JPWO2006093097A1 - アシストプローブ及びその利用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
特許文献1〜3には、HCPの1領域と相補的な配列を有するアシストプローブが図示されているが、どの様なアシストプローブが感度良くターゲット遺伝子を検出できるかに関しては、検討されていない。
からなる一対の第1及び第2プローブ(HCPとも称する)、並びに複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記XYX領域と前記YX領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
前記ZY領域と前記ZYZ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
また、本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブが3’側ターゲット領域にポリdT又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットRNAを鋳型として逆転写させる反応工程を含み、該逆転写反応を利用してターゲット遺伝子を検出することができる。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法において、前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することができる。
からなる一対の第1及び第2プローブと、複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第1及び第2プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域がポリdT又はプライマー配列を有するアシストプローブを用いても良い。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域側の5’末端にリン酸基を有するアシストプローブが用いられる。
図1に本発明のアシストプローブの一例を示す。図1において、10aは本発明のアシストプローブの第1の例であり、ターゲット領域TとHCP領域とからなり、HCP領域として3領域を有するが、5’端部からXYZではなく、XYXの3領域を有している(即ち、5’−XYX−T−3’)。従って、HCP−2(符号14)とアシストプローブ10aを反応させると、図2に示した如く、アシストプローブは、1本のHCP−2と3領域中、2領域連続で結合し、残り1領域がポリマー形成のため別のHCP−2と結合する。よって、一対のHCP(符号14,16)の複数対、アシストプローブ10a及びターゲット遺伝子12を反応させることにより、図3に示した如く、一対のHCPから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー18が形成される。
図1においては、3’側にターゲット領域を設けたアシストプローブを示したが、ターゲット領域とHCP領域の位置に特に限定はなく、5’側にターゲット領域を設けたアシストプローブも本発明に含まれるものである。5’側にターゲット領域を設けた場合のアシストプローブの一例としては、図7に示した如く、5’側にターゲット領域Tを、3’側にZYZの3領域からなるHCP領域を設けたアシストプローブ10b(5’−T−ZYZ−3’)が挙げられる。
本発明のアシストプローブとして、2本以上のHCP−2と1本のアシストプローブとがそれぞれ2領域連続で結合できるようにしたものを用いても良い。
なお、図8及び図10では第2のHCP領域を1個挿入した場合の例を示したが、該第2のHCP領域を複数有するアシストプローブを用いることも可能である。
本発明のアシストプローブとして、ターゲット配列やHCPに全く関係のない配列(Spacer配列)をもつスペーサー領域Sを、ターゲット領域とHCP領域の間や第1のHCP領域と第2のHCP領域の間に挿入したアシストプローブを用いることにより、シグナル検出の感度が上昇する場合もある。
本発明のアシストプローブにおいて、スペーサー領域の塩基数は特に限定されないが、0〜5塩基が好ましい。
図15において、(a)はターゲット遺伝子(符号12a)を示し、(b)は該ターゲット遺伝子に相補的な領域T2を3’端側に有する捕捉用プローブ(キャプチャープローブ:符号20)を結合させた支持体22を示す。図16は、アシストプローブ10g、捕捉用プローブ20及びターゲット遺伝子12aが結合した概略説明図である。図17は、ターゲット遺伝子12aを解離させ、アシストプローブ10gを連結させた捕捉用プローブ20が支持体24に結合している状態を示す。
その後、一対のHCP(14、16)の複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより(ステップ106)、図18に示した如く、支持体上に一対のHCPから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー18が形成される。
解離後のプローブ26を、mRNAのcDN領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブ28にハイブリダイズさせ、前記プローブ26を捕捉する(ステップ206、図23)。なお、前記捕捉用プローブを予め支持体22に結合させておくことが好ましい。
1.材料
パルサー法で用いられる一対のHCPとして、5’末端をCy3標識した下記塩基配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブ(HCP−1A及びHCP−2A)を用いた。
HCP−1Aの塩基配列(配列番号1)
5'-Cy3-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・Z領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)-3'
HCP−2Aの塩基配列(配列番号2)
5'-Cy3-X’領域(GATCGGCTATCATTGATACG)・Y’領域(GACTATATCGAACTTAGGCG)・Z’領域(CATTACGCTTAGTATACGCG)-3'
