WO1998056949A1 - Verfahren zur typisierung von allelen - Google Patents

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WO1998056949A1
WO1998056949A1 PCT/EP1998/002066 EP9802066W WO9856949A1 WO 1998056949 A1 WO1998056949 A1 WO 1998056949A1 EP 9802066 W EP9802066 W EP 9802066W WO 9856949 A1 WO9856949 A1 WO 9856949A1
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allele
nucleic acid
subtyping
seq
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Dolores J. Schendel
Susanne Gatz
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Roche Diagnostics Gmbh
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a method for subtyping alleles of polymorphic gene loci with the aid of PCR with sequence-specific polymers (PCR-SSP). Since the alleles of certain loci, such as the HLA loci, differ from one another in several nucleotides, multiple reactions are required to determine individual alleles.
  • PCR-SSP sequence-specific polymers
  • the basis of the invention is the direct detection of a specific allele with particular biological or medical importance due to a combination of PCR reactions. which, with the exception of certain control reactions, must all be positive if the allele to be detected exists.
  • the MHC which is present in all vertebrates and unique in its polymorphism, contains about 100 different genes in humans, which are located within a 3000 kb section on the short arm of chromosome 6. These genes will be divided into three superordinate classes with different loci. The genetically different variants of these loci are defined as alleles. while the proteins encoded by these genes and expressed on the cell surface are called antigens.
  • the term human leukocyte antigens (HLA) describes these molecules in humans.
  • the class I region in the human MHC consists of a multitude of alleles on several loci, of which an antigen-presenting function at least for the HLA-A molecules encoded in this region. -B and -C is secured.
  • the MHC gene complex has an extremely high number of different alleles. To date, over 27 different alleles are known for the HLA-A locus alone. Molecular biological analyzes of the MHC region, in particular, have shown that the HLA alleles are still divided into a number of subtypes that cannot be distinguished serologically. So for a single allele such as the HLA-A2 allele up 22 different subtypes have already been identified today (Bodmer et al., Tissue Antigens 49: 297-231, 1997).
  • the class I antigen structure consists of two non-covalently linked molecules, the polymorphic. ⁇ -chain anchored in the membrane with a molecular weight of about 45 kilodalton (kDa) and the invariant ß2-microglobulin (ß 2 m) encoded on chromosome 15 with about 1 kDa.
  • the tertiary structure of an HLA class I molecule was described by Bjorkman et al. 1987 by crystallographic analysis of the highly purified proteins. Both the ⁇ 3 domain of the ⁇ chain. and also ß 2 m have an immunoglobulin-like basic structure of about 90 amino acids each (Bjorkman et al., Nature 329: 506-512, 1987).
  • These membrane-near regions consist of several antiparallel layers of ß-strands and thus largely correspond in structure to the constant region of the immunoglobulins.
  • the ⁇ 3 domain is followed by the 40 amino acid hydrophobic transmembrane region and a 30 amino acid cytoplasmic anchor.
  • this domain also has the binding site for the co-receptor CD8 (Salter et al., Nature 345: 41-46. 1990).
  • the ⁇ 1 and ⁇ 2 regions interact to form a ⁇ sheet formed from eight strands. which is flanked on the side by two ⁇ helices.
  • Class I molecules are able to bind intracellular foreign antigens and present them to immune-competent cells after transport to the cell surface.
  • This system enables an organism to eliminate those forms of foreign molecules that are only accessible intracellularly.
  • An example of this is the detection of virus proteins that do not appear on the surface of infected cells.
  • the class I proteins provide monitoring of the cell's own structures. Mutations in malignant cells that are associated with a change in the protein sequence can consequently be recognized and eliminated from the organism.
  • CD8-positive cytotoxic T-lymphocytes are primarily responsible for the interaction with class I antigens. While the specific T cell receptor reacts directly with the HLA-bound peptide complex, the co-receptor CDS can simultaneously bind to the ⁇ 3 domain of class I molecules.
  • the interaction between the T cell and the antigen-presenting cell is stabilized by additional accessory molecules. These bonds also transmit costimulatory signals that are necessary for complete activation of the T cells.
  • SSOP sequence-specific oligonucleotides
  • PCR-SSP sequence-specific primers
  • sequencing sequencing the MHC loci of the patient to be examined is unsuitable due to the high experimental and material expenditure.
  • the SSOP is the PCR amplificate. which contains the polymorphic sections of the gene to be examined, blotted and denatured on membranes, so that the amplificate is single-stranded. After blocking and prehybridizing non-specific DNA binding sites, the membranes are loaded with various sequence-specific oligonucleotides and prehybridization and hybridization take place at defined temperatures. Since the membranes with the various oligonucleotides must generally be incubated and washed at different temperatures in order to achieve stringent conditions, this method is practically only suitable for highly polymorphic genes for a larger number of samples to be examined simultaneously (Dyer et al. Dis- Markers 11 (4): 145-160.
  • the DNA template is only amplified if there is no mismatch at the 3 ' end of the primer
  • the method is referred to, inter alia, as ARMS (amplification refractory mutation system) (Newton et al., Nucleic Acids Research 77 No 7: 2503-2516, 1989).
  • SSP sequence-specific primers
  • the starting point of the invention was therefore the task of developing a method in which incorrect allele typing due to a failure of a PCR reaction caused by experimental uncertainties should be avoided as far as possible.
  • the task was to reduce the experimental and material effort involved in typing polymorphic loci with the help of sequence-specific PCR as far as possible.
  • the invention therefore relates to a method for typing polymorphic loci, for example for typing HLA loci, in which individual alleles cannot be clearly identified by only one nucleic acid amplification.
  • the method is characterized in that a specific allele with particular importance is directly detected by a combination of PCR reactions which, if the allele exists, all lead to amplification products in the DNA to be examined, with the exception of control reactions.
  • the particular meaning can be, for example, that the existence of a certain allele and thus the existence of a certain MHC molecule on the cell surface is a prerequisite for certain therapeutic treatments.
  • the particular biological significance can also in individual cases consist in the fact that the existence of the positive allele is a prerequisite for a certain therapeutic treatment or that this allele occurs most frequently in the population from which the DNA originates.
  • One embodiment of the method is the typing of HLA alleles, for example the HLA-A2 subtype, the detection of the A * 0201 allele being of particular biological and medical importance.
  • HLA alleles for example the HLA-A2 subtype
  • detection of the A * 0201 allele being of particular biological and medical importance.
  • a set of 4 nucleic acid amplifications is first carried out, which includes the following reactions:
  • HLA-A allele (1/3) Detection of A * 0209 (1/4) Detection of non-A * 0209 (NN) (presence of an HLA-A2 allele different from A * 0209)
  • the invention furthermore relates to the use of one of the methods described for the pre-therapeutic subtyping of HLA loci.
  • the invention also relates to a kit. consisting of 8-18 primer pairs according to SEQ ID NO. 1-36, a DNA polymerase. Desoyxnucleotide triphosphates and a suitable buffer for nucleic acid amplification.
  • Genomic DNA of the patient to be examined is used as the starting material for the subtyping of alleles.
  • the DNA can be isolated from any solid tissue, blood or other body fluids by any method.
  • RNA can also be used as the starting material, provided that the subsequent method uses primers which hybridize with the mRNA transcribed by the gene locus under investigation.
  • PCR-SSP is carried out according to standard protocols known from the prior art.
  • a typical amplification approach contains a thermoresistant one
  • DNA polymerase deoxynucleotide triphosphates, buffers, oligonucleotide primers and the template DNA to be amplified.
  • the method is particularly suitable for the typing of HLA alleles, for example for alleles of HLA-A2. According to the state of the art, this typing has so far been extremely borrowed because 22 different alleles are currently known, the majority of which cannot be clearly identified by individual PCR-SSP reactions ( Figure 1).
  • the method according to the invention serves to detect the A * 0201 allele.
  • the in SEQ ID NO. 1 -34 and primer disclosed in Figure 2 can be used.
  • primers can also be used for all reactions, which differ from those in SEQ ID NO. Differentiate 1-34 disclosed sequences, but are still suitable for a sequence-specific amplification of the same region.
  • the invention also relates to embodiments in which the primers are used in combinations other than those described in detail below, provided that the allele of interest is directly detected.
