JPWO2006093097A1 - アシストプローブ及びその利用方法 - Google Patents

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Abstract

パルサー法における感度の向上と多遺伝子同時検出が可能なターゲット遺伝子の検出方法、該方法に用いられるアシストプローブ、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法を提供する。５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられた第１プローブ、及び５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられた第２プローブ、並びに複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、Ｙ、Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は５’端部から順に前記ターゲット領域及び前記核酸領域Ｚ、Ｙ、Ｚが設けられた構造を有するようにした。

Description

本発明は、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを用いたシグナル増幅方法に用いられるアシストプローブ及びその利用方法に関する。より詳細には、マイクロプレート型、スライドガラス型、微粒子型、電気伝導性基板等の支持体を用いたＤＮＡチップ（以下総称してＤＮＡチップと称する）上で、上記シグナル増幅方法を用いる際の感度上昇、及び複数遺伝子同時検出を可能とするアシストプローブ、該アシストプローブを用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法に関する。
酵素を使用しないシグナル増幅方法として、下記化学式（１）及び下記化学式（２）で示される一対のオリゴヌクレオチド（以下、ＨＣＰと称する）を用い、ＨＣＰの自己集合体（ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法（以下、パルサー法（ＰＡＬＳＡＲ法）と称す）及び該方法を利用した遺伝子の検出方法が報告されている（特許文献１及び２等）。
Figure 2006093097
Figure 2006093097
前記式（１）及び（２）において、領域Ｘと領域Ｘ’、領域Ｙと領域Ｙ’、領域Ｚと領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、複数対のＨＣＰの結合により下記化学式（３）で示される自己集合体が形成される。本明細書中でシグナルプローブポリマーとは、ＨＣＰにより形成される前記自己集合体を言う。またアシストプローブとは、検出するターゲット遺伝子と相補的な配列、及びＨＣＰと相補的な配列の両方を有するプローブを言い、ターゲット遺伝子とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。
Figure 2006093097
また、特許文献３はパルサー法を利用したＤＮＡチップ上のターゲット遺伝子の検出方法を開示している。特許文献１〜３は、ターゲット遺伝子と自己集合体の複合体を形成させ、自己集合体を検出することによりターゲット遺伝子を高感度に検出する方法を開示している。ターゲット遺伝子上にシグナルプローブポリマーを形成させる方法としては、ＨＣＰ自体にターゲット遺伝子と相補的な配列が含まれるようにＨＣＰをデザインする方法、及びアシストプローブを使用する方法がある。このうちアシストプローブを形成する方法は、ターゲット遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシストプローブを準備することにより、一対のＨＣＰにより複数の遺伝子を同時に検出できるという利点を有している。
特許文献１〜３には、ＨＣＰの１領域と相補的な配列を有するアシストプローブが図示されているが、どの様なアシストプローブが感度良くターゲット遺伝子を検出できるかに関しては、検討されていない。
特許第３２６７５７６号 特許第３３１０６６２号 国際公開２００３／０２９４４１号 国際公開２００４／０７４４８０号 国際公開２００４／０７２３０２号
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、多種遺伝子同時検出にも対応したパルサー法による検出感度の向上を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、パルサー法に適したアシストプローブのデザイン方法を見出した。本発明は、パルサー法における感度の向上と多遺伝子同時検出が可能なターゲット遺伝子の検出方法、該方法に用いられるアシストプローブ、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明者らはアシストプローブのデザインについて鋭意研究を重ねた結果、パルサー法に最適なアシストプローブの設計方法を見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明のターゲット遺伝子の検出方法は、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブ（ＨＣＰ−１とも称する）と、
Figure 2006093097
 ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブ（ＨＣＰ−２とも称する）と、
Figure 2006093097
 （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対の第１及び第２プローブ（ＨＣＰとも称する）、並びに複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域と前記核酸領域Ｘ又は前記核酸領域Ｚとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を有するものを用いても良い。
また、前記アシストプローブとして、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＸＹＸ領域と、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域と、前記ターゲット領域とを含むアシストプローブを用いても良い。
前記ＸＹＸ領域と前記ＹＸ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
また、前記アシストプローブとして、５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ及び前記核酸領域ＹからなるＺＹ領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＺＹＺ領域とを含むアシストプローブを用いても良い。
前記ＺＹ領域と前記ＺＹＺ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブを前記ターゲット遺伝子を鋳型としてライゲーション反応させる反応工程を含み、該ハイブリダイゼーション反応を利用してターゲット遺伝子を検出することが可能である。
また、本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブが３’側ターゲット領域にポリｄＴ又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットＲＮＡを鋳型として逆転写させる反応工程を含み、該逆転写反応を利用してターゲット遺伝子を検出することができる。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法において、前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することができる。
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
Figure 2006093097
 ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
Figure 2006093097
 （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対の第１及び第２プローブと、複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第１及び第２プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とする。
