PT91292B - Processo para a amplificacao de sequencias de nucleotidos - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
A presente invenção refere—se a um processo pa ra a amplificaçao de sequências de nucleótidos e a estojos pa ra a sua utilização. Este processo e de interesse particular em relaçao a amplificaçao de sequências de que se conhece ape nas uma porção e permite que as sequências longas de nucleoti dos sejam rápida e eficientemente sequenciadas. 0 método evita os processos de clonagem de ADN recombinantes até agora ne cessários para o sequenciamento de sequências de nucleótidos desconhecidas. Ao fazer isso, permite também detectar polimor fistnos entre sequências de nucleótidos de alelos diferentes num sítio genético, assim como a análise simultânea de alelos num sítio particular em diferentes indivíduos.
Os nucleótidos podem existir como nucleótidos individuais ou pares de bases (na presente memória descritiva, também designados como bp) ou em cadeias de nucleótidos, con—
tendo cada cadeia atê 10 bp ou ainda mais.
genoma humano, por exemplo, acredita-se con ter aproximadamente 3 x 1θ7 bp, contendo um único cromossoma 7 6 aproximadamente 10’ — 10 bp.
Desenvolveram—se e existem técnicas para o se quenciamento de sequências de nucleútidos relativamente curtas, desde há muitos anos, e incluem o método de Maxam e Gi1— bert (Maxam A. M., Gilbert W. (1977) ”A new method for sequen cing DNA”, proc. Natl. Acad. Sei. , USA, 74, 560 — 564 e Se— quencing endlabelled DNA with base—specific Chemical cleava— ges, Methods in Enzymology, 65 , 499 - 560 (1980)), no qual
ADN de cadeia única, radiomarcado em uma extremidade, por exem 32 pio, com p, é submetido a diversas protocolos de clivagem química (por exemplo, com sulfato de dimetilo ou hidrazina), que selectivamente fazem cortes num lado de um nucleotido par ti cular.
Os fragmentos obtidos sao separados de acordo com os seus tamanhos por electroforese em geles de acrilamida e identificados por auto—radiografia.
Poéem também determinar—se sequências de nu— cleótidos relativamente curtes pela técnica enzimática de ob— tenção do composto de didesoxi de Sanger e col. (Proc. Natl. Acad. Sei., USA, 74, 5463 - 7 (1977)), de acordo com o qual se utiliza o fragmento de Klenow de ADN polimerase(I) ou ADN polimerase T7 ou Taq ADN polimerase para sintetizar uma cúpia complementar da sequência pretendida de cadeia única na presen ça dos quatro trifosfatos de desoxinucleosidos, um ou mais dos quais ê radiomarcado, por exemplo, com J p e em quatro mistu— ras de incubação separadas contendo uma pequena concentração de cada um dos quatro trifosfatos de didesoxinucleósido.
Uma populaçao de moléculas de ADN radioacti— vas truncadas, tendo cada uma uma extremidade 5’, mas varian2 ____3>
• ·>
do cada uma de comprimento até uma extremidade 3' específica basica e assim obtida em cada reacçao. A seguir a uma incuba—
4W çao apropriada, o ADN de cada mistura pode ser desnaturado, submetido a eiectroforese lado a lado e as bandas radioacti— vas de ADN de cadeia única detectadas por auto-radiografia. A
A ** sequencia do ADN que serve de alvo pode então ser lida directamente a partir de auto—radiografia.
Além disso, a firma Ε. I. du Pont de Nemours & Company (DuPont) colocou recentemente no mercado um instrumento automático para sequenciar cadeias de ADN, que incorpo— Ta uma modificaÇao da técnica de ndidesoxi acima mencionada. Esta modificaÇao compreende a utilização de quatro terminado res de trifosfato de didesoxinucleósido marcados com corantes fluorescentes, emitindo cada terminador de cadeia de didesoxi luz de um comprimento de onda ligeiramente diferente quando ex citado por um laser de árgon. (Science, 23θ * 33& (Ι9θ7))« Todos os quatro terminadors de trifosfato de didesoxinucleósido podem ser usados no mesmo vaso de reacçao visto que os termi— nadores podem distinguir—se pelos seus espectros de emissão.
A mistura de fragmentos de ADN assim obtida pode ser submetida a eiectroforese numa única pista de um gel de poliacrilami
Λ ** da. A sequencia do ADN pretendido pode então ser lida automaticamente visto que a identidade do nucleótido que termina ca da banda do gel e determinada pela sua emissão de fluorescência característica.
Calculou—se que o sequenciador de ADN da firma DuPont é capaz de identificar cerca de 10.000 nucleótidos por dia em condiçoes óptimas, em contraste com uma media de 50.000 nucleútidos por ano que se calcula possa fazer um tra— balhador experimentado, usando a técnica manual nao modificada de •'didesoxi ·'.
Enquanto esta têcnina consiste num aperfeiçoa mento substancial da velocidade e de eficiência na determina** Λ çao de sequências de nucleótidos relativamente curtas, a fase
que determina a velocidade na determinação de sequências rela tivamente longas, por exemplo, sequências genómicas, depende
M ** da operaÇao coloquialmente conhecida como deslocação dos cro mo ssoma s
A deslocação dos cromossomas^ e uma técnica que compreende o isolamento sequencial de clones que possuem fragmentos que se sobrepoem para cobrir um segmento, por exem pio, de um cromossoma que é maior do que pode ser transportado num vector de um fago ou de um cosmxdio ou de um cromossoma artificial de levedura (YÂC), Esta técnica permite assim realizar o isolamento de um sítio de interesse para o qual nao se dispõe de amostra e e de utilização particular quando se sabe que o sítio de interesse está ligado a um sítio que foi identificado e clonado como um gene ou marcador de ADN. 0 sítio que foi identificado pode então ser empregado como amostra para seleccionar uma biblioteca genómica e hibridizará com qualquer fragmento que contenha sequências de nucleotidos com plementares e que, portanto, representa clones de sobreposi— çao. Essas sequências que se sobrepoem podem ser ou no sentido de 5' °u 3'. Um fragmento identificado como representan do um clone que se sobrepoe pode então ele próprio ser utilizado como amostra para re—seleccionar a biblioteca genómica e hibridizar—se com quaisquer fragmentos que contêm sequências complementares de nucleótidos que assim representam outros cio ***** Λ nes que se sobrepoem. Por repetição deste processo, as sequen cias de nucleótidos de regiões cada vez mais afastadas do sítio originalmente identificado podem ser determinadas até ser encontrado eventualmente o sítio de interesse.
A técnica de deslocação de cromossomas envolve um certo número de dificuldades potenciais como ê exemplificado pelo tempo que demora desde a descoberta de um mar— cador para uma desordem genetica ate a descoberta da lesão ge nética específica responsável pela desordem. Assim, por exemplo, um marcador genético ligado para a coreia de Hunting— ton (D4S1) foi descoberto em 1983, mas ainda hoje a lesão ge—
nética específica responsável por esta perturbação nao ê conhecida. Comentários semelhantes aplicam—se a muitas outras desordens genéticas.
. **
A técnica de deslocação de cromossomas sofre particularmente do inconveniente de que a clonagem de ADN genúmica ê um pré—requisito. Em um certo número de circunstãn cias, a clonagem pode revelar—se impossível ou pelo menos mui to difícil e, nessas condiçoes, a deslocação de cromossomas vem até uma extremidade prematura) A. R. Wyman e K. F. Wertman em Methods in Enzymology, Vol. 152, Guide to molecular cloning techniques, S. L. Berger e A. R. Kummel. Ed. , Academic Press, San diego, 19Ô7> páginas 173 - 1Ô0.
Além disso, a análise dos fragmentos identifi ** V cados como representando clones que se sobrepoem e complexa em virtude de, inter alia, o número desses fragmentos que podem ser localizados em qualquer selecção da biblioteca genomi ca e do facto de as sequências de sobreposição poderem ser no sentido 3’ ou no sentido 5’·
Outro problema serio com a deslocação dos cro t λ “ mossomas reside na larga ocorrência de sequências repetitivas dentro dos genomas humanos e outros. Assim, se o sítio identificado contêm esses elementos repetitivos, todos eles dentro do genotna humano podem ser identificados incorrectamen te como clones que se sobrepoem. A analise torna—se então ex— tremamente complexa.Alem disso, quaisquer clones que se sobrepoem, obtidos por deslocação de cromossomas originarão, quando se quenciados como se descreveu anteriormente na presente memó— ria descritiva, informações de sequencia derivadas de um único alelo clonado do sítio identificado. No contexto do estudo das diferenças genéticas importantes entre membros individuais <fe uma espécie e a sua relaçao com um fenótipo de um indivíduo seria vantajoso se mais do que um simples alelo pudesse ser
analisado e caracterizado simultaneamente.
A presente invenção baseia—se na descoberta de um método que evita, pelo menos em parte, as dificuldades aci ma mencionadas, amplificando fragmentos obtidos por meio da clivagem do ADN pretendido em sítios específicos fora das sequências conhecidas, evitando dessa forma a necessidade de cio nagem.
Assim, de acordo com uma propriedade caractenstica da presente invenção, proporciona—se um método para amplificaÇao de um fragmento de acido nucleico, que compreende uma sequência desconhecida, por extensão da primária, mêto do esse que compreende clivar—se um ácido nucleico alvo para se obterem fragmentos do ácido nucleico alvo, contendo um dos referidos fragmentos uma região de iiiiciaçao de primagem da sequencia de nucleótidos conhecidos para hibridizaÇao com um # ** primário da iniciaçao, preparar—se unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete a partir dos fragmentos de ácido nucleico alvo por ligaçao de cada unidade que tem uma região de promagem do vectorete de sequência conhecida para hi— bridizaçao com um primário vectorete e tratarem—se as unidades de fragmento de;ácido nucleico alvo/vectorete, conjuntamente ou sequencialmente, com trifosfatos de nucleósidos apro priados e um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleosido sob condiçoes de hibridizaÇao, de tal maneira que ** se sintetiza um produto da extensão de um primário de inicia— çao complementar de uma unidade de acido nucleico alvo de cadeia único/vectorete, tendo uma região de primagem de iniciaçao com a qual se hibridiza um primário de iniciaçao, escolhi do de modo a ser substancialmente complementar da região de primagem de iniciaçao, enquanto nao se sintetiza nenhum des— ses produtos de extensão complementares das unidades de fragmento de ácido nucleico alvo de cadeia única/vectorete que ** *· M nao tem essa região de primagem de iniciaçao.
Caso se pretenda, o mencionado produto de extensão pode ser submetido a amplificaÇao na presença de um
primário vectorete que é escolhido de modo a ser substancial— mente complementar da região de primagem do vectorete.
As unidades de fragmento de ácido nucleico al vo/vectorete sao assim tratadas com promario de iniciaçao e, se o produto de extensão do primário de iniciaçao tiver de ser amplificado, por exemplo, como ê descrito por R. K. Saiki e col. , Science 239 , 487 — 491 (Ι9θ7), Sao tratadas adicionalmente com primário vectorete.
** *
Quando nao se utiliza primário vectorete, pode conseguir—se amplificaçao aritmética ou linear (daqui por diante, na presente memória descritiva, designado como ”ampli ficaçao linear”) por hibridizaçao do promario de iniciaçao com a região de primagem de iniciaçao seguida por extensão do pri mário na presença de trifosfatos de nucleósidos apropriados e de um agente para a polimerizaçao de trifosfatos de nucleosi— aa a* a« dos, em condiçoes de hibridizaçao e desnaturaçao. Este proces so de primagem, extensão do primário e desnaturaçao pode repetir—se tantas vezes quantas sejam as apropriadas para se con seguir o mvel pretendido de amplificaçao. Preferivelmente , no entanto, a amplificaçao efectua—se na presença de primá— < aa aa rios tanto de iniciaçao como de vectoretes para a utilização da técnica de PCR acima referida e como se define posteriormente na presente memória descritiva.
De acordo com uma outra propriedade caracte— < ** nstica da presente invenção, proporciona—se um estojo para amplificaçao de um fragmento de acido nucleico de sequencia desconhecida por extensão do primário, estojo esse que compreende :
1) meios para clivar um ácido nucleico alvo num sítio especí fico para se obter um fragmento de ácido nucleico alvoj
2) um vectorete adaptado para ligaçao a um fragmento de acido nucleico alvo, obtido por utilizaÇao de meios para cli var um ácido nucleico alvo definido em l), de maneira a
formar, quando em utilização, uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, tendo o citado vectorete uma região de primagem do vectorete de sequência conheci— da para a hibridizaçao com um primário de vectoretej
3) cada um de quatro trifosfatos de nucleósidos diferentesj e
4) um agente para polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósidos em 3)·
Uma região de primagem do vectorete pode en— contrar—se presente ou ausente da porção de vectorete de uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, como se define mais adiante, na presente memória descritiva. Assim, o vectorete (2) no estojo de acordo com a presente invenção
M «W pode ele proprio nao conter uma região de primagem do vectore te desde que, em utilizaÇao, se forme uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete em que a sua porção de ve ctorete contenha uma região de primagem do vectorete.
Assim, essas unidades podem, por exemplo, ter uma região de primagem do vectorete na porção de vectorete da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete como for mada por ligaçao ou‘ter uma região de primagem do vectorete que so se obtém como resultado da extensão do primário de um f ~ primário de iniciaçao como se descreve mais adiante na presen te memória descritiva. As referências ao longo desta memória descritiva a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete (também designado unidade de vectorete”) como se de fine mais adiante devem ser assim compreendidas.
Preferivelmente, o estojo compreende adicionalmente um primário de vectorete que tem uma sequência de nu cleótidos substancialmente complementar da região de primagem de vectorete na unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/ vectorete. A presença desse primário de vectorete no estojo de acordo com a presente invenção permite a amplificaÇao da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete a ser efectuada por técnicas de PCR (como se definem mais adiante,
na presente memória descritiva), caso isso se pretenda.
estojo pode também conter uma série de primários de vectorete aninhados” (como se define mais adiante, na presente memória descritiva), que podem ser utilizados,por exemplo para reacções de amplificaÇao secundarias quando isso seja necessário ou pretendido e/ou para o sequenciamento dire cto dos produtos de amplificaÇao, como foi descrito em Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85, 7652 - 7656 (1988) por U. B. Gyllen stein e H. Ehrlich. Aprecia—se que todos esses primários de vectorete possam ser úteis como primários de sequenciamento directo para as extremidades distantes de fragmentos obtidos por amplificaÇao linear usando apenas um primário de inicia— çao.
Como o ácido nucleico alvo a ser investigado será normaimente peculiar para o utilizador do estojo, o pri— f * ****** mario ou os primários de iniciaÇao nao estarao normaimente pre sentes no estojo mas podem ser preparados pelo utilizador des te.
o estojo de acordo com conter um primário ou caso se pretenda, um primários de inicia—
Caso assim se pretenda, a presente invenção jpode adicionalmente vários primários de iniciaÇao e também, primário de iniciaÇao aninhado ou vários Çao aninhados.
estojo de acordo com a presente invenção po de também vantajosamente conter tampões para a realizaçao do método de acordo com a presente invenção, sendo uma caracte— rística específica particular do estojo de acordo com a pre— sente invenção, por exemplo a presença de tampões para variar as concentrações de trifosfato ou trifosfatos de potássio, ma gnésio e nucleósido da mistura reaccional. Estes últimos tam— poes podem ser desejáveis para determinar as condiçoes óptimas para os ciclos subsequentes do método de acordo com a pre sente invenção.
Vantajosamente, o estojo compreende mais do que um meio (uma pluralidade de meios) para clivar um ácido nucleico alvo, cada um em sítios específicos. Quando se encon tra presente uma pluralidade desses meios, o estojo compreenderá normalmente um vectorete diferente para cada um desses meios presentes, a fim de permitir a formaçao de unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete em relaçao a cada conjunto de fragmentos de ácido nucleico alvo que podem ser obti do s.
Muito embora a invenção nao se limite a esta 'aplicaçao, a pluralidade de vectoretes diferentes compartilha vantajosamente as sequências complementares de um primário ve ctorete. Nesses casos, um único primário vectorete proporciona a amplificaçao a partir de uma pluralidade de sítios de cli vagem do ácido nucleico alvo.
I Assim, numa forma de realizaçao preferida, o
I ** fi !estojo de acorco com a presente invenção contem adicionalmen— |te um ou mais componentes escolhidos de entre os seguintes} ίprimário ou primários de iniciaçao, primário ou primários de [vectorete aninhado(s), primário ou primários de iniciaçao ani
1,1 — ínhados, primários de sequenciamento, tampões para a realiza—
I ~ — — j çao do método de acordo com a presente invenção e tampões pa— ** f» ra variar as concentrações de trifosfato de magnésio, potássio e nucleésidos.
De acordo com uma outra característica da pre sente invenção, proporciona—se um estojo com uma biblioteca de vectoretes para a amplificaçao de um fragmento de acido nu cleico de sequencia desconhecida por extensão com um primário, estojo esse que compreende:
l) pelo menos uma biblioteca de vectoretes, compreendendo ca da biblioteca um conjunto de unidades de fragmento de áci do nucleico alvo/vectorete obtidas a partir de sequências de nucleótidos de um membro individual de uma espécie ani mal, planta ou microorganismo} e
2)
com a região de primagem de iniciação das unidades de fra gmento de ácido nucleico alvo/vectorete.
estojo da biblioteca de vectoretes compreen de preferivelmente uma pluralidade de bibliotecas de vectoretes.
As unidades de fragmento de ácido nucleico al co/vectorete podem ser preparados, por exemplo, directamente a partir da espécie pretendida, ou indirectamente a partirdes sa espécie, depois da clonagem inicial em vectores de plasmí— deos, fagos, cosmídios ou cromossomas artificiais de levedura (YAC).
A espécie de animal, planta ou mi croorgani stno empregado é preferivelmente a espécie humana, mas pode ser qualquer outra espécie de animal, planta ou microorganismo, como por exemplo bactérias, vírus, leveduras ou parasitas.
As sequências de nucleotidos sao preferivelmente de ADN genómico, mas podem ser de cromossomas ou clones escolhi do s.
As unidades de vectoretes empregadas podem ser unidades derivadas de um método de clivagem único e/ou unidades de vectorete múltiplo derivadas de métodos de clivagem múltipla, que, em conjunto ou separadamente, podem constituir uma biblioteca de vectoretes ou uma pluralidade de bibliotecas de vectoretes (como se define mais adiante, na presente memória descritiva).
Os fragmentos de ácido nàcleico alvo empregados podem derivar de um número de fontes diferentes. Assim, por exemplo, os fragmentos de ácido nucleico alvo podem ser obtidos de indivíduos particulares de uma espécie de animal, planta ou microorganismo, por exemplo, de indivíduos típicos da sua espécie.
Os fragmentos de ácido nucleico alvo podem tara bém ser obtidos a partir de indivíduos particulares conhecidos como heterozigóticos para determinado sítio genético, por exem pio um sítio que provoca fibrose cística ou outra doença here ditaria.
Os fragmentos de ácido nucleico alvo podem tam bém ser obtidos a partir de indivíduos particulares conhecidos como sendo homozigôticos para um dado sítio genético, por exemplo fibrose cística ou outra doença hereditária.
Os fragmentos de ácido nucleico alvo podem também ser obtidos a partir de indivíduos particulares que se sabe serem homozigóticos normais para determinado sítio genético, por exemplo fibrose cística ou outra doença hereditária.
Os fragmentos de ácido nucleico alvo podem também ser obtidos a partir de grupos de indivíduos (em oposi çao a indivíduos particulares) com um ou vários fenótipos com parti lhados.
ácido nucleico ou o tecido de cada membro de um grupo que compartilha um fenotipo pode, caso se pretenda, ser reunido numa piscina. Cada grupo de indivíduos consiste em pelo menos dois e, vantajosamente, menos de mil, por exemplo 5θ — 500. As unidades de vectoretes podem preparar—se a partir de fragmentos do ácido nucleico alvo e as unidades de vectorete reunidas ou usadas separadamente para formar as bibliotecas de vectoretes. 0 fenótipo compartilhado pode, caso assim se pretenda, ser uma doença ou a predisposição para uma doença, transporte obrigatório de uma doença herdada ou um es tado normal sem evidencia da doença ou da predisposição para a doença.
À comparaçao de sequências de nucleótidos obti dos usando o método de acordo com a presente invenção, identi fica quaisquer variantes genéticas comuns na populaçao que sao associadas” com, por exemplo, uma dada doença ou com a pre—
í disposição para a doença. Aprecia-se que isto prolonga consideravelmente o âmbito da análise pormenorizada em relaÇao e acima da tecnologia tentada previamente usando RFLP.
estojo com a biblioteca de vectoretes de acor do com a presente invenção preferivelmente contem adicionalmente primário ou primários de vectoretes e vantajosamente um ou mais primários escolhidos de primários de iniciaçao aninha dos, primário ou primários de vectoretes aninhados e primários de sequenciamento. 0 estojo com a biblioteca de vectoretes po de também conter convenientemente cada um de quatro diferentes trifosfatos de nucleósidos e um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleosidos. Caso assim se pretenda, o estojo com a biblioteca de vectoretes pode ainda conter tampões para realizar a presente invenção e/ou tampões que permi tam variar as concentrações do trifosfato de magnésio, potássio e nucleósido. Estes últimos tampões podem ser desejáveis para determinar as condiçoes óptimas para os ciclos subsequen tes do método de acordo com a presente invenção.
A presente invenção *é de larga aplicabilidade. Assim, por exemplo, a presente invenção pode ser empregada para identificar sequências de nucleótidos características de um microorganismo particular, tal como um microorganismo responsável por doenças em plantas ou animais, partieularmente em seres humanos, sendo esses microorganismos4 por exemplo, um fungo, uma levedura, uma bactéria ou um vírus, assim como um parasita (tal como plasmódio (malária) ou tripanossoma (do ença do sono)).
método de acordo com a presente invenção po de também empregar—se para identificar sequências de nucleóti dos responsáveis por resistência a fármacos, por exemplo anti bióticos, num dado organismo. Assim, a presente invenção permite a produção de amostras para os diagnósticos de doenças em animais ou plantas e, adicionalmente, permite a produção de amostras para diagnóstico de resistência a fármacos, por exem (i pio» antibióticos.
 presente invenção pode também empregar—se, por exemplo:
l) para detectar variações de sequências de nucleótidos, por exemplo, mutações pontuais responsáveis por perturbações genéticas em plantas, mas especialmente em animais e, par ticularmente em seres humanos;
I ί 2) para detectar variações das sequências de nucleótidos, por exemplo, supressões responsáveis por doenças neoplásticas em animais, particularmente em seres humanos)
3) para detectar variações das sequências de nucleótidos res ponsáveis pela predisposição para uma doença ou perturbações em plantas, mas especialmente em animais, particular mente em seres humanos} e
4) para detectar variações da sequência de nucleótidos responsáveis por uma característica específica, tal como uma característica desejável, por exemplo, em plantas tais co mo a cor das flores, rendimento da cultura ou resistência a herbicidas. ‘
A presente invenção pode também em estudos com animais, por exemplo na detecção transgêni cos.
ser empregada de animais
Além disso, a presente invenção ê de particu! lar interesse no sequenciamento de um genoma animal, parti cu— larmente no genoma humano, por exemplo para identificar poli— pêptidos até aqui desconhecidos, capazes de serem produzidos ;in vivo particularmente em seres humanos e polipéptidos que, por exemplo, possam ter interesse terapêutico.
em relaçao pio para o
A presente invenção pode também ter interesse com a produção de proteínas farmacêuticas, por exem sequenciamento de regiões de regulaçao de genes ou
de sistemas de expressão.
No contexto do sequenciaraento de genomas de grandes dimensões» por exemplo o genoma humano» ê largamente aceite que a principal limitaÇao correntemente apercebida é a preparaçao de mapas físicos que compreendem sobrepor contíguos de clones de cosmídios isolados. As estratégias correntes para esses projectos de mapeamento foram revistas em Ma— pping our Genes : Genome Projects : How Big, How Fas ?» Congress of the United States, Office of Technology Assessment, *The Johns Hopkins University Press» Baltimore e Londres (1988) Outros pormenores encontram-se em Mapping the Human Genome : Experimental Approaches for Cloning and Ordering DNA Fragments' R. M. Myer, Department of Physiology, University of Califórnia, San Francisco, EUA, em Mapping our Genes Contractor Re— ports, Vol. 2, Ordem ΝΩ PB 88—1Ó2—805/AS, disponível sob os auspícios da US OTA do National Technical Information Service (NTIS), 5285 Port Royal Road, Springfield, VA 221Ó1, Estados Unidos da América. Umá tentativa para fazer o mapeamento do genoma de E. coli muito mais pequeno é referida em C. L. Smith e col. (Science» 236, 1448 — 1453, 19θ7) e Y. Kohara e col. (Cell, 50, 495 - 508, 1987).
I *·
A presente invenção pode também ser empregada» por exemplo, para sequenciar fragmentos de nucleótidos de gran des dimensões, purificados por clonagem em cosmídios e YAC (cromossomas artificiais e leveduras)» Os cosmídios podem ser usados para clonar fragmentos de nucleótidos de, por exemplo, até cerca de 45 kb e os YAC podem ser usados para clonar fragmentos de tamanho médio superior a 300 kb (Nucleic Acids Research 17, 3^25 — 3433 (Ι9θ9), R· Anad e col.). A aplicabilidade da presente invenção para o sequenciamento de fragmentos de nucleótidos de grandes dimensões permite realizar o rápido sequenciamento de sequências de nucleótidos muito grandes.
Um aspecto jiarti cularmente vantajoso da presente invenção reside no facto de a análise de sequência rea—
lizada usando o método de acordo com a presente invenção nao envolver a clonagem do ácido nucleico alvo. Na prática, isto significa que todos os alelos presentes na amostra de ácido nucleico alvo podem ser analisados ao mesmo tempo. As vanta— gens desta maneira de proceder para identificaÇao de indivíduos normais e mutantes heterozigóticos assim como homozigóti cos foram previamente descritas quando o sequenciamento direc to dos produtos de PCR foram usados para realizar mutações (por exemplo, mutações pontuais) que provocam doenças herdadas (Nucleic Acids Res., 16, 8233 — 82^3 (1988), por C. R. Newton e col.).
Uma mutaÇao pontual é facilmente visualizada no heterozigoto por causa da comigraçao de bandas que correspondem às duas bases diferentes que aparecem em duas pistas do gel de sequenciamento de didesoxi. Os homozigotos (normais ou mutantes) neste par de base apresentam uma única banda que corresponde a uma base ou à outra nesta posição num gel se sequenciamento.
Anteriormente, um pré—requisito para este tipo de análise de sequência baseada em PCR era que a sequência ** 9 da região de interesse fosse determinada previamente por meto dos conhecidos per se. Isso permite que fossem concebidos pri mários de PCR para amplifi caÇao por subsequente sequenciamen— to repetitivo da região de interesse.
A presente invenção permite que essa análise seja realizada com fragmentos do ácido nucleico alvo cuja sequência nao está já completamente estabelecida. 0 sequenciamento tal como é realizado usando o método de acordo com a pre sente invenção sobre, por exemplo, ADN genómico humano de um indivíduo revela a extensão completa de diferenças polimórfi— cas entre os cromossomas diplSides^ Se se sabe que o indivíduo ê um heterozigótico obrigado para uma mutaÇao conhecida num dado sítio genético, então o sequenciamento de ambos os alelos (preferivelmente, sequenciamento simultâneo) pelo mêto do de acordo com a presente invenção revelará inevitavelmente todas as bases polifórmicas presentes que poderiam por consequência ser as causas de um fenótipo observado.
A importância das alterações de bases polimor ficas individuais pode ser confirmada ou desaprovada pelo estudo subsequente das mesmas sequências do ácido nucleico alvo em indivíduos homozigóticos normais e mutantes conhecidos (as sim como em outros heterozigóticos obrigados). Será por conse quência apreciado que a presente invenção representa um avanço considerável em relaçao às tentativas baseadas em RFLP cor rente (polimorfismo do comprimento dos fragmentos de restrição) para o estudo de variações entre cromossomas. Naquele ca so , só sao detectadas as alterações das bases que infrequente mente criam ou destroem um sítio de reconhecimento de endonuclease de restrição. Encontram-se a disposição técnicas para a análise fácil de mutações pontuais que nao resultam num RFLP (Nucleic Acids Re., 17, NQ 7> páginas 2503 - 2516 (1989), por
C. R. Newton e col. ).
Uma outra propriedade caracteristica específi ca da presente invenção ê a sua utilidade na análise de doenÇas poligenéticas ou multi fa ctori ai s. Assim, por exemplo, seria vantajoso estabelecer se variantes polimórficas partícula res em certos sítios genéticos sao indicativas de uma predisposição para desenvolver essas doenças poligenéticas multifac toriais, como aterosclerose, hipertensão, diabetes, esquizofrenia e semelhantes.
As tentativas para abordar esse problema previamente usando técnicas de RFLP provaram geralmente nao te— rem exito. Esse facto e provavelmente nao surpreendente visto que esses estudos se baseavam no exame de polimorfismos parti culares apresentados em grandes números de manchas de Southern de amostras de genes candidatos individuais de intensivo consumo de mao—de-obra. Assim, a gama do polimorfismo total no genoma humano realmente analisado por ligaçao com a predispo17
siçao para a doença foi de facto extraordinariamente pequeno (veja-se Molecular Approaches to Human Polygenic Disease,
Ciba Foundation Symposium 130, John Wiley, Chechester, 198?·
Usando a presente invenção, torna—se possível misturar ácidos nucleicos alvo provenientes de um número de indivíduos com uma determinada doença, predisposição para a doença ou outro fenótipo. Podem construir—se, a partir dessas ácidos nucleicos alvo reunidos, bibliotecas de vectoretes, co mo se define mais adiante na presente memória descritiva, por exemplo, ADN genómico humano reunido. A presente invenção permite que esta ADN genómico reunido seja sequenciado de acordo com uma maneira especial do processo. Os polimorfismos comuns tornam-se evidentes de maneira semelhante ás observações com um heterozigoto particular.
Novamente, a falta de necessidade de clonagem com ADN recombinante significa que todos os alelos presentes no material genómico reunido podem ser analisados simultaneamente. 0 número de amostras individuais presentes na piscina nao é limitado. A utilização do método de acordo com a presen te invenção simplesmente revela um genótipo de consenso mais polimorfismo. Uma comparaÇao dos resultados assim obtidos com resulrados semelhantes obtidos por análise de ADN genómico re unido a partir de indivíduos que nao manifestam a doença refe rida, nem predisposição para a doença nem outros fenótipos, permite que os polimorfismos associados com a doença ou com o fenót ipo (ou, inversamente, com a falta da doença ou do fe— nótipo) seja identificada·
A análise nao se limita às pequenas áreas do genoma humano perto dos genes considerados como candidatos. Este tipo de análise que utiliza o método de acordo com a pre sente invenção pode ser ainda facilitado combinando os produ— tos amplificados obtidos com um dado primário de iniciaÇao e uma biblioteca de vectoretes particular feita com ácido nuclei co alvo a partir de uma populaÇao de indivíduos ou normal ou
afectada. Se existem grandes diferenças polimórficas entre as populaçoeS) então misturando os produtos amplificados, des naturando-os e retemperando—os, originar-se—iam produtos de amplificaçao de cadeia dupla com pares de base que nao estão acasalados. Estas faltas de acasalamento podem ser reveladas usando reagentes, tais como 0s04 ou hidroxilamina, como ê referido por R. G. H. Cotton, N. R. Rodrigues e R. D. Campbell, pnas, 4397 - 4401, 1988.
Segue-se um glossário de certos termos e expressões usados na presente memória descritiva a fim de auxiliar o leitor da presente memória descritiva.
A expressão ácido nucleico alvo refere-se a uma sequência de nucleótidos, geralmente ADN genómico, por exemplo, ADN genómico de plantas ou de animais, como por exem pio ADN humano ou ADN bacteriano. Esse ácido nucleico alvo para utilização compreenderá normalmente uma parte (geralmente uma parte curta) de sequência conhecida e, geraimente, uma parte muito maior de sequência desconhecida·
A expressão fragmento de ácido nucleico alvo é utilizada na presente memória descritiva para significar um fragmento de um ácido nucleico alvo obtido por clivagem (como se define mais adiante, na presente memória descritiva) do á ci do nucleico alvo. A expressão frzgmento de acido nucleico ai vo, portanto, nao se utiliza apenas para significar um fraat at gmento obtido por utilizaÇao de endonuclease de restrição.
Além disso, um fragmento pode compreender, por exemplo, uma parte de sequência conhecida e, geralmente, uma parte maior de sequência desconhecida ou o fragmento pode ser de sequência desconhecida. Quando o fragmento é de sequência desconhecida, a clivagem e a obtenção de unidades de fragmento de áci do nucleico alvo/vectorete pode realizar—se como se descreve mais adiante, na presente memória descritiva.
Nestas circunstancias, podem gerar—se amos19 -
| tras de ADN aleatórias a partir do fragmento genómico muito 'maior por amplificaÇao linear com um primário de iniciaçao \ aleatorio ou por amplificaçao com um primário de iniciaçao ί _ J *» aleatorio mais um primário vectorete. A amplificaçao especifi ca originará fragmentos aleatórios que podem ser purificados e usados no mapeamento genético, como se descreve em Ceil 51, 319 - 337 (1987), H. Donis-Keller e col..
termo ‘àmpli fi caÇao11 ê utilizado na presente memória descritiva para designar a replicação de uma sequência de nucleótidos e/ou a sua sequencia complementar por meios nao biológicos e inclui a amplificaçao pelo uso de um primário de iniciaçao sozinho, sendo esse primário hibridizado com a região de primagem de iniciaçao de uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, sendo a extensão do primário efectuada na presença de trifosfatos de nucieósidos apropriados e de um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucieósidos em condiçoes de hibridizaÇao, sendo essa exten sao do primário seguida dc desnaturaÇaO) e sendo este processo de primagem, extensão do primário e desnaturaçao repetido tantas vezes quantas as que sejam apropriadas para se atingir um nível pretendido de amplificaçao.
termo amplificaçao também inclui a repli— caçao por técnicas de reacçao em cadeia com polimerase (PCR) como ê descrito por R. K. Saiki e col., em Science 239, 487 — - 491 (1987) e nas Patentes de Invenção Norte—Americanas Números 4 683 195 e 4 683 202, usando um primário de iniciaçao e um primário de vectorere, como se define mais adiante na pre sente memória descritiva e a técnica de reacçao de cadeia de polimerase por expressão ou técnica de PCR, tal como ê usado na presente memória descritiva para se referir a essas técnicas como se descreve nestas referências.
