびに抗体断片があげられる。捕捉試薬は、ハプテンまたは結合部に結合する分子でもよい。特異的DNA結合タンパク質への天然親和性を有するタンパク質およびDNA結合タンパク質に特異的に結合するように作出されたタンパク質もまた、この定義に含まれる。捕捉分子はまた、DNA結合タンパク質に結合する他の分子に結合する分子でもよい。例えば、抗ウサギIgGを使ってウサギ抗体−タンパク質複合体を捕捉してもよい。同様に、プロテインGを使ってヤギ抗体−タンパク質複合体を捕捉してもよい。捕捉試薬および対応する結合部の例を、表1に示す。
ここでいう「プロファイル」は、生物学的、生化学的または化学的系の二つまたはそれ以上の性質の測定の組合せである。測定は、同時または順に行なわれる。例えば、プロファイルは、試料中の二つまたはそれ以上のタンパク質の濃度で構成されてもよい。プロファイルの他の例は、試料中の二つまたはそれ以上のタンパク質のリン酸化状態である。プロファイルは、定量的または定量的測定から構成されてもよく、客観的データとともに主観的データを含んでもよい。
ここでいう「配列特異的切断試薬」(sequence-specific cleavage reagernt)は、特異的DNA配列の認識に基づいて特異的部位でDNAを切断することができる試薬である。配列特異的切断試薬の例としては、EcoR1、HindIIIおよびBamHIなどのタイプII制限エンドヌクレアーゼがあげられる。配列特異的切断試薬にはまた、特異的DNA配列に結合して酵素結合部位から一定距離のところでDNAを切断するようなタイプIIs(または「ホーミング」)制限エンドヌクレアーゼの種類も含まれる。
ここでいう「外部切断試薬」(external cleavage reagent)とは、核酸の一つまたはそれ以上の鎖の消化すなわち切断を核酸の一つまたはそれ以上の末端またはその近傍で開始する試薬を意味する。消化すなわち切断は、開始部位から単一方向に進行する。外部切断試薬には、エキソヌクレアーゼとして通常公知の酵素が含まれる。外部切断試薬の例およびそれらの性質を図2に示す。
ここでいう「プローブ捕捉配列」とは、標識または非標識オリゴヌクレオチドまたは核酸プローブを捕捉するのに用い得るDNAの配列を意味する。配列は、一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブ捕捉配列は、検出デュプレックスまたはDNA−タンパク質複合体を捕捉するのに用い得る。
ここでいう「シグナル増幅法」とは、「一標識」検出法を用いて達成され得るシグナルを超えて生物学的分析のシグナルを増強させるために用いられる方法を意味する。シグナル増幅法は、チラミドシグナル増幅法のような酵素触媒されたレポーター付着に基づいてもよく、酵素増幅法に基づいてもよい。代わりに、標識の数を増加させる方法を用いてもよい。そのような方法には、二次検出試薬のための複数の結合部位を含むデンドリマー、分枝ポリマーおよび長直鎖ポリマーの結合が含まれる。これら方法の例としては、オリゴヌクレオチドデンドリマー、分枝DNA、およびハイブリド捕捉があげられるが、これらには限定されない。他の増幅法は当業者に公知であって、本発明の状況で使用できる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応のような核酸増幅法およびローリングサークル型増幅法もまた、得られたシグナルの増幅に使用できる。これら方法の多くは核酸検出の感度を上げるために当初は設計されたが、抗体、ペプチド、アビジンまたはストレプトアビジンなどの検出試薬に適当な核酸分子を単に付することによって他の分子の検出にも容易に適用することができる。本発明では、アッセイによって生じたシグナルを増強するためにシグナル増幅法のいずれを用いてもよい。
オリゴヌクレオチドを、標準EDCカルボキシラートカップリングケミストリーを用いてビーズにカップリングさせた。概述すれば、ビーズをMES緩衝液pH4.7中に懸濁させて、オリゴヌクレオチドを最終濃度2μMになるように加える。新鮮なEDCを加えて最終濃度を1〜2mg/mlにして、暗所で回転させながらビーズ懸濁液と30分間反応させる。同様の濃度の新鮮EDCをビーズ懸濁液に再度加えて、さらに2時間暗所で回転させながら反応させる。カップリングさせたビーズを50mMトリス(pH7.5)、100mM NaCl、0.05%ツイーン20で1回、0.2%SDSのPBS溶液で1回、0.02%ツイーン20を含むPBS(pH7.5)で2回、PBS(pH7.5)で1回洗浄し、pH 7.5のPBSに再懸濁させて最終濃度を1000〜2000ビーズ/マイクロリットルにする。
