FI90255C - Menetelmä polypeptidin valmistamiseksi, joka on komplementaarinen ainakin osalle alkuperäistä peptidiä tai proteiinia, ja komplementaarisen polypeptidin käyttö - Google Patents

Description

1 90255

Menetelmå polypeptidin valmistamiseksi, joka on komple-mentaarinen ainakin osalle alkuperåistå peptidiå tai proteiinia, ja komplementaarisen polypeptidin kaytto 5 Tama keksinto koskee menetelmåå polypeptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alkuperåistå peptidiå tai proteiinia, valmistamiseksi, jolloin polypeptidin, alkuperaisen peptidin tai alkuperåisen proteiinin amino-hapot mååritellåan kuuluviksi kodoniensa toisen emaksen 10 mukaisiin ryhmiin, ja todetaan aminohapposekvenssi ainakin osasta alkuperaistå peptidiå tai proteiinia. Polypep-tideillå on tiettyjå rakenteellisia ja biologisia aktii-visuuksia ja affiniteetteja. Keksinto koskee myos mene-telmiå, joissa nåitå polypeptidejå kåytetåån.

15 Farmaseuttisten aineiden systemaattinen suunnit- telu on nykyisin saavuttanut pisteen, jossa lååkefarma-kologit voivat usein ennustaa kyseesså olevan farmakologisen aineen aktiivisuuden, kun tunnetaan sen rakenne/ toiminta-aktiivisuus kemiallisella tasolla. Tåmå tieto on 20 ollut erityisen kåyttokelpoista suunniteltaessa uusia farmakologisia aineita, jotka ovat rakenteellisesti sukua kantayhdisteelle mutta joilla on uusia farmakologisia ominaisuuksia tai vaikutuksia.

Esimerkiksi steroidien biokemian ja suunnittelun 25 alalia on erilaisten steroidien rakennetta muunnettu lu-kuisilla tavoilla parantuneiden tai erikoistuneiden vai-kutusten aikaansaamiseksi. Erås toinen esimerkki syste-maattisesta lååkesuunnittelusta on synteettisten penisil-liinien lååketieteellisen kemian alalla: nyt on suunni-30 teltu synteettisiå penisilliinejå, joilla on joukko vaikutuksia, joita ei-synteettisillå penisilliineillå ei ole. Naihin parannuksiin kuuluvat oraalisen aktiivisuuden, laajaspektrisen vaikutuksen ja penisillinaasia tuot-tavien bakteerien vastaisen vaikutuksen aikaansaanti.

35 Makromolekyylirakenteiden, kuten proteiinien, ra- kennetta/toimintaa tunnetaan kuitenkin suhteellisen vå- 2 90255 han. Vaikka tiedetåån esimerkiksi, ettå vasta-aineet si-toutuvat antigeeneihin, ei kuitenkaan ymmårretå tåydelli-sesti taustalla olevia vetovoimavuorovaikutuksia. Viela vahemmån tiedetåån antigeenin heråttåmån reaktion, jossa 5 muodostuu antigeenin sitomaan kykenevån vasta-aineen muo-dossa olevaa proteiinia, perusmekanismista.

Samalla tavoin ymmårretåån epåtåydellisesti pepti-dihormonien ja niiden hormonireseptorien valinen vuoro-vaikutus. Tiedetåan, ettå hormonaalinen aktiivisuus ilme-10 nee sekå peptidihormonin sitoutumisaffiniteettina resep-toriinsa ettå tåmån sitoutuneen hormonin luontaisena re-septoria "stimuloivana" aktiivisuutena. Ei-proteiinihor-monien tunnettujen rakenne-toimintariippuvuuksien perus-teella on våitetty, ettå sitoutumisaktiivisuuteen liittyy 15 eri rakennenåkokohtia kuin luontaiseen stimuloivaan ak- tiivisuuteen. Tietyt kemialliset rakenteet nåyttåvåt saa-van aikaan ligandin, esimerkiksi hormonin, sitoutumisen reseptoriinsa. Toiset kemialliset rakenteet nåyttåvåt puolestaan saavan aikaan reseptorin "stimuloitumisen", 20 sen jålkeen kun hormoni on sitoutunut siihen.

Aineet, joilla on sitoutumisaktiivisuus muttei luontaista stimulointiaktiivisuutta, tunnetaan "salpaa-jina" tax antagonisteina, sillå ne salpaavat todellisen hormonin aktiivisuuden. Erås esimerkki tållaisesta sal-25 paavasta aineesta on isoproterenoli, tunnettu katekoli- amiinibeetasalpaaja, joka kehitettiin katekoliamiinien ja niiden reseptorien vålisiå rakenne-toiminta-riippuvuuksia koskevien joidenkin tietojen perusteella. Samoin on tuo-tettu agonisteja, jotka sekå sitovat ettå aktivoivat hor-30 monireseptoreja. Polypeptidihormonien ollessa kyseesså tållaisia rakenne-toimintariippuvuuksia ei tunneta tåy-sin. Siten tållå hetkellå ei ole olemassa tapaa, joka tåsmållisesti mahdollistaisi polypeptidien, joilla on ky-ky olla spesifisesså vuorovaikutuksessa tietyn proteiini-35 hormonireseptorin tai tietyn polypeptidihormonin kanssa, systemaattisen suunnittelun.

3 90255

Kaikilla organismeilla, joilla on vahingoittumaton immuunijårjestelma, on biologinen kyky tuottaa ryhmå hy-vin erikoistuneita proteiineja, jotka tunnetaan immuno-globuliineina. Immunoglobuliineja tuottavat immuunikompe-5 tentin organismin erikoistuneet solut vasteena organisms Ile vieraan molekyylin låsnåololle. Nåita vieraita mo-lekyylejå kutsutaan yleenså antigeeneiksi. Antigeenit mååritellaån toiminnallisesti molekyyleiksi, joilla on kyky saada aikaan komplementaarisen vasta-aineen muodos-10 tuminen kyseesså olevassa organismissa. Siten muodostu-neella spesifisella vasta-aineella on kyky sitoutua an-tigeeniin, joka stimuloi sen muodostumista. Spesifisen vasta-aineen biologisena funktiona on sitoa vieras anti-geeni ja johtaa siten sen inaktivoitumiseen.

15 Tiedemiehet ovat onnistuneet kåsittelemaån eri- laisten organismien immuunijarjestelmaå siten, etta on saatu aikaan valtava joukko vasta-aineita, jotka ovat osoittautuneet kayttokelpoisiksi seka terapeuttisessa etta diagnostisessa laåketieteessa. Tiede on vahan aikaa 20 sitten, hybridoomatekniikan keksimisen ansiosta, kehit-tanyt mahdollisuuden valmistaa monoklonaalisia vasta-aineita, jotka sitoutuvat spesifisesti determinantiksi kut-suttuun valittuun molekyylirakenteeseen. Tallaisten spe-sifisten vasta-aineiden kayttokelpoisuus on suunnattoman 25 suuri ja se ulottuu viimeaikaisista kliinisista kokeista, jotka viittaavat tulevaisuudessa tarkeåan osaan syovan vastaisessa taistelussa, vasta-aineiden jokapaivaiseen kliiniseen tehtavåan lukuisten sairaustilojen detektoin-nissa veritutkimuksin.

30 Eras hyvin kiintoisa mutta suurelta osin teoreet- tinen vasta-ainetekniikan sovellutus on anti-idiotyyppis-ten vasta-aineiden alue. Anti-idiotyyppinen vasta-aine on toinen vasta-aine, jolla on kyky sitoutua ensimmaisen vasta-aineen idiotyyppiin eli sitoutumiskohtaan. Tallai-35 sella anti-idiotyyppisellå vasta-aineella on yhteisia piirteitå antigeenin kanssa, johon ensimmainen vasta-aine 4 90255 sitoutuu. Jos esimerkiksi muodostetaan insuliinin vastai-sia vasta-aineita ja sitten anti-idiotyyppisiå anti-insu-liinivasta-aineiden vastaisia vasta-aineita, on anti-idiotyyppisten vasta-aineiden jollakin osalla (idiotyy-5 pillå) insuliinin kaltaisia ominaisuuksia. Tama havainto antaa uskottavuutta sille teorialle, etta vasta-aineen sitoutumiskohta on kolmiulotteinen negatiivinen kuva an-tigeenista ja etta ensimmåisen vasta-aineen vastainen an-ti-idiotyyppinen vasta-aine on siten alkuperaisen anti-10 geenin positiivinen kuva. Tållaiset havainnot viittaavat siihen, etta jos pystyttåisiin suunnittelemaan ja tuot-tamaan tallaisia keskenaan vuorovaikutuksessa olevia ra-kenteita, voitaisiin kehittaå kokonainen uusi ryhrna bio-logisesti aktiivisia aineita, esimerkiksi polypeptidihor-15 moneja tai niiden reseptoreja, joilla on monia erilaisia uusia ja kayttokelpoisia vaikutuksia.

Vaikka vasta-ainetekniikka on edistynyt nopeasti, on sillå edelleen perustavaa laatua olevia teknisiå ra-joituksia. Tieteen ja lååketieteen tåytyy esimerkiksi 20 vielåkin turvautua vasta-ainetta tuottavaan soluun vasta-aineiden muodostamiseksi. Tutkijat eivat pysty suoraan kontrolloimaan vasta-ainetuotantoa. Tållainen suora kont-rolli olisi hyvin suuri etu. Se mahdollistaisi sellaisia etuja kuin keinotekoisten "vasta-aineiden" tuotannon, 25 joilla olisi kyky spesifisesti olla vuorovaikutuksessa valitun molekyylin lisaksi myos tarnan molekyylin ennalta valitun osan kanssa tai sitoutua siihen. Vasta-aineen ja antigeenin vålisen vetovoimavuorovaikutuksen taustaa ei vielå ymmårretå tåydellisesti.

30 Edellå kåsitellyn perusteella on ilmeistå, ettå vasta-aineita tuottavilla soluilla on mekanismi antigeenin kemiallisen rakenteen toteamiseksi ja vasta-aineen muodossa olevan komplementaarisen kemiallisen rakenteen tuottamiseksi. Tållainen komplementaarisuus johtaa kykyyn 35 sitoutua antigeeniseen rakenteeseen. Ennen tåtå keksintoå oli toiselle proteiinirakenteelle komplementaarisen ja 5 90255 siten sen kanssa sitoutumaan kykenevån proteiinirakenteen suunnittelemiseksi ja valmistamiseksi valttamatonta tun-tea sitoutumisilmion perustana olevat kemialliset vuoro-vaikutukset.

