JPH11506937A - Dnaの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、dnaの遺伝子的修飾を特定する方法 - Google Patents

Dnaの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、dnaの遺伝子的修飾を特定する方法

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JPH11506937A JP9501295A JP50129596A JPH11506937A JP H11506937 A JPH11506937 A JP H11506937A JP 9501295 A JP9501295 A JP 9501295A JP 50129596 A JP50129596 A JP 50129596A JP H11506937 A JPH11506937 A JP H11506937A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、目的とする遺伝子中に存在する遺伝子的変化および遺伝子的変異の正確な位置および配列を決定するための方法を提供する。本発明はさらに、目的とする遺伝子のポジショナルクローニングおよび配列決定のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 DNAの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、 DNAの遺伝子的修飾を特定する方法 発明の属する分野 本発明は、哺乳動物中の特定の疾患誘起DNA配列を含む、以前には特定さ れていないDNA中の配列の変化を直接的に特定する高スループットの方法論に 関する。本発明の方法は、遺伝子的多型を特定するために、遺伝子疾患に対する 分子的基礎を決定するために、そして遺伝子カウンセリングのためのキャリア診 断および出生前診断を提供するために使用することができる。 発明の背景 DNA配列中にある変化(たとえば、変異および多型)を検出する能力は、 遺伝子疾患の診断に対して、そして疾患誘起微生物の臨床的に重要な変異体を特 定することに対して中心的なことである。遺伝子的変化を分子的に解析する方法 の一つは、サザンブロット技術(Southern,E.M.,J.Mol.B iol.,98:503−517,1975)を用いた、制限酵素断片長多型( RFLP)の検出に関する。このアプローチが比較的煩わしいものであるために 、新しい方法が開発されたが、その中のいくつかはポリメラーゼ連鎖反応(PC R)を基礎としたものである。これらには、PCRを用いたRFLP解析(Ch ehab et al.,Nature,329:293−294,1987; Rommens et al.,Am.J.Hum.Genet.,46:395 −396,1990)、プライマー特定制限酵素部位修飾を用いた人工的RFL Pの作成(Haliassos et al.,Nuc.Acids Res., 17:3606,1989)、アリル特異的増幅(ASA)(Newton CR et al.,Nuc.Acids Res.,17:2503−2516,1 989)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)(Lander gren U et al.,Science 241:1077−1080, 19 88)、プライマー伸長(Sokolov BP,Nuc.Acids Res. ,18:3671,1989)、制限酵素部位の人工的導入(AIRS)(Coh en LB et al.,Nature 334:119−121,1988) 、アリル特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成(ASO)(Wallac e RB et al.,Nuc.Acids Res.,9:879−895, 1981)、およびそれらの変形が含まれる。ロボット工学とともに、直接的変 異および解析に対するこれらの技術は、効率のよい診断的解析として解析すべき ことが必要とされる変異の数が限られている場合にのみ、コストの削減およびス ループットの増進に寄与した。 しかしながらこれらの方法は、複合的変異解析に対するその応用に限界があ る。たとえば、米国で生存新生児2000−2500人に1人が罹る嚢胞性繊維 症、劣性遺伝子障害において、225を越える疾患誘起異変と推定される変異が 特定された。さらに一人の患者に複数の変異が存在する場合や、複数の変異がお 互いに数塩基対の間隔をおいて存在している場合がある。これらの現象は多数の サンプルDNAを処理することができる臨床的スクリーニング方法を設計する際 に、特有の困難性を示す。 Shuberら(Hum.Mol.Gen.,2:153−158,1993 )は、単一の標的DNAサンプルに対して複数のオリゴヌクレオチドプローブを 同時にハイブリッド形成することができる方法を開示している。ハイブリッド形 成反応において、合成オリゴヌクレオチドと標的DNAとの間で形成されるハイ ブリッドの、溶融温度の不均衡を排除する試薬を含むことにより、一回の試験で DNAサンプルをスクリーニングして別個の変異が存在することを調べるするこ とが可能である。一般的に100より多くのASOをプールすることができ、そ れらを標的DNAとハイブリッド形成することができる;第二の工程において、 陽性の結果を示すプールからのASOそれぞれを同一のDNAとハイブリッド形 成する。Shuberら(Genome Res.,5:488−493,19 95)は、複数のASOを最初に標的DNAとハイブリッド形成した後に、溶出 しそしてハイブリッド形成したASOの配列決定をする、複数アリル特異的疾患 解析に関する方法を開示する。この方法により、一つのASOが関与する多くの 別 々のハイブリッド形成をする必要なく変異を特定することができ、そしてこの方 法には関連する変異の先行知識が必要とされる。 しかしながら、上記方法を使用してまれな変異の頻度を適切に検出すること が達成されるためには、多くの変異をスクリーニングしなければならない。遺伝 子中のそれまでは未知の変異を特定するために、別の方法論を確立したが、それ には一本鎖立体構造多型(SSCP)(Orita M et al.,Proc. Natl.Acad.Sci.USA,86:2766−2770,1989) 、変性密度勾配ゲル電気泳動(DGGE)(Meyers RM et al., Nature,313:495−498,1985)、ヘテロ二本鎖解析(HE T)(Keen J et al.,Trends Genet.7:5,199 1)、化学的切断解析(CCM)(Cotton RGH et al.,Pro c.Natl.Acad.Sci.USA,85:4397−4401,198 8)、および標的サンプルの完全配列決定(Maxam AM et al.,M ethods Enzymol.,65:499−560,1980,Sang er F et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,7 4:5463−5467,1977)が含まれる。しかしながら、直接配列決定 を除くこれらの手順すべては、単なるスクリーニング方法である。すなわち、そ れらは変異は存在するものの変異の正確な配列および位置を特定することができ ないことを示すだけである。そのため、変異を完全に特定するためには、DNA サンプルの完全な配列決定が必要である。この理由のために、これらの方法は、 高スループットでありかつ低コストの日常的な診断方法としては両立しない。 このように、当該技術分野においては、それまでは特定されていない変異あ るいは配列の変化が存在する多数のDNAサンプルを効率よく解析することがで きる、比較的低コストの方法を必要としている。 発明の概要 本発明は、第一のDNAサンプル中に存在する1またはそれ以上の標的配列 中の遺伝子的変化を特定するための、高スループットの方法を含む。方法は以下 の工程: a)第一のサンプルを遺伝子的変化を含まない第二のDNAサンプルとハイ ブリッド形成し、遺伝子的変化の部位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖DN Aを形成し、 b)標的配列中のヘテロ二本鎖の一方のDNA鎖を切断し、変化の部位付近 に一本鎖のギャップを形成し、 c)ジデオキシヌクレオチドの存在下で切断したヘテロ二本鎖をDNAポリ メラーゼで処置し、ギャップ付近の配列を決定し、 d)ギャップに隣接するヌクレオチド配列とあらかじめ決定された同種(c ognate)の野生型配列とを比較して、遺伝子的変化を特定すること により行う。 上述した方法を行うときには、標的配列を含む第一のDNAサンプルを厳し い条件下で変化を含まない第二のDNAサンプルとハイブリッド形成する。形成 するハイブリッドはミスマッチ領域を含み、そのミスマッチ領域はミスマッチ認 識タンパク質を基礎とする系により、認識しそしてミスマッチ領域の片側あるい は両側をエンドヌクレアーゼ的に切断する。一回のエンドヌクレアーゼ的な切断 によりミスマッチ領域の片側しか切断されない場合には、一本鎖ギャップを形成 するために1またはそれ以上のエクソヌクレアーゼを使用する。一回のエンドヌ クレアーゼ的な切断によりミスマッチ領域の両側が切断された場合には、ヘリカ ーゼの活性により一本鎖断片が放出され、一本鎖のギャップを形成する。ギャッ プ付近の配列は、ジデオキシヌクレオチドとDNAポリメラーゼI、DNAポリ メラーゼIII、T4DNAポリメラーゼ、あるいはT7DNAポリメラーゼを 使用することで、酵素的DNA配列決定反応により、一回の工程でを決定するこ とことができる。 別の態様において本発明は、第一のDNAサンプル中に存在する標的配列中 の1またはそれ以上の遺伝子的変化を特定するための高スループットの方法を含 む。本方法は、以下の工程: a)第一のサンプルを遺伝子的変化を含まない第二のDNAサンプルとハイ ブリッド形成し、自由末端有し、遺伝子的変化の部位にミスマッチ領域を含むヘ テロ二本鎖DNAを形成し、 b)変化部分あるいはその近辺のDNAを切断し、新しい末端を形成し、 c)あらかじめ決定した配列のオリゴヌクレオチドを新しい末端にライゲー ションし、 d)ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を 決定する。そして、 e)d)において決定したヌクレオチド配列とあらかじめ決定された同種( cognate)の野生型配列とを比較して、遺伝子的変化を特定すること により行う。 