CN101128582B - 辅助探针及其利用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可以提高PALSAR法的灵敏度而且可以同时检测多基因的目标基因的检测方法、该方法中使用的辅助探针以及使用该辅助探针的信号探针聚合物的形成方法。本发明是一种使用如下所述的三种探针形成信号探针聚合物来检测目标基因的方法，其中的三种探针为：从5’端部开始依次设置有核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z的第一探针，从5’端部开始依次设置有核酸区域X’、核酸区域Y’及核酸区域Z’的第二探针，以及具有多个与所述第一探针相同的核酸区域及可以与目标基因杂交的目标区域的辅助探针。在该方法中，所述辅助探针具有从5’端部开始依次设置有所述核酸区域X、Y、X及所述目标区域的结构或从5’端部开始依次设置有所述目标区域及所述核酸区域Z、Y、Z的结构。

Description

辅助探针及其利用方法
技术领域
本发明涉及一种在使用了形成自身聚集体的一对寡核苷酸的信号扩增方法中使用的辅助探针及其利用方法。更具体而言，涉及一种在使用微板型、载玻片型、微粒型、导电性基板等支撑体的DNA芯片(以下总称为DNA芯片)上可以提高使用上述信号扩增方法时的灵敏度以及同时检测多基因的辅助探针、使用了该辅助探针的目标基因的检测方法、和使用了该辅助探针的信号探针聚合物的形成方法。 
背景技术
作为不使用酶的信号扩增方法，有报道使用下述化学式(1)和下述化学式(2)所示的一对寡核苷酸(以下称为HCP)，形成HCP的自身聚集体(聚合物)的信号扩增方法(以下称为PALSAR法)，以及利用该方法的基因的检测方法(专利文献1及2等)。 
[化1] 
Figure S06806207320070829D000011
[化2] 
在所述式(1)及(2)中，区域X与区域X’、区域Y与区域Y’、区域Z与区域Z’分别为可以杂交的互补核酸区域，利用多对HCP的结合形成下述化学式(3)所示的自身聚集体。在本说明书中，信号探针聚合物是指利用HCP形成的所述自身聚集体。另外，辅助探针是指具有与将要检测的目标基因互补的序列以及与HCP互补的序列的双方的探针，起到 连接目标基因和信号探针聚合物的作用。 
[化3] 
Figure S06806207320070829D000021
另外，专利文献3公开了利用PALSAR法的DNA芯片上的目标基因的检测方法。专利文献1～3公开了形成目标基因与自身聚集体的复合体，通过检测自身聚集体来高灵敏度地检测目标基因的方法。作为在目标基因上形成信号探针聚合物的方法，包含将HCP设计(design)成在HCP自身含有与目标基因互补的序列的方法以及使用辅助探针的方法。其中，形成辅助探针的方法具有的优点是，通过准备多个改变了与目标基因互补的部分的辅助探针，可以利用一对HCP同时检测多个基因。 
在专利文献1～3中，图示有具有与HCP的1区域互补的序列的辅助探针，但关于怎样的辅助探针能够灵敏度高地检测出目标基因，并没有进行探讨。 
专利文献1：专利第3267576号 
专利文献2：专利第3310662号 
专利文献3：国际公开第2003/029441号说明书 
专利文献4：国际公开第2004/074480号说明书 
专利文献5：国际公开第2004/072302号说明书 
发明内容
鉴于上述以往技术的现状，对于可以提高利用与同时检测多种基因相对应的PALSAR法的检测灵敏度，本发明人等进行了潜心研究。结果发现适于PALSAR法的辅助探针的设计方法。本发明的目的在于，提供一 种可以提高PALSAR法的灵敏度而且可以同时检测多基因的目标基因的检测方法、在该方法中使用的辅助探针以及使用了该辅助探针的信号探针聚合物的形成方法。 
为了解决上述课题，本发明人等对辅助探针的设计进行了潜心研究，结果发现PALSAR法中最适合的辅助探针的设计方法，以至完成本发明。即，本发明的目标基因的检测方法是使用包含如下所述的两个探针的一对第一及第二探针(总称为HCP)、以及具有多个与所述第一探针相同的核酸区域和可以与目标基因杂交的目标区域的辅助探针，形成信号探针聚合物，来检测目标基因的方法，其中的两个探针为： 
从5’端部开始依次设置核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z，具有下述化学式(1)的结构，包含3处核酸区域的第一探针(也称为HCP—1)； 
[化4] 
Figure S06806207320070829D000031