A expressão nao biológico ê usada na presen te memória descritiva apenas para excluir a amplificaçao por clonagem directa e propagaçao de colónias bacterianas. Com—
preende-se, portanto, que o termo amplificaçao’1 e usado na 'presente memória descritiva de modo a incluir os processos de amplificaçao tais como os que sao descritos na Publicação da
A*
Patente da Organizaçao Mundial de Propriedade Industrial PCT 87/06270 (ou Biotechnology, Vol. 6, Outubro de 1988), Publica çao da Patente de Invenção da Organizaçao Mundial da Propriedade Industrial PCT 88/10315 ou na PublicaÇao da Patente de Invenção da Organizaçao Mundial da Propriedade Industrial PCT 89/OIO5O.
termo clivagem é utilizado na presente me mória descritiva para referir a clivagem de um ácido nucleico num sítio específico. Essa clivagem é convenientemente efectuada usando uma endonuclease de restrição, preferivelmente uma endonuclease de corte de 6 bp, tendo uma sequência de reconhecimento e um modelo de clivagem conhecidos e assim a característica de clivagem de ADN em sítios específicos.
A este respeito, a posição destes sítios es— pecificos num dado acido nucleico alvo nao sera normalmente conhecida em relaçao à posição de outro elemento conhecido dum ácido nucleico alvo, mas a sequência dos sítios específicos é conhecida, bem assim como os seus modelos de clivagem. Assim, as sequências terminais dos fragmentos de restrição obtidos sao conhecidas. Assim, por exemplo, a endonuclease de restrição EcoRI reconhece a sequência • G| AATTC— cttaaI g- ->
— G
-CTTAA
AATTCGe cliva essa sequencia como se indica para originar fragmen— ** Λ tos de restrição que tem as extremidades coesivas indicadas. Como a sequência da extremidade coesiva é conhecida, é possível produzir unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vec torete com base neste conhecimento, como se descreve na prez ** sente memória descritiva mais adiante em relaçao com a expres sao unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete.
Podem empregar—se meios para clivar um ácido nucleico alvo num sítio específico diferente do das endonu—
AM M cleases de restrição, mas prefere—se a utilização de uma endo «M nuclease de restrição. Pode usar-se qualquer endonuclease de «w restrição conveniente. Os exemplos de endonucleases de restri çao individuais incluem as que sao pormenorizadas em Nucleic Acids Research, Sequences Supplement, Vol. l6, 1988, páginas r271 — r313 θ em Current Protocols in Molecular Biology, 19θ7 — 1988, editado por Ausubel F. Μ. , Brent R. , Kingston R. E. , Moor D. D. , Smith J. A. , Seidman J. G. e Struhl K. , Wiley In—
AM terscience, Secção 3, Tabela 3·1—1.
AM
As endonucleases de restrição capazes de produzirem fragmentos com extremidades coesivas, tais como EcoRI, HindIII e Xbal, sao convenientes independentemente de as ex—
AM tremidades coesivas 5' ou 3’ terem ou nao partes salientes. Será também apreciado que, tal como utilizando endonucleases
AM de restrição capazes de produzirem fragmentos com uma qualquer
AM extremidade coesiva saliente 3'°u 5’ , a produção de unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete seja também pos sivel usando endonucleases de restrição que produzem fragmentos com extremidades embotadas em conjunção com vectoretes de extremidades embotadas apropriadas, como se define mais adian te na presente memória descritiva·
Conhecem—se meios para clivar um ácido nuclei co alvo em a) um sítio ou vários sítios específicos diferen—
AM AM tes da digestão com endonuclease de restrição corrente e in— cluem, por exemplo, a utilização de primários—adaptadores e enzimas de restrição da Classe IIS (S. C. Kim e col., Science 240, 504 - 506 (1988); W. Szybalski, Gene, 40, 1Ó9 (1985); A. J. Podhajska e W. Szybalski, Gene, 4θ, 175 (1985), assim como várias abordagens químicas (B. L. Iverson e Ρ. B. Dervan, J. Amer. Chem. Soc., 109, 1241 — 1243 (1987)} G. B. Dreyer e P. B. Dervan, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 968 (1985)i V. V. Vlassov e col. , Nucleic Acids Res. , 14, 40Ó5 (19θ6); Η. E. Mo ser e Ρ. B. Dervan, Science 238, 645 (1987); D. R. Corey e P.
i !
G. SchultZ) Science 238 , ΐΛΟΙ (19Ô7 ) » J· Ρ· Sluka e col. , Sei ence 238, 1129 (1987)).
Além disso, é possível transformar os fragmen tos de ácido nucleico alvo de maneira a terem as extremidades embotadas ou por reparaçao/preenchimento mediados com polime— ! rase de ADN de quaisquer extremidades 5' coesivas salientes
A* .
ou por remoção de grupos salientes 3’ e/ou 5' usando a digestão da cadeia única mediada com Sl nuclease, a despeito de se rem gerados ou nao por digestão com enzima de digestão ou outros meios (por exemplo, químicos). Todos esses fragmentos com extremidades embotadas podem ser de novo transformados em uni dades de fragmento do ácido nucleico aivo/vectorete por liga—
A* çao com vectorete com extremidades embotadas apropriado.
A expressão região de primagem de iniciaÇao tal como ê usada na presente memória descritiva significa a porção de um fragmento de ácido nucleico alvo, digerido por
A# exemplo com enzima de restrição que e de uma sequencia de nucleótidos conhecida e com a qual se pode hibridizar em uso um primário de iniciaÇao e, caso se pretenda, primário ou primários de iniciaçao (c.omo se define na presente memória descritiva mais adiante), por exemplo, sobrepondo um primário ou pri Z A» marios de iniciaçao -ninhados. Em geral, o método de acordo com a presente invenção e efectuado de tàl maneira que apenas um dos fragmentos do ácido nucleico alvo presentes tenha uma região de primagem de iniciaçao. Uma excepçao seria a utiliza Çao de uma mistura de uma pluralidade de bibliotecas de vecto retes diferentes, como se define mais adiante na presente memória descritiva.
A expressão região de primagem de vectoretes tal como ê usada na presente memória descritiva, significa a porção da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectore te que é de sequência de nucleótidos conhecida, como se define pelo próprio vectorete e com a qual, em utilização, o primário do vectorete e, caso se pretenda, o primário ou os pri—
mários de vectorete aninhados (como se define na presente memória descritiva, mais adiante), por exemplo, o primário ou primários de vectorete aninhados que se sobrepoem se podem hi bridizar. A região de primagem de vectorete está presente na cadeia complementar da cadeia que contêm a região de primagem de iniciaçao.
A este respeito, a região de primagem do ve— ctorete com a qual em utilização o primário do vectorete e, caso assim se pretenda, o primário ou os primários de vectorete aninhados se hibridizam pode estar presente ou na unidade de fragmento do ácido nuclaico alvo/vectorete preparada por ligaçao ou numa unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/ vectorete preparada por extensão do primário de um primário de iniciaçao ou em ambos. Assim, aprecia-se que o primário do vectorete e, caso assim se pretenda, o primário ou os primários de vectorete aninhados sejam usados no método de acordo com a presente invenção podem ser escolhidos para hibridizaçao com uma região de. primagem de vectorete que pode, por exem pio, nao ser gerada até á extensão do primário de um primário de iniciaçao e, caso se pretenda, o primário ou primários de i ** Λ» iniciaçao aninhados. Uma consequência deste facto e que, por exemplo, o vectorete em si proprio nao precisa de ser um fragmento de ADN de cadeia dupla totalmente auto complementar.
termo primário, tal como ê usado na presente memória descritiva, refere—se a um oligonucleótido, quer ocorra ou nao naturalmente como numa digestão de restrição pu rificada quer seja produzido sinteticamente, o qual ê capaz de actuar como ponto de iniciaçao da síntese quando colocado sob condiçoes em que se induz a síntese de um produto de extensão do primário que ê complementar de uma cadeia de ácido nucleico, isto ê, na presença de trifosfatos de nucleósidos apropriados e um agente de polimerizaçao, tal como ADN polime *«* . ** rase num tampao apropriado (tampao inclui regulador de pH, força iónica, cofactores, etc.) e a uma temperatura apropriada.
B2sSS3SEsb^£^3^*~-
primário ê preferivelmente de cadeia única # Λ *** para se obter a maxima eficiência na extensão mas, como variante, pode também ter cadeia dupla. Se tiver cadeia duila, o primário ê primeiramente tratado para separar as suas ca— ί deias, antes de ser usado para preparar os produtos de extensão. Preferivelmente, o primário ê um oligo—desoxi-ribonucleó tido.
primário deve ser suficientemente comprido # ** para escorvar a síntese de produtos de extensão na presença do agente de polimerizaçao. Os comprimentos exactos dos prima rios dependem de muitos factores, incluindo a temperatura e a fonte do primário e a utilizaÇao do método. Por exemplo, dependendo da complexidade da sequencia do alvo, os primários de iniciaÇao e de vectorete contém tipicamente quinze a trinta e cinco nucleótidos, muito embora possam conter mais ou me ι , , f ~ nos nucleótidos. Moléculas de primário curtas necessitam geralmente de menores temperaturas para formar complexos híbridos suficientemente estáveis com o modelo.
A expressão primário de iniciaçao é utiliza da na presente memória descritiva para designar um primário «MM M capaz de hibridizaÇao com a região de primagem de iniciaçao, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.
M
Em utilização com, por exemplo, unidades de vectoretes preparadas a partir de ADN genómico humano total, pode ser preferi vel que o primário de iniciaçao seja mais longo do que quin ze a dezassete nucleótidos de modo a evitar a hibridizaçao e a primagem, ao acaso, com as sequências presentes no genoma s ** humano que acontecem por acaso se se adaptarem a região de pri magem de iniciaçao.
A expressão primário de vectorete e utiliza da na presente memória descritiva para designar um primário
Μ M capaz de hibridizaçao com a região de primagem do vectorete da unidade fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete. 0 pri mário de vectorete tem uma sequência de nucleótidos tal que e capaz de se hibridizar com um produto de extensão do prima—
rio de iniciaçao, depois da separaçao do seu complemento, pe** z ** lo que o produto de extensão do primário de iniciaçao serve como modelo para a síntese de um produto de extensão do primá rio de vectorete, facilitando dessa forma a amplificaçao.
Como, em geral, o método de acordo com a presente invenção ê efectuado de tal maneira que apenas uma das unidades de fragmento de ácido nucleico a lvo/ve ctorete tem una região de primagem de iniciaçao, so aquela unidade e submetida a amplificaçao. As unidades de fragmento do ácido nucleico alvo/vectorete que nao têm uma região de primagem de ini — ciaçao sao capazes de amplificaçao por PCR porque, muito erabo ra a formaçao dum produto de extensão do primário de vectorete possa ser possível, nenhum primário de iniciaçao será capaz de se hibridizar com o produto de extensão do primário de vectorete visto que nao esta presente nenhuma região de prima gem de iniciaçao e, assim, nao ê possível a amplificaçao por PCR.
Em utilizaÇao, prefere—se que a síntese dos produtos de amplificaçao do primário de vectorete seja dependente da síntese inicial de um produto de extensão do primário de iniciaçao. Isso evita a formaçao de grandes números de produtos de extensão do primário de vectorete nao amplificáveis que se possa esperar esgotem os trifosfatos de nucleósidos disponíveis ou outros cofactores na mistura reaccional de uma maneira prejudicial.
A expressão primário aninhado, tal como é usada na presente memória descritiva, significa um primário deslocado em um ou mais pares de bases no sentido 3' afastando—se da extremidade 5’ do primário de iniciaçao ou no sentido 3’ afastando—se da extremidade 5' do primário de vectorete ou no sentido 3’ afastando—se da extremidade 5' tanto do primário de iniciaçao como do primário de vectorete. É apreciado que a sequência do primário ou dos primários aninhados seja necessariamente escolhida de sequência complementar em relaÇao às regiões do primário de iniciaçao ou de vectorete conhe
cidas ou de ambas essas duas regiões.
A expressão unidade de fragmento de acido nu cleico alvo/vectorete (também designada, na presente memória descritiva, como unidade de vectorete) ê utilizada na presente memória descritiva para designar uma sequência de nucleó í ** ; tidos, por exemplo, uma sequencia de ADN que compreende «ra fra ’í gmento de ácido nucleico alvo e uma porção da sequência de nu cleôtidos conhecida, por exemplo, uma sequência de ADN, por— çao essa que, na forma de cadeia única, ê capaz de hibridiza! çao com o primário de vectorete, tal como se definiu anterior imente na presente memória descritiva.
A este respeito, é apreciado que a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo)vectorete possa ser capaz de hibridizaçao com um primário de vectorete ou, em virtu ! de da presença na unidade acima referida de uma porção de se— j quência de nucleótidos conhecida, sequência essa que ê substancialmente complementar da sequência do primário de vectore te ou em virtude da capacidade de um produto de extensão do ί J ** jprimário de iniciaçao, baseado numa cadeia de unidade acima !mencionada como modqlo, para compreender uma sequência de nu— | cleôtidos substancialmente complementar da sequência do primá rio de vectorete. A este respeito, será apreciado que a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete seja tal que, numa cadeia, terá substancialmente a mesma sequência, pe lo menos numa sua parte, que o primário de vectorete. Esta ca deia também contem a região de primagem de iniciaçao.
ί A parte da sequência de nucleótidos conhecida, por exemplo a sequência de ADN, pode derivar de qualquer fonte conveniente, desde que satisfaça o requisito acima citado de, na forma de uma única cadeia, ser capaz de hibridizaçao com o primário de vectorete. Assim, por exemplo, o vectorete pode preparar—se separadamente usando um sintetizador de ADN e o vectorete obtido ser ligado com o fragmento ou com os fra gmentos de ácido nucleico alvo para se obter a unidade ou as
unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectoretes.
A este respeito, o vectorete será conveniente mente adaptado para ligaçao ao fragmento ou aos fragmentos do ácido nucleico, numa extremidade coesisa do fragmento ou dos fragmentos do ácido nucleico alvo que se hibridizam com uma extremidade coesiva do vectorete para formar uma unidade de vectorete, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva, ou um fragmento de ácido nucleico alvo com a extremidade embotada pode ser ligado a um vectorete de extremidade embotada para formar uma unidade de vectorete, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva.
** fi fi
Nao e necessário, no entanto, que o vectorete seja pré—formado antes da ligaçao com o fragmento de ácido nu cleico alvo, embora isso possa ser preferível. Assim, por exem i pio, a unidade acima referida pode preparar—se, num caso apro priado, por ligaÇao de um ADN de cadeia única ao fragmento de ácido nucleico alvo, por exemplo, utilizando a parte saliente da extremidade coesiva para fixar um primeiro ADN de cadeia única a ela e, em seguida, permitir que seja ligada um segundo ADN de cadeia única, de modo a formar a unidade pretendida.
i **
Numa forma de realizaçao da presente invenção, a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete contem uma parte de um vectorete de bloqueio. A expressão vecto rete de bloqueio”, tal como ê usada na presente memória descritiva, refere—se a um vectorete ou à parte dum vectorete de uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete em que uma ou ambas as bases livres das extremidades se encontram sob uma forma modificada para evitar a ligaçao de nucleó tidos nesses pontos ou para evitar a extensão do primário,por exemplo, na presença de trifosfatos de nucleósidos apropriados e de um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nu cleôsidos sob as condiçoes de hibridizaçao.
Estas modificações sao conhecidas per se e po
dem consistir, por exemplo, na presença de um didesoxi-nucleó tido. Assim, por exemplo, o vectorete de bloqueio de cadeia dupla pode ter um didesoxi-nucleótido na extremidade 3', tal como di de soxi—a deno sina (ddA). Essa tnodificaÇao pode também incluir ribonucleósi dos em que o diol da ribose é clivado, por exemplo com periodato. Como variante, pode adicionar—se um re síduo 3'—desoxi—nucleósido, por exemplo um resíduo de 3'—deso xi-adenosina na extremidade 3' usando, por exemplo, trifosfato de cordicepina e terminal transferase. Como outra variante, pode introduzir—se uma funcionalidade 3’~amirio ou 3'— tio, qui micamente, na extremidade 3’, por métodos per se conhecidos.
De acordo com uma outra forma de realizaçao da presente invenção, um vectorete ou uma porção de vectorete com preende duas sequências com cadeia única parcialmente hibridi zadas que possuem um grau de nao complementariedade tal que a extensão do primário do vectorete nao se pode efectuar usando esse vectorete.
A expressão trifosfato de nucleosido é utilizada na presente memória descritiva para designar os trifos fatos de nucleósidos presentes quer em ADN quer em ARN e, assim, incluem nucleósidos que incorporam adenina, citosina, gua nina, timina e uracilo como base, sendo o agrupamento de açúcar desoxi—ribose ou ribose.
Em geral, os desoxi—ribonucleosidos sao empre gados e® combinaÇao com uma ADN polimerase. Sera apreciado, no entanto, que se podem empregar outras bases modificadas ca pazes de formarem pares de bases com uma das bases convencionais, adenina, citosina, guanina, timina e uracilo. Essas bases modificadas incluem, por exemplo, 7-desaza-guanina e hipo xantina.
termo nucleótido V, tal como ê utilizado na presente memória descritiva, pode referir—se a nucleótidos pre sentes quer em ADN quer em ARN e, assim, inclui nucleótidos que incorporam adenina, citosina, guanina, timina e uracilo como base, sendo o agrupamento de açúcar desoxi-ribose ou ribo se.
Será apreciado, no entanto, que outras bases modificadas capazes de formar pares de bases com uma das bases convencionais, adenina, citosina, guanina, timina e uraci lo, podem ser utilizadas no primário de iniciaçao e no primário de vectorete empregado de acordo com a presente invenção.
jEssas bases modificadas incluem, por exemplo, 7-desaza—guani— !na e hipoxantina.
I 0 agente para a polimerizaçao de trifosfatos ' de nucleósidos pode ser qualquer composto ou sistema que funciona de maneira a realizar a síntese de produtos de extensão de primários, incluindo enzimas. As enzimas apropriadas para esta finalidade incluem, por exemplo, E. coli ADN polimerase I (C. C. Richardsno e col. , J. Biol. Chem., 239, 222 (1964)), i .
i fragmento de Klenow de E. coli ADN polimerase I (H. Jacobsene col., Eur. J. Biochem., 45, 623 — 627 (1974)), T4 ADN polimerase (A. panet e col., Biochemistry 12, 5θ45 - 5θ5θ (1973))» 'T7 ADN polimerase (S. Tabor e C. C. Richardsnn, Proc. Natl^
Acad. Sei. USA 84, 4767 - 4771 (1987)), out ras polimerases de
ADN disponíveis, tra'nscriptase inversa e outras enzimas, incluindo enzimas termostáveis.
A expressão enzima termostávei, tal como e usada na presente memória descritiva, refere-se a uma enzima que ê relativamente estável ao calor e ê resistente ao calor e catalisa (facilita) a combinação dos nucleótidos de acordo com a maneira apropriada para formar os produtos de extensão do primário que sao complementares de cada cadeia de ácido nu ciei co.
Geralmente, a síntese ê iniciada na extremida de 3' de cada primário e prosseguirá no sentido 5’ ao longo do modelo de cadeia até a síntese terminar, produzindo geralmente moléculas de comprimento diferentes. No contexto da pre sente invenção, a síntese termina geralmente numa posição de30 terminada pelo sítio de clivagem do ácido nucleico alvo, o que resulta na obtenção de moléculas com o mesmo comprimento.
Pode haver enzimas, incluindo enzimas termos— táveis, no entanto, que iniciam a síntese na extremidade 5’ θ esta prossegue no outro sentido, usando um processo semelhante ao que acima se descreveu. Uma enzima termostável preferida que pode ser empregada no processo de acordo com a presente invenção, é extraída e purificada de Thermus aquaticus e tem um peso molecular igual a cerca de 86.000 - 90.000 daltons, como se descreve na Patente de Invenção Europeia Publicaçao Numero 237 3θ2 (veja—se também Pubiicaçao da Patente de Invenção Europeia Número 25θ 017)· A estirpe YT1 de Thermus aquatjcus está disponível sem quaisquer restrições na American Type Culture Collection, 12301 parklawn Drive, Rockville, Ma— ryland, Estados Unidos da América, sob o número ATCC 25 104.
É óbvio que ADN polimerases tendo propriedades superiores ou mais vantajosas podem ser obtidas por muta— çao aleatória de elones que expressam estas proteínas. A título de exemplo, seria obviamente preferível obter uma versão, depois de mutaçao, de Taq ADN polimerase que codifica ADN de cadeia dupla e que tinha como resultado a expressão de uma pro teína com propriedades superiores, como por exemplo falta de actividade de 5’-exo-nuclease. As técnicas para obter essas versões que dofreram mutaÇao pretendidas sao bem conhecidas e estão dentro dos conhecimentos dos biologistas moleculares mé dio s.
A expressap complementar de ê utilizada na presente memória descritiva em relaÇao com nucleotidos para significar um nucleótido que formará um par de bases com outro nucleótido específico, quando incorporado em ADN ou ARN. Assim, o trifosfato de desoxi—adenosina ê complementar de tri fosfato de timidina e o trifosfato de desoxi—guano sina ê complementar de trifosfato de desoxi-citidina, enquanto o trifos fato de desoxi—guano sina ê complementar de trifosfato de timi
31' dina. Α este respeito, aprecia-se que, muito embora o fato de timidina e o trifosfato de desoxi-guanosina po mar pares de bases em certas circunstancias, eles nao siderados como complementares para as finalidades da p memória descritiva.
tri fo s— ssam for sao con re sent e
Os primários, na presente memória descritiva,
A?
sao escolhidos de maneira a serem substancialmente comple— mentares em relaçao as diferentes cadeias de cada sequencia específica a ser prolongada ou amplificada. Isto significa que os primários devem ser suficientemente complementares para se hibridizarem com as suas respectivas cadeias. Por consequên— i cia, as sequências do primário nao necessitam de reflectir as sequências exactas dos seus modelos padrao, embora isso seja normalmente preferível.
j A expressão biblioteca de vectoretes, ê uti lizada na presente memória descritiva para referir uma pluralidade de unidades dé fragmentos de ácido nucleico alvo/vecto rete que sao obtidas depois de se clivar um ácido nucleico al j vo em todos os seus sítios de clivagem potencial em relaçao a uma dada endonuclease de restrição que o ácido nucleico alvo contêm preparando as unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete a partir da mistura total de fragmentos de áci do nucleico alvo por ciclos de ligaçao a uma porção de vectorete apropriadamente adaptada (e repetindo a clivagem, se isso for necessário).
Em geral, só uma única unidade de vectorete numa dada biblioteca de vectoretes contêm a região de prima— gem de iniciaÇao que interessa. No caso de ADN genomico humano clivado com uma endonuclease de restrição que reconhece uma sequência específica de 6 bp (um cortador de 6 bp), o tamanho médio dos fragmentos de ácido nucleico alvo resultantes será de 4096 pb e o ácido nucleico alvo gera aproximadamente 10^ desses fragmentos. Por consequência, obtêm-se uma biblioreca de vectoretes que contêm aproximadamente 10θ unidades de fra—
3.2 -
gmentos de ácido nucleico alvo/vectoretes a partir de ADN genómico humano clivado com uma endonuclease de corte de restri çao de 6 hp e apenas uma dessas unidades de vectorete naquela biblioteca de vectorete humano total contém uma dada região de primagem de iniciaçao capaz de iniciar a amplificaçao na presença de um primário de iniciaçao, um primário de vectorete caso assim se pretenda, trifosfato de nucleósido apropriados e de um agente para a polimerização do trifosfato de nucleósi •ι ta do sob as condiçoes de hibridizaçao.
Podem preparar—se diferentes bibliotecas de vectoretes a partir do mesmo ácido nucleico alvo por clivagem com diferentes endonucleases de restrição e ligaÇao de por— çoes de vectorete apropriadamente adaptadas para gerar unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete. Podem usar-se todas as endonucleases de restrição, neste processo, caso assim se pretenda, e no limite pode ligar—se uma porção do vectorete aos fragmentos do ácido nucleico alvo em qualquer sítio de reconhecimento da enzima de restrição no ácido nuclei co alvo. Esta propriedade característica nao é sempre desejável porque, idealmente, a região de primagem de iniciaçao de interesse em qualquer dada biblioteca de vectoretes se separa rá por 100 bp ou mais do ponto de ligaÇao da porção do vectorete.
Isto ê assim porque os produtos de extensão do primário de iniciaçao ou dos produtos de amplificaçao do primário do primário de iniciaÇao/vectoretes mais pequenos do que esse valor originam uma informação tao pequena sobre a se quência, na prática da presente invenção, que se tornam de pou co valor para o sequenciamento eficiente de sequências de nucleótidos longas. Além disso, a sequência de nucleótidos des ses produtos curtos será contida dentro dos produtos obtidos usando uma biblioteca de vectoretes em que o primário de ini— ciaçao está longe do sítio de ligaÇao da porção do vectorete.
A utilizaÇao de uma pluralidade de diferentes z ** bibliotecas de vectoretes com um primário de iniciaçao parti— cular permite realizar a identificaÇao das bibliotecas em que os produtos de prolongamento ou de atnplificaÇao sao de tamanho conveniente para o sequenciamento. Por exemplo, pode ser particularmente conveniente escolher produtos de prolongamento ou de amplificaçao de primário de iniciaçao com aproximada mente 200 bp, 400 bp, 600 bp, 800 bp, 1.000 bp, etc. , obtidos a partir de bibliotecas de vectoretes particulares com um dado primário de iniciaçao. 0 sequenciamento desses produtos a par tir de bibliotecas de vectoretes em que acontece eles ocorrer em para um dado primário de iniciaçao, usando um primário de sequenciamento de vectoretes ou de vectoretes aninhados e métodos em si conhecidos será provavelmente apro para gerar da—
Λ ** ** dos de sequências que se sobrepoem para uma larga região para o lado 3' do primário de iniciaçao.
A quantidade de dados de sequência gerados num ensaio de análise de uma pluralidade de bibliotecas de vectoretes com um dado primário de iniciaçao ê apenas limitada pelo tamanho dos produtos de prolongamento ou de amplificaçao do primário de iniciaçao que podem ser obtidos na prática e/ou pela distancia (a partir da região do primário de iniciaçao) até ao sítio de endonuclease de restrição mais afastado repre sentado na pluralidade de bibliotecas de vectoretes.
Numa forma de realizaçao vantajosa do método de acordo com a presente invenção, as unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete sao preparadas a partir de fragmentos de ácido nucleico alvo por ligaçao de tal modo que o vectorete nao pode ser clivado da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete formado pelo mesmo agente utili zado para clivar o ácido nucleico alvo e originar fragmentos de ácido nucleico alvo.
Ê especialmente preferido que o ácido nucleico alvo seja clivado com uma endonucleas de restrição para ori ginar um fragmento de ácido nucleico alvo para ligaçao a um vectorete, sendo a sequência de vectoretes escolhida de manei
descrito por + AATTXv — Vectorete á ci do i ra que a sequencia de reconhecimento de endonuclease de res— triçao da referida endonuclease de restrição esteja ausente na unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, por exemplo no caso de EcoRI acima !
-GAATTC — G
-CTTAAG-> -CTTAA ι
Fragmento de nuclei co aIvo na qual X ê qualquer nucleósido diferente de C e Y é o seu nu cleósido complementar.
A presente invenção pode ser levada a cabo de maneira que a síntese dos produtos de prolongamento do primário ouj preferivelmente, dos produtos de amplificaçao do primário de vectorete seja dependente da síntese inicial de um produto de prolongamento do primário de iniciaçao.
Isto pode conseguir-se, por exemplo, por am— plificaçao linear ou, preferivelmente, por utilização de um primário de vectorete que é apenas capaz de se hibridizar com o produto de prolongamento do primário de iniciaçao. Assim, vantajosamente, a porção de vectorete da unidade de fragmento do ácido nucleico alvo/vectorete compreende uma porção de cadeia dupla que tem uma primeira e uma segunda cadeias tendo a primeira cadeia um agrupamento de bloqueio da polimerizaÇao terminal e contendo a segunda cadeia, que é ligada aquela cadeia do fragmento do ácido nucleico alvo que contêm a região de primagem de iniciaçao possuindo uma porção de uma cadeia única, sendo o agrupamento de bloqueio de polimerizaÇao termi nal efectivo para evitar o prolongamento da primeira cadeia para formar um complemento para a mencionada porção com uma única cadeia da segunda cadeia na presença de trifosfatos de nucleosido apropriados e de um agente para polimerizaÇao dos trifosfatos de nucleósido sob as condiçoes de hibridizaçao. 0 primário de vectorete ê assim incapaz de se hibridizar com a
unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete mas ê capaz de se hibridizar com o produto de prolongamento do primário de iniciaçao. Assim, nao se obtêm produtos de prolongamento do primário do vectorete até à libertaÇao de um produto de prolongamento do primário de iniciaçao, depois do que os produtos de prolongamento obtidos incluem normalmente uma por çao complementar da sequência ou das sequências de nucleótidos conhecidas da porção de cadeia única da segunda cadeia. Esta forma de realizaçao vantajosa ê ilustrada na presente me mória descritiva, mais adiante, na Figura 6.
agrupamento de bloqueio da polimerizaÇao ê eficaz para evitar a polimerizaçao de uma sequencia de núcleo tidos de um primário para formar o complemento de uma sequên— cia de nucleótidos de modelo padrao na presença de um agente para a polimerizaçao de trifosfatos de nucleósido, tais como uma ADN polimerase, por exemplo, fragmento de Klenow de E. coli ADN polimerase I, T7 ADN polimerase ou Taq ADN polimerase.
agrupamento de bloqueio de polimerizaçao pode ser qualquer grupo conveniente para esta finalidade tal como um nucleósido modificado apropriado, por exemplo um didesoxi-nucleósi do ou um 3' —de soxi—nucleó sj. do , tais como cordicepina ou uma funcionalidade 3'-amino ou 3,—tio.
Numa outra forma de realizaçao especialmente preferida da presente invenção, a porção de vectorete da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete compreende uma parte com dupla cadeia tendo uma primeira e uma segunda cadeias, sendo a segunda cadeia da porção do vectorete ligada à cadeia do fragmento do ácido nucleico alvo que contêm a re— giao de primagem de iniciaçao e sendo a sequencia de nucleoti dos da primeira cadeia, da segunda cadeia e do primário do ve ctorete escolhida de modo que o primário do vectorete seja ca paz de se hibridizar com o complemento da segunda cadeia mas nao seja capaz de se hibridizar com a primeira cadeia, sob as mesmas condiçoes de hibridizaçao.
Será apreciado que a presença de um agrupamen
M MM to de bloqueio de polimerizaçao nesta forma de realizaçao nao é necessária· Pode ainda apreciar-se que, neste caso, a sequência do primário de vectorete ê substancialmente a mesma que a sequência de, pelo menos, uma parte da segunda cadeia de vectorete. Esta forma de realizaçao especialmente preferida da presente invenção é discutida com mais pormenor na presente memória descritiva mais adiante em relaçao com a Figura 6.
Uma outra forma de realizaçao preferida da pre sente invenção compreende a preparaçao de uma pluralidade de bibliotecas de vectoretes diferentes, para utilização com o mesmo primário de iniciaçao de uma cadeia, sendo cada biblioteca de vectoretes preparada clivando o ácido nucleico alvo em diferentes sítios de clivagem e preparando unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete a partir dos fragmentos do ácido nucleico alvo por ligaÇao de maneira a formar a citada biblioteca de vectoretes, tratando—se depois cada biblioteca de vectoretes separadamente ou conjuntamente com tri fosfatos de nucleósidos apropriados e um agente para a politne rizaÇao dos trifosfatos de nucleósidos sob as condiçoes de hi bridizaçao de modo que se obtenha uma pluralidade de produtos de prolongamento do primário de iniciaçao com base na utiliza çao do mesmo primário de iniciaçao único.
tamanho desses produtos de prolongamento ê determinado pela distancia desde o primário de iniciaçao até ao sítio 3' mais próximo para os meios de clivagem particulares, por exemplo enzima de restrição usada para construir aque la biblioteca particular.
Caso assim se pretenda, um ou mais produtos de prolongamento do primário de iniciaçao referido podem ser isolados e/ou sequenciados ou, pelo menos, pode sequenciar-se uma porção de produto de prolongamento. Assim, por exemplo»
M esta forma de realizaçao pode convenientemente ser utilizada para identificar um fragmento de ácido nucleico alvo pretendi ____ do, normalmente o mais comprido, que contém uma região de pri magem de iniciaçao, de modo que a extremidade terminai 3' pos sa ser sequenciada convenientemente com um primário de vectoretes aninhados, como se descreveu anteriormente na presente memória descritiva, a fim de proporcionar um novo ponto de par tida para posterior utilização do método de acordo com a presente invenção tal como esta forma de realizaçao preferida. A sequência da extremidade terminal 3’ do fragmento de ácido nu cleico alvo mais comprido anteriormente mencionado pode assim tornar-se uma região de primagem de iniciaçao de um novo fragmento de ácido nucleico alvo para um posterior ensaio de for *·* 9 ** maçao de produto de prolongamento do primário de iniciaçao de múltiplas bibliotecas de vectorete, identificação e sequencia mento do fragmento do ácido nucleico alvo mais comprido.
Ao escolher uma nova região de primagem de ini ** A ciaçao com base na nova sequencia de dados gerados usando o fi ** método de acordo com a presente invenção na extremidade termi nal 3' de um fragmento de ácido nucleico alvo, esses dados de sequência podem, como rotina, serem comparados com os dados de base publicamente disponíveis de acordo com as compilações das sequências dos ácidos nucleicos conhecidos (por exemplo, Genbank, EMBL), de modo a garantir que uma nova região de pri magem de iniciaçao proposta nao se emparelhe apertadamente por acaso com uma sequência de ácido nucleico conhecida algures, por exemplo íqo ADN genómico de interesse.