オリゴヌクレオチドアニーリング
検出デュプレックスを、タグ配列、NF−kB結合部位および5’リン酸基を有するオリゴヌクレオチドPO4Kbfor(P04-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG)ならびにタグ配列を欠く相補的オリゴヌクレオチドKBrev(TCCTGGGGATCCCCTCAACT)から組み立てた。
PO4KbforおよびKBrevを、まず100μMのオリゴヌクレオチドストックをアニーリング緩衝液(40mMトリスpH7.5、100mM NaClおよび1mM EDTA)中に希釈して20nM PO4Kbfor:1μM KBrevの比にして、アニーリングした。次いで、100μlのオリゴヌクレオチド混合物を95℃まで1分間加熱して、45分間かけて直線的に室温まで冷却した。一本鎖タグ配列を示す検出デュプレックスを含むアニーリングした混合物1μlを、250ngのポリdI−dCおよび0.5%ウシ血清アルブミン(フラクションV)を含む転写因子結合用緩衝液(10mMトリスpH7.5、50mM NaCl、2mM KCl、2mM MgCl2)19μlに加えて、種々の量のNF−kB P50タンパク質とともに室温で15分間インキュベートした。0.35%BSAを含む転写因子結合用緩衝液25μlに懸濁させた1800個のビーズを適切な反応物に加えて、室温で30分間インキュベートした。DNA結合タンパク質−検出デュプレックス複合体のビーズ表面へのハイブリダイゼーションに続いて、0.1μgのNF−kB P50特異的一次抗体(Santa Cruz Biotechnolgy、カタログ番号SC−114)を含む転写因子結合用緩衝液25μlを検出デュプレックス−試料−ビーズ混合物に加えて、暗所で攪拌しながら室温で20分間インキュベートした。フィルタープレート(Millipore MABV1250)および真空多岐管を用いて、0.35%BSAを含む転写因子結合用緩衝液100μlでビーズを1回洗浄した。50μlの1:500希釈のフィコエリスリン標識した抗ウサギ二次抗体(シグマ、カタログ番号P9537)を各分析物に加えた後、暗所で攪拌しながら室温で30分間インキュベートした。各分析物25μlを、Luminex 100機器を用いて解析した。この実験からのデータを図12に示すが、得られたシグナルは検出デュプレックスに加えたDNA結合タンパク質の量への濃度依存的応答を示す。
2μgの捕捉試薬(Santa Cruz Biotechnologies、NFKb P65抗体、カタログ番号SC−372)を、組換えプロテインG(Upstate Biotechnology)に共有カップリングさせたビーズ支持体とともにインキュベートする。このインキュベーションは暗所で攪拌しながら室温で2時間行なう。次いで、ビーズを3×200μl量の転写因子用緩衝液で洗浄して、プロテインGビーズ表面に結合しなかった抗体を除去する。200fmoleのビオチン−HPNFKB65ヘアピン検出デュプレックス:
本実施例では、クラスII制限エンドヌクレアーゼを、ビーズにカップリングしたヘアピンオリゴヌクレオチドを含んでなる検出デュプレックスとともに用いる。クラスII制限酵素は、DNAを認識してそれに結合する同一部位で二本鎖DNAを切断する。
検出デュプレックスを、NF−kB結合部位、Fok1結合部位およびタグ配列を含んでなるFORと称されるオリゴヌクレオチド(ビオチン−AAGGATGAGCGGGGGATCCCAATAGGCGGCTGCTTATCGGTCTAT)をFORオリゴヌクレオチドに相補的であるが相補的タグ配列を欠くbREBと称されるオリゴヌクレオチド(CTATTGGGATCCCCGCTCATCCTT)にハイブリダイズさせることによって組み立てた。
オリゴヌクレオチド対のハイブリダイゼーションは次のようにして行なった。bREVおよびFORを、40mMトリスpH7.5、100mM NaClおよび1mM EDTAを含む緩衝液中でそれぞれ1μMおよび40nMに希釈した。次いで、オリゴヌクレオチドを95℃で1分間加熱して、45分間かけて室温まで冷却した。