从5’端部开始依次设置核酸区域X’、核酸区域Y’及核酸区域Z’，具有下述化学式(2)的结构，包含3处核酸区域的第二探针(也称为HCP—2)； 
[化5] 
Figure S06806207320070829D000032
(在所述化学式(1)及(2)中，核酸区域X与核酸区域X’、核酸区域Y与核酸区域Y’、核酸区域Z与核酸区域Z’分别为可以杂交的互补区域) 
该方法中，所述辅助探针具有从5’端部开始依次设置所述核酸区域X、所述核酸区域Y、所述核酸区域X及所述目标区域的结构，或从5’端部开始依次设置所述目标区域、所述核酸区域Z、所述核酸区域Y及所述核酸区域Z的结构。 
作为所述辅助探针，也可以在所述目标区域与所述核酸区域X或所 述核酸区域Z之间，还具有不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。 
另外，作为所述辅助探针，也可以使用从5’端部开始依次含有包含所述核酸区域X、所述核酸区域Y及所述核酸区域X的XYX区域，包含所述核酸区域Y及所述核酸区域X的YX区域，所述目标区域。 
优选在所述XYX区域与所述YX区域之间，还含有不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。 
另外，作为所述辅助探针，也可以使用从5’端部开始依次含有包含所述目标区域，由所述核酸区域Z及所述核酸区域Y的ZY区域，包含所述核酸区域Z、所述核酸区域Y及所述核酸区域Z的ZYZ区域。 
优选在所述ZY区域与所述ZYZ区域之间，还含有不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。 
本发明的目标基因的检测方法包括使所述辅助探针以所述目标基因为模板进行连接(ligation)反应的反应工序，可以利用该杂交反应检测目标基因。 
另外，本发明的目标基因的检测方法中，所述辅助探针在3’侧目标区域具有多聚dT或引物(primer)序列，包括将所述辅助探针作为引物、以目标RNA为模板，进行逆转录的反应工序，可以利用该逆转录反应检测目标基因。 
在本发明的目标基因的检测方法中，可以通过使用只有所述目标区域不同的多个辅助探针，同时检测多个目标基因。 
本发明的信号探针聚合物的形成方法是使用包含如下所述的两个探针的一对第一及第二探针、以及具有多个与所述第一探针相同的核酸区域和可以与目标基因杂交的目标区域的辅助探针，使所述一对第一及第二探针的多对和所述辅助探针和所述目标基因发生反应，形成信号探针聚合物的方法，其中的两个探针为： 
从5’端部开始依次设置核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z，具有下述化学式(1)的结构，包含3处核酸区域的第一探针；
[化6] 
从5’端部开始依次设置核酸区域X’、核酸区域Y’及核酸区域Z’，具有下述化学式(2)的结构，包含3处核酸区域的第二探针； 
[化7] 
Figure DEST_PATH_G20275658150138000D000012
(在所述化学式(1)及(2)中，核酸区域X与核酸区域X’、核酸区域Y与核酸区域Y’、核酸区域Z与核酸区域Z’分别为可以杂交的互补区域) 
在所述方法中，所述辅助探针具有从5’端部开始依次设置有所述核酸区域X、所述核酸区域Y、所述核酸区域X以及所述目标区域的结构，或从5’端部开始依次设置有所述目标区域、所述核酸区域Z、所述核酸区域Y以及所述核酸区域Z的结构。 
本发明的辅助探针的第一方式为所述本发明方法中使用的辅助探针，其特征在于，具有从5’端部开始依次设置有具有所述核酸区域X、所述核酸区域Y及所述核酸区域X的XYX区域，和所述目标区域的结构。 
作为所述辅助探针，也可以使用所述目标区域具有多聚dT或引物序列的辅助探针。 
作为所述辅助探针，也可以使用在所述XYX区域与所述目标区域之间，还含有包含所述核酸区域Y和所述核酸区域X构成的YX区域，和/或不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域的辅助探针。 
本发明的辅助探针的第二方式为在所述本发明方法中使用的辅助探针，其特征在于，具有从5’端部开始依次设置有所述目标区域，和具有所述核酸区域Z、所述核酸区域Y以及所述核酸区域Z的ZYZ区域的结构。 
作为所述辅助探针，使用在所述目标区域侧的5’末端具有磷酸基的辅助探针。 
作为所述辅助探针，也可以使用在所述ZYZ区域与所述目标区域之 间，还含有包含所述核酸区域Y以及所述核酸区域Z的YZ区域、和/或不与目标基因以及所述第一和第二探针杂交的间隔区域的辅助探针。 
本发明的信号探针聚合物的特征在于，是利用所述本发明方法形成的。 