ターゲットDNA−1の塩基配列(配列番号3)
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
アシストプローブ−1の塩基配列(配列番号4)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
キャプチャープローブ−1の塩基配列(配列番号5)
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'
(2−1)第1ハイブリダイゼーション
下記組成の第1ハイブリダイゼーション溶液(全量50μL)を調製し、該溶液を95℃で2分間反応させ、68℃で120分間反応させた後、15℃に保持した。
〈第1ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
微小粒子(前記キャプチャープローブ−1を表面に固定したポリスチレン製粒子):500個
アシストプローブ−1:1pmol
ターゲットDNA−1:0,100又は500amol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris−HCl(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
前記第1ハイブリダイゼーション後の溶液に下記組成になるように50μLのHCP溶液を添加し(最終量100μL)、68℃で60分間反応させた後、15℃に保持した。なお、HCP溶液は添加前に95℃2分間の熱処理を行った。
〈第2ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
HCP−1A:50pmol
HCP−2A:50pmol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris−HCl(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
前記第2ハイブリダイゼーション後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は、フローサイトメーターとしてLuminex100(Luminex社製)を使用し、各項目100個前後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表1に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示した。
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−1のXYX領域とT領域との間に5つのポリdTからなるスペーサー領域SとYX領域を挿入した下記アシストプローブ−2を用いた以外は実施例1と同様に実験を行った。結果を表1に示す。
アシストプローブ−2の塩基配列(配列番号6)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・S領域(TTTTT)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
アシストプローブとして、従来のアシストプローブである下記アシストプローブ−3を用いた以外は実施例1と同様に実験を行った。結果を表1に示す。
アシストプローブ−3の塩基配列(配列番号7)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・Z領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
特許文献1〜3には、HCPの1領域と相補的な配列を有するアシストプローブが図示されているが、どの様なアシストプローブが感度良くターゲット遺伝子を検出できるかに関しては、検討されていない。
からなる一対の第1及び第2プローブ(HCPとも称する)、並びに複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記XYX領域と前記YX領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
前記ZY領域と前記ZYZ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことが好ましい。
また、本発明のターゲット遺伝子の検出方法が、前記アシストプローブが3’側ターゲット領域にポリdT又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットRNAを鋳型として逆転写させる反応工程を含み、該逆転写反応を利用してターゲット遺伝子を検出することができる。
本発明のターゲット遺伝子の検出方法において、前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することができる。
からなる一対の第1及び第2プローブと、複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第1及び第2プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とする。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域がポリdT又はプライマー配列を有するアシストプローブを用いても良い。
前記アシストプローブとして、前記ターゲット領域側の5’末端にリン酸基を有するアシストプローブが用いられる。
図1に本発明のアシストプローブの一例を示す。図1において、10aは本発明のアシストプローブの第1の例であり、ターゲット領域TとHCP領域とからなり、HCP領域として3領域を有するが、5’端部からXYZではなく、XYXの3領域を有している(即ち、5’−XYX−T−3’)。従って、HCP−2(符号14)とアシストプローブ10aを反応させると、図2に示した如く、アシストプローブは、1本のHCP−2と3領域中、2領域連続で結合し、残り1領域がポリマー形成のため別のHCP−2と結合する。よって、一対のHCP(符号14,16)の複数対、アシストプローブ10a及びターゲット遺伝子12を反応させることにより、図3に示した如く、一対のHCPから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー18が形成される。