ラムダエキソヌクレアーゼは、5’リン酸基を有する二本鎖DNAに高度に特異的で、リン酸化されていないDNA上で著しく低い活性を有する。DNAのラムダエキソヌクレアーゼ消化は5’から3’の方向で起きる。
タグ配列、NF−kB結合部位および5’リン酸基を含むオリゴヌクレオチドPO4Kbfor(P04-AGTTGAGGGGATCCCCAGGAGCGGCTTATCGGTCTATTCAACTCCCCTAGGGG)を、捕捉タグ配列を欠くビオチン化した相補的オリゴヌクレオチドであるビオチンKBrev(TCCTGGGGATCCCCTCAACT−ビオチン)にアニーリングさせた。
アニーリングは、まず100μMのオリゴヌクレオチドストックをアニーリング緩衝液(40mMトリスpH 7.5、100mM NaClおよび1mM EDTA)に希釈して、400nM PO4Kbfor:10μMビオチンKBrevの比にした。次いで、オリゴヌクレオチド混合物を95℃で1分間加熱して、45分間かけて室温まで冷却して、一本鎖タグ配列を表す二本鎖対を形成した。タグ捕捉配列にカップリングした約50,000個のビーズを、50μlのアニーリングしたオリゴヌクレオチドと室温で1時間ハイブリダイズさせた。次いで、ビーズを洗浄してハイブリダイズしなかったオリゴヌクレオチドを除去して、転写因子結合用緩衝液中に再懸濁した。
転写因子結合配列およびプローブ−捕捉配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドPO4P50(5'P04AGTTGAGGGGATCCCCAAGGGCGAAGGAACTCGACGTGGAGCCGTTTTT−アミノC6)を、既述したようにアミノ−C6を介してビーズにカップリングさせる。オリゴヌクレオチドPO4P50revをPO4P50にカップリングしたビーズ(1pmole/1000ビーズ)を、転写因子結合用緩衝液(10mMトリスpH7.5、50mM NaCl、2mM KCl、2mM MgCl2)中で1時間ハイブリダイズさせる。次いで、ビーズを洗浄して、転写因子結合用緩衝液中に1000ビーズ/μlの濃度で再懸濁させる。次いで、結合反応を、0.35%BSAおよび0.1〜2μgのポリdI−dCを含む20μl量の転写因子結合用緩衝液中で1000個のビーズを試料と室温で10分間インキュベートすることによって行なう。結合反応の後、20μlの3ユニットのラムダエキソヌクレアーゼを含む3mM MgCl2に増補した転写因子結合用緩衝液または同等のラムダエキソヌクレアーゼ保存緩衝液を適当な反応物に加えて、37℃で15分間インキュベートする。次いで、1pmoleのビオチン標識した一本鎖プローブDNAを各反応物に加えて、95℃で1分間加熱し、続いて室温になるまで30分間にわたって冷却することによってビーズとハイブリダイズさせる。プローブのビーズカップリングしたDNAとのハイブリダイゼーションの後、真空およびフィルタープレートを用いて2×100μl量のPBS pH7.5で分析物を洗浄する。ビーズを100μlの2μg/mlのSA−PEのPBS(pH7.5)溶液中に再懸濁させる。室温で10分間インキュベートした後、Luminex 100機器を用いて分析物を解析する。
対照細胞抽出物10μgおよび10ゲルシフトユニットの組換えNF−kBP50でスパイクされたHeLa細胞抽出物10μgを、別々に標識用緩衝液(PBS pH8.0)20μlに懸濁させる。0.5mgの水溶性型N−ヒドロキシスクシンイミド−ビオチン(NHS−ビオチン)を各標識反応物に加える。ボルテックス混合し、室温で2時間インキュベートする。30μlの転写因子結合用緩衝液(10mMトリスpH7.5、50mM NaCl、2mM KCl、2mM MgCl2)を各標識反応物に加えて、取り込まれなかったNHS−ビオチンをG−25スピンカラム上で脱塩することによって除去する。1ゲルシフトユニットの脱塩された標識された試料を、NF−kB P50結合部位を有するヘアピン検出分子にカップリングしたビーズとともにインキュベートする。このインキュベーションは、100ngのポリdI−dCおよび0.35%BSAフラクションVを含む転写因子結合用緩衝液の全量20μl中で行なう。室温で10分間インキュベートした後、80μlの2μl/mlのストレプトアビジン−フィコエリスリンの転写因子結合用緩衝液溶液を加え、10分間インキュベートして、Luminex 100機器を用いて解析する。組換えNF−kB P50でスパイクされた標識HeLa細胞抽出物とともにインキュベートしたビーズは、組換えNF−kB P50でスパイクされなかった標識HeLa細胞核抽出物に較べて、それら表面に連なる有意なフィコエリスリンシグナルを有する。