利用本发明，可以显著地提高利用PALSAR法的目标基因的检测灵敏度。另外，通过改变本发明的辅助探针的目标区域，使同时检测多种基因成为可能。 
附图说明
图1是表示本发明的辅助探针的第1例的概略示意图。 
图2是HCP—2和目标基因结合于图1的辅助探针上的模式图。 
图3是表示使用图1的辅助探针的信号探针聚合物的形成方法的一例的概略示意图。 
图4是表示辅助探针的一例的概略示意图。 
图5是HCP—2和目标基因结合于图4的辅助探针的模式图。 
图6是表示辅助探针的其他例的概略示意图。 
图7是表示本发明的辅助探针的第2例的概略示意图。 
图8是表示本发明的辅助探针的第3例的概略示意图。 
图9是HCP—2及目标基因结合于图8的辅助探针的模式图。 
图10是表示本发明的辅助探针的第4例的概略示意图。 
图11是表示本发明的辅助探针的第5例的概略示意图。 
图12是HCP—2及目标基因结合于图11的辅助探针的模式图。 
图13是表示本发明的辅助探针的第6例的概略示意图。 
图14是表示本发明的辅助探针的第7例的概略示意图。 
图15是表示利用图14的辅助探针及连接反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例的概略示意图，(a)表示目标基因、(b)表示结合于支撑体的捕捉用探针。 
图16是表示利用图14的辅助探针及连接反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤100的概略示意图。 
图17是表示利用图14的辅助探针及连接反应的目标基因的检测方法 的工序顺序的一例中步骤104的概略示意图。 
图18是表示利用图14的辅助探针及连接反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤106的概略示意图。 
图19是表示本发明的辅助探针的第8例的概略示意图。 
图20是表示利用图19的辅助探针及逆转录反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤200的概略示意图。 
图21是表示利用图19的辅助探针及逆转录反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤202的概略示意图。 
图22是表示利用图19的辅助探针及逆转录反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤204的概略示意图。 
图23是表示利用图19的辅助探针及逆转录反应的目标基因的检测方法的工序顺序的一例中步骤206的概略示意图。 
图中：10a～10h—本发明的辅助探针，11a、11b—辅助探针，12、12a、12b—目标基因，14—HCP—2，16—HCP—1，18—信号探针聚合物，20—捕捉用探针，22—支撑体，24—辅助探针10g与捕捉用探针20的邻接部分，26—探针。 
具体实施方式
以下基于附图说明本发明的实施方式，但图示例只被例示，所以只要不脱离本发明的技术思想，当然可以进行各种变形。 
图1是表示本发明的辅助探针的第1例的概略示意图，图2及图3是表示使用了图1的辅助探针的信号探针聚合物的形成方法的一例的概略示意图。图4是表示以往的辅助探针的一例的概略示意图，图5是目标基因及HCP的一方结合于图4的辅助探针的模式图。图6是表示辅助探针的其他例的概略示意图。 
作为PALSAR法中使用的辅助探针，有将HCP的一方(HCP—1)直接用作辅助探针的辅助探针，或如图4所示在HCP的一方(HCP—1)上补充与目标互补的序列(目标区域)的设计的辅助探针。图4所示的辅助探针11a从5’端部开始依次具有与HCP—1相同的包含核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z的HCP区域和与目标基因互补的目标区域T，如 图5所示，HCP区域在每1个区域与HCP—2(符号14)结合。此外，在本发明中，将由从所述核酸区域X、Y及Z构成的组中选择的多个核酸区域构成的区域称为HCP区域。 
本发明的辅助探针可以在2个区域与至少一条HCP—2结合，而且在其余区域也可以与其他HCP—2结合。 
图1表示本发明的辅助探针的一例。在图1中，10a是本发明的辅助探针的第1例，包含目标区域T和HCP区域，作为HCP区域具有3个区域，从5’端部开始具有不是XYZ而是XYX的3个区域(即，5’—XYX—T—3’)。因而，如果使HCP—2(符号14)与辅助探针10a反应，则如图2所示，辅助探针在3个区域中的2个连续区域与一条HCP—2结合，其余1个区域由于要形成聚合物而与其他HCP—2结合。因而，如图3所示，通过使一对HCP(符号14、16)的多对、辅助探针10a及目标基因12发生反应，形成包含由一对HCP形成的聚合物、辅助探针及目标基因的复合体的信号探针聚合物18。 