Isto obviamente tem mais probabilidade de acon tecet nos casos em que acontece que a extremidade terminal 3’ de um fragmento de ácido nucleico particular compreenda elementos repetitivos, tais como, por exemplo, sequências Alu. Nesses casos, é vantajoso realizar o método de acordo com a presente invenção numa pluralidade de bibliotecas de vectoretes com um dado primário de iniciaçao de modo a garantir que, pelo menos um dos produtos de prolongamento resultantes tenha uma extremidade terminal 3' única/nao repetitiva para a escolha de uma posterior região de primagem de iniciaçao.
A progressão passo a passo a partir de uma re giao de primagem de iniciaçao previamente desconhecida para outra ao longo de um ácido nucleico alvo, por exemplo ADN genómico humano, pode convenientemente ser controlado usando amostras do citado ácido nucleico alvo clivado em separado até se completar com a mesma endonuclease de restrição que ê usada na preparaçao das unidades de fragmento de acido nucleico alvo/vectorete (bibliotecas de vectoretes, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) e submetidas a electroforese em gel de agarose e Manchamento de Southern,
O ensaio dos filtros assim obtidos com um pri meiro primário de iniciaçao revelará um aspecto das bandas que é consistente com os vários sítios de reconhecimento de enzimas de restrição que rodeiam esta primeira região de primagem de iniciaçao no ácido nucleico alvo. A utilização do mé todo de acordo com a presente invenção com uma pluralidade de bibliotecas de vectoretes e este primeiro primário de iniciação, cada uma de cujas extremidades 3’ terminais sao defini—
Μ Μ Μ ** das pela posição em relaÇao a região de primagem de iniciaçao do sítio de reconhecimento mais próximo para a enzima de restrição usada para gerar a biblioteca de vectoretes em questão. Assim, obtêm—se efectivamente um mapa dos sítios de restrição para o lado 3' de um primeiro primário de iniciaçao.
Tendo subsequentemente escolhido uma segunda nova região de primagem de iniciaçao da sequência previamente desconhecida, a ligaçao à primeira região de primagem de ini— ciaçao e estabelecida re—amostrando o filtro com a Mancha de Southern, acima mencionado, com o segundo novo primário de ini ciaçao. 0 modelo das bandas obtido ê idêntico ao obtido com o primeiro primário de iniciaçao nos casos em que nenhum sítio de reconhecimento para a enzima de restrição em questão fica entre a primeira e a segunda regiões de primagem de iniciaçao. Nos casos em que ocorre um sítio de reconhecimento para a enzima de restrição em questão entre as regiões de primagem de iniciaçao, como ê demonstrado pelo aparecimento de produtos de extensão mais pequena na correspondente biblioteca de vectorete, então observa—se normalmente um fragmento de comprimento diferente ao reexaminar—se o filtro com a Mancha de Sou thern com um segundo primário de iniciaçao. Por repetição des te método, a consistencia, a precisão e o carácter de confian ça da progressão passo a passo a partir de uma região de pri— magem de iniciaçao para outra ao longo de um acido nucleico alvo é mantida e garantida.
Apreciar-se-á que a sequência das extremidades terminais 3' de toda a pluralidade de produtos de extensão de primários de iniciaçao pode ser facilmente obtida usando o mesmo primário de vecyoretes ou primários de vectoretes aninhados para o sequenciamento por métodos conhecidos per se.
Desta forma, a sequência completa de um segmento desconhecido do ácido nucleico ADN alvo pode ser deter minada de maneira fácil e sistemática e muito mais convenien— temente do que, por exemplo, usando a clonaçao M13 Shotgun. Esta conveniência ê por causa de os produtos de prolongamento do primário de iniciaçao poderem ser ordenados por tamanho e, por consequência, a ordem das suas sequências no ácido nuciei co alvo original torna—se evidente. Cada produto de prolongamento do primário de iniciaçao compartilha uma extremidade 5' determinada pelo primário de iniciaçao e uma extremidade 3' determinada pelo sítio 3' mais próximo para os meios de cliva gem particulares, por exemplo, enzima de restrição, usada na síntese daquela biblioteca particular de vectoretes.
Numa forma de realizaçao preferida de acordo com a presente invenção, qualquer dos produtos ou todos os pro dutos de prolongamento do primário de iniciaçao obtidos é ou sao sequenciados (como se define na presente memória descriti va mais adiante), pelo menos,na extremidade ou nas extremidades mais distantes em relaçao a um dado primário de iniciaçao de modo a determinar a sequência de um posterior primário de iniciaçao pelo que se obtêm produtos de prolongamento do pri —
mário de iniciaçao baseados no prolongamento do primário do posterior primário de iniciaçao.
De acordo ainda com uma outra forma de reali— zaçao preferida da presente invenção, um produto de extensão do primário de iniciaçao ou uma sua porção ê sequenciada (como se define na presente memória descritiva mais adiante) de forma a caracterizar o referido produto de prolongamento ou a respectiva porção.
Como se descreveu acima, uma aplicaçao potencialmente importante da presente invenção é a identificação de um genótipo previamente nao identificado, por exemplo, um defeito genético ou vários defeitos genéticos responsáveis por um fenótipo, por exemplo, uma doença ou uma perturbação genética ou a identificação de um genótipo previamente nao iden—
I tificado, por exemplo, um defeito genético ou vários defeitos genéticos que ê ou que sao responsáveis por um factor ou que contribuem para um factor que cria predisposição para um fenó tipo, por exemplo uma doença.
Assim, por exemplo, em relaçao a um genótipo tal como uma doença ou uma perturbaÇao genética, o método de acordo com a presente invenção pode ser aplicado ao acido nucleico que nao contém o genótipo (por exemplo, o defeito ou os defeitos genéticos) e ao ácido nucleico que realmente contêm o genótipo, por exemplo, o defeito ou defeitos genéticos a serem investigados, sendo a identificação do genótipo, por exemplo, de um defeito ou dos defeitos genéticos, efectuada por comparaçao da informação gerada pelo sequenciamento das duas amostras de ácidos nucieicos. Essa comparaçeo podia simplesmente efectuar—se, por exemplo, por comparaçao dos geles de sequenciamento convenientemente por varrimento automático.
A este respeito, aprecia-se que as sequências específicas nao precisam de ser determinadas per se desde que se gerem dados suficientes para permitir uma diferença ou as
4l -
diferenças entre as amostras do ácido nucleico alvo a ser de— tectado e identificado e os termos sequencialmente11 e sequen ciado sao, por consequência, utilizados na presente memória descritiva para incluir nao só a determinação da sequência de nucleótidos específica, mas também a protecção e a identifica çao de diferenças de sequências sem proceder à determinação específica da sequência dos nucleótidos.
Ê conveniente aplicar o método de acordo com a presente invenção ao ácido nucleico alvo de um heterozigoto permanente, por exemplo, para a doença genética ou perturbação genética a ser investigada. Necessariamente, tanto um ale lo normal como um alelo mutante para o sitio em questão estão presentes no indivíduo e esses sítios identificados usando o método da presente invençap, em que mais do que um único nu— cieotido se encontra presente no sequenciamento sao candidatos a ser o fenótipo, isto ê, a mutaçao que provoca a doença ou a perturbação.
Em adiçao ao que se refere acima, suspeita—se que certos genótipos, por exemplo, defeitos genéticos podem predispor indivíduo^ a fenótipos, por exemplo, doenças tais como aterosclerose prematura, hipertensão, diabetes e cancro. Poe exemplo, se esses defeitos genéticos pudessem ser identificados, então esses pacientes de alto risco podiam ser exa minados e o aparecimento da doença tratado numa fase inicial de desenvolvimento.
método de acordo com a presente invenção po ** £ de ser aplicado para a identificaÇao desses genotipos de predisposição. Assim, por exemplo, o método de acordo com a presente invenção pode ser aplicado ao ácido nucleico de uma plu ralidade de indivíduos afectados por um fenótipo a ser investigado, por um lado e, por outro lado, ao ácido nucleico de Z A* uma pluralidade de indivíduos que nao apresentam manifestações do mencionado fenótipo, sendo a identificaçao do genôtipo efe cuada por comparaçao das sequências das amostras do ácido nu42 -
cI ei co.
Convenientemente, o ácido nucleico proveniente da pluralidade de indivíduos afectados pelo fenotipo a ser investigado será reunido e submetido ao método de acordo com a presente invenção e, semelhantemente, ácido nucleico de indivíduos que nao apresentam esses sintomas do citado fenotipo é reunido e submetido ao método de acordo com a presente invenção. A comparaçao das diferenças das sequências entre os dois grupos identifica a presença de qualquer genótipo de pre jdisposição se algum ou alguns estiverem presentes.
A vantagem desta técnica reside no facto de permitir que o genótipo de um indivíduo com predisposição seja identificado a despeito da sua frequência de ocorrência e a despeito da complexidade global e do número de diferentes factores genéticos que contribuem para o fenotipo global. Assim, se a presença de uma combinaÇao de defeitos genéticos apa rentemente nao relacionados for responsável por/ou representar um factor contributório para a predisposição em reiaçao a uma doença a ser investigada, o método de acordo com a presen te invenção será capaz de identificar esta.
Uma forma de realizaçao ao processo de acordo com a presente invenção compreende circularizar—se um fragmen to de ácido nucleico alvo que tem extremidades capazes de ii— gaçao uma à outra, contendo o fragmento de ácido nucleico alvo uma porção da sequência de nucleótidos conhecida, sendo es sa sequência ou porção de nucleótidos conhecida capaz de servir como região de primagem de iniciaçao para a hibridizaçao com o primário de iniciaçao, hibridizaçao de um primário de iniciaçao à referida região de iniciaçao de primagem e submeter—se o híbrido assim formado ao prolongamento do primário na presença de trifosfatos de nucleósido apropriados e de um agente de polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósido em con— dições de hibridizaçao. Por exemplo, dois primários de inicia aa a>a çao orientados em sentidos opostos um em relaÇao ao outro do sentido normal em PCR normal podem então ser usados para efe— ctuar a amplificaçao
A este respeito, a circuiarizaçao do fragmento do ácido nucleico alvo pode considerar—se como a preparaçao da unidade de ácido nucleico alvo fragmento/vectorete por ligaçao e, assim, por exemplo, pode realizar—se o prolongamen to do primário com base no fragmento de ácido nucleico alvo circularizado como placa-padrao. Caso assim se pretenda, no entanto, o fragmento de ácido nucleico alvo circularizado pode ser clivado e realizado o prolongamento do primário no pro duto de clivagem como padrao, como se descreve em Nucleic Acids Research, Vol. l6, página 8l86, 1988, que foi publicada depois do Pedido de patente Britânica UK Numero 88l8O2O.3 depositado pelos requerentes, cuja propriedade se reivindica de acordo com a Convenção de Paris.
Além disso, se assim se pretender, o produto da clivagem pode ser usado para preparar uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete por ligaçao e prolonga mento do primário de iniciaçao realizado com base na unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete assim obtido co mo placa modelo.
Todas estas formas de realizaçao se consideram incluídas no âmbito da presente invenção.
Assim, por exemplo, o fragmento de ácido nucleico alvo circularizado formado pode ser clivado para se ob ter um produto de clivagem que contém, pelo menos, uma parte da sequência de nucleótidos conhecida, sendo a referida porção capaz de servir como região de primagem de iniciaçao para a hibridizaçao coo um primário de iniciaçao, caso em que, por exemplo, o fragmento de ácido nucleico alvo circularizado pode ser clivado dentro da região da sequência de nucleótidos conhecida para formar uma molécula linear que tem uma sequência conhecida na sua sequência desconhecida que flanqueia os terminais} ele pode ser clivado numa extremidade de uma sequên
ί cia de nucleótidos conhecidos para formar uma molécula linear que tem uma sequencia de nucleótidos conhecida numa extremida de e um modelo de sítios de clivagem conhecida na outra extre midade que a tornam capaz de ligaçao a uma vectoretej o, mais preferivelmente, pode ser clivado fora da sequência de nucleó tidos conhecida para formar uma molécula linear que contêm a sequência conhecida de nucleótidos e que tem um modelo conhecido de sítios de clivagem em, pelo menos, uma extremidade, normalmente em ambas as extremidades, o que permite que a extremidade ou extremidades sejam ligadas para formar uma unida de de fragmento do ácido nucleico alvo/vectorete. Assim uma forma de realizaçao preferida da presente invenção compreende a operaÇao de circularizaçao de um fragmento de acido nucleico alvo tendo extremidades capazes de ligaçao uma à outra, con tendo o fragmento de ácido nucleico alvo uma porção que ê capaz de servir como região de clivagem de iniciaçao para hibri dLzaçao com um primário de iniciaçaoj a operaçao.de clivagem do fragmento de ácido nucleico alvo circularizado fora da sequência de nucleótidos conhecida para formar uma molécula linear que contêm a sequência de nucleótidos conhecida e queten um modelo de sítios de clivagem conhecido em pelo menos uma ; extremidade para ligaçao a fim de formar uma unidade de fragímento de ácido nucleico alvo/vectoretej a operaçao de formaçao da mencionada unidade de fragmento de ácido nucleico ai— vo/vectoréte por ligaçao e tratamento da unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, simultânea ou sequencialmen te, com trifosfatos de nucieósido apropriados e com um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleosido sob as con dições de hibridizaçao.
Esta forma de realizaçao preferida da presente invenção ê de interesse em relaçao com fragmentos de ácidos nucleicos alvo circularizados com, por exemplo, pelo menos 1 kb até cerca de 20 kb, mas ê de particular interesse em relaçao a fragmentos de acido nucleico alvo circularizados de maiores dimensões por exemplo, com 20 kb até cerca de 120 kb tais como fragmentos de ácido nucleico alvo circularizados com
cerca de 100 kb.
limite superior do tamanho depende de consi deraçoes de ordem prática e, assim, baseia-se no tamanho máxi mo de fragmentos de ácido nucleico alvo que podem ser circula ri za do s.
— f
Essa cLrcularizaçao pode efectuar—se por técnicas conhecidas ( F. S. Collins (1988), Genome Analysis - Λ praticai approach (Editor K. Davies), páginas 73 - 94, IRL Pu blishers, Owford), por exemplo, efectuando a ligaçao a baixa concentração. Esta forma de realizaçao preferida pode assim efectuar—se por digestão, por exemplo, de ADN genómico com uma enzima de restrição, preferivelmente uma enzima de restri çao que corta relativamente pouco frequentemente, (por exemplo, fragmento médio com o tamanho de 10 — 20 kb) como, por «w exemplo, Xbal ou BamHI. Os fragmentos podem então ser autoligados para formar círculos. Os círculos podem então ser corta dos com uma enzima de restrição, preferivelmente uma enzima de restrição que corte frequentemente (por exemplo, Hinfl) e os fragmentos ligados a um correspondente vectorete (po exemplo, Hinfl). Assim, por exemplo, se está disponível uma sequência adjacente a um sítio de Xbal conhecido, a sequência adjacente ao sítio mais próximo, possivelmente distante, de Xbal, pode obter—se por análise do produto do vectorete. Desta maneira, pode fazer—se uma série de saltos que proporcionam pontos de partida adicionais para o método.
Apreciar-se—á que a capacidade para fazer es— ses saltos representa uma vantagem considerável em relaçao as técnicas de PCR como se descreveu previamente, na medida em que pode ser possível obter produtos de vectoretes amplificados, com uma distancia considerável a partir do sítio do primario de iniciaçao. Assim, o método nao e limitado pela dificuldade encontrada na utilizaÇao de rotina em se obterem produtos por PCR usuais com mais do que cerca de 5 kb.
ser
A fim de que a presente invenção possa Umais completamente compreendida, ela é descrita seguidamente na presente memória descritiva, a título de exemplo, com refe rência aos desenhos anexos, nos quais:
! A Figura 1 (a) representa esquematicamente um ; ácido nucleico alvo de dupla cadeiaj a Figura i (b) ilustra o ί
ácido nucleico alvo restringido; a Figura 1 (c) representa as unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/ vectorete obti— ! das por ligaçao dos fragmentos de restrição do ácido nucleico alvo com vectoretej a Figura i (d) representa a hibridizaÇao de (i) o primário de iniciaçao e (ii) o primário de vectorete com as unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectore1 te.
A Figura 2 representa uma forma de realizaçao da presente invençaoj a Figura 2 (a) reproduz uma visualiza— ! ça® dos fragmentos de restrição obtidos por digestão parcial de ADN genómico e submetido a electroforese em gelj a Figura 2 (b) representa um esquema da mistura de diferente tipos de fragmentos de elevado peso molecular de tamanho escolhido pa— í' ra posterior processamento; a Figura 2 (c) representa a mistu ra de produtos obtiçlos a seguir à ligaçao para formar unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete.
j
A Figura 3 representa uma forma de realizaçao da presente invenção que procura aumentar a concentração rela tiva dos fragmentos de restrição capazes de se hibridizarem com o primário de iniciaçao.
A Figura 4 representa uma outra forma de realizaçao da presente invenção que evita a utilização da nuclea I se Sl e que procura aumentar a concentração relativa de frag— mentos de restrição capazes de se hibridizarem tanto com o primário de iniciaçao como com o primário do vectorete; a Figura 4 (a) representa a mistura de produtos que podem ser obtidos a seguir ao tratamento dos fragmentos de restrição pro—
A* A duzidos por completa digestão da sequencia de ADN alvo de interesse com vectorete de bloqueio, na presença de ADN ligase;
a Figura 4 (b) representa um vectorete de bloqueio para utili zaçao na presente invenção depois da digestão cotn enzima de restrição EcoRI, a Figura 4 (c) esquematiza os produtos obtidos por digestão completa da mistura dos produtos representados na Figura 4 (a).
A Figura 5 representa duas porçoes diferentes de vectoretes para utilização no método de acordo com a presente invenção. A porção do vectorete (i) ê um vectorete de cadeia dupla de bloqueio que tem uma cadeia de topo (5') curta, tendo um grupo terminal 3’ capaz de bloquear a polimeriza çao e uma cadeia inferior (3* ) que forma uma cauda, sendo o grupo terminal 3' da cadeia de topo (') capaz de bloquear a polimerizaçao na presença de trifosfatos de nucleósido e de um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos da nucleósido, sob as condiçoes de hibridizaçao. A porção do vectorete (ii) tem uma cadeia dupla mas que tem um grau de nao complementari dade entre as duas cadeias.
A Figura 6 ê uma representação esquemática da aplicaçao da presente invenção as porçoes de vectorete da Figura 5·
A Figura 7 é uma representação esquemática do uso de bibliotecas de vectoretes.
A Figura 8 mostra a aplicaçao esquemática da presente invenção à amplificaÇao de fragmentos de ácido nucleico alvo circularizados.
A Figura 9 mostra a amplificaÇao de parte do gene de antitripsina 0(-l usando oiigonucleótidos 5θ a 6l (Fase 6 do método i) e uma unidade de vectorete/biblioteca Xbal.
A Figura 10 mostra o mapa de restrição do plaí mídio B3 (pUC8 com um inserto de 440 bp no sítio de EcoRI).
As Figuras (i) e (ii) representam fotografias
de um gel de agarose que mostram os fragmentos amplificados obtidos nos Exemplos 1, 5 θ 7·
A Figura 12 representa uma sequência do exao 9 do gene de feniIalanina—hidroxila se de flanqueamento e as posiçoes relativas de ligaçao para os oligonucleótidos 58, 63 66 e 59.
A Figura 13 mostra uma parte de uma fotografia de um gel de agarose que revela o produto amplificado obtido de acordo com o Exemplo 8.
A Figura l4 mostra uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos de amplificaçao obtidos de acordo com o Exemplo 9A Figura 15 mostra uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos de amplificaçao obtidos de acordo com o Exemplo 10.
A Figura l6 mostra uma fotografia de um gel ta de agarose que revela os produtos de amplificaçao obtidos de acordo com o Exemplo 11.
A Figura 17 mostra uma fotografia de um gel ta de agarose que revela os produtos de amplificaçao obtidos de acordo com o Exemplo 12.
A Figura l8 mostra uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 13·
A Figura 19 mostra uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 14.
A Figura 20 representa uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos amplificados obtidos
de acordo com o Exemplo 15·
A Figura 21 mostra uma auto—radiografia de um gel de sequenciamento que mostra a sequência de produtos gera dos no Exemplo l6.
A Figura 22 mostra a sequência de dados de nu cleótidos ferados a partir dos produtos descritos no Exemplo 16.
Μ M
A Figura 23 mostra uma secção do exao 1 que flanqueia o gene de fenilalanina—hidroxiia se 1 e indica as po siçces relativas dos oligonucieótidos 58, 62 e 67, assim como o sítio de restrição de EcoRI usado na construção da unidade de vectorete.
A Figura 24 (a) é uma fotografia de um gel de agarose que mostra o produto de amplificaçao primário obtido de acordo com o Exemplo 17} a Figura 24 (b) é uma fotografia de um gel de agarose que mostra os produtos de amplificaçao secundários obtidos de acordo com o Exemplo 17·
A Figura 25 mostra os dados da sequência de nucleótidos gerados a partir dos produtos descritos ni Exemplo 17} a Figura 25 (a) mostra a sequência lida com o oligonu cleótido 62 (como se define na presente memória descritiva, mais adiante)} a Figura 25 (b) mostra a sequência lida com o oligonucleótido 67 (como se define mais adiante, na presente memória descritiva)} a Figura 25 (c) mostra a sequência global lida com os oligonucleótidos 62 a 67.
A Figura 26 mostra uma secção do exao V de flanqueamento do gene de antitripsina OQ-1 e representa as posições relativas dos oligonucieótidos 58, 6θ, 68, 69 e 7θ> as sim como o sítio de restrição de EcoRI para têmpera e ligaçao do vectorete.
A Figura 27 (a) é uma fotografia de um gel de agarose que mostra o produto da amplificaçao primária obtido
de acordo com o Exemplo 18; a Figura 27 (b ) ê uma fotografia de um gel de agarose que mostra o produto da amplificaçao secundária obtido de acordo com o Exemplo 18 i a Figura 27 (c) ê uma auto-radiografia de um filtro de nylon, manchado como gel representado na Figura 27 (b) e ensaiado com uma amostra de antitripsina (X—1.
A Figura 28 mostra a sequência de nucleotidos de D5» um fragmento anínimo do cromossoma 7 do genoma humano, indicando a posição relativa dos oligonucleotidos 71 e 72.
A Figura 29 representa um mapa de restrição de região que contem D5· A posição relativa dos oligonucleotidos 71 e 72 ê indicada. As posiçoes dos produtos sintetizados de acordo cora o Exemplo 19 sao também representadas.
A Figura 30 ê uma fotografia de um gel de aga rose que mostra os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 19·
A Figura 31 mostra a sequência de nucleotidos gerados a partir do produto de Bcl 1 obtido como se descreveu no Exemplo 19· A posição dos sítios de HindíII e HaelII previstos a partir dos digestos de enzima de restrição é indica— da. A posição do oligonucleotido 73 que podia ser usado como primário de iniciaçao nos sítios subsequentes de amplificaçao da unidade de vectorete ê também indicada.
A Figura 32 ê uma fotografia de um gel de aga rose que mostra os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 20.
obtida a partir no Exemplo 20.
rose que mostra
A Figura 33 do produto
A Figura 3^ ê os fragmentos mostra a de EcoRI sequencia obtido como uma fotografia de obtidos depois da de nucleotidos se descreveu um gel de aga digestão com
enzimas de restrição do produto de EcoRI obtido como se descreveu no Exemplo 20.
A Figura 35 θ uma fotografia de um gel de aga rose que mostra os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 21.
A Figura 36 (a) representa um mapa de restrição de uma secção de uma biblioteca de Hindlll/vectorete de cosmídio, indicando a posição de oligonucleótidos 5θ» 76 e 77; a Figura 36 (b) mostra uma fotografia de um gel de agarose que mostra os produtos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 22.
A Figura 37 (a) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN genómico alvo ligado a um vectorete de EcoRI. As posiçoes dos oligonucleótidos 27, 76, 7θ θ 79 sao também indicadas} a Figura 37 (b) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN genomico alvo ligado a um vectorete de EcoRI. Indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 78, 79 e 81} a Figura 37 (c) mostra um segmento do exao 9 do gene de fenilaiamina—hidroxila se ligado a um vectorete de Eco RI. Indicam-se as posiçoes dos oligonucleótidos 63 a 79} a Fi gura 37 (d) representa um mapa de restrição do segmento do ADN genómico alvo (descrito em 37 (c/, acima), ligado a um ve ctorete de EcoRI modificado. Indicam—se as posiçoes dos oligo nucleótidos 76, 79» θθ e 8l} a Figura 37 (e) representa um ma pa de restrição de ADN genómico alvo (descrito em 37 (b), aci ma) ligado a um vectorete de EcoRI modificado. Indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 79» 80, 8l e 84} a Figura 37 (f) representa um segmento do exao 9 do gene de fenilalamina—hi— droxilase ligado a um vectorete de EcoRI modificado. Indicam— -se as posiçoes dos oligonucleótidos 63» 79, 8θ e 8l} a Figura 37 (g) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN genómico alvo ligado a um vectorete de Hindlll modificado. Indicam—se as posiçoes dos oligonucleotidos 76, 7° e 79} a Fi gura 37 (h) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN genómico aivo ligado a um vectorete de HinlIII modificado.
Indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 76, 79, 8l e 82, a Figura 37 (i) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN genómico alvo Ixgado a um vectorete de HindIII modi ficado. Indicam-se as posiçoes dos oligonucleotidos 76, 79,
8l e 83.
A Figura de agarose que revela os os Exemplos 23 (a), (b), mostra uma fotografia produtos amplificados de (c), (d), (e), (f), (g), de um gel acordo com (h ) e ( i ).
A Figura 39 (a) representa um mapa de restrição da sequência de ADN genómico alvo que contém o sítio poli mórfico Pstl detectado pela amostra KM19· 0 sítio polimôrfico
Pstl ê indicado com um asterisco. A Figura 39 (b) representa a formaçao de produtos circulares por ligaçao de fragmentos de ADN genómico alvo clivado com Pstl. A Figura 39 (c) representa a construção de bibliotecas de unidades de vectorete HindIII por ligaçao de oligonucleótidos a círculos de Pstl clivados por HindIII.
A Figura 40 mostra uma fotografia de um gel de agarose que revela os produtos amplificados obtidos de acor do com o Exemplo 24.
A Figura 1 (a) representa esquematicamente um ácido nucleico alvo de cadeia dupla com, por exemplo, 100 kb ou mais, cuja sequência ê desconhecida excepto relativamente aos nucleótidos 5’ iniciais representados a tracejado, por exem pio com cerca de 20 nucleótidos. Mostra—se um sítio de interesse, X, da sequência desconhecida a uma distancia desconhecida da extremidade 5'· θ ácido nucleico alvo é submetido a restrição (veja—se Figura 1 (b)) usando um cortador de 6 bp, tal como EcoRI, que se espera ligue um ácido nucleico, em média, em cada 4096 bp.
A sequência de reconhecimento para EcoRI ê
Y
GAATTC, sendo o ponto de clivagem indicado pela seta. Por con
sequência, EcoRI cliva o ácido nucleico alvo para se obterem extremidades coesivas. A extremidade coesiva dos fragmentos de resrriçao do ácido nucleico alvo sao então ligadas a um ve ctorete apropriado, como se mostra na Figura 1 (c), em que o vectorete ê tracejado. 0 vectorete pode ser uma sequência qual quer conveniente de nucleótidos, como se descreveu acima, mas tem, na sua extremidade 5’, uro modelo de sequência de nucleótidos que e consistente com a garantia da ligaçao com as extremidades coesivas dos fragmentos de restrição acima referidos. Assim, se se utiliza EcoRI como endonuclease de restrição, a extremidade 3' dos fragmentos de restrição e a extremi dade 5’ do vectorete têm as seguintes sequências:
Fragmentos de a* restrição
5' — G
3’ - CTTAA
AATTC - 3' G - 5'
Vectorete
Preferivelmente, aquela porção do modelo de re conhecimento da endonuclease de restrição que nao toma parte na ligaçao é alterada no vectorete para destruir o modelo de reconhecimento. Assim, qualquer endonuclease de restrição pre sente com a finalidade de clivagem do ácido nucleico alvo é incapaz de clivar as unidades de fragmentos de restriçao/vec— torete que se tenham formado. Quando a endonuclease de restri çao usada e RcoRI, então a extremidade terminal 5' do vectore te é preferivelmente
5' AATTA 3' ou 5'AATTT 3' ou 5' AATTG 3' C sendo a porção €G do modelo de reconhecimento modificada para AT ou sendo CG transposto para o modelo de reconhecimento com EcoRI.
** .
As unidades de fragmento de restriçao/vectore ** ** A te sao então tratadas conjuntamente ou, de preferencia, sequencialmente (com o primário de iniciaçao adicionado primeiramente) com primário de iniciaçao e com primário de vectore— te sob condiçoes de hibridizaçao (veja—se Figura 1 (d)).O pri mário de iniciaçao será apenas capaz de se hibridizar com aque
la parte de um fragmento de restrição alvo contendo uma sequen cia conhecida (ver Figura 1 (d) (i)).
primário do vectorete é concebodo para se hibridizar com a cadeia do ácido nucleico que ê formada por prolongamento do primário de iniciaçao (e como se mostra na l| Figura 1 (d), a cadeia do ácido nucleico que é complementar da cadeia do ácido nucleico com a qual o primário de iniciaçao á capaz de se hibridizar). 0 primário do vectorete hibri— diza—se com a região de primagem do vectorete de qualqer unidade de fragmento de restriÇao/vectorete presente (veja—se Fi gura 1 (d) (ii)), mas na presença de trifosfatos de nucleósido apropriados e de um agente para a polimerizaçao dos trifos fatos de nucleósido, a amplificaçao só tem lugar em relaçao à unidade de fragmento de restriçao/vectorete com a quai o primário de iniciaçao foi hibridizado então prolongado.
Aprecia—se que, preferivelmente, a hibridizaÇao (ii) só ocorrerá em utilização depois da hubridizaçao (i), prolongamento em presença de trifosfatos de nucleósido e de um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósido e subsequente desnaturaçao.
Isto evita uma situaçao evidente da Figura 1 (d), em que o primário do vectorete (ii) ê visto que se hibri diza e, por consequência, ê capaz de formar um produto de pro longamento com cada unidade de fragmento de ácido nucleico al vo/vectorete presente na mistura complexa- Ê assim preferível tratar e escorvar a unidade de vectorete primeiro com o primá rio de iniciaçao e, em seguida, depois das operaÇoes pormenorizadas acima descritas, adicionar o primário do vectorete.
Ê possível, portanto, identificar o fragmento alvo amplificado e, caso assim se pretenda, sequenciar o fragmento completo, por exemplo, pelas técnicas acima descritas. Caso se pretenda, no entanto, apenas a extremidade 3’ do fra— gmento de restrição alvo amplificado necessita de ser sequen55
ciada, de modo que se pode conceber um novo primário de iniciaçao. Este novo primário de iniciaçao pode então obter-se digerindo o ácido nucleico alvo com uma endonuclease de restrição diferente, preferivelmente também um cortador de 6 bp e o método da presente invenção repetido.
Desta maneira, pode sequenciar—se um —acido nucleico alvo a partir da extremidade 5' sem necessidade de clonagem e com o snntido do sequenciamento constante e consis tentemente prosseguindo no sentido 5’ para 3’· Repetindo o mê todo de acordo com a presente invenção, ê possível, portanto, atingir rapidamente e sequenciar o sítio acima mencionado, X, de interesse.
A Figura 2 ilustra uma forma de realizaçao da presente invenção. A sequência de ADN de interesse é submeti—
I i da a digestão parcial, por exemplo com EcoRI e os fragmentos | de restrição assim obtidos submetidos a electroforese em gel, como se mostra na Figura 2 (a).
A electroforese prossegue no sentido indicado í peia seta e, assim, fragmentos de restrição de elevado peso molecular aparecem em direcção ao topo do gel, enquanto os fra ίί gmentos de restrição de menor peso molecular aparecem em dire cçao ao fundo do gel. 0 eixo X representa uma concentração crescente de enzima de restrição ou de ibcubaçao prolongada. Os fragmentos de restrição com um tamanho menor do que um tamanho pré—determinado, por exemplo 10 kb, sao rejeitados e os fragmentos de restrição de maior peso molecular sao tomados para a realizaçao da operaçao seguinte.
Estes fragmentos de restrição de maior peso molecular constituem uma mistura de fragmentos de digestão par ciai que se sobrepoem, como se representa na Figura 2 (b),sen do os sítios de restrição de uma extremidade do fragmento de restrição marcados (1—) ou, dentro do fragmento, marcados (v).
«M
Todos os fragmentos de restrição terão sido
cortados usando a mesma endonuclease de restrição simples, por exemplo EcoRI, e assim, cada fragmento terá unidades coesivas características da endonuclease de restrição empregada para efectuar a digestão. Só os fragmentos extremos 5' θ 3’ terão uma única extremidade coesiva, enquanto os restantes fragmentos têm duas destas extremidades coesivas. Um vectorete como se definiu anteriormente, na presente memória descritiva, em que a sequência de reconhecimento da endonuclease de restri— *» z ** çao foi destruída pode então ser misturado com os fragmentos de restrição alvo acima mencionados na presença de uma ligase para se obter uma mistura de produtos como é exemplificado na Figura 2 (c), sendo o vectorete represnntado dentro de uma cai xa terminal.
Aprecia—se que a presença de ligase permite nao só a ligaçao dos fragmentos de restrição alvo com o vecto irete a ser efectuada mas também permite a ligaçao dos fragmen tos de restrição alvo uns aos outros. Será apreciado, por con ! sequência, que sob as condiçoes de ligaçao da Figura 2, nao seja improvável que os segmentos A e B nas unidades de fragmentos de ácido nucleico alvo/vectorete iniciais nao fiquem adjacentes no ácido nucleico genómico alvo original mas se te nham deslocado conjuntamente de maneira anómala durante a ii— gaçao. Os produtos de ligaçao sao então submetidos a digestão aa completa com a endonuclease de restrição empregada para efectuar a digestão parcial, por exemplo EcoRI.
