KR20070106705A - 어시스트프로브 및 그의 이용방법 - Google Patents

어시스트프로브 및 그의 이용방법 Download PDF

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Abstract

PALSAR법에 있어서 감도의 향상과 다유전자 동시 검출이 가능한 타겟 유전자의 검출방법, 이 방법에 사용되는 어시스트프로브 및 이 어시스트프로브를 사용한 신호 프로브 폴리머의 형성방법을 제공한다. 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치된 제 1프로브 및 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치된 제 2프로브, 및 복수의 상기 제 1 프로브와 동일한 핵산영역 및 타겟 유전자에 혼성 가능한 타겟 영역을 가지는 어시스트프로브를 이용하고 신호 프로브 폴리머를 형성시켜서 타겟 유전자를 검출하는 방법에 있어서, 상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, Y, X 및 상기 타겟 영역이 설치된 구조 또는 5'단부에서 차례로 타겟 영역 및 상기 핵산영역Z, Y ,Z 가 설치된 구조를 가지도록 했다.
어시스트프로브, 라이게이션, 핵산영역, 검출, 타겟유전자, PALSAR법

Description

어시스트프로브 및 그의 이용방법{ASSIST PROBES AMD METHOD OF USING THE SAME}
본 발명은 자기집합체를 형성하는 한 쌍의 올리고뉴클레오티드를 사용한 신호증폭방법에 이용되는 어시스트프로브 및 그의 이용방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 마이크로플레이트형, 슬라이드글라스형, 미세입자형, 전기전도성기판 등의 지지체를 이용한 DNA칩(이하 총칭하여 DNA칩으로 칭한다) 상에서 상기 신호증폭방법을 이용할 때의 감도 상승 및 복수 유전자 동시검출을 가능하게 하는 어시스트프로브, 어시스트프로브를 이용한 타겟 유전자의 검출방법 및 이 어시스트프로브을 사용한 신호 프로브 폴리머의 형성방법에 관한 것이다.
효소를 사용하지 않는 신호증폭방법으로서 하기 화학식(1) 및 하기 화학식(2)에서 나타낸 한 쌍의 올리고뉴클레오티드(이하, HCP로 칭한다)를 이용하는 HCP의 자기집합체(폴리머)를 형성시킨 신호증폭방법(이하, 펄서법(PALSAR법)으로 칭한다) 및 이 방법을 이용한 유전자의 검출방법이 보고되고 있다(특허문헌 1 및 2 등).
[화 1]
Figure 112007056278391-PCT00001
[화 2]
Figure 112007056278391-PCT00002
상기 식(1) 및 (2)에 있어서 영역X와 영역X', 영역Y와 영역Y', 영역Z와 영역Z'는 각각 혼성(hybridize) 가능한 상보적 핵산영역이고, 복수쌍의 HCP의 결합에 의해 하기 화학식(3)에 나타내는 자기집합체가 형성된다. 본 명세서 중에서 신호 프로브 폴리머란 HCP에서 형성되는 상기 자기집합체를 말한다. 또한, 어시스트프로브란 검출하는 타겟 유전자와 상보적인 배열 및 HCP와 상보적인 배열의 양쪽을 가지는 프로브를 말하고, 타겟 유전자와 신호 프로브 폴리머를 연결하는 작용을 한다.
[화 3]
Figure 112007056278391-PCT00003
또한, 특허문헌 3은 PALSAR법을 이용한 DNA칩 상의 타겟 유전자의 검출방법을 개시하고 있다. 특허문헌 1~3은 타겟 유전자와 자기집합체의 복합체를 형성시키고, 자기집합체를 검출하는 것에 의해 타겟 유전자를 고감도로 검출하는 방법을 개 시하고 있다. 타겟 유전자상에 신호 프로브 폴리머를 형성시키는 방법으로서는, HCP자체에 타겟 유전자와 상보적인 배열이 포함되도록 HCP를 디자인하는 방법 및 어시스트프로브를 사용하는 방법이 있다. 이 중 어시스트프로브를 형성하는 방법은 타겟 유전자와 상보적인 부분을 바꾼 복수의 어시스트프로브를 준비하는 것에 의해 한 쌍의 HCP에 의한 복수의 유전자를 동시에 검출할 수 있다고 하는 이점을 가지고 있다.
특허문헌 1~3에는 HCP의 1영역과 상보적인 배열을 가지는 어시스트프로브가 도시되고 있지만 어떤 다양한 어시스트프로브가 감도 좋게 타겟 유전자를 검출할 수 있는지에 대해서는 검토되고 있지 않다.