  • a set of 4 nucleic acid amplifications is first carried out, which includes the following reactions:
  • HLA-A allele (1/3) Detection of A * 0209 (1/4) Detection of non-A * 0209 (NN) (presence of an HLA-A2 allele different from A * 0209)
  • the patient is A2 / NA2 heterozygous, whereby the A2 allele is not identical to A * 0209. 3) The patient is heterozygous for A2 / NA2. where the A2 allele is identical to A * 0209.
  • the patient is A2 / NA2 heterozygous. where the A2 allele is identical to A * 0219.
  • the patient is A2 homozygous. where an allele is identical to A * 0209.
  • the patient is A2 homozygous. where at least one allele is A * 0209 and the second allele is either A * 0209 or A * 0219.
  • a third set of 4 amplification reactions can be carried out as a control or - if this is of any interest at all - to determine the present subtype.
  • the product of the reaction is again used in a nested PCR as a DNA template (1/1) of the first set of PCR reactions used, which corresponds to amplified A2 DNA.
  • the following reactions are preferably carried out with the in SEQ ID NO. 27-34 listed primers performed:
  • the process is continued with another set of 9 nucleic acid amplifications. All reactions are carried out as nested PCR. The product from reaction (1/1) of the first set of PCR reactions, which corresponds to amplified A2 DNA, is used as the DNA template. The following reactions are preferably carried out with the in SEQ ID NO. 9-16 and 17-26 listed primers performed:
  • reaction (2/1) of the second set of amplifications is positive, then positive reactions (2.'2) - (2/4) are a prerequisite for positive detection of the A * 0201 subtype.
  • a positive course of these reactions is not sufficient, since it is possible in A2 homozygous patients. that 2 rare A2 subtypes exist in combination, which can lead to (- analogous to A * 0201 -) all reactions (2 / l) - (2/4) being positive.
  • a positive course of (2/4) allows the statement that at least one allele exists which is not identical to A * 0204. A * ⁇ 211, or A * 0217.
  • the patient is A2 homozygous, it can A second allele from exactly this group exists (see also Fig. 5), which is why in this case the reactions (4 / l) - (4/5) should be used as indirect controls for the detection of A * 0201.
  • a * 0206. A * 0210. A * 0214. A * 0221 (3/1), A * 0205. A * 0208 (3/2), A * 0202. A * 0203 and A * 0222 (3/3) as well as A * 0212, A * 0213, and A * 0219 (3/4). If one of the reactions (3/1) - (3/4) from the third sentence and one of the reactions (4 / l) - (4/5) from the second sentence were positive, it cannot be assumed that an A * 0201 alleles are assumed.
  • the invention furthermore relates to the use of one of the described methods for the pre-therapeutic subtyping of the HLA loci.
  • This subtyping is special Significance for pre-therapeutic diagnoses before bone marrow transplants and therapeutic vaccinations, in which the vaccine is to be presented as part of the MHC complex in the patient (Tiercy et al .. Human Immunology 41: 207-215, 1994; Rufer et al .. Bone Marrow Transplant / /: 20. 1993; Player et al .. J. Immunother 19: 357-363. 1996; Mukherji et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 92: 8078-8082. 1995; Anonymous. Hum. Gene Ther.
  • the invention also relates to a kit.
  • a kit for example consisting of 8-18 primer pairs according to SEQ ID NO. 1-36.
  • a DNA polymerase Desoyxnucleotide triphosphates and a suitable buffer for nucleic acid amplification.
  • the kit can optionally consist of only the primer pairs or contain additional components for the analysis of the amplification products.
  • Particular embodiments of the kit contain primers for 2-4 sets according to the invention for PCR-SSP.
  • Figure 1 shows the polymorphisms occurring in all A2 alleles in a table.
  • the deviation from the sequence of the A * 0201 subtype is represented by letters in small brackets.
  • the amino acids (aa) are given in the single letter code. Mutations at the amino acid level are shown in capital letters. "-" indicates identity with the A * 0201 sequence.
  • Figure 2 contains a table (Table 2) with the reactions disclosed, the primer sequences used, the corresponding sequence numbers (SEQ ID NO.) And information on the orientation (sense / antisense) and position of the primers within the A2 allele (Arnett and Parham. Tissue Antigens 45: 217-257, 1995; Krausa and Browning, Tissue Antigens 47: 237-244, 1996).
  • the ⁇ 2-microglobulin gene amplification product obtained with the control primers has a length of 331 bp.
  • Figure 3 contains a diagram for the implementation of the method according to the invention for the analysis of the A2 allele. Reaction patterns 2, 5 and 6 require further subtyping.
  • Figure 4 contains a subtyping scheme for an A2 / NA2 heterozygous patient.
  • the subtypes are also shown in brackets, which are also not amplified by the respective PCR reactions, but in this Context are not relevant.
  • Figure 5 contains a subtyping scheme for an A2 homozygous patient.
  • the subtypes are also listed in parentheses, which are also amplified or not amplified by the respective PCR reactions, but are not relevant in this context are.
  • Figure 6 contains a table with the first set of primer combinations (l / l) - (l / 4) and the expected results. Those allele combinations. that lead to amplification products when using the respective primer pairs are marked with a "+”, "stop” denotes the results in which the method is ended.
  • Figure 7 contains a table with primer combinations for subtyping a patient who is heterozygous for A2 / NA2 (whereby allele A * 0209 is not taken into account). Those alleles which lead to amplification products when the respective primer combinations are used are marked with a "+”.
  • Figure 8 contains a table with primer combinations for subtyping a patient who is A2 homozygous (whereby allele A * 0209 is not taken into account). Those alleles which lead to amplification products when the respective primer combinations are used are marked with a "+".
  • the following examples further illustrate the invention:
  • Table 1 contains the respective reactions with the primer concentrations used and indicates. in which reactions formamide is added. False positive amplifications do not take place under these reaction conditions.
  • sequences of the primers used are in SEQ ID NO. 1-36 and tabulated in Figure 2.
  • thermocycles touchdown subambient by MWG. With tube control:
  • thermocycles (Costar H plate from Costar under .. simulated tube control ";" callibration factor 200 "):
  • the PCR products are separated electrophoretically on an ethidium bromide stained 2% agarose gel and made visible under UV light.
  • Example 4 Subtyping of an A2 / NA2 heterozygous patient

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Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Subtypisierung polymorpher Genloci, beispielsweise zur Subtypisierung von HLA-A2. Da die Subtypen dieses Allels sich in mehreren Nukleotiden voneinander unterscheiden, sind zu deren Bestimmung multiple sequenzspezifische PCR-Reaktionen erforderlich. Zur Minimierung experimenteller Fehler sowie des experimentellen und materiellen Aufwands wird die Bestimmung so durchgeführt, daß das eine Allel von besonderer biologischer oder medizinischer Bedeutung, welches zum Beispiel in der jeweils untersuchten Population am häufigsten existieren kann, direkt durch positive PCR-SSP Reaktionen nachgewiesen wird. Zur Unterscheidung von anderen Allelen werden Ausschlußreaktionen durchgeführt, wobei erfolgreiche Amplifikationen die Abwesenheit anderer Allele nachweisen.

Description

Verfahren zur Typisierung von Allelen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Subtypiserung von Allelen polymorpher Genloci mit Hilfe von PCR mit sequenzspezifischen Pπmern (PCR-SSP). Da die Allele bestimmter Loci wie beispielsweise der HLA Loci sich in mehreren Nukleotiden voneinander unterscheiden, sind zur Bestimmung einzelner Allele multiple Reaktionen erforderlich.
Grundlage der Erfindung ist der direkte Nachweis eines bestimmten Allels mit besonderer biologischer oder medizinischer Bedeutung aufgrund einer Kombination von PCR-Reak- tionen. die bei Existenz des nachzuweisenden Allels mit Ausnahme von bestimmten Kon- trollreaktionen alle positiv \ erlaufen müssen.
