WO2003002759A2 - Nachweis spezifischer dinukleotide in dna-proben durch fluoreszenzresonanztransfer (fret) - Google Patents

Nachweis spezifischer dinukleotide in dna-proben durch fluoreszenzresonanztransfer (fret) Download PDF

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • This invention relates to the analysis of nucleic acids, in particular to the analysis of certain dinucleotides in a certain DNA fragment.
  • This invention further relates to a method for analyzing methylation patterns in genomic DNA by providing a means for the detection of CpG dinucleotides which are characteristic of methylated sites of the genomic DNA after the bisulfite treatment.
  • the method uses the incorporation of fluorophores and the detection of fluorescence resonance energy transfer (FRET) of the amplified sample DNA in the double-stranded and single-stranded state.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • methylation of cytosine in the 5-position is the only known modification of genomic DNA. Although the exact mechanisms by which DNA methylation affects DNA transcription are unknown, the relationship between disease and methylation is well established. In particular, methylation patterns of CpG islands within regulatory areas of the genome appear to be highly tissue-specific. It therefore follows that the misregulation of genes can be predicted by comparing their methylation pattern with phenotypically “normal” expression patterns. The following examples are cases of disease associated with modified methylation patterns.
  • Dermatofibroma (Chen, T.C. et al., "Dermatofibroma is a clonal proliferative disease", J. Cutan Pathol. 2000 Jan; 27 (1): 36-9
  • Fragiles-X syndrome (Hornstra, I.K. et al., "High resolution methylation analysis of the FMRI gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome", Hum. Mol. Genet. 1993 Oct, 2 (10): 1659-65)
  • Methylcytosine is based on the specific reaction of bisulfite with cytosine, which is converted into uracil by subsequent alkaline hydrolysis, which matches the base pairing behavior with thymidine.
  • 5-methylcytosine remains unchanged under these reaction conditions. Consequently, the original DNA is converted in such a way that methylcytosine, which is not originally due to its hybridization behavior could be distinguished from cytosine, now using "normal" molecular biological techniques, such as, for example, by amplification and hybridization or sequencing, as the only remaining cytosine can be detected. All of these techniques are based on base pairing, which can now be fully evaluated.
  • the prior art is determined by a method in which the DNA to be analyzed is enclosed in an agarose matrix, which prevents the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts with single-stranded DNA) and which all precipitates - and purification steps replaced by rapid dialysis (Olek, A.; Oswald, J.; Walter, JA; A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis; Nuclear Acid Res., 1966, Dec. 15; 24 (24 ): 5064-6).
  • This method it is possible to analyze individual cells, which illustrates the potential of this method. At present, however, only individual regions up to a length of approximately 3000 become
  • FRET Fluorescence resonance energy transfer
  • Fluorescence resonance energy transfer is an interaction between two molecules in which the excited state of one molecule (the donor) transfers energy to the other molecule (the acceptor).
  • the donor molecule is a fluorophore while the acceptor molecule may or may not be one.
  • the energy transfer takes place without the emission of photons and is based on the dipole-dipole interaction between the two molecules.
  • Molecules generally used in the FRET include fluorescein, N, N, N ', N' -tetramethyl-6-carboxyrhoda in (TAMRA), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 4- ('-dimethylaminophenylazo ) benzoic acid (DABCYL) and 5- (2 '-aminoethyl) aminonaphthalene-1-sulfonic acid (EDANS).
  • Standard conditions for FRET include the following:
  • the emission spectrum of the donor molecule must overlap with the absorption spectrum of the acceptor molecule.
  • the efficiency of the energy transfer (for a single donor-acceptor pair) is given by:
  • FRET FRET can be used as a highly sensitive method for measuring microscopic distances, which is particularly useful in the field of molecular biology, where it has been used in a number of methods. It was used in the study of protein structure, arrangement, distribution,
  • FRET has also been used in a number of methods in the analysis of nucleic acids. These include the structural and conformal analysis of nucleic acids, hybridization, PCR, sequencing and primer extension assays.
  • PCR is a commonly used technique that has been described, for example, in U.S. Patents 4,683,195, 4,683,202 and 4,800,159. In short, it is the amplification of a nucleic acid sequence by repetitive cycles of annealing and extension of a primer on single-stranded nucleic acids, followed by denaturation of the resulting double-stranded molecule.
  • PCR (and variations thereof) has a variety of uses and is one of the key technologies found in most forms of nucleic acid analysis and manipulation. There are several commonly used methods for the detection of PCR products, such as gel electrophoresis and the use of labeled primer oligonucleotides and nucleoside triphosphates.
  • Genomic DNA for further amplification is obtained from DNA from cells, tissues or other test samples using standard procedures. This standard methodology can be found in references such as Fritsch and Maniatis eds. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
  • Real-time PCR Real-time PCR monitoring using fluorescence has been described in several ways.
  • An oligonucleotide probe that is complementary to the PCR product but still different from the PCR primer is used with one
  • FRET pair so that the donor molecule is quenched by an acceptor molecule.
  • the 5 'exonuclease begins to digest the probe and separates the FRET pair, which leads to increasing fluorescence.
  • a modification of this technology uses a nucleic acid in which the FRET pair is internally quenched, for example by having a hairpin conformation. By hybridization to a sequence of interest, the FRET pair is separated and the donor molecule emits fluorescence. This technology can be used, for example, to analyze SNPs.
  • An alternative technology is based on the use of two species of hybridization probes, each labeled with a component of the FRET pair. By hybridizing both probes to the target sequence appropriately Distance, a fluorescence signal is emitted. This technology can in turn be used to detect SNPs.
  • a major advantage of using such FRET-based PCR technologies is that the reaction can be monitored in a closed-tube reaction that is suitable for large and medium throughput and thus reduces the likelihood of contamination.
  • the invention describes a method for detecting the presence of a specific nucleotide in a DNA fragment using fluorescence resonance energy transfer (FRET).
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • the method should detect changed base sequences, especially dinucleotides. This limits the use of this method for the detection of mutations, since it is very rare that even a very short amplificate does not contain a particular dinucleotide or, for example, only once. That is why the presented
  • This invention provides a very sensitive method, with a low background signal, for visualizing these dinucleotides.
  • the detection of CG nucleotides is a preferred application, in principle all other dinucleotides can also be detected.
  • the invention cannot in principle differentiate, for example, from GC and CG dinucleotides.
  • GC dinuleotides only occur in the context of GCG, since C can only be found in the context of CG. Therefore, the presence of GC automatically proves the presence of CG, so this aspect does not matter in the preferred method.
  • This method for the detection of specific dinucleotides (or generally base sequences) in a DNA sample is characterized by an amplification step using a polymerase chain reaction (PCR), a) a nucleotide which is part of the dinucleotide to be detected (or generally base sequence), of which a suitable amount is labeled with a donor fluorophore and b) contains another nucleotide which is part of the dinucleotide to be detected (or generally a base sequence), of which a suitable amount is labeled with an acceptor fluorescence.
  • PCR polymerase chain reaction
  • This method is also characterized in that the presence of the dinucleotide is determined by the extent of the fluorescence resonance energy transfer (FRET) between the donor and acceptor fluorophore.
  • FRET fluorescence resonance energy transfer
  • real-time monitoring of the FRET signal is carried out during the PCR. In this way, the progress of the PCR can be examined.
  • the dinucleotide to be detected is tid self-complementary. This is the case, for example, with CG dinucleotides.
  • the dinucleotide to be detected occurs only once in the PCR product. As outlined above, this is very helpful when the presence of the FRET signal is used directly to draw conclusions about the sequence characteristics of the DNA sample. If, for example, only a CG is present in the PCR product of the bisulfite-treated DNA sample, it can be concluded directly that a methylated cytosine was contained in a specific position in the genomic DNA sample.
  • the dinucleotide occurs several times in the PCR product and the average amount of dinucleotides in the PCR product is determined.
  • the FRET signal is quantified and again, for example in the case of CG dinucleotides, their amount in the PCR fragment will be substantially proportional to the observed FRET signal. This can be used to determine the degree of cytosine methylation in a larger DNA fragment.
  • the generation of PCR product is determined by the increase in the fluorescence emitted in successive annealing phases, whereas the presence of the dinucleotide to be detected is determined in successive denaturation phases.
  • the sample is preferably illuminated with light of suitable wavelength during denaturation and the fluorescence is observed as a function of the state of naturalization of the sample.
  • the ability of the invention also lies in the interpretation of a FRET signal in stages in which the sample has double-stranded conformation as an indicator of a successful amplification reaction and the FRET signal of the same sample in a denatured state in order to gain knowledge of the content and CpG- Get nucleotides in the sample. This is possible because a FRET pair formed by a C and a G that forms a dinucleotide is independent of the state of naturalization of the sample, whereas a FRET pair that is formed by C and G during a Watson
  • either essentially all of the cytosines in the DNA sample are selectively deaminated before PCR, but the 5-methylcytosines remain essentially unchanged or all 5-methylcytosines are essentially deaminated but the cytosines remain essentially unchanged.
  • Cytosine-guanine (CpG) dinucleotides are detected and allow conclusions to be drawn about the methylation state of the cytosines in these CpG dinucleotides in this DNA sample. This deamination is preferably carried out using a bisulfite reagent.
  • the sample DNA is preferably only amplified by selected PCR primers if a certain methylation state at a stoned position in the sample DNA, the sequence context of which is essentially complementary to one or more of the selected PCR primers mentioned.