5 Kaikki proteiinit tai peptidit ovat paåasiassa mo- nomeerisista aminohappoyksikoista koostuvia polymeereja. Yleisesti ottaen on olemassa 20 erilaista aminohappoa, joista kullakin on erilainen kemiallinen rakenne ja siten erilaiset kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet.

10 Joillakin aminohapoilla on esimerkiksi taipumus olla hyd-rofobisempia luonteeltaan, kun taas joillakin on taipumus olla luonteeltaan hydrofiilisempiå. Joillakin aminohapoilla on vastaavasti taipumus vetåa puoleensa eråita aminohappoja ja samalla hylkia eråita muita aminohappoja. 15 Kussakin proteiinissa esiintyy siten erilaisia kyseesså olevan proteiinin yksittåisten aminohappojen aikaansaamia veto- ja hylkimisvoimia. Nåiden proteiinin aminohappojen vålisten vuorovaikutusvoimien lisåksi esiintyy myos aminohappojen ja ympåriston vålisiå vuorovaikutusvoimia.

20 Viimeksi mainitut voimat riippuvat siitå, onko proteiini esimerkiksi vesi- eli hydrofiilisesså ympåristosså vai vedettomåsså eli hydrofobisessa ympåristosså.

Proteiinin aminohappojen våliset vuorovaikutusvoi-mat ovat proteiinin kolmiulotteista eli "tertiaarista" 25 rakennetta måårååvå tårkein tekijå. Siten eråån nåkokan-nan mukaan proteiinin tietyt alueet sitovat tai vetåvåt puoleensa saman proteiinin tiettyjå toisia alueita, kun taas jotkut alueet saattavat hylkiå proteiinin tiettyjå alueita. Nettotuloksena on karakteristisen muodon ja si-30 ten funktionaalisen aktiivisuuden antaminen kullekin pro-teiinille.

Våhån aikaa sitten on kehitetty keino aminohappojen karakterisoimiseksi hydropatian avulla, joka heijas-taa suhteellista hydrofiilisyyttå ja hydrofobisuutta [Ky-35 te et al., J. Molec. Biol., 157 (1982) 105-132]. Maini-tussa julkaisussa on johdettu hydropatia-asteikko, jossa 6 90255 on otettu huomioon kunkin aminohapon sivuketjujen hydro-fiiliset ja hydrofobiset ominaisuudet. Tietokoneohjelmaa hyvåksi kåyttåmallå on maaritetty jatkuvasti ennalta måå-råtyn pituisen polypeptidisekvenssin sisållå vallitseva 5 keskimåarainen hydropatia. Tåmå tutkimus on osoittanut, ettå proteiineissa on hyvin selvåsti erotettavia hydrofo-bisuus- ja hydrofiilisyysalueita ja etta tallaisten alu-eiden vålinen intramolekulaarinen vuorovaikutus voi, luonnollisesti sisåisten vetysiltojen muodostumisen li-10 såksi, vaikuttaa proteiinien kolmiulotteiseen rakentee-seen.

Eras vielå uudempi tutkimus on viitannut siihen, ettå amfifiilisilla proteiinirakenteilla, ts sekå hydro-fiilisiå etta hydrofobisia aminohappoja ja alueita sisal-15 tåvillå proteiinirakenteilla, on tårkeå osa sekå proteii-nihormonien ettå niiden reseptorien aktiivisuuden yllåpi-tåmisesså [Kaiser et al., Science, 233 (1984) 249-255]. Tåmå tutkimus viittaa lisåksi siihen, ettå esimerkiksi hormonireseptoreissa olevat amfifiiliset rakenteet saat-20 taisivat olla komplementaarisia itse hormonien amfifiili-sille rakenteille peilikuvan kaltaisella tavalla. Hormo-nin ja sen reseptorin vuorovaikutuksen vålittåjånå voisi siten olla hormonin amfifiilisen rakenteen spesifinen vuorovaikutus reseptorin komplementaarisen amfifiilisen 25 rakenteen kanssa. Eras tapa, jolla tåtå ajatusta voidaan havainnollistaa, on tarkastella lukko ja sen avainmallia, jossa lukon muoto edustaa reseptorin amfifiilista raken-netta ja avaimen muoto hormoniaineen komplementaarista amfifiilista rakennetta.

30 Niinpå keino, jolla voitaisiin systemaattisesti suunnitella polypeptidejå, joilla on kyky sitoutua tun-nettuihin peptideihin, proteiineihin tai proteiinia si-såltåviin reseptoreihin tai olla vuorovaikutuksessa niiden kanssa, olisi hyvin hyodyllinen. Kåytånnon tiedon, 35 joka koskee proteiinihormonien reseptorien kanssa vuorovaikutuksessa olevien rakenteiden suunnittelua, pitåisi 7 90255 esimerkiksi johtaa kokonaisiin uusiin ryhmiin synteetti-siå hormoneja, joilla on suurempi spesifisyys ja aktiivi-suus. Toisin pain ajatellen voitaisiin suunnitella ja tuottaa polypeptideja, jotka ovat komplementaarisia tun-5 netuille proteiinihormoneille ja sitten kykenevia sitou-tumaan nåihin hormoneihin. Tallaisia suunniteltuja poly-peptideja voidaan kayttåå esimerkiksi komplementaarisen hormonin tekemiseen inaktiiviseksi.

Tallainen proteiinien tai peptidien suunnittelun 10 hallitseminen voisi vastaavalla tavalla osoittautua hyvin merkittavåksi monille tieteellisen tutkimuksen aloille. Jos synteettinen polypeptidi, joka on komplementaarinen proteiinihormonille, on esimerkiksi rakenteellisesti ana-loginen tåmån hormonin biologisen reseptorin kanssa, pi-15 tåisi tåmån komplementaarisen proteiinin vastaisen vasta-aineen sitoa myos todellinen hormonin reseptori. Tallai-set vasta-aineet olisivat kåyttokelpoisia spesifisten hormonireseptorien tai niiden osien tutkimisessa ja eris-tåmisesså ja johtaisivat siten hormonireseptorivuorovai-20 kutusten vielå parempaan ymmartamiseen. Synteettisen proteiinin tai peptidin,joka on komplementaarinen jollekin tietylle proteiinille, pitaisi lisåksi olla kåyttokelpoi-nen tåmån proteiinin kiteyttåmisesså esimerkiksi proteii-nirakenteen tutkimiseksi rontgenkristallografian avulla. 25 Lisåksi voitaisiin suunnitella myrkyttomåksi tekeviå polypeptide jå, jotka sitoutuvat tiukasti ja spesifisesti luonnossa esiintyviin ja joskus nautituiksi tuleviin tok-sisiin peptideihin.

Edellå esitetyt kuvatukset ovat vain harvoja niis-30 tå lukuisista sovellutuksista, joita kyky suunnitella synteettinen proteiini tai peptidi mahdollistaisi. Kyky suunnitella systemaattisesti polypeptidi, joka on vuoro-vaikutuksessa tunnettujen proteiinien kanssa tai sitoutuu niihin, jolloin suunnittelu perustuu tunnetun proteiinin 35 rakennenåkokohtiin, olisi selvåstikin suurimittainen tie- 8 90255 teellinen låpimurto peptidialalla ja/tai kemiassa ja laå-kefarmakologiassa.

Selventåmisen ja yhtenåisyyden vuoksi mååritellåån seuraavien termien yleinen merkitys tåsså yhteydesså.

5 Termi antiparalleelinen, joka viittaa nukleiini- happojen pariutumisiin, osoittaa pariutuneiden nukleiini happojen suuntautumisen. Alkuperåinen nukleiinihappo saat taa olla suunnassa 5':sta 3'seen (5'-3'), jossa 5' ja 3' viittaavat nukleotidien kytkeytymiseen liittyvien sokeri-10 ryhmien asemiin. Toinen, alkuperåisen nukleiinihapposåi- keen kanssa emåspariutunut eli komplementaarinen nukleii-nihapposåie on suunnassa 3'-5' asetettuna yhdensuuntai-sesti alkuperaisen, 5'-3'-suuntautuneen såikeen kanssa.

Koodaava nukleiinihappo sisaltaå nukleotiditriple-15 teistå (kodoneista) muodostuvan sekvenssin, joka maåraå aminohapposekvenssin luettuna suunnassa 5'-3'. Koodaama-ton (komplementaarinen) nukleiinihappo (tai nukleiinihap-posåie) on komplementaarinen koodaavalle nukleiinihapolle (tai nukleiinihapposåikeelle) såikeiden sijaitessa tai 20 ollessa emåspariutuneina antiparalleelisessa suunnassa.

Termi hydropaattinen komplementaarisuus, joka viittaa aminohappojen hydropatia-arvoihin (hydrofiilisyyden ja hydrofobisuuden suhteellinen mitta) osoittaa korkeaa hyd-ropatiaa vastaavan alhaisen hydropatian ja pain vastoin.

25 Viitattaessa aminohappoja sisåltaviin rakenteisiin, niitå kutsutaan yleensa peptideiksi, polypeptideiksi tai proteiineiksi, jolloin tåmå jarjestys osoittaa koon kas-vamista esimerkiksi dipeptidien, oligopeptidien ja monia satoja aminohappoja sisaltåvien proteiinien vålillå.

30 Termillå komplementaarisuus tai komplementti on tåsså kåytettynå sen kåyttoyhteyteen perustuva merkitys. Esimerkiksi komplementaariset emåkset tai nukleotidit ovat emåksiå ja nukleotideja, jotka karakteristisesti muodostavat vetysidoksia (G-C ja A-T tai A-U), komplemen-35 taariset kodonit, nukleiinihapot tai niiden muodostamat 9 90255 såikeet ovat nukleiinihappokaksoissåikeen, kuten esimer-kiksi klassisesti mååritetyn kaksoiskierteen, vetysidok-sin sitoutuneita polynukleotidikomponentteja, ja komple-mentaariset aminohapot, joilla on tavallisesti hydropaat-5 tista komplementaarisuutta, ovat komplementaaristen kodo-nien muodostaman parin jåsenten måårååmiå aminohappoja.