Der bei allen Vertebraten \ orhandene und in seinem Polymorphismus einzigartige MHC beinhaltet beim Menschen ungefähr 100 verschiedene Gene, die innerhalb eines 3000 kb langen Abschnittes auf dem kurzen Arm des Chromosom 6 liegen. Diese Gene werden m drei übergeordnete Klassen mit \ erschiedenen Loci eingeteilt werden. Man definiert die genetisch verschiedenen Varianten dieser Loci als Allele. während die von diesen Genen kodierten und auf der Zelloberfläche expπmierten Proteine als Antigene bezeichnet werden. Der Terminus Humane Leukozyten Antigene (HLA) beschreibt diese Moleküle beim Menschen. Die Klasse I Region besteht im humanen MHC aus einer Vielzahl von Allelen auf mehreren Loci, von denen eine antigenprasentierende Funktion zumindest für die in dieser Region ko- dierten Moleküle von HLA-A. -B und -C gesichert ist.
Der Genkomplex des MHC besitzt eine außerordentlich hohe Anzahl von verschiedenen Allelen. Bis heute sind alleine für den HLA-A Locus über 27 verschiedene Allele bekannt. So konnte vor allem durch molekularbiologische Analysen der MHC Region nachgewiesen werden, daß sich die HLA Allele teilweise noch in eine Vielzahl von serologisch nicht zu unter- scheidenden Subtypen aufteilen. So sind für em einziges Allel wie das HLA-A2 Allel bis heute bereits 22 verschiedene Subtypen identifiziert worden (Bodmer et al., Tissue Antigens 49: 297-231, 1997).
Die Grundlage dieser Komplexität scheint sowohl in Punktmutationen als auch in sogenannten Genkonversionen begründet zu sein, bei denen kurze Abschnitte zwischen hochhomologen DNS Sequenzen der einzelnen Allele ausgetauscht werden. Der durch die Vielzahl der Allele vorhandene große Polymorphismus dieser Region stellt ein grundsätzliches Problem der Transplantationsimmunologie/ Tumorimmunologie dar. Wenn man die Sequenzen der einzelnen Allele vergleicht, fallen die relativ großen Unterschiede mit Austauschen in bis zu zehn Prozent der Aminosäuren selbst innerhalb einer Spezies auf. Bei Bestimmung der Positionen dieser Unterschiede erkennt man zusätzlich deutliche Präferenzen für bestimmte Stellen anstelle einer zufälligen Verteilung (Colombani. Tissue Antigens 35: 103-1 13. 1990), die für das unterschiedliche Verhalten bei der Bindung von Peptiden verantwortlich sind (Parham. Nature 342: 617-618. 1989: Rammensee et al.. Ann. Rev. Immonol. 11: 213-244, 1993; Rammensee. Eur. J. Immunol. 22: 2453-2456, 1992).
Die Struktur der Klasse I Antigene besteht aus zwei nicht kovalent aneinander gebundenen Molekülen, der polymorphen. in der Membran verankerten α-Kette mit einem Molekulargewicht von etwa 45 kiloDalton (kDa) und dem invarianten, auf Chromosom 15 kodierten ß2- Mikroglobulin (ß2m) mit etwa 1 kDa. Die Tertiärstruktur eines HLA Klasse I Moleküles konnte von Bjorkman et al. 1987 durch kristallographische Analysen der hochgereinigten Proteine aufgeklärt werden. Sowohl die α3 -Domäne der α-Kette. als auch ß2m besitzen eine immunglobulinähnliche Grundstruktur aus etwa je 90 Aminosäuren (Bjorkman et al., Nature 329: 506-512, 1987). Diese membrannahen Regionen bestehen aus mehreren antiparallelen Lagen von ß-Strängen und entsprechen somit in ihrer Struktur weitgehend dem konstanten Bereich der Immunglobuline. An die α3-Domäne schließt sich die 40 Aminosäuren lange hydrophobe Transmembranregion und ein 30 Aminosäuren langer zytoplasmatischer Anker an. Zusätzlich besitzt diese Domäne auch noch die Bindungsstelle für den Co-Rezeptor CD8 (Salter et al., Nature 345: 41-46. 1990). Die αl- und α2-Region interagieren zu einem aus acht Strängen gebildeten ß-Faltblatt. das seitlich von zwei α-Helices flankiert wird. Die Moleküle der Klasse I sind in der Lage, intrazelluläre Fremdantigene zu binden und diese nach Transport an die Zelloberfläche an immunkompetente Zellen zu präsentieren. Dieses System befähigt einen Organismus, auch diejenigen Formen von Fremdmolekülen zu eliminieren, die nur intrazellulär zugänglich sind. Ein Beispiel hierfür ist die Erkennung von Virusproteinen, die nicht auf der Oberfläche von infizierten Zellen erscheinen. Zusätzlich vermit- teln die Proteine der Klasse I eine Überwachung der zelleigenen Strukturen. So können Mutationen von maligne entarteten Zellen, die mit einer Veränderung in der Proteinsequenz einhergehen, folgerichtig erkannt und aus dem Organismus eliminiert werden. Für die Interaktion mit Klasse I Antigenen sind vor allem CD8-positive zytotoxische T-Lymphozyten zuständig. Während der spezifische T-Zellrezeptor direkt mit dem Komplex aus HLA und gebundenem Peptid reagiert, kann der Co-Rezeptor CDS gleichzeitig an die α3-Domäne der Klasse I Moleküle binden. Zusätzlich wird die Interaktion zwischen T-Zelle und Antigenpräsentierender Zelle noch durch weitere akzessorische Moleküle stabilisiert. Diese Bindungen übertragen auch kostimulatorische Signale, die für eine vollständige Aktivierung der T-Zellen nötig sind.
Bereits der durch eine Punktmutation verursachte Austausch einer einzelnen Aminosäure im MHC Molekül kann dazu fuhren, daß das Antigen ein völlig verändertes Peptidbindungsver- halten aufweist oder daß die Interaktion mit T-Zellrezeptoren drastisch verändert wird. Deshalb ist eine Subtypisierung von HLA- Antigenen von besonderer Bedeutung (McMichael et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 9194-9198, 1988; Shieh et al.. Human Immunology 46: 18-26, 1996; Fleischhauer et al.. N. Engl. J. Med. 323: 1818-1822. 1990).
Während in der MHC Klasse II molekularbiologische Typisierungsmethoden serologische Methoden leicht ersetzen können, ist die Anwendung dieser Techniken auf die MHC Klasse I aus mehreren Gründen erschwert. Einerseits sind die polymorphen Nukleotidpositionen auf zwei Exons verteilt, andererseits können Allele verschiedener Loci aufgrund der engen Verwandtschaft der MHC Klasse I Gene untereinander gleiche Nukleotidsubstitutionen aufweisen. Schließlich ist der MHC Klasse I Polymorphismus stärker ausgeprägt als der der MHC Klasse IT (Bidwell, Immunology Today 15(7): 303-307, 1994). Stand der Technik, um diesen hohen Polymorphismus möglichst effizient zu untersuchen. sind Hybridisierungsverfahren mit sequenzspezifischen Oligonukleotiden (SSOP), PCR mit sequenzspezifischen Primern (PCR-SSP) und Sequenzierung. Eine Sequenzierung der MHC Loci des zu untersuchenden Patienten ist aufgrund des hohen experimentellen und materiellen Aufwands ungeeignet.