  • This can be done using the primer annealing selectivity to bisulfite-treated DNA which contains either TG or CG in a particular position, depending on the methylation status in the genomic DNA.
  • Primers can be used in both cases be constructed.
  • a primer could contain a G at its 3 'end, which is why it would then only bind to a DNA which contains a C at the corresponding position and therefore this primer will only or preferably amplify ethylated DNA because the C after the Bisulfite treatment indicates methylation in this position.
  • This method is known as MSP, methylation-sensitive PCR.
  • the sample DNA is only amplified if there is a certain methylation state at a certain point in the sample DNA, the sequence context of which is essentially complementary to one or more oligonucleotides or PNA oligomers which are also used in the PCR reaction. These oligonucleotides or PNA oligomers bind selectively to the template DNA and prevent their amplification depending on the methylation state of the DNA before the bisulfite conversion.
  • the donor and acceptor fluorophore pairs are preferably selected from the group consisting of fluorescein / rhodamine, phycoerythrin / Cy7, fluorescein / Cy5, fuorescein / Cy5.5, fluorescein / LC red 640 and fluorescein / LC red 705 ,
  • the Poben DNA is cleaved with restriction endonucleases before the deamination treatment (for example bisulfite).
  • a method is also preferred in which the enzymatic amplification of the chemically treated DNA takes place in such a way that only one strand of the DNA sample is amplified.
  • the DNA sample is obtained from mammalian sources, e.g. B. Zeil lines, blood, sputum, faeces, urine, Cerebrospinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the eyes, intestines, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histological sections and all possible combinations.
  • mammalian sources e.g. B. Zeil lines, blood, sputum, faeces, urine, Cerebrospinal fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the eyes, intestines, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histological sections and all possible combinations.
  • a primer of the PCR reaction is bound to a solid surface. This makes it possible to carry out the amplifications on the surface.
  • Strand can be removed after amplification and only the dinucleotides in the remaining strand bound to the surface are analyzed. This is particularly advantageous if the dinucleotide only occurs in one strand and not in the other strands because the amount of dinucleotides can be determined independently for both strands.
  • PCR reactions can also be carried out on a surface if several different primers are attached to it in such a way that the position of the primers on the surface correlates with their sequence, so that the results can be evaluated.
  • the surface composition of the solid phases mentioned preferably comprises silicone, glass, polystyrene, aluminum, steel, iron, copper, nickel, silver or gold.
  • a further preferred embodiment of the present invention is a diagnostic kit for the detection of the methylation of the cytosine bases in genomic DNA samples, the reagents for the selective deamination of cytosine bases in genomic DNA, one or more primers and fluorescence-labeled dinucleotides for amplification - Step and optionally regulations or instructions for one of the methods according to one of the preceding Claims included.
  • This kit can also consist of several additional items.
  • the components of the kit mentioned could contain containers in sufficient quantities for the following to carry out the methods:
  • Reagents for the amplification of the converted sample and the incorporation of the fluorophore-labeled nucleotides comprising: a) nucleic acid primer b) suitable mixture of unlabeled and fluorophore-labeled nucleotides c) DNA polymerase which is suitable to incorporate the fluorophore-labeled nucleotides. d) Instructions for use
  • the term "instructions for use” should cover a comprehensible expression to describe the reagent concentrations for the assay method, parameters such as relative amounts of the reagents to be combined, reaction times for reagents / sample mixtures, temperature, buffer conditions and the like.
  • the genomic DNA sample must be isolated from tissues or cellular sources.
  • the DNA sample can be taken from any tissue which is suspected to be expressed in the genome and, for example, from Zeil lines, blood, sputum, faeces, urine, cerebrospi nal liquid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from the intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histological sections, but is not limited to these.
  • the extraction can be done with means familiar to those skilled in the art, including the use of detergent lysates, ultrasound and vortexing with glass beads.
  • the genomic, double-stranded DNA is used for the analysis.
  • the DNA can be cleaved prior to chemical treatment, by all means known in the art, in particular with restriction endonucleases.
  • the nucleases mentioned can contain cytosine in their 5 '-CpG-3' context in their recognition sequence, so that the DNA is only cleaved if the cytosines are present in the recognition sequence in unmethylated form.
  • the sample DNA is then chemically treated to convert the methylated cytosine bases to uracil.
  • This chemical modification can be carried out, for example, using a bisulfite solution, but is not limited to this.
  • This chemical reaction can take place in any format known in the art. This includes, but is not limited to, the modification within agarose gels or in denaturing solvents.
  • the double-stranded DNA has to be denatured. This can be done as heat denaturation, which is carried out at variable temperatures. For high molecular weight DNA, the denaturation temperature is usually greater than 90 ° C. However, smaller fractions that do not require such high denaturation temperatures can be analyzed. In addition, the complementarity between the beaches decrease as the reaction proceeds and the cytosine residues are converted to uracil. A cyclic reaction protocol can therefore record different denaturation temperatures.
  • the bisulfite conversion also includes two important steps, the sulfonation of the cytosine and the subsequent deamination.
  • the reaction equilibria are on the right side at two different temperatures for each stage of the reaction.
  • the reaction takes place under cyclic conditions with changing temperatures.
  • the temperatures and reaction times at which each step is carried out can be varied depending on the specific requirements.
  • a preferred variant of the method comprises a temperature change from 4 ° C (10 minutes) to 50 ° C (20 minutes).
  • This type of bisulft treatment is state of the art in relation to WO 99/28498.
  • This chemical reaction can take place in any form known in the art. This includes, but is not limited to, modification within agarose gels, in denaturing solvents, or within capillaries.
  • the bisulfite reaction within agarose gels is state of the art and was described by Olek et al., Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066.
  • the DNA fragment is embedded in agarose gel and the conversion of cytosine 'to uracil takes place using hydrogen sulfite and a radical scavenger.
  • the DNA can then be amplified without the need for further purification steps.
  • the DNA conversion can take place without an agarose matrix.
  • the DNA can be incubated at elevated temperatures with hydrogen sulfite and a radical scavenger. This reaction takes place in an organic, denaturing solvent.
  • denaturing solvents include but not limited to, polyethylene glycol dialkyl, polyethylene glycol dialkyl ether, dioxane and substituted derivatives, urea or derivatives, acetonitrile, primary alcohols, secondary alcohols, tertiary alcohols, DMSO or THF.
  • the DNA sample is transferred to a heatable capillary which is permeable to small molecules before the chemical treatment.
  • the chemical modification reaction steps can then be carried out by adding and removing reagents through connected capillaries in the capillary tubes.
  • the two strands of DNA may no longer be complementary.
  • Amplification and incorporation of labeled nucleotide fractions of the genomic DNA treated in this way are then enzymatically amplified using oligonucleotide primers.
  • the length and design of these primers can be specific for the area of the genome to be analyzed. As such, a wide range of primers are suitable for use in this technique. This primer design is state of the art.
  • a suitable fraction of the C and G nucleotides introduced in the amplification reaction are labeled in such a way that a C and a G can form a FRET pair when they are close together.
  • Fluorophore pairs which are suitable for labeling the nucleotides in such a way that they are able to form FRET pairs are known to the person skilled in the art and include, but are not limited to, fluorescein / rhodamine, phytoerythrin / Cy7, fluorescein / Cy5, fluorescein / Cy5.5, fluorescein / LC red 640 and fluorescein / LC red 705.
  • the binding of these fluorophores to the nucleotides is state of the art.
  • the sample is irradiated with light of a suitable wavelength during the amplification reaction and the fluorescence is recorded as a function of the state of naturalization of the sample.
  • the special feature of the invention lies in the interpretation of a FRET signal in phases in which the sample has a double-stranded conformation as an indicator for a successful amplification reaction and the FRET signal of the same sample in a denatured state in order to know about the content Obtain CpG dinucleotides in the sample. This is possible because a FRET pair formed by a C and a G that form a dinucleotide is independent of the state of naturalization of the sample, whereas a FRET pair that is formed by a C and G in the context of the Watson-Crick -Binding is only present in the double-stranded conformation, which is illustrated by the illustrations.
  • Primers can be immobilized on a surface.
  • the surface or solid phase can be, for example, but is not limited to, a pearl, a microplate well or DNA chip.
  • other reactants such as the polymerase, can also be bound to the surface.
  • all reagents can be located in a microplate well in such a way that the assay can be carried out simply by adding a suitable buffer and the bisulfite-treated DNA sample.
  • This method is assumed to be used for high throughput analysis of genomic DNA samples.
  • the invention therefore also includes the analysis of data using a computer system.
  • this device can comprise one or more databases.
  • this device can comprise one or more “learning algorithms”. Other means of evaluating assay results in the high sales area are prior art.
  • FRET detection it is necessary to incorporate two different labels during the amplification. This is preferably done by using a labeled dCTP and a labeled dGTP in a PCR reaction in order to detect bisulfite-treated DNA CG dinucleotides and thus any methylation present in the underlying genomic sample.
  • HotStar polymerase and the following protocol were used for the PCR:
  • a 153bp fragment of the bisufit-treated human GSTPI gene was selected as an example.
  • the following primers were used for the amplification:
  • Primerl GTTTT (C / T) GTTATTAGTGAGT (SEQ. ID: 1)
  • Primer2 TCCTAAATCCCCTAAACC (SEQ. ID: 2)
  • amplificates were produced in which both labels were incorporated in one strand with labeled dCTP and dGTP.
