JPH11506937A

JPH11506937A - Ｄｎａの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、ｄｎａの遺伝子的修飾を特定する方法

Info

Publication number: JPH11506937A
Application number: JP9501295A
Authority: JP
Inventors: シュバー，アンソニー・ピー
Original assignee: Genzyme Corp
Current assignee: Genzyme Corp
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-06
Publication date: 1999-06-22
Also published as: WO1996041002A3; AU705257B2; EP0832283A2; CA2219933A1; AU5981396A; WO1996041002A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、目的とする遺伝子中に存在する遺伝子的変化および遺伝子的変異の正確な位置および配列を決定するための方法を提供する。本発明はさらに、目的とする遺伝子のポジショナルクローニングおよび配列決定のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ＤＮＡの配列決定およびポジショナルクローニングを含む、ＤＮＡの遺伝子的修飾を特定する方法発明の属する分野本発明は、哺乳動物中の特定の疾患誘起ＤＮＡ配列を含む、以前には特定されていないＤＮＡ中の配列の変化を直接的に特定する高スループットの方法論に関する。本発明の方法は、遺伝子的多型を特定するために、遺伝子疾患に対する分子的基礎を決定するために、そして遺伝子カウンセリングのためのキャリア診断および出生前診断を提供するために使用することができる。発明の背景ＤＮＡ配列中にある変化（たとえば、変異および多型）を検出する能力は、遺伝子疾患の診断に対して、そして疾患誘起微生物の臨床的に重要な変異体を特定することに対して中心的なことである。遺伝子的変化を分子的に解析する方法の一つは、サザンブロット技術（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ.，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ.，９８：５０３−５１７，１９７５）を用いた、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の検出に関する。このアプローチが比較的煩わしいものであるために、新しい方法が開発されたが、その中のいくつかはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を基礎としたものである。これらには、ＰＣＲを用いたＲＦＬＰ解析(Ｃｈｅｈａｂｅｔａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ，３２９：２９３−２９４，１９８７；Ｒｏｍｍｅｎｓｅｔａｌ.，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ.，４６：３９５ −３９６，１９９０)、プライマー特定制限酵素部位修飾を用いた人工的ＲＦＬＰの作成(Ｈａｌｉａｓｓｏｓｅｔａｌ.，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，１７：３６０６，１９８９)、アリル特異的増幅（ＡＳＡ）(ＮｅｗｔｏｎＣＲｅｔａｌ.，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，１７：２５０３−２５１６，１９８９)、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）(ＬａｎｄｅｒｇｒｅｎＵｅｔａｌ.，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０，１９８８)、プライマー伸長(ＳｏｋｏｌｏｖＢＰ，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ. ，１８：３６７１，１９８９)、制限酵素部位の人工的導入（ＡＩＲＳ）(ＣｏｈｅｎＬＢｅｔａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ３３４：１１９−１２１，１９８８) 、アリル特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成（ＡＳＯ）(ＷａｌｌａｃｅＲＢｅｔａｌ.，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，９：８７９−８９５，１９８１)、およびそれらの変形が含まれる。ロボット工学とともに、直接的変異および解析に対するこれらの技術は、効率のよい診断的解析として解析すべきことが必要とされる変異の数が限られている場合にのみ、コストの削減およびスループットの増進に寄与した。しかしながらこれらの方法は、複合的変異解析に対するその応用に限界がある。たとえば、米国で生存新生児２０００−２５００人に１人が罹る嚢胞性繊維症、劣性遺伝子障害において、２２５を越える疾患誘起異変と推定される変異が特定された。さらに一人の患者に複数の変異が存在する場合や、複数の変異がお互いに数塩基対の間隔をおいて存在している場合がある。これらの現象は多数のサンプルＤＮＡを処理することができる臨床的スクリーニング方法を設計する際に、特有の困難性を示す。Ｓｈｕｂｅｒら(Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ.，２：１５３−１５８，１９９３ )は、単一の標的ＤＮＡサンプルに対して複数のオリゴヌクレオチドプローブを同時にハイブリッド形成することができる方法を開示している。ハイブリッド形成反応において、合成オリゴヌクレオチドと標的ＤＮＡとの間で形成されるハイブリッドの、溶融温度の不均衡を排除する試薬を含むことにより、一回の試験でＤＮＡサンプルをスクリーニングして別個の変異が存在することを調べるすることが可能である。一般的に１００より多くのＡＳＯをプールすることができ、それらを標的ＤＮＡとハイブリッド形成することができる；第二の工程において、陽性の結果を示すプールからのＡＳＯそれぞれを同一のＤＮＡとハイブリッド形成する。Ｓｈｕｂｅｒら（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ.，５：４８８−４９３，１９９５）は、複数のＡＳＯを最初に標的ＤＮＡとハイブリッド形成した後に、溶出しそしてハイブリッド形成したＡＳＯの配列決定をする、複数アリル特異的疾患解析に関する方法を開示する。この方法により、一つのＡＳＯが関与する多くの別々のハイブリッド形成をする必要なく変異を特定することができ、そしてこの方法には関連する変異の先行知識が必要とされる。しかしながら、上記方法を使用してまれな変異の頻度を適切に検出することが達成されるためには、多くの変異をスクリーニングしなければならない。遺伝子中のそれまでは未知の変異を特定するために、別の方法論を確立したが、それには一本鎖立体構造多型(ＳＳＣＰ)(ＯｒｉｔａＭｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：２７６６−２７７０，１９８９) 、変性密度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）(ＭｅｙｅｒｓＲＭｅｔａｌ.，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：４９５−４９８，１９８５)、ヘテロ二本鎖解析（ＨＥＴ）(ＫｅｅｎＪｅｔａｌ.，ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．７：５，１９９１)、化学的切断解析（ＣＣＭ）(ＣｏｔｔｏｎＲＧＨｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：４３９７−４４０１，１９８８)、および標的サンプルの完全配列決定（ＭａｘａｍＡＭｅｔａｌ.，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ.，６５：４９９−５６０，１９８０，ＳａｎｇｅｒＦｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３−５４６７，１９７７）が含まれる。しかしながら、直接配列決定を除くこれらの手順すべては、単なるスクリーニング方法である。すなわち、それらは変異は存在するものの変異の正確な配列および位置を特定することができないことを示すだけである。そのため、変異を完全に特定するためには、ＤＮＡサンプルの完全な配列決定が必要である。この理由のために、これらの方法は、高スループットでありかつ低コストの日常的な診断方法としては両立しない。このように、当該技術分野においては、それまでは特定されていない変異あるいは配列の変化が存在する多数のＤＮＡサンプルを効率よく解析することができる、比較的低コストの方法を必要としている。発明の概要本発明は、第一のＤＮＡサンプル中に存在する１またはそれ以上の標的配列中の遺伝子的変化を特定するための、高スループットの方法を含む。方法は以下の工程：ａ）第一のサンプルを遺伝子的変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、遺伝子的変化の部位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）標的配列中のヘテロ二本鎖の一方のＤＮＡ鎖を切断し、変化の部位付近に一本鎖のギャップを形成し、ｃ）ジデオキシヌクレオチドの存在下で切断したヘテロ二本鎖をＤＮＡポリメラーゼで処置し、ギャップ付近の配列を決定し、ｄ）ギャップに隣接するヌクレオチド配列とあらかじめ決定された同種（ｃｏｇｎａｔｅ）の野生型配列とを比較して、遺伝子的変化を特定することにより行う。上述した方法を行うときには、標的配列を含む第一のＤＮＡサンプルを厳しい条件下で変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成する。形成するハイブリッドはミスマッチ領域を含み、そのミスマッチ領域はミスマッチ認識タンパク質を基礎とする系により、認識しそしてミスマッチ領域の片側あるいは両側をエンドヌクレアーゼ的に切断する。一回のエンドヌクレアーゼ的な切断によりミスマッチ領域の片側しか切断されない場合には、一本鎖ギャップを形成するために１またはそれ以上のエクソヌクレアーゼを使用する。