Bei der SSOP wird das PCR-Amplifikat. das die polymorphen Abschnitte des zu untersuchenden Gens enthält, auf Membranen geblottet und denaturiert, so daß das Amplifikat einzel- strängig vorliegt. Nach Blockierung und Vorhybridisierung unspezifischer DNA-Bindungsstellen werden die Membranen mit verschiedenen sequenzspezifischen Oligonukleotiden beladen und Vorhybridisierung und Hybridisierung erfolgen bei definierten Temperaturen. Da die Membranen mit den verschiedenen Oligonukleotiden zum Erreichen stringenter Bedingungen in der Regel bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert und gewaschen werden, müssen, ist dieses Verfahren bei hochpolymorphen Genen praktisch nur für eine größere Anzahl an gleichzeitig zu untersuchenden Proben geeignet (Dyer et al.. Dis-Markers 11(4): 145-160. 1993; Bozόn et al. Tissue Antigens 4": 512-518, 1996; Bidwell. Immunology Today 15(7): 303-307. 1994). Im Falle der PCR-SSP werden die Primer so ausgewählt, daß in der PCR zwischen Templates unterschieden werden kann, die sich nur durch eine Nukleotidsubstitution unterscheiden
(Ugozzoli and Wallace. Methods 2: 42-48, 1991). Diese Methode nutzt die Tatsache, daß der Taq-Polymerase die 3'-5'Exonukleaseaktivität fehlt (Lawyer et al.. Journal of Biological Chemistry 264: 6427-6436. 1989). also Primer/Template-Mismatche. vor allem, wenn sie am 3'Ende auftreten, nicht durch Proofreading „korrigiert" werden. Somit findet unter entspre- chend stringenten PCR-Bedingungen die Amplifikation des DNA-Templates nur statt, wenn am 3 'Ende des Primers kein Mismatch besteht. Die Methode wird unter anderem als ARMS (amplification refractory mutation system) bezeichnet (Newton et al., Nucleic Acids Research 77 No 7: 2503-2516, 1989). Die Verwendung solcher sequenzspezifischer Primer (SSP) ermöglicht es, auch komplexere Polymorphismen zu untersuchen. Bei der Kombination zweier SSPs findet sowohl am 5 'Ende als auch am 3 'Ende des zu amplifizierenden Gensegments eine Selektion statt, so daß letztendlich eine Amplifikation nur eintritt, wenn genetisches Material im Template enthalten ist, das mit keinem der beiden Primer einen Mismatch aufweist.
Stand der Technik für die Typisierung bzw. Subtypisierung von HLA Loci sind derzeit auf- wendige Verfahren, bei denen eine Vielzahl von PCR-SSP Reaktionen durchgeführt werden müssen, um eine eindeutige Alleltypisierung vornehmen zu können (Bunce et al., Tissue Anti- gens 46: 355-367, 1995: Krausa and Browning, Tissue Antigens 47: 237-244. 1996). Insbesondere wird dies bei der Identifizierung von HLA-A* 0201 Individuen deutlich. Dieser Sub- typ besitzt eine besondere Bedeutung, da es sich bei ihm zumindest in Europa sowie im Kaukasischen Raum um den am häufigsten vorkommenden Typus handelt (Browning and Krausa, Immunology Today / 7(4): 165-170. 1996). Dennoch wird dieses Allel nach dem Stand der Technik nur in einem Ausschlußverfahren, d. h. indirekt nachgewiesen (Krausa et al., Tissue Antigens 45: 223-231. 1995: Player et al.. Journal of Immunoterapy 19(5): 357-363, 1996). Kommt es dabei zu einem experimentell bedingten Ausfall einer PCR Reaktion, oder enthält die untersuchte DNA ein neues, bisher noch nicht bekanntes Allel. so kann dies dazu führen, daß durch diesen indirekten Nachweis fälschlicherweise eine Festlegung auf A*0201 erfolgt. Bestimmte Fragestellungen erfordern einzig und allein die Bestimmung auf Anwesenheit des Allels A*0201. Dies ist beispielsweise der Fall, wenn eine solche Bestimmung als prätherapeutische Diagnostik vor Knochenmarkstransplantationen oder therapeutischen Vakzinierungen durchgeführt wird. Weitergehende Typisierung sind in diesem Zusammenhang irrelevant.
Ausgangspunkt der Erfindung war somit die Aufgabe, ein Verfahren zu entwickeln, bei dem Fehltypisierungen von Allelen aufgrund eines durch experimentelle Unwägbarkeiten verursachten Ausfalls einer PCR Reaktion nach Möglichkeit vermieden werden sollten. Darüber hinaus stellte sich die Aufgabe, den experimentellen und materiellen Aufwand bei der Typi- sierung polymorpher Loci mit Hilfe von sequenzspezifischer PCR soweit wie möglich zu reduzieren.
Diese Aufgabenstellung wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem die zum Nachweis eines bestimmten Allels durchgeführten PCR Reaktionen positiv verlaufen müssen. Dadurch führt der Ausfall einer Amplifikationsreaktion aufgrund eines experimentell bedingten Fehlers nicht zu einer falschen Subtypisierung. da falsch negative Ergebnisse bezüglich der Existenz bestimmter Allele von besonderer Bedeutung durch das Verfahren soweit wie möglich minimiert werden. Bei der Auswahl der Kombination von durchgeführten PCR Reaktionen werden darüber hinaus die Frequenzen berücksichtigt, mit denen bestimmte Allele in derjenigen Po- pulation vorkommen, aus der die zu analysierende DNA stammt. Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Typisierung von polymorphen Loci, beispielsweise zur Typisierung von HLA Loci, bei denen einzelne Allele durch nur eine Nukleinsaureamplifikation nicht eindeutig nachgewiesen werden können. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß ein bestimmtes Allel mit besonderer Bedeutung durch eine Kombination von PCR Reaktionen direkt nachgewiesen wird, die bei Existenz des Allels in der zu untersuchenden DNA mit Ausnahme von KontroUreaktionen alle zu Amplifikations- produkten fuhren.
Die besondere Bedeutung kann beispielsweise darin bestehen, daß die Existenz eines bestimmten Allels und damit die Existenz eines bestimmten MHC-Molekuls an der Zelloberfläche Voraussetzung für bestimmte therapeutische Behandlungen ist. Die besondere biologische Bedeutung kann in Einzelf llen auch darin bestehen, daß die Existenz des positiv nachzuweisenden Allels Voraussetzung tur eine bestimmte therapeutische Behandlung ist oder daß dieses Allel in der Population, aus der die DNA stammt, am häufigsten vorkommt.
Eine Ausfuhrungsform des Verfahrens ist die Typisierung von HLA Allelen, beispielsweise des HLA-A2 Subtyps, wobei insbesondere der Nachweis des A*0201 Allels von besonderer biologischer und medizinischer Bedeutung ist. Vorzugsweise können dazu die in SEQ ID NO. 1-34 sowie in Abbildung 2 offenbarten Pπmer verwendet werden.
In einer besonderen Ausfuhrungstorm des Verfahrens zur Subtypiserung des HLA Allels wird zunächst ein Satz von 4 Nukleinsaureamplifikationen durchgeführt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(1/1) Nachweis von A2 (1/2) Nachweis von Nicht A2 (NA2) (Anwesenheit eines von A2 verschiedenen
HLA-A-Allels) (1/3) Nachweis von A*0209 (1/4) Nachweis von Nicht A*0209 (NN) (Anwesenheit eines von A*0209 verschiedenen HLA-A2 -Allels)
Vorzugsweise werden dazu die in SEQ ID NO. 1-8 offenbarten Primer verwendet. Falls aus dem Ergebnis jedoch hervorgeht, daß mit Ausnahme von A*0209 keine weiteren A2 Subtypen existieren, wird das Verfahren beendet.
Falls aus dem Ergebnis hervorgeht, daß genau ein A2 Subtyp existiert, und dieser nicht identisch mit A*0209 ist. so wird das Verfahren mit einem weiteren Satz von 4 Nukleinsäure- amplifikationen fortgesetzt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(2/1) AL#22/AL#Q
(2/2) AL#22/AL#BF
(2/3) AL#3/SG#N 16A (2/4) AL#14/AL#BG
Vorzugsweise werden dazu die in SEQ ID NO. 9-16 offenbarten Primer verwendet.
Falls aus dem Ergebnis hervorgeht, daß zwei A2 Allele existieren, von denen nach dem ersten Satz an Reaktionen nicht eindeutig abgeleitet werden kann, um welche Subtypen es sich handelt, so wird das Verfahren mit einem weiteren Satz von 9 Nukleiήsäureamplifikationen fortgesetzt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(2/1) AL#22/AL#Q (2/2) AL#22/AL#BF
(2/3) AL#3/SG#N16A
(2/4) AL#14/AL#BG
(4/1) AL#22/AL#AF
(4/2) AL#22/AL#BJ (4/3) AL#55/AL#Q
(4/4) AL#22/SG#16A
(4/5) AL#26/SG#N16A
Vorzugsweise werden dazu die in SEQ ID NO. 9-16 sowie No. 17-26 offenbarten Primer verwendet. In einer weiteren besonderen Ausführungsform des Verfahrens wird ein dritter Satz von 4 Nukleinsäureamplifikationen durchgeführt. Dieser Satz beinhaltet folgende Reaktionen:
(3/1) AL#27/AL#Q
(3/2) AL#27/AL#U (3/3) AL#22/AL#U
(3/4) AL#22/AL#R
Vorzugsweise werden dazu die in SEQ ID NO. 27-34 offenbarten Primer verwendet.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur prätherapeutischen Subtypisierung von HLA Loci.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit. bestehend aus 8-18 Primerpaaren gemäß SEQ ID NO. 1-36, einer DNA-Polymerase. Desoyxnukleotid- Triphosphaten sowie einem geeigneten Puffer für die Nukleinsäureamplifikation.