  • the PCR reaction was analyzed using an agarose gel using standard methods. The length of the PCR products was examined by fluorescence detection on a polyacrylic amide gel (ALF-Express Instrument, Amersham Pharmacia) and fragment analysis using capillary gel electrophoresis (ABI Pris).
  • FIG. 3 and FIG. 4 The use of the ALF standard protocol for checking the installation of the respective markings is shown in FIG. 3 and FIG. 4.
  • the FRET between the markings was determined on a LightCycler instrument (Röche Applied Science).
  • the FRET between fluorescein and Cy5 enables conclusions to be drawn about the number of CpGs in a certain volume element in the sample.
  • the intensity of the FRET depends on the incorporation rate of the labeled nucleotides, the average degree of methylation, the number of CpGs in the sample and the concentration of the fragments.
  • the rate of incorporation can be determined via the fragment analysis as in FIG. 4 using internal standards (on the primer), the concentration of the fragments and the number of CpGs are known. This allows you to easily determine the average number of CpGs and the degree of methylation from them. Verification is carried out using known templates that are methylated to 0 and 100%.
  • the intensity of the FRET also depends on the distance between the built-in dyes. Especially if you want to determine specific dinucleotides, it is essential to know the dependency of the FRET on the distance between the dyes. This can be determined using probe oligonucleotides in a LightCycler experiment like the following, here using a melting curve: Hybridization probes were used for detection with a gap of 4 bases between the probes: 1. anchor probe with fluorescein labeling at the 3'-end (*): 5 'GTTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT_ * 2. methylation-specific probe with Cy5 labeling at the 5'-end (*):
  • the FRET detection of the probes takes place as a melting curve determination in a LightCycler (FIG. 5).
  • the initial higher fluorescence values come about through the FRET.
  • the strands are separated to such an extent that the energy transfer between the fluorescein and Cy5 labels is no longer possible and the fluorescence approaches the background signal.
  • This melting curve analysis for FRET detection can be carried out in the method according to the invention following the PCR to determine the number of FRET pairs in a certain volume element.
  • FIG. 1 Figure la Double-stranded PCR fragment of a bisulfite DNA probe in which a cytosine (C) has remained unchanged because it was methylated.
  • the Gs and Cs are each labeled with a donor fluorophore and an acceptor fluorophore and form FRET pairs because they are in close proximity to one another.
  • a FRET pair is formed by a marked G and a marked C on the opposite strands.
  • a PCR fragment of Figure la under denaturation conditions the individual strands being separated to such an extent that no FRET pair can be formed on the opposite strands by Gs and Cs.
  • a FRET signal can still be detected because FRET pairs are formed by Gs and Cs on the individual strands.
  • FIG. 2b shows a PCR fragment from FIG. 1a with denaturation
  • Detection for ALF-Express with standard protocol (only Cy5 detected): Fully methylated, bisulfite-treated and amplified DNA: Peak A: Cy5-rich strand labeled Cy5; Peak B: G-rich strand Cy5 labeled (i.e. only the cytosines from the CG dinucleotides); unmethylated, bisulfite-treated and amplified DNA: peak C: C-rich strand Cy5 labeled; D: G-rich strand, no peak, since there are no cytosines.
  • Peak A C-rich strand labeled with fluorescein, only visible in the ethylated state
  • B G-rich strand labeled with fluorescein
  • unmethylated, bisulfite-treated and amplified DNA C: C-rich strand, no peak
  • Peak D G-rich strand labeled with fluorescein.
  • FIG. 5 The curves represent the melting point determinations that detect the FRET between the two detection probes.
  • Curve A shows the melting curve of the methylated bisulfite-treated DNA
  • curve B the bisulfite-treated unmethylated DNA
  • C the background signal.
  • the lower melting point of A is due to mismatch.

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Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion spezifischer Dinukleotide in einer DNA-Probe beschrieben. Eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wird unter Verwendung a) eines Nukleotids, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine ausreichende Menge durch ein Donor-Fluorphor markiert und b) ein anderes Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids ist, von dem eine ausreichende Menge mit einem Akzeptor-Fluorophor markiert ist, durchgeführt. Das Verfahren bestimmt oder quantifiziert die Anwesenheit des Dinukleotids durch Messung des Ausmaßes des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zwischen dem Donor- und Akzeptor-Fluorophor.

Description

Nachweis spezifischer Dinukleotide in DNA-Proben durch Fluoreszenzresonanzenergie ransfer (FRET)
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf die Analyse von Nukleinsäuren, insbesondere auf die Analyse bestimmter Dinukleo- tide in einem bestimmten DNA-Fragment. Diese Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Verfahren zur Analyse von Methylierungsmustern in genomischer DNA, indem sie ein Mittel zur Detektion von CpG-Dinukleotiden bereitstellt, die charakteristisch für methylierte Stellen der genomi- sehen DNA nach der Bisulfit-Behandlung sind. Das Verfahren nutzt den Einbau von Fluorophoren und die Detektion von Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) der ampli- fizierten Proben-DNA im doppesträngigen und einzelsträn- gigem Zustand.
Stand der Technik
DNA-Me thyli erun g Die in den letzten Jahren in der Molekularbiologie studierten Beobachtungsebenen konzentrierten sich auf Gene, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die Transkription der RNA in Proteine. Die Analyse der Regulationsmechanismen in Zusammenhang mit der Genkontrolle war stärker be- schränkt. Die Genregulation, zum Beispiel auf welcher
Stufe der Entwicklung eines Individuums ein Gen aktiviert oder inhibiert wird, und der gewebsspezifische Charakter dieser Regulierung werden weniger gut verstanden. Jedoch kann dies mit einem hohen Grad an Wahrscheinlichkeit mit dem Ausmaß und Charakter der Methylierung des Gens oder Genoms korreliert werden. Aus dieser Beobachtung kann sinnvollerweise gefolgert werden, dass pathogene genetische Störungen mittels abweichender genetischer Methylie- rungsmuster detektiert werden können. Die Bemühungen des Humangenom-Projektes konzentrieren sich auf die Sequenzierung des menschlichen Genoms. Man erwartet, dass dies bedeutenden therapeutischen und diagnostischen Nutzen für die Behandlung von Krankheiten erbringt. Diese Bemühungen waren bisher jedoch außerstande, sich einem signifikanten Aspekt genetischer Störungen, dem epigenetischen Faktor, zuzuwenden. Es hat sich gezeigt, dass die epigentische Regulation der Gentranskription viele Störungen verursacht. Einer der signifikantesten bisher identifizierten epigenetischen Mechanismen ist die Methylierung von Cytosin. Die Methylierung von Cyto- sin in der 5-Position ist die einzige bekannte Modifikation genomischer DNA. Obwohl die genauen Mechanismen, durch welche die DNA-Methylierung die DNA-Transkription beeinflusst, unbekannt sind, ist der Zusammenhang zwi- sehen Krankheit und Methylierung gut belegt. Insbesondere scheinen Methylierungsmuster von CpG-Inseln innerhalb regulatorischer Bereiche des Genoms hoch gewebsspezifisch zu sein. Daraus folgt daher, dass die Fehlregulation von Genen durch Vergleich ihres Methylierungsmusters mit phä- notypisch „normalen" Expressionsmustern vorhergesagt werden kann. Die folgenden Beispiele sind Krankheitsfälle, die mit modifizierten Methylierungs ustern assoziiert sind.
- Hals- und Nacken-Krebs (Sanchez-Cespedes, M. et al., „Gene promoter hypermethylation in tumours and serum of head and neck cancer patients", Cancer Res. 2000 Feb. 15; 60 (4): 892-5)
Hodgkinsche Krankheit (Garcia, J. F. et al . , „Loss of pl6 protein expression associated with methyla- tion of the pl6INK4A gene is a frequent finding in Hodgkin's disease", Lab. invest. 1999 Dec; 79 (12): 1453-9)
- Magenkrebs (Yanagisawa, Y. et al., „Methylation of the hMLHl promoter in familial gastric cancer with microsatellite instability", Int. J. Cancer 2000 Jan 1; 85 (1) : 50-3)
- Prader-Willi/Angelman-Syndrom (Zeschnigh et al.,
„Imprinted segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method", Human. Mol. genetics (1997) (6) 3pp 387-395)
ICF-Syndrom (Tuck-Muller et al . , „CMDNA hypomethyla- tion and unusual chromosome instability in cell lines fro ICF syndrome patients", Cytogenet. Call. Genet. 2000; 89(1-2): 121-8)
Dermatofibrom (Chen, T. C. et al., „Dermatofibroma is a clonal proliferative disease", J. Cutan Pathol. 2000 Jan; 27 (1) : 36-9
Hypertonie (Lee, S. D. et al . „Monoclonal endothe- lial cell proliferation is present in primary but not secondary pulmonary hypertension", J. clin. luvest. 1998 Mar 1, 101 (5): 927-34
Autismus (Klauck, S. M. et al. „Molecular genetic analysis of the FMR-1 gene in a large collection of autistic patients" Human Genet. 1997 Aug; 100 (2): 224-9
Fragiles-X-Syndrom (Hornstra, I. K. et al., „High resolution methylation analysis of the FMRl gene trinucleotide repeat region in fragile X syndrome", Hum. Mol. Genet. 1993 Oct, 2(10): 1659-65)
Huntingtonsche Krankheit (Ferluga, J. et al., „Pos- sible organ and age related epigenetic factors in
Huntington 's disease and colorectal carcinoma", Med. hypotheses 1989 May; 29 (1); 51-4)
Alle obigen Dokumente werden hiermit durch Bezugnahme in die Offenbarung mit einbezogen.