一回のエンドヌクレアーゼ的な切断によりミスマッチ領域の両側が切断された場合には、ヘリカーゼの活性により一本鎖断片が放出され、一本鎖のギャップを形成する。ギャップ付近の配列は、ジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、酵素的ＤＮＡ配列決定反応により、一回の工程でを決定することことができる。別の態様において本発明は、第一のＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定するための高スループットの方法を含む。本方法は、以下の工程：ａ）第一のサンプルを遺伝子的変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、自由末端有し、遺伝子的変化の部位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）変化部分あるいはその近辺のＤＮＡを切断し、新しい末端を形成し、ｃ）あらかじめ決定した配列のオリゴヌクレオチドを新しい末端にライゲーションし、ｄ）ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を決定する。そして、ｅ）ｄ）において決定したヌクレオチド配列とあらかじめ決定された同種（ｃｏｇｎａｔｅ）の野生型配列とを比較して、遺伝子的変化を特定することにより行う。標的配列を含む第一のＤＮＡサンプルと変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとをハイブリッド形成することにより、変化部分あるいはその近辺を特異的に切断することができ、それによりミスマッチ認識系により認識し切断することができるミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成する。一般的に、第一のＤＮＡサンプルは遺伝子疾患に罹った患者であって、当該疾患を引き起こす既知の変異のいかなるものも含まれていないゲノムを含む患者から得られたゲノムＤＮＡを含み、そして標的配列は既知の疾患誘起遺伝子を含む。これらの方法により特定された遺伝子的変化は、１あるいはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損あるいは置換を含む。本発明を行うときに有用であるミスマッチの認識、切断および除去システムは、限定されるものではないが、バクテリオファージの分解酵素、ミスマッチ修復タンパク質、ヌクレオチド除去修復タンパク質、除去修復、化学的修飾および切断が後に続くミスマッチの起こった塩基の化学的修飾、そしてこれらの組み合わせを含み、必要な際にはエクソヌクレアーゼを含む添加物を加える場合あるいは加えない場合がある。本発明では新規の変異あるいはそれまでは特定されていない多型を複合的に特定する高スループットの方法であって、多数の患者から得られたＤＮＡを単一の個体支持体上に固定化し、続いて以下の工程（すなわち上述したような、ハイブリッド形成工程、ミスマッチ認識工程、除去工程、切断工程、ライゲーション工程、配列決定工程および配列比較工程）の１またはそれ以上の工程を行う方法の応用を見いだした。さらに、固定化する前に標的配列を増幅し、それに続いて上述した工程を行うことにより、複数の特異的標的配列を同時に解析することができる。別の態様においては、本発明は疾患誘起遺伝子のポジショナルクローニングの方法を提供する。発明の方法は以下の工程：ａ）疾患に罹った患者から得られた第一のＤＮＡサンプルを疾患に罹っていない多数の患者から得られた第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、第一のＤＮＡサンプルの配列が第二のＤＮＡサンプルの配列と分離している部位にあるミスマッチ領域を含むハイブリッドを形成し、ｂ）ハイブリッド中の片側ＤＮＡ鎖を切断し変化の部位付近の一本鎖のギャップを形成し、ｃ）ギャップ付近のヌクレオチド配列を決定し、ｄ）ｃ）で決定したヌクレオチド配列の全部あるいは一部を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、ｅ）ｄ）で調製した合成オリゴヌクレオチドの配列を含む、コスミドあるいはＰ１ライブラリーから得られるＤＮＡクローンを特定することを使用して行う。本発明を行うときには、ミスマッチ領域はミスマッチ認識タンパク質を基礎とする系により、認識しそしてミスマッチ領域の片側あるいは両側をエンドヌクレアーゼ的に切断する。一回のエンドヌクレアーゼ的な切断によりミスマッチ領域の片側しかが切断されない場合には、一本鎖ギャップを形成するために１またはそれ以上のエクソヌクレアーゼを使用する。ミスマッチ領域の両側がエンドヌクレアーゼ的に切断された場合には、ヘリカーゼの活性により一本鎖断片が放出され、一本鎖のギャップを形成する。ギャップ付近の配列は、ジデオキシヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、あるいはＴ７ＤＮＡポリメラーゼを使用することで、酵素的ＤＮＡ配列決定反応により、一回の工程で決定することができる。本発明はさらに、目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの別の方法を提供する。これらの方法は、ａ）既知の表現型を示すヒト由来の第一のＤＮＡサンプルと表現型を示さない１またはそれ以上のヒト由来の第二のＤＮＡサンプルとをハイブリッド形成し、自由末端を有し、第一のＤＮＡサンプルの配列が第二のＤＮＡの配列と分離している部位のミスマッチ領域を含む、ヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）ａ）で形成したハイブリッドの自由末端をブロッキングし、ｃ）ミスマッチ領域中のあるいはそれに隣接するＤＮＡ鎖の片方あるいは両方を切断し、新しい末端を形成し、ｄ）あらかじめ決定された配列の一本鎖オリゴヌクレオチドをｃ）で形成した新規の末端にライゲーションし、ｅ）ライゲーションしあらかじめ決定した配列に隣接するヌクレオチド配列を決定し、ｆ）ｅ）において決定したヌクレオチド配列の全部あるいは一部を含む、合成オリゴヌクレオチドを調製し、そして、ｇ）ｆ）において調製した合成オリゴヌクレオチドの配列を含むコスミドあるいはＰ１ライブラリ由来のＤＮＡクローンを特定することにより行う。本明細書中で用いられるように、ポジショナルクローニングは、それまで未知の疾患誘起遺伝子を位置づけそして特定する方法に言及する。本発明の方法により特定される遺伝子的変化は、１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損、あるいは置換を含む。本発明を行う際に有用なミスマッチの認識、切断、および除去のシステムは、限定はされないが、ミスマッチ修復タンパク質、ヌクレオチド除去修復タンパク質、バクテリオファージリゾルベース（ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）、除去修復タンパク質がその後に続くミスマッチ塩基の化学的変化、そしてこれらの組み合わせを含み、必要な際にはエクソヌクレアーゼを含む添加物を加える場合あるいは加えない場合がある。発明の詳細な説明本発明は患者から分離されたＤＮＡ中の特異的標的配列を特定するための高スループットの方法を含む。本明細書中で使用しているように、高スループットという用語は、多数のＤＮＡサンプルを同時に素早くアッセイするシステムについて言及する。１またはそれ以上の遺伝子あるいは遺伝子位置が目的とする標的である場合に、本方法を応用することができる。特異的配列は、一般的に野生型のＤＮＡと比較して、１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、欠損あるいは置換を含む、１またはそれ以上の配列の変化を含む。本発明の方法を行う際には、標的配列を含む第一のＤＮＡサンプルを、１またはそれ以上の標的遺伝子の野生型を含む第二のＤＮＡサンプル（あるいはＤＮＡサンプルのプール）とハイブリッド形成する。本発明の方法は、ほとんど同一な（しかし完全に同一ではない）ＤＮＡ鎖間でのＤＮＡのハイブリッド（たとえばヘテロ二本鎖）の物理化学的な特徴を利用する。配列変化が存在するとき、ヘテロ二本鎖は、それ以外は完全にマッチしたハイブリッド中に埋め込まれたミスマッチ領域を含む。本発明によれば、ミスマッチ領域は、調節条件下で形成し、そして化学的および／または酵素的に修飾し、ついでミスマッチに隣接するそしてミスマッチを含む配列を決定する。使用するミスマッチ認識方法により、ミスマッチ領域は塩基をいくつでも、好ましくは１塩基からから約１０００塩基を含みうる。本発明の方法は、(疾患の原因となる一つの遺伝子あるいは複数の遺伝子が知られている場合に)個々の患者における特異的な疾患誘起変異、あるいはそれまでは特定されていない多型を特定するために、および新規の遺伝子を特定するためにポジショナルクローニングのために、使用することができる。好ましい態様において、特異的ＤＮＡ配列は、病理学的状態あるいは症候群に関連することが知られている患者のゲノムＤＮＡ中における特定の遺伝子の部分あるいは遺伝子位置を含む。遺伝子症候群の限定的ではない例としては、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血、地中海貧血（サラセミア）、ゴーシェ病、アデノシン・デアミナーゼ欠損症、α１−抗トリプシン欠損症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、家族性高コレステロール血症、脆弱Ｘ症候群(ｆｒａｇｉｌｅＸｓｙｎｄｒｏｍｅ)、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠損症、Ａ型血友病、ハンチントン病、強直性ジストロフィー、１型神経線維腫症、骨形成不全症、フェニルケトン尿症、網膜芽細胞腫、テイ・サックス病、そしてウィルムス腫瘍が含まれる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ＆Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ＧｅｎｅｔｉｃｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，第５版）。もう一つの態様において、特異的なＤＮＡ配列は、特定の遺伝子、あるいは特定の疾患と関連していることが知られていないが、しかし多型については知られているか疑われている遺伝子位置を含む。たとえば、肥満はアポリポタンパク質Ｂ遺伝子の変化と関連している可能性があり、高血圧はナトリウムあるいはその他の輸送システムにおける遺伝子的変化による可能性があり、大動脈動脈瘤は α−ハプトグロビンおよびコレステロールエステル輸送タンパク質の変化が関連する可能性があり、そしてアルコール中毒症はアルコールデヒドロゲナーゼおよびミトコンドリア性アルデヒドデヒドロゲナーゼの変異が関連する可能性がある。