本発明のアシストプローブの第１の態様は、前記本発明方法に用いられるアシストプローブであって、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｘを有するＸＹＸ領域と、前記ターゲット領域とが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域がポリｄＴ又はプライマー配列を有するアシストプローブを用いても良い。
前記アシストプローブとして、前記ＸＹＸ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むアシストプローブを用いても良い。
本発明のアシストプローブの第２の態様は、前記本発明方法に用いられるアシストプローブであって、５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚを有するＺＹＺ領域とが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域側の５’末端にリン酸基を有するアシストプローブが用いられる。
前記アシストプローブとして、前記ＺＹＺ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＹＺ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むアシストプローブを用いてもよい。
本発明のシグナルプローブポリマーは、前記本発明方法により形成されることを特徴とする。
本発明によれば、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上させることができる。また、本発明のアシストプローブのターゲット領域を変化させる事により多種遺伝子も同時に検出する事が可能である。
本発明のアシストプローブの第１の例を示す概略説明図である。 図１のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 図１のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。 アシストプローブの一例を示す概略説明図である。 図４のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 アシストプローブの他の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第２の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第３の例を示す概略説明図である。 図８のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 本発明のアシストプローブの第４の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第５の例を示す概略説明図である。 図１１のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 本発明のアシストプローブの第６の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第７の例を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は支持体に結合された捕捉用プローブを示す。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１００を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１０４を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１０６を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第８の例を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２００を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０２を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０４を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０６を示す概略説明図である。
符号の説明
１０ａ〜１０ｈ：本発明のアシストプローブ、１１ａ，１１ｂ：アシストプローブ、１２、１２ａ、１２ｂ：ターゲット遺伝子、１４：ＨＣＰ−２、１６：ＨＣＰ−１、１８：シグナルプローブポリマー、２０：捕捉用プローブ、２２：支持体、２４：アシストプローブ１０ｇと捕捉用プローブ２０の隣接部分、２６：プローブ。
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図１は本発明のアシストプローブの第１の例を示す概略説明図であり、図２及び図３は図１のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。図４は従来のアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、図５は図４のアシストプローブにターゲット遺伝子及びＨＣＰの一方が結合した模式図である。図６はアシストプローブの他の例を示す概略説明図である。
パルサー法に用いられるアシストプローブとしては、ＨＣＰの一方（ＨＣＰ−１）をそのままアシストプローブとして使用するものや、図４に示した如く、ＨＣＰの一方（ＨＣＰ−１）にターゲットに相補的な配列（ターゲット領域）を追加したデザインのものがあった。図４に示したアシストプローブ１１ａは、５’端部から順に、ＨＣＰ−１と同じ核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域ＺからなるＨＣＰ領域と、ターゲット遺伝子と相補的なターゲット領域Ｔを有し、図５に示した如く、ＨＣＰ領域は１領域ごとにＨＣＰ−２（符号１４）に結合するものである。なお、本発明において、前記核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺからなる群から選択される複数の核酸領域からなる領域をＨＣＰ領域と称する。
本発明のアシストプローブは、少なくとも１本のＨＣＰ−２と２領域で結合できるようにし、かつ残った領域で別のＨＣＰ−２とも結合できるようにしたものである。
図１に本発明のアシストプローブの一例を示す。図１において、１０ａは本発明のアシストプローブの第１の例であり、ターゲット領域ＴとＨＣＰ領域とからなり、ＨＣＰ領域として３領域を有するが、５’端部からＸＹＺではなく、ＸＹＸの３領域を有している（即ち、５’−ＸＹＸ−Ｔ−３’）。従って、ＨＣＰ−２（符号１４）とアシストプローブ１０ａを反応させると、図２に示した如く、アシストプローブは、１本のＨＣＰ−２と３領域中、２領域連続で結合し、残り１領域がポリマー形成のため別のＨＣＰ−２と結合する。よって、一対のＨＣＰ（符号１４，１６）の複数対、アシストプローブ１０ａ及びターゲット遺伝子１２を反応させることにより、図３に示した如く、一対のＨＣＰから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー１８が形成される。
但し、本発明において、図６に示した如く、結合の際に、アシストプローブのＨＣＰ領域側の末端とＨＣＰ−２の末端が一致するようなデザインは逆にシグナルが低下するため、アシストプローブのＨＣＰ領域側の末端が、ＨＣＰ−２と結合する時、ＨＣＰ−２の末端と重ならないように、アシストプローブをデザインする必要がある。図６において、１１ｂはアシストプローブの他の例である。
図７は、本発明のアシストプローブの第２の例を示す概略説明図である。
図１においては、３’側にターゲット領域を設けたアシストプローブを示したが、ターゲット領域とＨＣＰ領域の位置に特に限定はなく、５’側にターゲット領域を設けたアシストプローブも本発明に含まれるものである。５’側にターゲット領域を設けた場合のアシストプローブの一例としては、図７に示した如く、５’側にターゲット領域Ｔを、３’側にＺＹＺの３領域からなるＨＣＰ領域を設けたアシストプローブ１０ｂ（５’−Ｔ−ＺＹＺ−３’）が挙げられる。
図８は本発明のアシストプローブの第３の例を示す概略説明図であり、図９は図８のアシストプローブにＨＣＰの一方（ＨＣＰ−２）及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。図１０は本発明のアシストプローブの第４の例を示す概略説明図である。
本発明のアシストプローブとして、２本以上のＨＣＰ−２と１本のアシストプローブとがそれぞれ２領域連続で結合できるようにしたものを用いても良い。