Bisulf it-Behandl ng
Ein relativ neues und gegenwärtig am häufigsten verwende- tes Verfahren zur Analyse von DNA in Bezug auf 5-
Methylcytosin, basiert auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, welches durch nachfolgende alkalische Hydrolyse in Uracil überführt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten mit Thymidin übereinstimmt. 5- Methylcytosin bleibt unter diesen Reaktionsbedingungen jedoch unverändert. Folglich wird die Original-DNA in einer solchen Art umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein Hybridisierungsverhalten nicht von Cytosin unterschieden werden konnte, nun unter Verwendung "normaler" molekularbiologischer Techniken, wie zum Beispiel durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung, als das einzige verbleibende Cytosin de- tektiert werden kann. Alle diese Techniken basieren auf der Basenpaarung, die nun vollständig ausgewertet werden kann. Hinsichtlich der Empfindlichkeit wird der Stand der Technik durch ein Verfahren bestimmt, bei welchem die zu analysierende DNA in eine Agarose-Matrix eingeschlossen wird, wodurch die Diffusion und Renaturierung der DNA verhindert wird (Bisulfit reagiert nur mit einzelsträngi- ger DNA) und welches alle Ausfällungs- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek, A. ; Oswald, J. ; Walter, J. A. ; A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis; Nuc- leic Acid Res. , 1966, Dec. 15; 24 (24) : 5064-6) . Durch Verwendung dieses Verfahrens ist es möglich, individuelle Zellen zu analysieren, was das Potential dieses Verfahrens veranschaulicht. Gegenwärtig werden jedoch nur indi- viduelle Regionen bis zu einer Länge von ungefähr 3000
Basenpaaren analysiert, eine umfassende Analyse von Zellen auf tausende mögliche Methylierungereignisse ist nicht möglich. Dieses Verfahren kann jedoch auch keine sehr kleinen Fragmente aus kleinen Probenmengen zuverläs- sig analysieren. Diese gehen trotz des Diffusionsschutzes durch die Matrix verloren.
Ein Überblick über weitere bekannte Verfahren zur Detektion von 5-Methylcytosin kann aus dem folgenden Über- sichtartikel entnommen werden: Rein, T.; DePamphilis, M. L.; Zorbas, H. ; Nucleic Acids Res., 1998, 26, 2255.
Bis heute, abgesehen von wenigen Ausnahmen (z. B. Zeschnigk, M. ; Lieh, C; Buiting, K. ; Doerfler, W. ; Horsthemke, B.; A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman- and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus, Eur. J. Hum. Genet., 1997, Mar-Apr; 5 (2): 94-8), wird die Bisulfit- Technik nur in der Forschung angewendet. Es werden jedoch immer kurze, spezifische Fragmente eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifiziert und entweder vollständig sequenziert (Olek, A. ; Walter, J. ; The preimplantation ontogeny of the Hl9 methylation i print; Nat. Genet., 1997, Nov; 17 (3) : 275-6) oder es werden individuelle Cytosin-Positionen durch eine Primerextensions- reaktion (Gonzales, M. L.; Jones, P. A. ; Rapid quantita- tion of methylation differences at specific sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) ; Nucleic Acids Res., 1997, Jun. 15;25(12) .-2529-31, WO Patent 9500669) oder durch enzyma- tischen Verdau detektiert (Xion, Z.; Laird, P. W. ; COBRA; A sensitive and quantitative DNA methylation assay; Nucleic Acids Res., 1997, Jun. 15;25 (12) :2532-4) . Weiterhin ist auch die Detektion durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498).
Weitere Publikationen, die sich mit der Verwendung der Bisulfit-Technik zur Methylierungs-Detektion in individuellen Genen beschäftigen sind: Grigg, G.; Clark, S.; Se- quencing 5-Methylcytosin residues in genomic DNA, Bios- says, 1994, Jun; 16 (6) : 431-6, 431; Zechnigk, M., Schmitz, B.; Dittrich, B.; Buiting, K. ; Horstehmke, B.; Doerfler, W.; Imprinted Segments in the human genome: different DNA methylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndrome region as determined by the genomic sequencing method; Hum. Mol. Genet., 1997, Mar; 6 (3) : 387-95; Feil. R. ; Cahrl- ton, J. ; Bird, A. P.; Walter, J. ; Reik, W. ; Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol for bisulphite genomic sequencing; Nucleic Acids Res., 1994, Feb25;22 (4) : 695-6; Martin, V.; Ribieras, S.; Song-Wang, X; Rio, M. C; dante, R. ; Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethylation in the 5' region of the pS2 gene and its expression in human breast cancer cell lines; Gene., 1995, Mayl9; 157 (1-2) : 261-4; WO 97/46705, WO 95/15373 und WO 95/45560.
Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET)
Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) ist eine Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, bei der der angeregte Zustand eines Moleküls (der Donor) Energie auf das andere Molekül (der Akzeptor) überträgt. Das Donor-Molekül ist ein Fluorophor während das Akzeptor-Molekül einer sein oder auch nicht sein kann. Der Energietransfer findet ohne die Emission von Photonen statt und basiert auf der Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen den beiden Molekülen. Moleküle, die im allgemeinen beim FRET verwendet werden, schließen Fluorescein, N,N,N' ,N' -Tetramethyl-6- carboxyrhoda in (TAMRA) , 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX) , 4- ( ' -Dimethylaminophenylazo) benzoesäure (DABCYL) und 5- (2 ' -Aminoethyl) aminonaphthalin-1-sulfonsäure (EDANS) ein. Standardbedingungen für FRET schließen die folgenden ein:
- Große Nähe zwischen den Donor- und Akzeptor-Molekülen (typisch sind 10-100 x 10~10 m) .
- Das Emissionsspektrum des Donor-Moleküls muss mit dem Absorptionsspektrum des Akzeptor-Moleküls überlappen.
- Die Orientierungen der Übergangsdipole von Donor- und Akzeptor-Molekülen müssen annähernd parallel sein.
Das Ausmaß des Energietransfers ist abhängig vom Abstand zwischen den beiden Molekülen und der Überlappung der Do- nor- und Akzeptor-Spektren. Er kann durch die folgende Gleichung beschrieben werden: kt(r) = tD-1 • (RO/r) 6 worin r der Abstand zwischen Donor und Akzeptor, tD die Lebensdauer des Donors in Abwesenheit von Energietransfer ist und R0 als Förster-Abstand bezeichnet wird. Die Effizienz des Energietransfers (für ein einzelnes Do- nor-Akzeptor-Paar) ist gegeben durch:
E = R06/(R06 + r6) Förster-Abstände sind gewöhnlich in einem Bereich von 30- 60 x 10-10 m. Deshalb kann FRET als ein hochempfindliches Verfahren zur Messung mikroskopischer Abstände verwendet werden, was auf dem Gebiet der Molekularbiologie besonders nützlich ist, wo es bei einer Anzahl von Verfahren verwendet wurde. Er wurde bei der Untersuchung von Prote- instruktur, -anordnung, -Verteilung,
-konformation und -Wechselwirkung genauso verwendet wie bei der Untersuchung von Zellmembranen und Immunoassys. FRET ist auch bei einer Anzahl von Methoden bei der Analyse von Nukleinsäuren verwendet worden. Diese schließen die Struktur- und Konformatonsanalyse von Nukleinsäuren, Hybridisierung, PCR, Sequenzierung und Primerextension- sassays ein.
Enzymatische Amplifikation
PCR ist eine allgemein verwendete Technik, die zum Beispiel in den US-Patenten 4683195, 4683202 und 4800159 beschrieben worden ist. Kurz gesagt ist es die Amplifikation einer Nukleinsäuresequenz durch repetetive Zyklen von Annealing und Verlängerung eines Primers an einzelsträn- gigen Nukleinsäuren, gefolgt von der Denaturierung des resultierenden, doppelsträngigen Moleküls. PCR (und Variationen davon) hat eine Vielzahl von Anwendungen und ist eine der Schlüsseltechnologien, die in den meisten Formen der Nukleinsäureanalyse und -manipulation enthalten ist. Es gibt verschiedene allgemein verwendete Verfahren zur Detektion von PCR-Produkten, wie Gelelektrophorese und die Verwendung markierter Primer-Oligonukleotide und Nukleosid-Triphosphate. Die Verwendung fluoreszenzmar- kierter Nukleotide und Oligomere zur Nukleinsäureanalyse bei der PCR ist auch bekannt. Genomische DNA zur weiteren Amplifikation wird aus DNA von Zellen, Gewebe oder anderen Test-Proben durch Anwendung von Standardverfahren erhalten. Diese Standard- Methodologie findet man in Referenzen wie Fritsch and Ma- niatis eds . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Echtzei t-PCR Echtzeit-PCR-Monitoring unter Verwendung von Fluoreszenz ist in verschiedenen Arten beschrieben worden. Als erstes ermöglicht die Bindung von spezifischen Fluoreszenz- Farbstoffen wie Ethidiumbromid an die doppelsträngige DNA das Monitoring der Akkumulation des PCR-Produkts durch Korrelation mit steigender Fluoreszenz. Ein zweites De- tektions-Verfahren, die Polymerase-unterstützte Exo- nuklease-Spaltung, macht Gebrauch von der 5'- Exonukleaseaktivität von Polymerasen wie Taq. Eine Oligo- nukleotid-Sonde, die komplemantär zum PCR-Produkt ist, aber noch verschieden vom PCR-Primer, wird mit einem
FRET-Paar markiert, so dass das Donor-Molekül durch ein Akeptor-Molekül gequencht wird. Während der PCR- Amplifikation beginnt die 5 ' -Exonuklease die Sonde zu verdauen und trennt das FRET-Paar, was zu steigender Flu- oreszenz führt. Eine Abwandlung dieser Technologie verwendet eine Nukleinsäure, in der das FRET-Paar intern gequencht ist, zum Beispiel dadurch, dass sie eine Haarnadel-Konformation besitzt. Durch Hybridisierung an eine interessierende Sequenz wird das FRET-Paar getrennt und das Donor-Molekül emittiert Fluoreszenz. Diese Technologie kann zum Beispiel zur Analyse von SNPs verwendet werden.