さらに薬剤に対する個々の反応は、チトクロームＰ４５０などの薬剤修飾システムにおける変化により影響を受け、特定の感染性疾患に対する感受性も遺伝子的状態により影響を受ける可能性がある。最後に本発明の方法は個体識別試験についてのＨＬＡ解析に応用することができる。さらにもう一つの態様において、特異的ＤＮＡ配列は、体内に侵入した微生物のゲノムなどの外来性遺伝子配列の一部を含む。限定的ではない例として、細菌およびそのファージ、ウィルス、真菌、原虫、およびこれらに類似するものを含む。本方法は、適切な療法的治療を選択するために、微生物の別個の変異体間あるいは別個の系統間で区別することが望ましい場合に、特に応用可能である。１．ヘテロ二本鎖の調製本発明により、標的配列は動物あるいはヒトの患者から分離されたＤＮＡのサンプル中に含まれる。このＤＮＡは、いずれかの細胞供給源あるいは体液から得ることができる。臨床的な実務において利用できる細胞供給源の限定的ではない例として、血球細胞、頬細胞、膣頸部細胞、尿中の上皮細胞、胎児細胞、あるいはバイオプシーにより得られた組織中のいずれかの細胞が挙げられる。体液としては、血液、尿、脳脊髄液、そして感染あるいは炎症部分での組織滲出物が挙げられる。ＤＮＡは、当該技術分野で標準的な多くの方法のいずれかを用いて、細胞供給源あるいは体液から抽出する。ＤＮＡを抽出するために使用する具体的な方法は、その供給源の性質に依存することは理解されるであろう。ヒトゲノムＤＮＡの解析のために抽出したＤＮＡの好ましい量は、少なくとも５ｐｇである (およそ１細胞あたり４ｘ１０⁹塩基対のゲノムサイズに相当)。いくつかの応用において、たとえば微生物のゲノム中にある配列の変化を検出するなど、様々な量のＤＮＡを抽出することができる。いったん抽出した後は、標的配列を含むサンプルＤＮＡは本発明においてはさらに操作することなく使用することができる。好ましくは、サンプルＤＮＡ中に存在する１またはそれ以上の特定の領域を増幅することができる。この場合、増幅した領域は特定の隣接する配列をプライマーとして使用するように選択することにより、特定する。この工程での増幅により、サンプルＤＮＡ集団中の特定の配列濃度が上昇するという利点を提供する。増幅することができるＤＮＡ配列の長さは、８０ｂｐから３０ｋｂｐまでの範囲である(Ｓａｉｋｉｅｔａｌ. ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：４８７)。さらにたとえばビオチニル化により修飾した増幅用プライマーを使用することで増幅したＤＮＡ中に修飾を選択的に導入することができる。一つの態様においては、標的配列を含む第一のＤＮＡは、特定の配列を事前に増幅してもしなくても、固層マトリックスに結合する。このことから、多数の患者のサンプルあるいは第一のＤＮＡサンプルを同時に処理しそしてスクリーニングすることができる。本発明で使用するのに適した限定的ではないマトリックスの例としては、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ、親和性捕捉のための試薬でコートした磁気ビーズ、処置したあるいは処置していないマイクロタイタープレートなどが挙げられる。ＤＮＡをマトリックスに結合する方法は、使用する特定のマトリックスに依存するということを、当業者は理解するであろう。たとえば、ニトロセルロースに対する結合は、ＤＮＡが単に膜に吸着し、その後真空条件下で１５分から２時間、７５−８０℃で膜を焼くことにより行うことができる。別の方法では、結合したＤＮＡに対してさらなる処置を必要としない荷電ナイロン膜を使用することができる。アビジンでコートしたビーズおよびマイクロタイタープレートは、ビオチンが結合したＤＮＡ（たとえばビオチン結合プライマーの使用を介して）を結合するために使用する。さらに抗体で表面をコートすること、そしてＤＮＡ中に抗体特異的ハプテンを導入することにより、固体支持体上いずれのものにもＤＮＡを接着するために抗体を使用することができる。好ましい態様において、ビオチニル化プライマーを使用して増幅したＤＮＡは、ストレプトアビジンでコートしたビーズに結合する(Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ. ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ)。本発明を行う時には、未処理のあるいは増幅した第一のＤＮＡ、好ましくは固層マトリックスに結合したＤＮＡを、ミスマッチのループを形成しやすい条件下で第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成する。第二のＤＮＡサンプルは好ましくは、１あるいはそれ以上の標的配列の“野生型”版を含む。本明細書中で使用されているように、遺伝子の“野生型”版は、疾患には関連しない（あるいは識別できる表現系のいずれかとは関連しない）そして“正常な”個体が保有している、一般的な集団中の一つの優性遺伝子である。一般的な集団内では、野生型遺伝子は複数の優性遺伝子型を有しており、それらは配列中に、それぞれと比較した場合に識別できるほどの病原的効果を何も引き起こさない、配列中の変化を含む；すなわちこれらの変化は“多型”あるいは“アリル変異体”と呼ばれている。もっとも好ましくは、“正常な”個体から得たＤＮＡの混合物は、第二のＤＮＡサンプルとして使用し、その結果もっとも一般的な多型の混合物を提供する。このことから保証されることは、統計的には、第一のＤＮＡサンプルおよび第二のＤＮＡサンプルの間で形成したハイブリッドは好ましくは、個々のミスマッチ領域を形成しうる変異の領域以外は完全にマッチしているであろうということである。いくつかの応用において、多型を検出することが望ましい；それに応じてこの場合、第二のＤＮＡサンプルの適切な供給源を選択するであろう。ミスマッチを検出することに続いて使用する方法によって、野生型ＤＮＡも化学的あるいは酵素的に、たとえばメチル基の削除あるいは付加などの修飾をすることができる。本発明によるハイブリッド形成反応は、約１０ｍＭのＮａＣｌから約６００ｍＭのＮａＣｌの範囲の溶液中で、約３７℃から約６５℃の範囲の温度で行う。ハイブリッド形成反応の厳密性は、塩濃度および温度の両方により決定することを理解するであろう；その結果、１０ｍＭの塩、３７℃の条件下で行ったハイブリッド形成は、５００ｍＭの塩、６５℃で行ったものと同様な厳密性を有しうる。本発明の目的として、完全に相補的な配列間では完全なハイブリッドを形成し、同一分子内の非相補的な配列間ではミスマッチのループを形成するハイブリッド形成の条件のいずれを使用してもよい。好ましくは、ハイブリッド形成は６００ｍＭのＮａＣｌ、６５℃で行う。ハイブリッド形成工程に続いて、第一のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成しないＤＮＡ分子は、たとえば０．１ｘＳＳＣ、６５℃などの厳しい条件下で洗浄することにより除去する。ついでハイブリッド形成反応により形成したハイブリッドは、いずれかの自由末端をブロックするように処理することができ、それによりさらにたとえばＲＮＡリガーゼなどの酵素的に修飾するための基質としてそれらを提供することができる。適切なブロッキングの方法としては、限定するものではないが、５’リン酸基の除去、３’末端のジデオキシヌクレオチドによるホモ重合体の末端付加 (ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒｉｃｔａｉｌｉｎｇ)、そして修飾二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖末端へのライゲーションが挙げられる。２．ミスマッチの認識と切断続く工程において、ハイブリッドを処理し、一方または両方のＤＮＡ鎖をミスマッチ領域中であるいはそれに近接する部分で切断する。ミスマッチの認識および切断のために使用する方法により(以下を参照)、切断はミスマッチ領域の両端のどちらかからいくらかのあらかじめ決められた距離の場所で起こる可能性があり、そして野生型鎖あるいは変異鎖において起こりうる。このように本明細書中で使用しているようにミスマッチの“近傍”とは、ミスマッチの両端から１〜２０００塩基の距離までを範囲とする。本発明で使用するのに適したミスマッチ認識系および切断系の限定的でない例としては、ミスマッチ修復タンパク質、ヌクレオチド除去修復タンパク質、バクテリオファージリゾルベース、化学的修飾、そしてこれらの結合が挙げられる。これらの態様は以下に記述する。一般的に、以下に記述するそれぞれの態様にとって必要なミスマッチ認識タンパク質および／またはミスマッチ修飾タンパク質は、当該技術分野におけるな技術者によく知られた方法を使用して分離する。好ましくは、タンパク質の配列が知られているときには、対応する遺伝子のタンパク質コード配列を、生物のゲノムＤＮＡを適切なプライマーを用いて増幅することにより供給源となる生物から分離する。分離したタンパク質コードＤＮＡ配列は、たとえば組み換えタンパク質のアミノ末端あるいはカルボキシル末端のどちらかにアミノ酸の“精製タグ ”を挿入した様な、商業的に入手可能な発現ベクター中にクローン化する。ついで組換え発現ベクターを適切な宿主細胞中に導入し(たとえばＥ．ｃｏｌｉ)、そしてタンパク質を“タグ”を認識するアフィニティークロマトグラフィーにより細胞融解物から回収する。たとえば、細菌の発現ベクターｐＱｉｅｘ１２をポリヒスチジンのタグを伴うタンパク質を発現するために使用し、それによりＮｉ− セファロース（ＱｉａＧｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）上での一回工程のクロマトグラフィーにより組換え産物を精製することができる。その他の方法としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ配列をタグとして含む組換えタンパク質の発現に関するものがあり、それによりグルタチオン親和性カラム上で組換え産物の精製をすることができる(ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ)。必要であれば、ついで精製用タグを含むタンパク質は処理をすることでタグ配列を取り除く。別の方法としては、たとえばモレキュラーシーブ、イオン交換、および疎水性クロマトグラフィー、そして等電収束（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃｆｏｃｕｓｉｎｇ）を含む、当該技術分野でよく知られる標準的なタンパク質精製技術を用いて分離することができる。