標的配列を含む第一のDNAサンプルと変化を含まない第二のDNAサンプ ルとをハイブリッド形成することにより、変化部分あるいはその近辺を特異的に 切断することができ、それによりミスマッチ認識系により認識し切断することが できるミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成する。 一般的に、第一のDNAサンプルは遺伝子疾患に罹った患者であって、当該 疾患を引き起こす既知の変異のいかなるものも含まれていないゲノムを含む患者 から得られたゲノムDNAを含み、そして標的配列は既知の疾患誘起遺伝子を含 む。これらの方法により特定された遺伝子的変化は、1あるいはそれ以上のヌク レオチドの付加、欠損あるいは置換を含む。 本発明を行うときに有用であるミスマッチの認識、切断および除去システム は、限定されるものではないが、バクテリオファージの分解酵素、ミスマッチ修 復タンパク質、ヌクレオチド除去修復タンパク質、除去修復、化学的修飾および 切断が後に続くミスマッチの起こった塩基の化学的修飾、そしてこれらの組み合 わせを含み、必要な際にはエクソヌクレアーゼを含む添加物を加える場合あるい は加えない場合がある。 本発明では新規の変異あるいはそれまでは特定されていない多型を複合的に 特定する高スループットの方法であって、多数の患者から得られたDNAを単一 の個体支持体上に固定化し、続いて以下の工程(すなわち上述したような、ハイ ブリッド形成工程、ミスマッチ認識工程、除去工程、切断工程、ライゲーション 工程、配列決定工程および配列比較工程)の1またはそれ以上の工程を行う方法 の応用を見いだした。さらに、固定化する前に標的配列を増幅し、それに続いて 上述した工程を行うことにより、複数の特異的標的配列を同時に解析することが できる。 別の態様においては、本発明は疾患誘起遺伝子のポジショナルクローニング の方法を提供する。発明の方法は以下の工程: a)疾患に罹った患者から得られた第一のDNAサンプルを疾患に罹ってい ない多数の患者から得られた第二のDNAサンプルとハイブリッド形成し、第一 のDNAサンプルの配列が第二のDNAサンプルの配列と分離している部位にあ るミスマッチ領域を含むハイブリッドを形成し、 b)ハイブリッド中の片側DNA鎖を切断し変化の部位付近の一本鎖のギャ ップを形成し、 c)ギャップ付近のヌクレオチド配列を決定し、 d)c)で決定したヌクレオチド配列の全部あるいは一部を含む合成オリゴ ヌクレオチドを調製し、 e)d)で調製した合成オリゴヌクレオチドの配列を含む、コスミドあるい はP1ライブラリーから得られるDNAクローンを特定すること を使用して行う。 本発明を行うときには、ミスマッチ領域はミスマッチ認識タンパク質を基礎 とする系により、認識しそしてミスマッチ領域の片側あるいは両側をエンドヌク レアーゼ的に切断する。一回のエンドヌクレアーゼ的な切断によりミスマッチ領 域の片側しかが切断されない場合には、一本鎖ギャップを形成するために1また はそれ以上のエクソヌクレアーゼを使用する。ミスマッチ領域の両側がエンドヌ クレアーゼ的に切断された場合には、ヘリカーゼの活性により一本鎖断片が放出 され、一本鎖のギャップを形成する。ギャップ付近の配列は、ジデオキシヌクレ オチドとDNAポリメラーゼI、DNAポリメラーゼIII、T4DNAポリメ ラーゼ、あるいはT7DNAポリメラーゼを使用することで、酵素的DNA配列 決定反応により、一回の工程で決定することができる。 本発明はさらに、目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの別の方法 を提供する。これらの方法は、 a)既知の表現型を示すヒト由来の第一のDNAサンプルと表現型を示さな い1またはそれ以上のヒト由来の第二のDNAサンプルとをハイブリッド形成し 、自由末端を有し、第一のDNAサンプルの配列が第二のDNAの配列と分離し ている部位のミスマッチ領域を含む、ヘテロ二本鎖DNAを形成し、 b)a)で形成したハイブリッドの自由末端をブロッキングし、 c)ミスマッチ領域中のあるいはそれに隣接するDNA鎖の片方あるいは両 方を切断し、新しい末端を形成し、 d)あらかじめ決定された配列の一本鎖オリゴヌクレオチドをc)で形成し た新規の末端にライゲーションし、 e)ライゲーションしあらかじめ決定した配列に隣接するヌクレオチド配列 を決定し、 f)e)において決定したヌクレオチド配列の全部あるいは一部を含む、合 成オリゴヌクレオチドを調製し、そして、 g)f)において調製した合成オリゴヌクレオチドの配列を含むコスミドあ るいはP1ライブラリ由来のDNAクローンを特定すること により行う。 本明細書中で用いられるように、ポジショナルクローニングは、それまで未 知の疾患誘起遺伝子を位置づけそして特定する方法に言及する。 本発明の方法により特定される遺伝子的変化は、1またはそれ以上のヌクレ オチドの付加、欠損、あるいは置換を含む。本発明を行う際に有用なミスマッチ の認識、切断、および除去のシステムは、限定はされないが、ミスマッチ修復タ ンパク質、ヌクレオチド除去修復タンパク質、バクテリオファージリゾルベース (resolvase)、除去修復タンパク質がその後に続くミスマッチ塩基の 化学的変化、そしてこれらの組み合わせを含み、必要な際にはエクソヌクレアー ゼを含む添加物を加える場合あるいは加えない場合がある。 発明の詳細な説明 本発明は患者から分離されたDNA中の特異的標的配列を特定するための高 スループットの方法を含む。本明細書中で使用しているように、高スループット という用語は、多数のDNAサンプルを同時に素早くアッセイするシステムにつ いて言及する。1またはそれ以上の遺伝子あるいは遺伝子位置が目的とする標的 である場合に、本方法を応用することができる。特異的配列は、一般的に野生型 のDNAと比較して、1またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損あるいは置 換を含む、1またはそれ以上の配列の変化を含む。 本発明の方法を行う際には、標的配列を含む第一のDNAサンプルを、1ま たはそれ以上の標的遺伝子の野生型を含む第二のDNAサンプル(あるいはDN Aサンプルのプール)とハイブリッド形成する。本発明の方法は、ほとんど同一 な(しかし完全に同一ではない)DNA鎖間でのDNAのハイブリッド(たとえ ばヘテロ二本鎖)の物理化学的な特徴を利用する。配列変化が存在するとき、ヘ テロ二本鎖は、それ以外は完全にマッチしたハイブリッド中に埋め込まれたミス マッチ領域を含む。本発明によれば、ミスマッチ領域は、調節条件下で形成し、 そして化学的および/または酵素的に修飾し、ついでミスマッチに隣接するそし てミスマッチを含む配列を決定する。使用するミスマッチ認識方法により、ミス マッチ領域は塩基をいくつでも、好ましくは1塩基からから約1000塩基を含 みうる。 本発明の方法は、(疾患の原因となる一つの遺伝子あるいは複数の遺伝子が 知られている場合に)個々の患者における特異的な疾患誘起変異、あるいはそれ までは特定されていない多型を特定するために、および新規の遺伝子を特定する ためにポジショナルクローニングのために、使用することができる。 好ましい態様において、特異的DNA配列は、病理学的状態あるいは症候群 に関連することが知られている患者のゲノムDNA中における特定の遺伝子の部 分あるいは遺伝子位置を含む。遺伝子症候群の限定的ではない例としては、嚢胞 性繊維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血(サラセミア)、ゴーシェ病、アデノシ ン・デアミナーゼ欠損症、α1−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ筋ジストロ フィー、家族性高コレステロール血症、脆弱X症候群(fragile X s yndrome)、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、A型血友 病、ハンチントン病、強直性ジストロフィー、1型神経線維腫症、骨形成不全症 、フェニルケトン尿症、網膜芽細胞腫、テイ・サックス病、そしてウィルムス腫 瘍が含まれる(Thompson & Thompson,Genetics i n Medicine,第5版)。 もう一つの態様において、特異的なDNA配列は、特定の遺伝子、あるいは 特定の疾患と関連していることが知られていないが、しかし多型については知ら れているか疑われている遺伝子位置を含む。たとえば、肥満はアポリポタンパク 質B遺伝子の変化と関連している可能性があり、高血圧はナトリウムあるいはそ の他の輸送システムにおける遺伝子的変化による可能性があり、大動脈動脈瘤は α−ハプトグロビンおよびコレステロールエステル輸送タンパク質の変化が関連 する可能性があり、そしてアルコール中毒症はアルコールデヒドロゲナーゼおよ びミトコンドリア性アルデヒドデヒドロゲナーゼの変異が関連する可能性がある 。さらに薬剤に対する個々の反応は、チトクロームP450などの薬剤修飾シス テムにおける変化により影響を受け、特定の感染性疾患に対する感受性も遺伝子 的状態により影響を受ける可能性がある。最後に本発明の方法は個体識別試験に ついてのHLA解析に応用することができる。 さらにもう一つの態様において、特異的DNA配列は、体内に侵入した微生 物のゲノムなどの外来性遺伝子配列の一部を含む。限定的ではない例として、細 菌およびそのファージ、ウィルス、真菌、原虫、およびこれらに類似するものを 含む。本方法は、適切な療法的治療を選択するために、微生物の別個の変異体間 あるいは別個の系統間で区別することが望ましい場合に、特に応用可能である。 1.ヘテロ二本鎖の調製 本発明により、標的配列は動物あるいはヒトの患者から分離されたDNAの サンプル中に含まれる。このDNAは、いずれかの細胞供給源あるいは体液から 得ることができる。臨床的な実務において利用できる細胞供給源の限定的ではな い例として、血球細胞、頬細胞、膣頸部細胞、尿中の上皮細胞、胎児細胞、ある いはバイオプシーにより得られた組織中のいずれかの細胞が挙げられる。体液と しては、血液、尿、脳脊髄液、そして感染あるいは炎症部分での組織滲出物が挙 げられる。DNAは、当該技術分野で標準的な多くの方法のいずれかを用いて、 細胞供給源あるいは体液から抽出する。DNAを抽出するために使用する具体的 な方法は、その供給源の性質に依存することは理解されるであろう。ヒトゲノム DNAの解析のために抽出したDNAの好ましい量は、少なくとも5pgである (およそ1細胞あたり4x109塩基対のゲノムサイズに相当)。いくつかの応用 において、たとえば微生物のゲノム中にある配列の変化を検出するなど、様々な 量のDNAを抽出することができる。 いったん抽出した後は、標的配列を含むサンプルDNAは本発明においては さらに操作することなく使用することができる。