不过，在本发明中，如图6所示，在结合时，辅助探针的HCP区域侧的末端与HCP—2的末端一致这样的设计，相反信号会降低，所以需要设计成在辅助探针的HCP区域侧的末端在与HCP—2结合时不与HCP—2的末端重合的辅助探针。在图6中，11b是辅助探针的其他例。 
图7是表示本发明的辅助探针的第2例的概略示意图。 
图1表示在3’侧设置有目标区域的辅助探针，但对目标区域与HCP区域的位置没有特别限定，本发明也包含在5’侧设置有目标区域的辅助探针。作为在5’侧设置有目标区域时的辅助探针的一例，如图7所示，可以举出在5’侧设置有目标区域T、在3’侧设置有包含ZYZ的3个区域的HCP区域的辅助探针10b(5’—T—ZYZ—3’)。 
图8是表示本发明的辅助探针的第3例的概略示意图，图9是HCP的一方(HCP—2)及目标基因结合于图8的辅助探针的模式图。图10是表示本发明的辅助探针的第4例的概略示意图。 
作为本发明的辅助探针，也可以使用2条以上的HCP—2与1条辅助探针能够分别在2个区域连续地结合的辅助探针。 
如图8所示，例如可以举出在5’末端的第一HCP区域(XYX)与3’ 末端的目标区域T之间，插入具有能够使2个区域连续地与HCP—2结合的XY的2个区域的第二HCP区域得到的辅助探针10c(5’—XYX—YX—T—3’)。如果使该辅助探针10c与HCP—2反应，则如图9所示，一条辅助探针10c分别在2个区域连续地与2条HCP—2结合。 
另外，如图10所示，也可以使用在5’末端的目标区域T与3’末端的第一HCP区域(ZYZ)之间，插入具有能够使2个区域连续地与HCP—2结合的ZY的2个区域的第二HCP区域得到的辅助探针10d(5’—T—ZY—ZYZ—3’)。 
此外，图8及图10表示插入1个第二HCP区域时的例子，但也可以使用具有多个该第二HCP区域的辅助探针。 
图11是表示本发明的辅助探针的第5例的概略示意图，图12是HCP的一方(HCP—2)及目标基因结合于图11的辅助探针的模式图。图13是表示本发明的辅助探针的第6例的概略示意图。 
作为本发明的辅助探针，有时也可以通过使用在目标区域与HCP区域之间或第一HCP区域与第二HCP区域之间插入具有与目标序列或HCP完全无关的序列(间隔(Spacer)序列)的间隔区域S得到的辅助探针，来使信号检测的灵敏度上升。 
在本发明的辅助探针中，对间隔区域的碱基数没有特别限定，优选为0～5个碱基。 
作为具有所述间隔区域的辅助探针，例如可以举出在目标区域与HCP区域之间插入间隔区域的辅助探针[5’—XYX—S—T—3’(参照图11的辅助探针10e)或5’—T—S—ZYZ—3’]、在第一HCP区域与第二HCP区域之间插入间隔区域的辅助探针[5’—XYX—S—YX—T—3’(参照图13的辅助探针10f)或5’—T—ZY—S—ZYZ—3’]、在目标区域与第二HCP区域之间插入间隔区域的辅助探针[5’—XYX—YX—S—T—3’或5’—T—S—ZY—ZYZ—3’]、以及在目标区域与第二HCP区域之间和第二HCP与第一HCP区域之间的双方插入间隔区域的辅助探针[5’—XYX—S—YX—S—T—3’或5’—T—S—ZY—S—ZYZ—3’]等。 
图14是表示在利用连接反应的目标基因的检测方法中使用的辅助探针的一例的概略示意图，10g是本发明的辅助探针的第7例。如图14所 示，作为辅助探针，通过使用使目标区域5’末端磷酸化的辅助探针，也可以优选用于利用连接反应的目标基因的检测方法中(例如参照专利文献4等)。 
以下对利用所述连接反应的目标基因的检测方法的一例进行说明。图15～图18是表示利用图14所示的辅助探针及连接反应的本发明的目标基因的检测方法的工序顺序的一例的概略示意图。 
在图15中，(a)表示目标基因(符号12a)、(b)表示使在3’端侧具有与该目标基因互补的区域T2的捕捉用探针(capture probe：符号20)结合的支撑体22。图16是辅助探针10g、捕捉用探针20及目标基因12a结合的概略示意图。图17表示使目标基因12a解离、使辅助探针10g连结的捕捉用探针20与支撑体24结合的状态。 
如图14～16所示，所述辅助探针10g及所述捕捉用探针20构成为：在使辅助探针10g与捕捉用探针20与目标基因12a结合时，在该捕捉用探针20的末端与该辅助探针10g的末端邻接的状态下与目标基因12a退火。 