특허문헌 1 : 특허 제3267576호
특허문헌 2 : 특허 제3310662호
특허문헌 3 : 국제공개2003/029441호
특허문헌 4 : 국제공개2004/074480호
특허문헌 5 : 국제공개2004/072302호
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명자들은 상기 종래기술에 있는 현상을 보고, 다종유전자 동시검출에도 대응한 PALSAR법에 의한 검출감도의 향상을 가능하게 총괄하여 예의연구를 거듭해 왔다. 그 결과 PALSAR법에 적합한 어시스트프로브의 디자인방법을 찾아냈다. 본 발명은 PALSAR법에 있어서 감도의 향상과 다유전자 동시검출이 가능한 타겟 유전자의 검출방법, 이 방법에 이용되는 어시스트프로브, 및 이 어시스트프로브를 이용한 신호 프로브 폴리머의 형성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은 어시스트프로브의 디자인에 관하여 예의연구를 거듭한 결과, PALSAR법에 최적인 어시스트프로브의 설계방법을 찾았고, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다. 즉 본 발명의 타겟 유전자의 검출방법은 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치되고, 하기 화학식 (1)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 1프로브(HCP-1로도 칭한다)와
[화 4]
Figure 112007056278391-PCT00004
5'단부에서 차례로 핵산영역X', 핵산영역Y' 및 핵산영역Z'가 설치되고, 하기 화학식 (2)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 2프로브(HCP-2로도 칭한다)
[화 5]
Figure 112007056278391-PCT00005
(상기 화학식(1) 및 (2)에 있어서 핵산영역X와 핵산영역X', 핵산영역Y와 핵산영역Y' , 핵산영역Z와 핵산영역Z'는 각각 혼성(hybridize) 가능한 상보적 영역이다)로 이루어진 한 쌍의 제1 및 제2 프로브(HCP-2로도 칭한다), 또한 복수의 상기 제 1프로브와 동일한 핵산영역 및 타겟 유전자에 혼성 가능한 타겟 영역을 가지는 어시스트프로브를 사용하고, 신호 프로브 폴리머를 형성시켜서 타겟 유전자를 검출하는 방법에 있어서, 상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y, 상기 핵산영역 X 및 상기 타겟 영역이 설치된 구조 또는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z가 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 어시스트프로브로서 상기 타겟 영역과 상기 핵산영역X 또는 상기 핵산영역Z와의 사이에, 또한 타겟 유전자에 병렬하여 또는 상기 제1 및 제2의 프로브에 혼성하지 않는 스페이서(SPACER)영역을 가지는 것을 사용해도 된다.
또한, 상기 어시스트프로브로서 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 XYZ영역과 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 YX영역과 상기 타겟 영역을 포함하는 어시스트프로브를 사용해도 된다. 상기 XYX영역과 상기 YX영역과의 사이에 또한 타겟 유전자에 병렬하여 제1 및 제2프로브에 혼성하지 않는 스페이서 영역을 포함하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 어시스트프로브로서 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역과 상기 핵산영역Z 및 상기 핵산영역Y로 이루어진 ZY영역과 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z로 이루어진 ZYZ영역을 포함하는 어시스트프로브를 사용해도 된다.
상기 ZY영역과 ZYZ영역과의 사이에 또한 타겟 유전자에 병렬하여 상기 제1 및 제 2의 프로브에 혼성하지 않는 스페이서(SPACER)영역을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 타겟 유전자의 검출방법이 상기 어시스트프로브를 상기 타겟 유전자를 주형(鑄型)으로 해서 라이게이션(LIGATION) 반응시키는 반응공정을 포함하고, 이 혼성화(hybridization) 반응을 이용하여 타겟 유전자를 검출하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 타겟 유전자의 검출방법이, 상기 어시스트프로브가 3'측 타겟 영역에 폴리dT 또는 프라이머 배열을 가지고, 상기 어시스트프로브를 프라이머로 하고 타겟RNA를 주형으로 하여 역전사 시키는 반응공정을 포함하고, 이 역전사 반응을 이용하여 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
본 발명의 타겟 유전자의 검출방법에 있어서 상기 타겟 영역만 다른 복수의 어시스트프로브를 이용하는 것에 의해 복수의 타겟 유전자를 동시에 검출할 수 있다.
본 발명의 신호 프로브 폴리머의 형성방법은 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치되어 하기 화학식(1)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제1 프로브와
[화 6]
Figure 112007056278391-PCT00006
5'단부에서 차례로 핵산영역X', 핵산영역Y' 및 핵산영역Z'가 설치되어 하기 화학식(2)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 2프로브
[화 7]
Figure 112007056278391-PCT00007
(하기 화학식(1) 및 (2)에 있어서 핵산영역X와 핵산영역X', 핵산영역Y와 핵산영역Y',핵산영역Z와 핵산영역Z'는 각각 혼성 가능한 상보적 영역이다)
로 이루어진 한 쌍의 제1 및 제2 프로브와 복수의 상기 제1 프로브와 동일한 핵산영역 및 타겟 유전자에 혼성 가능한 타겟 영역을 가지는 어시스트프로브를 이용하고 상기 한 쌍의 제1 및 제2 프로브의 복수쌍과 상기 어시스트프로브와 상기 타겟 유전자를 반응시킨 신호 프로브 폴리머를 형성시키는 방법에 있어서, 상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y, 상기 핵산영역X 및 상기 타겟 영역이 설치된 구조를 가지고 또는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z가 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 어시스트프로브의 제1의 태양은 상기 본 발명방법에 사용되는 어시스트프로브에 있어서, 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X를 가지는 XYX영역과 타겟 영역이 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 어시스프트프로브로서 상기 타겟 영역이 폴리dT 또는 프라이머 배열을 가지는 어시스트프로브를 사용해도 된다.