好ましくは、サンプルDNA中 に存在する1またはそれ以上の特定の領域を増幅することができる。この場合、 増幅した領域は特定の隣接する配列をプライマーとして使用するように選択する ことにより、特定する。この工程での増幅により、サンプルDNA集団中の特定 の配列濃度が上昇するという利点を提供する。増幅することができるDNA配列 の長さは、80bpから30kbpまでの範囲である(Saiki et al. ,1988,Science,239:487)。さらにたとえばビオチニル化 により修飾した増幅用プライマーを使用することで増幅したDNA中に修飾を選 択的に導入することができる。 一つの態様においては、標的配列を含む第一のDNAは、特定の配列を事前 に増幅してもしなくても、固層マトリックスに結合する。このことから、多数の 患者のサンプルあるいは第一のDNAサンプルを同時に処理しそしてスクリーニ ングすることができる。本発明で使用するのに適した限定的ではないマトリック スの例としては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ、親和性捕捉 のための試薬でコートした磁気ビーズ、処置したあるいは処置していないマイク ロタイタープレートなどが挙げられる。DNAをマトリックスに結合する方法は 、使用する特定のマトリックスに依存するということを、当業者は理解するであ ろう。たとえば、ニトロセルロースに対する結合は、DNAが単に膜に吸着し、 その後真空条件下で15分から2時間、75−80℃で膜を焼くことにより行う ことができる。別の方法では、結合したDNAに対してさらなる処置を必要とし ない荷電ナイロン膜を使用することができる。アビジンでコートしたビーズおよ びマイクロタイタープレートは、ビオチンが結合したDNA(たとえばビオチン 結合プライマーの使用を介して)を結合するために使用する。さらに抗体で表面 をコートすること、そしてDNA中に抗体特異的ハプテンを導入することにより 、 固体支持体上いずれのものにもDNAを接着するために抗体を使用することがで きる。好ましい態様において、ビオチニル化プライマーを使用して増幅したDN Aは、ストレプトアビジンでコートしたビーズに結合する(Dynal,Inc. ,Milwaukee,WI)。 本発明を行う時には、未処理のあるいは増幅した第一のDNA、好ましくは 固層マトリックスに結合したDNAを、ミスマッチのループを形成しやすい条件 下で第二のDNAサンプルとハイブリッド形成する。第二のDNAサンプルは好 ましくは、1あるいはそれ以上の標的配列の“野生型”版を含む。本明細書中で 使用されているように、遺伝子の“野生型”版は、疾患には関連しない(あるい は識別できる表現系のいずれかとは関連しない)そして“正常な”個体が保有し ている、一般的な集団中の一つの優性遺伝子である。一般的な集団内では、野生 型遺伝子は複数の優性遺伝子型を有しており、それらは配列中に、それぞれと比 較した場合に識別できるほどの病原的効果を何も引き起こさない、配列中の変化 を含む;すなわちこれらの変化は“多型”あるいは“アリル変異体”と呼ばれて いる。もっとも好ましくは、“正常な”個体から得たDNAの混合物は、第二の DNAサンプルとして使用し、その結果もっとも一般的な多型の混合物を提供す る。このことから保証されることは、統計的には、第一のDNAサンプルおよび 第二のDNAサンプルの間で形成したハイブリッドは好ましくは、個々のミスマ ッチ領域を形成しうる変異の領域以外は完全にマッチしているであろうというこ とである。いくつかの応用において、多型を検出することが望ましい;それに応 じてこの場合、第二のDNAサンプルの適切な供給源を選択するであろう。ミス マッチを検出することに続いて使用する方法によって、野生型DNAも化学的あ るいは酵素的に、たとえばメチル基の削除あるいは付加などの修飾をすることが できる。 本発明によるハイブリッド形成反応は、約10mMのNaClから約600 mMのNaClの範囲の溶液中で、約37℃から約65℃の範囲の温度で行う。 ハイブリッド形成反応の厳密性は、塩濃度および温度の両方により決定すること を理解するであろう;その結果、10mMの塩、37℃の条件下で行ったハイブ リッド形成は、500mMの塩、65℃で行ったものと同様な厳密性を有しうる。 本発明の目的として、完全に相補的な配列間では完全なハイブリッドを形成し、 同一分子内の非相補的な配列間ではミスマッチのループを形成するハイブリッド 形成の条件のいずれを使用してもよい。好ましくは、ハイブリッド形成は600 mMのNaCl、65℃で行う。ハイブリッド形成工程に続いて、第一のDNA サンプルとハイブリッド形成しないDNA分子は、たとえば0.1xSSC、6 5℃などの厳しい条件下で洗浄することにより除去する。 ついでハイブリッド形成反応により形成したハイブリッドは、いずれかの自 由末端をブロックするように処理することができ、それによりさらにたとえばR NAリガーゼなどの酵素的に修飾するための基質としてそれらを提供することが できる。適切なブロッキングの方法としては、限定するものではないが、5’リ ン酸基の除去、3’末端のジデオキシヌクレオチドによるホモ重合体の末端付加 (homopolymeric tailing)、そして修飾二本鎖オリゴヌク レオチドの二本鎖末端へのライゲーションが挙げられる。 2.ミスマッチの認識と切断 続く工程において、ハイブリッドを処理し、一方または両方のDNA鎖をミ スマッチ領域中であるいはそれに近接する部分で切断する。ミスマッチの認識お よび切断のために使用する方法により(以下を参照)、切断はミスマッチ領域の両 端のどちらかからいくらかのあらかじめ決められた距離の場所で起こる可能性が あり、そして野生型鎖あるいは変異鎖において起こりうる。このように本明細書 中で使用しているようにミスマッチの“近傍”とは、ミスマッチの両端から1〜 2000塩基の距離までを範囲とする。本発明で使用するのに適したミスマッチ 認識系および切断系の限定的でない例としては、ミスマッチ修復タンパク質、ヌ クレオチド除去修復タンパク質、バクテリオファージリゾルベース、化学的修飾 、そしてこれらの結合が挙げられる。これらの態様は以下に記述する。 一般的に、以下に記述するそれぞれの態様にとって必要なミスマッチ認識タ ンパク質および/またはミスマッチ修飾タンパク質は、当該技術分野におけるな 技術者によく知られた方法を使用して分離する。好ましくは、タンパク質の配列 が知られているときには、対応する遺伝子のタンパク質コード配列を、生物のゲ ノムDNAを適切なプライマーを用いて増幅することにより供給源となる生物か ら分離する。分離したタンパク質コードDNA配列は、たとえば組み換えタンパ ク質のアミノ末端あるいはカルボキシル末端のどちらかにアミノ酸の“精製タグ ”を挿入した様な、商業的に入手可能な発現ベクター中にクローン化する。つい で組換え発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入し(たとえばE.coli)、そ してタンパク質を“タグ”を認識するアフィニティークロマトグラフィーにより 細胞融解物から回収する。たとえば、細菌の発現ベクターpQiex12をポリ ヒスチジンのタグを伴うタンパク質を発現するために使用し、それによりNi− セファロース(QiaGen,Chatsworth,CA)上での一回工程の クロマトグラフィーにより組換え産物を精製することができる。その他の方法と しては、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ配列をタグとして含む組換えタ ンパク質の発現に関するものがあり、それによりグルタチオン親和性カラム上で 組換え産物の精製をすることができる(Pharmacia Biotech, Uppsala,Sweden)。必要であれば、ついで精製用タグを含むタン パク質は処理をすることでタグ配列を取り除く。別の方法としては、たとえばモ レキュラーシーブ、イオン交換、および疎水性クロマトグラフィー、そして等電 収束(isoelectric focusing)を含む、当該技術分野でよ く知られる標準的なタンパク質精製技術を用いて分離することができる。本明細 書中で使用して得るように“分離”とは、供給源となる細胞に由来する無関係の タンパク質あるいはその他のコンタミナントにより妨害されることなく本発明の 状況においてその機能を実行することができる程度にタンパク質を精製すること を意味する。 本発明を行う際に使用するミスマッチの認識タンパク質およびミスマッチ修 飾タンパク質は、E.coliからヒトまであるいはその混合物などのいずれの 種に由来していてもよい。一般的には、既知のタンパク質の機能的類似体は、系 統発生をまたいで存在する。本明細書中で使用しているように既知のタンパク質 の“機能的類似体”とは、in vivoにおいてあるいは無細胞の反応におい てどちらでも第一のタンパク質に対して機能的に交換することができるもう一つ のタンパク質のことをいう。 ミスマッチ修復タンパク質: DNAの複製の間に形成するミスマッチを修復するため、多数の異なる酵素 系が系統発生をまたいで存在する。E.coliにおける1つの系として、Mu tY遺伝子産物が関与するものがあり、それによりA/Gミスマッチを認識し、 そしてA含有鎖を切断する(Tsai−Wu et al.,J.Bacteri ol.178:1902,1991)。E.coliにおける別の系では、新規 合成DNA鎖中のエラーを、そのDNA鎖が不完全なメチル下である一過性の状 態に基づいて特異的に認識するために、(通常の複製の流れの中で母親のメチラ ーゼ(methylase)が新規合成DNAに対して働く前に)MutS、M utL、そしてMutHタンパク質の調和的な活性を利用する。一般的には切断 は、ミスマッチの1−2Kb中の半メチル化GATC部位で起こり、ついでニッ クからミスマッチまでの3’−5’方向あるいは5’−3’方向のどちらかにお いて鎖をエクソヌクレアーゼ融解性に切断する。in vivoにおいてはこの 後、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素およびその他の因子が関与する再合成が 起こる(Creaver,Cell,76:1−4,1994)。 本発明で使用するためのミスマッチ修復タンパク質は、(上述したように)E .coliからあるいは適切な機能的特徴を有するミスマッチ修復タンパク質を 含むいずれかの生物から由来することができる。有用なタンパク質の限定的でな い例としては、Salmonella typhimurium由来のタンパク 質(MutS、MutL)、Streptococcus pneumoniae 由来のタンパク質(HexA、HexB)、Saccharomyces cer visiae由来のタンパク質(“全タイプ”、MSH2、MLH1、MSH3) 、Schizosaccharomyces pombe由来のタンパク質(S W14)、マウス由来のタンパク質(rep1、rep3)およびヒト由来のタ ンパク質(“全タイプ”、hMSH2、hMLH1、hPMS1、hPMS2、 ducl)が含まれる。