Eine alternative Technologie basiert auf der Verwendung zweier Spezies von Hybridisierungs-Sonden, jede markiert mit einem Bestandteil des FRET-Paares. Durch Hybridisierung beider Sonden an die Target-Sequenz in angemessenem Abstand, wird ein Fluoreszenz-Signal emittiert. Diese Technologie kann wiederum zur Detektion von SNPs verwendet werden.
Ein Hauptvorteil der Verwendung solcher FRET-basierter PCR-Technologien ist es, dass die Reaktion in einer Clo- sed-Tube-Reaktion überwacht werden kann, die geeignet ist für großen und mittleren Durchsatz und damit die Wahrscheinlichkeit der Kontamination reduziert.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung beschreibt ein Verfahren, zum Nachweis der Anwesenheit eines spezifischen Nukleotids in einem DNA- Fragment, unter Verwendung von Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) . Dieses kann verwendet werden, um Informationen über Sequenzeigenschaften eines Proben-DNA- Fragments zu erhalten. Zum Beispiel könnte eine Punktmu- taion in einem Fragment detektiert werden, falls ein Di- nukleotid, als ein Ergebnis seiner Mutation, in seiner
Sequenz anwesend ist, welches im Wildtyp nicht vorliegt. Jedoch wird dieses dann am besten funktionieren, wenn das durch die Mutation gebildete Dinukleotid in dem Fragment sehr selten ist oder im Wildtyp nicht vorliegt. Allgemein soll das Verfahren veränderte Basenabfolgen, insbesondere Dinukleotide nachweisen. Das beschränkt die Anwendung dieses Verfahrens zur Detektion von Mutationen, da es sehr selten der Fall ist, dass sogar ein sehr kurzes Amplifikat ein bestimmtes Dinukleotid nicht enthält oder zum Beispiel nur einmal. Deshalb wird das vorgestellte
Verfahren zur Detektion von Dinukleotiden zur Bestimmung von Sequenzcharakteristika genomischer DNA-Proben in vielen Fällen nicht anwendbar sein.
Jedoch ist die Situation für genomische DNA, die mit Bisulfit behandelt wurde, eine ganz andere. Wie oben er- wähnt, führt Bisulfit zu einer selektiven Dea inierung von Cytosin und lässt 5-Methylcytosin grundlegend unverändert. Die Methylierung von Cytosin tritt fast ausschließlich im Sequenz-Zusammenhang 5'-CG-3' auf. Deshalb treten bestimmte Dinukleotide, die C enthalten, nach der Bisulfitbehandlung in einem Strang nicht mehr auf, aber sie können noch im komplementären Strang auftreten, der durch Amplifikation von Bisulfit-behandelter DNA gebildet wird. Speziell ist die Situation für 5'-CG-3'- Dinukleotide. Diese treten nur dann in beiden Strängen auf, wenn das Cytosin des jeweiligen CG-Dinukleotids e- thyliert war und während der Bisulfit-unterstützten Deaminierung unverändert geblieben ist. Deshalb ist die E- xistenz eines CG-Dinukleotids in einem Amplifikat, vor- ausgesetzt, dass in den Primern keine CGs enthalten sind, ein klarer Hinweis auf die Anwesenheit eines methylierten Cytosins in der korrespondierenden genomischen DNA-Probe.
Diese Erfindung stellt ein sehr empfindliches Verfahren, mit einem niedrigen Hintergrundsignal, zur Sichtbarmachung dieser Dinukleotide bereit. Obwohl, wie oben erwähnt, die Detektion von CG-Nukleotiden eine bevorzugte Anwendung ist, können prinzipiell jedoch auch alle anderen Dinukleotide detektiert werden. Es ist jedoch zu er- wähnen, dass die Erfindung prinzipiell keine Unterscheidung beispielsweise von GC und CG Dinukleotiden durchführen kann. Jedoch treten in der Bisulfit-behandelten DNA beispielsweise GC Dinuleotide nur im Kontext GCG auf, da C nur noch im Kontext CG zu finden ist. Daher beweist das Vorhandensein von GC automatisch auch die Anwesenheit von CG, so dass dieser Aspekt in dem bevorzugten Verfahren keine Rolle spielt. Es wird daher nachfolgend immer vom Nachweis von Dinukleotiden gesprochen, auch wenn die Unterscheidung jeweils vom inversen Dinukleotid nicht mög- lieh ist. Dieses Verfahren zur Detektion spezifischer Dinukleotide (bzw. allgemein Basenabfolgen) in einer DNA-Probe ist durch einen Amplifizierungsschritt unter Verwendung einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gekennzeichnet, a) ein Nukleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids (oder allgemein Basenabfolge) ist, wovon eine geignete Menge mit einem Donor-Fluorophor markiert ist und b) ein anderes Nuleotid, das Teil des zu detektierenden Dinukleotids (oder allgemein Basenabfolge) ist, wovon eine ge- eignete Menge mit einem Akzeptor-Fluoreszenz markiert ist, enthaltend. Dieses Verfahren ist auch dadurch gekennzeichnet, dass die Anwesenheit des Dinukleotids durch das Ausmaß des Fluoreszenzresonanzenergietransfers (FRET) zwischen Donor- und Akzeptor-Fluorophor bestimmt wird. Das bedeutet, dass markierte Fluorophore nur dann in direkter Nähe in das PCR-Produkt eingebaut werden, wenn das bestimmte, zu analysierende Dinukleotid gebildet wird. Wenn zum Beispiel die Anwesenheit eines CG-Dinukleotids im PCR-Produkt defektiert werden soll, kann eine Fraktion der C-Nukleotide in der PCR-Reaktion mit dem Fluoreszenz- Donor und eine Fraktion des G-Nukleotids mit Akzeptor- Fluorophor markiert werden, oder umgekehrt. Nur wenn ein C und G im PCR-Produkt dicht beieinander sind, kann FRET beoachtet werden. Auf diesem Weg können die CG- Dinukleotide identifiziert werden. Wenn dagegen ein TG-
Nukleotid anwesend ist, kann kein FRET beobachtet werden. Deshalb kann dieses Verfahren direkt angewendet werden, um DNA-Methylierung zu beobachten. Das wird in den Zeichnungen und deren Beschreibungen weiter herausgearbeitet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein Echtzeit-Monitoring des FRET-Signals während der PCR durchgeführt. Auf diesem Weg kann der Fortschritt der PCR untersucht werden. In einer anderen bevorzugten Ausfüh- rungsform der Erfindng ist das zu detektierende Dinukleo- tid selbst-komplementär. Das ist zum Beisiel bei CG- Dinukleotiden der Fall.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng tritt das zu detektierende Dinukleotid nur einmal im PCR-Prodkt auf. Wie oben umrissen, ist dies sehr hilfreich, wenn die Anwesenheit des FRET-Signals direkt verwendet wird, um Schlüsse über die Sequenz-Charakteristika der DNA-Probe zu ziehen. Wenn zum Beispiel nur ein CG im PCR-Produkt der Bisulfit-behandelten DNA-Probe anwesend ist, kann direkt geschlossen werden, dass ein methylier- tes Cytosin in einer bestimmten Position in der genomischen DNA-Probe enthalten war.
Aber es ist auch möglich und bevorzugt, dass das Dinukleotid mehrere Male im PCR-Produkt auftritt und die durchschnittliche Menge der Dinukleotide im PCR-Produkt bestimmt wird. In diesem Fall zum Beispiel wird das FRET- Signal quantifiziert und wieder wird, beispielsweise im Fall von CG-Dinukleotiden, ihre Menge im PCR-Fragment im Wesentlichen proportional zum beobachteten FRET-Signal sein. Dies kann verwendet werden, um den Grad der Cyto- sin-Methylierung in einem größeren DNA-Fragment zu bestimmen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Erzeugung von PCR-Produkt durch den Anstieg der emittierten Fluoreszenz in sukzessiven Annealing- Phasen bestimmt, wohingegen die Anwesenheit des zu detek- tierenden Dinukleotids in sukzessiven Denaturierungspha- sen bestimmt wird.