Os produtos de digestão completa serão em geral fragmentos de restrição de alvo com cadeia dupla, tendo um vectorete ligado em cada extremidade do fragmento e tendo aa os fragmentos de restrição alvo um vectorete apenas numa extremidade do fragmento. Haverá uma populaçao de enquadramento de fragmentos de restrição alvo, por exemplo fragmentos A e B . . ** aa na Figura 2 (c) que nao terão um vectorete em nenhuma das suas extremidades. Os primeiros produtos constituirão uma proporção mínima da mistura total de produtos.
Por desnaturaçao, apenas uma pequena parte ves
tigial de unidades de vectorete do produto serão capazes de se hibridizsr com o primário de iniciaçao mas uma proporção muito substancial da mistura de produtos pode ser capaz de se hi bridizar com o primário do vectorete, a nao ser que se tenha levado a cabo uma substancial modificaÇao do vectorete, como se descreve mais adiante. A amplificaçao do fragmento de res triçao pretendido será possível, por consequência, mas a proporção substancial da biblioteca das unidades de vectorete ca paz de se hibridizar com o primário do vectorete pode resultar na necessidade de se usarem quantidades substanciais de ** primário do vectorete, do agente para polimerizaçao dos tri— fosfatos de nucleósido (por exemplo, Tac ADN polimerase) e dos trifosfatos de nucleósido propriamente ditos. Esta dificuldade pode ser obviada nalguma proporção mediante a utiliza çao de pequenas quantidades de material de partida mas seria vantajoso aumentar selectivamente a proporção relativa desuni dades de fragmentos de restrição alvo/vectorete capazes de se hibridizar com o primário de iniciaçao na mistura de produtos.
A racionalizaçao para a abordagem da construção de uma biblioteca de unidades de vectorete representada na Figura 2 é a seguinte. A digestão total de uma enzima de corte com 6 bp origina uma populaçao de fragmentos com um tamanho médio igual a 4 096 bp. A ligaçao de unidades de vectorete a esta populaçao (aproximadamente 10 fragmentos de ADN genómico humano total) seria de esperar que originasse muitos fragmentos com uma unidade de vectorete em cada extremidade. Muitos deles sao consideravelmente mais pequenos do que 4 096 bp atendendo a distribuição de Gauss de sítios de restrição. Em utilização, um primário de vectorete nestas circunstancias pode-actuar como os dois primários numa PCR corrente. Grandes quantidades de produtos de amplificaçao espúrios sao gerados bem assim como qualquer produto que resulta de um primário de iniciaçao. Na discussão efectuada anteriormente na presente memória descritiva fez—se referência a métodos em que a sínte se de produtos de amplificaçao de primário de vectorete depen de da síntese inicial de um produto de prolongamento do primá
rio de iniciaçao. Na forma de realizaçao representada na Figu ra 2) a própria unidade de vectorete pode hibridizar—se e ini ciar a cópia do primário de vectorete. 0 inconveniente acima mencionado de formaçao do produto de PCR a partir de fragmentos de ácido nucleico alvo com porçoes de vectorete em cada extremidade e evitado por uma operaçao de fraccionamento do tamanho de tal maneira que quaisquer construções da unidade de vectorete tenha os dois vectoretes idênticos separados por uma distância tal (por exemplo, maior do que 10 kb) que a PCR corrente ê tao ineficiente que nao se forma nenhuma quantidade significativa de produto.
A Figura 3 representa uma forma de realizaçao ta que procura aumentar a concentração relativa de fragmentos de restrição capazes de se hibridizarem com o primário de inicia Çao no produto das unidades de vectorete obtidas como se descreveu acima em relaçao com a Figura 2. Na Figura 3(s), (i) θ um fragmento de restrição que contém uma região de primagem de iniciaçao (i) e tem uma porção de vectorete (tracejada) (2)i (ii) é um fragmento de restrição que tem uma porção de vectorete (tracejada) (2) ligada em cada extremidade mas nao uma região de primagem de iniciaçao; (iii) ê um fragmento de restrição que nao tem região de primagem de iniciaçao mas tem uma única porção de vectorete (tracejada) (2). A este respeito, a mistura do produto é tratada, depois de desnaturaÇao (veja—se Figura 3b), apenas com primário de iniciaçao (3), na presença de um agente para a polimerização de trifosfatos de polimerização, tal como Taq ADN polimerase e trifosfatos de nucleósido. Nesta operaçao, nao se emprega primário de vectorete. As unidades de fragmentos de restrição alvo/vectorete
Z ta at capazes de se hibridizarem com o primário de iniciaçao sao as sim selectivamente replicadas (veja—se Figura 3 (c)), nao sen do possível a replicação de fragmentos sem a necessária região ta de primagem de iniciaçao. A mistura de produtos assim obtida
Z ** z e então submetida a tratamento com uma endonuclease especifica de cadeia única tal como SI nuclease (veja-se Figura 3 (d)) Esta endonuclease rompe as ligações internas de fosfodiester
em DNA com uma única cadeia e assim obtém—se como resultado a produção de ADN de cadeia dupla com as extremidades abruptas. Este processo aumenta a concentração relativa das unidades de fragmento de restrição alvo/vectorete capazes de se hibridi— zar com o primário de iniciaçao sobre os fragmentos de fundo restantes. Além disso, se assim se pretender, esta fase do processo de desnaturaçao, que consiste no tratamento com primário de iniciaçao só na presença de um agente para a polime— rizaçao de trifosfatos de nucleósido e trifosfatos de nucleó— sido seguido por tratamento da mistura de produtos assim obti da com uma endonuclease específica de cadeia única tal como SI nuclease, pode ser repetido quantas vezes se pense serem desejáveis ou necessárias para aumentar a concentração relati va das unidades de fragmento de restrição alvo/vectorete capa zes de se hibridizar com o primário de iniciaçao. Quando a con centraçao dessas unidades/vectorete é considerada como sendo suficientemente elevada em relaçao com os fragmentos do fundo restantes, a mistura de produtos pode ser adicionalmente tratada com primário de vectorete para se efectuar a amplificaçao como se descreve nas Patentes de Invenção Norte-Americanas Números 4 683 195 θ 4 683 202.
Um inconveniente da técnica acima proposta é o facto de a SI nuclease tender a nao ser tao específica de cadeia única como seria desejável e, assim, também se pode de gradar algum ADN de cadeia dupla.
Alem disso, a amplificaçao linear nao seria apropriada em relaçao com a técnica da Figura 3 visto que só um ciclo único de prolongamento de primário de iniciaçao originaria ADN de cadeia dupla resistente a Sl—nuclease.
A Figura 4 representa uma outra forma de rea— iizaçao que evita o uso de Sl—nuclease e que procura aumentar a concentração relativa de fragmentos de restrição capazes de se hibridizar com o primário de iniciaçao na mistura de produ tos obtida por digestão completa com endonuclease de restri60 -
çao da sequência de ADN alvo de interesse. A vantagem desta forma de realizaçao reside no facto de nao ser necessário o fraccionamento dos fragmentos obtidos nem ser necessária a ele ctroforese etn gel como operaÇao inicial. A seguir à digestão completa da sequência de ADN de interesse com uma endonuclease de restrição tal como EcoRI, os fragmentos obtidos sao tra tados com um vectorete de bloqueio (como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) na presença de uma ADN— —iigase para se obter uma mistura completa de produtos como se representa na Figura 4(a). Aprecia—se que os fragmentos A e B nao fiquem necessariamente adjacentes na sequência de ADN original mas podem ter—se unido de maneira anómala na reacçao com ADN-ligase. 0 vectorete de bloqueio consiste numa sequência de oiigonucleótidos de cadeia dupla como se representa na Figura 4 (b) que tem uma primeira extremidade coesiva numa das suas extremidades adaptada para ligaçao às correspondentes ex tremidades coesivas dos fragmentos de restrição mas em que parte do sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição que nao toma parte na ligaçao é alterada no vectorete para des truir o sítio de reconhecimento, de tal maneira que uma vez que se tenha formado a unidade de fragmento de restrição vectorete, esta nao pode ser clivada pela endonuclease de restri Çao que originou es fragmentos de restrição. A outra extremidade do vectorete de bloqueio compreende uma extremidade que tem um resíduo de bloqueio que pode ser preferivelmente um 3’— —didesoxi—nucleósido tal como didesoxi—adenosina (ddA) ou qual quer outro resíduo 3' de tal modo que o prolongamento do primário nao pode realizar—se aí, por exemplo, um 3*—desoxi—nucleósido ou outra modificação química per se conhecida. A cadeia inferior sobrepoe—se com a cadeia superior como mostra a Figura 4 (b). Esta cadeia preferivelmente termina num resíduo nao fosforilado para evitar problemas de auto—ligaçao. A região (4) possui a mesma sequência que o primário de vectorete de tal maneira que o primário de vectorete ê capaz de se hi— bridizar com o produto de prolongamento de um primário de in» ciaçao mas nao com a cadeia superior improlongável do vectore te de bloqueio 3'—modificado. 0 vectorete de bloqueio é conve
6l 38B»a®BpsS
I nientemente preparado como duas cadeias separadas que sao sub sequentemente hibridizadas. A primeira e a segunda cadeias sao cada uma delas praradas separadamente, por exemplo manualmente, ou convenientemente usando um sintetizador de ADN, sendo a primeira cadeia 5’—fosforilada por meios químicos, convenientemente enzimaticamente, por exemplo mediante utilização de : polinucleótido—quina se e sendo convenientemente usada uma transferase terminal para introduzir um didesoxi—nucleótido 3’—terminai ou outros nucleótidos modificados. Como variante, é possível introduzir outros agrupamentos de bloqueio (por
I exemplo amino) quimicamente na extremidade 3' por métodos per se conhecidos. A primeira e a segunda cadeias assim prepara— das sao em seguida deixadas hibridizar-se para formar o vecto rete de bloqueio de cadeia dupla.
A mistura de produtos representados na Figura 4 (a) e obtida a seguir ao tratamento dos fragmentos de res— i triçao com vectorete de bloqueio na presença de uma ADN-iigase é submetida a digestão completa com a mesma endonuclease de restrição usada para criar os fragmentos de restrição antes da formaçao de unidades de fragmento de restriçao/vectore te de modo que se obtêm os tipos de produtos (i), (ii) e (iii) indicados na Figura 4 (c). Com o fim de se reduzir a concentração relativa de fragmentos de restrição (iii) presentes na mistura de unidades de fragmentos de restriçao/vectorete (i) e (ii ) , o ciclo acima mencionado pode ser repetido tantas vezes quantas as que se pense serem necessárias ou desejáveis para formar uma piscina de unidades de fragmentos de restriçao/vectorete por exemplo baseada na utilizaÇao da endonuclea se de restrição EcoRI.
A Figura 5 mostra em (i) um vectorete de bloqueio que compreende um oligonucleótido de topo com l4 bases e um oligonucleótido de fundo com 42 bases ligados em conjunto aom a parte saliente de quatro bases (uma saliência 5') com plementar das extremidades produzidas no ADN alvo clivado.
2 3 4 5 5' ~
Ν , Ν , Ν , Ν , Ν e Ν sao como se define ! na presente memória descritiva mais adiante na Tabela 1. A ex tremidade 3' do oligonucleótido de 14 bases é modificada (X) de tal maneira que o prolongamento 5'—>3' a partir daquela i extremidade nao se pode realizar usando qualquer das ADN—poli merases conhecidad, por exemplo fragmento de Klenow, T7 ADN— —polimerase (Sequenase) ou Taq ADN polimerase. Esta base modi i ficada pode ser um didesoxinucleótido (por exemplo cordicepina). 0 resíduo de açúcar 3' pode, caso se pretenda, ser modificado por qualquer método químico per se conhecido.
A base 3’ terminal do mero 42 do fundo e a ba j se complementar na posição 5 (a partir da extremidade 3’ ) no oligonucleótido do topo com 14 bases sao escolhidas de tal ma neira que, a seguir a ligaçao do vectorete de bloqueio para o ADN alvo clivado, o hexanucleótido resultante (na junção de i ligaçao) nao e reconhecido pela endonuclease de restrição uti lizada para clivar o ADN genómico originalmente. Isto é impor tante quando se garante que cada fragmento de ADN genómico cli vado tem um vectorete de bloqueio ligado nas suas extremidades. Obviamente, os produtos de ligaçao contêm fragmentos de ADN genómicos clivados, religados uns aos outros e estes sao digeridos de novo a fim de gerar extremidades de recepção para o vectorete de bloqueio numa segunda reacçao de ligaçao.
Este ciclo de restrição e de ligaçao pode pre cisar de ser repetido mais de uma vez, por exemplo três a qua tro vezes, para garantir que cada fragmento de ADN genómico clivado tenha um vectorete de bloqueio em qualquer das suas extremidades. Prefere—se que cada fragmento de ADN genómico clivado tenha um vectorete de bloqueio em cada uma das suas extremidades de modo a evitar a primagem aleatória de qualquer das extremidades 3' nao bloqueadas dos fragmentos de ADN genomico na mistura reaccional depois da desnaturaçao e do tra tamento com primário de iniciaçao.
vectorete de bloqueio representado na Figu—
Η ra 5 (i) é apropriado para o ADN genómico alvo com endonuclea ses de restrição que produzem partes suspensas 5'· Para as en donuclease de restrição que produzem uma suspensão 3’, o ve— ; ctorete de bloqueio terá de ser ligeiramente modificado. Assim, por exemplo, o o ligonucleótido superior de catorze bases tem de ser substituído por uma cadeia superior de dez bases (faltando a parte suspensa de quatro bases na extremidade 5') e a cadeia inferior de oiigonucleótidos de quarenta e duas ba ses podia ser substituída por uma cadeia inferior de quarenta e seis bases, ficando as quatro bases extra na extremidade 3' e sendo complementares das extremidades produzidas pela endonuclease de restrição usada para clivar o ADN genómico alvo.
A Figura 5 (ii) mostra uma porção de vectorete nao complementar que consiste em duas sequências de cadeia simples temperadas (um oligonucleótido de cinquenta e sete ba i ses e um oligonucleótido de cinquenta e três bases) que possui um grau de nao complementaridade tal que o prolongamento do primário do vectorete nao possa realizar—se imediatamente.
A discussão acima feita relativamente ao vectorete de bloqueio da Figura 5 (i) aplica—se exactamente da mesma maneira à porção de vectorete nao complementar com a excepção de que - a por | çao de vectorete nao complementar nao precisa de possuir quais quer nucleósidos modificados.
A Figura 6 mostra uma representação esquemáti ca da aplicaÇao dn presente invenção às porçoes de vectorete da Figura 5 (i)· 0 ADN genómico alvo é digerido completamente com uma endonuclease de restrição única para produzir fragmen
A/ tos como se mostra em (i). As porçoes de vectorete de bloqueio I (5 na Figura 5 (i)) sao ligadas nas extremidades do fragmento | (ii) de ADN alvo genómico clivado na presença de ADN-ligase. ί A amplificaçao realiza—se então depois da desnaturaçao usando os primários de sequência de nucleótidos conhecida x e na presença de, por exemplo, Taq—polimerase.
Assim, na Figura 6 (iii), x. representa o pri—
Α .
, mano ae iniciaçao e possui a mesma sequencia ou> pelo menos^
A *** substancialmente a mesma sequencia que a região marcada IP (primário de iniciaçao) na cadeia 1. x ê capaz de se hibridiI zar com uma região de primagem de iniciaçao (ΐΡΓι) na cadeia 2. A cadeia 2 que contém a região de primagem de iniciaçao (IPR) contêm também uma porção da sequência de nucleótidos que ê a mesma ou que ê, pelo menos, substancialmente a mesma que a se ’ quência de nucleótidos do primário de vectorete (VP). Em uti— lizaçao, o prolongamento primário de x origina uma cadeia que contém uma região de primagem do vectorete (VPR) apropriada para hibridação com o primário de vectorete (VP) representado pelo primário Como a cadeia 1 nao contêm uma região de pri magem de vectorete propriamente dita e nao pode ser submetida a prolongamento do primário por causa da presença do agrupamento de bloqueio da polimerizaçao e a cadeia 2 também nao tem região de primagem do vectorete, nenhum prolongamento do primário de um primário do vectorete pode realizar—se até que uma região de primagem do vectorete seja criada por prolongamento por primário do primário de iniciaçao.
Será, portanto, apreciado que, no primeiro ci cio de amplificaÇao, só o primário x possa produzir um produto de prolongamento que se estende até à extremidade do oligo nucleótido de quarenta e duas bases do vectorete de bloqueio (iii ). 0 p rimário é redundante no primeiro ciclo, visto que nao há sequência complementar para ele se hibridizar e produzir produtos de prolongamento. A sequência de primário —e exactamente a mesma que as bases 2 a 31 da estremidade 5' do oligonucleótido inferior de quarenta ê duas bases da Figura 5 (i) e as bases 13 a 42 inclusive do oligonucleótido inferior de 53 bases da Gigura 5 (ii)·
I
No segundo cicio e depois dele (v e vi), o pri mário pode hibri di zar—se com o produto do prolongamento do primário x. e a síntese complementar deste produto prolongado (iv) pode prosseguir. Assim, o primário nao pode hibridizar -se com qualquer dos produtos de ligaçao representados em (iii).
Ele pode apenas hibridizar—se com um produto essencialmente prolongado de maneira completa de primário x. Que θ a sequência de nucleótidos conhecida no sítio de interesse. Assim, só se produz um produto de amplificaçao que contém primário x, a sequência de nucleótidos desconhecida _z e o primário _y_. A sequência de nucleótidos de _z pode ser determinada a partir de ambas as extremidades usando o primário x e como primários de sequenamento. Como variante, podem preparar—se primários de sequenciamento aninhados x’ e . Estes conterão a sequência 3’ do primário x ou a sequência 3' do primário por exemplo as bases 25 a 42 a partir da extremidade 5' do oligonucleótido de quarenta e dois meros na Figura 5 (i)·
A Figura 6 mostra o método de acordo com a pre sente invenção por referência a uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, em que a porção de vectorete contêm uni agrupamento de bloqueio da polimerizaçao. Aplicam— -se considerações semelhantes quando a porção de vectorete com «M ** preende pelo menos uma região de nao complementaridade, como se descreveu anteriormente, na presente memória descritiva e como se ilustra, a título de exemplo, na Figura 5 (ii)·
Assim, a cadeia 1 possui a mesma sequência ou peio menos substancialmente a mesma sequência que a região IP marcada. Um primário de iniciaçao (IP) será capaz de se hibri dizar com a região de primagem de iniciaçao (IPR) na cadeia 2. A cadeia 2 que contêm a IPR também contêm uma porção da sequên cia de nucleótidos que ê a mesma ou pelo menos substancialmen te a mesma que a sequência de nucleótidos do primário de vectorete (VP), mas esta porção da cadeia 2 nao se hibridiza com a correspondente porção da cadeia 1 por causa do grau de nao complementaridade deliberadamente introduzida na cadeia 1.
Assim, o primário do vectorete (VP) nao pode hibridizar—se com a cadeia 1 visto que a cadeia 1 nao contêm região de primagem de vectorete (VPR) nem pode hibrizidar—se com a cadeia 2 porque a cadeia 2 contêm uma porção de sequên—
; cia que é a mesma oue VP, mas nao a sequência complementar ou í VPR. Assim, nennuns produtos de prolongamento do primário do
Ι- * ** jvectorete se podem formar ate que se tenha criado uma região I de primagem do vectorete (VPR) por prolongamento do primário do primário de iniciaçao. (IP).
processo acima descrito é então preferivel;! mente repetido usando uma endonuclease de restrição diferente | e vectoretes de bloqueio concebidos correspondentemente dife— | rentes para formar um grupo diferente de unidades de fragmento de restriçao/vectorete que constitui uma biblioteca diferente de vectoretes.
i Este processo pode repetir-se separadamente
I : para qualquer número pretendido de endonucleases de restrição | diferentes (por exemplo, dez a trinta, convenientemente, quin íze a vinte e cinco, vantajosamente cerca de vinte) e de vec— ι toretes de bloqueio correspondentemente concebidos para formar muitas bibliotecas diferentes de unidade de fragmento de restriçao/vedtorete.
As diferentes bibliotecas de unidades de fra— j gmento de restriçao/vectorete podem então ser misturadas para
I , l formar uma pluralidade de bibliotecas desses híbridos. A pluralidade de bibliotecas pode então ser tratada com primário de iniciaçao sob condiçoes de hibridizaÇao na presença de tri fosfatos de nucleósidos e de um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósido, como por exemplo Taq ADN—poli— merase. A adiçao do primário de vectorete em condiçoes apripriadas para a reacçao de cadeia de polimerase (PCR) como se descreve nas Patentes de Invenção Norte—Americanas Números 4 683 195 e 4 683 202 tem como resultado a amplificaçao apenas dos sítios de interesse a esses fragmentos amplificados podem ser submetidos a sequenciamento, permitindo assim que se conceba novo primário de iniciaçao e o processo acima mencionado pode repetir—se usando o novo primário de iniciaçao como ponto de partida para a amplificaçao e, caso se pretenda, o
sequenciamento de uma posterior região de interesse, sendo o procedimento repetido quando assim se pretenda.
A Figura 7 ilustra c que acima se refere,mostrando uma representação esquemática da utilização de bibliotecas de vectoretes. ADN gEnómico é digerido completamente com a endonuclease de restrição EcoRI. Porçoes de vectoretes com prolongamentos salientes de quatro bases complementares dos prolongamentos salientes de quatro bases produzidos por cliva gem com EcoRI sao ligadas nas extremidades de cada fragmento de ADN genómico clivado. Este conjunto e chamado uma bibliote ca de vectoreres de EcoRI. Bibliotecas semelhantes sao construídas usando, por exemplo, cerca de quinze a vinte endonu— cleases de restrição que reconhecem sequências de hexar.ucleótidos. Quando estas bibliotecas sao agrupadas e submetidas a amplificaçao, pode obter—se uma gama de produtos da PCR ou elas podem, mais preferivelmente, ser usadas individual e separada mente para produzir um único produto da PCR a partir de cada biblioteca.
A Figura 7 (a) mostra um mapa de restrição hi poíêtico para o lado 3' àe um sítio de interesse da sequência de nucleotidos conhecida (w). Mediante amplificaçao de biblio tecas de vectoretes agrupadas usando primários x e X» obtêm— se os produtos da PCR, Z, Z1, Z2, Z3 e Z4, representados em (b).
A electroforese destes produtos de PCR num gel de agarose produz o aspecto das bandas representado em (c), em que as reacções de PCR sao realizadas separadamente sobre cada biblioteca de vectoretes, de preferência, a uma pluralidade agrupada de bibliotecas.
produto da PCR maior visualizado no gel (nes te caso, Z4) pode ser purificado sobre o gel a sua sequência de nucleotidos da extremidade 3' determinada usando um oligótnero ou um oligómero aninhado como primário de sequen— ciamento. Esta sequência de nucleótidos na extremidade 3' de
Ζ4 podia então servir ou ser usada para a síntese de um novo primário de iniciaçao x. em posteriores operaçoes de deslocamento usando este método.
h A Figura 8 mostra a aplicaçao esquemática da
U «w presente invenção a PCR inversa, PCR inversa que foi ná pouco !tempo descrita por T. Triglia e col., Nucleic Acids Pesearch, - Vol. ib, 1988, página 8l86 e por H. Ochman e col. , Genetics ί 120, 621 — 623 (Novembro de 19θ8).
ADN genómico é digerido com uma enzima de restrição que, preferivelmente, corta de maneira relativamente pouco frequente (por exemplo, tamanho médio dos fragmentos
- 20 kb), como, por exemplo, Xbal, Kpnl e BamHI. Os frag** **>* z mentos a baixa concentração sao autoligados para formar círculos. Os círculos sao então cortados com uma enzima de restrição que, preferivelmente, corta frequentemente (tal como, i Hinfl) e os fragmentos sao ligados com um correspondente vectorete, por exemplo, um vectorete Hinfl.
Assim, por exemplo, se se dispuser de uma se;quência adjacente a um sítio Xba conhecido, a sequência adja— j cente ao próximo sítio Xba pode ser obtida por análise do pro J duto da unidade de vectorete. Desta maneira, pode fazer—se uma j série de saltos proporcionando pontos de partida adicionais z ** para o método de acordo com a presente invenção.
Enquanto um tamanho médio de fragmentos de 10 — 20 kb é referido acima a título de exemplo, seria preferível clivar o ácido nucleico alvo de maneira a originar fragmentos mesmo maiores, por exemplo com cerca de 100 kb. Esses fragmentos podem obter—se, por exemplo por utilização de enzi mas de restrição que cortam o ADN genómico muito pouco frequentemente, tais como Notl, BssHII e Sall.
A Figura 11 (i) ê uma fotografia de um gel de agarsse que mostra nas pistas 1 e 11 o marcador 0x174 clivado
com HaelII, na pista 12 o marcador À-/Hind±II , na pista 2 o controlo da PCR e na pista 9 o fragmento amplificado obtido usando o ligonucleóridos 5θ θ 6l no Exemplo 1 e como se mostra h na Figura 9·
Η !ί A Figura 11 (ii) representa a porção superior í de uma fotografia de um gel de agarose que mostra o marcador i λ/Hi ndlll nas pistas 1 e 13» o marcador 0x174 clivado com i HaelII, nas pistas 2 e 12, um controlo da PCR na pista 3 ® θ í fragmento amplificado obtido usando oligonucleótidos 58 a 6l no Exemplo 1 (veja—se Figura 9) na pista 10.
! A Figura 11 (iii) é a porção inferior de uma fotografia de um gel de agarose que mostra o marcador λ/Hind— i III nas pistas 1 e 11, o marcador 0x174 clivado com HaelII na acordo com o Exem— amplificado obtido e 10.
ί pista b, o fragmento amplificado obtido de ! pio 5 nas pistas 2, 3» 4 e 5 θ o fragmento de acordo com o Exemplo 7 nas pistas 7, 8,
As restantes Figuras sao discutidas pormenori zadamente nos Exemplos mais abaixo referidos na presente memó ria descritiva.
A presente invenção é agora ilustrada, mas nao limitada, por referência aos seguintes métodos e Exemplos, em que se usaram os seguintes oligo—desoxi-nucleótidos abaixo por menorizados, sendo cada sequência de nucleótidos referi de'lida no sentido convencional 5' 3’·
Oligonucleótjdo do Tipo A (um conjunto de oligonucleôtidos com o comprimento de catorze bases com quatro ou cinco bases terminais na extremidade 5’ » variando na sequência e, assim, apropriados para utilizar com saliências 5'· As bases da extremidade 4 representam a suspensão 5', enquanto a quinta base da extremidade está presente para destruir o sítio de reco ίnhecimento da enzima de restrição).
Especificamente usaram-se:
^BR3?93B%sr
Oligonucleótido 1
CTAGGAAGGAGAGG (para utilização com ADN digerido com as endonucleases de res triçao Xbal ou Nhel ou Spel).
Oligonucleótido 2
AATTGAAGGAGAGG *>* (para utilização com ADN digerido com a endonuclease de restrição EcoRI).
ι Oligonucleótido 3
I
I
GATCGAAGGAGAGG i ~ [ (para utilizaÇao com ADN digerido com as endonucleases de res ί triçao BamHI ou BglII ou XhoII ou Bell).
Oligonucleótido 4 í AGCTGAAGGAGAGG (Para utilização com ADN clivado com a endonuclease de restri çao Hindlll).
Oligonucleótido 5
TCGAGAAGGAGAGG . ** (para utilização com ADN clivado com a endonuclease de restri çao Sall).
Oligonuclease 6
CGCGGAAGGAGAGG (para utilizaÇao com ADN clivado com as endonucleases de restrição MluI ou BssHIl).
Oligonucleótido 7
GTACGAAGGAGAGG (para utilização com ADN clivado com a çao Asp7l8).
endonuciea se de restri
Oligonucleótido 8
TCGACAAGGAGAGG (para utilizaÇao com ADN clivado com a endonuclease de restrição Xhol ).
Oligonucleótjdo 9
CATGCAAGGAGAGG (para utilizaÇao com ADN clivado com a çao Ncol).
endonuclease de restri
Oligonucleótjdo 10
GGCCCAAGGAGAGG (para utilizaÇao com ADN clivado com as endonucieases de restrição Notl ou Eagl).
Oligonucleótido 11
CCGGTAAGGAGAGG *·» (para utilização com ADN clivado com as endonucleases de res— triçao Bspmll ou Xmal ou AccIII).
Oligonucleótido 12
CATGTAAGGAGAGG
A* (para utilizaÇao com ADN digerido com as endonucleases de res triçao BspHI ou Ncol).
Oligonucleótido 13
CTAGTAAGGAGAGG
(para utilização com ADN digerido com as endonucleases de res triçao Avrll, Nhel ou Xbal),
Oligonucleótido do Tipo B (conjunto de oligonucleótidos com o comprimento de quarenta e duas bases, com a base da extremi dade 3' variando em sequência, sendo os oligonucleótidos apro priados para utilizaÇao com saliências 5')·
Especificamente utilizaram-se.’
0ligonucleótido l4
CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTC
Este o ligonucieótido destina—se a ser usado com os oligonucleótidos 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7·
Oligonucleótido 15
CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTG (A sequência de nucleótidos é a mesma que a sequência i4, com excepçao de o resíduo C terminai 3’ ser substituído por G). Este oligonucleótido destina—se a ser usado com os oligonucle ôtidos 8, 9 e 10.
Oligonucleótido ió
CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTT (A sequência de nucleótidos ê a mesma que a l4, com a diferen ça de o resíduo C terminal 3' ser substituído por T).
Oligonucleótido 17
CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCTGTCCTCTCCTTA (A sequência de nucleótidos é a mesma que a sequência l4, com a excepçao de o resíduo C terminal 3* ser substituído por A).
TJWIL—. tl AB ijt·
| Este oligonucleótido destina—se a ser usado com os oligonucle lótidos 11, 12, 13 e l8 (dei inidos na presente memória descri— j tiva mais adiante).
j Oligonucleótido 18 (dez meros)
TAAGGAGAGG oligonucleótido l8 e temperado com o oiigo— nucleótico 1?. Eles sao concebidos para utilizaÇao com uma ; unidade de vectorete com ADN digerido com uma endonuclease de ί restrição de criar estremidades embotadas.
!
ί
Os oligonucleótidos 19 e os oligonucleótidos x ** ** ; da serie do tipo C sao apropriados para usar com suspensões 3' ί Oligonucleótido 19 (dez meros) | 5'- ΑΑΛ GGA GAG G-3' ι
| Este oligonucleótido é concebido para utiliza çao com os oligonucleótidos 20 a 25, como se define mais adian ί te na presente memória descritiva.
I
Oligonucleótido do Tipo C (um conjunto de oligonucleótidos com quarenta e seis bases de comprimento)
Oligonucleótido 20 í 5'—CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT TGC A-3' (para utilizaÇao com ADN digerido com as endonucleases de res triçao Nsil ou Pstl).
i
Oligonucleótido 21
5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT AGC T-3'
!: (para utilização com ADN digerido com as endonuc lea se s de res trição SstI ou Saci).
i [i Oligonucleótido 22 i 5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT
I j CAT G-3' i
I; (para utilização com ADN digerido com a endonuclease de res— ; triçao Sphl).
’ Oligonucleótido 23 f
[ 5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT GTA C-3' ( (para utilização com ADN digerido com a endonuclease de restrição Kpnl).
í;
íl Oligonucleótido 24
P-p p 5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT j ACG T-3' (para utilização com ADN digerido com a endonulease de restri Çao Aatll).
I
Oligonucleótido 25
5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTT GGC C-3' (para utilização com ADN digerido com a endonuclease de restrição Apal ).
i
Oligonucleótidos do Tipo D
Este conjunto é um conjunto de oligonucleóti— dos com o comprimento de cinquenta e sete bases, com quatro ou cinco bases na extremidade 5' variando na sequência.
I 1 j ¢.
i do 26
J í I !( CTAGGAAGGAGAGGACGCTGTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAAGGGAGAG (para ser utilizado com o oligonucleótido 40 (como definido mais adiante na presente memória descritiva) e com ADN digeri do com Xbal, Nhel ou Spel.
Ί
Oligonucleótido 27
5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA ! GGA GAG AAG GGA GAG-3' : Para ser utilizado com o oligonucleótido 40 e ADN clivado com 1 EcoRI.
I ! Oligonucleótido 28
5'—TCGAGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3'
Para ser utilizado com o oligonucleótido 40 e ADN clivado com j, Sail.
! Oligonucleótido 29 í 5'-CGC GGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA i GAG AAG GGA GAG-3'
Para ser utilizado com o oligonucleótido 40 e ADN clivado com BssHI ou MluI.
Oligonucleótido 3^
I 5'-AGC TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG— 3’
Bira ser usado com o oligonucleótido 40 e ADN clivado com Hind
III.
’ Oligonucleótido 31
5'-GAT CGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG GGA GAG AAG GGA GAG-3' AAG GTA AGG AAC GGA
Para ser usado com 0 oligonucleótido 40 BamHI, Bell ou BglII. e com ADN clivado com
Oligonucleótido 32
5'—CCG GGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG GGA GAG AAG GGA GAG AAG GTA AGG AAC GGA
Para ser usado com 0 oligonucleótido 4θ AcclII ou BspMII. e com ADN clivado com
Oligonucleótido 33
5'—TGC AGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG GGA GAG AAG GGA GAG—3' AAG GTA AGG AAC GGA
Para ser usado com 0 oligonucleótido 40 A p a LI. e com ADN clivado com
Oligonucleótido 3^
5'-TCG ATA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG GGA GAG AAG GGA GAG-3' AAG GTA AGG AAC GGA
Para ser usado com 0 oligonucleótido 4i XI10I. e com ADN clivado com
Oligonucleótido 35
5'-GGC CTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG—3'
Para ser usado com o oligonucleótido 4l e com ADN clivado com EagI ou Notl ou XmalII.