好ましくは、ヒトおよび酵母由来の“全タイプ”のミス マッチ修復系を使用する(Chang et al.,Nuc.Acids Re s.,19:4761,1991;Yang et al.,J.Biol.Ch em., 266:6480,1991)。好ましい態様において、上述した様に患者DN Aと野生型DNAとの間で形成したヘテロ二本鎖を、本質的には国際特許出願第 WO/93/20233号において記述しているように精製する、ヒト“全タイ プ”ミスマッチ修復活性とともにインキュベートする。 インキュベーションは、たとえば10mM Tris−HCl pH7.6 、10mM ZnCl2、1mMジチオスレイトール、1mM EDTAおよび 2.9%グリセロール中で、37℃、1−3時間行う。別の態様において、精製 したMutS、MutLおよびMutHは、ミスマッチ領域を切断するために使 用する(Su et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 83:5057,1986;Grulley et al.,J.Biol.C hem.,264:1000,1989)。 ヌクレオチド除去修復タンパク質: E.coliにおいて、UvrA、UvrB、UvrC、およびUvrDで 表される4種のタンパク質がUV光により障害を受けたかあるいはそれ以外の化 学的に修飾されたヌクレオチドを修復するために(Sancar,Scienc e,266:1954,1994)、そして同様にミスマッチを修復するために( Huang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 91:12213,1994)、相互作用する。ATPaseであり、UvrB とA21複合体を形成するUvrAは、障害の部位に結合し、DNAをほどきそ してよじれさせ、そしてUvrBが障害部位にしっかりと結合できるように立体 構造的な変化を引き起こす。ついでUvrAは複合体から分離し、UvrCが結 合することができる。UvrBは、障害部位から3’側に5番目のフォスフォジ エステル結合の部位をエンドヌクレアーゼ融解性に切断することを触媒する。つ いでUvrCは、障害部位から5’側に8番目のフォスフォジエステル結合の部 位を同様に切断することを触媒する。最終的には、UvrD(ヘリカーゼII) が除去したオリゴマーを放出する。in vivoにおいて、DNAポリメラー ゼIがUvrBと置換し、除去ギャップを埋め、そしてバッチ部分をライゲーシ ョンする。 本発明の一つの態様において、患者のDNAと野生型DNAとの間で形成し たヘテロ二本鎖を、UvrA、UvrB、UvrCの混合物をUvrDの存在下 あるいは非存在下で処理する。上述したように、タンパク質は野生型E.col iからあるいはタンパク質をコードする組換え遺伝子を含むE.coliあるい はその他の適切な宿主細胞から精製することができ、そして融和性の緩衝液およ び濃度で処方する。最終産物は、ミスマッチの部位を含む一本鎖のギャップを含 むヘテロ二本鎖である。 本発明において使用する除去修復タンパク質は、(上述したように)E.co liに、あるいは適切な機能的類似体を含むいずれかの生物に由来することがで きる。有用な類似体の限定的ではない例としては、S.cervisiae由来 (RAD1、2、3、4、10、14および25)、およびヒト由来(XPF、X PG、XPD、XPC、XPA、ERCC1、およびXPB)の類似体が含まれ る(Sancar,Science,266:1954,1994)。ヒトの類似 体を使用するときには、除去パッチは、障害部位の3’末端から5ヌクレオチド 伸長したオリゴヌクレオチド、および障害部位の5’末端から24ヌクレオチド 伸長したオリゴヌクレオチドを含む。Aboussekhraら(Cell,8 0:859,1995)は、ヒト細胞由来の精製した構成要素を使用するヌクレ オチド除去修復のためのin vitro再構築系を開示する。 化学的なミスマッチの認識: 本発明における患者DNAと野生型DNAの間で形成されるヘテロ二本鎖は 、四酸化オスミウム(チミジンのミス対合のため)によりあるいはヒドロキシル アミン(シトシンのミス対合のため)により処理することにより、当該技術分野 においてよく知られている手順を用いて(たとえば、Grompe,Natur e Genetics,5:111,1993:およびSaleeba et al.,Meth.Enzymol.217:288,1993を参照)化学的 に修飾することができる。一つの態様において、化学的に修飾したDNAを(上 述したように)除去修復タンパク質と接触させる。ヒドロキシルアミン修飾塩基 あるいは四酸化オスミウム修飾塩基を、修復の必要があるときには障害のある塩 基 として認識し、DNA鎖の一方を選択的に切断し、そして生成物は上記のように ギャップのあるヘテロ二本鎖となる。 リゾルベース(resolvase): リゾルベースは、(Holliday構造、十字形、そしてループを含む)組 換えイベントの起こっている間に、曲がり、よじれあるいはDNAのゆがみを介 して、分岐DNA中間体の分解を触媒する(Youil et al.,Pro c.Natl.Acad.SciUSA,92:87,1995)。たとえば、 バクテリオファージT4由来のエンドヌクレアーゼVII(T4E7)は、1か ら約50塩基のミスマッチ領域を認識し、そしてミスマッチ領域の3’境界部か ら6ヌクレオチド以内で二本鎖を分解する。T4E7はたとえばT4ファージの 遺伝子49を過剰発現した組換えE.coliなどから分離することができる。 本発明で使用するための別の適切なリゾルベースは、バクテリオファージT7の エンドヌクレアーゼI(T7E1)であり、T7E1はポリヒスチジン精製タグ 配列を使用して分離することができる(Mashal et al.,Natur e Genetics,9:177,1995)。 好ましい態様において、上述したように患者DNAと野生型DNAとの間で 形成したヘテロ二本鎖は、100−3000ユニットのT4E7を含む反応液5 0μl中で、37℃、1時間インキュベートする。 3.配列決定 本発明を行う際に、患者から得た固定化したDNAを野生型DNAとハイブ リッド形成してミスマッチ領域を形成し、ついでミスマッチ修復タンパク質、除 去修復タンパク質、リゾルベース、化学的修飾そして切断試薬あるいはこれらの 試薬の組み合わせにより処理してミスマッチ領域の部位と関連するいくつかのあ らかじめ決定した位置に、一本鎖あるいは二本鎖の切れ目(break)を導入 する。 一つの態様において、一本鎖の切れ目をミスマッチ領域の片側あるいは両側 のあらかじめ決定した位置に導入することにより、ミスマッチ領域を含む一本鎖 断片の選択的な除去が起こる。結果として得られる構造は、使用したミスマッチ 認識系により、ギャップが長さにして約5から約2000塩基中に存在する可能 性がある、ギャップのあるヘテロ二本鎖である。 (ミスマッチを含む)除去される領域のヌクレオチド配列を決定するために、 ヘテロ二本鎖をジデオキシヌクレオチドの存在下において適切なDNAポリメラ ーゼ酵素とインキュベートする。この工程において使用するのに適している酵素 としては、これらだけに限定されないが、DNAポリメラーゼI、DNAポリメ ラーゼIIIホロ酵素、T4DNAポリメラーゼ、そしてT7DNAポリメラー ゼが含まれる。唯一必要なことは、酵素がギャップのあるヘテロ二本鎖を基質と して急性DNA合成をすることができるということである。サンガー(Sang er)の配列決定反応におけるように、ジデオキシヌクレオチドの存在により、 成熟前停止生成物の入れ子の組(nested set of prematu re termination products)を生成することができ、そ してこれらの産物の分解物を、たとえばゲル電気泳動によりギャップ付近のDN A配列を示すことができる。 いくつかの状況において、この方法を使用して得られた配列は、野生型鎖と は一致するが、変異がある患者DNAにはしないだろう。結果は関連するDNA 領域をあらかじめ増幅するかあるいは増幅せずに、配列決定の第二ラウンドによ り容易に調節することができる。この場合において、患者の修飾していないDN Aを第一ラウンドにおいて決定した配列に由来する配列決定プライマーと組み合 わせて鋳型として使用することにより、変位の配列を決定する。 配列決定の別の態様において、ついで野生型DNAと患者DNAとの間で形 成したハイブリッドを変性により解離し、そして野生型DNAおよび標的DNA のいずれかの切断産物は洗浄することにより除去する。ついで残存する固定化し た標的DNAは、“ライゲーションオリゴヌクレオチド”と表され、あらかじめ 決定した配列の合成一本鎖オリゴヌクレオチドとライゲーションし、酵素的DN A配列決定のためのプライマーとして供する。オリゴヌクレオチドは長さにして 約15から約25ヌクレオチドでありうる。好ましいライゲーションオリゴヌク レオチドは、配列5’−CAGTAGTACAACTGACCCTTTTGGG ACCGC−3’を有する。ライゲーションはたとえばRNAリガーゼを使用し て行うことができる(Pharmacia Biotech,Uppsala, Sweden)。 一般的なライゲーション反応は、50mM Tris−HCl、pH7.5 、10mM MgCl2、20mMジチオスレイトール、1mM ATP、10 0μg/mlウシ血清アルブミン、少なくとも1μgの固定化標的DNA、10 倍過剰モル数のライゲーションオリゴヌクレオチド、および0.1−5.0単位 /mlのT4RNAリガーゼを含む、20μl反応液中で、37℃15分間かけ て行う。ライゲーションの後、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドは 、洗浄することにより除去する。 ついでライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するDNAの配列を、 当該技術分野で既知のいずれかの方法により決定する。一つの態様において、ラ イゲーションオリゴヌクレオチドに相補的なあらかじめ決定した配列である第二 のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使用することにより、酵素的 配列決定をジデオキシサンガー技術により行う(Sanger et al.,P roc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463,1977)。 