如图16所示，使辅助探针10g及捕捉用探针20与目标基因12a杂交(步骤100)。然后，进行使用连接酶(ligase)的连接反应(步骤102)。只有在所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20的邻接部分24的序列与目标基因12a的序列互补的情况下，通过该连接反应连结所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20。 
在所述连接反应之后，除去所述目标基因12a(步骤104)。如图17所示，在所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20的邻接部分24的序列与目标基因12a的序列互补的情况下，成为连结辅助探针10g的捕捉用探针20与支撑体20结合的状态。 
然后，添加多对的一对HCP(14、16)，通过使其进行杂交反应(步骤106)，如图18所示，在支撑体上形成包含由一对HCP形成的聚合物、辅助探针及目标基因的复合体的信号探针聚合物18。 
另一方面，在所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20的邻接部分24的序列不与目标基因的序列互补的情况下，在所述步骤102之后，不使所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20连结，在除去目标基因之后，成为 只有捕捉用探针20结合于支撑体24的状态。因而，之后，添加多对的一对HCP形成的聚合物不被捕捉于支撑体上，通过清洗等将其除去。 
因而，可以通过检测被捕捉在支撑体上的信号探针聚合物来检测目标基因。特别是可以通过构成为所述辅助探针10g与所述捕捉用探针20的邻接部分24位于目标基因的变异部位，来检测变异基因。 
图19是表示在利用了逆转录反应的目标基因的检测方法中使用的辅助探针的一例的概略示意图，10h是本发明的辅助探针的第8例。如图15所示，作为辅助探针，通过使用在3’侧目标区域具有多聚dT序列等可以用作逆转录反应的引物的序列的辅助探针，可以适当用于在利用逆转录反应的目标基因的检测方法(例如参照专利文献5等。)中。 
以下对所述利用逆转录反应的目标基因的检测方法的一例进行说明。图20～23是表示利用辅助探针及逆转录反应的本发明的目标基因的检测方法的工序顺序的一例的概略示意图。在图20～图23中，例示了目标基因为mRNA，作为辅助探针，使用在3’末端的目标区域具有多聚dT、在5’侧设置具有XYX的3个区域的HCP区域的辅助探针10h的情况。 
在作为目标基因的mRNA(符号12b)的多聚A尾(tail)部分结合在3’末端含有多聚dT的辅助探针10h(步骤200，图20)，将该辅助探针10h用作引物，利用逆转录反应进行mRNA的逆转录反应，形成包含该辅助探针及该mRNA的cDNA区域的探针26(步骤202，图21)。 
接着，如图22所示，从所述探针26解离mRNA，成为具有cDNA区域和XYX的HCP区域的一条链的寡核苷酸(步骤204)。 
使解离后的探针26与具有与mRNA的cDNA区域互补的区域的捕捉用探针28杂交，捕捉所述探针26(步骤206，图23)。其中，优选预先使所述捕捉用探针与支撑体22结合。 
然后，添加多对的一对HCP，通过使其进行杂交反应(步骤208)，形成通过捕捉用探针28捕捉的信号探针聚合物，通过检测该信号探针聚合物，可以检测目标基因。 
实施例 
以下举出实施例，对本发明进一步详细说明，但毫无疑问，这些实施 例只被例示而不被限定地解释。 
(实施例1) 
1.材料 
作为在PALSAR法中使用的一对HCP，使用Cy3标记5’末端的具有下述碱基序列的寡核苷酸·探针(HCP—1A及HCP—2A)。 
HCP—1A的碱基序列(序列编号1) 
5’-Cy3-X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y区域(CGCCTAAGTTCGATA 
TAGTC)·Z区域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)-3’ 
HCP—2A的碱基序列(序列编号2) 
5’-Cy3-X’区域(GATCGGCTATCATTGATACG)·Y’区域(GACTATATCGAACT 
TAGGCG)·Z’区域(CATTACGCTTAGTATACGCG)-3’ 
作为目标DNA，使用具有载脂蛋白(Apolipoprotein)E(ApoE)来源的碱基序列的合成DNA(目标DNA—1)。 