例えば、図８に示した如く、５’末端の第１のＨＣＰ領域（ＸＹＸ）と３’末端のターゲット領域Ｔとの間に、ＨＣＰ−２と２領域連続して結合できるＸＹの２領域を有する第２のＨＣＰ領域を挿入したアシストプローブ１０ｃ（５’−ＸＹＸ−ＹＸ−Ｔ−３’）が挙げられる。該アシストプローブ１０ｃとＨＣＰ−２を反応させると、図９に示した如く、１本のアシストプローブ１０ｃは、２本のＨＣＰ−２とそれぞれ２領域連続で結合する。
また、図１０に示した如く、５’末端のターゲット領域Ｔと３’末端の第１のＨＣＰ領域（ＺＹＺ）との間に、ＨＣＰ−２と２領域連続して結合できるＺＹの２領域を有する第２のＨＣＰ領域を挿入したアシストプローブ１０ｄ（５’−Ｔ−ＺＹ−ＺＹＺ−３’）を用いても良い。
なお、図８及び図１０では第２のＨＣＰ領域を１個挿入した場合の例を示したが、該第２のＨＣＰ領域を複数有するアシストプローブを用いることも可能である。
図１１は本発明のアシストプローブの第５の例を示す概略説明図であり、図１２は図１１のアシストプローブにＨＣＰの一方（ＨＣＰ−２）及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。図１３は本発明のアシストプローブの第６の例を示す概略説明図である。
本発明のアシストプローブとして、ターゲット配列やＨＣＰに全く関係のない配列（Spacer配列）をもつスペーサー領域Ｓを、ターゲット領域とＨＣＰ領域の間や第１のＨＣＰ領域と第２のＨＣＰ領域の間に挿入したアシストプローブを用いることにより、シグナル検出の感度が上昇する場合もある。
本発明のアシストプローブにおいて、スペーサー領域の塩基数は特に限定されないが、０〜５塩基が好ましい。
前記スペーサー領域を有するアシストプローブとしては、例えば、ターゲット領域とＨＣＰ領域の間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’（図１１のアシストプローブ−１０ｅ参照）、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］、第１のＨＣＰ領域と第２のＨＣＰ領域との間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−ＹＸ−Ｔ−３’（図１３のアシストプローブ−１０ｆ参照）、又は５’−Ｔ−ＺＹ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］、ターゲット領域と第２のＨＣＰ領域との間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−ＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹ−ＺＹＺ−３’］、並びにターゲット領域と第２のＨＣＰ領域の間及び第２のＨＣＰと第１のＨＣＰ領域の間の両方にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−ＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］等が挙げられる。
図１４は、ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられるアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、１０ｇは本発明のアシストプローブの第７の例である。図１４に示した如く、アシストプローブとして、ターゲット領域の５’末端をリン酸化させたアシストプローブを用いることにより、ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法（例えば、特許文献４等参照。）にも好適に使用することができる。
前記ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説明する。図１５〜図１８は、図１４に示したアシストプローブ及びライゲーション反応を利用した本発明のターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図である。
図１５において、（ａ）はターゲット遺伝子（符号１２ａ）を示し、（ｂ）は該ターゲット遺伝子に相補的な領域Ｔ2を３’端側に有する捕捉用プローブ（キャプチャープローブ：符号２０）を結合させた支持体２２を示す。図１６は、アシストプローブ１０ｇ、捕捉用プローブ２０及びターゲット遺伝子１２ａが結合した概略説明図である。図１７は、ターゲット遺伝子１２ａを解離させ、アシストプローブ１０ｇを連結させた捕捉用プローブ２０が支持体２４に結合している状態を示す。
図１４〜図１６に示した如く、前記アシストプローブ１０ｇ及び前記捕捉用プローブ２０は、アシストプローブ１０ｇと捕捉用プローブ２０をターゲット遺伝子１２ａに結合させる時に、該捕捉用プローブ２０の末端と該アシストプローブ１０ｇの末端が隣接する状態でターゲット遺伝子１２ａとアニーリングするように構成されている。
図１６に示した如く、アシストプローブ１０ｇ及び捕捉用プローブ２０をターゲット遺伝子１２ａにハイブリダイズさせる（ステップ１００）。その後、リガーゼを用いたライゲーション反応を行う（ステップ１０２）。前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子１２ａの配列と相補的な場合にのみ、該ライゲーション反応により前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０は連結される。
前記ライゲーション反応後、前記ターゲット遺伝子１２ａを除去する（ステップ１０４）。前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子１２ａの配列と相補的な場合は、図１７に示した如く、アシストプローブ１０ｇを連結させた捕捉用プローブ２０が支持体２４に結合した状態となる。
その後、一対のＨＣＰ（１４、１６）の複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより（ステップ１０６）、図１８に示した如く、支持体上に一対のＨＣＰから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー１８が形成される。
一方、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子の配列と相補的でない場合は、前記ステップ１０２後、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０は連結されず、ターゲット遺伝子を除去後、捕捉用プローブ２０のみ支持体２４に結合した状態となる。従って、その後、一対のＨＣＰの複数対を添加し、形成させたポリマーは支持体上に捕捉されず、洗浄等により除去される。
よって、支持体上に捕捉されたシグナルプローブポリマーを検出することによりターゲット遺伝子を検出することができる。得に、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４がターゲット遺伝子の変異部位に位置するように構成することにより、変異遺伝子を検出することができる。
図１９は、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられるアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、１０ｈは本発明のアシストプローブの第８の例である。図１５に示した如く、アシストプローブとして３’側ターゲット領域にポリｄＴ配列など逆転写反応のプライマーとして利用できる配列を有するアシストプローブを用いることにより、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法（例えば、特許文献５等参照。）にも好適に使用することができる。
前記逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説明する。図２０〜２３は、アシストプローブ及び逆転写反応を利用した本発明のターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す断面概略説明図である。図２０〜図２３においては、ターゲット遺伝子がｍＲＮＡであり、アシストプローブとして、３’末端のターゲット領域にポリｄＴを有し、５’側にＸＹＸの３領域を有するＨＣＰ領域を設けたアシストプローブ１０ｈを用いた場合の例を示した。
ターゲット遺伝子であるｍＲＮＡ（符号１２ｂ）のポリＡテール部分に３’末端にポリｄＴを含むアシストプローブ１０ｈを結合させ（ステップ２００、図２０）、該アシストプローブ１０ｈをプライマーとして用いて、逆転写反応によりｍＲＮＡの逆転写反応を行い、該アシストプローブ及び該ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域からなるプローブ２６を形成させる（ステップ２０２、図２１）。