상기 어시스트프로브로서 상기 XYX영역과 타겟 유전자와의 사이에 다시 상기핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 YX영역 및 또는 타겟 유전자에 병렬하여 또는 제1 및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서(SPACER)영역을 포함하는 어시스트프로브를 사용해도 된다.
본 발명의 어시스트프로브의 제2의 태양은 상기 본 발명방법에 사용되는 어시스트프로브에 있어서 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역과 상기 핵산영역Z, 상기핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z를 가지는 ZYZ영역이 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
상기 어시스트프로브로서 상기 타겟 영역 측의 5'말단에 인산기를 가지는 어시스트프로브가 사용된다.
상기 어시스트프로브로서 상기 ZYZ영역과 상기 타겟 유전자와의 사이에 다시핵산영역Y 및 핵산영역Z로 이루어진 YZ영역 및 또는 타겟 유전자에 병렬하여 제1 및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서(SPACER)영역을 포함하는 어시스트프로브를 사용해도 된다.
본 발명의 신호 프로브 폴리머는 상기 본 발명방법에 의해 형성되는 것을 특징으로 한다.
도 1은 본 발명의 어시스트프로브의 제1의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 2는 도 1의 어시스트프로브에 HCP-2 및 타겟 유전자가 결합한 모식도이다.
도 3은 도 1의 어시스트프로브를 사용한 신호 프로브 폴리머의 형성방법의 일례를 나타내는 개략설명도이다.
도 4는 어시스트프로브의 일례를 나타내는 개략설명도이다.
도 5는 도 4의 어시스트프로브에 HCP-2 및 타겟 유전자가 결합한 모식도이다.
도 6은 어시스트프로브의 다른 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 7은 본 발명의 어시스트프로브의 제 2의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 8은 본 발명의 어시스트프로브의 제 3의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 9는 도 8의 어시스트프로브에 HCP-2 및 타겟 유전자가 결합한 모식도이다.
도 10은 본 발명의 어시스트프로브의 제 4의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 11은 본 발명의 어시스트프로브의 제 5의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 12는 도 11의 어시스트프로브에 HCP-2 및 타겟 유전자가 결합한 모식도이다.
도 13은 본 발명의 어시스트프로브의 제 6의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 14는 본 발명의 어시스트프로브의 제 7의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 15는 도 14의 어시스트프로브 및 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례를 나타내는 개략설명도에 있어서의 (a)는 타겟 유전자, (b)는 지지체에 결합된 포착용 프로브를 나타낸다.
도 16은 도 14의 어시스트프로브 및 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자 의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 100을 나타내는 개략설명도이다.
도 17은 도 14의 어시스트프로브 및 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 104를 나타내는 개략설명도이다.
도 18은 도 14의 어시스트프로브 및 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 106을 나타내는 개략설명도이다.
도 19는 본 발명의 어시스트프로브의 제 8의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 20은 도 19의 어시스트프로브 및 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 200을 나타내는 개략설명도이다.
도 21은 도 19의 어시스트프로브 및 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 202를 나타내는 개략설명도이다.
도 22는 도 19의 어시스트프로브 및 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 204를 나타내는 개략설명도이다.
도 23은 도 19의 어시스트프로브 및 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례에 있어서의 스텝 206을 나타내는 개략설명도이다.
부호의 설명
(10a~10h): 본 발명의 어시스트프로브, (11a,11b): 어시스트프로브, (12,12a,12b): 타겟 유전자, (14): HCP-2, (16): HCP-1, (18): 신호 프로브 폴리머, (20): 포착용 프로브, (22): 지지체, (24): 어시스트프로브(10g)과 포착용 프로브 (20)의 인접부분, (26): 프로브
이하에 본 발명의 실시의 형태를 첨부도에 기초를 두어서 설명하지만 도시예는 예시적 나타내는 것이므로 본 발명의 기술사상에서 이탈하지 않는 한 다양한 변화가 가능한 것을 말할 것도 없다.
도 1은 본 발명의 어시스트프로브의 제1의 예를 나타내는 개략설명도 이고, 도 2 및 도 3은 도 1의 어시스트프로브를 이용한 신호 프로브 폴리머의 형성방법의 일예를 나타내는 개략설명도이다. 또 4는 종래의 어시스트프로브의 일례를 나타내는 개략설명도 이고, 도 5는 도 4의 어시스트프로브에 타겟 유전자 및 HCP의 한쪽이 결합된 모식도이다. 도 6은 어시스트프로브의 다른 예를 나타내는 개략설명도이다.
PALSAR법에 사용되는 어시스트프로브로서는 HCP의 한쪽(HCP-1)을 그대로 어시스트프로브로서 사용하는 것이나, 도 4에 나타난 것과 같이 HCP의 한쪽(HCP-1)에 타겟에 상보적인 배열(타겟 영역)을 추가한 디자인이였다. 도 4에 나타난 어시스트프로브 11a는 5'단부에 차례로 HCP-1과 동일하게 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z로 이루어진 HCP영역과 타겟 유전자와 상보적인 타겟 영역T를 가지고, 도 5에 나타난 것과 같이 HCP영역은 1영역인 것에 HCP-2(부호 14)에 결합하는 것이다. 또한 본 발명에 있어서 상기 핵산영역X, Y 및 Z로 이루어진 군에서 선택되는 복수의 핵산영역으로 이루어진 영역을 HCP영역으로 칭한다.