図1においては、3’側にターゲット領域を設けたアシストプローブを示したが、ターゲット領域とHCP領域の位置に特に限定はなく、5’側にターゲット領域を設けたアシストプローブも本発明に含まれるものである。5’側にターゲット領域を設けた場合のアシストプローブの一例としては、図7に示した如く、5’側にターゲット領域Tを、3’側にZYZの3領域からなるHCP領域を設けたアシストプローブ10b(5’−T−ZYZ−3’)が挙げられる。
本発明のアシストプローブとして、2本以上のHCP−2と1本のアシストプローブとがそれぞれ2領域連続で結合できるようにしたものを用いても良い。
なお、図8及び図10では第2のHCP領域を1個挿入した場合の例を示したが、該第2のHCP領域を複数有するアシストプローブを用いることも可能である。
本発明のアシストプローブとして、ターゲット配列やHCPに全く関係のない配列(Spacer配列)をもつスペーサー領域Sを、ターゲット領域とHCP領域の間や第1のHCP領域と第2のHCP領域の間に挿入したアシストプローブを用いることにより、シグナル検出の感度が上昇する場合もある。
本発明のアシストプローブにおいて、スペーサー領域の塩基数は特に限定されないが、0〜5塩基が好ましい。
図15において、(a)はターゲット遺伝子(符号12a)を示し、(b)は該ターゲット遺伝子に相補的な領域T2を3’端側に有する捕捉用プローブ(キャプチャープローブ:符号20)を結合させた支持体22を示す。図16は、アシストプローブ10g、捕捉用プローブ20及びターゲット遺伝子12aが結合した概略説明図である。図17は、ターゲット遺伝子12aを解離させ、アシストプローブ10gを連結させた捕捉用プローブ20が支持体24に結合している状態を示す。
その後、一対のHCP(14、16)の複数対を添加し、ハイブリダイゼーション反応をさせることにより(ステップ106)、図18に示した如く、支持体上に一対のHCPから形成されたポリマー、アシストプローブ及びターゲット遺伝子の複合体からなるシグナルプローブポリマー18が形成される。
解離後のプローブ26を、mRNAのcDN領域に相補的な領域を有する捕捉用プローブ28にハイブリダイズさせ、前記プローブ26を捕捉する(ステップ206、図23)。なお、前記捕捉用プローブを予め支持体22に結合させておくことが好ましい。
1.材料
パルサー法で用いられる一対のHCPとして、5’末端をCy3標識した下記塩基配列を有するオリゴヌクレオチド・プローブ(HCP−1A及びHCP−2A)を用いた。
HCP−1Aの塩基配列(配列番号1)
5'-Cy3-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・Z領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)-3'
HCP−2Aの塩基配列(配列番号2)
5'-Cy3-X’領域(GATCGGCTATCATTGATACG)・Y’領域(GACTATATCGAACTTAGGCG)・Z’領域(CATTACGCTTAGTATACGCG)-3'
ターゲットDNA−1の塩基配列(配列番号3)
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
アシストプローブ−1の塩基配列(配列番号4)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
キャプチャープローブ−1の塩基配列(配列番号5)
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'
(2−1)第1ハイブリダイゼーション
下記組成の第1ハイブリダイゼーション溶液(全量50μL)を調製し、該溶液を95℃で2分間反応させ、68℃で120分間反応させた後、15℃に保持した。
〈第1ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
微小粒子(前記キャプチャープローブ−1を表面に固定したポリスチレン製粒子):500個
アシストプローブ−1:1pmol
ターゲットDNA−1:0,100又は500amol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris−HCl(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
前記第1ハイブリダイゼーション後の溶液に下記組成になるように50μLのHCP溶液を添加し(最終量100μL)、68℃で60分間反応させた後、15℃に保持した。なお、HCP溶液は添加前に95℃2分間の熱処理を行った。
〈第2ハイブリダイゼーション溶液の組成〉
HCP−1A:50pmol
HCP−2A:50pmol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris−HCl(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
前記第2ハイブリダイゼーション後、フローサイトメーターにて測定を行った。測定は、フローサイトメーターとしてLuminex100(Luminex社製)を使用し、各項目100個前後微小粒子の蛍光強度を測定後、中央値を求めた。結果を表1に示す。なお、数値はブランク値を引いた値を示した。
アシストプローブとして、前記アシストプローブ−1のXYX領域とT領域との間に5つのポリdTからなるスペーサー領域SとYX領域を挿入した下記アシストプローブ−2を用いた以外は実施例1と同様に実験を行った。結果を表1に示す。
アシストプローブ−2の塩基配列(配列番号6)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・S領域(TTTTT)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