次に、図２２に示した如く、ｍＲＮＡを前記プローブ２６から解離させ、ｃＤＮＡ領域とＸＹＸのＨＣＰ領域を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドとする（ステップ２０４）。
解離後のプローブ２６を、ｍＲＮＡのｃＤＮ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブ２８にハイブリダイズさせ、前記プローブ２６を捕捉する（ステップ２０６、図２３）。なお、前記捕捉用プローブを予め支持体２２に結合させておくことが好ましい。
その後、一対のＨＣＰの複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより（ステップ２０８）、捕捉用プローブ２８で捕捉されたシグナルプローブポリマーが形成され、該シグナルプローブポリマーを検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することができる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
（実施例１）
１．材料
パルサー法で用いられる一対のＨＣＰとして、５’末端をＣｙ３標識した下記塩基配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブ（ＨＣＰ−１Ａ及びＨＣＰ−２Ａ）を用いた。
ＨＣＰ−１Ａの塩基配列（配列番号１）
5'-Cy3-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｚ領域（CGCGTATACTAAGCGTAATG）-3'
ＨＣＰ−２Ａの塩基配列（配列番号２）
5'-Cy3-Ｘ’領域（GATCGGCTATCATTGATACG）・Ｙ’領域（GACTATATCGAACTTAGGCG）・Ｚ’領域（CATTACGCTTAGTATACGCG）-3'
ターゲットＤＮＡとして、ApolipoproteinE（ApoE）由来の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ−１）を用いた。
ターゲットＤＮＡ−１の塩基配列（配列番号３）
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
アシストプローブとして、前記ＨＣＰ−１Ａの３領域中２領域をＸＹＸの順で含み、３’末端にターゲットＤＮＡ−１と相補する配列の領域（Ｔ領域）を有する下記アシストプローブ−１を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（配列番号４）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
キャプチャープローブとして、前記ターゲットＤＮＡ−１に相補的な塩基配列を有する下記キャプチャープローブ−１を用いた。
キャプチャープローブ−１の塩基配列（配列番号５）
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'
２．方法
（２−１）第１ハイブリダイゼーション
下記組成の第１ハイブリダイゼーション溶液（全量５０μＬ）を調製し、該溶液を９５℃で２分間反応させ、６８℃で１２０分間反応させた後、１５℃に保持した。
〈第１ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
微小粒子（前記キャプチャープローブ−１を表面に固定したポリスチレン製粒子）：５００個
アシストプローブ−１：１ｐｍｏｌ
ターゲットＤＮＡ−１：０，１００又は５００ａｍｏｌ
３Ｍ ＴＭＡＣ
０．１％ N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
（２−２）第２ハイブリダイゼーション（パルサー法）
前記第１ハイブリダイゼーション後の溶液に下記組成になるように５０μＬのＨＣＰ溶液を添加し（最終量１００μＬ）、６８℃で６０分間反応させた後、１５℃に保持した。なお、ＨＣＰ溶液は添加前に９５℃２分間の熱処理を行った。
〈第２ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
ＨＣＰ−１Ａ：５０ｐｍｏｌ
ＨＣＰ−２Ａ：５０ｐｍｏｌ
３Ｍ ＴＭＡＣ
０．１％ N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
（２−３）測定
前記第２ハイブリダイゼーション後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は、フローサイトメーターとしてLuminex100（Luminex社製）を使用し、各項目１００個前後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表１に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示した。
Figure 2006093097
（実施例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１のＸＹＸ領域とＴ領域との間に５つのポリｄＴからなるスペーサー領域ＳとＹＸ領域を挿入した下記アシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−２の塩基配列（配列番号６）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｓ領域（TTTTT）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
（比較例１）
アシストプローブとして、従来のアシストプローブである下記アシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−３の塩基配列（配列番号７）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｚ領域（CGCGTATACTAAGCGTAATG）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
表１に示した如く、本発明のアシストプローブを用いた実施例１及び２は、従来のアシストプローブを用いた比較例１に比べてシグナルが著しく上昇した。
本発明は、自己集合体を形成する一対のオリゴヌクレオチドを用いたシグナル増幅方法に用いられるアシストプローブ及びその利用方法に関する。より詳細には、マイクロプレート型、スライドガラス型、微粒子型、電気伝導性基板等の支持体を用いたＤＮＡチップ（以下総称してＤＮＡチップと称する）上で、上記シグナル増幅方法を用いる際の感度上昇、及び複数遺伝子同時検出を可能とするアシストプローブ、該アシストプローブを用いたターゲット遺伝子の検出方法、及び該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法に関する。
酵素を使用しないシグナル増幅方法として、下記化学式（１）及び下記化学式（２）で示される一対のオリゴヌクレオチド（以下、ＨＣＰと称する）を用い、ＨＣＰの自己集合体（ポリマー）を形成させるシグナル増幅方法（以下、パルサー法（ＰＡＬＳＡＲ法）と称す）及び該方法を利用した遺伝子の検出方法が報告されている（特許文献１及び２等）。
Figure 2006093097
Figure 2006093097
前記式（１）及び（２）において、領域Ｘと領域Ｘ’、領域Ｙと領域Ｙ’、領域Ｚと領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的核酸領域であり、複数対のＨＣＰの結合により下記化学式（３）で示される自己集合体が形成される。本明細書中でシグナルプローブポリマーとは、ＨＣＰにより形成される前記自己集合体を言う。またアシストプローブとは、検出するターゲット遺伝子と相補的な配列、及びＨＣＰと相補的な配列の両方を有するプローブを言い、ターゲット遺伝子とシグナルプローブポリマーをつなぐ働きをする。
Figure 2006093097
また、特許文献３はパルサー法を利用したＤＮＡチップ上のターゲット遺伝子の検出方法を開示している。特許文献１〜３は、ターゲット遺伝子と自己集合体の複合体を形成させ、自己集合体を検出することによりターゲット遺伝子を高感度に検出する方法を開示している。ターゲット遺伝子上にシグナルプローブポリマーを形成させる方法としては、ＨＣＰ自体にターゲット遺伝子と相補的な配列が含まれるようにＨＣＰをデザインする方法、及びアシストプローブを使用する方法がある。このうちアシストプローブを形成する方法は、ターゲット遺伝子と相補的な部分を変えた複数のアシストプローブを準備することにより、一対のＨＣＰにより複数の遺伝子を同時に検出できるという利点を有している。