本明細書中で使用して得るように“分離”とは、供給源となる細胞に由来する無関係のタンパク質あるいはその他のコンタミナントにより妨害されることなく本発明の状況においてその機能を実行することができる程度にタンパク質を精製することを意味する。本発明を行う際に使用するミスマッチの認識タンパク質およびミスマッチ修飾タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉからヒトまであるいはその混合物などのいずれの種に由来していてもよい。一般的には、既知のタンパク質の機能的類似体は、系統発生をまたいで存在する。本明細書中で使用しているように既知のタンパク質の“機能的類似体”とは、ｉｎｖｉｖｏにおいてあるいは無細胞の反応においてどちらでも第一のタンパク質に対して機能的に交換することができるもう一つのタンパク質のことをいう。ミスマッチ修復タンパク質：ＤＮＡの複製の間に形成するミスマッチを修復するため、多数の異なる酵素系が系統発生をまたいで存在する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける１つの系として、ＭｕｔＹ遺伝子産物が関与するものがあり、それによりＡ／Ｇミスマッチを認識し、そしてＡ含有鎖を切断する(Ｔｓａｉ−Ｗｕｅｔａｌ.，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：１９０２，１９９１)。Ｅ．ｃｏｌｉにおける別の系では、新規合成ＤＮＡ鎖中のエラーを、そのＤＮＡ鎖が不完全なメチル下である一過性の状態に基づいて特異的に認識するために、（通常の複製の流れの中で母親のメチラーゼ（ｍｅｔｈｙｌａｓｅ）が新規合成ＤＮＡに対して働く前に）ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、そしてＭｕｔＨタンパク質の調和的な活性を利用する。一般的には切断は、ミスマッチの１−２Ｋｂ中の半メチル化ＧＡＴＣ部位で起こり、ついでニックからミスマッチまでの３’−５’方向あるいは５’−３’方向のどちらかにおいて鎖をエクソヌクレアーゼ融解性に切断する。ｉｎｖｉｖｏにおいてはこの後、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素およびその他の因子が関与する再合成が起こる(Ｃｒｅａｖｅｒ，Ｃｅｌｌ，７６：１−４，１９９４)。本発明で使用するためのミスマッチ修復タンパク質は、(上述したように)Ｅ．ｃｏｌｉからあるいは適切な機能的特徴を有するミスマッチ修復タンパク質を含むいずれかの生物から由来することができる。有用なタンパク質の限定的でない例としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ由来のタンパク質(ＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ)、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のタンパク質(ＨｅｘＡ、ＨｅｘＢ)、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｖｉｓｉａｅ由来のタンパク質(“全タイプ”、ＭＳＨ２、ＭＬＨ１、ＭＳＨ３) 、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ由来のタンパク質(ＳＷ１４)、マウス由来のタンパク質（ｒｅｐ１、ｒｅｐ３）およびヒト由来のタンパク質（“全タイプ”、ｈＭＳＨ２、ｈＭＬＨ１、ｈＰＭＳ１、ｈＰＭＳ２、ｄｕｃｌ）が含まれる。好ましくは、ヒトおよび酵母由来の“全タイプ”のミスマッチ修復系を使用する(Ｃｈａｎｇｅｔａｌ.，Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ.，１９：４７６１，１９９１；Ｙａｎｇｅｔａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２６６：６４８０，１９９１)。好ましい態様において、上述した様に患者ＤＮＡと野生型ＤＮＡとの間で形成したヘテロ二本鎖を、本質的には国際特許出願第ＷＯ／９３／２０２３３号において記述しているように精製する、ヒト“全タイプ”ミスマッチ修復活性とともにインキュベートする。インキュベーションは、たとえば１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．６、１０ｍＭＺｎＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＥＤＴＡおよび２．９％グリセロール中で、３７℃、１−３時間行う。別の態様において、精製したＭｕｔＳ、ＭｕｔＬおよびＭｕｔＨは、ミスマッチ領域を切断するために使用する(Ｓｕｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：５０５７，１９８６；Ｇｒｕｌｌｅｙｅｔａｌ.，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ.，２６４：１０００，１９８９)。ヌクレオチド除去修復タンパク質：Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣ、およびＵｖｒＤで表される４種のタンパク質がＵＶ光により障害を受けたかあるいはそれ以外の化学的に修飾されたヌクレオチドを修復するために(Ｓａｎｃａｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１９５４，１９９４)、そして同様にミスマッチを修復するために( Ｈｕａｎｇｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１２２１３，１９９４)、相互作用する。ＡＴＰａｓｅであり、ＵｖｒＢとＡ₂Ｂ₁複合体を形成するＵｖｒＡは、障害の部位に結合し、ＤＮＡをほどきそしてよじれさせ、そしてＵｖｒＢが障害部位にしっかりと結合できるように立体構造的な変化を引き起こす。ついでＵｖｒＡは複合体から分離し、ＵｖｒＣが結合することができる。ＵｖｒＢは、障害部位から３’側に５番目のフォスフォジエステル結合の部位をエンドヌクレアーゼ融解性に切断することを触媒する。ついでＵｖｒＣは、障害部位から５’側に８番目のフォスフォジエステル結合の部位を同様に切断することを触媒する。最終的には、ＵｖｒＤ（ヘリカーゼＩＩ）が除去したオリゴマーを放出する。ｉｎｖｉｖｏにおいて、ＤＮＡポリメラーゼＩがＵｖｒＢと置換し、除去ギャップを埋め、そしてバッチ部分をライゲーションする。本発明の一つの態様において、患者のＤＮＡと野生型ＤＮＡとの間で形成したヘテロ二本鎖を、ＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣの混合物をＵｖｒＤの存在下あるいは非存在下で処理する。上述したように、タンパク質は野生型Ｅ．ｃｏｌｉからあるいはタンパク質をコードする組換え遺伝子を含むＥ．ｃｏｌｉあるいはその他の適切な宿主細胞から精製することができ、そして融和性の緩衝液および濃度で処方する。最終産物は、ミスマッチの部位を含む一本鎖のギャップを含むヘテロ二本鎖である。本発明において使用する除去修復タンパク質は、(上述したように)Ｅ．ｃｏｌｉに、あるいは適切な機能的類似体を含むいずれかの生物に由来することができる。有用な類似体の限定的ではない例としては、Ｓ．ｃｅｒｖｉｓｉａｅ由来 (ＲＡＤ１、２、３、４、１０、１４および２５)、およびヒト由来（ＸＰＦ、ＸＰＧ、ＸＰＤ、ＸＰＣ、ＸＰＡ、ＥＲＣＣ１、およびＸＰＢ）の類似体が含まれる(Ｓａｎｃａｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６：１９５４，１９９４)。ヒトの類似体を使用するときには、除去パッチは、障害部位の３’末端から５ヌクレオチド伸長したオリゴヌクレオチド、および障害部位の５’末端から２４ヌクレオチド伸長したオリゴヌクレオチドを含む。Ａｂｏｕｓｓｅｋｈｒａら(Ｃｅｌｌ，８０：８５９，１９９５)は、ヒト細胞由来の精製した構成要素を使用するヌクレオチド除去修復のためのｉｎｖｉｔｒｏ再構築系を開示する。化学的なミスマッチの認識：本発明における患者ＤＮＡと野生型ＤＮＡの間で形成されるヘテロ二本鎖は、四酸化オスミウム（チミジンのミス対合のため）によりあるいはヒドロキシルアミン（シトシンのミス対合のため）により処理することにより、当該技術分野においてよく知られている手順を用いて（たとえば、Ｇｒｏｍｐｅ，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，５：１１１，１９９３：およびＳａｌｅｅｂａｅｔａｌ.，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８８，１９９３を参照）化学的に修飾することができる。一つの態様において、化学的に修飾したＤＮＡを（上述したように）除去修復タンパク質と接触させる。ヒドロキシルアミン修飾塩基あるいは四酸化オスミウム修飾塩基を、修復の必要があるときには障害のある塩基として認識し、ＤＮＡ鎖の一方を選択的に切断し、そして生成物は上記のようにギャップのあるヘテロ二本鎖となる。リゾルベース（ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）：リゾルベースは、(Ｈｏｌｌｉｄａｙ構造、十字形、そしてループを含む)組換えイベントの起こっている間に、曲がり、よじれあるいはＤＮＡのゆがみを介して、分岐ＤＮＡ中間体の分解を触媒する（Ｙｏｕｉｌｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃｉＵＳＡ，９２：８７，１９９５）。たとえば、バクテリオファージＴ４由来のエンドヌクレアーゼＶＩＩ（Ｔ４Ｅ７）は、１から約５０塩基のミスマッチ領域を認識し、そしてミスマッチ領域の３’境界部から６ヌクレオチド以内で二本鎖を分解する。Ｔ４Ｅ７はたとえばＴ４ファージの遺伝子４９を過剰発現した組換えＥ．ｃｏｌｉなどから分離することができる。本発明で使用するための別の適切なリゾルベースは、バクテリオファージＴ７のエンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）であり、Ｔ７Ｅ１はポリヒスチジン精製タグ配列を使用して分離することができる(Ｍａｓｈａｌｅｔａｌ.，ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，９：１７７，１９９５)。好ましい態様において、上述したように患者ＤＮＡと野生型ＤＮＡとの間で形成したヘテロ二本鎖は、１００−３０００ユニットのＴ４Ｅ７を含む反応液５０μｌ中で、３７℃、１時間インキュベートする。３．