Komplementaariset peptidit tai polypeptidit ja niihin liittyvå alkuperainen peptidi tai proteiini ovat peptidipari, jota måårååvåt komplementaariset nukleotidi-10 tai aminohapposekvenssit, ja niille on luonteenomaista sitoutumisaffiniteetti parin jasenten vålillå. Peptidille tai ainakin osalle proteiinista komplementaarisilla poly-peptideillå on esimerkiksi sitoutumisaffiniteetti tåmån peptidin tai proteiinin osan suhteen. Vaikka peptidien 15 sitoutumisaffiniteetteja ei tåydellisesti ymmårretå, ne voidaan ainakin osittain selittåå amfifiilinen sekundaa-rirakenne-ajatuksen avulla, jotka kuvaavat Kaiser et al. (Science, 223 (1984) 249-255).

Menetelmåå polypeptidin, joka on komplementaarinen 20 ainakin osalle alkuperåistå peptidiå tai proteiinia, ami-nohapposekvenssin maarittamiseksi ei ole tahån mennesså keksitty. Keksinnon mukaisille menetelmille on tunnus-omaista se, mitå patenttivaatimuksissa esitetåan. Eraan aspektin mukaisesti 25 (a) johdetaan ensimmåisen nukleiinihapon ensimmåinen nuk- leotidisekvenssi, joka mahdollisesti koodaa ainakin osan alkuperaisestå peptidistå tai proteiinista biosynteesiå; (b) mååritetaån toisen nukleiinihapon toinen nukleotidi-sekvenssi, joka emåspariutuu ensimmåisen nukleiinihapon 30 ensimmåisen nukleotidisekvenssin kanssa, jolloin ensimmåinen ja toinen nukleiinihappo pariutuvat antiparallee-lisissa suunnissa; ja (c) mååritetåån komplementaarisen polypeptidin aminohap-posekvenssi toisesta nukleotidisekvenssistå luettuna sa- 35 massa lukukehyksesså ensimmåisen nukleotidisekvenssin kanssa.

10 90255

Tama komplementaarinen polypeptidi, jonka amino-happosekvenssi on taten maaritetty, voidaan valmistaa erilaisin keinoin, kuten esimerkiksi kemiallisesti synte-tisoimalla, johtamalla mainitun aminohapposekvenssin si-5 saltavåsta proteiinista tai suuremmasta polypeptidistå tai, kun toinen nukleiinihappo on DNA, insertoimalla toi-nen nukleotidisekvenssi plasmidiin, jolloin muodostuu yhdistelmå-DNA-plasmidivektori, ja transformoimalla silla yksisoluinen organismi, jolloin saadaan mainittua komple-10 mentaarista polypeptidiå biologisesti syntetisoiva yksisoluinen transformanttiorganismi.

Eraana puolenaan tama keksintd koskee polypepti-dien, joilla on kyky olla spesifisesti vuorovaikutukses-sa valittujen, aminohapposekvenssiltaan tunnettujen koh-15 depeptidirakenteiden kanssa, suunnittelua ja tuotantoa.

Kuva 1 esittaa graafisesti koodaustiedon sisalta-van nukleotidisaikeen ja sen kanssa antiparalleelli-sesti emSpariutuneen komplementaarisen eli koodattamatto-man nukleotidisaikeen måSraamien aminohappojen hydropa-20 tia-arvojen riippuvuutta. Kunkin saikeen nukleotiditrip-lettikoodi luettiin suunnassa 5'-3'. Koodattujen aminohappojen hydropatia-arvot on piirretty komplementaarises-ti koodattujen aminohappojen keskimåaraisia hydropatia-arvoja vastaan.

25 Kuva 2 esittaa graafisesti koodaavan nukleotidi saikeen koodaamien aminohappojen ja sen kanssa antiparal-leelisesti emaspariutuneen koodaamattoman nukleotidisaikeen koodaamien aminohappojen hydropatia-arvojen riippuvuutta. Koodaavan saikeen nukleotiditriplettikoodi luet-30 tiin suunnassa 5'-3', kun taas koodaamattoman saikeen koo-di suunnassa 3'-5'. Koodattujen aminohappojen hydropatia-arvot on piirretty komplementaarisesti koodattujen aminohappojen hydropatia-arvoja vastaan.

Kuva 3 esittaa graafisesti vapaan ACTH:n sitoutumis-35 ta HTCA:lla (ACTH:lle komplementaarinen peptidi) tai insu- 11 90255 liinilla påållystettyihin mikrotitraussyvennyksiin. Si-toutunut ACTH mitattiin ELISA:11a (enzyme-linked immuno-absorbent assay).

Kuva 4 esittåå graafisesti ACTH:n sitoutumista mik-5 rotitraussyvennyksiin, joista kukin oli påållystetty HTCA: 11a (3,7 nmol/syvennys). Kukin ACTH-lisåys sisålsi 3,7 nmol liukenevaa ACTH:ta, ja se sekoitettiin ennalta abs-kissalle merkittyihin mååriin liukoista HTCA:ta. Sitoutu-nut ACTH mitattiin ELISA:11a, ja vapaa ACTH laskettiin 10 våhentåmållå sitoutunut ACTH kokonais-ACTH:sta.

Kuva 5 esittåå graafisesti HTCA:n vasta-aineen (anti-HTCA:n) sitoutumista kiinnitettyihin hiiren liså-munuaissoluihin (Y-l) ja tåmån sitoutumisen estymistå ACTH:n vaikutuksesta.

15 Kuva 6 esittåå graafisesti anti-HTCA:n ennalta si- dottujen hiiren lisåmunuaissolu(Y-l)komponenttien geeli-kromatografiaeluaattia.

Kuva 7 esittåå graafisesti gamma ( ϋ') endorf iinin sitoutumista erilaisista mååristå tåtå ainetta, joka li-20 såttiin mikrotitraussyvennyksiin, jotka oli påållystetty: naudan gamma-endorfiinisåikeellekomplementaarisen nukleo-tidisåikeen koodaamalla peptidillå (gamma-odne), 40^ug/sy-vennys; insuliinilla, 20 yksikkoå/syvennys; tai naudan seerumialbumiinilla (BSA), 200^ug/syvennys.

25 Kuva 8 esittåå epidermaalisen kasvutekijån (EGF:n) ja EGF-reseptorin nukleotidi- ja aminohapposekvensseja. Myos EGF-reseptorin nukleotidisekvenssille komplementaa-rinen nukleotidisekvenssi ja aminohapposekvenssi, jota koodaa komplementaarinen nukleotidisekvenssi luettuna 30 suunnassa 3l-5', esitetåån. EGF- ja EGF-reseptorisekvens-sien ollessa kyseesså pienemmållå numerolla merkityt ase-mat edustavat 51-nukleotidin suuntaa ja aminoterminaali-sen aminohapon suuntaa. EGF-reseptorille komplementaa-risen viestin sekvenssien ollessa kyseesså, pienemmållå 35 numerolla merkityt asemat edustavat 31-nukleotidin suun- 12 90255 taa ja aminoterminaalisen aminohapon suuntaa. Homologi-set sekvenssit on merkitty laatikoin.

Kuvat 9A ja 9B esittåvåt peptidihormonien (EGF, interleukiini-2 (IL-2) ja transferriini (TF)); peptidi-5 hormonireseptorien (EGF-reseptori, IL-2-reseptori ja TF-reseptori) ja naille reseptoreille komplementaarisen viestin tiettyja nukleotidi- ja aminohapposekvensseja. Pepti-dihormoni- ja reseptorisekvenssien tapauksessa pienemmal-la numerolla merkityt asemat edustavat 5'-nukleotidin lø suuntaa ja aminoterminaalisen aminohapon suuntaa. Komplementaarisen viestin sekvenssien yhteydesså pienemmålla numerolla merkityt asemat edustavat 3'-nukleotidin suuntaa ja aminoterminaalisen aminohapon suuntaa. Komplemen-taarinen nukleotidi luettiin suunnassa 3'-5', jolloin 15 saatiin vastaava aminohapposekvenssi.

Biologisesti merkityksellisten molekyylien vali-set vuorovaikutukset ovat solujen ja elinten valisen kom-munikoinnin perusta. Kun tietyt biologisesti merkityksel-liset kommunikoivat molekyylit ovat esimerkiksi peptidi-2ø hormoneja ja niiden peptidipitoisia solureseptoreja, on pitkMan etsitty pohjaa ja jarkevaa selitysta niiden kom-munikaatiovuorovaikutuksille.

Kuten tåsså kuvataan, on havaittu, ettå nukleiini-happojen antiparalleelisten emaspariutuvien saikeiden va-25 lilla vallitsee aikaisemmin havaitsematon ja perustavaa laatua oleva suhde. ErSana puolenaan tamS suhde saat-taa saada aikaan peptidipareja, joissa kyseessa olevan parin kummallakin jdsenella on affiniteetti toisen jasenen suhteen. Tclma perussuhde esitetaan taulukossa 1, jos-30 sa esitetaan erilaiset kodonit ja niille komplementaari-set (ts niiden kanssa emåspariutuvat) kodonit. Koodaavan saikeen (esimerkiksi saikeen, joka sisaltåa aminohapposek-venssiå kuvaavan koodausinformaation) esitetaan luettavina vasemmalta oikealle (suunnassa 5'—31). Komplementaarisen 35 (ts koodaamattoman) antiparalleelisen emåspariutuneen sai- 13 90255 keen kodonit luetaan myos suunnassa 5'-3'. Koodaamaton ja koodaava nukleiinihapposaie pariutuvat ollessaan an-tiparallellisessa suunnassa (esimerkiksi koodaava såie on vasemmalta oikealle luettaessa suunnassa 5'-3' ja koo-5 daamaton såie vasemmalta oikealle luettaessa suunnassa 3'-5'), niin ettå pariutuneita kodoneja katsotaan vastak-kaisissa tarkastelusuunnissa (esimerkiksi vasemmalta oikealle versus oikealta vasemmalle) luettaessa ne suunnassa 5'-3'. Taulukossa 1 annetut kodonit on ryhmitelty pe-10 råkkåin Kyten et al. måårittelemån hydropatian mukaan.