Als Ausgangsmaterial für die Subtypisierung von Allelen wird genomische DNA des zu untersuchenden Patienten verwendet. Prinzipiell kann die DNA aus beliebigem soliden Gewebe, Blut oder anderen Körperflüssigkeiten nach beliebigen Methoden isoliert werden. Auch RNA kann in Ausnahmefällen als Ausgangsmaterial verwendet werden, sofern bei dem sich anschließenden Verfahren Primer eingesetzt werden, die mit der vom untersuchten Genlocus transkribierten mRNA hybridisieren.
Die Durchföhrung von PCR-SSP erfolgt nach aus dem Stand der Technik bekannten Stan- dardprotokollen. Ein typischer Amplifikationsansatz enthält dabei eine thermoresistente
DNA-Polymerase, Desoxynukleotidtriphosphate, Puffer, Oligonukleotid-Primer sowie die zu amplifizierende Template DNA.
Besonders geeignet ist das Verfahren für die Typiserung von HLA Allelen, beispielsweise für Allele von HLA-A2. Nach dem Stand der Technik ist diese Typisierung bisher außerordent- lieh aufwendig, da derzeit 22 verschiedene Allele bekannt sind, die sich in ihrer Mehrzahl nicht durch einzelne PCR-SSP Reaktionen eindeutig identifizieren lassen (Abbildung 1).
Insbesondere dient das erfindungsgemäße Verfahren dem Nachweis des A*0201 Allels. Vorzugsweise können dazu die in SEQ ID NO. 1 -34 sowie in Abbildung 2 offenbarten Primer verwendet werden. Prinzipiell können für alle Reaktionen jedoch auch Primer verwendet werden, die sich von den in SEQ ID NO. 1 -34 offenbarten Sequenzen unterscheiden, aber dennoch für eine sequenzspezifische Amplifikation der gleichen Region geeignet sind. Gegenstand der Erfindung sind außerdem auch Ausführungsformen, bei denen die Primer in anderen als den im Folgenden im Detail beschriebenen Kombinationen eingesetzt werden, sofern eine direkter Nachweis des interessierenden Allels erfolgt.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens zur Subtypiserung des HLA Allels wird zunächst ein Satz von 4 Nukleinsaureamplifikationen durchgeführt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(1/1) Nachweis von A2
(1/2) Nachweis von Nicht A2 (NA2) (Anwesenheit eines von A2 verschiedenen
HLA-A-Allels) (1/3) Nachweis von A*0209 (1/4) Nachweis von Nicht A*0209 (NN) (Anwesenheit eines von A*0209 verschiedenen HLA-A2-Allels)
Dazu werden vorzugsweise die in SEQ ID NO. 1-8 aufgeführten Primer verwendet. Der Test auf A*0209 wird bereits im ersten Satz des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt, weil sich A*0209 von A*0201 nur durch einen einzigen Basenaustausch in Exon 4 unterscheidet. Daraus folgt, daß Reaktionen ( 1/3) und ( 1/4) in jedem Fall als KontroUreaktionen durchgeführt werden müssen, um beide Allele voneinander unterscheiden zu können. (Darüber hinaus ist für Reaktion (1/4) zu berücksichtigen, daß Subtyp A*0219 nicht amplifiziert wird. Dagegen werden die von A2 verschiedenen Allele A68 und A69 amplifiziert.) Alle vier Reaktionen führen bei geeigneten PCR Bedingungen unter Verwendung partiell gereinigter genomischer DNA reproduzierbar zu eindeutigen Amplifikationsprodukten. Wie schematisch in Abbildung 3 dargestellt, sind dabei 8 unterschiedliche Ergebnisse möglich:
1 ) Der Patient besitzt kein A2-Allel.
2) Der Patient ist A2/NA2 heterozygot, wobei das A2 Allel nicht identisch mit A*0209 ist. 3) Der Patient ist A2/NA2 heterozygot. wobei das A2 Allel identisch mit A*0209 ist.
4) Der Patient ist A2/NA2 heterozygot. wobei das A2 Allel identisch mit A*0219 ist.
5) Der Patient ist A2 homozygot. wobei ein Allel identisch mit A*0209 ist.
6) Der Patient ist A2 homozygot. wobei beide Allele nicht identisch mit A*0209 sind.
7) Der Patient ist A2 homozygot. wobei mindestens ein Allel A*0209 und das zweite Allel entweder A*0209 oder A*0219 ist.
8) Der Patient ist A*0219 homozygot.
Der weitere Ablauf des Verfahrens ist von diesem Ergebnis abhängig:
Falls aus dem Ergebnis hervorgeht, daß mit Ausnahme von A*0209 oder A*0219 keine weiteren A2 Allele existieren, wird das Verfahren beendet (Ergebnisse 1,3,4,7,8), da das Ziel der beschriebenen Ausführungsform in einem positiven Nachweis von A*0201 besteht. Ist diese Möglichkeit jedoch aufgrund der 4 durchgeführten Reaktionen bereits auszuschließen, so erübrigt sich eine weitere Fortführung des Verfahrens.
Nach dem Stand der Technik ist bekannt, daß eine überwiegende Mehrheit an Individuen heterozygot bezüglich des HLA Genkomplexes ist (Klein, Natural History of the Major Histocompatibility Complex. p. 619. Wiley, New York 1986).
Falls Ergebnis 2 eintritt, das heißt, falls genau ein A2 Allel existiert, das nicht mit A*0209 identisch ist (A2/NA2 Heterozygotie). so wird das Verfahren mit einem weiteren Satz von 4 Nukleinsäureamplifikationen fortgesetzt. Sämtliche Reaktionen werden als Nested PCR durchgeführt. Als DNA-Template wird das Produkt aus Reaktion (1/1) des ersten Satzes an PCR Reaktionen verwendet, welches amplifizierter A2 DNA entspricht. Folgende Reaktionen werden vorzugsweise mit den in SEQ ID NO. 9-16 aufgeführten Primern durchgeführt:
(2/1) AL#22/AL#Q
(2/2) AL#22/AL#BF (2/3) AL#3/SG#N16A
(2/4) AL#14/AL#BG
Wie aus Abbildung 4 ersichtlich, werden A*0201, A*0204, A*0207. A*0211, A*0215N, A*0216, A*0217, A*0218 sowie A*0220 durch positiven Verlauf von (2/1) detektiert. Durch positive Reaktionen (2/2)-(2/4) können dagegen sämtliche Allele dieser Gruppe mit Ausnahme von A*0201 ausgeschlossen werden. Daraus folgt, daß in der überwiegenden Mehrzahl der Fälle bereits aufgrund dieser 4 Reaktionen eindeutig festgestellt werden kann, ob das unter den dargestellten Voraussetzungen am häufigsten auftretende Allel A*0201 in der untersuchten DNA repräsentiert ist. so daß für die alleinige Bestimmung von A*0201 in der Regel 4 Amplifikationsreaktionen aus dem ersten Satz und 4 Amplifikationsreaktionen aus dem zweiten Satz hinreichend sind.
Falls eine der beschriebenen Reaktionen nicht zu einem detektierbaren Amplifikationsprodukt führt, liegt ein seltener Subtyp vor. Aufgrund der Tatsache, daß der Subtyp A*0201 jedoch unter den beschriebenen Ausgangsvoraussetzungen am häufigsten auftritt, kann fakultativ zur Überprüfung des Ergebnisses der Satz an Reaktionen (2/1) bis (2/4) wiederholt werden. Dadurch wird die Gefahr eines falsch-negativen Ergebnisses bezüglich A*0201 noch weiter minimiert.