Bevorzugter Weise wird die Probe während der Denaturierung mit Licht geeigneter Wellenlänge beleuchtet und die Fluoreszenz als Funktion des Naturierungszustandes der Probe beobachtet. Das Können der Erfindung liegt auch in der Interpretation eines FRET-Signals in Stadien, in denen die Probe doppelsträngige Konformation hat, als Indikator für eine erfolgreiche Amplifizierungsreaktion und des FRET-Signals der selben Probe in denaturiertem Zustand, um Kenntnisse über den Gehalt and CpG-Dnukleotiden in der Probe zu erhalten. Dies ist möglich, weil ein FRET-Paar, gebildet durch ein C und ein G, das ein Dinukleotid bildet, unabhängig vom Naturierungszustand der Probe ist, wohingegen ein FRET-Paar, das durch C und G während einer Watson-
Crick-Bindung gebildet wird, nur in der doppelsträngigen Konformation der Probe vorliegt, wie in den Abildungen illustriert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden vor der PCR entweder im Wesentlichen alle Cytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert, aber die 5-Methylcytosine bleiben im Wesentlichen unverändert oder alle 5- Methylcytosine werden im Wesentlichen deaminiert aber die Cytosine bleiben im Wesentlichen unverändert. Cytosin- Guanin- (CpG) Dinukleotide werden detektiert und lassen Schlüsse über den Methylierungszustand der Cytosine in diesen CpG-Dinukleotiden in dieser DNA-Probe zu. Diese Deaminierung wird bevorzugt unter Verwendung eines Bisul- fit-Reagenzes durchgeführt.
Bevorzugter Weise wird die Proben-DNA nur durch ausgewählte PCR-Primer amplifiziert, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer bestirnten Stelle in der Pro- ben-DNA, deren Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren der genannten ausgewählten PCR-Primer ist. Dies kann, unter Verwendung der Primer- Annealing-Selektivität gegenüber Bisulfit-behandelter DNA getan werden, welche in einer bestimmten Position entwe- der TG oder CG enthält, abhängig vom Methylierungsstatus in der genomischen DNA. Primer können für beide Fälle konstruiert werden. Ein Primer könnte ein G an seinem 3'- Ende enthalten, weshalb er dann nur an eine DNA binden würde, die ein C an der entsprechenden Position ethält und deshalb wird dieser Primer nur oder bevorzugt ethy- lierte DNA amplifizieren, weil das C nach der Bisulfit- Behandlung auf eine Methylierung in dieser Position hinweist. Dieses Verfahren ist als MSP, methylierungssensi- tive PCR, bekannt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Proben-DNA nur amplifziert, wenn ein bestimmter Methylierungs-Zustand an einer bestimmten Stelle in der Proben-DNA vorliegt, deren Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren Oligo- nukleotiden oder PNA-Oligmeren ist, die zusätzlich in der PCR-Reaktion verwendet werden. Diese Oligonukleotide oder PNA-Oligomere binden selektiv an die Templat-DNA und verhindern deren Amplifikation in Abhängigkeit vom Methylie- rungszustand der DNA vor der Bisulfit-Umsetzung.
Bevorzugter Weise werden die Donor- und Akzeptor- Fluorophor-Paare ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Fluorescein/Rhodamin, Phycoerythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fuorescein/Cy5.5, Fluorescein/LC Rot 640 und Fluores- cein/LC Rot 705.
In einer anderen bevougten Variante der Erfindung, wird die Poben-DNA vor der Deaminierungsbehandlung (zum Beispiel Bisulfit) mit Restriktionendonukleasen gespalten.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, worin die enzymatische Amplifizierung der chemisch behandelten DNA so geschieht, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
Bevozugter Weise wird die DNA-Probe aus Quellen vom Säugetier, z. B. Zeil-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Augen, Gedärmen, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologi- schen Schnitten und allen möglichen Kombinationen gewon- nen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist ein Primer der PCR-Reaktion an eine Feststoffoberfläche gebunden. Dies ermöglicht es, die Amplifikati- onen an der Oberfläche durchzuführen. Der komplementäre
Strang kann nach der Amplifikation entfernt werden und es werden nur die Dinukleotide im verbleibenden, an der 0- berflache gebundenen, Strang analysiert. Das ist besonders vorteilhaft, wenn das Dinukleotid nur in einem Strang und nicht in den anderen Strängen auftritt, weil die Menge an Dinukleotiden für beide Stränge unabhängig bestimmt werden kann. Auch können mehrere verschiedene PCR-Reaktionen auf einer Oberfläche durchgeführt werden, wenn mehrere verschiedene Primer an ihr derart befestigt sind, dass die Position der Primer auf der Oberfläche mit deren Sequenz korreliert, so dass die Auswertung der Ergebnisse möglich wird.
Bevorzugter Weise umfasst die Oberflächenzusammensetzung genannter Festphasen Silikon, Glas, Polystrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein diagnostisches Kit zur Detektion der Methylierung der Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, das Reagenzien zur selektiven Deaminierung von Cytosin- Basen in genomischer DNA, einen oder mehere Primer und Fluoreszenz-markierte Dinukleotide für den Amplifizie- rungsschritt und wahlweise Vorschriften oder Anleitungen für eines der Verfahren gemäß einem der voran stehenden Ansprüche umfasst. Dieses Kit kann auch aus mehreren zusätzlichen Gegenständen bestehen.
Als Beispiel könnten die Komponenten des genannten Kits Behältnisse in ausreichend großer Menge für folgendes um- fassen, um die Verfahren durchzuführen:
1) Reagenzien für die Bisulfit-Umwandlung der Proben-DNA.
2) Reagenzien für die Amplifizierung der umgewandelten Probe und den Einbau der Fluorophor-markierten Nukleoti- de, umfassend: a) Nukleinsäure-Primer b) geeignete Mischung von nicht-markierten und Fluorophor-markierten Nukleotiden c) DNA-Poly erase, die geeignet ist, die Fluorophor- markierten Nukleotide einzubauen d) Gebrauchsanweisung
Der Begriff "Gebrauchsanweisung" sollte einen fassbaren Ausdruck abdecken, um die Reagenz-Konzentrationen für das Assay-Verfahren, Parameter wie relative Mengen der zusammenzuführenden Reagenzien, Reaktionszeiten für Reagen- zien/Proben-Mischungen, Temperatur, Pufferbedingungen und dergleichen zu beschreiben.
Im Folgenden werden die Schritte der bevorzugten Ausführungsformen detaillierter beschrieben.
DNA-Isolierung
Zuerst muß die genomische DNA-Probe aus Geweben oder zellulären Quellen isoliert werden. Bei Säugetieren, vorzugsweise Menschen, kann die DNA-Probe aus jedem Gewebe entnommen werden, von dem vermutet wird, dass die Target- Region im Genom exprimiert wird und zum Beispiel auch aus Zeil-Linien, Blut, Sputum, Fäkalien, Urin, Cerebrospi- nalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Darm, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologische Schnitte, ist jedoch nicht beschränkt auf diese. Die Extraktion kann mit für den Fachmann geläufigen Mitteln erfolgen, einschließlich der Verwendung von detergenten Lysaten, Ultraschall und Vortexing mit Glasperlen. Wenn die Nukleinsäuren extrahiert worden sind, wird die genomische, doppesträngige DNA für die Analyse verwendet.
DNA-Restriktion
In einer bevorzugten Ausführungsform kann die DNA vor der chemischen Behandlung gespalten werden, und zwar durch alle im Stand der Technik bekannten Mittel, insbesondere mit Restriktionsendonukleasen. Genannte Nukleasen können Cytosin im 5 ' -CpG-3 ' -Kontext in ihrer Erkennungssequenz enthalten, so dass die DNA nur dann gespalten wird, wenn die Cytosine in der Erkennungssequenz in unmethylierter Form vorliegen.
Bisulfit-Behandlung
Die Proben-DNA wird dann chemisch behandelt, um die methylierten Cytosin-Basen zu Uracil umzusetzen. Diese che- mische Modifikation kann zum Beispiel mittels einer Bisulfit-Lösung erfolgen, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Diese chemische Umsetzung kann in jedem im Stand der Technik bekannten Format stattfinden. Das schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf, die Modi- fizierung innerhalb von Agarose-Gelen oder in denaturierenden Lösemitteln.
In dem Fall, dass die chemische Modifizierung als Bisul- fit-Behandlung der DNA erfolgt, können sich die folgenden Schritte anschließen. Die doppelsträngige DNA muß denaturiert werden. Das kann als Hitze-Denaturierung geschehen, die bei varialen Temperaturen ausgeführt wird. Für hochmolekulare DNA ist die Denaturierungste peratur gewöhnlich größer als 90 °C. Jedoch kann die Analyse von kleineren Fragementen erfolgen, die keine so hohen Denaturierungstemperaturen benötigen. Zusätzlich nimmt die Komplementarität zwischen den Strän- gen ab, wenn die Reaktion voranschreitet und die Cytosin- Reste zu Uracil umgesetzt werden. Deshalb kann ein cycli- sches Reaktionsprotokoll verschiedene Denaturierungs- Temperaturen erfassen. Die Bisulfit-Umsetzung umfasst des weiteren zwei wichtige Schritte, die Sulfonierung des Cytosins und die nachfolgende Deaminierung. Die Reaktionsgleichgewichte sind bei zwei unterschiedlichen Temperaturen für jede Stufe der Reaktion auf der richtigen Seite. Wenn man die Reaktions- kinetiken berücksichtigt, ist es bevorzugt, dass die Reaktion unter cyclischen Bedingungen, mit wechselnden Temperaturen, sattfindet. Die Temperaturen und Reaktionszeiten, bei denen jeder Schritt durchgeführt wird, können je nach den spezifischen Anforderungen im Einzelfall vari- iert werden. Jedoch umfasst eine bevorzugte Variante des Verfahrens eine Temperaturänderung von 4 °C (10 Minuten) auf 50 °C (20 Minuten) . Diese Art der Bisulft-Behandlung ist Stand der Technik in Bezug auf WO 99/28498. Diese chemische Umsetzung kann in jeder im Stand der Technik bekannten Form stattfinden. Das schließt ein, ist aber nicht begrenzt auf, die Modifizierung innerhalb von Agarose-Gelen, in denaturierenden Lösemitteln oder innerhalb von Kapillaren. Die Bisulfit-Umsetzung innerhalb von Agarose-Gelen ist Stand der Technik und wurde von Olek et al., Nucl. Acids Res. 1996, 24, 5064-5066 beschrieben.