Tåtå nimenomaista ryhmittelyå kåytetåån ainoastaan asian valaisemiseksi, eikå sitå pitåisi pitåå tåmån keksinnon piiriå rajoittavana. Kuten taulukosta 1 voidaan havaita, komplementaarisilla kodoneilla, jotka pariutuvat hydrofo-15 bisia aminohappoja (joilla on suuri hydropatia) vastaavien kodonien kanssa, on taipumus koodata hydrofillisiå aminohappoja (joilla on alhainen hydropatia). Tilanne on kåån-teinen hydrofiilisten aminohappojen kodonien kohdalla. Lievåsti hydrofiilisten aminohappojen (joilla on lievås-2o ti negatiivinen hydropatia) ollessa kyseessa komplementaa-riset kodonit koodaavat samankaltaisia aminohappoja. Nåmå tulokset esitetåån graafisessa muodossa kuvassa 1. Tållå riippuvuudella on suuri biologinen merkitys, kuten jåljem-pånå kuvataan.

25 Taulukko 1

Aminohapot, joiden kodonit ovat komplementaarisia seuraavien aminohappojen kodoneille:

Koodaava såie Koodaamaton såie

Kodoni Aminohappo Kodoni Aminohappo 30 ----------------------------------------------------- (1) Hydrofobiset aminohapot AUU isoleusiini AAU asparagiini . . AUC isoleusiini GAU asparagiinihappo AUA isoleusiini UAU tyrosiini 35 GUU valiini AAC asparagiini 14 90255

Taulukko 1 (jatkuu)

Kodoni Aminohappo Kodoni Aminohappo GUC valiini GAC asparagiinihappo GUG valiini CAC histidiini 5 GUA valiini UAC tyrosiini CUU leusiini AAG lysiini CUC leusiini GAG glutamiinihappo CUG leusiini CAG glutamiini UUG leusiini CAA glutamiini 10 UUU fenyylialaniini AAA lysiini UUC fenyylialaniini GAA glutamiinihappo UGU kysteiini ACA treoniini UGC kysteiini GCA alaniini AUG metioniini CAU histidiini 15 GCG alaniini CGC arginiini GCU alaniini AGC seriini GCC alaniini GCC glysiini GCA alaniini UGC kysteiini (2) Hydrofiiliset aminohapot 20 CGC arginiini GCG alaniini CGU arginiini ACG treoniini CGA arginiini UCG seriini AGA arginiini UCU seriini CGG arginiini CCG proliini 25 AGG arginiini CCU proliini AAG lysiini CUU leusiini AAA lysiini UUU fenyylialaniini AAU asparagiini AUU isoleusiini AAC asparagiini GUU valiini 3Q GAU asparagiinihappo AUC isoleusiini GAC asparagiinihappo GUC valiini CAA glutamiini UUG leusiini CAG glutamiini CUG leusiini GAG glutamiinihappo UUG leusiini 35 GAA glutamiinihappo UUC fenyylialaniini

Taulukkqljatkuu)

Koodaava saie Koodaamaton saie

Kodoni Aminohappo Kodoni aminohappo is 90255 CAC histidiini GUG valiini 5 CAU histidiini AUG metioniini (3) Lievasti hydrofillinen aminohappo GGU glysiini ACC treoniini GGA glysiini UCC seriini GGG glysiini CCC proliini 10 GGC glysiini GCC alaniini ACC treoniini GGU glysiini ACU treoniini AGU seriini ACG treoniini CGU arginiini ACA treoniini UGU kysteiini 15 UGG tryptofaani CCA proliini UCC seriini GGA glysiini AGU seriini ACU treoniini UCG seriini CGA arginiini UCU seriini AGA arginiini 20 AGC seriini GCU alaniini UAU tyrosiini AUA isoleusiini UAC tyrosiini GUA valiini CCC proliini GGG glysiini CCA proliini UCC trypfaani 25 CCU proliini AGG arginiini CCG proliini CGG arginiini

Taulukossa 1 olevat pariutuneet kodonit (nukleo-tiditripletit) ovat tulosta hypoteettisten koodaavien nuk-30 leiinihapposaikeiden (tassa tapauksessa RNA) ja koodaamat-tomien nukleiinihapposaikeiden (antiparalleelisessa suun-nassa pariutunut RNA) vertailusta. Kumpikin saie luettiin sitten suunnassa 5'-3' ja samassa lukukehyksessa, jolloin saatiin alkuperaiset kodonit ja niille komplementaariset 35 (niiden kanssa emaspariutuvat) kodonit.

16 90 255 20 mahdollisesta hydrofobisia aminohappoja koo-daaville kodoneille komplementaarisesta kodonista vain kaksi (GCA ja UCG) koodaavat hydrofobisia aminohappoja.

18 mahdollisesta hydrofiilisiå aminohappoja koodaaville 5 kodoneille komplementaarisesta kodonista 13 koodasi hydrofobisia aminohappoja ja 5 lievasti hydrofiilisiå aminohappoja.

20 mahdollisesta lievasti hydrofiilisia aminohappoja koodaaville kodoneille komplementaarisesta kodo-10 nista 10 koodasi lievasti hydrofobisia aminohappoja, 5 vahvasti hydrofiilisiå aminohappoja ja 5 vahvasti hydrofobisia aminohappoja, jolloin netto-vaikutuksena oli pie-ni muutos hydropaattisessa luonteessa.

Taulukossa 2 luetellaan koodatut aminohapot ja 15 niitå vastaavat taulukon 1 mukaiset komplementaarisesti koodatut aminohapot, ja se sisåltåå myos niiden hydropa-tia-arvot (Kyte et al., 1982). 'j .

Taulukko 2

Taulukossa 1 esitettyjen aminohappojen ja niiden 20 komplementtien hydropatia-arvot

Aminohapot Arvo Kanplementit Arvot Keskim. arvo ILE +4,5 ASN -3,5 ASP -3,5 TYR -1,3 -2,8 25 VAL +4,2 ASN -3,5 ASP -3,5 HIS -3,2 TYR -1,3 -2;9 LEU +3,7 LYS -3,9 GLU -3,5 30 GLN -3,5 -3,6 PHE +2,7 LYS -3,9 GLU -3,5 -3,7 CYS +2,5 THR -0,7 ALA +1,8 +0,6 35 MET +1,8 HIS "3,2

Taulukko 2 (jatkuu)

Aminohapot Arvo Kanplementit Arvot Keskim. arvo 17 90 2 55 ALA +1,8 ARG -4,5 SER -0,9 5 GLY -0,4 CYS +2,5 -0,8 ARG -4,5 ALA +1,8 THR -0,7 SER -0,9 PRO -1,6 -0,5 10 LYS -3,9 LEU +3,7 PHE +2,7 +3,2 ASN -3,5 ILE +4,5 VAL +4,2 +4,4 ASP -3,5 ILE +4,5 15 VAL +4;2 +4,4 GLN -3,5 LEU +3,7 +3,7 GLU -3,5 LEU +3,7 PHE +2,7 +3,2 HIS -3,2 VAL +4,2 20 MET +1,9 +3,1 GLY -0,4 THR -0,7 SER -0,9 PRO -1,6 ALA +1,8 -0,1 25 THR "°/7 GLY -0,4 SER -0,9 ARG -4,5 CYS +2,5 -0,8 TRP -0,9 PRO -1,6 -1,6 SER -0,9 GLY -0,4 30 THR -0,7 ARG -4.5 ALA +1,'θ -1,6 TYR -1,3 ILE +4,5 VAL +4,2 +4,4 PRO -1,6 GLY -0,4 : 35 TRP -0,9 ARG -4,5 -2,5 18 90255

Kuten taulukossa 2 esitetaan ja valaistaan graafi-sesti kuvassa 1, on olemassa yleinen riippuvuus, josta ovat esimerkkeinå aminohapporyhmåt. Esimerkiksi ensimmais-ta aminohapporyhmaå maaraa (ts koodaa) ensimmainen kodoni-5 ryhma ja toista (komplementaarisesti koodattua) amino- happoryhmåa maaraa toinen kodoniryhmå, joka on komplemen-taarinen ensimmåiselle kodoniryhmålle. Havaitaan ensim-maisen aminohapporyhmån ja toisen aminohapporyhmån vali-nen riippuvuus, jota voidaan luonnehtia hydropaattisesti 1Q kåanteiseksi. Eraassa tapauksessa komplementaarisesti koo-dattuja hydrofiilisiå aminohappoja (joilla on alhainen hyd-ropatia) maaraavat kodonit, jotka ovat komplementaarisia hydrofobisia aminohappoja (joilla on korkea hydropatia) koodaaville kodoneille. Tata riippuvuutta voidaan kutsua 15 hydropaattiseksi komplementaarisuudeksi.

Kuva 1 esittaa taulukon 2 tuloksista piirrettya ku-vaajaa, joka osoittaa koodaavan nukleiinihapposåikeen ko-donien maaraamien aminohappojen hydropatia-arvoja komple-mentaarisen koodaamattoman sSikeen kodonien komplementaa-2Q risesti mSSrSamien aminohappojen keskimaaråisten hydropa-tia-arvojen funktiona. NSiden tulosten lineaarinen regres-sioanalyysi antaa korrelaatiokertoimeksi - 0,77. Samanlai-nen malli havaitaan, kun laskenta tehdaan eraallå toisella hydropatia-arvojen mMaraamisjarjestelmalla, jossa trypto-25 faanilla, tyrosiinilla, glutamiinilla ja asparagiinilla on jonkin verran erilaiset arvot (tulokset eivat nakyvissa, Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78 (1981) 3824-3828). Siten koodamattoman saikeen maåraåmien aminohappojen hyd-ropatia-arvoilla on taipumus olla kaanteisessa suhteessa 30 koodaavan såikeen aminohappojen hydropatia-arvoihin, eika tama riippuvuus ole sattumanvarainen, vaan se olisi ha-vaittavissa kayttamSlla mita tahansa aminohappojen ominai-suuksia kuvaavaa arvojenmaaraåmisjarjestelmaa, joka hei-jastaa hydrofobisuus- ja hydrofiilisyystaipumuksia joko 35 yksinaan tai yhdessa aminohappojen muiden fysikaalisten ominaisuuksien kanssa.

19 90255

Kiintoisaa on se, etta samankaltainen riippuvuus syntyy luettaessa komplementaariset kodonit suunnassa 3'-5'. Suunnassa 3^51 luettujen komplementaaristen kodo-nien koodausriippuvuudet esitetaan taulukossa 3.