Sollte die jeweilige Reaktion (2/1 ) des zweiten Satzes an Amplifikationen negativ sein, so bedeutet dies, daß kein Allel aus der Gruppe von Allelen bestehend aus A*0201, A*0204, A*0207, A*0215N, A*021 1. A*0216. A*0217, A*0218 und A*0220 vorhanden ist.
Für diesen Fall kann als Kontrolle oder - falls dies überhaupt von Interesse ist - zur Bestim- mung des vorliegenden Subtyps ein dritter Satz von 4 Amplifikationsreaktionen durchgeführt werden. Wiederum wird in einer Nested PCR als DNA-Template das Produkt aus Reaktion (1/1) des ersten Satzes an PCR Reaktionen verwendet, welches amplifizierter A2 DNA entspricht. Folgende Reaktionen werden vorzugsweise mit den in SEQ ID NO. 27-34 aufgeführten Primern durchgeführt:
(3/1) AL#27/AL#Q (3/2) AL#27/AL#U
(3/3) AL#22/AL#U
(3/4) AL#22/AL#R
Aufgrund dieser Reaktionen können sämtliche weiteren A2 Allele positiv nachgewiesen wer- den. Dazu gehören A*0206. A*0210. A*0214, A*0221 (3/1), A*0205, A*0208 (3/2),
A*0202. A*0203, A*0222 (3/3) sowie A*0212, A*0213. und A*0219 (3/4). Da somit sämtliche Allele erfaßt sind, muß eine dieser Reaktionen positiv sein, um ein negatives Resultat bezüglich der Existenz eines A*0201 Allels zu bestätigen.
Falls aus dem Ergebnis des ersten Satzes an Amplifikationen hervorgeht, daß der untersuchte Patient A2 homozygot ist. wobei beide A2 Allele nicht identisch mit A*0209 sind und der Patient auch nicht A*0219 homozygot ist (Homozygotie für A2; Ergebnis 6), so ist ein direkter Nachweis von A*0201 für ein eindeutiges Ergebnis nicht hinreichend. Für diesen vergleichsweise seltenen Fall wird das Verfahren mit einem anderen Satz von 9 Nukleinsäuream- plifikationen fortgesetzt. Sämtliche Reaktionen werden als Nested PCR durchgeführt. Als DNA-Template wird das Produkt aus Reaktion (1/1) des ersten Satzes an PCR Reaktionen verwendet, welches amplifizierter A2 DNA entspricht. Folgende Reaktionen werden vorzugsweise mit den in SEQ ID NO. 9-16 sowie 17-26 aufgeführten Primern durchgeführt:
(2/1) AL#22/AL#Q
(2/2) AL#22/AL#BF
(2/3) AL#3/SG#N16A
(2/4) AL#14/AL#BG
(4/1) AL#22/AL#AF (4/2) AL#22/AL#BJ
(4/3) AL#55/AL#Q (4/4) AL#22/SG#16A
(4/5) AL#26/SG#N 16A
Sollte die jeweilige Reaktion ( 2/1 ) des zweiten Satzes an Amplifikationen negativ sein, so bedeutet dies genau wie bei A2/NA2-heterozygoten Patienten, daß kein Allel aus der Gruppe von Allelen bestehend aus A*0201. A*0204. A*0207, A*0215N, A*0211, A*0216, A*0217, A*0218 und A*0220 vorhanden ist. Dies ist insbesondere im Hinblick auf A*0201 relevant, da die Existenz genau dieses Subtyps in der beschriebenen Ausführungsform nachgewiesen werden soll.
Sollte die Reaktion (2/1 ) des zweiten Satzes an Amplifikationen positiv sein, so sind darüber hinaus positive Reaktionen ( 2.'2)-(2/4) Voraussetzung für einen positiven Nachweis des A*0201 Subtyps. Dennoch ist ein positiver Verlauf dieser Reaktionen nicht hinreichend, da es bei A2 homozygoten Patienten möglich ist. daß 2 seltene A2 Subtypen in Kombination vorliegen, was dazu führen kann, daß (- analog zu A*0201 -) sämtliche Reaktionen (2/l)-(2/4) positiv verlaufen. (Beispielsweise läßt ein positiver Verlauf von (2/4) die Aussage zu. daß mindestens ein Allel existiert, welches nicht identisch mit A*0204. A*Ö211, oder A*0217 ist. Da der Patient jedoch A2 homozygot ist. kann dennoch ein zweites Allel aus genau dieser Gruppe existieren (s. auch Abb. 5). Deshalb sind in diesem Falle die Reaktionen (4/l)-(4/5) zum indirekten Nachweis von A*0201 als KontroUreaktionen heranzuziehen.
Wie aus Abbildung 5 ersichtlich, ist auch bei vier positiv verlaufenen Reaktionen (2/l)-(2/4) die Existenz eines A*0201 Allels trotzdem nicht hinreichend nachgewiesen, so daß die Ergebnisse der KontroUreaktionen (4/1 )-(4/5) näher analysiert werden müssen. Auch dadurch ist jedoch eine eindeutige Aussage nicht in jedem Falle möglich. Dabei sind drei Alternativen zu unterscheiden:
(a) Falls sämtliche 5 Reaktionen (4/1 )-(4/5) negativ sind, also nicht zu Amplifikationspro- dukten führen, besitzt der Patient mindestens ein A*0201 Allel.
(b) Falls zwei der Reaktionen (4/1 )-(4/5) positiv verlaufen, besitzt der Patient zwei von A*0201 verschiedene A2 Allele. (c) Falls genau eine der Reaktionen (4/1 )-(4/5) positiv ist, kann nicht eindeutig bestimmt werden, ob eines der A2 Allele tatsächlich identisch mit A*0201 ist. In diesem Fall ist alternativ zur Existenz eines A*0201 Subtyps nicht auszuschließen, daß zwei Allele existieren, von denen das eine durch eine der Reaktionen (4/l)-(4/5) und das andere durch eine der Reaktionen (3/1 )-(3/4) positiv nachzuweisen ist.
Für den Fall (c) wird eine weitergehende Analyse durchgeführt, die die Durchführung eines dritten Satzes von 4 Amplifikationsreaktionen erforderlich macht. Wiederum wird in einer Nested PCR Reaktion als DNA-Template das Produkt aus Reaktion (1/1) des ersten Satzes an PCR Reaktionen verwendet, welches amplifizierter A2 DNA entspricht. Analog wie bei Heterozygotie des A2 Allels werden folgende KontroUreaktionen vorzugsweise mit den in SEQ ID NO. 27-34 aufgeführten Pπmern durchgeführt:
(3/1) AL#27/AL#Q
(3/2) AL#27/AL#U
(3/3) AL#22/AL#U
(3/4) AL#22/AL#R
Aufgrund dieser Reaktionen können sämtliche weiteren A2 Subtypen positiv nachgewiesen werden. Dazu gehören A*0206. A*0210. A*0214. A*0221 (3/1), A*0205. A*0208 (3/2), A*0202. A*0203 und A*0222 (3/3) sowie A*0212, A*0213, und A*0219 (3/4). Falls also eine der Reaktionen (3/1 )-(3/4) aus dem dritten Satz sowie eine der Reaktionen (4/l)-(4/5) aus dem zweiten Satz positiv verlaufen sind, kann nicht von der Existenz eines A*0201 Allels ausgegangen werden.
Falls aus dem Ergebnis des ersten Satzes an Amplifikationen hervorgeht, daß der Patient A2 homozygot ist. wobei ein Allel identisch mit A*0209 ist (Ergebnis 5), so werden in diesem Ausnahmefall sämtliche Reaktionen (2/l)-(2/4), (3/l)-(3/4) sowie (4/l)-(4/5) durchgeführt werden.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung eines der beschriebenen Verfahren zur prätherapeutischen Subtypisierung der HLA Loci. Diese Subtypisierung ist von besonderer Bedeutung für prätherapeutische Diagnosen vor Knochenmarkstransplantationen und therapeutischen Vakzinierungen, bei denen die Vakzine als Bestandteil des MHC -Komplexes im Patienten präsentiert werden sollen (Tiercy et al.. Human Immunology 41: 207-215, 1994; Rufer et al.. Bone Marrow Transplant / /: 20. 1993; Player et al.. J. Immunother 19: 357-363. 1996; Mukherji et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 92: 8078-8082. 1995; Anonymous. Hum. Gene Ther. 3: 677-690, 1992: Jaeger et al.. Int. J. Cancer 66: 162-169, 1996; Crowley et al., Cancer Res. 50: 492-498. 1990; Zhai et al.. Journal of Immunology. 156: 700-710, 1996. Toshita i et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 236-240, 1996).