配列決定本発明を行う際に、患者から得た固定化したＤＮＡを野生型ＤＮＡとハイブリッド形成してミスマッチ領域を形成し、ついでミスマッチ修復タンパク質、除去修復タンパク質、リゾルベース、化学的修飾そして切断試薬あるいはこれらの試薬の組み合わせにより処理してミスマッチ領域の部位と関連するいくつかのあらかじめ決定した位置に、一本鎖あるいは二本鎖の切れ目（ｂｒｅａｋ）を導入する。一つの態様において、一本鎖の切れ目をミスマッチ領域の片側あるいは両側のあらかじめ決定した位置に導入することにより、ミスマッチ領域を含む一本鎖断片の選択的な除去が起こる。結果として得られる構造は、使用したミスマッチ認識系により、ギャップが長さにして約５から約２０００塩基中に存在する可能性がある、ギャップのあるヘテロ二本鎖である。 (ミスマッチを含む)除去される領域のヌクレオチド配列を決定するために、ヘテロ二本鎖をジデオキシヌクレオチドの存在下において適切なＤＮＡポリメラーゼ酵素とインキュベートする。この工程において使用するのに適している酵素としては、これらだけに限定されないが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、そしてＴ７ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。唯一必要なことは、酵素がギャップのあるヘテロ二本鎖を基質として急性ＤＮＡ合成をすることができるということである。サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）の配列決定反応におけるように、ジデオキシヌクレオチドの存在により、成熟前停止生成物の入れ子の組（ｎｅｓｔｅｄｓｅｔｏｆｐｒｅｍａｔｕｒｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓ）を生成することができ、そしてこれらの産物の分解物を、たとえばゲル電気泳動によりギャップ付近のＤＮＡ配列を示すことができる。いくつかの状況において、この方法を使用して得られた配列は、野生型鎖とは一致するが、変異がある患者ＤＮＡにはしないだろう。結果は関連するＤＮＡ領域をあらかじめ増幅するかあるいは増幅せずに、配列決定の第二ラウンドにより容易に調節することができる。この場合において、患者の修飾していないＤＮＡを第一ラウンドにおいて決定した配列に由来する配列決定プライマーと組み合わせて鋳型として使用することにより、変位の配列を決定する。配列決定の別の態様において、ついで野生型ＤＮＡと患者ＤＮＡとの間で形成したハイブリッドを変性により解離し、そして野生型ＤＮＡおよび標的ＤＮＡのいずれかの切断産物は洗浄することにより除去する。ついで残存する固定化した標的ＤＮＡは、“ライゲーションオリゴヌクレオチド”と表され、あらかじめ決定した配列の合成一本鎖オリゴヌクレオチドとライゲーションし、酵素的ＤＮＡ配列決定のためのプライマーとして供する。オリゴヌクレオチドは長さにして約１５から約２５ヌクレオチドでありうる。好ましいライゲーションオリゴヌクレオチドは、配列５’−ＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣ−３’を有する。ライゲーションはたとえばＲＮＡリガーゼを使用して行うことができる(ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ)。一般的なライゲーション反応は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、少なくとも１μｇの固定化標的ＤＮＡ、１０倍過剰モル数のライゲーションオリゴヌクレオチド、および０．１−５．０単位／ｍｌのＴ４ＲＮＡリガーゼを含む、２０μｌ反応液中で、３７℃１５分間かけて行う。ライゲーションの後、ライゲーションしていないオリゴヌクレオチドは、洗浄することにより除去する。ついでライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するＤＮＡの配列を、当該技術分野で既知のいずれかの方法により決定する。一つの態様において、ライゲーションオリゴヌクレオチドに相補的なあらかじめ決定した配列である第二のオリゴヌクレオチドを配列決定プライマーとして使用することにより、酵素的配列決定をジデオキシサンガー技術により行う(Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３，１９７７)。ついでそれぞれの微少配列決定反応は、限定するものではないがゲル電気泳動を含む当該技術分野でよく知られている技術により解読し、そして配列を決定する。別の態様において、ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドを、４種類のヌクレオシド三リン酸のすべての存在下においてＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＤＮＡ合成を開始するために使用する。ついで新規に合成する鎖は、Ｐｅａｓｅら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：５０２２，１９９４）により記述されているようにオリゴヌクレオチド配列に対するハイブリッド形成を使用することにより解析する。本発明による配列変異の特定は、好ましくは、第一ラウンドのミスマッチ認識および切断、オリゴヌクレオチドライゲーション、そしてＤＮＡの配列決定において達成する。ライゲーションしたオリゴヌクレオチドがａ）変化を含む固定化された短縮標的細胞、ｂ）ミスマッチ領域のどちらかの境界部分から１０−５００ｂｐの範囲内で共有結合的に接着することができる。これらの条件のどちらかが満たされない場合、配列の変化を位置づけそして特定するためにさらにもう一ラウンドの配列決定が必要になる可能性がある。１またはそれ以上のさらなる配列決定のラウンドのための配列決定プライマーは、第一ラウンドにおいて得られる配列(同一の鎖あるいは相補的な鎖のどちらか)により読みとりうることを、当該技術分野の通常の技術を有する者は理解するだろう。理論的に結合することが期待される以外は、１または２の配列決定ラウンドは既知の野生型配列および特定の患者のＤＮＡの中に含まれている配列の間での分岐を示しうる(以下を参照)。高スループットの応用本発明の方法は、高スループットのＤＮＡ解析、すなわち多数の患者から採取したＤＮＡサンプルを高速で同時に処理するために特に適している。さらに新規の変異を検出するためのその他の方法と対照的に、本発明の方法は、一回の反応で多数の遺伝子位置を同時に解析するために適しており、これは“複合的”解析と示される。そのため、単一の反応混合物中でいずれかの１サンプルあるいは多数のサンプルのために、本発明では遺伝子内位置（単一遺伝子内でのいくつかの領域）および遺伝子間位置（異なる遺伝子間でのいくつかの領域）の両方を解析することができる。本発明の方法を行う際に関連する操作は、固体支持体としてあるいはたとえばビーズを入れる容器としてマルチウェルマイクロタイターディッシュ（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌｍｉｃｒｏｔｌｔｅｒｄｉｓｈ）を使用することにより、連続的なインキュベーションや洗浄を行うためのロボットを使用することにより、そして最終的には商業的に入手可能な自動ＤＮＡシークエンサーを使用して自動的に配列決定をすることにより、自動化をすることができる。臨床的な観点において、５００人の患者のＤＮＡサンプルをコスト効率的な方法で１−２日で解析することができることを企図している。ポジショナルクローニング本発明の方法は、いずれかの生物における病理学的状態あるいはその他の検出可能な表現型を引き起こす未知遺伝子のポジショナルクローニングにも適している。本明細書で使用している“ポジショナルクローニング”とは、それまでは未知の疾患誘起遺伝子の位置決定し、特定する工程を示している。たとえば、症候の原因となる特定の遺伝子が特定されていない場合でも、いくつかのメンバーが遺伝子的な症候の兆候を示す複合的なファミリーを特定することはしばしば可能である。一般的には、未知遺伝子の探索は、１またはそれ以上の以下の時間集約的および労働力集約的な工程を含む：１）特定の染色体の比較的大きな分節に対して遺伝子を細胞遺伝学的に位置決定すること、２）特定された染色体領域に対応する数十万ヌクレオチドを集合的にカバーする様に、コスミドあるいはＰ１クローンが集合的にオーバーラップすること、３）クローンの配列を決定すること、そして４）発現した遺伝子のタンパク質コード領域を特定するために転写マッピングをすること。本発明は、疾患誘起遺伝子の位置特定のための、代替のそしてコスト効率的な方法を提供する。簡単に言うと、患者から採取したＤＮＡを上記のように正常なＤＮＡとハイブリッド形成させ、変異の部位でミスマッチ領域を形成する。好ましくは、染色体上の位置に対応するＤＮＡの大きな領域を、患者のゲノムＤＮＡから増幅し、その後ハイブリッド形成反応を行う。その後ハイブリッドは上記のいずれかの方法により処理し、それによりミスマッチ領域を認識、切断し、ミスマッチ領域の付近のヘテロ二本鎖にギャップを形成する。最後に、ミスマッチ領域に近接する配列を決定する。この態様において、ミスマッチに近接する十分に短い配列を特定することは、疾患誘起遺伝子を限定的に特定するのに役に立つ。配列決定の第一ラウンドにおいて決定する短い配列は、ゲノムライブラリーあるいはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする際に使用するためのオリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用することができる。一次配列情報を単独であるいはライブラリースクリーニングとともに使用することができるその他の方法には、組織特異的発現の特定、ｍＲＮＡの逆転写増幅、そして患者集団における遺伝子型／表現型の関連についてのスクリーニングが含まれる。このように、理論により限定されることは望まないが、疾患やその他の表現型を引き起こすそれまでは未知の遺伝子を、この方法により素早く、そして効率よく特定することができることを企図している。以下の実施例は、限定することなく本発明を説明することを意図している。実施例実施例１：標的ＤＮＡの調製Ａ）血液からのサンプルＤＮＡの調製高グルコースＡＣＤＶａｃｕｔａｉｎｅｒｓ^TM（黄色のふた）中に採取した全血サンプルを遠心分離し、バッフィーコート（遠心分離したときに赤血球層の上部に層を成す白血球および血小板の層）を回収した。白血球を１４ｍＭのＮＨ₄Ｃｌと１ｍＭのＮａＨＣＯ₃の１０：１（ｖ／ｖ）混合液で２回洗浄することにより融解し、白血球の核を核融解緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．４ＭＮａＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ、５００μｇ／ｍｌプロテナーゼＫ）中に再懸濁し、３７℃で一晩インキュベートした。