特許文献１〜３には、ＨＣＰの１領域と相補的な配列を有するアシストプローブが図示されているが、どの様なアシストプローブが感度良くターゲット遺伝子を検出できるかに関しては、検討されていない。
特許第３２６７５７６号 特許第３３１０６６２号 国際公開２００３／０２９４４１号 国際公開２００４／０７４４８０号 国際公開２００４／０７２３０２号
上記した従来技術の現状に鑑み、本発明者らは、多種遺伝子同時検出にも対応したパルサー法による検出感度の向上を可能にすべく鋭意研究を重ねてきた。その結果、パルサー法に適したアシストプローブのデザイン方法を見出した。本発明は、パルサー法における感度の向上と多種遺伝子同時検出が可能なターゲット遺伝子の検出方法、該方法に用いられるアシストプローブ、並びに該アシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するため、本発明者らはアシストプローブのデザインについて鋭意研究を重ねた結果、パルサー法に最適なアシストプローブの設計方法を見出し、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明のターゲット遺伝子の検出方法は、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブ（ＨＣＰ−１とも称する）と、
Figure 2006093097
 ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブ（ＨＣＰ−２とも称する）と、
Figure 2006093097
 （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対の第１及び第２プローブ（ＨＣＰとも称する）、並びに複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域と前記核酸領域Ｘ又は前記核酸領域Ｚとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を有するものを用いても良い。
また、前記アシストプローブとして、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＸＹＸ領域と、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域と、前記ターゲット領域とを含むアシストプローブを用いても良い。
前記ＸＹＸ領域と前記ＹＸ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
また、前記アシストプローブとして、５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ及び前記核酸領域ＹからなるＺＹ領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＺＹＺ領域とを含むアシストプローブを用いても良い。
前記ＺＹ領域と前記ＺＹＺ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブを前記ターゲット遺伝子を鋳型としてライゲーション反応させる反応工程を含み、該ハイブリダイゼーション反応を利用してターゲット遺伝子を検出することが可能である。
また、本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブが３’側ターゲット領域にポリｄＴ又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットＲＮＡを鋳型として逆転写させる反応工程を含み、該逆転写反応を利用してターゲット遺伝子を検出することができる。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法において、前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することができる。
本発明のシグナルプローブポリマーの形成方法は、５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
Figure 2006093097
 ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
Figure 2006093097
 （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
からなる一対の第１及び第２プローブと、複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第１及び第２プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とする。
本発明のアシストプローブの第１の態様は、前記本発明方法に用いられるアシストプローブであって、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｘを有するＸＹＸ領域と、前記ターゲット領域とが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域がポリｄＴ又はプライマー配列を有するアシストプローブを用いても良い。
前記アシストプローブとして、前記ＸＹＸ領域と前記ターゲット領域との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むアシストプローブを用いても良い。
本発明のアシストプローブの第２の態様は、前記本発明方法に用いられるアシストプローブであって、５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚを有するＺＹＺ領域とが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域側の５’末端にリン酸基を有するアシストプローブが用いられる。
前記アシストプローブとして、前記ＺＹＺ領域と前記ターゲット領域との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＹＺ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むアシストプローブを用いてもよい。
本発明のシグナルプローブポリマーは、前記本発明方法により形成されることを特徴とする。
本発明によれば、パルサー法を利用したターゲット遺伝子の検出感度を著しく向上させることができる。また、本発明のアシストプローブのターゲット領域を変化させる事により多種遺伝子も同時に検出する事が可能である。
以下に本発明の実施の形態を添付図面に基づいて説明するが、図示例は例示的に示されるもので、本発明の技術思想から逸脱しない限り種々の変形が可能なことはいうまでもない。
図１は本発明のアシストプローブの第１の例を示す概略説明図であり、図２及び図３は図１のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。図４は従来のアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、図５は図４のアシストプローブにターゲット遺伝子及びＨＣＰの一方が結合した模式図である。図６はアシストプローブの他の例を示す概略説明図である。
パルサー法に用いられるアシストプローブとしては、ＨＣＰの一方（ＨＣＰ−１）をそのままアシストプローブとして使用するものや、図４に示した如く、ＨＣＰの一方（ＨＣＰ−１）にターゲットに相補的な配列（ターゲット領域）を追加したデザインのものがあった。図４に示したアシストプローブ１１ａは、５’端部から順に、ＨＣＰ−１と同じ核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域ＺからなるＨＣＰ領域と、ターゲット遺伝子と相補的なターゲット領域Ｔを有し、図５に示した如く、ＨＣＰ領域は１領域ごとにＨＣＰ−２（符号１４）に結合するものである。なお、本発明において、前記核酸領域Ｘ、Ｙ及びＺからなる群から選択される複数の核酸領域からなる領域をＨＣＰ領域と称する。
本発明のアシストプローブは、少なくとも１本のＨＣＰ−２と２領域で結合できるようにし、かつ残った領域で別のＨＣＰ−２とも結合できるようにしたものである。
図１に本発明のアシストプローブの一例を示す。図１において、１０ａは本発明のアシストプローブの第１の例であり、ターゲット領域ＴとＨＣＰ領域とからなり、ＨＣＰ領域として３領域を有するが、５’端部からＸＹＺではなく、ＸＹＸの３領域を有している（即ち、５’−ＸＹＸ−Ｔ−３’）。従って、ＨＣＰ−２（符号１４）とアシストプローブ１０ａを反応させると、図２に示した如く、アシストプローブは、１本のＨＣＰ−２と３領域中、２領域連続で結合し、残り１領域がポリマー形成のため別のＨＣＰ−２と結合する。よって、一対のＨＣＰ（符号１４，１６）の複数対、アシストプローブ１０ａ及びターゲット遺伝子１２を反応させることにより、図３に示した如く、一対のＨＣＰから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー１８が形成される。