본 발명의 어시스트프로브는 적어도 한개의 HCP-2와 2영역에서 결합할 수 있도록 하고 동시에 남은 영역에서 별도의 HCP-2와도 결합할 수 있도록 한 것이다.
도 1에 본 발명의 어시스트프로브의 일례를 나타낸다. 도 1에 있어서 (10a) 는 본 발명의 어시스트프로브의 제1의 예이고, 타겟 영역T와 HCP영역으로 이루어지고 HCP영역으로서 3영역을 가지지만 5'단부에서 XYZ로는 이루어지고 XYX의 3영역을 가지고 있다(즉 5'-XYX-T-3'). 따라서 HCP-2(부호 14)와 어시스트프로브 (10a)를 반응시키면 도 2에 나타난 것과 같이 어시스트프로브는 한개의 HCP-2와 3영역 중 2영역 연속으로 결합하고 나머지 1 영역이 폴리머 형성을 하기 위해서 별도의 HCP-2와 결합한다. 따라서 한 쌍의 HCP(부호 14, 16)의 복수쌍, 어시스트프로브(10a) 및 타겟 유전자(12)를 반응시키는 것에 의해 도 3에 나타난 것과 같이 한 쌍의 HCP에서 형성된 폴리머, 어시스트프로브 및 타겟 유전자의 복합체로 이루어진 신호 프로브 폴리머(18)가 형성된다.
단, 본 발명에 있어서 도 6에 나타난 것과 같이 결합할 때 어시스트프로브의 HCP영역 측의 말단과 HCP-2의 말단이 일치하도록 한 디자인은 반대로 신호가 저하하기 때문에 어시스트프로브의 HCP영역 측의 말단이 HCP-2와 결합할 때 HCP-2의 말단과 겹치지 않게 어시스트프로브를 디자인 할 필요가 있다. 도 6에 있어서 (11b)는 어시스트프로브의 다른 예이다.
도 7은 본 발명의 어시스트프로브의 제2의 예를 나타내는 개략설명도이다.
도 1에 있어서는 3'측에 타겟 영역을 설치한 어시스트프로브를 나타냈지만, 타겟 영역과 HCP영역과 HCP영역의 위치에 특히 한정되지 않고 5'측에 타겟 영역을 설치한 어시스트프로브도 본 발명에 포함되는 것이다. 5'측에 타겟 영역을 설치한 경우 어시스트프로브의 일례로서는 도 7에 나타난 것과 같이 5'측에 타겟 영역T를, 3'측에 ZYZ의 3영역으로 이루어진 HCP영역을 설치한 어시스트프로브(10b)(5'-T- ZYZ-3')를 들 수 있다.
도 8은 본 발명의 어시스트프로브의 제3의 예를 나타내는 개략설명도 이고, 도 9는 도 8의 어시스트프로브에 HCP의 한쪽(HCP-2) 및 타겟 유전자가 결합한 모식도이다. 도 10은 본 발명의 어시스트프로브의 제4의 예를 나타내는 개략설명도이다.
본 발명의 어시스트프로브로서 2개 이상의 HCP-2와 1개의 어시스트프로브가 각각 2 영역 연속으로 결합할 수 있도록 한 것을 사용해도 된다.
예를 들면, 도 8에 나타난 것과 같이 5'말단의 제1의 HCP영역(XYX)와 3'말단의 타겟 영역T 사이에 HCP-2와 2영역 연속해서 결합할 수 있는 XY의 2영역을 가지는 제2의 HCP영역을 삽입한 어시스트프로브 10c(5'-XYX-YX-T-3')를 들 수 있다. 이 어시스트프로브 10c와 HCP-2를 반응시키면, 도 9에 나타난 것과 같이 1개의 어시스트프로브 10c는 2개의 HCP-2와 각각 2영역 연속으로 결합한다.
또, 도 10에 나타난 것과 같이 5'말단의 타겟 영역T와 3'말단의 제 1의 HCP영역(ZYZ)와의 사이에 HCP-2와 2영역 연속해서 결합할 수 있는 ZY의 2영역을 가지는 제 2의 HCP영역을 삽입한 어시스트프로브 10d(5'-T-ZY-ZYZ-3')을 이용해도 된다.
또한, 도 8 및 도 10에서는 제2의 HCP 영역을 1개 삽입한 경우의 예를 나타내지만 제2의 HCP영역을 복수 가지는 어시스트프로브를 사용하는 것도 가능하다.
도 11은 본 발명의 어시스트프로브의 제 5의 예를 나타내는 개략설명도 이고, 도 12는 도 11의 어시스트프로브에 HCP의 한쪽(HCP-2) 및 타겟 유전자가 결합 한 모식도이다. 도 13은 본 발명의 어시스트프로브의 제 6의 예를 나타내는 개략설명도이다.