ついでそれぞれの微少配列決定反応は、限定するものではないがゲル電気泳動を 含む当該技術分野でよく知られている技術により解読し、そして配列を決定する 。 別の態様において、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに対して相補的 なオリゴヌクレオチドを、4種類のヌクレオシド三リン酸のすべての存在下にお いてDNAポリメラーゼIを使用してDNA合成を開始するために使用する。つ いで新規に合成する鎖は、Peaseら(Proc.Natl.Acad.Sc i.USA,91:5022,1994)により記述されているようにオリゴヌ クレオチド配列に対するハイブリッド形成を使用することにより解析する。 本発明による配列変異の特定は、好ましくは、第一ラウンドのミスマッチ認 識および切断、オリゴヌクレオチドライゲーション、そしてDNAの配列決定に おいて達成する。ライゲーションしたオリゴヌクレオチドがa)変化を含む固定 化された短縮標的細胞、b)ミスマッチ領域のどちらかの境界部分から10−5 00bpの範囲内で共有結合的に接着することができる。これらの条件のどちら かが満たされない場合、配列の変化を位置づけそして特定するためにさらにもう 一ラウンドの配列決定が必要になる可能性がある。1またはそれ以上のさらなる 配列決定のラウンドのための配列決定プライマーは、第一ラウンドにおいて得ら れる配列(同一の鎖あるいは相補的な鎖のどちらか)により読みとりうることを、 当該技術分野の通常の技術を有する者は理解するだろう。理論的に結合すること が期待される以外は、1または2の配列決定ラウンドは既知の野生型配列および 特定の患者のDNAの中に含まれている配列の間での分岐を示しうる(以下を参 照)。 高スループットの応用 本発明の方法は、高スループットのDNA解析、すなわち多数の患者から採 取したDNAサンプルを高速で同時に処理するために特に適している。さらに新 規の変異を検出するためのその他の方法と対照的に、本発明の方法は、一回の反 応で多数の遺伝子位置を同時に解析するために適しており、これは“複合的”解 析と示される。そのため、単一の反応混合物中でいずれかの1サンプルあるいは 多数のサンプルのために、本発明では遺伝子内位置(単一遺伝子内でのいくつか の領域)および遺伝子間位置(異なる遺伝子間でのいくつかの領域)の両方を解 析することができる。本発明の方法を行う際に関連する操作は、固体支持体とし てあるいはたとえばビーズを入れる容器としてマルチウェルマイクロタイターデ ィッシュ(multiwell microtlter dish)を使用する ことにより、連続的なインキュベーションや洗浄を行うためのロボットを使用す ることにより、そして最終的には商業的に入手可能な自動DNAシークエンサー を使用して自動的に配列決定をすることにより、自動化をすることができる。臨 床的な観点において、500人の患者のDNAサンプルをコスト効率的な方法で 1−2日で解析することができることを企図している。 ポジショナルクローニング 本発明の方法は、いずれかの生物における病理学的状態あるいはその他の検 出可能な表現型を引き起こす未知遺伝子のポジショナルクローニングにも適して いる。本明細書で使用している“ポジショナルクローニング”とは、それまでは 未知の疾患誘起遺伝子の位置決定し、特定する工程を示している。たとえば、症 候の原因となる特定の遺伝子が特定されていない場合でも、いくつかのメンバー が遺伝子的な症候の兆候を示す複合的なファミリーを特定することはしばしば可 能である。一般的には、未知遺伝子の探索は、1またはそれ以上の以下の時間集 約的および労働力集約的な工程を含む:1)特定の染色体の比較的大きな分節に 対して遺伝子を細胞遺伝学的に位置決定すること、2)特定された染色体領域に 対応する数十万ヌクレオチドを集合的にカバーする様に、コスミドあるいはP1 クローンが集合的にオーバーラップすること、3)クローンの配列を決定するこ と、そして4)発現した遺伝子のタンパク質コード領域を特定するために転写マ ッピングをすること。 本発明は、疾患誘起遺伝子の位置特定のための、代替のそしてコスト効率的 な方法を提供する。簡単に言うと、患者から採取したDNAを上記のように正常 なDNAとハイブリッド形成させ、変異の部位でミスマッチ領域を形成する。好 ましくは、染色体上の位置に対応するDNAの大きな領域を、患者のゲノムDN Aから増幅し、その後ハイブリッド形成反応を行う。その後ハイブリッドは上記 のいずれかの方法により処理し、それによりミスマッチ領域を認識、切断し、ミ スマッチ領域の付近のヘテロ二本鎖にギャップを形成する。最後に、ミスマッチ 領域に近接する配列を決定する。 この態様において、ミスマッチに近接する十分に短い配列を特定することは 、疾患誘起遺伝子を限定的に特定するのに役に立つ。配列決定の第一ラウンドに おいて決定する短い配列は、ゲノムライブラリーあるいはcDNAライブラリー をスクリーニングする際に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計す るために使用することができる。 一次配列情報を単独であるいはライブラリースクリーニングとともに使用す ることができるその他の方法には、組織特異的発現の特定、mRNAの逆転写増 幅、そして患者集団における遺伝子型/表現型の関連についてのスクリーニング が含まれる。このように、理論により限定されることは望まないが、疾患やその 他の表現型を引き起こすそれまでは未知の遺伝子を、この方法により素早く、そ して効率よく特定することができることを企図している。 以下の実施例は、限定することなく本発明を説明することを意図している。 実施例 実施例1:標的DNAの調製 A)血液からのサンプルDNAの調製 高グルコースACD VacutainersTM(黄色のふた)中に採取し た全血サンプルを遠心分離し、バッフィーコート(遠心分離したときに赤血球層 の上部に層を成す白血球および血小板の層)を回収した。白血球を14mMのN H4Clと1mMのNaHCO3の10:1(v/v)混合液で2回洗浄すること により融解し、白血球の核を核融解緩衝液(10mM Tris、pH8.0、 0.4M NaCl、2mM EDTA、0.5%SDS、500μg/mlプ ロテナーゼK)中に再懸濁し、37℃で一晩インキュベートした。ついでサンプ ルを1/4量の飽和NaClで抽出し、そしてDNAをエタノール中で沈殿した 。ついでDNAを70%エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてTE緩衝液(10 mM Tris−HCl、pH7.5、1mM EDTA)中に溶かした。 B)頬の細胞からのサンプルDNAの調製 頬の細胞は、滅菌サイトロジーブラシ(Scientific Produ cts)または雌型(female)ダクロン綿棒(Medical Pack aging Corp.)で、ブラシあるいは綿棒で30秒間頬の内側をこする ことにより回収した。DNAは、室温ですぐにあるいは4℃で貯蔵した後、以下 の様に調製した。ブラシあるいは綿棒を、ポリプロピレンのマイクロ遠心管中に 入れた50mMのNaOH(600μl)中に浸し、ボルテックスをかけた。ブ ラシあるいは綿棒を入れたままの遠心管を95℃で5分間加熱し、その後ブラシ あるいは綿棒を慎重に取り除いた。DNAを含む溶液をついで、1M Tris 、pH8.0(60μl)で中性化し、再びボルテックスをかけた(Mayal l et al.,J.Med.Genet.27:658,1990)。DNA は4℃で保存した。 C)ハイブリッド形成の前に行う標的DNAの増幅 CFの患者から採取したDNAをPerkin−Elmer社製のCetu s 9600サーマルサイクラー中でPCRにより増幅した。5種のプライマー セットを用いて、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節(CFTR)遺伝子( Richards et al.,Hum.Mol.Gen.2:159,19 93)の対応するエクソン4、10、20そして21の領域を同時に増幅した。 50μlのPCR反応混合物には、以下の要素:すなわち0.2−1μgのCF 患者DNA、10mM Tris、pH8.3、50mM KCl、1.5mM MgCl2、0.01%(w/v)ゼラチン、200μMのそれぞれのデオキ シヌクレオチド3リン酸、0.4μMのそれぞれの増幅プライマー、そして2. 5単位のTaqポリメラーゼが含まれた。開始の変性は、94℃で20秒間イン キュベーションすることにより行い、ついで94℃で10秒間、55℃で10秒 間、74℃で10秒間でそれぞれ構成される増幅のサイクルを28サイクル繰り 返し、74℃、5分間で最後のソーク(soak)を行った。増幅に続き、8μ lのPCR産物を2%アガロースゲル中で電気泳動し、5つの産物すべてが存在 することを証明した。 D)固体マトリックスに対するDNAの結合 固体支持体に対する増幅DNAの結合のために、上述した増幅反応をビオチ ニル化プライマーの存在下で行う。ついでビオチニル化産物をDynabead sR M−280ストレプトアビジン(Dynal)とともに、10mM Tr is−HCl、pH7.5、1mM EDTA、2M NaCl、そして0.1 %Tween−20を含む溶液中で、48℃、15−30分間インキュベートす る。 実施例2:標的DNAと野生型DNAのハイブリッド形成 A)野生型DNAの調製 健康なヒトの血液あるいは頬の細胞から実施例1に記載したようにDNAを 調製する。代表的な“野生型”DNAサンプルを、10−200人のヒトから採 取したDNAサンプルを一緒にして完全に混ぜることにより調製する。 B)ハイブリッド形成反応 ハイブリッド形成は、上記実施例IDに従って調製したビーズ固定化DNA を含むマイクロタイターディッシュ中で行う。ハイブリッド形成溶液は、10m M Tris−HCl、pH7.5、650mM NaCl中に、およそ500 μg/mlの野生型DNA(上記実施例2Aに従って調製)とおよそ50μg/ mlの増幅し固定化した標的DNA(実施例1に従って調製)を含む。反応混合 物を90℃で3分間加熱し、その後ハイブリッド形成を65℃で1時間進行させ る。ついでハイブリッド形成溶液を除去し、ビーズを65℃の0.1xSSC中 で3回洗浄する。 C)自由末端のブロッキング 上述したように調製したDNA:DNAハイブリッドを含むビーズを処理し 、それにより自由末端をブロックしそしてそれ以上たとえばRNAリガーゼなど により修飾することができないようにする。ウェルを、0.4Mカコジル酸カリ ウム、50mM Tris−HCl、pH6.9、4mMジチオスレイトール、 1mM CoCL2、2mM ddGTP、500μg/mlのウシ血清アルブ ミン、および2単位のターミナルトランスフェラーゼを含む100μlの溶液中 で、37℃15分間インキュベートした。 