但し、本発明において、図６に示した如く、結合の際に、アシストプローブのＨＣＰ領域側の末端とＨＣＰ−２の末端が一致するようなデザインは逆にシグナルが低下するため、アシストプローブのＨＣＰ領域側の末端が、ＨＣＰ−２と結合する時、ＨＣＰ−２の末端と重ならないように、アシストプローブをデザインする必要がある。図６において、１１ｂはアシストプローブの他の例である。
図７は、本発明のアシストプローブの第２の例を示す概略説明図である。
図１においては、３’側にターゲット領域を設けたアシストプローブを示したが、ターゲット領域とＨＣＰ領域の位置に特に限定はなく、５’側にターゲット領域を設けたアシストプローブも本発明に含まれるものである。５’側にターゲット領域を設けた場合のアシストプローブの一例としては、図７に示した如く、５’側にターゲット領域Ｔを、３’側にＺＹＺの３領域からなるＨＣＰ領域を設けたアシストプローブ１０ｂ（５’−Ｔ−ＺＹＺ−３’）が挙げられる。
図８は本発明のアシストプローブの第３の例を示す概略説明図であり、図９は図８のアシストプローブにＨＣＰの一方（ＨＣＰ−２）及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。図１０は本発明のアシストプローブの第４の例を示す概略説明図である。
本発明のアシストプローブとして、２本以上のＨＣＰ−２と１本のアシストプローブとがそれぞれ２領域連続で結合できるようにしたものを用いても良い。
例えば、図８に示した如く、５’末端の第１のＨＣＰ領域（ＸＹＸ）と３’末端のターゲット領域Ｔとの間に、ＨＣＰ−２と２領域連続して結合できるＸＹの２領域を有する第２のＨＣＰ領域を挿入したアシストプローブ１０ｃ（５’−ＸＹＸ−ＹＸ−Ｔ−３’）が挙げられる。該アシストプローブ１０ｃとＨＣＰ−２を反応させると、図９に示した如く、１本のアシストプローブ１０ｃは、２本のＨＣＰ−２とそれぞれ２領域連続で結合する。
また、図１０に示した如く、５’末端のターゲット領域Ｔと３’末端の第１のＨＣＰ領域（ＺＹＺ）との間に、ＨＣＰ−２と２領域連続して結合できるＺＹの２領域を有する第２のＨＣＰ領域を挿入したアシストプローブ１０ｄ（５’−Ｔ−ＺＹ−ＺＹＺ−３’）を用いても良い。
なお、図８及び図１０では第２のＨＣＰ領域を１個挿入した場合の例を示したが、該第２のＨＣＰ領域を複数有するアシストプローブを用いることも可能である。
図１１は本発明のアシストプローブの第５の例を示す概略説明図であり、図１２は図１１のアシストプローブにＨＣＰの一方（ＨＣＰ−２）及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。図１３は本発明のアシストプローブの第６の例を示す概略説明図である。
本発明のアシストプローブとして、ターゲット配列やＨＣＰに全く関係のない配列（Spacer配列）をもつスペーサー領域Ｓを、ターゲット領域とＨＣＰ領域の間や第１のＨＣＰ領域と第２のＨＣＰ領域の間に挿入したアシストプローブを用いることにより、シグナル検出の感度が上昇する場合もある。
本発明のアシストプローブにおいて、スペーサー領域の塩基数は特に限定されないが、０〜５塩基が好ましい。
前記スペーサー領域を有するアシストプローブとしては、例えば、ターゲット領域とＨＣＰ領域の間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’（図１１のアシストプローブ−１０ｅ参照）、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］、第１のＨＣＰ領域と第２のＨＣＰ領域との間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−ＹＸ−Ｔ−３’（図１３のアシストプローブ−１０ｆ参照）、又は５’−Ｔ−ＺＹ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］、ターゲット領域と第２のＨＣＰ領域との間にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−ＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹ−ＺＹＺ−３’］、並びにターゲット領域と第２のＨＣＰ領域の間及び第２のＨＣＰと第１のＨＣＰ領域の間の両方にスペーサー領域を挿入したアシストプローブ［５’−ＸＹＸ−Ｓ−ＹＸ−Ｓ−Ｔ−３’、又は５’−Ｔ−Ｓ−ＺＹ−Ｓ−ＺＹＺ−３’］等が挙げられる。
図１４は、ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられるアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、１０ｇは本発明のアシストプローブの第７の例である。図１４に示した如く、アシストプローブとして、ターゲット領域の５’末端をリン酸化させたアシストプローブを用いることにより、ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法（例えば、特許文献４等参照。）にも好適に使用することができる。
前記ライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説明する。図１５〜図１８は、図１４に示したアシストプローブ及びライゲーション反応を利用した本発明のターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図である。
図１５において、（ａ）はターゲット遺伝子（符号１２ａ）を示し、（ｂ）は該ターゲット遺伝子に相補的な領域Ｔ2を３’端側に有する捕捉用プローブ（キャプチャープローブ：符号２０）を結合させた支持体２２を示す。図１６は、アシストプローブ１０ｇ、捕捉用プローブ２０及びターゲット遺伝子１２ａが結合した概略説明図である。図１７は、ターゲット遺伝子１２ａを解離させ、アシストプローブ１０ｇを連結させた捕捉用プローブ２０が支持体２４に結合している状態を示す。
図１４〜図１６に示した如く、前記アシストプローブ１０ｇ及び前記捕捉用プローブ２０は、アシストプローブ１０ｇと捕捉用プローブ２０をターゲット遺伝子１２ａに結合させる時に、該捕捉用プローブ２０の末端と該アシストプローブ１０ｇの末端が隣接する状態でターゲット遺伝子１２ａとアニーリングするように構成されている。
図１６に示した如く、アシストプローブ１０ｇ及び捕捉用プローブ２０をターゲット遺伝子１２ａにハイブリダイズさせる（ステップ１００）。その後、リガーゼを用いたライゲーション反応を行う（ステップ１０２）。前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子１２ａの配列と相補的な場合にのみ、該ライゲーション反応により前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０は連結される。
前記ライゲーション反応後、前記ターゲット遺伝子１２ａを除去する（ステップ１０４）。前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子１２ａの配列と相補的な場合は、図１７に示した如く、アシストプローブ１０ｇを連結させた捕捉用プローブ２０が支持体２４に結合した状態となる。
その後、一対のＨＣＰ（１４、１６）の複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより（ステップ１０６）、図１８に示した如く、支持体上に一対のＨＣＰから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー１８が形成される。
一方、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４の配列がターゲット遺伝子の配列と相補的でない場合は、前記ステップ１０２後、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０は連結されず、ターゲット遺伝子を除去後、捕捉用プローブ２０のみ支持体２４に結合した状態となる。従って、その後、一対のＨＣＰの複数対を添加し、形成させたポリマーは支持体上に捕捉されず、洗浄等により除去される。
よって、支持体上に捕捉されたシグナルプローブポリマーを検出することによりターゲット遺伝子を検出することができる。得に、前記アシストプローブ１０ｇと前記捕捉用プローブ２０の隣接部分２４がターゲット遺伝子の変異部位に位置するように構成することにより、変異遺伝子を検出することができる。