본 발명의 어시스트프로브로서 타겟 배열이나 HCP에 전혀 관계가 없는 배열(Spacer배열)을 가지는 스페이서 영역S를, 타겟 영역과 HCP영역의 사이나 제 1의 HCP영역과 제 2의 HCP영역의 사이에 삽입한 어시스트프로브를 이용하는 것에 의해 신호검출의 감도가 상승하는 경우도 있다.
본 발명의 어시스트프로브에 있어서 스페이서 영역의 염기수는 특히 한정되어 있지 않지만 0~5염기가 바람직하다.
상기 스페이서 영역을 가지는 어시스트프로브로서 예를 들면 타겟 영역과 HCP영역의 사이에 스페이서 영역을 삽입한 어시스트프로브[5'-XYX-S-T-3'(도 11의 어시스트프로브-10e참조), 또는 5'-T-S-ZYZ-3'], 제1의 HCP영역과 제 2의 HCP영역과의 사이에 스페이서 영역을 삽입한 어시스트프로브 [5'-XYX-S-YX-T-3'(도 13의 어시스트프로브-10f 참조), 또는 5'-T-ZY-S-ZYZ-3'], 타겟 영역과 제 2의 HCP영역과의 사이에 스페이서 영역을 삽입한 어시스트프로브[5'-XYX-YX-S-T-3'또는 5'-T-S-ZY-ZYZ-3'], 또는 타겟 영역과 제2의 HCP영역의 사이 및 제2의 HCP와 제2의 HCP영역의 사이의 양쪽에 스페이서 영역을 삽입한 어시스트프로브[5'-XYX-S-YX-S-T-3'또는 5'-T-S-ZY-S-ZYZ-3'] 등을 들 수 있다.
도 14는 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법에 이용되는 어시스트프로브의 일례를 나타내는 개략설명도 이고, (10g)는 본 발명의 어시스트프로브의 제7의 예이다. 도 14에 나타난 것과 같이 어시스트프로브로서 타겟 영역의 5' 말단을 인산화시킨 어시스트프로브를 이용하는 것에 의해 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법(예를 들면, 특허문헌 4등 참조.)에도 적합하게 사용할 수 있다.
상기 라이게이션 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 일례를 이하에서 설명한다. 도 15~도 18은 도 14에 나타난 어시스트프로브 및 라이게이션 반응을 이용한 본 발명의 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일예를 나타내는 개략설명도이다.
도 15에 있어서 (a)는 타겟 유전자(부호 12a)를 나타내고, (b)는 이 타겟 유전자에 상보적인 영역T2를 3'단측에 가지는 포착용 프로브(캡쳐 프로브: 부호 20)를 결합시킨 지지체(22)를 나타낸다. 도 16은 어시스트프로브(10g), 포착용 프로브(20) 및 타겟 유전자(12a)가 결합한 개략설명도 이다. 도 17은 타겟 유전자(12a)를 해리시켜 어시스트프로브(10g)을 연결시킨 포착용 프로브(20)가 지지체(24)에 결합하고 있는 상태를 나타낸다.
도 14~도 16에 나타난 것과 같이 상기 어시스트프로브(10g) 및 상기 포착용 프로브(20)는 어시스트프로브(10g)와 포착용 프로브(20)를 타겟 유전자(12a)에 결합시킬 때에 이 포착용 프로브(20)의 말단과 이 어시스트프로브(10g)의 말단이 인접하는 상태에서 타겟 유전자(12a)와 어닐링(annealing)하도록 구성되어 있다.
도 16에 나타난 것과 같이 어시스트프로브(10g) 및 포착용 프로브(20)를 타겟 유전자 (12a)에 혼성시켰다(스텝 100). 그 후 리가아제를 이용한 라이게이션 반 응을 실시한다(스텝 102). 상기 어시스트프로브 (10g)과 상기 포착용 프로브 (20)의 인접부분 (24)의 배열이 타겟 유전자 (12a)의 배열과 상보적인 경우에만 이 라이게이션 반응에 의해 상기 어시스트프로브(10g)와 상기 포착용 프로브(20)는 연결된다.
상기 라이게이션 반응 후 타겟 유전자(12a)를 제거한다(스텝 104).
상기 어시스트프로브(10g)과 상기 포착용 프로브(20)의 인접부분(24)의 배열이 타겟 유전자(12a)의 배열과 상보적인 경우는 도 17에 나타난 것과 같이 어시스트프로브(10g)를 연결시킨 포착용 프로브(20)가 지지체(24)에 결합한 상태로 된다.
그 후 한 쌍의 HCP(14, 16)의 복수쌍를 첨가하고 혼성화 반응을 시킨 것에 의해(스텝 106) 도 18에 나타난 것과 같이 지지체상에 한 쌍의 HCP에서 형성된 폴리머, 어시스트프로브 및 타겟 유전자의 복합체로 이루어진 신호 프로브 폴리머(18)가 형성된다.