ついでサンプルを１／４量の飽和ＮａＣｌで抽出し、そしてＤＮＡをエタノール中で沈殿した。ついでＤＮＡを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、そしてＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）中に溶かした。Ｂ）頬の細胞からのサンプルＤＮＡの調製頬の細胞は、滅菌サイトロジーブラシ（ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｒｏｄｕｃｔｓ）または雌型（ｆｅｍａｌｅ）ダクロン綿棒（ＭｅｄｉｃａｌＰａｃｋａｇｉｎｇＣｏｒｐ.）で、ブラシあるいは綿棒で３０秒間頬の内側をこすることにより回収した。ＤＮＡは、室温ですぐにあるいは４℃で貯蔵した後、以下の様に調製した。ブラシあるいは綿棒を、ポリプロピレンのマイクロ遠心管中に入れた５０ｍＭのＮａＯＨ（６００μｌ）中に浸し、ボルテックスをかけた。ブラシあるいは綿棒を入れたままの遠心管を９５℃で５分間加熱し、その後ブラシあるいは綿棒を慎重に取り除いた。ＤＮＡを含む溶液をついで、１ＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．０（６０μｌ）で中性化し、再びボルテックスをかけた(Ｍａｙａｌｌｅｔａｌ.，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．２７：６５８，１９９０)。ＤＮＡは４℃で保存した。Ｃ）ハイブリッド形成の前に行う標的ＤＮＡの増幅ＣＦの患者から採取したＤＮＡをＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製のＣｅｔｕｓ９６００サーマルサイクラー中でＰＣＲにより増幅した。５種のプライマーセットを用いて、嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節（ＣＦＴＲ）遺伝子（Ｒｉｃｈａｒｄｓｅｔａｌ.，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．２：１５９，１９９３）の対応するエクソン４、１０、２０そして２１の領域を同時に増幅した。５０μｌのＰＣＲ反応混合物には、以下の要素：すなわち０．２−１μｇのＣＦ患者ＤＮＡ、１０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ８．３、５０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、２００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオチド３リン酸、０．４μＭのそれぞれの増幅プライマー、そして２．５単位のＴａｑポリメラーゼが含まれた。開始の変性は、９４℃で２０秒間インキュベーションすることにより行い、ついで９４℃で１０秒間、５５℃で１０秒間、７４℃で１０秒間でそれぞれ構成される増幅のサイクルを２８サイクル繰り返し、７４℃、５分間で最後のソーク（ｓｏａｋ）を行った。増幅に続き、８μ ｌのＰＣＲ産物を２％アガロースゲル中で電気泳動し、５つの産物すべてが存在することを証明した。Ｄ）固体マトリックスに対するＤＮＡの結合固体支持体に対する増幅ＤＮＡの結合のために、上述した増幅反応をビオチニル化プライマーの存在下で行う。ついでビオチニル化産物をＤｙｎａｂｅａｄｓ^R Ｍ−２８０ストレプトアビジン（Ｄｙｎａｌ）とともに、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ、２ＭＮａＣｌ、そして０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む溶液中で、４８℃、１５−３０分間インキュベートする。実施例２：標的ＤＮＡと野生型ＤＮＡのハイブリッド形成Ａ）野生型ＤＮＡの調製健康なヒトの血液あるいは頬の細胞から実施例１に記載したようにＤＮＡを調製する。代表的な“野生型”ＤＮＡサンプルを、１０−２００人のヒトから採取したＤＮＡサンプルを一緒にして完全に混ぜることにより調製する。Ｂ）ハイブリッド形成反応ハイブリッド形成は、上記実施例ＩＤに従って調製したビーズ固定化ＤＮＡを含むマイクロタイターディッシュ中で行う。ハイブリッド形成溶液は、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６５０ｍＭＮａＣｌ中に、およそ５００ μｇ／ｍｌの野生型ＤＮＡ（上記実施例２Ａに従って調製）とおよそ５０μｇ／ｍｌの増幅し固定化した標的ＤＮＡ（実施例１に従って調製）を含む。反応混合物を９０℃で３分間加熱し、その後ハイブリッド形成を６５℃で１時間進行させる。ついでハイブリッド形成溶液を除去し、ビーズを６５℃の０．１ｘＳＳＣ中で３回洗浄する。Ｃ）自由末端のブロッキング上述したように調製したＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを含むビーズを処理し、それにより自由末端をブロックしそしてそれ以上たとえばＲＮＡリガーゼなどにより修飾することができないようにする。ウェルを、０．４Ｍカコジル酸カリウム、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．９、４ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＣｏＣＬ₂、２ｍＭｄｄＧＴＰ、５００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、および２単位のターミナルトランスフェラーゼを含む１００μｌの溶液中で、３７℃１５分間インキュベートした。実施例３：ミスマッチの認識、切断および配列決定Ａ）本発明の一態様において、実施例２で記述したように調製したＤＮＡハイブリッドが結合している５０μｌのビーズをそれぞれが含む、４種の別個の反応混合物を、２μｌの１０ｘＴ４ポリメラーゼ緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭジチオスレイトール、そして１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン）；１６μｌの水；１ μｌのＴ４エンドヌクレアーゼ７（２５０−３０００単位、Ｋｏｓａｋら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：７７９，１９９０）中に記載しているように採取）；そして１μｌのＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（３単位）とともにインキュベートする。反応は、３７℃で１−１０分間行う。ついで９μｌの“終止混合物”をそれぞれの反応物に添加する。“終止混合物”には８μＭの１種のｄｄＮＴＰ（たとえば、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰまたはｄｄＣＴＰ）と８０μＭの４種のｄＮＴＰを含み、そのうちの１種を放射活性物質あるいは蛍光で標識する。さらに、１μｌの１０ｘＴ４ポリメラーゼ緩衝液を添加し、そして反応を３７℃で５分間行う。反応混合物を回収し、ビーズを１００μｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭＥＤＴＡ）で３回洗浄する。最後に、ビーズを６μ ｌのローディング緩衝液（９５％フォルムアミド、２０ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ブロムフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）中で再懸濁する。緩衝液をビーズから回収し、そして６％の変性用ポリアクリルアミドＤＮＡ配列決定ゲル中で泳動する。Ｂ）別の方法としては、実施例２で記述したように調製したＤＮＡハイブリッドを含む５０μｌのビーズを５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭＭｇＣｌ₂そして１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液中で５００単位のＴ４エンドヌクレアーゼ７とともに、３７℃で３０分間インキュベートする。Ｔ４エンドヌクレアーゼ７は、Ｋｏｓａｋら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９４：７７９，１９９０）に従って採取する。インキュベーションの後、ビーズを９０℃で３分間加熱し、その後溶液を素早く除去し、あらかじめ暖めておいたＴＥで置換し、そしてビーズをＴＥで３回、室温で洗浄する。この処置によりＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドを効率よく変性し、そして野生型ＤＮＡ鎖を除去する。実施例４：ミスマッチの認識と化学的なミスマッチの切断を使用した切断本発明の一態様において、上記実施例１および２において調製したマイクロタイターウェルを、ヒドロキシルアミンと四酸化オスミウムで連続的に処置する。Ａ）ヒドロキシルアミン処置ヒドロキシルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩより入手）を蒸留水中で溶解し、そしてｐＨをジエチルアミン（Ａｌｄｒｉｃｈ）で６．０に調節し、それにより最終濃度を約２．５Ｍにする。２００μｌの溶液をウェル中で３７℃２時間インキュベートする。ヒドロキシルアミン溶液を０．３Ｍ酢酸ナトリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．２、そして２５μｇ／ｍｌイーストｔＲＮＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む氷冷溶液で置換することにより、反応を停止する。ついでウェルを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、１ｍＭＥＤＴＡの氷冷溶液中で洗浄し、ついで四酸化オスミウムで処置する。Ｂ）四酸化オスミウム処置四酸化オスミウム（Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、１ｍＭＥＤＴＡ、１．５％（ｖ／ｖ）ピリジン中で、４％（ｗ／ｖ）の濃度になるように融解する。ウェルをこの溶液で３７℃、２時間インキュベートする。四酸化オスミウム溶液を０．３Ｍ酢酸ナトリウム、０．１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ５．２、そして２５μｇ／ｍｌイーストｔＲＮＡを含む氷冷溶液で置換することにより、反応を停止する。