Oligonucleótido 36
: 5'-CCG GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA ! GGA GAG AAG GGA GAG-3' í
li Para ser usado com o oligonucleótido 4l e com ADN clivado com I Bspmll ou Xmal ou AcclII.
í ι
Oiigonucleórido 37
I ii 5’-CAT GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3' í Para ser usado com o oligonucleótido 4l e com ADN clivado com BspHI ou Ncol.
Oligonucleótido 38
5'-CTA GTA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA Íí GGA GAG AAG GGA GAG-3'
; Para ser usado com 0 oligonucleótido 4l e 1 Avrll, Nhel ou Xbal. com ADN cliva do com
j i Oligonucieórido 39
j 5X-TA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA
GAG AAG GGA GAG-3'
Para ser usado com 0 oligonucleótido 4l e com ADN clivado com
uma endonuclease de restrição capaz de criar extremidades em—
bota da s.
Oligonucleótjdos do Tipo E
Este é um conjunto de oligonucieôtidos com cin quenta e três bases de comprimento, com um resíduo terminal 3' variável.
Oligonucleótido 40
5'—CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG
-_^5LeJSSsiíS5Baa25^^^^^^-?=
TCC TCT CCT TC-3'
Para ser usado com os oligonucleótidos 26 a 33·
Oligonucleótido 4l
5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TA-3'
Para ser usado com os oIigonucleótidos 3^ a 39·
Oligonucleótidos do Tipo F
Esta série é constituída por oligonucleótidos com o comprimento de cinquenta e tres bases para utiiizaçao com o conjunto dos o ligonucleótidos do tipo G (43 a 48), como se define na presente memória descritiva mais adiante, e é pa ra utiiizaçao com suspensões 3'·
Oligonucleótido 42
5'—AAAGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA GAG AAG GGA GAG-3'
Oligonucleótjdos do Tipo G
Esta com o comprimento de na extremidade 3' que série é um conjunto de cinquenta e sete bases variam em sequência.
oligonucleótidos com quatro bases
Oligonucleótido 43
5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG TCC TCT CCT TTT GCA—3'
Para ser usado com o oligonucleótido 42 e com ADN clivado com PstI ou Nsil.
Oligonucleótido 44
5'-CTC TCC CTT TCC TCT CCT TTA CTC GAA TCG TAA CCG GCT-3' TTC GTA CGA GAA TCG CTG
i Para ser usado SstI ou Saci. com o oligonucieóti do 42 e con! ADN clivado com
Oligonucleótido 45
1 1 ; 5--ctc tcc CTT TCC TCT CCT TTC CTC GAA TCG TAA CCG ATG-3' TTC GTA CGA GAA TCG CTG
Para ser usado Sphí. í 1 com o oligonucleótido 42 e com ADN clivado com
Oligonucieórido 46
5'-CTC TCC CTT TCC TCT CCT TTG CTC GAA TCG TAA CCG TAC-3' TTC GTA CGA GAA TCG CTG
Para ser usado Kpnl. com o oligonucleót ido 42 e com ADN clivado com
Oligonucleótido 4?
5'-CTC TCC CTT TCC TCT CCT TTA CTC GAA TCG TAA CCG CGT-3' TTC GTA CGA GAA TCG CTG
Para ser usado com o oligonucleótido 42 e com ADN clivado com AatlI.
Oligonucleótido 48 i 5'-CTC TCC CTT CTC GAA TCG TAA CCG TTC GTA CGA GAA TCG CTG
I TCC TCT CCT TTG GCC-3' i
S
E i Para ser usado com o oligonucleótido 42 e com ADN clivado com Apal.
As endonucleases de restrição indicadas, destinam—se a ser utilizadas para clivar o ADN para utilização com o oligonucleótido particular ou com o par de oiigonucleó80 tidos particulares. Assim, o oligonucleótido 1 destina—se a : ser utilizado cotn, por exemplo, ABN genómico clivado com Nhel ou Spel ou XbaI.
partes ótido s
Todos os oligonucleótidos suspensas 5' (isto é, tipo A, D e 18, 19 e 39 sao, preferivelmente, para utilizar com F (42)) e oligonucle fo s for l la do s.
Oligonucleótidos 49 - 37 sao utilizados na construção de uni dades de vectorete alternativas.
Oligonucleótido 49
5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CTG TCG AAG GTA AGG AAC GGA GGA G-3'
01Lgonucleótido 50 i 5'-CGA ATC GTA ACC GTT CGT ACG AGA ATC GCT GTC CTC TCC TTC-3'
Oligonucleótido 5± j! 5'-AAT TGA AGG AGA GGA CGC TGT CAG AGG ACG GTT ACG AAC GTA ,! GGA CAG AAG GGA GAG-3' | Oligonucleótido 52
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Oligonucleótido 57
5'-ΑΛΤ TGA AGG AGA GGC AGA AGG GAG AG-3'
Unidades de Vectoretes Alternativos
O oligonucleótido 49 deve ser temperado com o oligonucleótido 50.
Os oligonucleótidos 51, 52 e 57 devem ser tem perados com o oligonucleótido 40.
O oligonucleótido 53 deve ser temperado com o o ligonuc1eótido 54 oligonucleótido 55 deve ser temperado com o oligonucleótido 5θ·
Estes o ligonucieóti dos seriam usados com AON genómico clivado com EcoI?I.
VECTORETTE UNITS
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Na Tabela 1, N , N , N e N representam quatro nucleótidos presentes para proporcionar extremidades coesivas capazes de ligaçao em um correspondenre sítio de restri çao num fragmento do ácido nucleico alvo. Os nucleótidos N^ e 5»
N sao deliberadamente escolhidos para destruir o modelo de reconhecimento do sítio de restrição. Assim, por exemplo;
N^N^N^N^N^ pode representar AATTG
em relaçao ao sítio de restrição com EcoRI, e
N^N^N^N^N^ pode representar AGCTG 5»
N? C em relaçao ao sitio de restrição com HindIII.
2 3 4 5 5'
Quando N , N , N , N , N e N representam o modelo de reconhecimento do sitio de restrição com EcoRI acima mencionado, as unidades de vectoretes específicas 1 — 10 sao pormenorizadas abaixo, na Tabela 2, sendo cada oligonucie ótido referido pelo seu número de identificação apropriado.
3
Nas unidades de vectorete 11 e 12, na Tabela 2, N , N , N ,
5 5’ ,
N , N e N represçntam o modelo de reconhecimento do sitio i
de restrição com HindIII acima mencionado e cada oligonucleotido está marcado com o seu número de identificação apropriado
CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTCTTTCTCCTTCC
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Sítio de
Oligonucleótidos $8, 59 θ 6θ podem ser usados com todos os construtos.
Oligonucleótido 58 θ um primário de vectorete universal, por exemplo (AO) CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGCTCTTCCCTCTC
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TCGCTAAGAGCATGCTTGCCAATGCTAAGC 3’ 58 5'
Oligonucleótido 59 θ um primário de sequencia manto universal e um primário de vectorete aninhado, por exem pio (AO) - CTTCCTCTCCTGTCGCTA3’ TTCCTCTCCTGTCGC 5' 12
Oligonucleótido 6θ ê um primário de vectorete universal aninhado, por exemplo (AO) 3' CTTCCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCAACCTCTCCTGTCGCTAAGAGCATGCTTGCCA
3' 60 5'
Oligonucleótidos curtos sao mero lA + mero A2 temperados.
Oligonucleótidos loçgos sao o mero 57 + mero recozidos.
tipo A e o tipo D sao respectivamente oiigo nucleótidos equivalentes curto e comprido. Portanto, 1 e 26 ** tem a mesma parte suspensa e sao ambos para serem usados com ADN clivado com Nhel, Spel ou Xbal. De maneira semelhante, 2 e 27 destinam—se ambos a serem usados com ADN clivado com EcoRI.
Aplica—se exactamente o mesmo ao tipo Be ao tipo E, 19 e tipo F (42) e tipo C e tipo G.
Cada oligonucleótido destina—se a ser ligado a ADN clivado com a endonuclease de restrição indicado a seguir àquele oligonucleótido.
Os tipos A e B (e tipo D e tipo E) destinam— —se a ser utilizados com suportes 5'·
Os oligonucleótidos 19 + tipo C (e tipo F + . ** tipo G) destinam—se a ser utilizados com suspensões 3'·
Os oligonucleótidos 1 a 8 sao emparelhados com o oligonucleótido l4.
Os oligonucleótidos 9 a 13 e 1θ sao emparelha dos com o oligonucleótido 17· oligonucleótido 19 é emparelhado com ® oligonucleótidos 20 a 25· l ~
Os oligonucleótidos 26 a 33 sao emparelhados com o oligonucleótido 40.
Os oligonucleótidos 34 a 39 sao emparelhados com o oligonucleótido 4l.
oligonucleótido do tipo F (42) é emparelhado com os oligonucleótidos do tipo G 43 a 48.
oligonucleotido 7 (e 32) pode ser substitui do pelo oligonucleótido 11 (e 36) para usar com ADN restringi do com Bspmll.
Aprecia—se que os oligonucleótidos 1 a 7 se destinem a temperar com o oligonucleótido l4. Os oiigonucleô—
tidos 8 a 10 sao para temperar com o oligonucleótido 15· Os oligonucleótidos 11 a 13 sao para temperar com o oligonucleótido 17· Pode nao ser necessário usar o oligonucleótido i6.
Oligonucleótido 5&
CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCT (um oligonucleótido com o comprimento de trinta bases destina do a ser o primário do vectorete universal na reacçao de ca deia de polimerase (PCR) descrita na operaçao 6 do método I descrito mais adiante, na presente memória descritiva).
Oligonucleótidos Adicionais Usados n s Exemplos Referidos na
Presente Memória Descritiva, mais adiante
Estes oligonucleótidos podem ser utilizados com qualquer bublioteca de vectoretes independentemente da en donuclease empregada, com excepçao do oligonucleótido 65, como se pormenoriza em seguidaί
Oligonucleótido 6l
GAGACTTGGTATTTTGTTCAATCATTAAG (um oligonucleótido 3' do exao V do gene de antripsina ÇA— l)·
Oligonucleótido 62
AAAAGCCAGAGACCTCACTCCCGGGGAGCC (um oligonucleótido 5' do exao 1 do gene humano de fenilalani na-hidroxilase, mutações que provocam feni1-cetoanuria (PKU)).
Oligonucleótido 63
AGGGACTTACTGTGGCGAGCTTTTCAATGT (um oligonucleótido 3’ do exao 9 e do gene de fenilalanina—hi droxilase (PAH)).
Oligonucleótjdo 64
GGGCCTCAGTCCCAACATGGCTAAGAGGTG (oligonucleótido 3' de exao III do gene de antitripsina ¢(.-1).
Oligonucleótjdo 6g
AATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATG (um primário inverso M13 prolongado).
Este oligonucleótido e oara mo um dos primários de PCR para insertos de qualquer de M13 ADN ou plasmídio pUC ADN.
ser utilizado co— ampiifi caçao em
Oligonucleótido 66
5'-ATC AGG TGC ACC CAG AGA GGC AAG GCC-3' (um oligonucleótido 3' Oe exao 9 do gene de feni1—alanina—hi— droxilase (PAH)).
Método I método I compreende as seguintes seis opera ço e s:
Operaçao 1 — Fosforilaçao de oligonucleótido do tipo A, segui da por purificação em gel da especie íosforilaàa
Operaçao 2 — Adiçao de um resíduo de ddA à extremidade 3' do oligonucleótido do tipo A fosforilado da Opera— «M ** çao 1, seguida de purificaÇao em gel.
Operaçao 3 — Tempera do oligonucleótido do tipo A modificado de maneira a obter—se o correspondente oiigonu— cleôtido do tipo B.
Operaçao 4 — Preparaçao de ADN e digestão de restrição.
Operaçao 5 — Ligaçao dos oligonucleotidos temperados do tipo
A e do tipo B ao ADN desfosforiia do clivado da Operaçao 4.
Operaçao 6 — Amplificaçao dos produtos de ligaçao da Operaçao 5 e detecçao e análise dos produtos da PCR.
Estas operaçoes podem efectuar—se, por exemplo, procedendo da seguinte maneiraí
Operaçao 1
Usaram—se os seguintes tampões e outras soiu— çoes tituladas:
1.1 Tampao de IPX Quina se
Tris.HCl (pH 7,6) 0,5 M MgCl2 0,1 M Ditiotreitol 5θ mM Espermidina 1 mM EDTA 1 mM guardada a —20° C.
1.2 5'-Trifosfato de adenosina
Sai de sódio sob a forma de solução 10 mM (Pharmacia), diluida a 20 picomole/microlitro com água guardada a —20° C.
1.3 Rádjo-Isótopo s
a) 5’ (oCJ p ) — tri fo sfat o de adenosina (Amersham) Actividade específica aproximadamente 6000 Ci/milimole.
2
b) 5’—(fcC p)—trifosfato de desoxi—adenosina (Amersham)
Actividade específica aproximadamente 3θθθ Ci/micro— mole.
1.4 Tampao de Amostra de Formamida
5
80% (em vo lume/vo lume) de formamida desionizada 50 mM de Tris, borato de pH 8,3 1 mM de EDTA
0,1% (peso/volume) de azul de bromofenol 0,1% (peso/volume) de xileno—cianol
Desionizou-se a formamida mediante agitaçao durante trinta minutos com 2 gramas de resina de Amberlite MB—1 (Bio—Kad) e filtrando através de um papel de filtro What man número 1. 0 tampao foi guardado às escuras.
1.5 Solução a 40% de Acrilamida Concentrada
Por 500 ml:
Acrilamida (grau para electroforese) 190 g
Bis-acrilamida (grau para e1ectroforese) 10 g.
A acrilamida foi agitada durante trinta minutos com 5 gramas de resina Amberlite MB—i (Bio—Rad) e filtrou -se usando duas folhas de papel de filtro Whatman número 1.
A solução concentrada foi guardada às escuras a temperatura de 4 ' C.
1.6 Persulfato de Amónio a 10%
Dissolveu—se 1 grama de persulfato de amónio (Sigma, grau para electroforese) e diluiu-se até perfazer 10 ml em água desionizada esterilizada· Guardou—se às escuras.
1.7 Mistura de Gel a 0,5% (acrilamida 20%, ureia 7 M)
Por 50 ml:
gramas de ureia ml de solução concentrada de acrilamida a 40% (1.5)
2,5 ml de 10 x TBE (1.8).
Imetíiatamente antes da utilização, a di cionam—se como agentes de polimerizaçao:
300 microlitros de persulfato de amónio a 10% (1.6) 40 microlitros de TEMED
I.8 10 χ TBE
Por litro:
Tris 109 gramas
EDTA 9,5 gramas
Acido bórico 55 gramas
Diluiu.—se o tampao de 10 x TBE com
A* concentração de 1 x ou de 0,5 x» conforme for nece
ssario.
I. 9
Tampao A
0,1 M de Tris.HCL, pH 7,7 10 mM de trietilamina i mM de EDTA
Guardou-se o tampao a 4° C e preparou—se tampao fresco uma vez por mês
I.10 Reagente B
Por 100 mi:
ml de etanol ml dc água desionizada esterilizada.
Misturaram-se os seguintes compostos num tubo de Sarstedt de 1,5 ml
Oligonucleótido do tipo A Tampao de Quinase 10 X (l.l)
100 pmoles microlitros
5'-Trifosfato de adenosina (1.2)
5'-(Ç32P)-Trifosfato de adenosina (1.3)
Poiinucleóti do T4 quinase de E. coli (Am ersham)
HO até perfazer
9,5 microlitros (190 picomoles) microlitros (10 ρ ί como ie s)
4o uni da de s 50 microlitros
A proporção de o ligonucieóti dos para moléculas de ATP foi mantida igual a 1 : 2.
Realizou-se a fosforiiaçao dos oligonucleoti— ** o dos por incubaçao a 37 C durante sessenta minutos.
Adicionaram-se 20 microlitros da solução de amostra de formamida (1.4) e desnaturou—se a amostra da enzima em banho-maria a 9θ° C durante dez minutos antes de carregar num gel de desnaturaçao com 20% de acrilamida e ureia 7M.
Realizou-se a purificação em gel dos oligonu— cleótidos tratados çom quinase. Purificaram-se os oligonucieó tidos fosforilados por electroforese em geles de poliacrilami da de desnaturaçao, como foi descrito por R. Wu e col., Puri fication and sequence analysis of synthetic oligonucleotides, em Oligonucleotide Synthesis — a praticai approach, editado por M. J. Gait, IRL Press.
c) Purificação Final através de Coluna
Para lizaram-se cartuchos Nsorb^DuPont).
esta operaçao de purificação final, uti — de purificação de ácido nucleico Ne—
1)
Pré—Equilibraçao da Coluna
A coluna foi colocada num suporte universal com pinças. Lavou-se o interior do cartucho com 2 mi de meta—
nol do grau para HPLC. Este lavou qualquer pequena parte solta do enchimento de novo para dentro do leito da coluna.
Prendeu-se seguramente o adaptador no topo do cartucho formando uma vedaÇao estanque ao ar. Encheu—se uma seringa de plástico descartável com ar e ligou—se ao adaptador. Com uma ligeira pressão constante, empurrou—se o metanol através do cartucho (cauda igual a cerca de uma gota por 2 se gundos). Da mesma maneira, a coluna foi ferrada deixando passar 2 ml de tampao A (i.9) através dela.
2)
Carregamento da Amostra
Adicionaram-se 2,8 microiitros de trietilamina aos 2 ml de água contendo o oligonucleótido. Esta mistura foi então adicionada directamente no topo do leito da coluna, utilizando seringa e agulha. Fez-se passar a amostra através da coluna usando uma seringa cheia com ar, como em c (1).
3) Lavagem da Amostra
Adicionaram-se 3 ml de tampao A (1.9) à coluna usando seringa e agulha. Esta foi forçada suavemente a pas sar através da coluna como em c (l).
4) Aplicou—se 1 ml de reagente B (1.10) na parte superior da coluna. Eluiu—se o ADN do leito da coluna fazendo passar forçadamente com suavidade usando uma seringa cheia com ar, como em c (1). Colectou-se o efluente num tubo de Sarstedt em 1,5 ml e evaporou—se até à secura numa centífuga a que se aplicou vácuo (UNIVAP, Uniscience).
Kessuspendeu-se o oligonucleótido purificado, seco, à medida das necessidades.
Fase 2
Utilizaram-se os seguintes tampões e outras soluçoes tituladas:
2.1 Cacodilato de sódio 1,4 M, pH 7,5 com HC1 Guardou—se a —20° C.
2.2 Cloreto cobaltoso 5 mM Guardou-se a -20° C.
2·3 Ditiotreitol 1 mM
Guardou—se a —20° C.
2.4 Sal de sódio de 5'-trifosfato de didesoxi—adenosina liofilizado (Soehringer, Mannheim).
Diluiu-se com H_0 para se obter uma solução concentrada &
de armazenagem com 10 mM e a solução de trabalho era 1 mM por diluição com l^O.
2.5 0,5 de EDTA, pH 8,0.
Adiçao de um Resíduo de Didesoxi—adenosina a Extremidade 3' Ho
Oligonucleóti do do _TiP°_A í?o sí ori lou—se oligonucleótido do tipo A e purificou—se o produto fosforilado como se descreveu na Operaçao 1. Com uma recuperação de 80%, obtiveram—se 80 picomoles de oligonucleótido combinado com quinase e disponível para a
A/ reacçao de transferase terminal.
Ressuspenderam—se os 80 picomoles de oligonucleótido I quinasado e purificado em 48 microlitros de água desionizada esterilisada·
Ao oligonucleótido quinasado, adicionaram-se os seguintes reagentes:
microlitros de oligonucleótido (80 picomoles)
ίο ío mi crolitro mi crolitro s mi croli t ro s mi croli tro s mi croli tro s mi croli tro s mM ddATP (l nmoie) (2.4) de ácido cacodíiico 1,4 M (2.1) mM DTT (2.3) de cloreto cobaltose 5 mM (2.2) ddATP (Λ32Ρ) (15 picomoles) (1-3» de transferase terminal (150 unidades de Boenringer TdT).
b)
Incubou—se a mistura reaccional· a 31° C duran te uma hora e interrompeu-se a reacçao por adiçao de 4 microiitros de EDTA 0,5 M.
Adi cionaram—se 40 niicroiitros do tampao da amostra de formamida (1.4) e desnaturou-se a amostra incubando em banho—maria de 90° C durante dez minutos antes de se carregar num gei de 20% de acrilamida e 7M de ureia para desnaturaçao.
Efectuou-se a electroforese em gel exactamente como se descreveu na Operaçao 1.
Cortou—se a banda de oligonucleótido do tipo A agora com 15 ineros e purificou—se exactamente como se descreveu na Operaçao 1. A recuperação final caicuiou-se ser 5θ picomoles. Ress spendeu—se esta quantidade em 250 microlitros de água desionizada esterilizada para se obter uma concentração final de 0,2 pmole/microlitro.
Operaçao 3
Tempera do Oligonucleótido do Tipo A Modificado de Maneira a
Obter—se um Correspondente Oligonucleótido do Tipo B
Foi necessária a seguinte solução:
3.1 Tampao de Tempera 10 x
100 mM 100 mM de de Tris. HC1 Mg CL. (pH 8,0)
100
Num tubo de Sarstedt de 1,5 ml, com a tampa roscada, mLsturaram-se os seguintes reagentes:
picomoles do oligonucleótido do tipo A modificado (obtido por intermédio das operaçoes 1 e 2) picomoles do oligonucleótido do tipo B 5 microlitros do tampao de têmpera 10 x (3-1) e HO até perfazer 50 microlitros.
Se o oligonucleótido do tipo A é escolhido do oligonucleótido 1, 2, 3 ou 4, então um oligonucleótido do tipo B conveniente para estes (l — 4) será o oligonucleótido i4.
Colocou-se um tubo de Eppendorf em banho-maria aquecido à ebulição (convenientemente um pequeno copo). Depois de cinco minucos, deixou-se arrefecer a água do banho-maria lentamente até à temperatura ambiente durante um inter valo de tempo de duas horas. Finalmente, colectaram—se os con teúdos do tubo no fundo por centrifugação durante dez segun— dos. 0 o ligonucleotido temperado, a uma conventraçao de 0,5 : pmo le/tni cro li t ro , estar*pronta para ser utilizado em ligações.
Fase 4
Preparaçao de ADN de Restrição
Utilizaram-se as seguintes amostras de ADN:
1. ADN I genómico Humano
2. ADN II genómico humano (ADN genómico preparado a partir de células de linfoblastoides) a que se adicionou 0,1 mg/ml de 5-azacitidina ao meio de cultura para evitar a metila çao dos radicais de citidina durante a replicaçao do ADN e o desenvolvimento das células.
Utilizaram-se os seguintes tampões:
4.1 Tampao salino de pequena concentração 10 x
101
100 mM de Tris.HCi, pH 7,5 100 mM de Mg Cl mM de ditio-eritritol
4.2 Tampao salino de concentração média 10 x
100 mM de Tris.HCi, pH 7,5 100 mM de MgCl 500 mM de NaCl mM de ditio—eritrirol.
4.3 Tampao salino de elevada concentração 10 x
500 mM de Tri s. HCl, pH 7 ,
100 mM de Με ci 2
1000 mM de NaCl
10 mM de ditio-eri trito 1
Tampao BamHI 10 x
lOOmM de Tris-HCl, pH 8,0
50 mM de msci2
1000 mM de NaCl
10 mM de 2—mercapto—etanol.
4. 5 Tampao de EcoRI 10 x
100 mM de Tris.HCi, pH 7,5
100 mM de MgCl2
500 mM de NaCl
4. 6 Tampao de TE
10 mM de Tris.Hcl, pH 7,5
1 mM de EDTA
4. 7 Ta mp a 0 de Amostra de Agarose
% (peso/voluma) de Ficoll 400
0,05% (peso/volume) de azul de bromofenol 0,05% (peso/volume) de xileno—ciano1.
102
Fez-se o tampao de amostra com o tampao 1 x
TBE (1.8).
4.8 Tampão CIP 10 X
500 mM de Tris.HCl, pll 8,0 1 mM de EDTA.
i) Empregaram—se as seguintes condiçoes para clivar o ADN genómico com endonucleases de restrição específicas!
50 mi crograma s de ADN
20 mf croli t ro s do tampao de restrição 10 X apropriado
50 unidades da endonuclease de restrição pretendida.
Ajudtou—se o volume final da mistura reaccional de maneira a ser igual a 200 microlitros.
Efectuou—se a digestão a 37° C durante duas «w *** .
horas. Interrompeu-se a reacçao por adiçao de 4 microlitros de 0,5 M de EDTA (2.5) r aquecimento da amostra a 70° C duran te dez minutos.
ii) Ensaiou-se um micrograma da amostra por electroforese em gel de agarose a fim de garantir que a digestão esta va completa procedendo da seguinte forma.
Electroforese em Gel de Agarose
Prepararam-se os geles com 0,7% (peso/volume) de agarose (pharmacia) num tampao 1 X TBE (1.8) c submergiu— —se em tampao de TBE com a mesma concentração durante a electroforese. Adicionou—se um quinto do volume de tampao de amos tra de agarose (4.7) à amostra antes de introduzir nas cavida des do gel. A seguir à electroforese, manchou—se o gel durante dez minutos mergulhando—o em água desionizada contendo 1 micrograma/mi li litro de brometo de etídio. ViAualizou-se o ADN a 302 nm usando um trans—iluminador (Macrovue—LKB).
103 -
) Purificou-se o ADN digerido por extracçgo com fenol:
Adicionou-se um volume igual dc fenol redesti i
i lado tamponizado (BRL, fenol do grau para acido nucleico tamponizado com TE (4.Ó) ao ADN restringido e agitou-se a mistura durante trinta segundo. Separou—se a emulsão de cor branca formada em duas fases por centrifugação durante cinco minutos. Transferiu—se a fase aquosa para um novo tubo. Quaisquer vestígios de fenol residual foram eliminados por extraeçao da fa se aquosa com fenol: clorofórmio : álcool iso—amílico (25 · :24 : 1) - um volume igual — com um volume igual de clorofórmio : álcool iso—amílico (24 : 1).
b) Finalmente purificou—se o ADN por precipitação côm etanol.
Adicionou—se um décimo de volume de solução 3
M ae acetato de sódio à solução de ADN para se obter uma concentração final de 3θθ· mM de acetato de sódio. Precipitou—se o ADN pela adiçao de 2,5 volumes de etanol a 95% θ eni seguida deixando repousar a —80° C durante trinta minutos, seguindo—se a centrifugação (miçrocentífuga durante cinco minutos, 12.000 rotaçoes por minuto). Lavou—se o ADN peletizado com etanol a 8o% (volume/volume) frio e secou—se sob vácuo. Dissolveu—se o ADN em tampao, quando necessário.
iv) Desfosforilaçao do ADN Clivado
Desfosforiiizou-se o ADN clivado para evitar a autoligaçao.
Dissolveu-se o ADN restringido e purificado em 175 microlitros de água desionizada esterilizada.
A este ADN adicionaram-se microlitros de fosfatase de intestino de vitelo (CIP) (Boehringer Mannheim) (1 unidade/mi crolitro) microlitros de tampao de CIP 10 x (4.8).
104 -
: Incubou-se a amostra a 37 C durante sessenta minutos. Adicionaram-se 4 microlitros de EDTA ϋ,5 molar e pu— ! rificou-se o ADN de sfo sfori iado por extracçao com fenol e pre j| cipitaçao com etanol, como se descreveu em iii) (a) e em iii) li (b), acima referidos. Dissolveu—se a pelete de ADN final em 50 ! mi cro ii t ro s de tampao de TE (4.6) para se obter uma concentra ' çao de 1 micrograma/microlitro.
Fase 5
Ligaçao dos Oligonucleótidos I e II Temperados ao ADN Desfos— forilado Clivado
Utilizou—se o seguinte tampao
5-1
Tam pao de ligaçao 10 X
200 mM de Tris.HCl, pH 7,4
100 mM de MgCl2
100 mM de DTT .
10 mM de ATP
Mi sturaram—se os
de Sarstedt de 1,5 ml :
ADN genómico clivado (7,4 picomoies) 10 microgramas 0ligonucleótidos temperados provenientes da operaçao 3
Tampao de ligaçao 10 X T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim)
Agua desionizada esterilizada até perfazer o volume de pmoles 10 microlitros 2 unidades
100 microlitros.
Deixou—se a mistura de ligaçao a 4 C em re— pouso durante a noite. Determinou—se o rendimento da ligaçao por electroforese em gel como sendo 5% dos produtos de liga— çao — veja—se Operaçao 4 (ii) sobre pormenores da maneira de proceder.
105
Purificargm-se então os produtos da ligaçao »W M por extracçao com fenol e precipitaÇao com etanol, como se des creveu na Operaçao 4 (iii). Dissolveu—se a pelete final de ADN em 9,5 microiitros de tampao de TE (4.6) para se obter uma con centraçao de 1 micrograma/microiitro.
Operaçao 6
AmplificaÇao dos Produtos de Ligaçao da Fase 5
Utilizaram-se os seguintes tampões e outras soluçoes correntes:
1 Tampao de Amplificação 10 X
500 mM de KC1
100 mM de Tris-HCi, pH 8,3
15 mM de MgCl2
0,1% de gelatina
Guardou—se a —20° C.
6.2 Nucieóti dos
í.
Solução de Armazenagem com 10 X:
2 mM de dATP
2 mM de dTTP
2 mM de dGTP
2 mM de dCTP
Guarda—se a —20° C.
6.3 Marcadores do Tamanho
Bacteriófago 0X174 clivado com HaelII.
tamanho das bandas expresso em pares de bases é: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118 e 72.
106 t ubo
Misturaram-se os seguintes produtos num de Sarstedt de 1,5 ml, com tampa roscada!
micrograma de produtos de ligaÇao da operaçao 5
100 picomoles de oligonucleótido 5&
100 picomoles do oligonucleótido 6l, ou 62 ou 63· microiitros de tampao de amplificaçao 10X (6.1) microiitros de nucleótidos de armazenagem 10 X.
Diluiu-se com água destilada desionizada até perfazer o volume de 100 microiitros.
Colocou—se o tubo em banho-maria aquecido à ebulição durante cinco minutos. Diluiu—se Taq polimerase (An— giian) com tampao de amplificaçao I X (6. 1) até se obter a concentração de i unidade/microlitro.
í
Adicionaram-se 2 microiitros da enzima diluída à mistura reaccional aquecida à ebulição acima referida e misturou—se. 0 conteúdo foi acumulado no fundo numa centrífu— jga durante cinco segundos. Colocaram—se então 5θ microiitros ί de óleo mineral leve (Sigma) por cima da mistura reaccional (para evitar a evapõraçao durante as reacções seguintes).
Colocou—se o tubo num banho-maria a
1) 6o° c durant e doi s minuto s
2) 72° c durant e . * tres minuto s
3) 91° c durante doi s minutos.
Repetiram—se as operações 1, 2 e 3 trinta e nove vezes. Em seguida, colocou—se o tubo em banho-maria a 60° C durante dois minutos, seguindo-se a incubação a 72° C duran te oito minutos. No fim da amplificaçao, o conteúdo foi acumu lado no fundo por centrifugação e separou—se o óleo mineral com uma pipeta.
Analisaram—se 15 microiitros de produtos am—
107
plificados por electroforese em gel de agarose, como se descreveu na Operaçao 4 (ii). Para determinar o tamanho do produ ! !
[j to ou produtos amplificados, realizou—se uma electroforese com 0X1?^ adjacentemente a amostra amplificada.
Método II
Método II compreende as seguintes operaçoes:
1. Adição de um resíduo de ddA na extremidade 3' de um oiigo nucieótido do tipo A, seguida por purificação em gel das espécies com a extremidade 3' marcada.
2. Fosforilação do oligonucleótido do tipo A marcado na ex— tremidade 3’ » seguida por separaÇao de nucleotidos nao in corpo ra dos.
3· Tempera do oligonucleótido do tipo A modificado de maneira a obter-se o correspondente oligonucleótido do tipo B.
ã. Clivagem do ADN genómico
5· Ligaçao dos oligonucleótidos temperados A + B ao ADN cliva do.
i
6. Amplificação dos produtos de ligaçao.
Detecção e análise dos produtos de PCR.
As operaçoes acima referidas podem efectuar—
-se, por exemplo, procedendo da seguinte maneira:
Operaçao 1
Os pormenores experimentais sao exactamente os mesmos da Operaçao 2, do Método I.
Operaçao 2 oligonucleótido ê fosforilado como se des— creveu na Operaçao 1, no Método I. 0 oligonucleotído fosfori108 -
lado é é purificado directamente por passagem através de uma coluna, como se refere pormenorizadamente na Operaçao 1 (ii) c do Método I.
Antes de se carregar a amostra na coluna, adi cionam—se 200 microlitros de tampao A (1.9) à mistura reaccio nal, em vez de trietilamina.
Operações 3 ~ θ sao exactamente as mesmas que no Método I.
Método III
Este Método envolve as seguintes operaçoes:
1. Fosforilaçao do oligonucleótido do tipo A de l4 meros seguida de purificação em gel da espécie fosforilada.
2. Adiçao de um resíduo de ddA à extremidade 3' do oligonu— cieótido quinasado I, seguida de purificação em gel.
3« Tempera do oligonucleótido do tipo A de maneira a obter— —se o correspondente oligonucleótido do tipo B.
4. Restrição do ADN.
5. Ligaçao dos oligonucleótidos A + B temperados ao ADN restringido .
6. Adiçao de um didesoxi—nucleótido às extremidades 3’ livres.
7· Amplificaçao dos produtos da ligaçao. Detecção e análise at dos produtos de amplificaçao.
Estas operaçoes podem efectuar—se, por exemplo, procedendo da seguinte maneirai
Operaçoes 1 a 5 sao exactamente como se pormenorizou no Méto do I.