Claims (19)
- 配列特異的DNA結合タンパク質の検出方法であって、
(a) 検出デュプレックス(duplex)と、少なくとも一つの配列特異的DNA結合タンパク質を含むと思われる試料とを、該デュプレックスと該DNA結合タンパク質との間の配列特異的結合をさせるに十分な時間接触させ、
(b) 工程(a)からの混合物と、検出デュプレックスを切断できる切断試薬とを接触させ、ここで検出デュプレックスの切断は該DNA結合タンパク質の該デュプレックスへの結合によって阻害され、かつ
(c) 該DNA結合タンパク質による該切断の阻害を検出する
ことを含んでなる、方法。 - 切断試薬が、配列特異的切断試薬である、請求項1に記載の方法。
- 配列特異的切断試薬が、制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、検出デュプレックスが、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼが、タイプII制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、タイプII制限エンドヌクレアーゼ認識部位である、請求項3に記載の方法。
- 制限エンドヌクレアーゼが、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼであり、かつ、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が、タイプIIs制限エンドヌクレアーゼ認識部位である、請求項3に記載の方法。
- 該ヌクレアーゼが有意なエンドヌクレアーゼ活性を欠くエキソヌクレアーゼである、請求項1に記載の方法。
- 検出デュプレックスが、
(i)タグ配列を含む第一のオリゴヌクレオチドと、
(ii)第一のオリゴヌクレオチドと相補的であって、検出可能な標識を含んでなる第二のオリゴヌクレオチドと
を含んでなる、請求項1に記載の方法。 - 検出デュプレックスが、捕捉タグをさらに含んでなる、請求項7に記載の検出法。
- 検出デュプレックスが、試料と接触させる前に捕捉タグを介して固体支持体上に固定化される、請求項8に記載の方法。
- 検出デュプレックスが、捕捉タグを介して固体支持体上に固定化される、請求項8に記載の方法。
- 複数の検出デュプレックスを用い、各検出デュプレックスが固体表面の予め決められた位置でのデュプレックスの捕捉を可能にする捕捉タグを有している、請求項8に記載の方法。
- 配列特異的DNA結合タンパク質の検出方法であって、
(a) 少なくとも一つの配列特異的DNA結合タンパク質を含むと思われる試料と、検出デュプレックスとを、該デュプレックスと該結合タンパク質との間の配列特異的結合をさせるに十分な時間接触させ、かつ
(b) 該デュプレックスと該結合タンパク質との間の結合を検出する
ことを含んでなる、方法。 - 工程(a)または(b)の前または後で、検出デュプレックスを固体支持体上に固定化する工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。
- 固定化がデュプレックス上の捕捉タグを介してなされる、請求項13に記載の方法。
- 検出が、検出デュプレックスとの接触前に、該タンパク質試料を検出可能な標識で標識することにより行われる、請求項14に記載の方法。
- 検出が、該結合タンパク質を特異的に結合する検出試薬により行われる、請求項14に記載の方法。
- 検出試薬が抗体である、請求項16に記載の方法。
- 該検出デュプレックスが標識され、該固定化工程が結合タンパク質の表面への捕捉により行われる、請求項13に記載の方法。
- 配列特異的DNA結合タンパク質の検出方法であって、
(a) 捕捉表面と、少なくとも一つの配列特異的DNA結合タンパク質を含むと思われる試料とを、捕捉表面で該配列特異的結合タンパク質を捕捉させるに十分な時間接触させ、
(b) 該捕捉表面と検出デュプレックスとを接触させ、かつ
(c) 該デュプレックスと該結合タンパク質との間の結合を検出する
ことを含んでなる、方法。
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