5 Taulukko 3

Aminohapot, joiden kodonit ovat komplementaarisia seuraavien aminohappojen kodoneille.

Koodaava saie Koodaamaton saie

Kodoni Aminohappo Kodoni Aminohappo 10 _ (1) Hydrofobiset aminohapot AUA isoleusiini UAU tyrosiini GUU valiini CAA glutamiini GUC valiini CAG glutamiini GUG valiini CAC histidiini GUA valiini CAU histidiini UUA leusiini AAU asparagiini UUG leusiini AAC asparagiini CUU leusiini GAA glutamiinihappo CUC leusiini GAG glutamiinihappo 20 CUA leusiini GAU asparagiinihappo CUG leusiini GAC asparagiinihappo UUU fenyylialaniini AAA lysiini UUC fenyylialaniini AAG lysiini UGU kysteiini ACA treoniini 25 UGC kysteiini ACG treoniini AUG metioniini UAC tyrosiini GCU alaniini CGA arginiini GCC alaniini CGG arginiini GCA alaniini CGU arginiini 30 GCG alaniini CGC arginiini (2) Hydrofiiliset aminohapot CGU arginiini GCA alaniini CGC arginiini GCG alaniini CGA arginiini GCU alaniini 35 CGG arginiini GCC alaniini

Taulukko 3 (jatkou)

Koodaava såie Koodaamaton såie

Kodoni Aminohappo Kodoni Aminohappo 20 90255 AGA arginiini UCU seriini AGG arginiini UCC seriini AAA lysiini UUU fenyylialaniini AAG lysiini UUC fenyylialaniini AAU asparagiini UUA leusiini AAC asparag iini UUG leusiini 10 GAU asparagiinihappo CUA leusiini GAC asparagiinihappo CUG leusiini CAA glutamiini GUU valiini CAG glutamiini GUC valiini ^ GAG glutamiinihappo CUC leusiini GAA glutamiinihappo CUU leusiini CAC histidiini GUG valiini GAU histidiini GUA valiini (3) Lievåsti hydrofiiliset aminohapot GGU glysiini CCA proliini 20 GGC glysiini CCG proliini GGA glysiini CCU proliini GGG glysiini CCC proliini ACC treoniini UGG tryptofaani ACG treoniini UCG kysteiini 25 ACA treoniini UGU kysteiini UGG tryptofaani ACC treoniini UCU seriini AGA arginiini UCC seriini AGG arginiini UCA seriini AGU seriini 30 UCG seriini AGC seriini AGU seriini UCA seriini AGC seriini UCG seriini UAU tyrosiini AUA isoleusiini UAC tyrosiini AUG metioniini 35 CCU proliini GGA glysiini T a u. 1 ukk o _3 _ (jatkuu)

Koodaava saie Koodaamaton saie

Kodoni aminohappo Kodoni Aminohappo 2i 90255 ^ CCC proliini GGG glysiini CCA proliini GGU glysiini CCG proliini GGC glysiini

Kuten taulukossa 3 esitetåån, 20 mahdollisesta hydrofobisia aminohappoja vastaaville kodoneille komple-10 mentaarisesta kodonista ei suunnassa 3'-5' luettuna yk-sikaan koodannut hydrofobisia aminohappoja, 16 koodasi hydrofiilisiS aminohappoja ja 4 (UAU, ACA, ACG ja UAC) koodasi lievasti hydrofiilisia aminohappoja.

18 mahdollisesta vahvasti hydrofiilisia amino-15 happoja vastaaville kodoneille komplementaarisesta kodonista ei suunnassa 3'-5' luettuna yksikaan koodannut voi-makkaasti hydrofiilisia aminohappoja, 16 koodasi hydrofobisia aminohappoja ja kaksi (UCU ja UCC) lievasti hydrofiilisia aminohappoja.

20 Taulukossa 4 on luettelo aminohappojen ja nii- den komplementtien (ts komplementaarisesti koodattujen eli vastaavien komplementaaristen kodonien koodaamien aminohappo jen) , joita kuvataan taulukossa 3, hydropatia-arvot.

22 9 0 2 5 5

Taulukko 4

Taulukossa 3 esitettyjen aminohappojen ja nii-den komplementtien hydropatia-arvot Amiinihappo Arvo Komplement!t Arvot 5 ILE +4,5 TYR -1,3 VAL +4,2 GLN -3,5 HIS -3,2 LEU +3,7 ASN -3,5 GLU -3,5 10 ASP -3,5 PH E +2,7 LYS -3,9 CYS +2,5 THR -0,7 MET +1,9 TYR -1,3 15 ALA +1*8 ARG -4,5 ARG -4,5 ALA +1,8 SER -0,9 LYS -3,9 PHE +2,7 20 ASN -3e5 LEU +3,7 ASP -3,5 LEU +3,7 GLN -3,5 VAL +4,2 GLU -3/.5 LEU + 3,7 25 HIS -3,2 VAL +4,2 GLY -0,4 PRO -1,6 THR -0.7 TRP -0,9 CYS +2,5 30 TRP -0*9 THR -0,7 SER “0,9 ARG -4,5 SER -0,9 TYR -1,3 ILE +4,5 MET +1,9 35 . , PRO -1,6 GLY -0,4 23 90255

Lievåsti hydrofiilisiå aminohappoja koodaaville kodoneille komplementaarisista mahdollisista kodoneista luettuina suunnassa 3'-5' 14 koodaa lievasti hydrofiilisiå aminohappoja, 2 (ACA ja ACG) voimakkaasti hydrofiilisiå 5 aminohappoja ja 4 (UCG, UGU, AUA ja AUG) hydrofobisia aminohappoja. Nettovaikutuksena on pieni muutos koodaamaton-ta såiettå vastaavien aminohappojen keskimååråisesså hyd-ropaattisessa luonteessa.

Kuvassa 2 esitetåån koodaavaa såiettå vastaavien 10 aminohappojen hydropatia-arvot koodaamatonta såiettå vastaavien aminohappojen hydropatia-arvojen funktiona. Nåi-den tulosten lineaarinen regressioanalyysi antaa korrelaa-tiokertoimeksi -0,77. Niinpå, samoin kuin suunnan 5'-3' ollessa kyseesså, ovat suunnassa 3'-5' koodaamatonta såiet-15 tå vastaavien aminohappojen hydropatia-arvot kåånteisesså suhteessa koodaavaa såiettå vastaavien aminohappojen vas-taaviin arvoihin, eikå tåmå riippuvuus ole sattumanvarai-nen.

Nåmå geneettisen koodin sisåltåmån informaation 20 riippuvuuden osoittavat aminohappojen hydropaattisen komp-lementaarisuuden. Hydrofillisiå ja hydrofobisia aminohappoja koodaavien kodonien komplementteina olivat suunnassa 5'-3' luettuna yleenså hydrofobisia ja vastaavasti hydrofil lisia aminohappoja vastaavat kodonit. "Varauksettomia" 25 (lievasti hydrofiilisiå) aminohappoja vastaavien kodonien keskimååråisenå taipumuksena oli komplementoitua "varauksettomia" aminohappoja vastaavilla kodoneilla. Kuten nåmå tarkastelut osoittavat, on tuloksena låhes identtinen malli, kun komplementaarinen nukleotidikodoni luetaan 30 suunnassa 3'-5' suunnan 5'-3' sijasta. Koska komplemen- taarisen kodonin toinen nukleotidi on muuttumaton lukemis-suunnasta riippumattomasti, mååråå tåmå triplettikodonin toinen nukleotidi pååasiallisesti komplementaaristen kodonien koodaamien aminohappojen hydropaattisen komplemen-35 taarisuuden. Tåmå nåyttåå suurelta osin johtuvan siitå 24 90255 tosiasiasta, ettå pååosalla (6 7:sta) hydrofiilisista aminohapoista on adeniini nukleotidikodoninsa toisena nukleotidina, kun taas komplementaarinen nukleotidi uri-diini on useimpia (5 7:stå) hydrofobisia aminohappoja vas-5 taavien kodonien toisena nukleotidina. Toinen hydrofobi-sessa ryhmåssM esiintyvistå kahdesta poikkeuksesta edella esitettyyn (alaniini) ei vakavasti mitatoi edella. esitet-tya yleissåantoå, koska sen toisena emåksenå on sytosii-ni, kun taas hydrofiilisessa ryhmassa esiintyvan ainoan 10 poikkeuksen (arginiini) toisena emaksena on guaniini.

Siten hydrofobisten ja hydrofiilisten aminohappojen vaih-tuminen toisikseen on IShes tSyde]lista luetaanpa komplementaarinen kodoni suunnassa 5'-3' tai 3'-5'. Kuutta va-rauksetonta (lievasti hydrofiilista) aminohappoa, poikkeuk-15 sena tyrosiini, vastaavien kodonien toisena emaksena on joko G tai C. Siten tåta ryhmåå vastaavat kodonit johtavat tavallisesti samantyyppiseen aminohappoon riippumatta komplementaarisen kodonin luentasuunnasta.

Taulukossa 5 luetellaan aminohapot, joita vastaa-20 vat kodonit sisaltavat tietyn toisen (keskimmaisen) emaksen .

25 90255 T au lukko_5

Aminohapot, joiden kodonissa on tietty toinen emas RNA-kodonin Aminohapot toinen emSs O _ ______________________________

U ILE

VAL

leu PHe

MET

1Q A LYS

ASN

ASP

GLN

GLU

HIS

TYR

15

G CYS

ARG G LY TRP SER

C THR

20 SER

PRO

ALA

Sillå aminohapporyhmållå (U-ryhma), jota koodaava 25 toinen emas on uridiini, on komplementeerisesti koodattu aminohapporyhma (A-ryhma), jota koodaava toinen emas on adeniini, ja pMin vastoin. Sytosiinin ja guaniinin koodaa-milla ryhmillå (C-ryhma ja vastaavasti G-ryhmå) on saman-lainen riippuvuus.

30 Taulukossa 6 luetellaan kodonien, joilla on tietty toinen emas, koodaamien aminohappojen hydropatia-arvot ja, kåtevyyden aminohapoille (komplementeille). TassSkin ta-pauksessa nåhdaan hydropaattisesti komplementaarinen riip-:. . puvuus.