Ｃ）ピペリジン切断ディッシュを１Ｍピペリジンで９０℃３０分間インキュベートすることにより、ヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムと反応するＣおよびＴ塩基の化学的切断を行うことができる。ついでウェルを蒸留水で何回も洗浄する。実施例５：ミスマッチ領域の配列決定実施例１および２で記載したように調製し、そしてミスマッチに認識・切断を目的とする（上記実施例３Ｂあるいは４あるいはその他の方法により記載した）固定化ＤＮＡを、配列５’−ＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣ−３’を有する一本鎖オリゴヌクレオチドとともに、オリゴヌクレオチドが自由５’末端に効率よくライゲーションすることができるような条件下でインキュベートする。５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、２０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ、そして１００μ ｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含む溶液中で、オリゴヌクレオチドと固定化ＤＮＡとを混合し、その後ＲＮＡリガーゼ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）をその溶液に添加し、最終酵素濃度が０．１− ５．０Ｕ／ｍｌになるようにする。反応は、３７℃で１５分間行う。ライゲーション反応の後、溶液を除去し、ウェルを蒸留水で洗浄する。ついでＳａｎｇｅｒ法を用いて、ＤＮＡの配列決定を行う(Ｓａｎｇｅｒｅｔａｌ.，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４：５４６３，１９７７)。実施例６：疾患誘起遺伝子のポジショナルクローニング以下に記載する実験は、疾患誘起遺伝子に対応するゲノム領域の素早い位置決定と配列決定をするために行う。遺伝子疾患を発現している複合のファミリーを、標準的な臨床的指標を用いて特定する。ＤＮＡサンプルを上記実施例１に記載しているように疾患に罹っている患者そして罹っていないヒトから採取した；遺伝の様式から見て疾患が常染色体性劣性疾患であるように見える場合には、推定上疾患遺伝子のヘテロ結合体になるヒトからＤＮＡサンプルを採取する。一態様において、上記実施例２に記載したように、すべてのＤＮＡサンプルは、野生型ＤＮＡとハイブリッド形成することによりミスマッチの解析に供される。ついでハイブリッドをミスマッチ修復タンパク質で処理し、ギャップのあるヘテロ二本鎖を形成し、そしてギャップ付近の配列を上記実施例３Ａに記載するように決定する。別の態様において、上記実施例２において記載したように野生型ＤＮＡとハイブリッド形成することにより、すべてのＤＮＡサンプルをミスマッチの解析に供する。ついでハイブリッドを上記実施例３Ｂに記載したように、Ｔ４エンドヌクレアーゼ７で処理する。最後に、配列５’−ＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣ−３’を有するオリゴヌクレオチドを切断したハイブリッドにＲＮＡリガーゼを使用してライゲーションし、そして産物を上記実施例５に記載したように酵素的ＤＮＡ配列決定に供する。疾患に罹っていないヒト、罹っているヒトから採取した配列、そして推定上ヘテロ結合体のファミリーのメンバーをそれぞれとそして利用可能な配列データベースを用いて、たとえばＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＧｅｎｅＣｏｄｅｓ，ＡｎｎＡｒｂｏｒ，ＭＩ）やＡｓｓｅｍｂｌｙＬｉｇｎ（Ｋｏｄａｋ，ＮｅｗＨａｖｅｎ，ＣＴ）を使用して比較する。配列は、オリゴヌクレオチドプローブを設計するための基礎としても供し、そのオリゴヌクレオチドプローブを化学的に合成し、そしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーをプローブするために使用する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号０８／４８８，０１２ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／４８８，０１３ (32)優先日 1995年６月７日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．第一のゲノムＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、ａ）前記ＤＮＡサンプルを変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）標的配列中の前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断し、前記変化の部位付近に一本鎖のギャップを形成し、ｃ）ジデオキシヌクレオチドの存在下で、前記切断したヘテロ二本鎖をＤＮＡポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決定し、そしてｄ）前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種(ｃｏｇｎａｔｅ) の野生型配列とを比較し、前記遺伝子変化を特定することを含む前記方法。２．変化が、１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、削除、および置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１、１６、２４または３２に記載の方法。３．前記標的配列を増幅してからハイブリッド形成工程を行う、請求項１、１６、２４または３２に記載の方法。４．第一のＤＮＡサンプルを固体支持体に固定化してからハイブリッド形成工程を行う、請求項１、１６または２４に記載の方法。５．固体支持体が、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ、そしてプラスチックからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。６．前記切断工程が、ミスマッチ認識および切断に適した条件下で、前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡを１またはそれ以上のリゾルベース（ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）タンパク質に暴露することを含む、請求項１、２１、２４または３５に記載の方法。７．リゾルベースが、Ｔ４エンドヌクレアーゼ７およびＴ７エンドヌクレアーゼ１からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。８．前記ＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼそしてＴ４ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される、請求項１または２１に記載の方法。９．前記切断工程が、ミスマッチ認識、切断および除去に適した条件下で、前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡを１またはそれ以上のミスマッチ修復タンパク質に暴露することを含む、請求項１、２１、２４または３５に記載の方法。１０．１またはそれ以上のミスマッチ修復タンパク質が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（大腸菌）のタンパク質であるＭｕｔＳ、ＭｕｔＬ、ＭｕｔＨおよびＭｕｔＵまたはそれらの機能的類似体を含む、請求項９に記載の方法。１１．前記機能的類似体が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｐｏｍｂｅ、マウス、およびヒトからなる群から選択される種に由来する、請求項１０に記載の方法。１２．前記切断工程が、ミスマッチ認識、切断および除去に適した条件下で、前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡをヌクレオチド除去修復タンパク質の混合物に暴露することを含む、請求項１、２１、２４または３５に記載の方法。１３．混合物が、Ｅ.ｃｏｌｉ（大腸菌）のタンパク質であるＵｖｒＡ、ＵｖｒＢ、ＵｖｒＣおよびＵｖｒＤまたはそれらの機能的類似体を含む、請求項１２に記載の方法。１４．機能的類似体が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅおよびヒトからなる群から選択される種に由来する、請求項１３に記載の方法。１５．さらに前記第一のＤＮＡを鋳型として使用して前記ヌクレオチド配列の相補性を決定することを含む、請求項１または２４に記載の方法。１６．第一のゲノムＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、ａ）第一のＤＮＡサンプルを変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、Ｔ４エンドヌクレアーゼ７およびＤＮＡポリメラーゼＩの混合物で処理し、未成熟の結果産物を形成し、ｃ）ミスマッチ領域に近接するヌクレオチド配列を決定するために前記未成熟産物を分解し、そしてｄ）前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変化を特定することを含む前記方法。１７．ＤＮＡ中の１またはそれ以上の変異を複合的に特定する方法であって、ａ）１またはそれ以上の第一のＤＮＡサンプルを固体支持体上に固定し、ｂ）前記固定化サンプルを変異を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、変異の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｃ）前記ミスマッチ領域に隣接する前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖を切断し、前記変異の部位にギャップを形成し、ｄ）前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、酵素的ＤＮＡ配列決定法を用いて前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決定し、そしてｅ）前記ヌクレオチド配列と１またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定することを含む方法。