Das DNA-Fragment wird in Agarose-Gel eingebettet, und die Umsetzung von Cytosin' zu Uracil findet mittels Hydrogensulfit und einem Radikalfänger statt. Die DNA kann dann amplifiziert werden, ohne dass weitere Reinigungsschritte nötig sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann die DNA-Umsetzung ohne Agarose-Matrix stattfinden. Die DNA kann bei erhöhten Temperaturen mit Hydrogensulfit und einem Radikalfänger inkubiert werden. Diese Reaktion findet in einem organischen, denaturierenden Lösemittel statt. Beispiele für denaturierende Lösemittel umfassen, sind jedoch nicht begrenzt auf, Polyethylenglykoldialkyl Poly- ethylenglykoldialkylether, Dioxan und substituierte Derivate, Harnstoff oder Derivate, Acetonitril, primäre Alkohole, sekundäre Alkohole, tertiäre Alkohole, DMSO oder THF.
In einer weiteren Ausführungsform wird die DNA-Probe vor der chemischen Behandlung in eine beheizbare Kapillare überführt, die für kleine Moleküle permeabel ist. Die Reaktionsschritte der chemischen Modifikation können dann mittels Zugabe und Entfernen von Reagenzien durch verbundene Kapillaren in den Kapillarenröhrchen ausgeführt werden.
Im Anschluss an die chemische Behandlung könnten die zwei DNA-Stränge nicht länger komplementär sein.
Amplifikation und Einbau markierter Nukleotide Fraktionen der so behandelten genomischen DNA werden dann unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern enzymatisch amplifiziert . Die Länge und Gestaltung dieser Primer kann für den zu analysierenden Bereich des Genoms spezifisch sein. Als solche ist eine große Auswahl an Primern zur Verwendung für diese Technik geeignet. Diese Primer- Gestaltung ist Stand der Technik.
Eine geeignete Fraktion der C- und G-Nukleotide, die in der A plifizierungs-Reaktion eingeführt wurden, sind in solcher Weise markiert, dass ein C und ein G ein FRET- Paar bilden können, wenn sie nah beieinander sind. Fluo- rophor-Paare die geeignet sind, die Nukleotide so zu mar- kieren, dass sie befähigt werden, FRET-Paare zu bilden, sind dem Fachmann geläufig und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fluorescein/Rhodamin, Phytoe- rythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fluorescein/Cy5.5, Fluores- cein/LC Rot 640 und Fluorescein/LC-Rot 705. Die Anbindung dieser Fluorophore an die Nukleotide ist Stand der Technik. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Probe während der Amplifizierungsreaktion mit Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt und die Flu- oreszenz als Funktion des Naturierungszustandes der Probe aufgezeichnet .
Das Besondere der Erfindung liegt in der Interpretation eines FRET-Signals in Phasen, in denen die Probe dop- pelsträngige Konformation besitzt, als Indikator für eine erfolgreiche Amplifizierungs-Reaktion und des FRET- Signals derselben Probe in denaturiertem Zustand, um Kenntnisse über den Gehalt an CpG-Dinukleotiden in der Probe zu erhalten. Das ist möglich, weil ein FRET-Paar, das durch ein C und ein G gebildet wird, die ein Dinukleotid ausbilden, unabhängig vom Naturierungszustand der Probe ist, wohingegen ein FRET-Paar, das durch ein C und G im Rahmen der Watson-Crick-Bindung ausgebildet wird, nur in der doppelsträngigen Konformation vorliegt, was durch die Abbildungen verdeutlicht wird.
Fest-Phasen-Assay
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die
Primer auf einer Oberfläche immobilisiert werden. Die 0- berfläche oder feste Phase kann beispielsweise sein, ist jedoch nicht beschränkt auf, eine Perle, ein Mikroplate Well oder DNA-Chip. In einer weitern bevorzugten Ausführungsform können auch andere Reaktionsteilnehmer, wie die Polymerase, an die Oberfläche gebunden werden. In einer solchen Ausführungsform können alle Reagenzien so in einem Mikroplate Well lokalisiert sein, dass das Assay einfach durch Addition eines geeigneten Puffers und der Bisulfit-behandelten DNA-Probe durchgeführt werden kann.
Weitergehende Datenverarbeitung Es wird vorausgesetzt, dass dieses Verfahren für die Analyse genomischer DNA-Proben mit hohem Durchsatz verwendet wird. Deshalb umfasst die Erfindung auch die Analyse von Daten unter Verwendung einer Rechneranlage. In einer be- vorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung eine o- der mehrere Datenbanken umfassen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann diese Vorrichtung einen oder mehrere "lernende Algorithmen" umfassen. Andere Mittel zur Evaluierung von Assay-Ergebnissen im Bereich von hohem Umsatz sind Stand der Technik.
Beispiel:
Für die FRET Detektion ist es erforderlich, zwei unterschiedlich Markierungen bei der Amplifikation einzubauen. Dies erfolgt bevorzugt durch Verwendung eines markierten dCTPs und eines markierten dGTPs in einer PCR Reaktion, um auf bisulfitbehandelter DNA CG Dinukleotide und damit etwa vorhandene Methylierung in der zugrundeliegenden genomischen Probe nachzuweisen.
Für die PCR wurde HotStar Polymerase und das folgende Protokoll verwendet:
Thermocycler Programm: 1. Segment: anfängliche Denaturierung 15 Minuten bei 95 °C
2. Segment: 40 cycles of 95°C for 45 sec
52°C for 45 sec 72°C for 45 sec
3. Abschließende Synthesephase 10 Minuten bei 72 °C Als Donor Akzeptor-Paar wurden Fluorescein und Cy5 ausgewählt. Selbige eignen sich für die Verwendung auf einem LightCycler. Es wurden sowohl FRET im Einzelstrang, d.h. Zwischen Markierungen an einem Strang, und FRET zwischen zwei hybridisierten Strängen gemessen. Dabei war ein FRET zwischen hybridisierten Strängen nur sehr schwach, so dass dieser die Auswertung nicht signifikant beeinflussen wird. Folgende PCR-Versuchsbedingungen galten für den gleichzeitiger Einbau von Fluorescein-G und Cy5 Markierungen zum Nachweis eines FRET im Einzelstrang in einer PCR Reaktion:
Fluo-dGTP 0,050 mM
Cy5-dCTP 0,050 mM
Taq 0,1 U/μl dNTP (jeweils) 0,1 mM Primerl 0,5 pmol/μl
Primer2 0,5 pmol/μl
BSA 0,25 mg/ml
Puffer 1 x 1,5 mM
DNA 0,4 ng/μl
Als Beispiel wurde ein 153bp Fragment des Bisufit behandelten humanen GSTPI Gens ausgewählt. Folgende Primer wurden für die Amplifikation verwendet:
Primerl: GTTTT (C/T) GTTATTAGTGAGT (SEQ. ID:1) Primer2: TCCTAAATCCCCTAAACC (SEQ. ID:2)
Zur Detektion des FRET zwischen zwei Strängen und des FRETs zwischen unterschiedlichen Markierungen innerhalb eines Stranges wurden erstens Heteroduplexes hergestellt von Amplifikaten, die jeweils nur mit einer der Markierungen versehen waren, und zweitens wurden nach obigem Protokoll Amplifikate hergstellt, bei denen beide Markierungen in einem Strang eingebaut wurden, mit markiertem dCTP und dGTP. Die Analyse der PCR Reaktion erfolgte mit einem Agarose- gel nach Standardverfahren. Die Länge der PCR-Produkte wurde durch Fluoreszenzdetektion auf einem Polyacryala- midgel (ALF-Express Instrument, Amersham Pharmacia) und Fragmentanalyse mittels Kapillargel- elektrophorese (ABI Pris ) untersucht.
Die Anwendung des ALF Standardprotokolls zur Kontrolle des Einbaus der jeweiligen Markierungen ist in Figur 3 und Figur 4 dargestellt. Der FRET zwischen den Markierungen wurde auf einem LightCycler Instrument (Röche Applied Science) bestimmt.
Der FRET zwischen Fluorescein und Cy5 ermöglicht nun die Rückschlüsse auf die Anzahl der CpGs in einem bestimmten Volumenelement in der Probe. Die Intensität des FRET is abhängig von der Einbaurate der markierten Nukleotide, dem durchschnittlichen Methylierungsgrad, der Anzahl der CpGs in der Probe und der Konzentration der Fragmente. Die Einbaurate kann über die Fragmentanalyse wie in Figur 4 mittels internen Standards (am Primer) bestimmt werden, Konzentration der Fragmente sowie Anzahl der CpGs sind bekannt. Damit lässt dich die durchschnittliche Anzahl der CpGs und daraus der Methylierungsgrad zwanglos ermit- teln, Verfikation erfolgt durch bekannte, jeweils zu 0 und 100% methylierte Template.