目标DNA—1的碱基序列(序列编号3) 
5’-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA 
GGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGT 
ACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3’ 
作为辅助探针，使用以XYX的顺序含有所述HCP—1A的3个区域中的2个区域、在3’末端具有与目标DNA—1互补的序列的区域(T区域)的下述辅助探针—1。 
辅助探针—1的碱基序列(序列编号4) 
5’-X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y区域(CGCCTAAGTTCGATATAG 
TC)·X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·T区域(GTACTGCACCAGGCGGC 
CGC)-3’ 
作为捕捉探针(capture probe)，使用具有与所述目标DNA—1互补的碱基序列的下述捕捉探针—1。 
捕捉探针—1的碱基序列(序列编号5)
5’-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCT 
CCTTGGACAGCCG-NH2-3’ 
2.方法 
(2—1)第一杂交 
配制下述组成的第一杂交溶液(总量50μL)，在95℃下使该溶液反应2分钟，在68℃下使其反应120分钟，然后保持在15℃。 
(第一杂交溶液的组成) 
微小粒子(在表面固定了所述捕捉探针—1的聚苯乙烯制粒子)：500个 
辅助探针—1：1pmol 
目标DNA—1：0，100或500amol 
3M TMAC 
0.1％N—十二烷酰肌氨酸(N—Lauroylsarcosine) 
50mM Tris—HCl(pH8.0) 
4mM EDTA(pH8.0) 
(2—2)第二杂交(PALSAR法) 
在所述第一杂交之后的溶液中添加50μL的HCP溶液(最终量100μL)，使其成为下述组成，在68℃下反应60分钟，然后保持在15℃。其中，HCP溶液在添加前进行了95℃2分钟的热处理。 
(第二杂交溶液的组成) 
HCP—1A：50pmol 
HCP—2A：50pmol 
3M TMAC 
0.1％N—十二烷酰肌氨酸(N—Lauroylsarcosine) 
50mM Tris—HCl(pH8.0) 
4mM EDTA(pH8.0) 
(2—3)测定 
在所述第二杂交之后，用流式细胞仪(Flow Cytometer)进行测定。测定使用Luminex100(Luminex公司制)作为流式细胞仪，在测定各项 目100个前后微小粒子的荧光强度之后，求出中位数。结果见表1。其中，数值表示减去空白(blank)值后的值。 
[表1] 
  
目标DNA浓度(amol) 实施例1 实施例2 比较例1
0 0 0 0
100 1268 4301 273
500 19099 20112 15988
(实施例2) 
作为辅助探针，使用在所述辅助探针—1的XYX区域与T区域之间插入5个包含多聚dT的间隔区域S和YX区域的下述辅助探针—2，除此以外，与实施例1同样地进行实验。结果见表1。 
辅助探针—2的碱基序列(序列编号6) 
5’-X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y区域(CGCCTAAGTTCGATATAG 
TC)·X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·S区域(TTTTT)·Y区域(CGCCTA 
AGTTCGATATAGTC)·X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·T区域(GTACT 
GCACCAGGCGGCCGC)-3’ 
(比较例1) 
作为辅助探针，使用作为以往的辅助探针的下述辅助探针—3，除此以外，与实施例1同样地进行实验。结果见表1。 
辅助探针—3的碱基序列(序列编号7) 
5’-X区域(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y区域(CGCCTAAGTTCGATATAG 
TC)·Z区域(CGCGTATACTAAGCGTAATG)·T区域(GTACTGCACCAGGCGGC 
CGC)-3’ 
如表1所示，使用本发明的辅助探针的实施例1及2与使用以往的辅助探针的比较例1相比，信号显著地上升。