35 26 90255

Taulukko 6

Aminohappojen ja niiden komplementtien hydro- patia-arvot taulukon 5 mukaisesti ryhmiteltyina

Toinen KeskimaMrMiset hydro- ^ emasryhma patia-arvot

Koodattu Komplementti U ILE +4,5 VAL +4,2 LEU +3,7 PHE +2,7 IQ MET +1,9 +3)4 -3;2 A LYS -3,9 ASN -3,5 ASP -3,5 GLN -3,5 GLU -3,5 HIS -3,2 TYR -1,3 -3,2 +3,4 G CYS -2,5 ARG -4,5 GLY -0,4 TRP -0,9 SER -0,9 -0,8 -0,4 20 C THR -0,7 SER -0,9 PRO -1,6 ALA +1,8 -0,4 -0,8 25 Taulukoista 2, 4 ja 6 on selvasti nahtavissa, ettå peptideihin ja niiden komplementteihin liittyy yleinen hydropaattisen luonteen vastakkaisuus kunkin aminohapon kohdalla, kun sekvenssit asetetaan yhdensuun-: taisesti paralleelisella tai antiparalleelisella tavalla 30 muodostusmenetelmastS riippuen. TamSn keksinnon edulli-: set suoritusmuoto, joista on esimerkkina taulukoissa 1 ja 3 esitettyjen kodoniriippuvuuksien hyvSksikayttd, ovat erityistapauksia yleisemmin maaritellysta menetelmasta komplementaaristen peptidien muodostamiseksi.

33 Kun nukleiinihapposekvensseja ei tunneta, voidaan 27 90255 kayttaa toisen emaksen komplementaarisuuteen tai hydro-paattiseen kaanteisyyteen perustuvia yleisia menetelmiå erityisen edullisten komplementaaristen peptidien homolo-gien muodostamiseen. Kun esimerkiksi tunnetaan kokonaan 5 tai osittain proteiinin tai peptidin aminohapposekvenssi, mutta ei sita vastaavia nimenomaisia kodoneja, komplemen-taarinen peptidi voidaan suunnitella taulukossa 6 esitet-tyjen yleisten riippuvuuksien perusteella. Alkuperaisen proteiini- tai peptidisekvenssin aminohappo, jonka kodonin -LQ toinen-emas on uridiini (U-ryhmån aminohappo), korvataan A-ryhmån aminohapolla ja pain vastoin. Proteiini- tai peptidisekvenssin aminohappo, jonka kodonin toinen emas on sytosiini (C-ryhma), korvataan guaniiniryhmån (G-ryhman) aminohapolla. Naiden korvausten jalkeen saatu aminohappo-35 sekvenssi on komplementaarinen vastaaville osille alkupe-raistå peptidia tai proteiinia.

Taulukoita 1, 3 ja 6 voidaan kayttaa yleisella tavalla, kun ei tunneta nukleiinihapposekvensseja. Tål-laisissa tapauksissa alkuperaisessa peptidi- tai prote-20 iinisekvenssissa oleva aminohappo korvataan aminohapolla, joka on peråisin vastaavasta koodaamatonta saietta vas-taavasta aminihapporyhmastå. Naiden substituutioiden jalkeen saatu aminohapposekvenssi on komplementaarinen alkuperaisen peptidin tai proteiinin vastaaville osille.

25 Taman keksinnon periaatteiden lisalaajennuksena on se, ettå komplementaarisen aminohapposekvenssin nimenomai-nen suuntautuminen ei vålttamatta ole ratkaiseva. Kuten alan ammattimiehelle kay selvaksi hanen tutkiessaan koko tasså esitettya kuvausta, voidaan aminohapot muodostet-30 taessa komplementaarinen polypeptidi asettaa rinnakkain kumpaan tahansa kahdesta suunnasta orientoituneina. Suh-teessa aminohapposekvenssiin, joka maaraa hydropaattisel-ta luonteeltaan tietynlaisten aminohappojen asemat, ovat aminoterminaalinen ja karboksiterminaalinen suunta vaih-35 dettavissa keskenaMn, ja kumpikin konstruktio johtaa komp- 28 90255 lementaarisiin polypeptideihin. Yksinkertaisemmassa muo-dossa voidaan eraana esimerkkina mainita, ettå jos tie-tyn aminohapposekvenssin aminoterminaalinen paa sisaltåa valiinin (kodonin toinen emas = U), sisaltaisi komplemen-5 taarinen aminohapposekvenssi aminoterminaalisessa tai karb-oksiterminaalisessa paassa aminohapon, jonka kodonin toinen emas on A (LYS, ASN, ASP, GLN, GLU, HIS tai TYR), kun kåytetåan taulukon 6 mukaista yleista menetelmaa.

Geneettinen koodi on saattanut syntyM evoluution 10 aikana tuloksena antikodonisten emasten ja niita vastaa-vien aminohappojen kemiallisesta samankaltaisuudesta. Tama samankaltaisuus on ehka johtanut tasså yhteydesså ha-vaittuihin malleihin. Tålle ilmiolle saattaa olla funktio-naalista ja evoluutioon liittyvaå etua siita tosiasiasta, 15 etta hydropaattisesti samankaltaisia aminohappoja vastaa-vien kodonien toinen emas on sama. Ennen nukleiinihappojen lukemisen suuntautumisen tuloa oli ehka lasna saman hydro-paattisen ryhman aminohappo, ja tuloksena olevat pepti-dit tai proteiinit olivat siten konformaatioltaan suurin 2Q piirtein samanlaisia luettiinpa nukleiinihapot kumpaan tahansa suunnista 51-3' ja 3'-5'.

Tama keksinto koskee tarkeimpSna puolenaan sita ha-vaintoa, etta voidaan suunnitella ja valmistaa polypeptide ja, jotka ovat komplementaarisia ainakin osalle alku-25 peråistM peptidia tai proteiinia, jolla on tunnettu ami-nohapposekvenssi tai koodaava nukleotidisekvenssi, ja joilla on sitoutumisaffiniteetti alkuperaisen peptidin tai proteiinin suhteen. Jos alkuperåisen peptidin tai proteiinin aminohapposekvenssi tunnetaan ainakin osittain 30 (esimerkiksi 4-5 aminohappoa), voidaan tata sekvenssia koskevaa tietoa kåyttaa monin tavoin komplementaarisen polypeptidin konstruktion måarååmiseen.

Edullisessa komplementaarisen polypeptidin suun-nittelutavassa kaytetSSn hyvSksi taulukossa 3 esitettyja 35 aminohapporiippuvuuksia. Siten jokaiseen alkuperSisen pep- 29 .90255 tidin tai proteiinin tai sen osan todetun aminohapposek-venssin isoleusiinikohteen laitetaan tilalle tyrosiini. Toisena esimerkkina mainittakoon, etta kukin valiini kor-vataan glutamiinilla tai histidiinillå. Loput 18 aminohap-5 poa korvataan myds taulukossa 3 esitettyjen riippuvuuksien mukaisesti. Kuten tSssa hakemuksessa jåljempanå osoitetaan (esimerkiksi esimerkit 2A, 2B ja 2C), kun alkuperaisina peptideina tai proteiineina kaytetaan peptidihormonin re-septorikohdan aminohapposekvensseja, saadaan tilastolli-jq sesti merkitsevåt ja ainutlaatuiset kodoniohjeet peptidi-hormonien osia vårten, joille on luonteenomaista sitoutu-minen mainittuihin reseptorikohtiin ja siten komplementaa-risuus niille. Tutkittaessa tarkeiranin esimerkkeja 2A, 2B ja 2C seka myds kuvia 8, 9A ja 9B kåy ilini, etta edulli-15 siirunat tiettyjen aminohappojen korvaamiset on tehty niissa tunnetun nukleotidisekvenssin perusteella, on esimerkiksi korvattu seriinilla arginiini ja seriinilla tai kysteii-ni1la treoniini.

Toisessa edullisessa menetelmåssa komplementaaris-20 ten polypeptidien suunnittelemiseksi kaytetaan taulukossa 1 esitettyja aminohapporiippuvuuksia. TSlloin kuitenkin luetaan alkuperaisen peptidin, proteiinin tai sen halu-tun osan aminohapposekvenssi karboksiterminaalisesta suun-nasta alkaen. Taman karboksiterminaalisen suunnan on maarå 25 vastata substituoivasti (ts. antaa ohjeet aminohappojen asemista) komplementaarisen polypeptidin aminoterminaalis-ta suuntaa. Kun tama jarjestyksen kaantyminen painvastai-seksi on saatu aikaan, korvaamiset voidaan tehda taulukossa 1 esitettyjen aminohapporiippuvuuksien mukaisesti. Ku-30 kin isoleusiini esimerkiksi korvataan tyrosiinilla, aspara-giinilla tai asparagiinihapolla. Muiden 19 aminohapon korvaamiset voidaan tehda taulukon 1 aminohapporiippuvuuksien mukaisesti.

Kuten jaljempana esimerkeissa 1A-1H esitetåan, suun-'· 35 niteltaessa gammaendorfiinille ja ACTHrlle komplementaari- 30 90255 sia polypeptideja ja valmistettaessa niitM tehtiin kukin aminohapposubstituutio tunnettujen nukleotidisekvenssien perusteella. EsimerkkeinM mainittakoon, ettå valiini kor-vattiin asparagiinihapolla tai histidiinillå; leusiini 5 lysiinillå tai glutamiinihapolla; fenyylialaniini gluta-miinihapolla; arginiini alaniinilla tai proliinilla; ly-siini leusiinilla; histidiini valiinilla; glysiini proliinilla; treoniini glysiinilla tai arginiinilla; seriini glysiinilla, arginiinilla tai alaniinilla; tyrosiini valiinil-10 la; ja proliini glysiinilla tai arginiinilla.

Eras toinen edullinen menetelmS tietyn komplementaa-risten aminohappojen joukon valitsemiseksi yhteinen toinen emås-ryhmåsta esitetaan seuraavassa. Kullekin valitulle aminohapolle muodostetaan luettelo kaikista mahdollisista 15 komplementaarisista aminohapoista, joita voisi syntya kaikista mahdollisista kodoneista suunnissa 3'-5' ja 5'-3' luettuina. Tasta luettelosta valitaan tiheimmin esiintyvå aminohappo. Esimerkiksi valiinille on olemassa 4 kodonia, jotka voidaan lukea kumpaankin suuntaan ja saada ryhma 20 valiinin mahdollisia komplementteja.