実施例3:ミスマッチの認識、切断および配列決定 A)本発明の一態様において、実施例2で記述したように調製したDNAハ イブリッドが結合している50μlのビーズをそれぞれが含む、4種の別個の反 応混合物を、2μlの10xT4ポリメラーゼ緩衝液(50mM NaCl、1 0mM Tris−HCl、pH7.9、10mM MgCl2、1mMジチオ スレイトール、そして1mg/mlのウシ血清アルブミン);16μlの水;1 μlのT4エンドヌクレアーゼ7(250−3000単位、Kosakら(Eu r.J.Biochem.194:779,1990)中に記載しているように 採取);そして1μlのT7DNAポリメラーゼ(3単位)とともにインキュベ ートする。反応は、37℃で1−10分間行う。 ついで9μlの“終止混合物”をそれぞれの反応物に添加する。“終止混合 物”には8μMの1種のddNTP(たとえば、ddGTP、ddATP、dd TTPまたはddCTP)と80μMの4種のdNTPを含み、そのうちの1種 を放射活性物質あるいは蛍光で標識する。さらに、1μlの10xT4ポリメラ ーゼ緩衝液を添加し、そして反応を37℃で5分間行う。 反応混合物を回収し、ビーズを100μlのTE(10mM Tris−H Cl、pH7.5、1mM EDTA)で3回洗浄する。最後に、ビーズを6μ lのローディング緩衝液(95%フォルムアミド、20mM EDTA、0.0 5%ブロムフェノールブルー、0.05%キシレンシアノールFF)中で再懸濁 する。緩衝液をビーズから回収し、そして6%の変性用ポリアクリルアミドDN A配列決定ゲル中で泳動する。 B)別の方法としては、実施例2で記述したように調製したDNAハイブリ ッドを含む50μlのビーズを50mM Tris−HCl、pH8.0、10 mM MgCl2そして1mMジチオスレイトールを含む溶液中で500単位の T4エンドヌクレアーゼ7とともに、37℃で30分間インキュベートする。T 4エンドヌクレアーゼ7は、Kosakら(Eur.J.Biochem.19 4:779,1990)に従って採取する。 インキュベーションの後、ビーズを90℃で3分間加熱し、その後溶液を素 早く除去し、あらかじめ暖めておいたTEで置換し、そしてビーズをTEで3回 、室温で洗浄する。この処置によりDNA:DNAハイブリッドを効率よく変性 し、そして野生型DNA鎖を除去する。 実施例4:ミスマッチの認識と化学的なミスマッチの切断を使用した切断 本発明の一態様において、上記実施例1および2において調製したマイクロ タイターウェルを、ヒドロキシルアミンと四酸化オスミウムで連続的に処置する。 A)ヒドロキシルアミン処置 ヒドロキシルアミン(Aldrich,Milwaukee,WIより入手 )を蒸留水中で溶解し、そしてpHをジエチルアミン(Aldrich)で6. 0に調節し、それにより最終濃度を約2.5Mにする。200μlの溶液をウェ ル中で37℃2時間インキュベートする。ヒドロキシルアミン溶液を0.3M酢 酸ナトリウム、0.1mM EDTA、pH5.2、そして25μg/mlイー ストtRNA(Sigma,St.Louis,MO)を含む氷冷溶液で置換す ることにより、反応を停止する。ついでウェルを10mM Tris−HCl、 pH7.7、1mM EDTAの氷冷溶液中で洗浄し、ついで四酸化オスミウム で処置する。 B)四酸化オスミウム処置 四酸化オスミウム(Aldrich)を10mM Tris−HCl、pH 7.7、1mM EDTA、1.5%(v/v)ピリジン中で、4%(w/v) の濃度になるように融解する。ウェルをこの溶液で37℃、2時間インキュベー トする。四酸化オスミウム溶液を0.3M酢酸ナトリウム、0.1mM EDT A、pH5.2、そして25μg/mlイーストtRNAを含む氷冷溶液で置換 することにより、反応を停止する。 C)ピペリジン切断 ディッシュを1Mピペリジンで90℃30分間インキュベートすることによ り、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムと反応するCおよびT塩基の化 学的切断を行うことができる。ついでウェルを蒸留水で何回も洗浄する。 実施例5:ミスマッチ領域の配列決定 実施例1および2で記載したように調製し、そしてミスマッチに認識・切断 を目的とする(上記実施例3Bあるいは4あるいはその他の方法により記載した )固定化DNAを、配列5’−CAGTAGTACAACTGACCCTTTT G GGACCGC−3’を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとともに、オリゴヌク レオチドが自由5’末端に効率よくライゲーションすることができるような条件 下でインキュベートする。50mM Tris−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、20mMジチオスレイトール、1mM ATP、そして100μ g/mlウシ血清アルブミンを含む溶液中で、オリゴヌクレオチドと固定化DN Aとを混合し、その後RNAリガーゼ(Pharmacia Biotech, Uppsala,Sweden)をその溶液に添加し、最終酵素濃度が0.1− 5.0U/mlになるようにする。反応は、37℃で15分間行う。ライゲーシ ョン反応の後、溶液を除去し、ウェルを蒸留水で洗浄する。 ついでSanger法を用いて、DNAの配列決定を行う(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:546 3,1977)。 実施例6:疾患誘起遺伝子のポジショナルクローニング 以下に記載する実験は、疾患誘起遺伝子に対応するゲノム領域の素早い位置 決定と配列決定をするために行う。 遺伝子疾患を発現している複合のファミリーを、標準的な臨床的指標を用い て特定する。DNAサンプルを上記実施例1に記載しているように疾患に罹って いる患者そして罹っていないヒトから採取した;遺伝の様式から見て疾患が常染 色体性劣性疾患であるように見える場合には、推定上疾患遺伝子のヘテロ結合体 になるヒトからDNAサンプルを採取する。 一態様において、上記実施例2に記載したように、すべてのDNAサンプル は、野生型DNAとハイブリッド形成することによりミスマッチの解析に供され る。ついでハイブリッドをミスマッチ修復タンパク質で処理し、ギャップのある ヘテロ二本鎖を形成し、そしてギャップ付近の配列を上記実施例3Aに記載する ように決定する。 別の態様において、上記実施例2において記載したように野生型DNAとハ イブリッド形成することにより、すべてのDNAサンプルをミスマッチの解析に 供する。ついでハイブリッドを上記実施例3Bに記載したように、T4エンドヌ クレアーゼ7で処理する。最後に、配列5’−CAGTAGTACAACTGA CCCTTTTGGGACCGC−3’を有するオリゴヌクレオチドを切断した ハイブリッドにRNAリガーゼを使用してライゲーションし、そして産物を上記 実施例5に記載したように酵素的DNA配列決定に供する。 疾患に罹っていないヒト、罹っているヒトから採取した配列、そして推定上 ヘテロ結合体のファミリーのメンバーをそれぞれとそして利用可能な配列データ ベースを用いて、たとえばSequencher(Gene Codes,An n Arbor,MI)やAssembly Lign(Kodak,New Haven,CT)を使用して比較する。配列は、オリゴヌクレオチドプローブ を設計するための基礎としても供し、そのオリゴヌクレオチドプローブを化学的 に合成し、そしてヒトゲノムDNAライブラリーをプローブするために使用する 。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 08/488,012 (32)優先日 1995年6月7日 (33)優先権主張国 米国(US) (31)優先権主張番号 08/488,013 (32)優先日 1995年6月7日 (33)優先権主張国 米国(US) (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),AU,CA,JP

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 第一のゲノムDNAサンプル中に存在する標的配列中の1または それ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、 a)前記DNAサンプルを変化を含まない第二のDNAサンプルとハイブリ ッド形成し、変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖DNAを形 成し、 b)標的配列中の前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断し、前記変化の部位付 近に一本鎖のギャップを形成し、 c)ジデオキシヌクレオチドの存在下で、前記切断したヘテロ二本鎖をDN Aポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決定し、そ して d)前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種(cognate) の野生型配列とを比較し、前記遺伝子変化を特定すること を含む前記方法。 2. 変化が、1またはそれ以上のヌクレオチドの付加、削除、および 置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1、16、2 4または32に記載の方法。 3. 前記標的配列を増幅してからハイブリッド形成工程を行う、請求 項1、16、24または32に記載の方法。 4. 第一のDNAサンプルを固体支持体に固定化してからハイブリッ ド形成工程を行う、請求項1、16または24に記載の方法。 5. 固体支持体が、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ 、そしてプラスチックからなる群から選択される、請求項4に記載の方法。 6. 前記切断工程が、ミスマッチ認識および切断に適した条件下で、 前記ヘテロ二本鎖DNAを1またはそれ以上のリゾルベース(resolvas e)タンパク質に暴露することを含む、請求項1、21、24または35に記載 の方法。 7. リゾルベースが、T4エンドヌクレアーゼ7およびT7エンドヌ クレアーゼ1からなる群から選択される、請求項6に記載の方法。 8. 前記DNAポリメラーゼが、DNAポリメラーゼI、DNAポリ メラーゼIII、T7DNAポリメラーゼそしてT4DNAポリメラーゼからな る群から選択される、請求項1または21に記載の方法。 