序列表
<110>卫材R&D管理有限公司
<120>辅助探针及其利用方法
<130>77051-PCT-CN
<140>PCT/JP2006/303629
<141>2006-02-27
<150>JP 2005-54521
<151>2005-02-28
<160>7
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>附着在5′末端的cy3
<400>1
cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgcgtatact aagcgtaatg    60
<210>2
<211>60
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<220>
<221>m i sc_feature
<222>(1)..(1)
<223>附着在5′末端的cy3
<400>2
gatcggctat cattgatacg gactatatcg aacttaggcg cattacgctt agtatacgcg    60
<210>3
<211>120
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<400>3
ggcggaggag acgcgggcac ggctgtccaa ggagctgcag gcggcgcagg cccggctggg    60
cgcggacatg gaggacgtgt gcggccgcct ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat    120
<210>4
<211>80
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<400>4
cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgtatcaatg atagccgatc    60
gtactgcacc aggcggccgc                                                80
<210>5
<211>61
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<220>
<221>misc_feature
<222>(61)..(61)
<223>附着在3′末端的氨基
<400>5
acacgtcctc catgtccgcg cccagccggg cctgcgccgc ctgcagctcc ttggacagcc    60
g                                                                    61
<210>6
<211>125
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<400>6
cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgtatcaatg atagccgatc   60
tttttcgcct aagttcgata tagtccgtat caatgatagc cgatcgtact gcaccaggcg  120
gccgc                                                              125
<210>7
<211>80
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>人工序列的描述：合成的
<400>7
cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgcgtatact aagcgtaatg    60
gtactgcacc aggcggccgc                                                80

Claims (12)

1.一种目标基因的检测方法，其是使用包含如下所述的两个探针的一对第一及第二探针、以及具有多个与所述第一探针相同的核酸区域和可以与目标基因杂交的目标区域的辅助探针，形成信号探针聚合物，来检测目标基因的方法，其中的两个探针为：
从5’端部开始依次设置有核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z，具有下述化学式(1)的结构，包含3处核酸区域的第一探针；