アシストプローブとして、従来のアシストプローブである下記アシストプローブ−3を用いた以外は実施例1と同様に実験を行った。結果を表1に示す。
アシストプローブ−3の塩基配列(配列番号7)
5'-X領域(CGTATCAATGATAGCCGATC)・Y領域(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)・Z領域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)・T領域(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
Claims (15)
- 5’端部から順に核酸領域X、核酸領域Y及び核酸領域Zが設けられ、下記化学式(1)の構造を有する、3箇所の核酸領域からなる第1プローブと、
からなる一対の第1及び第2プローブ、並びに複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブを用い、シグナルプローブポリマーを形成させて、ターゲット遺伝子を検出する方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とするターゲット遺伝子の検出方法。 - 前記アシストプローブが、前記ターゲット領域と前記核酸領域X又は前記核酸領域Zとの間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を有することを特徴とする請求項1記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y及び前記核酸領域XからなるXYX領域と、前記核酸領域Y及び前記核酸領域XからなるYX領域と、前記ターゲット領域とを含む、又は5’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Z及び前記核酸領域YからなるZY領域と、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域ZからなるZYZ領域とを含むことを特徴とする請求項1又は2記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 前記XYX領域と前記YX領域との間、又は前記ZY領域と前記ZYZ領域との間に、更にターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域を含むことを特徴とする請求項3記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 前記アシストプローブを前記ターゲット遺伝子を鋳型としてライゲーションさせる反応工程を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 前記アシストプローブが3’末端のターゲット領域にポリdT又はプライマー配列を有し、前記アシストプローブをプライマーとし、ターゲットRNAを鋳型として逆転写させる反応工程を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 前記ターゲット領域のみ異なる複数のアシストプローブを用いることにより、複数のターゲット遺伝子を同時に検出することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記載のターゲット遺伝子の検出方法。
- 5’端部から順に核酸領域X、核酸領域Y及び核酸領域Zが設けられ、下記化学式(1)の構造を有する、3箇所の核酸領域からなる第1プローブと、
からなる一対の第1及び第2プローブと、複数の前記第1プローブと同じ核酸領域及びターゲット遺伝子にハイブリダイズ可能なターゲット領域を有するアシストプローブとを用い、前記一対の第1及び第2プローブの複数対と前記アシストプローブと前記ターゲット遺伝子とを反応させ、シグナルプローブポリマーを形成させる方法であって、前記アシストプローブが、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y、前記核酸領域X及び前記ターゲット領域が設けられた構造を有する、又は5’端部から順に前記ターゲット領域、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zが設けられた構造を有することを特徴とするシグナルプローブポリマーの形成方法。 - 請求項1〜8のいずれか1項記載の方法に用いられ、5’端部から順に前記核酸領域X、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Xを有するXYX領域と、前記ターゲット領域とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
- 前記XYX領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Y及び前記核酸領域XからなるYX領域、及び/又はターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むことを特徴とする請求項9記載のアシストプローブ。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の方法に用いられ、5’端部から順に前記ターゲット領域と、前記核酸領域Z、前記核酸領域Y及び前記核酸領域Zを有するZYZ領域とが設けられた構造を有することを特徴とするアシストプローブ。
- 前記ZYZ領域と前記ターゲット遺伝子との間に、更に前記核酸領域Y及び前記核酸領域ZからなるYZ領域、及び/又はターゲット遺伝子並びに前記第1及び第2プローブにハイブリダイズしないスペーサー領域、を含むことを特徴とする請求項11記載のアシストプローブ。
- 前記ターゲット領域がポリdT又はプライマー配列を有することを特徴とする請求項9又は10記載のアシストプローブ。
- 前記ターゲット領域側の5’末端にリン酸基を有することを特徴とする請求項11又は12記載のアシストプローブ。
- 請求項1〜8のいずれか1項記載の方法により形成されるシグナルプローブポリマー。
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