図１９は、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法に用いられるアシストプローブの一例を示す概略説明図であり、１０ｈは本発明のアシストプローブの第８の例である。図１５に示した如く、アシストプローブとして３’側ターゲット領域にポリｄＴ配列など逆転写反応のプライマーとして利用できる配列を有するアシストプローブを用いることにより、逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法（例えば、特許文献５等参照。）にも好適に使用することができる。
前記逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の一例を以下に説明する。図２０〜２３は、アシストプローブ及び逆転写反応を利用した本発明のターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す断面概略説明図である。図２０〜図２３においては、ターゲット遺伝子がｍＲＮＡであり、アシストプローブとして、３’末端のターゲット領域にポリｄＴを有し、５’側にＸＹＸの３領域を有するＨＣＰ領域を設けたアシストプローブ１０ｈを用いた場合の例を示した。
ターゲット遺伝子であるｍＲＮＡ（符号１２ｂ）のポリＡテール部分に３’末端にポリｄＴを含むアシストプローブ１０ｈを結合させ（ステップ２００、図２０）、該アシストプローブ１０ｈをプライマーとして用いて、逆転写反応によりｍＲＮＡの逆転写反応を行い、該アシストプローブ及び該ｍＲＮＡのｃＤＮＡ領域からなるプローブ２６を形成させる（ステップ２０２、図２１）。
次に、図２２に示した如く、ｍＲＮＡを前記プローブ２６から解離させ、ｃＤＮＡ領域とＸＹＸのＨＣＰ領域を有する一本鎖のオリゴヌクレオチドとする（ステップ２０４）。
解離後のプローブ２６を、ｍＲＮＡのｃＤＮ領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブ２８にハイブリダイズさせ、前記プローブ２６を捕捉する（ステップ２０６、図２３）。なお、前記捕捉用プローブを予め支持体２２に結合させておくことが好ましい。
その後、一対のＨＣＰの複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより（ステップ２０８）、捕捉用プローブ２８で捕捉されたシグナルプローブポリマーが形成され、該シグナルプローブポリマーを検出することにより、ターゲット遺伝子を検出することができる。
以下に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例は例示的に示されるもので限定的に解釈されるべきでないことはいうまでもない。
（実施例１）
１．材料
パルサー法で用いられる一対のＨＣＰとして、５’末端をＣｙ３標識した下記塩基配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブ（ＨＣＰ−１Ａ及びＨＣＰ−２Ａ）を用いた。
ＨＣＰ−１Ａの塩基配列（配列番号１）
5'-Cy3-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｚ領域（CGCGTATACTAAGCGTAATG）-3'
ＨＣＰ−２Ａの塩基配列（配列番号２）
5'-Cy3-Ｘ’領域（GATCGGCTATCATTGATACG）・Ｙ’領域（GACTATATCGAACTTAGGCG）・Ｚ’領域（CATTACGCTTAGTATACGCG）-3'
ターゲットＤＮＡとして、ApolipoproteinE（ApoE）由来の塩基配列を有する合成ＤＮＡ（ターゲットＤＮＡ−１）を用いた。
ターゲットＤＮＡ−１の塩基配列（配列番号３）
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
アシストプローブとして、前記ＨＣＰ−１Ａの３領域中２領域をＸＹＸの順で含み、３’末端にターゲットＤＮＡ−１と相補する配列の領域（Ｔ領域）を有する下記アシストプローブ−１を用いた。
アシストプローブ−１の塩基配列（配列番号４）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
キャプチャープローブとして、前記ターゲットＤＮＡ−１に相補的な塩基配列を有する下記キャプチャープローブ−１を用いた。
キャプチャープローブ−１の塩基配列（配列番号５）
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'
２．方法
（２−１）第１ハイブリダイゼーション
下記組成の第１ハイブリダイゼーション溶液（全量５０μＬ）を調製し、該溶液を９５℃で２分間反応させ、６８℃で１２０分間反応させた後、１５℃に保持した。
〈第１ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
微小粒子（前記キャプチャープローブ−１を表面に固定したポリスチレン製粒子）：５００個
アシストプローブ−１：１ｐｍｏｌ
ターゲットＤＮＡ−１：０，１００又は５００ａｍｏｌ
３Ｍ ＴＭＡＣ
０．１％ N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
（２−２）第２ハイブリダイゼーション（パルサー法）
前記第１ハイブリダイゼーション後の溶液に下記組成になるように５０μＬのＨＣＰ溶液を添加し（最終量１００μＬ）、６８℃で６０分間反応させた後、１５℃に保持した。なお、ＨＣＰ溶液は添加前に９５℃２分間の熱処理を行った。
〈第２ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
ＨＣＰ−１Ａ：５０ｐｍｏｌ
ＨＣＰ−２Ａ：５０ｐｍｏｌ
３Ｍ ＴＭＡＣ
０．１％ N-Lauroylsarcosine
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
４ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）
（２−３）測定
前記第２ハイブリダイゼーション後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は、フローサイトメーターとしてLuminex100（Luminex社製）を使用し、各項目１００個前後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表１に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示した。
Figure 2006093097
（実施例２）
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−１のＸＹＸ領域とＴ領域との間に５つのポリｄＴからなるスペーサー領域ＳとＹＸ領域を挿入した下記アシストプローブ−２を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−２の塩基配列（配列番号６）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｓ領域（TTTTT）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
（比較例１）
アシストプローブとして、従来のアシストプローブである下記アシストプローブ−３を用いた以外は実施例１と同様に実験を行った。結果を表１に示す。
アシストプローブ−３の塩基配列（配列番号７）
5'-Ｘ領域（CGTATCAATGATAGCCGATC）・Ｙ領域（CGCCTAAGTTCGATATAGTC）・Ｚ領域（CGCGTATACTAAGCGTAATG）・Ｔ領域（GTACTGCACCAGGCGGCCGC）-3'
表１に示した如く、本発明のアシストプローブを用いた実施例１及び２は、従来のアシストプローブを用いた比較例１に比べてシグナルが著しく上昇した。