[化1]
Figure FSB00000050284700011
从5’端部开始依次设置核酸区域X’、核酸区域Y’及核酸区域Z’，具有下述化学式(2)的结构，包含3处核酸区域的第二探针；
[化2]
在所述化学式(1)及(2)中，核酸区域X与核酸区域X’、核酸区域Y与核酸区域Y’、核酸区域Z与核酸区域Z’分别为可以杂交的互补区域；
在所述的检测方法中，所述辅助探针具有从5’端部开始依次设置有所述核酸区域X、所述核酸区域Y、所述核酸区域X及所述目标区域的结构，或从5’端部开始依次设置有所述目标区域、所述核酸区域Z、所述核酸区域Y及所述核酸区域Z的结构。
2.根据权利要求1所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
所述辅助探针在所述目标区域与所述核酸区域X或所述核酸区域Z之间，还具有不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。
3.根据权利要求1或2所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
所述辅助探针，从5’端部开始依次含有包含所述核酸区域X、所述核酸区域Y及所述核酸区域X的XYX区域，包含所述核酸区域Y及所述核酸区域X的YX区域，所述目标区域；或者从5’端部开始依次含有所述目标区域，包含所述核酸区域Z及所述核酸区域Y的ZY区域，包含所述核酸区域Z、所述核酸区域Y及所述核酸区域Z的ZYZ区域。
4.根据权利要求3所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
在所述XYX区域与所述YX区域之间、或所述ZY区域与所述ZYZ区域之间，还含有不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。
5.根据权利要求1或2所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
包含使所述辅助探针以所述目标基因为模板进行连接的反应工序。
6.根据权利要求1或2所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
所述辅助探针在3’末端的目标区域具有多聚dT或引物序列，包含将所述辅助探针作为引物、以目标RNA为模板进行逆转录的反应工序。
7.根据权利要求1或2所述的目标基因的检测方法，其特征在于，
通过使用只有所述目标区域不同的多个辅助探针，同时检测多个目标基因。
8.一种信号探针聚合物的形成方法，其是使用包含如下所述的两个探针的一对第一及第二探针、以及具有多个与所述第一探针相同的核酸区域和可以与目标基因杂交的目标区域的辅助探针，使多对所述第一及第二探针、所述辅助探针和所述目标基因发生反应，形成信号探针聚合物的方法，其中的两个探针为：
从5’端部开始依次设置有核酸区域X、核酸区域Y及核酸区域Z，具有下述化学式(1)的结构，包含3处核酸区域的第一探针；
[化3]
Figure FSB00000050284700021
从5’端部开始依次设置有核酸区域X’、核酸区域Y’及核酸区域Z’，具有下述化学式(2)的结构，包含3处核酸区域的第二探针；
[化4]
Figure FSB00000050284700031
在所述化学式(1)及(2)中，核酸区域X与核酸区域X’、核酸区域Y与核酸区域Y’、核酸区域Z与核酸区域Z’分别为可以杂交的互补区域；
在所述的检测方法中，所述辅助探针具有从5’端部开始依次设置有所述核酸区域X、所述核酸区域Y、所述核酸区域X及所述目标区域的结构，或从5’端部开始依次设置有所述目标区域、所述核酸区域Z、所述核酸区域Y及所述核酸区域Z的结构。
9.一种辅助探针，其特征在于，
在权利要求1～8中任意一项所述的方法中使用，具有从5’端部开始依次设置具有所述核酸区域X、所述核酸区域Y及所述核酸区域X的XYX区域和所述目标区域的结构。
10.根据权利要求9所述的辅助探针，其特征在于，
在所述XYX区域与所述目标区域之间，还含有包含所述核酸区域Y及所述核酸区域X的YX区域、和/或不与目标基因以及所述第一及第二探针杂交的间隔区域。
11.根据权利要求9或10所述的辅助探针，其特征在于，
所述目标区域具有多聚dT或引物序列。
12.一种信号探针聚合物，其是利用权利要求1～8中任意一项所述的方法形成的信号探针聚合物。
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