한편, 상기 어시스트프로브(10g)와 상기 포착용 프로브(20)의 인접부분(24)의 배열이 타겟 유전자의 배열과 상보적이지 않은 경우는, 상기 스텝 102 후 상기 어시스트프로브(10g)와 상기 포착용 프로브(20)는 연결되지 않고, 타겟 유전자를 제거 후 포착용 프로브(20)만 지지체(24)에 결합한 상태로 된다. 따라서 그 후 한 쌍의 HCP의 복수쌍을 첨가하고, 형성된 폴리머는 지지체상에 포착되지 않고 세정 등에 의해 제거된다.
따라서 지지체상에 포착된 신호 프로브 폴리머를 검출하는 것에 의해 타겟 유전자를 검출할 수 있다. 얻어진 상기 어시스트프로브(10g)와 상기 포착용 프로 브(20)의 인접부분(24)이 타겟 유전자의 변이부위에 위치 하도록 구성하는 것에 의해 변이유전자를 검출할 수 있다.
도 19는 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법에 사용되는 어시스트프로브의 일례를 나타내는 개략설명도 이고, (10h)는 본 발명의 어시스트프로브의 제8의 예이다. 도 15에 나타난 것과 같이 어시스트프로브로서 3'측 타겟 영역에 폴리dT 배열 등 역전사 반응의 프라이머로서 사용할 수 있는 배열을 가지는 어시스트프로브를 사용하는 것에 의해, 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법(예를 들면, 특허문헌 5등 참조)에도 적합하게 사용할 수 있다.
상기 역전사 반응을 이용한 타겟 유전자의 검출방법의 일례를 이하에서 설명한다. 도 20~23은 어시스트프로브 및 역전사 반응을 이용한 본 발명의 타겟 유전자의 검출방법의 공정순의 일례를 나타내는 단면 개략설명도 이다. 도 20~23에 있어서는 타겟 유전자가 ｍRAN 이고, 어시스트프로브로서, 3'말단의 타겟 영역에 폴리dT를 가지고 5'측에 XYX의 3영역을 가지는 HCP영역을 설치한 어시스트프로브 (10h)를 이용한 경우의 예를 나타냈다.
타겟 유전자에 있는 mRAN(부호 12b)의 폴리A 테일 부분에 3'말단에 폴리dT를 포함하는 어시스트프로브(10h)를 결합시키고(스텝 200, 도 20), 그 어시스트프로브(10h)를 프라이머로서 사용하고, 역전사 반응에 의한 ｍRAN의 역전사 반응을 실시하고, 이 어시스트프로브 및 이 mRAN의 cDNA영역으로 이루어진 프로브(26)를 형성시켰다(스텝 202, 도 21).
다음으로 도 22에 나타난 것과 같이 mRAN를 상기 프로브(26)에서 해리시켜 cDNA영역과 XYX의 HCP영역을 가지는 단일가닥(Single-stranded)의 올리고뉴클레오티드로 한다(스텝 204).
해리 후 프로브(26)을 mRAN의 cDNA영역에 상보적인 영역을 가지는 포착용 프로브(28)에 혼성시켜 상기 프로브(26)를 포착한다(스텝 206, 도 23). 또한 상기 포착용 프로브를 미리 지지체(22)에 결합하게 하는 것이 바람직하다.
그 후 한 쌍의 HCP의 복수쌍를 첨가하고 혼성화 반응시키는 것에 의해(스텝 208), 포착용 프로브(28)에서 포착된 신호 프로브 폴리머가 형성되고, 이 신호 프로브 폴리머를 검출하는 것에 의해 타겟 유전자를 검출할 수 있다.
실시예
이하에서 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 이러한 실시예는 예시적으로 나타낸 것으로 본 발명의 기술사상으로부터 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 가능한 것은 말할 것도 없다.
(실시예 1)
1. 재료
PALSAR법에서 사용되는 한 쌍의 HCP로서 5'말단을 Cy3 표지한 하기 염기배열을 가지는 올리고뉴클레오티드·프로브(HCP-1A 및 HCP-2A)를 사용했다.
HCP-1A의 염기배열(배열번호 1)
5'-Cy3-X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y영역(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)·Z영역(CGCGTATACTAAGCGTAATG)-3'
HCP-2A의 염기배열(배열번호 2)
5'-Cy3-X'영역(GATCGGCTATCATTGATACG)·Y'영역(GACTATATCGAACTTAGGCG)·Z'영역(CATTACGCTTAGTATACGCG)-3'
타겟 DNA로서 아폴리포단백질E(ApoE) 유래의 염기배열을 가지는 합성DNA(타겟DNA-1)을 사용했다.
타겟 DNA-1의 염기배열(배열번호 3)
5'-GGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGTGCGGCCGCCTGGTGCAGTACCGCGGCGAGGTGCAGGCCAT-3'
어시스트프로브로서 상기 HCP-1A의 3영역 중 2영역을 XYX를 차례로 포함하고, 3'말단에 타겟 DNA-1과 상보하는 배열의 영역(T영역)을 가지는 하기 어시스트프로브-1을 사용했다.
어시스트프로브-1의 염기배열(배열번호 4)
5'-X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y영역(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)·X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·T영역(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
캡쳐 프로브로서 상기 타겟 DNA-1에 상보적인 염기배열을 가지는 하기 캡쳐 프로브-1를 사용했다.