Operaçao 6
109 -
I Os produtos da IigaÇao purificados provenien: tes da Operaçao 5 sao dissolvidos em 30 microlitros de água desionizada destilada· Ao ADN, adicionam—se os seguintes produto s:
microlitros de tampao de amplificaÇao 10 X (6.l) pmoles de didesoxi—nucleótido apropriado i unidade de Taq polimerase (Anglian) adiciona-se água até perfazer um volume de 5θ microlitros.
Incuba—se a mistura reaccional a 37° C duran—
I te trinta minutos.
Purifica—se o precipitação com etanol, como çao 4 (iii ).
ADN por extracçao com fenol e se descreve no Método I, Opera—
Dissolve—se a pelete de tampao TE (4.6) para se obter uma grama/microlitro.
de ADN em 5θ microlitros concentração de 1 micro-
Operaçao 7
Método IV
rença de a
rações 5 e
Método V
é a mesma que a Operaçao 6 do Método
Ê exactamente igual ao Método II OperaÇao b do Método III ser inserida 6 do Método II.
I, com a dife— entre as Ope
Método V compreende as seguintes operaçoes:
1. Fosforilaçao do oligonucleótido do tipo D com cinquenta e sete meros, seguida pela sua separaÇao do nucleótido nao incorpora do.
2. Têmpera do oligonucleótido fosforilado, por exemplo, do ti po D tratado com quina se, para se obter o oligonucleótido do tipo E apropriado.
110
Segue—se a Operaçao 4 tal como os Métodos I—IV
Essas operaçoes podem efectuar—se, por exemplo, da seguinte maneira:
1. 0 oligonucleótido é fosforilado como se descreve no Método I , Operaçao 1. A purificaÇao faz—se com uma coluna
MK *NeNsorb ', como se descreve no Método I, Operaçao I (ii) c.
2. Tempera como se pormenorizou no Método I.
A seguir a Operaçao 4 para diante procede—se como se pormenorizou anteriormente (Métodos I e III).
Método VI
Método VI compreende as seguintes opEraçoes:
1. Fosforilaçao do oligonucleótido de l4 meros do tipo A (ou dos oligonucleótidos l8 ou 19 ou 39 ou tipo F (42) ou do tipo D), seguida de purificação em gel de especie fosfori lada ·
2. Tempera do oligonucleótido fosforilado para l8, 19 ou do tipo D com a obtenção do correspondente oligonucleótido apropriado do tipo B (ou tipo C) ou do tipo ou tipo G.
3« Digestão do ADN genómico com enzima de restrição.
4. Ligaçao dos oligonucleótidos temperados ao ADN restringido
5· Restrição dos produtos de ligaçao da operaçao acima referi da .
6. Ligaçao de mais oligonucleótidos temperados para originar produtos da Operaçao 5·
7· Repetição das operaçoes 5 θ o·
8. Restrição final dos produtos da Operaçao 7·
9« Adiçao de um trifosfato de didesoxi—nucleótido na extremi
111
dade 3' dos produtos da Operaçao 8.
10. Amplificaçao dos produtos da Operaçao 9· Detecção e anáii se dos produtos amplificados.
Estas operaçoes podem efectuar-se, por exemplo, da seguinte maneira.
Operaçao 1
Como se descreveu na Operaçao 1 do Método I.
Operaçao 2
Esta operaçao realiza-se de acordo com a mesma maneira de proceder da Operaçao 3 do Método I.
Por exemplo:
Os oligonucleotídos 1 a 7 sao temperados para se obter l4.
Os oligonucieótidos II a ±3 θ 18 sao temperados para se obter 17,.
Os òligonucleótidos 20 a 25 sao temperados pa ra se obter 19·
Os oligonucleotídos 26 a 32 sao temperados p;
ra se obter 40.
Os oligonucleotídos 24 a 39 sao temperados pj ra se o bter 4l.
Os oligonucleótidos 43 a 48 sao temperados pa ra se obter 42.
Operaçao 3
Esta operaçao é a mesma que a Operaçao 4 (i), 4 (ii) e 4 (iii) do Método I mas o ADN restringido nao ê des— fo sforilado.
112
**« .
Operaçao 4
Λ* f M
Ligaçao dos Oligonucleótidos Temperados aos Tampões de ADR
Clivados e Outras Soluçoes Correntes
4.1 Tampao de Li g a ç a o 10 X
200 mM de Tris-HCl, pH 7,4
100 mM de MgCl2
100 mM de DTT
10 mM de ATP
i) 0 cálculo do número de pi comoies
josas existente em 1 mi crograma
ii) como na Operaçao 5 do Método I.
Ligações
Mi sturaram—se os seguintes produtos num tubo de Sarstedt de 1,5 ml?
ADN genómico clivado 7,4 pmoles (10 microgramas) Oligonucleótidos temperados provenientes da
Operaçao 2
Tampao de ligaçao 10 x (:4.l)
T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim) prnole s mi cro litros unida de s
Agua desionizada esterilizada para se completar até ao volume de 100 micro litros
A mistura de ligaçao foi deixada em repouso a 4° C durante a noite.
A eficiência da ligaçao foi determinada por electroforese em gel de 5°'° dos produtos de ligaçao — ver Ope— raçao 4 (ii) do Método I para os pormenores do procedimento.
Os produtos de ligaçao foram purificados por
A* M extracçao com fenol e precipitação com etanol, como se descre
113 -
veu na secção 4 (iii) ou no Método I.
í :Operaçao 5
Esta operaçao é a mesma que a Operaçao 3 acima referida.
Operaçao b ** Z ** I
Esta operaçao e a mesma que a Operaçao 4 aci— ma descrita, com a excepção de se usarem concentrações equimo lares de ADN para oligonucleotidos temperados.
Por exemplo:
7,4 picomoles de ADN
7,4 picomoles de o ligonuc1eótidos temperados.
Operaçao 7
Repetem—se as Operações 5 θ θ acima descritas.
Operaçao 8
Como a OperaÇao 5 acima descrita.
Operaçao 9
Tampões e Outras Soluçoes Correntes
9·1 Tampao de T7 ADN Polimerase (5 χ)
9. 2
200 mM de Tri s. HC1
100 mM de MgCl2
250 mM de NaCl
dNTP - dATP
mM de dTTP mM de dGTP mM de dCTP diluída com água desionizada esterilizada.
114 9· 3 ddATP
i) mH de ddATP dilui da com água desionizsda esterilizada.
Adiçao de um resíduo de ADN nas extremidades 3’ dos pro dutos da Operaçao 8:
Misturaram-se os seguintes reagentes num tubo de Sarstedt de 1,5 ml:
A miccrogramss de ADN da Operaçao 8 acima descrita 20 microlitros de tampao de T7 ADN 5 χ (9·1) microlitros de dNTP (9·2) microlitros de ddATP (9*3) unidades de T7 ADN polimerase (Sequenase).
volume foi completado até perfazer 100 microlitros com água desionizada e destilada.
Incubou—se o tubo a 37° C durante trinta minu tos. A enzima foi então desnaturada por incubaçao a 70° C durante dez minutos. /
Em seguida, o ADN foi purificado por extrac— çao com fenol e precipitação com etanol, como se descreveu an teriormente.
Operaçao 10
Esta operaçao ê a mesma que a Operaçao 6 do Método I ou a amplificaçao pode realizar—se numa máquina com cicios de temperatura (por exemplo, a máquina programável Te— chne de Dri—Block PHC—1).
Aprecia—se que neste Método VI se faz reagir 5'-trifosfato de didesoxi-adenosina com as extremidades 3' dos oligonucleótidos ligados na presença de T7 ADN polimerase (Se
115
quenase) a fim de substituir qualquer perda de resíduos de ddA da extremidade 3' como consequência de uma actividade de exonuclease inesperada da T4 ADN ligase específica para didesoxi— nu cieó ti do s.
Método VIΪ
Ksicdo VII ê o mesmo que o Método VI, com a diferença de se omitir a Operaçao I do Método VI. Além disso, neste método nao se efectua a purificaÇao em gei mas a ef.iciên cia da ligaçao pode ser verifica a por electroforese em gel de agarose e manchamento com brometo de etídio.
Método VIII
Método VIII é o mesmo que o Método VI, com a diferença de se omitir a Operaçao 9· Ds oligonucleótidos
usados : ne st e método sao , por exemplo
26 a 32 t empera do s para 40
36 a 39 t emperado s para 4l
43 a 48 t empera do s para 42.
Método IX
Método IX compreende as seguintes operaçoes:
1. Fosforilaçao
2. Têmpera
3« Restrição de ADN
4. Ligaçao (por exemplo, a 25° C) de oligonucleótidos tempe rados ao ADN clivado
5· Re stri çao/ligaçao.
o. Amplificação dos produtos da Operaçao 5 θ detecção e ana lise dos produtos de amplificaçao.
As operaçoes acima mencionadas podem efectuar
116 -
As operaçoes acima mencionadas podem efectuar —se, por exemplo, como se descreveu em relaçao com as correspondentes fases do Método VI.
Método X
As Operações 1, 2 c 3 do Método X sao as mesmas que as Operaçoes 1, 2 e 3 do Método VIII. A OperaÇao 4 (i ) do Método X é também a mesma que a OperaÇao 4 (i) do Método VIII, mas a OperaÇao 4 (ii) efectua—se da seguinte maneira!
(ii) Ligações
Num tubo de Sarstedt, de 0,5 mi, misturam—se os seguintes produtos:
ADN 7387 restringido Oligonucleótidos temperados Tampao de ligaçao 10 x (4.1) x ATP (4.2) .
T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim)
0,74 pmoles (l raicrogr. 1,65 pmoles 1 microlitro mi crolitro unidade microlitros.
H^O até perfazer
Deixou—se repousar a mistura em ligaçao a 25 C (em Techne Dri—Block) durante cento e vinte minutos.
Diluiu—se então a mistura de ligaçao com água, de maneira a obter-se uma concentração de ADN igual a 10 ng/ microlitro e submeteu—se a reacçao de amplificaçao, como se descreveu na operaçao 10 do Método VIII anteriormente referido na presente memória descritiva.
Método XI
Método XI é igual ao Método X, com excepçao do seguinte:
A seguir à reacçao de ligaçao a 25° C, duran—
117
te cento e vinte minutos, os produtos de ligaçao sao digeridos com a endonuclease de restrição pela adiçao de microiitros de tampao para a endonuclease de restrição apropriada (veja-se 3·!) unidades de endonuclease de restrição H^O até perfazer 20 microiitros e realizaçao de incubaçao a 37° C durante sessenta minutos.
A amostra foi então diluida com H^O, de manei ra a obter—se uma concentração de ADN igual a 10 ng/microlitro
Método XII
Método XII é o mesmo que o Método X, com a diferença de, na Operaçao 4 (ii), a mistura em ligaçao ser dei xada em repouso a 4° C durante a noite em vez de a 25° C durante duas horas.
Finalmente, a mistura de ligaçao é diluida com água até se obter uma concentração de ADN igual a 10 ng/micro litro.
í.
Método XIII
Método XIII é o mesmo que o Método XII, com a diferença de, a seguir à reacçao de ligaçao durante a noite . o ** a 4 C, os produtos de ligaçao serem digeridos com a endonucle ase de restrição apropriada.
Isto faz—sei adicionando aos 10 microiitros de mistura de ligaçao microiitros de tampao para a endonuclease apropriada (veja-se 3· l) unidades de endonuclease de restrição (Boehringer Mannheim)
H^O até perfazer 20 microiitros, e incubaçao a 37° C durante sessenta minutos.
118 Á amostra ê então diluída com HQ0 até se obter uma concentração dc ADN igual a 10 ng/microlitro.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Prepararam—se oligonucleótidos 1 e l4 como se descreveu nas Operaçoes 1 e 2 do Método 1 acima descrito. Estes oiigonucleótidos, para utilização no Método I, foram temperados como se descreveu na Operaçao 3 acima referida. Prepa
Írou-se ADN IX genómico humano e clivou—se como se descreveuna
I ~ (Operaçao 4 do Método I. Clivou-se ADN II genómico humano com endonuclease de restrição Xbal e desfosforiiou—se (como se des creve pormenorizadamente na Operaçao 4 acima descrita) com os oiigonucleótidos i e l4 temperados, exactamente como se descreveu na Operaçao 5 acima descrita.
Realizou-se então a amplificaçao nos produtos de ligaçao.
A Figura 11 (i), como se descreveu anteriormente na presente mémória descritiva, mostra o marcador 0X174 clivado com HaelII nas pistas 1 e li, o marcador À.HindIII na pista 12, uma amplificaçao de controlo na pista 2 e o fragmen to amplificado obtido usando oiigonucleótidos 5θ θ 6l. Este fragmento amplificado tem o comprimento de 800 bp, como se es perava.
A Figura 11 (ii) mostra também o marcador HindIII nas pistas 1 e 13» o marcador 0X174 clivado com HaelII nas pistas 2 e 12, um controlo de amplificaçao na pista 3 6 um fragmento amplificado obtido usando oligonucleótidos 5& θ 61 na pista 10.
Exemplo 2
Usam-se oiigonucleótidos 1 e l4 com ADN cliva do com a endonuclease de restrição Xbal
119 -
a) Fosforilou—se oligonucleótido 1 (100 picomoles) e purifi cou—se a espécie tratada com quinase como se descreveu na Operaçao 1 do Método I.
fc>) 0 oligonucleótido 1 quinasado foi submetido à acçao de transferase terminal para adicionar um resíduo de dideso xi-adenosina na extremidade 3' do oligonucleótido. 0 oli gonucleótido 1 de 15 meros resultante (+ ddA na extremidade 3') foi purificado como se pormenoriza na Operaçao 2 do Método I.
c) Hibridizou—se o oligonucleótido i de maneira a obter-se o oligonucleótido i4.
d) Clivou-se o ADN II genómico humano com o endonuclease Xbal e desfosforilou—se como se pormenoriza no Método I.
e) Ligaram—se os oligonucleótidos 1 e l4 temperados a ADN II genómico humano restringido com Xbal — veja—se Método I para os pormenores.
f) Realizou—se a amplificaçao nos produtos de ligaçao usando oligonucleótidos 58 e 6l. 0 produto amplificado esperado neste caso tem aproximadamente 800 bp.
Exemplo 3
Usando oligonucleótido _2 e i4 cotn ADN clivou—
-se com a endonuclease de restrição EcoRI.
a) Fosforilou-se o oligonucleótido 2 e adicionou-se um resí duo ddA na extremidade 3', como se descreveu acima no Exemplo 2. Este oligonucleótido modificado foi então tem peradoí de maneira a obter-se o oligonucleótido l4.
b) Clivou-se ADN I genómico com a endonuclease de restrição EcoRI e desfosforilou—se como se descreveu no Método I.
c) Ligaram-se então os oligonucleótidos _2 + 14 temperados ao ADN I clivado com AcoRI.
120
;í d) Realizou—se a amplificaçao dos produtos de ligaçao usan— ; do :
) (i) oligonucleótidos 58 e 62 i o produto esperado tem cerca de 220 pb;
(ii) oligonucleótidos 58 θ 63 >
o produto esperado tem 5θ0 bp.
Exemplo 4
Utiliza— se oligonucleóti do J e 14 com ADN cli vado com a endonuclease de restrição BamHI.
I j a) Fosforilou-se o oligonucleótido J) e adicionou—se um nucleótido ddA na extremidade 3' , como se descreveu acima no Exemplo 1.
b) Este oligonucleótido assim preparado foi em seguida temperado de maneira a obter—se o oligonucleótido l4.
c) Clivou—se ADN I genómico com a endonuclease de restrição BamHI e desfosforilou—se como se descreveu no Método I.
d) Os oligonucleótidos e 14 temperados foram em seguida ligados a ADN ÍI genómico clivado com BamHI (veja—se Método I para os promenores).
e) Foram então bloqueados quaisquo- extremidades 3' livres nos produtos de ligaçao com resíduo de ddG, usando a maneira de proceder que se descreveu na fase do Método _3·
f) Finalmente, realizou-se a amplificaçao destes produtos usando oligonucleótidos 58 e 63.
produto esperado tem 200 pb.
Exemplo
Usam—se os oligonucleótidos 2. e l4 com ADN cli vado com a endonuclease de restrição BamHI.
121
a) Preparou—se oligonucleótido _3 e temperou—se para obtenção do oligonucleótido l4, como se descreveu acima no Exem pio 4.
b) Digeriu—se ADN do plasmídio pUC8 contendo um inserto de 440 pb (veja—se B3 , Figura 10) até se completar com a en donuclease de restrição BamHI e desfosforilou—se como se pormenorizou no Método I.
c) Temperaram—se os oligonucleóti do s _3 θ l4 de maneira a obter—se ADN do plasmídio clivado com BamHI.
d) Ligou—se um resíduo de ddG às extremidades livres 3' > co mo se descreveu em pormenorno Exemplo 4. Realizou-se a amplificaçao dos produtos de ligaçao usando oligonucleótidos 58 e 65. A Figura 11 (iii) anteriormente descrita na presente memória descritiva mostra o marcador Λ Hind— III no campo da pista 11* o marcador 0X174 clivado com HaelII na pista 6 e o fragmento amplificado obtido de acordo com o Exemplo 5 nas pistas 2, 3j 4 e 5« Como se es perava, o produto rinha cerca de 440 pb de comprimento.
Exemplo 6
Utilizam-se oligonucleótidos 26 e 40 com ADN clivado com a endonuclease de restrição Xbal.
a) Fosfori lou-se oligonucleótido 26 e purificou-se a espécie quinasada, como se descreveu no Método V.
b) Temperou-se oiigonucleótido 26 quinasado para se obter oligonucleótido 40 nas condiçoes descritas na Fase 3 do Método I.
c) Restringiu-se ADN II genómico humano com Xbal e desfosfo rilou—se como sc descreveu pormenorizadamente na Fase 4 do Método I.
d) Ligaram-se então oligonucleótidos temperados 26 e 40 ao ADN II genómico clivado com a endonuclease de restrição
122
Xbal (veja-se Operaçao 5 do Método I, relativamente aos pormenore s ).
Quaisquer extremidades 3' dos produtos de ligaçao foram bloqueados com um resíduo de ddA, usando a maneira de pro ceder descrita na Operaçao 6 do Método III.
os produtos de IigaÇao produto esperado tem cer produto esperado tem cer ca de 76o bp.
A ampiificaçao reaiizou-se sobre com (i) oligonucieótidos 5θ θ 6lj o ca de 800 bp', (ii) oligonucleótidos 58 e 64, o
Exemplo 7
Utilizam—se oligonucleótidos 27 e 40 com ADN clivado com a endonuclease de restrição Ecoll.
a) Fosforilou-se oligonucleótido 27, purificou—se e temperou—se de maneira a obter—se oligonucleótido 40, como se descreveu acima, no Exemplo 5·
b) Clivou—se ADN I genómico com a endonuclease de restrição EcoPI e desfosforiiou-se, como se descreve pormenorizada mente na Operaçao 4 do Método I.
c) Ligaram—se então oligonucleótidos 27 e 40 temperados ao ADN I genómico clivado com EcoRI (veja—se Operaçao 5 do Método I, relativamente aos pormenores).
d) bloquearam—se quaisquer extremidades livres 3' rxisten— tes nos produtos de iigaÇao com residuo de ddA, como se descreve na Operaçao 6 do Método III.
e) A ampiificaçao realizou-se sobre os produtos de ligaçao usando (i) oligonucleôtidos 58 e 62, o produto esperado tem cer ca de 220 bpj
123 -
(ii) oligonucleótidos 58 e 63· o produto esperado tem 56O bp.
A Figura 11 (iii) como se mencionou acima na presente memória descritiva mostra o marcador Λ HindIII nas pistas 1 e 11, o marcador 0X174 clivado com Haelll na pista 6 e os fragmentos amplificados obtidos de acordo com o Exemplo 7 nas pistas 7, 8, 9 e 10.
Exemplo 8 \ Construiu-se uma biblioteca de vectoretes de j EcoRI de acordo com o Método VI e utilizou-se a unidade de ve ctorete 6 (oligonucleótido 27, 40) em conjunto com o ADN da linha de células 7378.
A reacçao de amplificaçao realizou—se sobre 10 ng da biblioteca construída a fim de amplificar a sequên— ci a representada na Figura 12.
Condiçoes de Amplificaçao
Misturaram-se as seguintes quantidades de pro dutos num tubo de Sarstedt com a capacidade de 0,5 ml ng da biblioteca de vectoretes EcoRI construída 100 pmole 58 100 pmole
100 micromolar (concentração final) de dNTP (veja—seM1.7 como se define mais adiante na presente memória descritiva.
Ajustou—se o volume de maneira a perfazer a concentração de 100 yuM com H^O bidestilada esterilizada. Sobre a mistura reaccional colocou—se suavemente uma camada de 50 microlitros de óleo mineral leve (Sigma) a fim de se evitar a evaporaçao. Colocou-se depois o tubo num dispositivo Te chne Dri—Block regulado a 96°C. Deixou—se desnaturar o ADN du
124
rante 10 minutos a 96°C. λ mistura reaccional adicionaram-se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus). Empregaram-se as seguin-
tes temperaturas e 4* tempos de realizaçao da reacçao para ampli-
ficar a sequência entre oligonucleótidos 58 e 63:
91° c 2 minutos
62° C 2 minutos
72° C 2 minutos
Realizaram—se 40 ciclos. No ciclo final, a tem
peratura do bloco foi mantida a 72° C durante 9,9 minutos e, em seguida, deixou—se arrefecer até à temperatura ambiente du rante um período de 1 hora.
Analisaram—se 15 microlitros da mistura da re ** A* acçao de amplificaÇao por electroforese em gel de agarose.
resultado está representado na Figura 13 que mostra o produto de amplificaÇao obtido de acordo com este exemplo na pista 1 e o marcador 0X174 clivado com Hae III na pista 2. 0 produto amplificado ê do tamanho esperado (cerca de 600 bp).
X
Exemplo 9
Este Exemplo efectuou—se de acordo com o mêto do IX, procedendo como se descreve seguidamente.
Operaçao 1
Fosforilaçao de Oligonucleótido do Topo11
Oligonucleótido 49» 51, 52, 53, 55, 27, 57 e 2.
M 4W 4*
1.1 Tampões e Outras Soluçoes Usuais de Tampao de Quinase lOx
0,5 M de Tris.HCl (pH 7,6)
0,1 M de MgCl2 mM de ditiotreitol
125 -
niM de espermidina 1 mM de EDTA o
Guardou—se a —20 C.
1.2 5*-Trifosfato de adenosina
Utilizou—se o sal de sódio adquirido na firma Pharmacia, sob a forma de solução 10 mM.
Diluiu—se a 20 pmoles/microlitro em água. Guardou—se a —20° C.
Maneira de Proceder
Misturaram-se os seguintes componentes num tubo de Sarstedt de 1,5 ml·
Oligonucleótido 10 pmoles
Tampao lOx quinase (1.1) 1 microlitro
ATP (1.2) 1 microlitro (20 pM)
T4 polinucleótido quinase (Amersham) 5 unidades
H^O atê perfazer 10 microlitros
A proporção molar de oligonucleótidos para ATP foi mantida igual a 1 I 2.
** 9
Realizou—se a fosforiiaçao dos oligonucleoti— ** o dos por incubaçao a 37 C durante sessenta minutos.
No fim deste período de tampo,a T4 polinucleó ** o tido quinase foi inactivada por incubaçao a 9θ C durante dez minutos. 0s tubos foram então submetidos a centrifugação numa microcentrífuga durante 10 segundos, para colectar todo o con densado.
As especies fosforiladas nao sao purificadas . em gel neste método.
126 -
ί Operaçao 2 j Tempera do Oligonucleótido do Topo11 Fosforilado, de Maneira ! a Obter—se o Correspondente Oligonucleótido do Fundo ** z
Solução necessária*
2. 1 Tampao de Tempera lOx
100 mM de Tris HC1 (pH 8,0)
100 mM de MgClg j Misturaram—se os seguintes componentes num tu bo de Sarstedt de 1,5 ml, com tampa roscada:
pmoles (em 10 microlitros) de oligonucleótidos de ι topo fosforilado, proveniente da Operaçao 1 í
pmoles do correspondente oligonucleótido de fundo microlitros de tampao de têmpera lOx (2.1)
H20 até completar 20 microlitros.
tubo foi colocado em banho—maria aquecido a
A* ebulição. Depois de se aquecer durante cinco minutos interrom peu—se e deixou—se arrefecer lentamente o banho-maria até à ιtemperatura ambiente durante um período de cerca de duas horas. Finalmente, o conteúdo do tubo foi colectado no fundo por centrifugação numa microcentrífuga durante 10 segundos. 0s oligonucleótidos temperados, a uma concentração de 0,5 pmoles/
A* «V microlitro, estão então prontos para serem utilizados nas ope ** A0 rações de ligaçao.
As unidades vectoretes 1-8 sao como se defi ne na Tabela I, anteriormente, na presente memória descritiva.
Operaçao 3
A»
Preparaçao de ADN
Utilizou—se ADN da linha de células 73$7
127 -
3.1 Tampao de EcoRI lOx
100 mM de Tris.HCl (pH 7,5)
100 mM de MgCl2
500 mM de NaCl
3- 2 Tampao de TE
mM de Tris.Hcl (pH 7,5) mM de EDTA
3·3 Tampao de Agarose de Amostra
15% (peso/volume) de Ficoll 400
0,05% (peso/volume) de azul de bromofenol 0,05% (peso/volume) de xileno—ciano1.
tampao de amostra foi preparado com tampao lx TBE (3*4 abaixo).
3·4 Tampao 10x TBE (por litro)
Tris 109 gramas
EDTA 9,5 gramas
Acido bórico 55 gramas
Diluiu—se o tampao lOx TBE em água a 1 x ou
0,5 x de concentração, conforme as necessidades.
i ) Empregaram—se as seguintes condiçoes para clivar ADN da linha de células 73«7 com a endonuclease de restrição EcoRI:
microgramas de ADN genómico de 73θ7 40 microj-itros de tampao lOx EcoRI (3«l) unidades da endonuclease de restrição EcoRI (de Boehringer Mannheim)
H^O atê perfazer 400 microlitros.
128 -
'3 ** Ο
Efectuou—se a digestão a 37 C durante duas i ** O 'horas. Terminou—se a reacçao aquecendo a amostra a 7θ C du— (jrante dez minutos.
ii) Ensaiaram-se 5 microiitros da amostra por electroforese em gel de agarose para garantir a digestão completa.
ί ‘‘lectoforese em Gel de Agarose
Prepararam—se os geles com 0,7% (peso/volume) ;de agarose (Pharmacia) em tampao lx TBE (3*4) e mergulhou—se
Μ M ** em tampao TBE com a mesma concentração para a realizaçao da electroforese. λ amostra (5 microiitros) adicionou—se um volu me de um quinto de tampao de agarose com a amostra (3»3) antes de carregar as amostras nas cavidades do gel. A seguir à electroforese, manejou—se o gel durante dez minutos mergulhan do—o em água desionizada contendo 1 micrograma/mililitro de (brometo de etídio. 0 ADN foi visualizado a 3θ2 nm usando um ( trans—iluminador (Chromato-Vue C—63)· iii )a )Puri ficou-se o ADN digerido por extracçao com fenol.
! Utilizou-se um volume igual de fenol redestij lado tamponizado (fenol do grau BRL ADN, tamponizado com
TE—3·2) adicionado ao ADN restringido e agitou-se a mis tura com formaçao de vórtice durante trinta segundos. Separou—se a emulsão branca assim formada em duas fases por microcentrifugaÇao durante cinco minutos. Transferiu-se a fase aquosa para um tubo fresco. Qualquer fenol residual foi eliminado extraindo primeiramente a fa ! se aquosa com um volume igual de fenol : clorofórmio :
álcool amílico (25 ί 24 : 1) - um volume igual - e, em seguida, com um volume igual de clorofórmio! álcool iso íi —amílico (24 : l).
b) 0 ADN foi finalmente purificado por precipitação com etanol.
λ** >
solução de ADN adicionou—se acetato de sodio
129 -
M de modo a obter-se uma concentração final de 3θθ mM de acetato de sódio. Precipitou—se õ ADN mediante adi— çao de 2,5 volumes de etanol a 95% ® arrefecimento a —80 C durante trinta minutos, seguido de centrifugação (microcentrífuga durante cinco minutos a 12.000 rota— çoes por minuto). 0 ADN reunido como pelete foi lavado com etanol frio a 80% (volume/volume) e seco sob vácuo. Dissolveu—se o ADN em tampao de TE (3·2) para se obter uma concentração igual a 0,5 micrograma/litro.
** .
Operaçao 4
Ligaçao dos Oligonucleótidos Temperados ao ADN Clivado
Tampões e Outras Soluçoes Usuais
4.1 Tampao de ligaçao IQx
200 mM 100 mM 100 mM de Tris.HCl (pH 7,4) de MgCl2 de DTT
lOx ATP
mM de ATP
4. 3 0,5 M de NaCl.
cálculo das picotnoles das extremidades pega josas existentes em 1 micrograma de ADN clivado foi feito como se descreveu em 4.1 (i) do Método I.
Ligações
Num tubo de Sarstedt de 0,5 ml, misturaram—se os seguintes componentes
ADN 7387 clivado 1,48 picomoles (2 ^ig)
Oligonucleótidos temperados (pro— venientes da Operaçao 2) 3 picomoles
Tampao de ligaçao lOx (4.1) 2 microlitros
130 -
ΙΟχ ATP (4. 2)
T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim)
H^O até perfazer o volume final de mi crolitro s unidades microlitros
Deixou—se a mistura se ligaçao em repouso a 25° C durante cento e vinte minutos. Em seguida, adicionou—se NaCl (4.3) à mistura de ligaçao de maneira a obter—se uma con centraÇao final igual a 50 mM. Quaisquer fragmentos de ADN ge nSmico ligados a outros fragmentos de ADN genómico foram re— cortados mediante a adiçao de 2 unidades de EcoRI (Boehringer Mannhaeim) e subsequente incubaçao da amostra a 37 C durante trinta minutos. As unidades de vectorete foram então ligadas a esses fragmentos de ADN genómico recortado, adicionando
ATP até à concentração de 1 níM (4.2)
1,5 picomoles de oligonucleótidos temperados 1 unidade de T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim) e incubando a 25° C durante uma hora. Depois de se recortar o ADN a 37° C durante trinta minutos com EcoRI, a endonuclease ** M de restrição nao e inactivada.
Por conseguinte, durante a segunda e última ** o ligaçao a 25 C durante sessenta minutos, quaisquer fragmentos de ADN genómico que se encontrem ligados a outros fragmen tos de ADN genomico sao presumivelmente reclivados durante a mesma reacçao, de modo que, no fim desta reacçao de restri— çao, virtualmente 100% dos fragmentos de ADN genómico tem uni dades de vectorete em ambas as extremidades. A ligaçao da uni dade de vectorete para cortar o ADN genómico inactiva aquele sitio de restrição particular.
Em seguida, diluiu—se o ADN (mistura reaccio— nal) ate a concentração de 10 ng/microlitro.
As bibliotecas de vectoretes de EcoRI foram
131 -
ί construídas usando este método e unidades de vectoretes 1 atê
I 8 conjuntamente com ADN dalinha de células 7387· li ií
Construiu—se também uma biblioteca de controlo EcoRI, em que as unidades de vectorete foram omitidas das ligações acima descritas.
a*
Operaçao 5 ** %
AmplificaÇao Aplicada as Bibliotecas de Vectoretes
Amostras de 10 ng de cada uma das bibliotecas construídas (para as unidades de vectoretes 1 a 8 e para a bi |blioteca de controlo de ADN menos vectoretes) foram submetidas a amplificaçao. Amplificou—se a sequência representada na Figura 12 usando oligonucleótidos 5θ e 63 como amplímerose as condiçoes de amplificaÇao usadas foram como as que se descreveram no Exemplo 8.
Analisaram—se 15 microlitros do produto de am j ** iplificaÇao por electroforese em gel de agarose.
1!
|!
resultado obtido ê como se mostra na Figura
14. Obteve—se um produto com o tamanho esperado (cerca de 600 ** *4 bp) em todas as reacções, com excepçao da quelas em que o ADN do substrato ê da biblioteca construída sem vectoretes na mis tura de ligaçao. Isto e de esperar, visto que a sequencia de oligonucleStidos (um dos amplímeros acima referidos) está den tro das unidades de vectoretes.
Estes resultados indicam que a concepção das unidades de vectoretes nao tem um efeito significativo sobre ** A Λ a amplificaÇao da sequencia de nucleótidos entre as unidades de vectoretes e qualquer sequência genómica pretendida (isto ê, o oligonucleótido 63, acima referido.
Os resultados obtidos estão representados na
132 -
Figura l4 que representa uma fotografia de um gel manchado com brometo de etídio que mostra os produtos obtidos como se refe re em segui dal
1. Biblioteca te 1. construi da com ADN 73θ7 + uni dade de vectore—
2. Biblioteca te 2. construída com ADN 7387 + uni dade de vectore—
3· Biblioteca te 3. construída com ADN 7387 + uni dade de vectore—
4. Biblioteca te 4. construída com ADN 7387 + unidade de vectore—
5· Biblioteca te 5· construída com ADN 7387 + unidade de vectore—
6. Biblioteca te 6. construi da com ADN 7387 + uni dade de vectore—
7- Biblioteca te 7. construída com ADN 7387 + unidade de vectore—
8. Biblioteca construída com ADN 7387 menos vectoretes.
9. Marcador 0X174/HealII.
10. Marcador 0X174 HealII.
11. Biblioteca construída com ADN 7387 + uni dade de vectore—
te 8.
Obtêm—se um produto com o tamanho esperado, em qualquer doe casos.
Exemplo 10
Este Exemplo efectuou-se usando o Método X, como se descreveu anteriormente na presente memória descritiva
Construíram—se bibliotecas de vectoretes EcoRI usando este método e as unidades de vectoretes 1 a 7» como se definiu acima na presente memória descritiva e ADN da linha
133 -
de células 73θ7
Construiu—se também uma biblioteca de EcoRI de controlo, em que se omitiram as unidades de vectoretes das ligações acima descritas,
Amplificação Aplicada às Bibliotecas de Vectoretes
Submeteram—se 10 ng de cada uma das bibliotecas construídas (para as unidades de vectoretes 1 — 7 e a biblioteca de controlo de ADN menos vectoretes) a amplificaçao. A sequencia representada no Exemplo 8 foi amplificada usan oligonucleótidos 58 e 63 como amplímeros. Usaram—se as condi— çoes de amplificaçao descritas no Exemplo 8.