Die Intensität des FRET ist zudem vom Abstand der eingebauten Farbstoffe abhängig. Vor allem wenn man spezifi- sehe Dinukleotide bestimmen möchte, ist es unerlässlich, die Abhängigkeit des FRET vom Abstand der Farbstoffe zu kennen. Diese kann über Sondenoligonukleotide in einem LightCycler Experiment wie dem folgenden bestimmt werden, hier durch eine Schmelzkurve: Verwendet wurden Hybridisierungssonden zur Detektion mit einer Lücke von 4 Basen zwischen den Sonden: 1. Ankersonde mit Fluoresceinmarkierung am 3'-Ende(*): 5 ' GTTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT_* 2. Methylierungsspezifische Sonde mit Cy5-Markierung am 5'-Ende(*) :
*_5 ' GTATTAGGTTTGGGTTTTTGGT
Die FRET Detektion der Sonden findet als Schmelzkurvenbestimmung in einem LightCycler statt (Figur 5) . Die an- fänglichen höheren Fluoreszenzwerte kommen durch den FRET zustande. Durch das Schmelzen der DNA werden die Stränge in einem solchen Maße getrennt, dass die Energieübertragung zwischen den Fluorescein und Cy5-Markierungen nicht mehr möglich ist und die Fluoreszenz nähert sich dem Hin- tergrundsignal an.
Diese Schmelzkurvenanalyse zum FRET-Nachweis kann in dem erfindungsgemäßen Verfahren im Anschluß an die PCR zur Bestimmung der Anzahl von FRET-Paaren in einem bestimmten Volumenelement durchgeführt werden.
Aus dieser Anzahl der FRET Paare, der Konzentration der PCR Produkte und der Anzahl der methylierbaren Positionen wird letztlich der durchschnittliche Methylierungsgrad bei Kenntnis der Einbaurate (siehe oben) errechnet.
Beschreibung der Figuren
Figur la Doppelsträngiges PCR-Fragment einer Bisulfit-DNA-Sonde, in der ein Cytosin (C) unverändert geblieben ist, weil es methyliert war. Die Gs und Cs sind jeweils mit einem Do- nor-Fluorophor und einem Akzeptor-Fluorophor markiert und bilden FRET-Paare, weil sie sich in großer Nähe zu einan- der befinden.
Figur lb
Doppelsträngiges PCR-Fragment einer Bisulfit-DNA-Sonde mir der gleichen Original-Sequenz wie in Abbildung la, worin ein C zu T umgesetzt wurde, weil es nicht methyliert war. Durch ein markiertes G und ein markiertes C an den gegenüberliegenden Strängen wird noch ein FRET-Paar gebildet.
Fugur 2a
Ein PCR-Fragment der Abbildung la unter Denaturierungs- Bedingungen, wobei die einzelnen Stränge in einem solchen Maß getrennt werden, dass sich an den gegenüberliegenden Strängen durch Gs und Cs kein FRET-Paar bilden kann. Es kann noch ein FRET-Signal detektiert werden, weil sich FRET-Paare durch Gs und Cs auf den einzelnen Strängen bilden.
Figur 2b Ein PCR-Fragment der Abbildung la unter Denaturierungs-
Bedingungen, wobei die einzelnen Stränge in einem solchen Maß getrennt werden, dass weder ein FRET-Paar durch Gs und Cs auf gegenüberliegenden Strängen gebidet wird, noch ein FRET-Paar auf den einzelnen Strängen gebildet wird, weil entweder nur ein G oder ein C vorhanden ist. Deshalb kann kein FRET-Signal detektiert werden. Figur 3
Detektion auf ALF-Express mit Standardprotokoll (nur Cy5 detektiert) : Vollständig methylierte, bisulfitbehandelte und a plifi- zierte DNA: Peak A: C-reicher Strang Cy5 markiert; Peak B: G-reicher Strang Cy5 markiert (d.h. nur die Cytosine aus den CG-Dinukleotiden) ; nichtmethylierte, bisulfitbehandelte und amplifizierte DNA: Peak C: C-reicher Strang Cy5 markiert; D: G-reicher Strang, kein Peak, da keine Cytosine vorhanden.
Figur 4
Detektion auf ABI Prism 310 DNA Analyzer (nur Fluorescein detektiert) :
Vollständig methylierte, bisulfitbehandelte und amplifi- zierte DNA: Peak A: C-reicher Strang mit Fluorescein markiert, nur im auf ethylierten Zustand sichtbar; B: G- reicher Strang mit Fluorescein markiert; nichtmethylierte, bisulfitbehandelte und amplifizierte DNA: C: C-reicher Strang, kein Peak; Peak D: G-reicher Strang mit Fluorescein markiert.
Figur 5 Die Kurven stellen die Schmelzpunktbestimmungen da, die den FRET zwischen den beiden Detektionssonden nachweisen. Die Kurve A zeigt die Schmelzkurve der aufmethylierten bisulfitbehandelten DNA, die Kurve B die bisulfitbehandelte nichtmethylierte DNA und C das Hintergrundsignal. Der niedrigere Schmelzpunkt von A kommt durch Mismatch zustande.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis bestimmter Basenabfolgen in einer DNA-Probe, dadurch gekennzeichnet, dass eine
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ausgeführt wird unter Verwendung a) eines Nukleotids, das Teil der zu detektierenden Basenabfolge ist, von dem eine geeignete Menge mit einem Donor-Fluorophor markiert ist, b) ein anderes Nukleotid, das Teil der zu detektierenden Basenabfolge ist, von dem eine geeignete Menge mit einem Akzeptor-Fluorophor markiert ist und dadurch gekennzeichnet, dass die Anwesenheit des Di- nukleotids durch das Ausmaß des Fluoreszenzresonanz- energietransfers (FRET) zwischen Donor- und Akzeptor- Fluorophor bestimmt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Echtzeit-Monitoring des FRET-Signals während der PCR durchgeführt wird.
3. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu detektierende Di- nukleotid selbst-komplementär ist.
4. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zu detektierende Dinukleotid im PCR-Produkt nur einmal auftritt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Dinukleotid mehrere Male im PCR-Produkt auftritt und die durchschnittliche Menge der Dinukleotide im PCR-Produkt bestimmt wird.
6. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Entstehung des PCR- Produkts durch den Anstieg der emittierten Fluoreszenz in sukzessiven Annealing-Phasen, beobachtet wird, wohingegen die Anwesenheit der zu detektierenden Dinukleotide in sukzessiven Denaturierungsphasen bestimmt wird.
7. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor der PCR entweder im Wesentlichen alle Cytosine in der DNA-Probe selektiv deaminiert sind, aber die 5-Methylcytosine jedoch im Wesentlichen unverändert beleiben oder im Wesentlichen alle 5-Methylcytosine in der DNA- Probe selektiv deaminiert werden, aber die Cytosine im Wesentlichen unverändert bleiben und dadurch gekennzeichnet, dass vorwiegend Cytosin- Guanin- (CpG) Dinukleotide detektiert werden, was Rückschlüsse auf den MethylierungsStatus der Cytosine in diesen CpG-Dinukleotiden dieser DNA-Probe erlaubt.
8. Verfahren gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Deaminierung durch ein Bisulfit-Reagenz durchgeführt wird.
9. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA durch ausgewählte DNA-Primer nur dann amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand an einer spezifichen Stelle in der Proben-DNA vorliegt, dessen Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren der ausgewählten Primer ist.
10. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-DNA durch ausgewählte PCR-Primer nur dann amplifiziert wird, wenn ein bestimmter Methylierungszustand in der Proben-DNA vorliegt, dessen Sequenz-Kontext im Wesentlichen komplementär zu einem oder mehreren Oligonukleo- tiden oder PNA-Oligomeren ist, die zusätzlich in der PCR-Reaktion verwendet werden.
11. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die Donor- und Akzeptor-Fluorophor-Paare ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Fluores- cein/Rhodamin, Phytoerythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5, Fluorescein/CY5.5, Fluorescein/LC Rot 640 und Fluo- rescein/LC Rot 705.
12. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, worbei die DNA-Probe vor der Deaminierungs-Behandlung mit Restriktionsendonukleasen gespalten wird.
13. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die enzymatische Amplifikation der chemisch be- handelten DNA socher Art ist, dass nur ein Strang der DNA-Probe amplifiziert wird.
14. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, wobei die DNA-Probe aus Quellen vom Säugetier iso- liert wird, z. B. Zeil-Linien, Blut, Sputum, Fäka- lien, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit, in Paraffin eingebettetes Gewebe, zum Beispiel Gewebe aus Augen, Gedärme, Niere, Gehirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Schnitten und alle mögli- ehe Kombinationen.
15. Verfahren gemäß einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass ein Primer in der PCR- Reaktion an eine Feststoffoberflache gebunden ist.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei die Oberflächenzusammensetzung Silikon, Glas Polystyrol, Aluminium, Stahl, Eisen, Kupfer, Nickel, Silber oder Gold umfasst .
17. Diagnostisches Kit zum Nachweis der Methylierung von Cytosin-Basen in genomischen DNA-Proben, umfassend Reagenzien zur selektiven Deaminierung von Cytosin- Basen in genomischer DNA, einen oder mehrere fluoreszierend markierte Nukleotide für den Amplifizie- rungsschritt und optional Protokolle oder Anleitungen für ein Verfahren, gemäß einem der voranstehenden Ansprüche .
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