１８．ＤＮＡサンプルを変性してからハイブリッド形成を行う、請求項１、１６、１７、２４、３３または３４に記載の方法。１９．第一のＤＮＡサンプルを増幅してから固定化する、請求項１７、３３または３４に記載の方法。２０．ゲノムＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、ａ）前記ＤＮＡを変性し、ｂ）前記ＤＮＡを再度アニーリングし、変化の部位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成し、ｃ）前記標的配列中の前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断し、前記変化の部位付近に一本鎖のギャップを形成し、ｄ）前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決定し、そしてｅ）前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変化を特定することを含む方法。２１．目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの方法であって、ａ）特定の表現型を示すヒトに由来する第一のＤＮＡサンプルを、前記表現型を示さない１またはそれ以上のヒトに由来する第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、前記第一のＤＮＡ配列が前記第二のＤＮＡ配列と異なっている部位にミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成し、ｂ）前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を切断し、前記ミスマッチ領域の付近に一本鎖のギャップを形成し、ｃ）前記切断したヘテロ二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、ＤＮＡポリメラーゼで処理し、前記ギャップの付近のヌクレオチド配列を決定し、ｄ）前記ヌクレオチド配列のすべてあるいは一部を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、そしてｅ）前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するＤＮＡクローンを特定することを含む前記方法。２２．ミスマッチ領域が、目的とする遺伝子中で１またはそれ以上のヌクレオチドの付加、削除、そして置換およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１またはそれ以上の修飾により引き起こされる、請求項２１または３５に記載の方法。２３．前記ヌクレオチド配列が、酵素的ＤＮＡ配列決定法により決定される、請求項２１または３５に記載の方法。２４．第一のＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、ａ）前記第一のＤＮＡサンプルを変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｂ）前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡを、変化の部位あるいはそれに近接する部位で切断し、新しい末端を形成し、ｃ）あらかじめ配列が決定されている一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端にライゲーションし、ｄ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接する前記ＤＮＡサンプルのヌクレオチド配列を決定し、そしてｅ）前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変化を特定することを含む前記方法。２５．さらに前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡ上の前記自由末端をブロックしてから切断工程を行うことを含む、請求項２４または３５に記載の方法。２６．ブロッキングの工程が、５’リン酸基の除去、ジデオキシヌクレオチドによる３’末端のへのホモポリマーテール付加、そして修飾した二本鎖オリゴヌクレオチドのライゲーションからなる群から選択される方法を含む、請求項２５に記載の方法。２７．前記切断工程が以下の工程：ａ）前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡを、ミスマッチ認識および修飾に適した条件下で、１またはそれ以上の非タンパク質化学的試薬と暴露させ、そしてｂ）修飾部分に近接する部分で前記ヘテロ二本鎖の一方の鎖を切断することを含む、請求項２４または３５に記載の方法。２８．化学的試薬が、ヒドロキシルアミンおよび四酸化オスミウムからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。２９．一本鎖オリゴヌクレオチドが、約１５から約３５の長さのヌクレオチドである、請求項２４または３５に記載の方法。３０．ライゲーション工程をＲＮＡリガーゼを使用して行う、請求項２４または３５に記載の方法。３１．決定工程を、オリゴヌクレオチドのアレーに対するハイブリッド形成を利用して行う、請求項２４または３５に記載の方法。３２．第一のゲノムＤＮＡサンプル中に存在する標的配列中の１またはそれ以上の遺伝子的変化を特定する方法であって、ａ）第一のＤＮＡサンプルを固体支持体上に固定し、ｂ）前記固定化したサンプルを変化を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変化の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｃ）前記自由末端を、ジデオキシヌクレオチドの存在下において、ターミナルトランスフェラーゼで化学的にブロックし、ｄ）前記ミスマッチ領域に隣接した前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡの一方の鎖をバクテリオファージのＴ４エンドヌクレアーゼ７で切断し、新しい末端を形成し、ｅ）配列５’−ＣＡＧＴＡＧＴＡＣＡＡＣＴＧＡＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＡＣＣＧＣ−３’を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端とライゲーションし、ｆ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を、酵素的ＤＮＡ配列決定法を使用して決定し、そしてｇ）前記ヌクレオチド配列とあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、変異を特定することを含む前記方法。３３．ＤＮＡ中の１またはそれ以上の変異を特定する方法であって、ａ）前記ＤＮＡサンプルを固体支持体に固定し、ｂ）前記固定化サンプルを変異を含まない第二のＤＮＡとハイブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変異の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｃ）化学的に前記自由末端をブロックし、ｄ）前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖を、前記ミスマッチ領域の中であるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、ｅ）あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端にライゲーションし、ｆ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を決定し、そしてｇ）前記ヌクレオチド配列と１またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定することを含む前記方法。３４．第一のＤＮＡ中の１またはそれ以上の変異を複合的に特定する方法であって、ａ）１またはそれ以上の第一のＤＮＡサンプルを固体支持体上に固定化し、ｂ）前記固定化したサンプルを変異を含まない第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、自由末端を有し、かつ変異の部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖ＤＮＡを形成し、ｃ）化学的に前記自由末端をブロックし、ｄ）前記ヘテロ二本鎖の一方または両方の鎖を、前記ミスマッチ領域の中であるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、ｅ）あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端にライゲーションし、ｆ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を決定し、そしてｇ）前記ヌクレオチド配列と１またはそれ以上のあらかじめ配列決定した同種の野生型配列とを比較し、前記変異を特定することを含む前記方法。３５．目的とする遺伝子のポジショナルクローニングの方法であって、ａ）特定の表現型を示すヒトに由来する第一のＤＮＡサンプルを、前記表現型を示さない１またはそれ以上のヒトに由来する第二のＤＮＡサンプルとハイブリッド形成し、自由末端を有し、かつ前記第一のＤＮＡサンプルの配列が前記第二のＤＮＡサンプルの配列と異なる部位においてミスマッチ領域を含むヘテロ二本鎖を形成し、ｂ）前記ヘテロ二本鎖ＤＮＡの一方または両方の鎖を、ミスマッチ領域の中であるいは隣接する部分で切断し、新しい末端を形成し、ｃ）あらかじめ配列を決定した一本鎖オリゴヌクレオチドを前記新しい末端にライゲーションし、ｄ）前記ライゲーションしたオリゴヌクレオチドに隣接するヌクレオチド配列を決定し、ｅ）前記ヌクレオチド配列のすべてあるいは一部を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、そしてｆ）前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するＤＮＡクローンを特定することを含む前記方法。３６．特定するための工程が、コロニーハイブリッド形成法、組織特異的発現を特定する方法、ｍＲＮＡの逆転写増幅法、および遺伝子型／表現型の関連について疾患に罹っている集団をスクリーニングすることからなる群から選択される方法を使用して行う、請求項２１または３５に記載の方法。