Analisaram—se 15 microlitros do produto por electroforese em gel de agarose.
resultado ê como se representa na Figura 15 Produziu—se um produto do tamanho esperado (cerca de 600 bp) em todas as reacções, excepto naquelas em que o ADN de substrato ê da biblioteca construída sem vectoretes na mistura de ligaçao. Isso e comó se esperava, visto que a sequencia do oligonucleótido 58 (um dos amplímeros acima referidos) fica dentro das unidades de vectorete.
As pistas da fotografia representada na Figu— ra 15 sao as seguintes:
1. Marcador 0X174 HaelII.
2. Produto dade de da amplificaçao vectorete 1. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
3- Produto da amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 + uni—
dade de vectorete 2.
4. Produto de amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 + uni—
dade de vectorete 3·
134 -
5. Produto dade de da amplificaÇao vectorete 4. da bibliote ca de ADN 7387 + uni—
6. Produto dade de A* de amplificaÇao vectorete 5· da bibliot e ca de ADN 7387 + uni—
7. Produto dade de A4 da amplificaÇao vectorete 6. de biblioteca de ADN 7387 + uni—
8. Pro dut0 dade de *4 da amplificaÇao vectorete 7· da biblioteca de ADN 7387 + uni—
9- Produto de amplificaÇao da biblioteca de ADN 7387 meno s
vectoretes.
10. Marcador 0X174 HaelII.
Em cada biblioteca, obtêm—se o resultado esperado.
A4
Estes resultados indicam que a concepção das
A* unidades de vectorete nao tem qualquer efeito significativo sobre a amplificaÇao da sequência dos nucleótidos entre as uni dades de vectorete e qualquer sequência genómica pretendida (isto ê, oligonucleótido 63, acima referido).
i
Exemplo 11
Este Exemplo efectuou—se de acordo com o Meto do XI, como se referiu acima na presente memória descritiva.
Construíram—se bibliotecas de vectoretes de EcoRI usando este método e as unidades de vectoretes 1 a 7 e ADN da linha de células 73θ7·
Construiu—se tambám uma biblioteca de contro—
A* lo em que se omitiram as unidades de vectoretes nas ligações acima descritas.
** %
Amplificação Aplicada as Bibliotecas de Vectoretes
Submeteram-se 10 ng de cada uma das bibliote—
135 -
cas construídas (para as unidades de vectoretes 1 a 7 e para a bibliotece de controlo de ADN menos vectoretes) à reacçao de cadeia com polimerase. Amplifi cou—se a sequência representada no Exemplo 1 usando os oligonucleótidos 58 e 63 como am—
A* «tf plxmeros. Empregaram—se as condiçoes de amplificaçao descritas no Exemplo 8.
Anali saram—se 15 microlitros de cada produto por electroforese em gel de agarose.
resultado obtido ê como se mostra na Figura l6. Em todas as reacçoes, se produziu um produto com o tamanho esperado (cerca de 600 bp ) , com excepção do substrato de ADN da biblioteca construída sem vectoretes na mistura de li— gaçao. Isto ê como se esperava, visto que a sequência do oli— gonucleótido 58 (um dos amplxmeros acima referidos) está dentro das unidades de vectoretes.
As pistas da fotografia representada na Figu—
ra l6 sao as seguintes:
1. Marcador 0X174 HaelII.
2. • «tf Produto da amplificaçao da biblioteca de ADN 73&7 + uni—
dade de vectorete 1.
3. «tf Produto de amplificaçao da biblioteca de ADN 73θ7 + uni-
dade de vectorete 2*
4. «tf Produto da amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 + uni—
dade de vectorete 3·
5. Produto de amplificaçao de biblioteca de ADN 7387 + uni—
dade de vectorete 4.
6. Produto dade de «tf de amplificaçao vectorete 5· da biblioteca de ADN 7387 + uni—
7. Produto «tf de amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 + uni-
dade de vectorete 6.
8. Produto «tf da amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 + uni—
136 -
9· Produto da amplificaçao da biblioteca de ADN 73θ7 menos vectoretes.
10. Marcador 0X174 HaelII.
Estes resultados indicam que a concepção das ** A unidades de vectoretes nao tem qualquer efeito adverso significativo sobre a amplificaçao da sequência de nucleótidos entre as unidades de vectorete e qualquer sequência fenómica pre tendida (isto é, oligonucleótido 63, acima referido).
Exemplo 12
Este Exemplo efectuou—se de acordo com o Meto do XII, como se definiu anteriormente na presente memória des critiva.
Construíram—se bibliotecas de vectoretes EcoRI usando este método e unidades de vectoretes 1 até 7 e ADN da linha de célula 73Ô7·
Construiu—se também uma biblioteca de contro— i
lo de EcoRI em que se omitiram também as unidades de vectore— tes das ligações acima descritas.
Amplificaçao Aplicada a Bibliotecas de Vectoretes
Submeteram—se a amplificaçao, 10 ng de cada uma das bibliotecas construídas (para as unidades de vectoretes 1 a 7 e a biblioteca de controlo de ADN menos vectoretes. Amplificou—se a sequência representada no Exemplo 1 usando oligonucleótidos 5θ e 63 como amplxmeros. Empregaram—se as condiçoes de amplificaçao descritas no Exemplo 8.
Analisaram—se 15 microiitros do produto de am plificaÇao por electroforese em gel de agarose.
resultado obtido ê como se representa na Fi
137 gura 17« Obteve—se um produto com o tamanho esperado (cerca de
600 bp) em todas as reacções, excepto quando o ADN de substra cto ê resultante da biblioteca de controlo construída sem vectoretes na mistura de ligaçao. Isto e como se esperava visto que a sequência do oligonucleótido 58 (um dos amplímeros acima mencionados) se encontra dentro das unidades de vectorete.
As pistas da fotografia representada na Figu— aa ra 17 sao as seguintes:
1. Marcador 0X174 HaelII.
2. Produto dade de da amplificaçao vectorete 1. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
3. Produto dade de aa da amplificaçao vectorete 2. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
4. Produto dade de aa da amplificaçao vectorete 3· da biblioteca de ADN 7387 + uni—
5. Produto dade de aa da amplificaçao vectorete 4. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
6. Produto dade de aa da amplificaçao vectorete 5. I da biblioteca de ADN 7387 + uni—
7. Produto dade de ' ta da amplificaçao vectorete 6. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
8. Produto dade de aa da amplificaçao vectorete 7· da biblioteca de ADN 7387 + uni —
9. Produto aa da amplificaçao da biblioteca de ADN 7387 meno s
vectoretes.
10. Marcador 0X17^ HaelII.
Estes resultados indicam que a concepção das unidades de vectoretes nao tem efeitos significativos sobre a ** Λ Λ amplificaçao da sequencia de nucleotidos entre as unidades de vectoretes e qualque sequência genómica pretendida (isto ê, oligonucleótido 63, acima mencionado).
138 -
Exemplo 13
Este Exemplo efectuou-se de acordo com o Meto do XIII, como se descreveu anteriormente na presente memória descritiva.
Construiram—se bibliotecas de vectoretes EcoRI usando este método e unidades de vectoretes 1 até 7 e ADN da linha de células 73θ7·
Construiu—se também uma biblioteca de controlo de EcoRI em que se omitiram as unidades de vectoretes da reacçao de ligaçao.
Amplificaçao Aplicada às Bibliotecas de Vectoretes
Submeteram—se a amplificaçao 10 nanogramas de cada uma das bibliotecas construídas (para as unidades de vectoretes 1 a 7 e para a biblioteca de controlo de ADN menos vectoretes). Amplificou—se a sequência representada no Exemplo 1 usando Oligonucleótidos 58 e 63 como amplímeros. Empre— garam—se as condiçoes de PCR descritas no Exemplo o.
/
Anali saram—se 15 microlitros do produto da am plificaçao por eiectroforese em gel de agarose.
resultado obtido ê como está representado na Figura l8. Obteve—se um produto do tamanho esperado (600 . ** bp) em todas as reacçoes, excepto quando e substracto de ADN ê da biblioteca construída sem vectoretes na mistura de liga— Çao. Isto ê como se esperava, visto que a sequência de oligonucleótidos 58 (um dos amplímeros acima referidos) se encontra dentro das unidades de vectoretes.
As pistas da fotografia representada na Figu** ra lo sao as seguintes:
1. Marcador 0X174 Haelll.
139 -
2. Produto dade de da amplificaÇao vectorete 1. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
3. Produto dade de da ampiificaçao vectorete 2. da bibliot e ca de ADN 7387 + uni—
4. Produto dade de «M da amplificaÇao vectorete 3· da biblioteca de ADN 7387 + uni—
5. Produto dade de da amplificaÇao vectorete 4. da bibliot e ca de ADN 7387 + uni—
6. Produto dade de da ampiificaçao vectorete 5· da bibliot e ca de ADN 7387 + uni—
7. Produto dade de «M da ampiificaçao vectorete 6. da biblioteca de ADN 7387 + uni—
8. Produto dade de «tf da amplificaÇao vectorete 7· da biblioteca de ADN 7387 + uni-
9. Produto «tf da amplificaÇao da biblioteca de ADN 7387 meno s
vectoretes.
10. Marcador 0X174 HaelII.
Estes resultados indicam que a concepção das unidades de vectoretes nao tem qualquer efeito significativo ** Λ Λ sobre a amplificaÇao da sequencia de nucleótidos entre as uni dades de vectoretes e qualquer sequência genómica pretendida (veja—se oligonucleótido 63 acima referido).
Exemplo 14
Construíram—se cinco bibliotecas de vectoretes com EcoRI diferentes usando ADN da linha de células 73θ7 e unidades de vectoretes 8, da seguinte maneira!
1) (a) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Método IX.
(b) Construi u— se uma biblioteca usando 0 Método X.
(c) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Método XE.
(d) Construiu—se uma bublioteca usando 0 Método XII.
140 -
(e) Construiu—se uma biblioteca usando o Método XIII.
2) Antes da amplificaÇao, as bibliotecas construídas em l), acima referidas, foram submetidas a reacções de bloqueio da extremidade 3’.
Μ M
Tampões e Outras Soluçoes Correntes
7-2.1 Tampao de T7 ADN polimerase 5*
200 mM de Tris.HCl (pH 7,5)
100 mM de MgCl2
25O mM de NaCl
7- 2. 2. dNTPs- d ATP
1 mM de dTTP
1 mM de dGTP
1 mM de dCTP
completada com água desionizada esterilizada.
7. 2. 3 ddATP í
mM de ddATP diluída com água desionizada esterilizada
Realizou—se a adiçao de um resíduo de ddA nas extremidades 3’ dos produtos provenientes de 1), acima referi do.
Misturaram—se os seguintes componentes num tu bo de Sarstedt com 0,5 ml:
0,5 microlitros de ADN dz Operaçao 1) acima descrita 4 microlitros de tampao de T7 ADN polimerase 5X (7-2.1) microlitros de solução de dNTP—dATP (7-2.2) microlitros de solução de ddATP (7-2.3) unidade de T7 ADN polimerase (Sequenase)
HgO até perfazer 20 microlitros.
l4l -
Conservou—se o tubo a 37° C durante trinta mi ** o
Jnutos. Desnaturou—se a enzima por incubaçao a 7θ C durante íi
I dez minutos.
ί
A concentração do ADN em todas as amostras foi seguidamente diluida com água atê se obter 10 ng/microlitro.
I ·*
Amplificaçao Aplicada a Bibliotecas de Vectoretes i
-i
I \ **
Submeteram—se a reacçao em cadeia com polimé— rase 10 nanogramas de cada uma das cinco bibliotecas construí idas. A sequência indicada no Exemplo 8 foi amplificada usando os oligonucleótidos 58 e 63 como amplímeros. Empregaram—se as condiçoes de amplificaçao referidas no Exemplo 8.
Analisaram—se 15 microlitros do produto da am IplificaÇao por electroforese em gel de agarose.
resultado obtido está representado na Figu— i ra 19· i
í As pistas da auto—radiografia representada na
I jFigura 19 sao as seguintes:
I1. Marcador 0X174'HaelII.
ί
2. Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore te 8 do Método IX + bloqueio da extremidade 3'·
3· Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore tes 8 Método X + bloqueio da extremidade 3’·
4. Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore tes 8 Método XI + bloqueio da extremidade 3*·
5· Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore tes 8 Método XII + bloqueio de extremidade 3’·
6. Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore tes 8 Método XIII + bloqueio da extremidade 3'·
Todos os produtos eram do tamanho esperado.
142 -
|! Exemplo 15 íj
Construíram—se cinco bibliotecas de vectoretes EcoRI diferentes usando ADN da linha de células 7387 β uni dade de vectoretes 8.
a ) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Método IX.
b) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Mêto do X.
c) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Mêt 0 do XI.
d) Construiu-se uma biblioteca usando 0 Método XII.
e) Construiu—se uma biblioteca usando 0 Método XIII.
com a excepção de 0 oligonucleót: ido 2 ser nao fosforilado.
Prepararam—se as bibliotecas b) atê e) como se descreveu para os Métodos IX a XII. Trataram—se as biblio— j tecas b), c), d), e) e uma alíquota da biblioteca a) com ddATP i e T7 ADN polimerase (sequenase) para bloquear as extremidades
3' livres.
** AS
As condiçoes foram idênticas as que se descre veram no Exemplo 14.
Realizou—se a amplificaçao em todas estas bibliotecas.
Amplificou-se a sequência representada na Figura 12 usando os oligonucleótidoβ 63 e 58. Empregaram—se as ** n condiçoes descritas no Exemplo o.
Analisaram-se 15 microlitros do produto da am plificaÇao por electroforese em gel de agarose (1,4 % em peso/ /volume de gel).
Os resultados obtidos sao como esta representado na Figura 20.
As pistas da fotografia representada na Figura 20 sao as seguintes:
- 143 -
1. Produto da amplificaçao de ADN 73θ7 + unidade de vectore te 8 Método IX (oligonucleótido 2 nao fosforilado).
2. Produto da amplificaçao de ADN 7387 + unidade de vectore te 8 Método IX + bloqueio da extremidade 3’ (oligonucleó ** .
tido 2 nao fosforilado).
3· Produto da amplificaçao de ADN 7387 + unidade de vectore te 8 pelo Método X + bloqueio da extremidade 3’ (oligonu cleótido 2 nao fosforilado).
4. Produto da amplificaçao de ADN 7387 + unidade de vectore te 8 pelo Método XI + bloqueio da extremidade 3' (oligo— nucleótido 2 nao fosforilado).
5· Produto da amplificaçao de ADN 7387 + unidade de vectore te 8 pelo Método XII + bloqueio da extremidade 3’ (oligo nucleótido 2 nao fosforilado).
6. Produto da amplificaçao de ADN 7387 + unidade de vectore tes 8 pelo Método XIII + bloqueio da extremidade 3’ (oli gonucleótido 2 nao fosforilado).
7. Marcador 0X174 HaelII.
Todos os produtos eram do tamanho esperado.
Exemplo 16
Efectuou—se este Exemplo para mostrar que o produto com cerca de 600 pb representado nas Figuras 13 a 20 ê um produto de oligonucleótidoe 58 a 63 (veja-se Exemplo 8) e nao um produto de um dos amplímeros.
Para cada amplificaçao, usaram—se 10 nanogra— mas de cada uma das seguintes bibliotecas de vectoretes:
uma biblioteca preparada usando ADN 7387 e es unidades de vectoretes 1 a 8 no Método VIIj uma bibliote a preparada usando ADN 7387 e a unidade de vecto rete 8 usando o Método VII + bloqueio da extremidade 3’ (veja -se Exemplo 14 para pormenores)»
144 -
uma biblioteca preparada usando ADN 73θ7 e unidade de vectore te 8 (oligonucleótido lb nao fosforilado) usando o Método VII + bloqueio da extremidade 3' (veja—se Exemplo 15 para pormenores)} uma biblioteca preparada usando ADN 73θ7 menos vectorete usan do o Método VII.
Para mostrar que os produtos obtidos no Exemplo 8 a partir de bibliotecas construídas com unidadesa de ve ctoretes 1 a 8 eram todos idênticos, os produtos de amplifica Çao com a sequência correcta representados na Figura 16 (produtos 2—8) e o produto representado na pista 11 da Figura l4 foram sequenciados usando oligonucleótidos 59 e 66.
A Figura 21 representa uma fotocópia da auto—radiografia obtida a partir do sequenciamento dos produtos 2 a 8 da Figura 16 com o oligonucleótido 66.
A auto—radiografia mostra também o sequenciamento de partes do intrao 8 e do exao 9 do gene de fenil—ala— nina—hidroxilase (fenil—cetonória — PKU) como controlo. Os produtos de amplificaçao 2-8 aparecem da esquerda para a di reita (como se representa na Figura l6) e sao todos idênticos. A ordem das pistas ê CGTA.
A Figura 22 mostra os dados da sequência de nucleótidos gerados a partir dos produtos descritos no Exemplo l6.
As bases 1 a 16 estão na extremidade 3' da se quência do intrao 8 de PKU publicados.
As bases 7 a 452 constituem novos dados de se quencia do intrao 8 de PKU determinados de acordo com o meto—
M do da presente invenção.
Exemplo 17
145 Sequenciou—se o produto com cerca de 220 bp do Exemplo 7 (i)» pistas 7, 8, 9, 10 e 11 usando os oligonucleótidos 62 a 67·
Assim, o produto de 220 bp do Exemplo 7 (i) foi :
1) amplificado em ciclos constituídos por três fases! a) 60° dois minutos} b) 72°C, três minutos e c) 91°C, dois minu tos} realizando—se quarenta ciclos (usou—se 0,5 microgra mas de ADN) por 100 microlitros carregados/pista (veja— -se Figura 24 a)}
2) o produto 1) acima referido foi em seguida purificado por gel e amplificado em ciclos de duas operaçoes: a) 60° C, quatro minutos e b) 91° C, dois minutos} tendo—se rea lizado quarenta ciclos (veja—se Figura 24 b).
As posiçoes dos oligonucleótidos 5θ, 62 e 67 ** Λ sao representadas na.Figura 23. Na Figura 25, a sequencia estabelecida em a) ê a sequência lida com o oligonucleótido 62} a sequência estabelecida em b) é a sequência lida com o olido nucleótido 67· Em a) e b) a sequência sublinhada é a sequência complementar/iríversa lida com o oligonucleótido 62 e 67·
A sequência global 5’-^3’ é representada na Figura 25 c), em que as posiçoes 2—31 leem a sequencia 5' — 3’ do oligonucleóti— do 62} ** · Λ A as posiçoes 75 — 104 leem a sequencia inversa complementar do oligonucleótido 67} as posiçoes 95 — 104 (marcadas com uma linha contínua por cima da sequência) constituem as primeiras dez bases da sequência do interao publicadas (veja—se Biochemistry 1985, 24, páginas 556 — 561, Kwok e col.)} as posiçoes 2 — 104 estão de acordo com a sequencia publicada ** A ** para o exao I de PKU e partes das sequências do interao} a posição 105 para diante e constituída pelos dados da nova
jsequência para o interao 1 de PKU.
i
Exemplo 18
Submeteu—se o exao V do gene de alfa—antitri— psina ao método de acordo com a presente invenção (veja—se Fi gura 26) usando os seguintes oligonucleótidos:
(primário vectorete universal), 60 (oligonucleótido anunha do do vectorete universal), 68 (exao V 5' )* * ** 69 (exao V 5' ani inhado) e 70 (exao V 3· ).
• A biblioteca de vectorete fez—se com ADN genó mico cortado com EcoRI com oligonucleótidos de vectoretes tem perados (87/40 como se define na presente memória descritiva) e procedeu—se a ligaçao.
A amplificaÇao efectuou—se procedendo da seguinte maneira.
Usaram—se 100 ng da biblioteca de vectoretes numa primeira operaçao de amplificaÇao, procedendo da seguinte forma i
I100 ng de ADN da biblioteca de vectoretes Oligonucleótidos 58 + 68 (100 picomoles)
100 micromoles de dNTP unidades de Taq polimerase
Dilui—se atê perfazer o volume 100 microlitros com água destilada jil tampao: 5θθ mM KC1 100 mM de MgClg l4 mM de MgCl 0,1% de gelatina
Condiçoes de realizaçao da Reacçao ** ·* o
Operaçao de desnaturaÇao inicial 93 C du rante dez minutos.
- 147 -
39 ciclos de 93° C, doi s minutos
65°C , doi s minutos
72o C, oito minutos.
Ciclo final 72° C, dez 1 minuto s.
resultado está representado na Figura 27 (a) na pista 4. A pista 3 representa uma reacçao de amplificaÇao de cpntrolo usando oligonucleótidos 68 e 70 para originar um produto com cerca de 200 pb.
A operaçao primaria de amplificaÇao originou uma mancha com tamanho aproximado esperado. A mistura reaccio nal primária foi em seguida diluída da seguinte forma!
microlitro do produto da pista 4 da Figura 27 (a) foi diluído atê perfazer 1 ml com ddH 0 , » ~ 3 , 2 (isto e, diluição de 10 ) microlitro desta solução foi usada em subsequentes «peraçoes de PCR (total = 100 microlitros) (isto ê, diluição total = 10^) e reamplificou—se usando uma gama de pares primários como se segue:
Segundo PCR (com oligonucleótidos aninhados) /il do produto da pista 4 da Figura 27(a) (10^) ADN 100 pmoles dos oligonucleótidos 60 + 69
p.1 de tampao 10X 100 /imoles de dNTP unidades de Taq polimerase
Tampões 10X : 5θ0
100
0,1
mM de KC1
mM de Tris, pH 8,3
mM de MgCl2
% de gelatina
Diluiu—se com água de 100 microlitros.
bidestilada até ao volume
148 -
Condiçoes de Realizaçao da Reacçao
Fase inicial de desnaturaçao dez minutos.
95°C durante produto secundário da amplificaçao verifica —se ser um produto de 3»θ kb nas pistas 1, 2 e 3 da Figura 27 (b).
À Figura 27 (b) ê uma fotografia de um gel de agarose que mostra o produto da amplificaçao secundária entre os oligonucleótidos 6θ e 69·
A pista 1 mostra o produto de ria entre os oligonucleótidos a pista 2 mostra o produto de ria entre os oligonucleótidos a pista 3 mostra o produto de ria entre oligonucleótidos 60
3,0 kb da ampli fi caçao secundá
60 e 69i
3,0 kb da 60 e 69» ampli fi caÇao secundá
3,0 kb da e 69; amplifi caçao secundá
a pista 4 mostra o marcador 0X174 clivado com HaelII e o marca dor λ. clivado com HindIII.
g?el foi manchado para uma membrana de nylon e ensaiado com uma amostra alfa—1 de antitripsina. Observou— —se uma única banda do tamanho correcto (3>θ kb) e representa — se na Figura 27 (c).
A Figura 27 (c) á uma auto-radiografia de um filtro de nylon (manchado a partir do gel representado na Figura 27 (b)) que tinha sido ensaiado com uma amostra (/,-1 an— titripsina. A posição dos marcadores de ADN esta representada.
A pista 1 refere—se ao produto de 3»θ kb da amplificaçao secundária entre oligonucleótidos 60 e Ó9i ** 9 a pista 2 mostra o produto de 3»θ kb de amplificaçao secundaria entre os oligonucleótidos 60 e 69» a pista 3 mostra o produto de 3»θ kb da amplificaçao secunda—
- 149 -
ria entre os oligonucleótidos 60 e 69.
Exemplo 19
D5 é uma sequencia genómica anónima que tinha sido cionada como o fragmento de 474 bp, Xbal — EcoRI. A sequência de D5 foi determinada pelos métodos normais (Newton e col., Nucleic Acide Research 16, 8233 — 8243, 1983) e está re presentada na Figura 29·
Sintetisaram—se dois primários de oligonucleó tidos 71 e 72:
5' AAGTTTGAGCATAGGAAAAGTTCTGTGCCC
5’ AGTTCTGTGCCCAAAATTGCATCCAAG ** £ £
A posição dos oligonucleótidos 71 e 72 e indi cada na Figura 29«
Isolou—se ADN genómico da linha de células de linfoblastoides GM 7387 (NIGMS, repositório de células mutantes genéticas humanas) e digeriram-se partes alíquotas (20 mi crogramas) com as s.eguintes enzimas de restrição: Dral, Bell, 1 ΦΛ
HindIII e HaelII. Prepararam—se então bibliotecas de vectoretes de acordo com o Método X.
Realizaram-se amplificações primárias utilizando alíquotas de cada biblioteca, como se descreve na presente memória descritiva mais adiante.
Num tubo de Sarstedt de 0,5 mililitro, misturaram—se os seguintes componentes:
ng da biblioteca de vectoretes construída 100 pmoles do oligonucleótido 58 100 pmoles do oligonucleótido 71 100 mi cromoles de dNTP microlitros de tampao 10X
I5O -
Tampao 10X:
500 mM de KC1
100 mM de Tris.HCl (pH 8,3)
10 mM de MgCl2
0,1% de gelatina.
! Ajustou—se o volume com água bidestilada este rilizada de maneira a ser igual a 100 microlitros. Pipetaram—
II-se 50 microlitros de óleo mineral leve (sigma), cuidadosamen i
í te, por cima da mistura reaccional, a fim de evitar a evapora I çao.
j 0 tubo foi então aquecido a 96° C (num bloco ! de secagem programável Techne PHC—1 que tinha sido equilibra— li do a 96° C). Deixou—se desnaturar o ADN durante 10 minutos a | 96° C. Deixou—se arrefecer o bloco até 90° C. λ mistura reac—
I j cional, adicionaram—se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus).
! Empregaram—se as seguintes temperaturas e intervalos de tempo para amplificar a sequência entre os oligonucleótidos 5θ e 71: ί
i 92° G, dois minutos
I 65o c, doi s minutos
72° C, cinco minutos.
í í
Realizaram—se quarenta ciclos. Durante o ciclo final, manteve—se a mistura reaccional a 72° C durante dez minutos.
Das misturas reaccionais, retiraram—se alíquo tas (15 microlitros). Adicionou—se mistura carregada com corante (5 microlitros) e analizaram-se as amostras em geles con tendo 1,4 % de agarose.
Mistura da Carga de Corante
155 (peso/volume)
0,05% (peso/volume)
0,05% (peso/volume) dissolvidos em TBE IX.
Ficoll 400 azul de bromofenol xileno—ciano1 ** f
Realizou—se uma amplificaÇao secundaria sobre
151 -
uma alíquota das misturas reaccionais primárias. Diluiu-se uma alíquota da mistura reaccional primária (2 microlitros) com água até perfazer 400 microlitros. Colocou—se uma alíquota do material diluído (2 microlitros) num tubo de Sarstedt de 0,5 ml.
Adicionaram—se ao tubo os seguintes componentes:
100 picomoles de oligonucleótido 60 100 picomoles de oligonucleótido 72 100 mi cromoles de dNTP microlitros de tampao 10X.
Tampão IPX: 500 mM de KC1
100 mM de Tris.HCl (pH 8,3) mM MgCl2 0,1% de gelatina
Completou—se o volume até perfazer 100 microlitros com água bidestilada esterilizada. Sobre a mistura reaccional) pipetou—se cuidadosamente 50 microlitros de óleo mi neral leve (Sigma) para evitar a evaporaçao.
Aqueceu—se então o tubo ate 90 C (no Techne Dri—Block PHC—1 programável, que tinha sido equilibrado a 96° C). Deixou—se desnaturar o ADN durante dez minutos a 96° C. Deixou—se arrefecer o bloco até 90° C. λ mistura reaccional, adicionaram—se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus). Empregaram-se as seguintes temperaturas e intervalos de tempo para amplificar a sequência entre os oligonucleótidos 60 e 72:
92° C, dois minutos
65° C, doi s minutos
72° C, cinco minutos
Realizaram—se trinta e sete ciclos Durante o último ciclo, manteve—se a mistura reaccional a 72° C durante dez minutos.
Das misturas reaccionais retiraram—se amostras
152 -
ji alíquotas (15 microlitros). Adicionou—se uma mistura de carga I de corante (5 microlitros) e as amostras foram analisadas em I gel de agarose a 1,4%.
Mistura de Carga de Corante
15% (peso/volume) de Ficoll 400 0,05% de azul de bromofenol 0,05% de xileno—cianol dissolvidos em TBE lx
As bibliotecas (Haelll, HindIII, Bell, Dral) originaram produtos distintos com um intervalo de tamanhos de 0,4 — 1,5 kb (Figura 3θ)« A partir do tamanho observado dos produtos, foi possível preparar um mapa provisório de restrição (Figura 31)· Os produtos foram depois analisados por di—
MM gestões de restrição. Os produtos autênticos puderam ser clivados de maneira a originarem os fragmentos com o tamanho pre visto. Assim, o produto com 0,82 kb, Bcl, pode ser clivado por HundIII, para originar um produto de 0,78 kb e pode também ser clivado por Haelll para originar um fragmento de 0,75 kb. A análise do produto de 0,82 kb Bell por HindIII e Haelll ê representada na Figpra 3θ· Observaram—se os produtos previs— /
tos e o produto Bell foi em seguida eluído para ser submetido à análise da sequência.
Assim, na Figura 3θ» está representado, na
M pista 2, o produto resultante da amplificaçao de uma bibliote ca de vectoretes Haelll, o produto que resulta da amplifica— ** 9 çao de uma biblioteca de vectoretes de HindIII esta represen—
M tado na pista 3» o produto que resulta da amplificaçao de uma biblioteca de vectoretes Bell está representado na pista 4; e
M o produto resultante da amplificaçao de uma biblioteca de vec toretes Dral está representado na pista 5· A pista 7 mostra
M os fragmentos obtidos depois da digestão do produto Bell com a enzima de restrição Haelll. A pista o mostra os fragmentos obtidos após a digestão do produto Bell com a enzima de res—
M triçao HindIII. A pista 9 mostra o produto Bell, as pistas 1
153 -
e 6 contêm marcadores de ADN de 1 kb (BRL).
Analise de Digestão com Enzimas de Restrição de Produtos de
Ve ctoret e s
16 mi crolitro s de mi stura da aa reacçao aa de amplificaçao
2 mi crolitro s de tampao de aa restrição 10X
2 mi crolitro s de enzima de ta restrição •
Incubou—se a amostra a 37° C durante uma hora. Adicionaram—se 5 microlitros de mistura de carregamento de co rante a amostra e anali saram—se os produtos em gel de agarose a 1,4%.
Sequenciamento
Eluiu—se o produto Bell do gel de agarose e sequenciou—se usando o oligonucleótido 59 e a metodologia cor rente (Newton e col., Nucleic Acids Research 16, 8233 — 8243, 1988). A sequência está representada na Figura 31· Concebeu— -se um outro primário (73) pera esta sequência e usou-se nas operaçoes seguintes!.
5’ GGCCTTTGANNAAGAGAAGAGTCAAGGATG exame da sequência confirma a presença dos sítios de HaelII e HindIII, previstos pelos ensaios de acordo com o método da presente invenção.
Exemplo 20
Exame do Genoma de Chlamydia Usando o Método de Acordo com a aa
Presente Invenção
Desenvolveu-se o serotipo L2 de Chlamydia tra— chomatis em cêl las de McCoy tratadas com cicio—heximida. Purificaram—se os corpos elementares com gradientes de glicerol “
-tartarato originando 10 corpos elementares. Extraiu-se o ADN por tratamento com proteinase K/SDS, feno 1—clorofórmio e recu
154 -
perou-se por precipitação com etanol. Recuperaram-se 90 mg de ! ADN dos quais 900 ng se calcularam ser de ADN de Chlatnydia e
I! f il os restantes serem de ADN de rato derivado das células de McCoy.
Digeriu-se ADN (5 microgramas equivalentes a 50 ng de ADN de Chlamydia) tanto com EcoRI como com BamHI. Prepararam—se bibliotecas de vectoretes de acordo com o Método X usando os oligonucleótidos apropriados (27, 40, EcoRI,
31, 40 , BamHI). As bibliotecas foram diluídas atê se obter um volume final de 100 microlitros.
Sintetisaram-se dois primários de oligonucleó tidos sobre a sequência de consenso de MOMP (proteína em maior proporção da membrana exterior) de Chlamydia)L2 (Stephens e col., J. Bacteriology 169, 3079- 3θθ5» 1987):
5' CTGCTCACGTAAATGCACAATTCCG
5’ AACCGAGAGCAAAAGCCATATTGGC aa
Ampli fi caÇao
Num/tubo de Sarstedt de 0,5 ml, misturaram—se os seguintes componentesJ microlitros de bibliotecade vectorete RcoRI 20 microlitros de tampao 5X
Tampao 5X: 335 niM de Tris.HCl (pH
8,5) mM de (NH^SO^ mM de MgCl 50 mM 2—mercapto—etanol 0,8 mg/ml de albumina de soro bovino
100 pmoles de oligonucleótido 58 100 pmoles de oligonucleótido 74 200 mi cromoles de dNTP.
155 -
Ajustou—se o volume a 100 microiitros com água didestilada esterilizada, pipetaram—se cuidadosamente 50 mi— crolitros de óleo mineral leve (Sigma) para cima da mistura reaccional, a fim de evitar a evaporaçao.
Em seguida, aqueceu-se o tubo a 96° C (num Te chne Dri—Block PHC—1 programável que foi equilibrado a 96°C). Deixou—se desnaturar o ADN durante dez minutos a 96°C. Deixou —se depois arrefecer o bloco até 90° C. λ mistura reaccional adicionaram—se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus). Empregaram—se as seguintes temperaturas e intervalos de tempo para amplificar a sequência entre os oligonucleótidos 60 e 72í
92°C,
0,7 minutos
C, 0,7 minutos 72° C, 1 minuto
Realizaram—se quarenta ciclos. Retirou—se 10% da mistura reaccional para análise em gel de agarose. Os re—
Ar suitados obtidos estão representados na Figura 32, na qual a pista 1 mostra o marcador 0X174 clivado com HaelIIj a pista 2 mostra o .produto da amplificaÇao entre os oligonu— /
cleótidos 5θ e 74 usando 10 microiitros da biblioteca de EcoRI i e a pista 3 mostra o produto da amplificaÇao entre os oligonu— cleótidos 58 e 74 usando 1 microlitro da biblioteca de EcoRI.