Valiini

Kodoni Komplementti 5'-luenta 3-luenta

GUU C AA ASN GLN

25 GUC CAG ASP GLN

GUG CAC HIS HIS

GUA CAU TYR HIS

Tasta luettelosta valitaan HIS VAL:n komplemen-tiksi. Tallaisia valintoja kutsutaan tåssa yhteydessa kon-30 sensuskomplementeiksi. Seuraavassa taulukossa esitetaan kullekin aminohapolle tehdyt valinnat.

3i 90255

Taulukko 6A

Konsensuskomplementtisubstituutiot Aminohappo Konsensuskomplementti

5 ILE TYR

VAL HIS

LEU GL^

PHE LYS

MET TYR, HIS

T ve phe

ASN LEU

10 ASP LEu

GLN LEU, VAL

GLU LEu

HIS VAL

TYR ILE

ργς THR

,c ARG ALA

15 gly pr0

*pj^p THR, PRO

gpp SER, A RG

THR CYS

PRO GLY

ALA ARG

2Q

Peptidien tuotantoa ja kåsittelya tuntevat tie-tavat, ettå kysteiiniryhman lasnåolo peptidisekvenssisså saattaa johtaa joissakin tilanteissa hapettumis- ja dime-- - roitumisongelmiin. NåistS syistå jotkut tutkijat saatta- ' . 25 vat haluta korvata komplementaarisissa peptidisekvensseis- sS olevat kysteiiniryhmat muulla hydropaattisesti neut-raalilla aminohapolla, kuten seriinilla, ja tallaiset kor-vaamiset ovat tamån keksinnon mukaisesti mahdollisia.

Eras toinen edullinen menetelma tietyn komplementaa-risten aminohappojen ryhman valitsemiseksi yhteinen toinen emas-ryhmasta on maarittåS kullekin aminohapolle tiheim-min kaytetty (lajispesifinen) kodoni ja lukea komplemen-taarinen kodoni joko suunnassa 5'-3' tai 3'-5' (tassa kaytetaan nimitysta "esiintymistiheyteen perustuvat kodo-nit"). Kullekin aminohapolle (ja kullekin lajille) voidaan 32 90255 johtaa kaksi esiintymistiheyteen perustuvaa komplemen-taarista aminohappoa ja kayttåå niitå komplementaaris-ten peptidisekvenssien muodostamiseen. Jos edella maini-tun prosessin aikana kohdataan lopetuskodoni (joka on 5 soluissa tapahtuvan luennan lopetuksen aikaansaava viesti) , voidaan kayttaå kyseesså olevaa aminohappoa vastaa-vaa toiseksi yleisinta kodonia (jne). Alla olevassa tau-lukossa 6B annetaan esiintymistiheyteen perustuvat komplementet aminohapoille, jolloin on kaytetty Granthamin et al. 10 ^Nuc. Acids. Res., 9 (1981) r43-r75/ maarittamia ihmiskodo-nifrekvensseja.

Taulukko 6B

Ihmisessa vallitsevaan esiintymistiheyteen perustuvat komplementtisubstituutiot 15 Aminohappo 5'-3'-komplementti 3'-5'-komplementti

ILE ASP TYR

VAL HIS HIS

LEU GLN ASP

PHE GLN LYS

MET HIS TYR

20

LYS LEU PHE

ASN VAL LEU

ASP VAL LEU

GLN LEU VAL

G LU LEU VAL

HIS VAL VAL

25 TYR VAL MET

CYS ALA THR

ARG PRO SER

G LY ALA PRO

TRP PRO THR

SER GLY ARG

30 THR GLY TRP

PRO GLY GLY

ALA GLY ARG

Eras vaihtoehtoinen ja edullinen menetelmå tietyn 35 komplementaaristen aminohappojen ryhman valitsemiseksi 33 90255 yhteinen toinen emås-ryhmasta on måSrittåå yleisimmin kåytetty kodoni kullekin toinen emås-ryhmålle. Koska ko-donien kayttotiheys vaihtelee lajista toiseen, tåmå la-hestymistapa voi antaa erilaisia valintoja eri lajeille.

5 Kayttamållå Granthamin et al. (Nuc. Acid. Res., 9 (1981) r43-r75) muodostamia ihmiskodonien kayttdtiheyksiå, muo-dostettiin seuraavassa taulukossa esitetyt valitut yksin-kertaistetut komplementaariset aminohapot (mainittuja komp-lementaarisia aminohappoja kutsutaan tassS "yksinkertais-1Q tetuiksi komplementeiksi").

Taulukko 6C

Ihmisen yksinkertaistetut komplementtisubstituutiot

Aminohappo Yksinkertaistettu komple ment ti 15

ILE, VAL, LEU, PHE, MET GLU

LYS, ASN, ASP, GLN, GLU, HIS, TYR LEU

CYS, ARG, GLY, TRP ALA

SER, THR, PRO, ALA GLY

2Q Peptidi saattaa olla joissakin tapauksissa itse- komplementaarinen sekvenssinså erityispiirteiden takia. Sekvenssi on itsekomplementaarinen, kun se sisaltaS in-versiokohdan toinen emSs-sekvenssissåan. Esimerkki: ' N-paa Glu-Leu-Glu-Leu Peptidisekvenssi

25 51 -paa A - U - A - U

3'-paa U - A - U - A Komplementtisekvenssi C-paå Leu-Glu-Leu-Glu • Tama tetrapeptidi on selvastikin oma komplement- tinsa, jolla on antiparalleelinen orientaatio. Talla pep-30 tidilla on joukko muita aminohapposekvenssiltaan erilai-sia antiparalleelisia komplement te ja, joilla edelleen on sama toinen emas-sekvenssi. Kaikkia antiparalleellisia komplementteja voitaisiin tarkastella toisina emas-analo-geina.

35 Naiden sekvenssien erityisluonne voi johtaa tiet- 34 90 255 tyjen koetulosten analysoinnin monimutkaisuuteen, kun lasna on itsekomplementaarinen peptidi muiden antiparal-leelisten komplementtien rinnalla. Muilla antiparallee-lisilla komplementeilla voisi olla tavanomaisten analogien 5 ominaisuuksia (agonisti- tai antagonistivaikutuksia) tai komplementteihin (epåtavanomaisia antagonisteja ja vasta-aineita, jotka ovat tavanomaisia agonisteja ja antagonisteja) normaalisti liittyvia ominaisuuksia. Riippumatta komplementtien toimintatavan yksityiskohdista naissa eri-10 tyistapauksissa, voidaan komplementaarisen peptidin peri-aatetta kayttaa uusien molekyylien, joilla on haluttuja biologisia aktiivisuusominaisuuksia, muodostamiseen.

Komplementaarisia polypeptideja, joiden sekvenssit on maaritetty milla tahansa edella kuvatuista menetelmista 15 alkuperaisen aminohapposekvenssin tai nukleotidikodonisek-venssin perusteella, voidaan sitten valmistaa kemialli-sella synteesilla, ohjatulla biologisella synteesilla tai johtamalla (esimerkiksi irrottamalla) peptideista tai proteiineista, jotka sisaltåvat måaritettyja aminohappo-20 sekvensseja.

TMssa kuvatut komplementaarisia aminohappoja kos-kevat riippuvuudet mahdollistavat monien polypeptidira-kenteiden, jotka sisaltavat halutiolle aminohapposekvens-seille komplementaarisia aminohapposekvensseja, muodostuk-25 sen ja kayton. Komplementaarinen aminohapposekvenssi voi olla kokonainen peptidi tai polypeptidi, kuten tassa esi-tetaan esimerkiksi HTCA:n ja gamma-odnen kohdalla, jotka ovat komplementaarisia kohdepeptidien ACTH (1-24) ja vas-taavasti geimmaendorf iini koko sekvenssi Ile .

30 Erityissovellutuksissa voidaan sitoa komplementaa rinen peptidi suurempaan molekyyliin sellaisin menetelmin kuin kemiallisella silloituksella tai sisallyttamallå suurempaan polypeptidirakenteeseen. Komplementaarisia polypeptideja voidaan myos kiinnittaa kiinteSan matrii-35 siin sellaisia kSyttbtarkoituksia kuin affiniteettikro-matografiaa vårten.

35 90255

TatS keksintSS kSytSnt6on sovellettaessa siina erityistapauksessa, etta kohdepeptidia koodaava nukleo-tidisekvenssi tunnetaan, voidaan sita kåyttSS komple-mentin aminohapposekvenssin mSaraSmiseen. Tassa tilan-5 teessa tietyt kodonit, jotka vastaavat isoleusiinia (AUU, AUC), leusiinia (UUA, CUA), treoniinia (ACU) tai seriinia (UCA), voivat johtaa komplementaarisiin kodo-neihin, jotka luettuina suunnassa 5'-3’ tai 3'-5' ovat lopetuskodoneja, jotka koodaavat proteiinisynteesin lo-10 pettamista. TassS tilanteessa kaytettSisiin lopetuskodo-nin toista emasta aminohapon valitsemiseen, jolla on sopiva hydropaattinen komplementaarinen luonne (taulu-koissa 5 ja 6 esitetyista ryhmista). Valintaa tietysta ryhmasta voidaan edullisesti kaventaa optimoimalla hyd-15 ropaattinen komplementaarisuus. Esimerkiksi ILE:a (hyd- ropatia-arvo +4,5) vastaavan kodonin (AUU tai UUA) olles-sa kyseessS voitaisiin valita LYS (hydropatia-arvo -3,9) ryhmasta, jossa komplementaarinen toinen emas on A; seriinia (hydropatia-arvo -0,9) vastaavan kodonin (ACU) olles-20 sa kyseessS voidaan valita tryptofaani (-0,9) tai serii-ni (-0,9) ryhmSstS, jossa toinen emSs on G.

TSmSn keksinnon piiriS voidaan kuvata tarkemmin erityissuoritusmuotojen avulla. Luteinisoivaa hormonia vapauttava hormoni (LH-RH) esimerkiksi on dekapeptidi, 25 jota koodaava nukleotidisekvenssi on tuntematon mutta jolla on taulukon 7 ylimmSHS rivilla esitetty amino-happosekvenssi.