本発明のアシストプローブの第１の例を示す概略説明図である。 図１のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 図１のアシストプローブを用いたシグナルプローブポリマーの形成方法の一例を示す概略説明図である。 アシストプローブの一例を示す概略説明図である。 図４のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 アシストプローブの他の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第２の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第３の例を示す概略説明図である。 図８のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 本発明のアシストプローブの第４の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第５の例を示す概略説明図である。 図１１のアシストプローブにＨＣＰ−２及びターゲット遺伝子が結合した模式図である。 本発明のアシストプローブの第６の例を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第７の例を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例を示す概略説明図であり、（ａ）はターゲット遺伝子、（ｂ）は支持体に結合された捕捉用プローブを示す。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１００を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１０４を示す概略説明図である。 図１４のアシストプローブ及びライゲーション反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ１０６を示す概略説明図である。 本発明のアシストプローブの第８の例を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２００を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０２を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０４を示す概略説明図である。 図１９のアシストプローブ及び逆転写反応を利用したターゲット遺伝子の検出方法の工程順の一例におけるステップ２０６を示す概略説明図である。
符号の説明
１０ａ〜１０ｈ：本発明のアシストプローブ、１１ａ，１１ｂ：アシストプローブ、１２、１２ａ、１２ｂ：ターゲット遺伝子、１４：ＨＣＰ−２、１６：ＨＣＰ−１、１８：シグナルプローブポリマー、２０：捕捉用プローブ、２２：支持体、２４：アシストプローブ１０ｇと捕捉用プローブ２０の隣接部分、２６：プローブ。

Claims (15)

  1. ５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
    Figure 2006093097
     ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
    Figure 2006093097
     （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
    からなる一対の第１及び第２プローブ、並びに複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とするターゲット遺伝子の検出方法。
  2. 前記アシストプローブが、前記ターゲット領域と前記核酸領域Ｘ又は前記核酸領域Ｚとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を有することを特徴とする請求項１記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  3. 前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＸＹＸ領域と、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域と、前記ターゲット領域とを含む、又は５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ及び前記核酸領域ＹからなるＺＹ領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＺＹＺ領域とを含むことを特徴とする請求項１又は２記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  4. 前記ＸＹＸ領域と前記ＹＸ領域との間、又は前記ＺＹ領域と前記ＺＹＺ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことを特徴とする請求項３記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  5. 前記アシストプローブを前記ターゲット遺伝子を鋳型としてライゲーションさせる反応工程を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  6. 前記アシストプローブが３’末端のターゲット領域にポリｄＴ又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットＲＮＡを鋳型として逆転写させる反応工程を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  7. 前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
  8. ５’端部から順に核酸領域Ｘ、核酸領域Ｙ及び核酸領域Ｚが設けられ、下記化学式（１）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第１プローブと、
    Figure 2006093097
     ５’端部から順に核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙ’及び核酸領域Ｚ’が設けられ、下記化学式（２）の構造を有する、３箇所の核酸領域からなる第２プローブと、
    Figure 2006093097
     （前記化学式（１）及び（２）において、核酸領域Ｘと核酸領域Ｘ’、核酸領域Ｙと核酸領域Ｙ’、核酸領域Ｚと核酸領域Ｚ’はそれぞれハイブリダイズ可能な相補的領域である）
    からなる一対の第１及び第２プローブと、複数の前記第１プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第１及び第２プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ、前記核酸領域Ｘ及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は５’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚが設けられた構造を有することを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。
  9. 請求項１〜８のいずれか１項記載の方法に用いられ、５’端部から順に前記核酸領域Ｘ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｘを有するＸＹＸ領域と、前記ターゲット領域とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
  10. 前記ＸＹＸ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＸからなるＹＸ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むことを特徴とする請求項９記載のアシストプローブ。
  11. 請求項１〜８のいずれか１項記載の方法に用いられ、５’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Ｚ、前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域Ｚを有するＺＹＺ領域とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
  12. 前記ＺＹＺ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Ｙ及び前記核酸領域ＺからなるＹＺ領域、及び／又はターゲット遺伝子並びに前記第１及び第２プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むことを特徴とする請求項１１記載のアシストプローブ。
  13. 前記ターゲット領域がポリｄＴ又はプライマー配列を有することを特徴とする請求項９又は１０記載のアシストプローブ。
  14. 前記ターゲット領域側の５’末端にリン酸基を有することを特徴とする請求項１１又は１２記載のアシストプローブ。
  15. 請求項１〜８のいずれか１項記載の方法により形成されるシグナルプローブポリマー。
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