캡쳐 프로브- 1의 염기배열(배열번호 5)
5'-ACACGTCCTCCATGTCCGCGCCCAGCCGGGCCTGCGCCGCCTGCAGCTCCTTGGACAGCCG-NH2-3'
2.방법
(2-1) 제 1 혼성화
하기 조성의 제 1 혼성화 용액(전량50μL)를 조제하고 이 용액을 95℃에서 2분간 반응시키고, 68℃에서 120분간 반응시킨 후 15℃에 보관 유지했다.
<제 1 혼성화 용액의 조성>
미소입자(상기 캡쳐 프로브-1을 표면에 고정한 폴리스티렌제 입자) : 500개
어시스트프로브- 1: 1pmol
타겟 DNA-1: 0, 100 또는 500amol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris-HCI(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
(2-2) 제 2 혼성화(PALSAR법)
상기 제 1 혼성화 후 용액에 하기 조성이 되도록 50μL의 HCP용액을 첨가하고 (최종량 100μL), 68℃에서 60분간 반응시킨 후 15℃에서 보관 유지했다. 또한 HCP 용액은 첨가 전에 95℃에서 2분간의 열처리를 실시했다.
<제 2 혼성화 용액의 조성>
HCP-1A : 50pmol
HCP-2A : 50pmol
3M TMAC
0.1% N-Lauroylsarcosine
50mM Tris-HCI(pH8.0)
4mM EDTA(pH8.0)
(2-3)측정
상기 제2 혼성화 후 유식세포분석기(Flow Cytometer)로 측정을 실시했다. 측정은 유식세포분석기로서 Luminex 100( Luminex사 제조)을 사용하고, 각 항목 100개 전후 미소입자의 형광강도를 측정 후, 중앙값을 구했다. 결과를 표 1에 나타낸다. 또한 수치는 블랭크값을 뺀 값을 나타냈다.
[표 1]
Figure 112007056278391-PCT00008
(실시예 2)
어시스트프로브로서 상기 어시스트프로브-1의 XYX영역과 T영역과의 사이에 5개의 폴리dT로 이루어진 스페이서 영역S와 YX영역을 삽입한 하기 어시스트프로브-2를 사용한 이외에는 실시예 1과 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
어이스트프로브-2의 염기배열 (배열번호 6)
5'-X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y영역(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)·X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·S영역(TTTTT)·Y영역(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)·X 영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·T영역(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
(비교예 1)
어시스트프로브로서 종래의 어시스트프로브인 하기 어시스트프로브-3을 사용한 이외에 실시예 1과 동일하게 실험을 실시했다. 결과를 표 1에 나타낸다.
어시스트프로브-3의 염기배열 (배열번호 7)
5'-X영역(CGTATCAATGATAGCCGATC)·Y영역(CGCCTAAGTTCGATATAGTC)·Z영역(CGCGTATACTAAGCGTAATG)·T영역(GTACTGCACCAGGCGGCCGC)-3'
표 1에 나타난 것과 같이 본 발명의 어시스트프로브를 사용한 실시예 1 및 2는 종래의 어시스트프로브를 사용한 비교예 1과 비교해서 신호가 현저하게 상승했다.
본 발명에 의하면 PALSAR법을 이용한 타겟 유전자의 검출감도를 현저하게 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 어시스트프로브의 타겟 영역을 변화시키는 것에 의해 다종유전자도 동시에 검출하는 것이 가능하다.
SEQUENCE LISTING <110> EISAI R&D MANAGEMENT CO., LTD. <120> Assist-probe and method for use thereof <130> 77051-PCT-KR <140> PCT/JP2006/303629 <141> 2006-02-27 <150> JP 2005-54521 <151> 2005-02-28 <160> 7 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cy3 attached at the 5' end <400> 1 cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgcgtatact aagcgtaatg 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Cy3 attached at the 5' end <400> 2 gatcggctat cattgatacg gactatatcg aacttaggcg cattacgctt agtatacgcg 60 <210> 3 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 3 ggcggaggag acgcgggcac ggctgtccaa ggagctgcag gcggcgcagg cccggctggg 60 cgcggacatg gaggacgtgt gcggccgcct ggtgcagtac cgcggcgagg tgcaggccat 120 <210> 4 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 4 cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgtatcaatg atagccgatc 60 gtactgcacc aggcggccgc 80 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <220> <221> misc_feature <222> (61)..(61) <223> amino group attached at the 3' end <400> 5 acacgtcctc catgtccgcg cccagccggg cctgcgccgc ctgcagctcc ttggacagcc 60 g 61 <210> 6 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 6 cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgtatcaatg atagccgatc 60 tttttcgcct aagttcgata tagtccgtat caatgatagc cgatcgtact gcaccaggcg 120 gccgc 125 <210> 7 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial Sequence; Synthetic <400> 7 cgtatcaatg atagccgatc cgcctaagtt cgatatagtc cgcgtatact aagcgtaatg 60 gtactgcacc aggcggccgc 80

Claims (15)

  1. 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치되고, 하기 화학식(1)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 1 프로브와
    [화 1]
    Figure 112007056278391-PCT00009