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Kit. beispielsweise bestehend aus 8-18 Primerpaaren gemäß SEQ ID NO. 1-36. einer DNA-Polymerase. Desoyxnukleotid- Triphosphaten sowie einem geeigneten Puffer für die Nukleinsaureamplifikation. Wahlweise kann der Kit auch nur aus den Primerpaaren bestehen oder zusätzliche Komponenten zur Analyse der Amplifika- tionsprodukte enthalten. Besondere Ausführungsformen des Kits enthalten Primer für 2-4 erfindungs gemäße Sätze für PCR-SSP.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1 stellt die in sämtlichen A2 Allelen auftretenden Polymorphismen tabellarisch dar. Auf Nukleotidebene werden die Abweichung von der Sequenz des A*0201 Subtyps durch klein in Klammern geschriebene Buchstaben dargestellt. Die Aminosäuren (aa) sind im Einzelbuchstabencode angegeben. Mutationen auf Aminosäureebene sind in Großbuchstaben wiedergegeben. "-" gibt Identität mit der A*0201 -Sequenz an.
Abbildung 2 enthält eine Tabelle (Tabelle 2) mit den offenbarten Reaktionen, den verwendeten Primersequenzen, den entsprechenden Sequenznummern (SEQ ID NO.) sowie Angaben zur Orientierung (sense/ antisense) und Position der Primer innerhalb des A2 Allels (Arnett and Parham. Tissue Antigens 45: 217-257, 1995; Krausa and Browning, Tissue Antigens 47: 237-244, 1996). Das mit den Kontrollprimern erhaltene Amplifikationsprodukt des ß2-Mikro- globulingens hat eine Länge von 331 bp. Abbildung 3 enthält ein Schema für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Analyse des A2 Allels. Reaktionsmuster 2, 5 und 6 erfordern eine weitere Subtypisierung.
Abbildung 4 enthält ein Subtypisierungsschema für einen A2/NA2 heterozygoten Patienten Für die Reaktionen (2/2) und (2/3) sind in Klammern auch die Subtypen aufgeführt, die eben- falls durch die jeweiligen PCR Reaktionen nicht amplifiziert werden, aber in diesem Zusammenhang nicht relevant sind.
Abbildung 5 enthält ein Subtypisierungsschema für einen A2 homozygoten Patienten. Für die Reaktionen (2/2), (2/3) und (4/5) sind in Klammern auch die Subtypen aufgeführt, die eben- falls durch die jeweiligen PCR Reaktionen amplifiziert bzw. nicht amplifiziert werden, aber in diesem Zusammenhang nicht relevant sind.
Abbildung 6 enthält eine Tabelle mit dem ersten Satz an Primerkombinationen (l/l)-(l/4) sowie den zu erwartenden Ergebnissen. Diejenigen Allelkombinationen. die beim Einsatz der jeweiligen Primerpaare zu Amplifikationsprodukten führen, sind mit einem "+" gekennzeichnet, "stop" kennzeichnet die Ergebnisse, bei denen das Verfahren beendet wird.
Abbildung 7 enthält eine Tabelle mit Primerkombinationen zur Subtypisierung eines Patienten, der A2/NA2 heterozygot ist (wobei Allel A*0209 nicht berücksichtigt wird). Diejenigen Allele, die beim Einsatz der jeweiligen Primerkombinationen zu Amplifikationsprodukten führen, sind mit einem "+" gekennzeichnet.
Abbildung 8 enthält eine Tabelle mit Primerkombinationen zur Subtypisierung eines Patienten, der A2 -homozygot ist (wobei Allel A*0209 nicht berücksichtigt wird). Diejenigen Allele, die beim Einsatz der jeweiligen Primerkombinationen zu Amplifikationsprodukten führen, sind mit einem "+" gekennzeichnet. Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:
Beispiel 1 • Isolierung der genomischen DNA
Für eine PCR aus genomischer DNA von peripheren Blutlymphozyten oder kultivierten Zel- len von den zu untersuchenden Patienten ist es ausreichend, wenn die Zellen lysiert und die DNA-bindenden Proteine abgebaut werden.
6-30x10" Zellen werden nach zweimaligem Waschen in PBS in Lösung A resuspendiert (lOOμl je 6x10" Zellen). Anschließend wird ein gleiches Volumen frisch mit Proteinase K ver- setzte Lösung B zugegeben. Der Ansatz wird für lh bei 56°C und dann für 10min bei 95°C inkubiert. Pro 25 μl PCR Ansatz werden 2μl Lysat eingesetzt.
Lösung A Lösung B
. lOmM Tris-HCl pH 8.3 . lOmM Tris-HCl pH 8,3
. 1 OOmM KC1 . 2,5mM MgCl2
. 2.5mM MgCl2 . 1% (v/v) Tween 20
. l% (v/v) Nonidet P40 . 120μg/ml Proteinase K
Beispiel 2: Nukleinsäureamplifikation:
Alle Reaktionsansätze haben ein Volumen von 25 μl. Zur Kontrolle wird als interner Standard eine 331bp langen Fragments aus dem ßi.Mikroglobulin-Gen amplifiziert.
Alle Reaktionsansätze enthalten:
- lOx Reaction Buffer (Pharmacia) mit 500mM KC1, 15mM MgCl2 , und lOOmM Tris-HCl (pH 9,0 bei RT)
- 200μM von jedem dNTP (Pharmacia)
- 0,1 μl Taq-Polymerase (Pharmacia; 5U/μl)
- 0,1 - 0,6μM von jedem sequenzspezifischen Primer - 0,2 - 0,4μM von den Kontrollprimern ( SEQ ID NO. 35. 36)
- fakultativ 3% Formamid
- Bei den Reaktionen (1/1 )-( 1/4) aus genomischer DNA erfolgt die Zugabe von H20 ad 23 μl und die Zugabe von 2μl DNA
- Bei den „nested-Reaktionen"" erfolgt die Zugabe von 2.5 μl 1 : 100 Verdünnung des A2- PCR-Produkts zu 22.5 μl ( H20 ad 22.5 μl).
Tabelle 1 enthält die jeweiligen Reaktionen mit den verwendeten Primerkonzentrationen und zeigt an. bei welchen Reaktionen Formamid zugesetzt wird. Falsch positive Amplifikationen finden unter diesen Reaktionsbedingungen nicht statt.
Tabelle
Figure imgf000020_0001
Die Sequenzen der verwendeten Primer sind in SEQ ID NO. 1-36 sowie in Abbildung 2 tabellarisch dargestellt.
Die PCR für die Basisreaktionen ( 1/1 )-( 1/4) werden mit folgenden Thermozykien durchgeführt (Touchdown subambient von MWG. mit tube control):
lx 95°C 2 min
4x (95°C 1 min. 65°C 1 min. 72°C 1 min) 4x (95°C 1 min, 65°C 1 min. 72°C 1 min 15 sec) 25x (95°C 50 sec. 55°C 40 sec. 72°C 1 min 30 sec) lx 72°C 5 min lx 30°C 1 min 4°C for ever
Die „nested"-PCR-Reaktionen (2/l)-(4/5) werden mit folgenden Thermozykien durchgeführt (Costar H-Platte von Costar unter ..simulated tube-control"; „callibration factor 200"):
lx 95°C 2 min
5x (95°C 35 sec. 65°C 40 sec. 72°C 1 min 15 sec) lOx (95°C 35 sec. 55°C 40 sec. 72°C 1 min 30 sec) lx 72°C 5 min lx 30°C 1 min 4°C for ever
Auf einem Ethidiumbromid gefärbtem 2% Agarose-Gel werden die PCR-Produkte elektro- phoretisch aufgetrennt und unter UV-Licht sichtbar gemacht.