9. 前記切断工程が、ミスマッチ認識、切断および除去に適した条件 下で、前記ヘテロ二本鎖DNAを1またはそれ以上のミスマッチ修復タンパク質 に暴露することを含む、請求項1、21、24または35に記載の方法。 10. 1またはそれ以上のミスマッチ修復タンパク質が、Escher ichia coli(大腸菌)のタンパク質であるMutS、MutL、Mu tHおよびMutUまたはそれらの機能的類似体を含む、請求項9に記載の方法 。 11. 前記機能的類似体が、Salmonella typhimur ium、Streptococcus pneumoniae、Sacchar omyces cerevisiae、Schizosaccharomyce s pombe、マウス、およびヒトからなる群から選択される種に由来する、 請求項10に記載の方法。 12. 前記切断工程が、ミスマッチ認識、切断および除去に適した条件 下で、前記ヘテロ二本鎖DNAをヌクレオチド除去修復タンパク質の混合物に暴 露することを含む、請求項1、21、24または35に記載の方法。 13. 混合物が、E.coli(大腸菌)のタンパク質であるUvrA 、UvrB、UvrCおよびUvrDまたはそれらの機能的類似体を含む、請求 項12に記載の方法。 14. 機能的類似体が、Saccharomyces cerevis iaeおよびヒトからなる群から選択される種に由来する、請求項13に記載の 方法。 15. さらに前記第一のDNAを鋳型として使用して前記ヌクレオチド 配列の相補性を決定することを含む、請求項1または24に記載の方法。 16. 第一のゲノムDNAサンプル中に存在する標的配列中の1または それ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、 a)第一のDNAサンプルを変化を含まない第二のDNAサンプルとハイブ リッド形成し、変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖DNAを 形成し、 b)前記ヘテロ二本鎖DNAを、ジデオキシヌクレオチドの存在下において 、T4エンドヌクレアーゼ7およびDNAポリメラーゼIの混合物で処理し、未 成熟の結果産物を形成し、 c)ミスマッチ領域に近接するヌクレオチド配列を決定するために前記未成 熟産物を分解し、そして d)前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを 比較し、前記変化を特定すること を含む前記方法。 17. DNA中の1またはそれ以上の変異を複合的に特定する方法であ って、 a)1またはそれ以上の第一のDNAサンプルを固体支持体上に固定し、 b)前記固定化サンプルを変異を含まない第二のDNAサンプルとハイブリ ッド形成し、変異の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖DNAを形 成し、 c)前記ミスマッチ領域に隣接する前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖 を切断し、前記変異の部位にギャップを形成し、 d)前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下におい て、DNAポリメラーゼで処理し、酵素的DNA配列決定法を用いて前記ギャッ プの付近のヌクレオチド配列を決定し、そして e)前記ヌクレオチド配列と1またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同 種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定すること を含む方法。 18. DNAサンプルを変性してからハイブリッド形成を行う、請求項 1、16、17、24、33または34に記載の方法。 19. 第一のDNAサンプルを増幅してから固定化する、請求項17、 33または34に記載の方法。 20. ゲノムDNAサンプル中に存在する標的配列中の1またはそれ以 上の遺伝子的変化を特定する方法であって、 a)前記DNAを変性し、 b)前記DNAを再度アニーリングし、変化の部位にミスマッチ領域を含む ヘテロ二本鎖を形成し、 c)前記標的配列中の前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断し、前記変化の部 位付近に一本鎖のギャップを形成し、 d)前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下におい て、DNAポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決 定し、そして e)前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを 比較し、前記変化を特定すること を含む方法。 21. 目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの方法であって、 a)特定の表現型を示すヒトに由来する第一のDNAサンプルを、前記表現 型を示さない1またはそれ以上のヒトに由来する第二のDNAサンプルとハイブ リッド形成し、前記第一のDNA配列が前記第二のDNA配列と異なっている部 位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成し、 b)前記ヘテロ二本鎖DNAの一方の鎖を切断し、前記ミスマッチ領域の付 近に一本鎖のギャップを形成し、 c)前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下におい て、DNAポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決 定し、 d)前記ヌクレオチド配列のすべてあるいは一部を含む合成オリゴヌクレオ チドを調製し、そして e)前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するDNAクローンを特定 すること を含む前記方法。 22. ミスマッチ領域が、目的とする遺伝子中で1またはそれ以上のヌ クレオチドの付加、削除、そして置換およびそれらの組み合わせからなる群から 選択される1またはそれ以上の修飾により引き起こされる、請求項21または3 5に記載の方法。 23. 前記ヌクレオチド配列が、酵素的DNA配列決定法により決定さ れる、請求項21または35に記載の方法。 24. 第一のDNAサンプル中に存在する標的配列中の1またはそれ以 上の遺伝子的変化を特定する方法であって、 a)前記第一のDNAサンプルを変化を含まない第二のDNAサンプルとハ イブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変化の部位においてミスマッチ領域を 含むヘテロ二本鎖DNAを形成し、 b)前記ヘテロ二本鎖DNAを、変化の部位あるいはそれに近接する部位で 切断し、新しい末端を形成し、 c)あらかじめ配列が決定されている一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新し い末端にライゲーションし、 d)前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接する前記DNAサン プルのヌクレオチド配列を決定し、そして e)前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを 比較し、前記変化を特定すること を含む前記方法。 25. さらに前記ヘテロ二本鎖DNA上の前記自由末端をブロックして から切断工程を行うことを含む、請求項24または35に記載の方法。 26. ブロッキングの工程が、5’リン酸基の除去、ジデオキシヌクレ オチドによる3’末端のへのホモポリマーテール付加、そして修飾した二本鎖オ リゴヌクレオチドのライゲーションからなる群から選択される方法を含む、請求 項25に記載の方法。 27. 前記切断工程が以下の工程: a)前記ヘテロ二本鎖DNAを、ミスマッチ認識および修飾に適した条件下 で、1またはそれ以上の非タンパク質化学的試薬と暴露させ、そして b)修飾部分に近接する部分で前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断すること を含む、請求項24または35に記載の方法。 28. 化学的試薬が、ヒドロキシルアミンおよび四酸化オスミウムから なる群から選択される、請求項27に記載の方法。 29. 一本鎖オリゴヌクレオチドが、約15から約35の長さのヌクレ オチドである、請求項24または35に記載の方法。 30. ライゲーション工程をRNAリガーゼを使用して行う、請求項2 4または35に記載の方法。 31. 決定工程を、オリゴヌクレオチドのアレーに対するハイブリッド 形成を利用して行う、請求項24または35に記載の方法。 32. 第一のゲノムDNAサンプル中に存在する標的配列中の1または それ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、 a)第一のDNAサンプルを固体支持体上に固定し、 b)前記固定化したサンプルを変化を含まない第二のDNAサンプルとハイ ブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変化の部位においてミスマッチ領域を含 むヘテロ二本鎖DNAを形成し、 c)前記自由末端を、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、ターミナ ルトランスフェラーゼで化学的にブロックし、 d)前記ミスマッチ領域に隣接した前記ヘテロ二本鎖DNAの一方の鎖をバ クテリオファージのT4エンドヌクレアーゼ7で切断し、新しい末端を形成し、 e)配列5’−CAGTAGTACAACTGACCCTTTTGGGAC CGC−3’を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端とライゲーシ ョンし、 f)前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配 列を、酵素的DNA配列決定法を使用して決定し、そして g)前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを 比較し、変異を特定すること を含む前記方法。 