    5'단부에서 차례로 핵산영역X', 핵산영역Y' 및 핵산영역Z'가 설치되고, 하기 화학식(2)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어지는 제 2 프로브
    [화 2]
    Figure 112007056278391-PCT00010
    (상기 화학식(1) 및 (2)에 있어서, 핵산영역X와 핵산영역X', 핵산영역Y와 핵산영역Y', 핵산영역Z와 핵산영역Z'는 각각 혼성 가능한 상보적 영역이다)
    로 이루어진 한 쌍의 제 1 및 제 2프로브와 복수의 상기 제 1프로브와 동일한 핵산영역 및 타겟 유전자에 혼성 가능한 타겟 영역을 가지는 어시스트프로브를 사용하고, 신호 프로브 폴리머를 형성시켜서 타겟 유전자를 검출하는 방법에 있어서,
    상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y, 상기 핵산영역X 및 상기 타겟 영역이 설치된 구조, 또는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z가 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 어시스트프로브가 상기 타겟 영역과 상기 핵산영역X 또는 상기 핵산영역Z와의 사이에 또한 타겟 유전자에 병렬하여 상기 제1 및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서(spacer) 영역을 가지는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  3. 제 1항에 또는 제 2항에 있어서, 상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 XYX영역과, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 YX영역과, 상기 타겟 영역을 포함하고, 또는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역과, 상기 핵산영역Z 및 상기 핵산영역Y로 이루어진 ZY영역과, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z로 이루어진 ZYZ영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 XYX영역과 상기 YX영역과의 사이 또는 상기 ZY영역과 상기 ZYZ영역과의 사이에, 또한 타겟 유전자에 병렬하여 제1및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  5. 제 1항에 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어시스트프로브를 상기타겟 유전자를 주형으로 하여 라이게이션시키는 반응공정을 포함하는 것을 특징으 로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  6. 제 1항에 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어시스트프로브가 3'말단의 타겟 영역에 폴리dT 또는 프라이머 배열을 가지고, 상기 어시스트프로브를 프라이머로 하고 타겟 RNA를 주형으로 하여 역전사 시키는 반응공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  7. 제 1항에 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 타겟 영역만 다른 복수의 어시스트프로브를 사용하는 것에 의해 복수의 타겟 유전자를 동시에 검출하는 것을 특징으로 하는 타겟 유전자의 검출방법.
  8. 5'단부에서 차례로 핵산영역X, 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치되고, 하기 화학식(1)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 1프로브와,
    [화 3]
    Figure 112007056278391-PCT00011
    5'단부에서 차례로 핵산영역X', 핵산영역Y' 및 핵산영역Z'가 설치되고, 하기 화학식(2)의 구조를 가지는 3개소의 핵산영역으로 이루어진 제 2프로브
    [화 4]
    Figure 112007056278391-PCT00012
    (상기 화학식(1) 및 (2)에 있어서, 핵산영역X와 핵산영역X', 핵산영역Y와 핵산영역Y', 핵산영역Z와 핵산영역Z'는 각각 혼성 가능한 상보적 영역이다)
    로 이루어진 한 쌍의 제1 및 제2 프로브와, 복수의 상기 제1 프로브와 동일한 핵산영역 및 타겟 유전자에 혼성 가능한 타겟 영역을 가지는 어시스트프로브를 사용하고, 상기 한 쌍의 제1 및 제2 프로브의 복수쌍과 상기 어시스트프로브와 상기 타겟 유전자를 반응시킨 신호 프로브 폴리머를 형성시키는 방법에 있어서,
    상기 어시스트프로브가 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y, 상기 핵산영역X 및 상기 타겟 영역이 설치된 구조를 가지고, 또는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 핵산영역Z가 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 신호 프로브 폴리머의 형성방법 .
  9. 제 1항에 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 사용되는 5'단부에서 차례로 상기 핵산영역X, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X를 가지는 XYX영역과, 상기 타겟 영역이 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 XYX영역과 타겟 유전자의 사이에, 또한 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역X로 이루어진 YX영역, 및/또는 상기 타겟 유전자에 병렬하여 제1 및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  11. 제 1항에 내지 제 8항 중 어느 한 항의 방법에 사용되는 5'단부에서 차례로 상기 타겟 영역과, 상기 핵산영역Z, 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z를 가지는 ZYZ영역이 설치된 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 ZYZ영역과 상기 타겟 유전자의 사이에, 또한 상기 핵산영역Y 및 상기 핵산영역Z로 이루어진 YZ영역, 및/또는 타겟 유전자에 병렬하여 제1 및 제2 프로브에 혼성하지 않는 스페이서 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  13. 제 9항에 또는 제 10항에 있어서, 상기 타겟 영역이 폴리dT 또는 프라이머 배열을 가지는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  14. 제 11항에 또는 제 12항에 있어서, 상기 타겟 영역 측의 5'말단에 인산기를 가지는 것을 특징으로 하는 어시스트프로브.
  15. 제 1항에 내지 제 8항 중 어느 한 항에 기재된, 방법에 의해 형성되는 신호 프로브 폴리머.
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