Beispiel 3 : Amplifikation von HL A-A2
Zur Subtypiserung des HLA-Allels wird zunächst ein Satz von 4 Nukleinsäureamplifikationen mit den in SEQ ID NO. 1 -8 offenbarten Primern durchgeführt, der folgende Reaktionen beinhaltet: (1/1) Nachweis von A2
(1/2) Nachweis von Nicht A2 (NA2)
(1/3) Nachweis von A*0209
(1/4) Nachweis von Nicht A*0209 (NN)
Alle theoretisch möglichen Ergebnisse sind in Abbildung 6 tabellarisch zusammengefaßt. Es wird deutlich, daß diese vier Reaktionen ausreichen, um eindeutig zu bestimmen, ob und wenn ja wie viele A2 Allele (homozygot. heterozygot) vorliegen, und ob diese eventuell existierenden Allele identisch mit A*0209 sind.
Beispiel 4: Subtypisierung eines A2/NA2 heterozvgoten Patienten
Falls nach dem ersten Satz an Amplifikationen feststeht, daß in der untersuchten DNA genau ein A2 Allel existiert, das nicht identisch mit A*0209 ist. so wird das Verfahren mit einem weiteren Satz von 4 Nukleinsäureamplifikationen mit den in SEQ ID NO. 9-16 offenbarten Primem fortgesetzt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(2/1) AL#22/AL#Q
(2/2) AL#22/AL#BF
(2/3) AL#3/SG#N 16A (2/4) AL#14/AL#BG
Alle theoretisch möglichen Ergebnisse sind in der linken Hälfte von Abbildung 7 tabellarisch zusammengefaßt. Es wird deutlich, daß diese 4 Reaktionen ausreichen, um eindeutig zu bestimmen, ob der Patient ein Allel A*0201 aufweist. Falls Reaktion (2/1) negativ ist, können fakultativ zur Kontrolle 4 weitere Amplifikationsreaktionen mit den in SEQ ID NO. 27-34 offenbarten Primern durchgeführt werden:
(3/1) AL#27/AL#Q
(3/2) AL#27/AL#U (3/3) AL#22/AL#U
(3/4) AL#22/AL#R Aus der rechten Hälfte der Abbildung 7 ist ersichtlich, daß eine dieser 4 Reaktionen positiv sein muß. falls kein A*0201 Allel existiert. Ist dies nicht der Fall, so hat im Laufe des Verfahrens aufgrund experimenteller Unwägbarkeiten eine sequenzspezifische PCR Reaktion zu einem falsch negativen Ergebnis geführt.
Beispiel 5: Subtypisierung eines A2-homozvgoten Patienten
Falls nach dem ersten Satz an Amplifikationen feststeht, daß zwei weitere A2 Subtypen existieren, die jedoch beide nicht mit A*0209 identisch sind, so ist ein direkter Nachweis von A*0201 nicht möglich. In diesem Fall wird das Verfahren mit einem weiteren Satz von 9 Nukleinsäureamplifikationen unter Verwendung der Primer aus SEQ ID NO. 9-16 sowie 17- 26 fortgesetzt, der folgende Reaktionen beinhaltet:
(2/1 ) AL#22/AL Q
(2/2) AL#22/AL#BF (2/3) AL#3/SG#N 16A
(2/4) AL#14/AL#BG
(4/1) AL#22/AL#AF
(4/2) AL#22/AL#BJ
(4/3) AL#55/AL#O (4/4) AL#22/SG# 16A
(4/5) AL#26/SG#N 16A
Alle theoretisch möglichen Ergebnisse sind in der linken Hälfte von Abbildung 8 tabellarisch zusammengefaßt. Sie zeigt, daß mit diesen 9 Reaktionen Allel A*0201 in der Regel indirekt nachgewiesen bzw. ausgeschlossen werden kann. Eine Ausnahme bildet die Möglichkeit, daß zusätzlich zu (2/l)-(2/4) genau eine der Reaktionen (4/l)-(4/5) zu einem Amplifikationspro- dukt führt. In diesem Falle können dann 4 weitere Amplifikationsreaktionen
(3/1) AL#27/AL#Q (3/2) AL#27/AL#U
(3/3) AL#22/AL#U (3/4) AL#22/AL#R
vorzugsweise mit den in SEQ ID NO. 29-34 durchgeführt werden, deren mögliche Ergebnisse in der rechten Hälfte von Abbildung 8 tabellarisch dargestellt sind. Führt eine dieser 4 Reaktionen zu einem Amplifikationsprodukt. so kann unter diesen Umständen nicht von der Existenz des A*0201 Allels ausgegangen werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Subtypisierung von komplexen polymorphen Loci in einer biologischen, DNA enthaltenen Probe, bei denen einzelne Allele durch multiple Nukleinsäureamplifikationen nachgewiesen werden, dadurch gekennzeichnet, daß ein bestimmtes Allel durch eine Kombination von Nukleinsäureamplifikationen nachgewiesen wird, die bei Existenz des Allels in der zu untersuchenden DNA zu Amplifikationsprodukten führen.
2. Verfahren nach Anspruch 1. dadurch gekennzeichnet, daß mit Ausnahme von KontroUreaktionen sämtliche Nukleinsäureamplifikationen zu Amplifikationsprodukten fuhren.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß dasjenige Allel direkt durch eine Nukleinsäureamplifikation nachgewiesen wird, welches in der Population, aus der die DNA stammt, am häufigsten vorkommt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1. 2 oder 3 zur Typisierung von MHC Klasse I Loci.
5. Verfahren gemäß Anspruch 4 zur Typisierung des HLA-A.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5 zur Subtypisierung von HLA-A2.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6 zum Nachweis des A*0201 Allels.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der in SEQ ID NO. 1 -34 offenbarten Primer verwendet werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, daß zunächst ein Satz von Nukleinsäureamplifikationen durchgeführt wird, der sämtliche Reaktionen aus einer Gruppe bestehend aus A2. Nicht A2, A*0209, und Nicht A*0209 umfaßt.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der in SEQ ID NO. 1-8 offenbarten Primer verwendet werden.
1 1. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein zweiter Satz von Nukleinsäureamplifikationen durchgeführt wird, der sämtliche Reaktionen aus einer Gruppe bestehend aus AL#22/AL#Q, AL#22/AL#BF, AL#3/SG#N16A und AL#14/AL#BG umfaßt.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1 1. dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der in SEQ ID NO. 9-16 offenbarten Primer verwendet werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-10, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein zweiter Satz von Nukleinsäureamplifikationen durchgeführt wird, der sämtliche Reaktionen aus einer Gruppe bestehend aus AL#22/AL#Q, AL#22/AL#BF, AL#3/SG#N16A und AL#14/AL#BG. AL#22/AL#AF. AL#22/AL#BJ, AL#55/AL#Q, AL#22/SG#16A und AL#26/SG#N16A umfaßt.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13. dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der in SEQ ID NO. 9-16 sowie No. 17-26 offenbarten Primer verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1-14, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich ein Satz von Nukleinsäureamplifikationen durchgeführt wird, der sämtliche Reaktionen aus einer Gruppe bestehend aus AL#27/AL#Q, AL#27/AL#U, AL#22/AL#U und
AL#22/AL#R umfaßt.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15. dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei der in SEQ ID NO. 27-34 offenbarten Primer verwendet werden.
17. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-16 zur prätherapeutischen Subtypisierung.
18. Verwendung gemäß Anspruch 17 zur Subtypisierung vor einer Knochenmarkstransplan- tation.
19. Verwendung gemäß Anspruch 17 zur Subtypisierung vor einer therapeutischen oder gentherapeutischen Vakzinierung.
20. Verwendung gemäß Anspruch 17. 18 oder 19 zur Subtypisierung vor einer therapeutischen Zellvakzinierung oder Tumorzellvakzinierung.
21. Verwendung gemäß Anspruch 17. 18 oder 19 zur Subtypisierung vor einer Vakzinierung mit einem MHC-Carrier oder einer Peptidvakzinierung
22. Kit. bestehend aus 8-18 Primerpaaren gemäß SEQ ID NO. 1-36, einer DNA-Polymerase. Desoyxnukleotid-Triphosphaten sowie einem geeigneten Puffer für die Nukleinsäure- amplifikation.
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