33. DNA中の1またはそれ以上の変異を特定する方法であって、 a)前記DNAサンプルを固体支持体に固定し、 b)前記固定化サンプルを変異を含まない第二のDNAとハイブリッド形成 し、自由末端を有し、かつ変異の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本 鎖DNAを形成し、 c)化学的に前記自由末端をブロックし、 d)前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖を、前記ミスマッチ領域の中で あるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、 e)あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端 にライゲーションし、 f)前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配 列を決定し、そして g)前記ヌクレオチド配列と1またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同 種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定すること を含む前記方法。 34. 第一のDNA中の1またはそれ以上の変異を複合的に特定する方 法であって、 a)1またはそれ以上の第一のDNAサンプルを固体支持体上に固定化し、 b)前記固定化したサンプルを変異を含まない第二のDNAサンプルとハイ ブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変異の部位においてミスマッチ領域を含 むヘテロ二本鎖DNAを形成し、 c)化学的に前記自由末端をブロックし、 d)前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖を、前記ミスマッチ領域の中で あるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、 e)あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端 にライゲーションし、 f)前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配 列を決定し、そして g)前記ヌクレオチド配列と1またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同 種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定すること を含む前記方法。 35. 目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの方法であって、 a)特定の表現型を示すヒトに由来する第一のDNAサンプルを、前記表現 型を示さない1またはそれ以上のヒトに由来する第二のDNAサンプルとハイブ リッド形成し、自由末端を有し、かつ前記第一のDNAサンプルの配列が前記第 二のDNAサンプルの配列と異なる部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二 本鎖を形成し、 b)前記ヘテロ二本鎖DNAの一方または両方の鎖を、ミスマッチ領域の中 であるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、 c)あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端 にライゲーションし、 d)前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配 列を決定し、 e)前記ヌクレオチド配列のすべてあるいは一部を含む合成オリゴヌクレオ チドを調製し、そして f)前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するDNAクローンを特定 すること を含む前記方法。 36. 特定するための工程が、コロニーハイブリッド形成法、組織特異 的発現を特定する方法、mRNAの逆転写増幅法、および遺伝子型/表現型の関 連について疾患に罹っている集団をスクリーニングすることからなる群から選択 される方法を使用して行う、請求項21または35に記載の方法。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9724480D0 (en) * 1997-11-19 1998-01-14 Hexagen Technology Limited Screening process
US6297010B1 (en) * 1998-01-30 2001-10-02 Genzyme Corporation Method for detecting and identifying mutations
EP1147219A1 (en) 1999-02-05 2001-10-24 Amersham Pharmacia Biotech UK Limited Analysis method
US7166432B2 (en) 1999-03-12 2007-01-23 Integragen Compositions and methods for genetic analysis
DE19911130A1 (de) * 1999-03-12 2000-09-21 Hager Joerg Verfahren zur Identifikation chromosomaler Regionen und Gene
AU6387000A (en) * 1999-07-29 2001-02-19 Genzyme Corporation Serial analysis of genetic alterations
US6524794B1 (en) 1999-10-29 2003-02-25 Decode Genetics Ehf. Identical-by-descent fragment enrichment
US6235483B1 (en) 2000-01-31 2001-05-22 Agilent Technologies, Inc. Methods and kits for indirect labeling of nucleic acids
DE10030452A1 (de) * 2000-06-21 2002-01-24 Max Planck Gesellschaft Assay zur Detektion von primären DNA-Schäden
WO2002024953A1 (en) * 2000-09-21 2002-03-28 Merck & Co., Inc. Method for generating recombinant polynucleotides
WO2003070977A2 (en) * 2002-02-21 2003-08-28 Nanogen Recognomics Gmbh Method for detecting single nucleotide polymorphisms
ES2292270B1 (es) 2004-04-14 2009-02-16 Oryzon Genomics, S.A. Procedimiento para detectar selectivamente acidos nucleicos con estructuras atipicas convertibles en muescas.
US20200407776A1 (en) * 2019-06-26 2020-12-31 Integrated Dna Technologies, Inc. Compositions and methods for improved detection of genomic editing events

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5556750A (en) * 1989-05-12 1996-09-17 Duke University Methods and kits for fractionating a population of DNA molecules based on the presence or absence of a base-pair mismatch utilizing mismatch repair systems
AU3919293A (en) * 1992-03-27 1993-11-08 University Of Maryland At Baltimore Detection of gene mutations with mismatch repair enzymes
WO1993022457A1 (en) * 1992-04-24 1993-11-11 Massachusetts Institute Of Technology Screening for genetic variation
US5376526A (en) * 1992-05-06 1994-12-27 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Genomic mismatch scanning
FR2709761B1 (fr) * 1993-09-10 1995-11-24 Pasteur Institut Procédé de détection de molécules contenant des mésappariements nucléotidiques et de localisation de ces mésappariements, et application à la détection de substitutions ou de délétions de bases .
DE69605803T2 (de) * 1995-05-11 2000-07-20 Arild Lagerkvist Nachweis von fehlpaarungen durch spaltung mit resolvase auf einem festträger
US5707806A (en) * 1995-06-07 1998-01-13 Genzyme Corporation Direct sequence identification of mutations by cleavage- and ligation-associated mutation-specific sequencing
US5571676A (en) * 1995-06-07 1996-11-05 Ig Laboratories, Inc. Method for mismatch-directed in vitro DNA sequencing

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