Purificou—se o produto da amplificaÇao de uma biblioteca de EcoRI com oligonucleótidos 58 e 74. Realizou—se a amplificaÇao assimétrica (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 85, páginas 7652 - 7656, Outubro de 1988, U. B. Gyllenstein e H. Ehrlich) do produto com 5θ picomoles de oligonucleótido 74 e de oligonucleótido 58 durante trinta e cinco ciclos, como se descreveu acima. Purificou—se o produto amplificado numa coluna contendo G50 (como se descreve em Molecular Cloning —A laboratory manual, T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook,
- 156 -
Coid Spring Harbor Labotatory, 1982) e sequenciou-se com o oli gonu c leótido 59, como se descreve no Exemplo 17· A sequência esta representada na Figura 3A. A digestão de uma aliquota do produto de PCR com ou Hinfl ou Ciai confirma a presença destes sítios de restrição (Figura 34).
Na Figura 34, as pistas da fotografia sao as seguint e s:
Pista 1 — marcador de ADN 0X174 HaelII
Pi st a 2 — produto de EcoRI digerido com Ciai
Pi st a 3 — produto de EcoRI
Pi st a 4 — Produto de EcoRI digerido com Hinfl
Pi st a 5 — marcador de ADN 0X174 HaelII.
Exemplo 21
Amplificaçao Linear Aplicada ao Genoma de Chlamydia
Num tubo de Sarstedt com 0,5 ml, colocaram—se os seguintes componentes:
microlitros?de biblioteca de vectorete BamHI 20 microlitros de tampao 5X (definido no Exemplo 20)
100 picoraóles de oligonucleótido 75 200 mi cromoles de dNTP.
Ajustou—se o volume a 100 microlitros com água bidestilada esterilizada, pipetarara—se 50 microlitros de óleo mineral leve (Sigma), duidadosamente, colocados por cima da mistura reaccional a fim de evitar a evaporaçao.
Em seguida, aqueceu—se o tubo a 96° C (num Te chne Dri—Block PHC—1 programável que tinha sido equilibrado a 96° C. Deixou—se desnaturar o ADN durante dez minutos a 96° C. Deixou—se então arrefecer o bloco ate 90 C. A mistura reac— * cional adicionaram—se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus).
• Empregaram—se as seguintes temperaturas e intervalos de tempo
157 para amplificar a sequência entre os oligonucieótidos 75 θ o sítio de BamHI:
93° C, 0,7 minuto
65° c, 0,7 minuto
72° c, 1»5 minutos
I H· lo*
Realizaram—se quarenta ciclos. Em seguida adi cionaram—se à mistura reaccional 100 picomoles de oligonucle tido 58 e 2 unidades de Taq polimerase e continuou—se a ampl ficaçao durante mais vinte ciclos, como se descreveu acima· Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional por electroforese em gel de agarose (Figura 35)·
Realizou—se uma reacçao adicional em que se amplificou uma biblioteca de BamHI usando oligonucieótidos 75 e 58, sob as condiçoes reaccionais acima descritas. Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional por electroforese em gel de agarose (Figura 35)·
Na Figura 35» a pista 1 mostra o rçiarcador 0X174 clivado com HaelIIj í
a pista 2 mostra o produto da amplificaçao linear de uma biblioteca de vectoretes de BamHI usando oligonucleótido 75» a pista 3 mostra o produto resultante de vinte ciclos de amplificação secundária com oligonucieótidos 58 e 75» a pista 4 mostra o produto que resulta de trinta e cinco ciclos de amplificaçao secundária com oligonucieótidos 58 e 75»e a pista 5 mostra o produto que resulta de quarenta ciclos de amplificaçao primária com oligonucieótidos 58 e 75·
Exemplo 22
Construiu—se uma biblioteca genómica humana usando o vector cosmídio p Cos EMBL2, procedendo de acordo com maneiras de proceder publicadas (p. F. R. Little (1987) em
158 DNA Cloning — A Praticai Approach, Vol. III, páginas 19 — 42, editado por D. M. Glover). A biblioteca foi escolhida por hi— bridizaçao com a amostra KM19 (X. Estivill e col., (1987)» Na ture 326, 84O — 845). Identificaram—se diversos clones positi vos e seleccionou—se um clone 4,17 que continha a sequência KM19 num inserto de 40 kb.
Digeriu—se o cosmídio 4.17 com HindIII e preparou—se uma biblioteca de vectoretes de acordo com o Método X
Sintetizaram—se os dois o ligonucleótidos primários e 77:
5' GGAAGGCCTTCAAAATTAACAGTGTAGCC
5' GCTGCATCATATAAGTTGCC.
«tf
As posiçoes destes primários estão indicadas na Figura 36 (a).
Realizou—se uma ampiificaçao de PCR sobre uma alíquota da biblioteca, como se descreve mais abaixo na presente memória descritiva.
Num tubo de Sarstedt com 0,5 ml de capacidade, mi sturaram-se as seguintes quantidades de componentes:
0,1 picograma de biblioteca de vectoretes de cosmídios 100 picomoles de oligonucleótido 5θ 1O0 picomoles de oligonucleótido 76 100 /iM de dNTP «tf microlitros de tampao 10X
Tampão 10X: 500 mM de KC1
100 mM Tris.HCl (pH 8,3) mM de MgCl2
0,1% de gelatina.
Preparou—se uma segunda mistura reaccional co locando os seguintes componentes num tubo de Sarstedt com a
159 capacidade de 0,5 ml:
0,1 pi cograma de
100 pi comole s de
100 pi comole s de
100 yM de dNTP
10 mi crolitros
biblioteca de vectorete oligonucleótido 58 oligonucleótido 77 de tampao 10X.
de co smí dio
Ajustou-se o volume das misturas reaccionais de maneira a perfazerem 100 microlitros com água bidestilada esterilizada. Pipetaram—se para cima da mistura reaccional 50 microlitros de óleo mineral leve (Sigma), cuidadosamente, a ee ee fim de evitar a evaporaçao. Os tubos foram então colocados num aquecedor cíclico térmico (Techne Dri—Block PHC—1 Programável que tinha sido equilibrado a 96° C). Deixoi—se arrefecer o bloco até 90° C. λ mistura reaccional, adicionaram—se 2 unidades de Taq polimerase (Cetus). Empregaram—se as seguintes temperaturas e intervalos de tempo para 58 e 76 e 58e 77:
92° c, doi s minutos
65° c, doi s minutos
72° c, cinco 1 minutos.
Realizaram-se quarenta ciclos. Durante o ciclo final, manteve—se a mistura reaccional a 72° C durante dez minutos.
Das misturas reaccionais, retiraram—se alíquo tas (15 microlitros). Adicionou—se uma mistura de carga de co rante (5 microlitros) e analisaram—se as misturas em gel de agarose a 1,4%.
Mistura de Carga de Corante
15% em peso/volume de Ficoll 400
0,05% em peso/volume de azul de bromofenol
0,05% em peso/volume de xileno-cianol
dissolvidos em TBE lx.
l60 -
Os resultados estão indicados na Figura 36 (to )í j Pista 1 h
j Pi st a 2
Pista 3
I
Pista 4 corresponde a marcador ADN 0X174 HaelII corresponde a produto com 230 com bp (oligonucleóti— do 58, oligonucleótido 78) corresponde ao produto com 1200 bp (oligonucleótido 58, oligonucleótido 77) corresponde a marcadores de ADN 0X174 HaelII.
Exemplo 23
Sintetizaram—se os seguintes oligonucieótidos:
5’ CTCTCCCTTCTCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGGTCCTCTCCTTC
Corresponde a um oligonucleótido do tipo E mo dificado contendo uma sequência que representa os resíduos de nucleótidos 385 — 4l4 do gene de resistência à tetraciclina do plasmídio pBR322 (T. Maniatis, E. F. Fritsch e J. Sambrook (1982), Molecular Cloning — A laboratory manual, páginas 479 — — 5θ3)· A ser utilizado em conjunção com oligonucleótidos do tipo D.
í
5' CCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCG
Ê um primário de vectorete universal modifica do que representa resíduos de nucleótidos 385 — 4l4 do gene de resistência a tetraciclina do plasmídio pBR322 (Maniatis e col., Molecular Cloning — A laboratory manual, páginas 479 — — 5θ3)· A ser usado com o oligonucleótido 78 e os oligonucieó tidos 8o/8l, 82/81 e 83/81, descritos mais abaixo na presente memória descritiva.
5' AATTGGCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT ê um oligonucleótido do tipo D modificado que contém uma extremidade coesiva EcoRI, um sítio de reconheci—
- l6l -
mento Notl e um sítio de reconhecimento Fokl, para ser usado com o oligonucleótido 8l.
5' AGTTCTCCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGGATGGCGGCCGCC
Ê um oligonucleótido do tipo E modificado.
5' AGCTGGCGGCCGCCATCCTAATTCTGTCGAAGGTAAGGAACGGAGGAGAGAACT
Ê um oligonucleótido do tipo D modificado que contêm uma extremidade coesiva de HundIII, um sítio de reconhecimento Notl e um sítio de reconhecimento de Fokl,para ser usado com o oligonucleótido 8l.
5' AGCTGGCGGCCGCCATCC—NH
Ê um oligonucleótido do tipo A mo di fi cado , con tendo uma extremidade coesiva HindIII com uma modificação de amino—hexilo de bloqueio da extremidade 3’, a ser usado com o oligonucleótido 8l.
5» GGCTCAACAGTCAGTTTGAACTAGC
X
Ê um primário adjacente a um sítio de EcoRI na região de KM19·
Mapas de restrição apropriados para cada uma
M 99 das seguintes amplificações sao representados na Figura 37, na qual
a) mostra um mapa de restrição de um segmento de ADN genómi— co ligado a um vectorete de EcoRIj indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 27, 76, 78 e 79}
b) mostra um mapa de restrição de um segmento de ADN genómi— co ligado a um vectorete de AcoRI} sao indicadas as posiçoes dos oligonucleótidos 78, 79 e 84;
1Ó2 -
c) mostra um segmento do exao 9 do gene de feni1—alanina—hiA* droxilase ligado a um vectorete de EcoRI} sao indicadas as posiçoes dos oligonucleótidos 63 e 79»
d) mostra um mapa de restrição do segmento do segmento de ADN genómico (descrito em 37 (a), acima) ligado a um vectorete EcoRI modificado} indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 76, 79, 80 e 81}
e) representa um mapa de restrição de um segmento de ADN ge— nómico (descrito em 37 (b), acima) ligado a um vectorete de EcoRI modificado} sao indicadas as posiçoes dos oligonucleótidos 79, 80, 8l e 84}
f) mostra um segmento do exao 9 do gene de feni1—alanina—hidroxilase ligado a um vectorete de EcoRI modificado} indi cam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 63, 79, 80 e 8l}
g) mostra um mapa de restrição de um segmento de ADN genómi— co ligado a uma biblioteca de vectoretes de Hindlll modificada} indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 76, e 79}
h) mostra um mapa de restrição de um segmento de ADN genómi— co ligado a uma biblioteca de vectoretes de Hindlll modificada} indicam—se as posiçoes dos oligonucleótidos 78, 79, 81 e 82}
i) mostra um mapa de restrição de um segmento de ADN genómi— co ligado a uma biblioteca de vectoretes de Hindlll modificada} indicam-se as posiçoes dos oligonucleótidos 76, 79, 81 e 83.
a) Preparou—se uma biblioteca de vectoretes de EcoRI a partir de ADN genómico digerido com EcoRI (linha de células
7387) e oligonucleótidos 27 e 79 de acordo com o Método X. Am plificou—se uma alíquota da biblioteca (1 nanograma) com oli— gonucleotidos 76 e 79· A amplificaçao realizou—se como se de creveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistura rea lo Im
- I63 -
cional (15 microlitros) num gel de 1,4% de agarose. Os resultados sao representados na Figura 38·
Pista 1 — marcadores de ADN 0X174 HaelII
Pista 2 — produto de 870 bp que resulta da amplificaÇao entre oligonucleótidos 76 e 79·
b) Amplificou-se uma alíquota (l nanograma ) da biblioteca de vectoretes EcoRI descrita no Exemplo anterior com os oli— gonucleótidos 79 θ 84. A amplificaÇao realizou—se como se des creveu no Exemplo 8. Analisou-se uma alíquota da mistura reaccional (15 microlitros) num gel contendo 1,4% de agarose. 0 resultado está representado na Figura 38.
Pista 3 — corresponde a um produto de 520 bp resultante da am plificaçao entre os oligonucleótidos 79 e 84.
c) Amplificou—se uma alíquota (l nanograma) da biblioteca de vectorete EcoRI descrita nos Exemplos anteriores com os oligonucleótidos 63 θ 79· A amplificaÇao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistuta reaccional (15 microlittos) num gel contendo 1,4% de agarose. 0 resultado está representado na Figura 38.
Pista 4 — corresponde ao produto de 600 bp resultante da amplificaÇao entre os oligonucleótidos 76 e 79·
d) Preparou—se uma biblioteca de vectoretes de EcoRI a partir de ADN genómico digerido com EcoRI (linha de células
73θ7) s oligonucleótidos 8θ e 8l de acordo com o Método X. Am plificou—se uma alíquota da biblioteca (nanograma) com oligo— nucleótidos 76 e 79· A amplificaÇao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional (15 microlitros) em gel contendo 1,4% de agarose. Os resultados estão representados na Figura 38·
Pista 5 — corresponde ao produto de 87O bp resultante da amplificaÇao entre o oligonucleótidos 76 e 79·
164 -
e) Amplificou-se uma alíquota da biblioteca descrita em (4) acima referida com os oligonucleótidos 79 e 84. A ampli— ficaçao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional num gel contendo 1,4 % de agarose. 0 resultado está representado na Figura 38.
Pista 6 — corresponde ao produto de 520 bp resultante da amplificaçao entre os oligonucleótidos 79 e 84.
f) Amplificou—se uma alíquota da biblioteca descrita em (4) acima referida com os oligonucleótidos 63 a 79. A ampli— ficaçao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou— -se uma alíquota da mistura reaccional num gel contendo 1,4 % de agarose. 0 resultado está representado na Figura 38.
Pista 7 - corresponde a um produto com 600 bp resultante da amplificaçao entre os oligonucleótidos 63 e 79.
g) Preparou-se uma biblioteca de vectoretes HindIII a partir de ADN genómico digerido com HindIII (linha de células
7387) e os oligonucleótidos 30 e 8l, procedendo de acordo com o Método X. Amplificou—se uma alíquota da biblioteca (1 nano— grama) com os oligonucleótidos 76 e 79· A amplificaçao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíqup ta da mistura reaccional (15 microlitros) num gel contendo 1,4% de agarose. Os resultados estão indicados na Figura 38.
Pista 8 — corresponde a um produto de 230 bp resultante da am plificaçao entre os oligonucleótidos 76 e 79·
h) Preparou—se uma biblioteca de vectoretes HindIII a partir de ADN genómico digerido com HindIII (linha de células
73θ7) e os oligonucleótidos 82 e 8l, de acordo com o Método X. Amplificou—se uma alíquota da biblioteca (l nanograma) com os oligonucleótidos 76 e 79· A amplificaçao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional (15 microlitros) num gel contendo 1,4% de agarose. Os resultados estão representados na Figura 38.
- 165 -
* ****>.,
Pista 9 — corresponde a um produto de 230 bp resultante da am plificaçao entre os oligonucleotidos 76 e 79·
i) Preparou—se uma biblioteca de vectoretes HindIII a partir de ADN genómico digerido com HindIII (linha de células
7387) θ os oligonucleótidos 83 e 8l, procedendo de acordo com o Método X. Amplificou—se uma alíquota da biblioteca (1 nano— grama) com oligonucleótidos 76 e 79· A amplificaÇao realizou—se como se descreveu no Exemplo 8. Analisou—se uma alíquota da mistura reaccional (15 microlitros) num gel contendo 1,4 % ** de agarose. Os resultados estão representados na Figura 3°·
Pista 9 — corresponde a um produto de 230 bp resultante da am plificaçao entre os oligonucleótidos 76 e 79·
Pista 10 — corresponde aos marcadores de ADN 0X174 HaelII.
Exemplo 24
Sintetizaram—se os seguintes oligonucleótidos:
5’ ATTCTGTCCAGGAAACTTTGTGTTTTGTCA
5' AGCCGAAGAGÀAAGGGCATAATCTC
5' TCACTACCAGCTTTCCCCCACTTCCCTGGC
5' CCCTAAATTAGTCTCAGCTCCAGGTAAGGT
Extraiu—se ADN da linha de células 73&2 (pre— viamente demonstrado que possuía o haplotipo ++ para o poli- .w morfismo KM19 PstI) e digeriu—se com PstI. Depois da extraçao com fenol/clorofórmio, recuperou-se o ADN por precipitação com etanol (veja-se Figura 39 (a)).
Circularizaçao
Num tubo de Sarstedt com 0,5 ml, colocaram—se os seguintes produtos:
166 -
I 100 nanogramas de ADN 73^2 digerido com PstI j M M microlitros de tampao de ligaçao 10X 10 microlitros de ATP 10 mM jl 0,5 microlitros de T4 ADN ligase (Boehringer Mannheim, j 8 unidades/microlitro
I
Ajustou—se o volume de maneira a perfazer 100 ί microlitros com água bídestilada esterilizada e incubou—se du
Ο ** X rante duas horas a 25 C. Realizaram—se cinco reacções identi cas e reuniram—se depois de duas horas a 25° C. A mistura reu ni da foi extraída com fenol/clorofórmio e o ADN foi recuperado por precipitação com etanol. Dissolveu—se a pelete de ADN em 100 microlitros de água e purificou—se por giltraçao em gel em colunas previamente cheias (colunas de G-50 Sephadex ( Nick, Pharmacia). Eluiu—se o ADN com 400 microlitros de água. Liofilizou—se a solução e redissolveu—se em agua (9 microli— tros) de modo a obter—se a concentração final de 50 nanogramas/microlitro. Diluiu—se um microlitro desta solução com agua de maneira a perfazer 50 microlitros (veja—se Figura 39 (b)).
Construção da Biblioteca de Vectoretes
I m '
Digestão com HindIII microlitros de círculos de PstI (100 ng)
M
0,5 microlitros de tampao 10X 1,5 microlitros de H^0 microlitro de HindIII (2 unidades).
Incubou—se a mistura reaccional a 37° C durante trinta minutos.
M
Ligaçao
Adicionaram-se os seguintes produtos ao produ
M ** to da digestão de restriçãoί m
microlitro de tampao 10X 1 microlitro de ATP 10 mM
167 -
microlitro de oligonucleótido 8l e 82 temperados (0,25 pm) ou 8l e 83 (0,25 pmoles) microlitro de ligase (2 unidades)
0,5 microiitros de 10X de tampao de HindIII
Incubou—se a mistura durante trinta minutos a 37° C.
Adicionaram—se oligonucleótidos temperados (8l/Ó2 ou 81/83, 0,25 picomoles) e incubou—se a mistura reac— O ** cional durante mais uma hora a 37 C. Ajustou-se então o volu ime da mistura reaccional a 100 microiitros com água (veja—se ! Figura 39 (c)).
L. Adicionaram-se os seguintes produtos a um tubo de Sarstedt de 0,5 ml!
(5 ng) (100 pmoles) (100 pmoles)
Círculos PstI Oligonucleótido ,85 Oligonucleótido 86 10 microiitros de tampao PCR a 10%
100 /iM de dNTP unidades de Taq polimerase (Cetus).
Ajustou—se o volume a 100 microiitros com água e realizou—se a amplificaçao como se descreveu no Exemplo 8. Obteve—se o produto previsto com 710 pb confirmando que se ti nham formado círculos. Os resultados estão representados na Figura 40.
Pista 1 correspondente a ADN marcador 0X174 HaelII
Pista 2 corresponde a um produto com 71θ pb da amplificaçao entre os oligonucleótidos 85 e 86.
2. Num tubo de Sarstedt com 0,5 ml, colocaram—se os seguintes produtos:
168 -
nanogramas de círculo de PstI—vectoretes de HindIII— —oligonucleótidos 81/82
Oligonucleótido 85 (100 picomoles)
Oligonucleótido 79 (100 picomoles) microlitros de tampao PCR 10 X 100 uM de dNTP unidades de Taq polimerase (Cetus).
Ajustou—se o volume a 100 microlitros com água e realizou—se a amplificaçao como se descreveu no Exemplo 8.
Obteve—se o produto com 720 bp previsto. Os resultados estão representados na Figura 40.
Pista 3 corresponde ao produto de 720 bp da amplificaçao en tre os oligonucleótidos 85 e 79·
3· Diluiu—se a mistura reaccional da amplificaçao descrita 7 em (2) acima de um factor igual a 10’. Colocou—se 1 mi— crolitro da mistura diluída num tubo de Sarstedt com 0,5 ml.
AdiCionaram—se os seguintes componentes ao tu bo de Sarstedt:
Oligonucleótido 79 (100 picomoles)
Oligonucleótido 88 (100 picomoles) microlitros de tampao PCR 10X 100 de dNTP unidades de Taq polimerase (Cetus).
Ajustou—se o volume a 100 microlitros e reali zou—se a amplificaçao como se descreveu no Exemplo 8. Obteve— —se o produto com 500 bp, previsto. Os resultados estão repre sentados na Figura 40.
Pista 4 corresponde ao produto de 500 bp da amplificaçao entre os oligonucleótidos 79 e 88.
169 _
4. Digeriu—se com PstI o produto da amplificaçao resultante da fase (3) acima referida. Obteve—se o produto previsto (3^0 bp, l60 bp). 0 resultado é representado na Fi gura 40.
Pista 5 corresponde aos produtos que resultam da digestão do produto de PCR (pista 4) com PstI. Obtêm—se produtos de 34o bp e l60 bp.
5Num tubo de Sarstedt com 0,5 ml, colocaram—se os seguintes componentes:
nanogramas
Oligonucleoti do OligonucleSti do 10 microlitros 100 yM de dNTP 2 unidades de de círculo de PstI—vectorete -oligonucleótido 83/82 85 (100 picomoles) (100 picomoles) de tampao de PCR 10 X
Taq polimerase (Cetus).
de
HindíII— ! Ajustou—se o volume a 100 microlitros com água 1 ** j bidestilada esterilizada e realizou—se a amplificaçao como se descreveu no Exemplo 8. Obteve—se o produto previsto com 720 pb. Os resultados estão indicados na Figura 40.
Pista 6 corresponde ao produto de 720 bp da amplificaçao entre os oligonucleotidos 79 e 85.
6. Diluiu—se a mistura reaccional de amplificaçao descrita θ em (5), acima, de um factor igual a 10 . Colocou—se 1 mi crolitro da mistura diluída em um tubo de Sarstedt de 0,5 ml. Ao tubo de Sarstedt adicionaram—se também cs seguintes componentes :
Oligonucleotido 79 (100 picomoles) Oligonucleotido 88 (100 picomoles) 10 microlitros de tampao PCR 10 X 100 pM de dNTP
170 -
unidades de Taq polimerase (Cetus).
Ajustou—se o volume a 100 microlitros com água bidestilada esterilizada e realizou—se a amplificaÇao como se descreveu no Exemplo 8. Obteve—se o produto com 500 bp , previsto. Os resultados estão indicados na Figura 40.
Pista 7 corresponde ao produto com 500 bp de amplificaÇao en tre os oligonucleótidos 79 e 88.
7· Digeriu—se com PstI o produto da amplifica-ao resultante da fase (6) acima descrito. Obtiveram—se o s produtos previstos (340 bp , ÍÓO bp). 0s resultados estão representados na Figura 40.
Pista 8 corresponde aos produtos resultantes da digestão do produto de PCR (pista 6) com PstI. Obtêm—se produtos de 34o e l60 bp.
**
8. Diluiu—se a mistura reaccional da amplificaÇao acima des crita (3) de um factor igual a 10 . Colocou—se 1 microli tro da mistura diluída num tubo de Sarstedt de 0,5 ml.
Ao tubo de Sarstedt adicionaram—se os seguintes componen tes!
Oligonucleótido 79 Oligonucleótido 85 microlitros de tampao de PCR 10 X 100 ybM de dNTP unidades de Taq polimerase (Cetus).
Ajustou—se o volume a 100 microlitros com água bidestilada esterilizada e a amplificaÇao realizou—se como se descreveu no Exemplo 1. Obteve—se o produto com 720 bp previs to. Os resultados estão representados na Figura 40.
Pista 9 corresponde ao produto de 720 bp de amplificaÇao en tre os oligonucleótidos 79 e 85«
171 -
9· Digeriu—se cotn PstI o produto da amplificaçao resultante ί de (8) acima descrito. Obtiveram-se os produtos previs[ tos (37O bp , 350 bp).
í •i ** i Pista 10 corresponde aos produtos que resultam da digestão do produto PCR (pista 9) com PstI.
Obtiveram—se produtos de 37θ bp e de 35θ bp.
\ Pista 11 corresponde aos marcadores de ADN 0X174 HaelII.

Claims (2)

REIVINDICAÇÕES _ ia ! i t | Processo para a amplificaçao de um fragmento ί de ácido nucleico compreendendo uma sequência desconhecida por extensão com primário, caracterizado por compreender: í clivar—se um ácido nucleico alvo para se obter fragmentos de ácido nucleico alvo, contendo um dos referi dos fragmentos uma região de primagem de iniciaçao de sequen— cia de nucleotidos conhecida para hibridizaÇao com um prima— at rio de iniciaçao, preparar—se unidades de fragmento de ácido nu cleico alvo/vectoretes a partir dos fragmentos de ácido nu— at at cleico alvo por ligaçao de cada unidade que tem uma região de Λ ** primagem do vectorete de sequencia conhecida para hibridaçao com um primário de vectorete, e tratar—se as unidades de fragmento de ácido 172 - nucleico alvo/vectorete, em conjunto ou sequencialmente, com trifosfatos de nucleósidos apropriados e com um agente para a polimerizaÇao de trifosfatos de nucleósidos e com um agente para a polimerizaÇao de trifosfatos de nucleosidos sob as con Μ M dições de hibridizaçao de maneira que se sintetiza um produto de extensão de um primário de iniciaçao complementar de uma unidade de ácido nucleico alvo de cadeia lateral simples/vectorete que tem uma região de primagem de iniciaçao com que e 0 ** hibridizado um primário de iniciaçao escolhido de maneira a M ser substancialmente complementar da região de primagem de ini MM M ciaçao , enquanto nao se sintetiza esse produto de extensão com plementar de unidades de fragmento de ácido nucleico alvo de cadeia lateral unica/vectorete que nao tem essa região de pri M magem de iniciaçao. Processo de acordo com a reivindicação 1, ca— M racterizado pelo facto de o produto de extensão ser submetido a amplificaçao na presença de um primário de vectorete que e escolhido de maneira a ser substancialmente complementar de M uma região de primagem do vectorete. - 3a Processo de acordo com a reivindicaÇao 1, caracterizado pelo facto de a síntese de produtos de amplifica— çao de primário de vectorete ser dependente da síntese ini ciai de um produto de extensão do primário de iniciaçao. 173 - racterizado pelo facto de a porção vectorete da unidade de fra gmento de ácido nucleico alvo/vectorete compreender uma parte com cadeia lateral dupla tendo uma primeira e uma segunda ca— ! deias laterais, sendo a segunda cadeia lateral da porção de ve i , : ctorete ligada ao fragmento de acido nucleic.) alvo que contem ! a região de primagem de iniciaçao e sendo a sequencia de nu— ! ί cleótidos da primeira cadeia lateral, a segunda cadeia late— ί ral e o primário do vectorete escolhidos de tal maneira que o i primário do vectorete é capaz de se hibridizar com o complemento da segunda cadeia lateral mas nao com a primeira cadeia 99 99 lateral sob as mesmas condiçoes de hibridizaÇao. - 5a Processo de acordo com a reivindicação 3» ca99 racterizado pelo facto de a porção de vectorete da unidade fra gmento de ácido nucleico alvo/vectorete compreender uma porção com dupla cadeia lateral tendo uma primeira e uma segunda cadeias laterais, tendo a primeira cadeia lateral um agrupa— ' 99 mento que bloqueia a polimerizaçao na extremidade e possuindo a segunda cadeia lateral que em utilização esta ligada a ca— deia lateral do fragmento de acido nucleico alvo a região de primagem de iniciaçao contendo uma unica porção de cadeia ia— teral e sendo o agrupamento de bloqueio da polimerizaçao terminal eficaz para evitar a extensão da primeira cadeia late— s ** ral para formar um complemento a mencionada porção com cadeia lateral única na presença de trifosfatos nucleósidos apropria dos e um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleó 99 99 sidos sob as condiçoes de hibridizaÇao. - 6â Processo de acordo com qualquer das reivindi— -174 - caçoes anteriores, caracterizado pelo facto de se preparar uma pluralidade de diferentes bibliotecas de vectoretes para uti— lizaçao com o mesmo primário de iniciaçao unico, compreendendo cada biblioteca de vectorete unidades de fragmento de áci— M do nucleico alvo/vectorete obtidas por ligaçao de fragmentos de ácido nucleico preparados por clivagem de ácido nucleico alvo em diferentes sítios de clivagem, tratando cada bibliote ca de vectorete ou em separado ou em conjunto com trifosfatos M de nucleósidos apropriados e um agente para a polimerizaçao de MM trifosfatos de nucleosidos sob as condiçoes de hibridizaçao M para se obter uma pluralidade de produtos de extensão do pri— mario de iniciaçao, com base na utilização do mesmo primário de iniciaçao unico. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se circularizar um ácido nucleico que tem extremidades capazes de se ligar uma à outra, contendo o acido nucleico uma porção que e capaz de servir co Μ t Μ M mo uma região de primagem de iniciaçao para hibridizaçao com um primário de iniciaçao} se clivar o acido nucleico circula— rizado fora da sequência de nucleótidos conhecida para se for mar uma molécula linear que contém a sequência de nucleótidos conhecida e tem um conjunto de sítios de clivagem conhecido M em pelo menos uma extremidade para ligaçao de maneira a formar uma unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete} se formar a citada unidade de fragmento de ácido nucleico al— M vo/vectorete por ligaçao e se tratar a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, em conjunto ou sequencial— mente, com primário de iniciaçao, trifosfatos de nucleosidos M apropriados e um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósidos sob as condiçoes de hibridizaçao. - 8â 175 Processo de acordo com a reivindicação 7, ca— rzcterizado pelo facto de se tratar a unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete, em conjunto ou sequencialmente, com primário de iniciaçao, primário de vectorete, trifosfatos de nucleósidos apropriados e um agente para a polimerizaçao dos trifosfatos de nucleósidos. Processo de acordo com qualquer das reivindi— aa caçoes anteriores, caracterizado pelo facto de se prepararem as unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete a partir de fragmentos de ácido nucleico alvo por ligaçao de tal aa maneira que o vectorete nao possa ser clivado a partir das unidades de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete obtidas pelo mesmo agente usado para clivar o ácido nucleico alvo para originar fragmentos de ácido nucleico alvo. - 10a Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de se clivar o ácido nucleico alvo com uma endonuclease de restrição para se obter um fragmento de ácido nucleico alvo para ligaçao a um vectorete, sendo a sequência do vectorete escolhida de tal maneira que a sequência de reconhecimento da endonuclease de restrição da referida en aa donuclease de restrição estar ausente na unidade de fragmento de ácido nucleico alvo/vectorete. Processo de acordo com qualquer das reivindi— 176 - : caçoes anteriores, caracterizado pelo facto de qualquer ou to dos os produtos de extensão de primários de iniciaçao obtido ! ou obtidos ser ou serem sequenciado ou sequenciados em pelo I menos a extremidade ou as extremidades distantes para um dado ’ primário de maneira a determinar a sequência de um posterior I z ** ϊ primário de iniciaçao para se obter outros produtos de exten— sao de primários de iniciaçao baseados na extensão do prima— z ** rio do outro primário de iniciaçao. i - 12a I !Í Processo de acordo com caçoes anteriores, caracterizado pelo um produto de extensão de primário de | porção para caracterizar o mencionado [ ee i a sua porção. qualquer das reivindifacto de se sequenciar ee iniciaçao ou uma sua ee produto de extensão ou - 13a _ ee Processo de acordo com as reivindicações 11 ou 12, para a identificação de um genotipo responsável por um dado fenótipo, caracterizado pelo facto de se comparar a sequência de ácido nucleico que contém o genotipo com a sequên— cia de acido nucleico que nao contem esse genotipo para identificar dessa forma o genotipo responsável pelo dado fenótipo. - 14 a Processo de acordo com a reivindicaÇao 13, ca ee racterizado pelo facto de a comparaçao se efectuar por utilização de uma finica amostra de ácido nucleico de um heterozi— goto obrigatório para o dado fenotipo. 177 15® Processo de acordo com ss reivindicações 11 ou 12, para a identificação de um genotipo responsável por uma pre—disposiçao ou que contribui para uma pre—disposiçao para um dado fenotipo se ela se encontrar presente, caracterizado pelo facto de se compararem as sequências de ácido nucleico de uma pluralidade de indivíduos afectados pelo fenotipoa ser investigado com as sequências de ácido nucleico de uma pluralidade de indivíduos em que nao se encontra presente qualquer evidência do fenotipo a ser investigado para identificar um genotipo responsável ou que contribui para uma pré—disposiçao para o fenotipo a ser investigado se ele se encontrar presente. - 16a Processo de acordo com a reivindicação 15, ca racterizado pelo facto de se comparar as diferenças de sequên cias entre
1) um conjunto de ácidos nucleicos de uma pluralidade de indivíduos afectados pelo fenotipo a ser investigadoi e
2) um conjunto de ácidos nucleicos de uma pluralidade de indivíduos que nao apresentam evidência do fenotipo a ser investigado.
A requerente declara que o primeiro pedido des ta patente foi apresentado no Reino Unido em 28 de Julho de 1988, sob o N2 881802O.3.
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