36 90255 g !8£3 £ έ .2r£,E £ δΕ’-ΓΕΊί £ υ £Γ£ ϋ C7<3uPto ι

flBMUO «Μ Vlp^OJ

3 c c 3 cl w c a c 3 in μ S G S G .3 assess S' >1 ^ U o fl3 O Vj U o Π3 u Swa< £

^ μ o *—< <D 4-> CJ H D O 4J

Λ! J*

5 I

<H W< >, W CT< O1 l-t »-t 1-« P «0 s & ces Is e«£3 η åO U U t-ι O ro fi £ £«£3

W <H 4J .-I

£ $£ 5

3 3 0 3 0) H 3 II JJ

5 3£ S

:': , >-i Q ^ t) Q

^8¾ s I S S

II 11 II

Η > H > En > 37 90255 Tåsså kuvattujen tietojen ja periaatteiden poh-jalla ennustetaan luottamuksella, etta useimmat, ellei-vat kaikki taulukkoon 7 liittyvilla menetelmillå tuote-tut komplement!t vetåvåt puoleensa LH-RH:ta ja osoittau-5 tuvat kåyttokelpoisiksi tåmån hormonin vaikutusten saate-lysså.

Taman keksinndn mukaisten yhden tai useamman spesi- fisen peptidin, jolla on toivottavimmat biologiset tai bio- kemialliset ominaisuudet tai vaikutukset kyseesså olevas- 20 sa tapauksessa, valinta riippuu useista tekijoista, joi- hin kuuluvat biologisen systeemin, jossa komplementaaris- ta peptidia on måårå kayttaa, luonne, se halutaanko diagnos- tista tai terapeuttista kayttokelpoisuutta, ja biologisen vaikutuksen tyyppi ja vaikutustapa, jota komplementaari- 25 selta peptidilta odotetaan kohteena olevassa biologisessa systeemissa. Jotkut komplementaariset peptidit saattavat olla toisia edullisempia halutusta vaikutuksesta riippuen.

Seuraava lahestymistapa on eras ehdotus niiden monien mah- dollisten suunnitteluohjelmien joukosta, joita voidaan 20 kayttaa komplementaaristen peptidisekvenssien muodostami- seen, jotka saavat aikaan reaktion biologisessa, diagnosti- sessa tai fysikaalisessa kokeessa komplementaarisen pep- -4 tidin pitoisuuden ollessa 10 mol/1 tai pienempi. Tassa -4 komplementaarisen peptidin pitoisuus korkeintaan 10 mol/1 25 (tastedes kaytetåån nimitystå "pienin komplementaarisen pep-: tidin sitoutumisaktiivisuus") on kåyttokelpoinen parametri valittaessa soveltuvia keksinndn mukaisia komplementaari-sia peptidejå, sillå kåytånnon kannalta suurempiin kuin pienintå komplementaarisen peptisin sitoutumisaktiivi-30 suutta vastaaviin pitoisuuksiin saattaa liittyå epåkåytan-ndllisiå terapeuttisia annoksia, ja ne saattavat johtaa peptideihin, joiden sitoutuminen ei ole kyllin spesifi-nen ollakseen kåyttokelpoinen terapeuttisiin tai diagnos-tisiin kåyttotarkoituksiin.

35 Jåljempånå kuvattava valikointilåhestymistapa antaa 38 90255 alan anunattimiehille mahdollisuuden helposti valmistaa komplementaarisia peptidejå, joille on luonteenomaista pienin komplementaarisen peptidin sitoutumisaktiivisuus. Siinå erityistapauksessa, etta nukleiinihapposekvenssit 5 tunnetaan, voidaan suunnitella nelja komplementaarista peptidia suoraan edellS annettujen tietojen perusteella (lukemalla komplementaarinen nukleiinihapposekvenssi joko suunnassa 5'-3' tai 3'-5' ja orientoimalla saatu ami-nohapposekvenssi joko aminopaasta karboksipaåhan tai karboksipååstå aminopaahan) . Ellei yhdellåkåån naista komp-lementaarisista peptideistå ole haluttua aktiivisuustasoa tai ellei tunneta kohteen nukleiinihapposekvenssiå, voidaan suunnitella kaksi komplementaarista peptidia kohteen aminohapposekvenssin perusteella kayttamallå konsensus-15 komplementtilåhestymistapaa (taulukko 6A) ja orientoimalla komplementtiaminohapposekvenssi joko aminopaasta karb-oksipaahan tai karboksipaasta aminopaahan. Ellei ole saa-vutettu haluttua aktiivisuustasoa, voidaan suunnitella edelleen nelja komplementaarista peptidiS lahestymista-2Q valla, joka perustuu kodonien kåyttbtiheyteen (esimerkik-si taulukko 6B), lukemalla kutakin kohdesekvenssin amino-happoa vastaava useimmin kaytetty kodoni 5'-31-komple-mentikseen tai 3'-51-komplementikseen ja orientoimalla komp-lementtiaminohapposekvenssi joko aminopaSsta karboksipaa-25 tai karboksipaasta aminopaahMn. VielM kaksi komple- menttia voidaan suunnitella kayttamalla yksinkertaistet-tu komplementti-lShestymistapaa (esimerkiksi taulukko 6C), jossa identifioidaan lajispesifisesti tiheimmin kaytetty aminohappo kullekin toinen emas-ryhmalle, muodostetaan 30 komplementaarinen aminohapposekvenssi kohdesekvenssin kunkin aminohapon toinen emas-ryhmSn perusteella ja orien-toidaan komplementtiaminohapposekvenssi joko aminopaasta karboksipaahan tai karboksipaasta aminopSåhån.

Saatetaan havaita, etta kyseessa olevassa systee-35 misså toinen peptidisidosten orientaatio saa aikaan toi- 39 90255 votumpia komplementaarisia peptideja kuin toinen, ts pep-tidejå, joilla on pienin komplementaarisen peptidin si-toutumisaktiivisuus, tai peptideja, joiden aktiivisuus-alue on pienimmån komplementaarisen peptidin sitoutumis-5 aktiivisuuden ylåpuolella. Tåsså tapauksessa tutkijat saattavat haluta rajoittaa kokeilunsa toivottavaan orien-taatioon lisakokeiden yksinkertaistamiseksi. Jos edellå esitetty suunnitteluohjelma on johtanut erityisen toivottavaan komplementaariseen peptidiin, tutkijat voivat lisåk-10 si yrittåa, kuten yleensa tehdåan, loytaa viela toivot- tavampia komplementaarisia peptideja vaihtamalla selektii-visesti yksi tai useampia komplementtiaminohapposekvenssin aminohapoista samassa toinen emås-ryhmSssa oleviin muihin aminohappoihin.

15 Aktiivisten tai toivottavien komplementaaristen pep- tidien suunnittelua voidaan helpottaa myos valmistamalla komplementaaristen peptidien seos, kuten sellainen, joka voitaisiin saada peptidien kiinteafaasisynteesissa, jossa voitaisiin lisatS yhteen tai useampaan liittymisreaktioon 20 osallistuvat useat aminohapporeagenssit yhdessa vaihees- sa, minka jalkeen tehdaan seoksen gradienttieluointi affi-niteettikromatografiakolonnista, joka sisaltaa kiinteåan kantajaan kiinnitettya kohdepeptidia. Tiukimmin sitoutu-nut komplementaarinen peptidi eluoituu viimeisena. Eri elu-25 ointifraktioissa olevien peptidien rakenteet voidaan måå-rittåå keråcimållå fraktiot ja tekemalla sekventointi ta-vanomaisin keinoin. Talla tavalla voidaan tutkia monia peptideja mahdollisimman vahålla tyolla ja on helppo saada peptideja, jolla on pienin komplementaarinen aktiivi-30 suus.

.. . Vaihtoehtoinen tapa maårittcla toivottavat komple- mentaariset peptidisekvenssit olisi muodostaa joukko mono-klonaalisia vasta-aineita kohdepeptidille ja sekventoida immunoglObuliinia koodaavan geenin voimakkaasti vaihtele-35 vat alueet. Sekventointitutkimukse11a ldydetyt komplemen- 40 90255 taarisuusalueet osoittavat oikeassa kokoonpanossa ol-lessaan komplementaarisen peptidisekvenssin. Suunni-teltaessa komplementaarisia polypeptideja luonnon amino-hapot voidaan korvata osittain tai kokonaan analogeilla, 5 joilla on samankaltainen rakenne tai hydropaattisuus. Alaniini voidaan esimerkiksi korvata alfa-aminoisovoi-hapolla, arginiini kanavaniinilla, aspartaatti beta-hydr-oksiaspartaatilla, leusiini norleusiinilla tai gamma-kloorileusiinilla ja fenyylialaniini beta-fenyyliserii-10 nilla tai D-fenyylialaniinilla mainitaksemme vain muutamia alan ammattimiesten tuntemia rakenneanalogeja. TSllaisten korvausten kaytto komplementaarisen polypeptidin konstru-oinnissa taman keksinndn mukaisella menetelmalla on tarkoi-tettu kuuluvaksi taman keksinnon piiriin.

15 Luonnon hormoneille tai niiden osille komplemen taarisia peptideja voidaan kåyttåå muodostettaessa vasta-aineita, jotka tunnistavat ja sitovat hormonireseptoreja. Nailla vasta-aineilla on horraonin anti-idotyyppisten vasta-aineiden ominaisuudet, ja niita voidaan kåyttåa siten re-20 septorien puhdistamiseen, hormoniin normaalisti liittyvaan biologisen reaktion stimulointiin tai luonnon hormonin vaikutuksen estamiseen. Hormonille komplementaarisen pep-tidin vasta-aineen aikaansaamaa biologista reaktiota saa-telee osittain tapa7 jolla antigeeni (komplementaarinen 25 peptidi) tarjotaan kyseessa olevalle vasta-ainetta tuotta-valle solulle. Tietyt tarjoamistavat saattavat olla edul-lisia halutusta reaktiotyypistå riippuen.

Peptidit kytketåan yleensa kantajiin, kuten suuriin proteiineihin, kaytettaessa niita vasta-aineiden muodos-30 tamiseen. Alan cimmattimiehet tuntevat erilaisia kytkemis-menetelmia. Se, minka tyyppistS kytkemista kaytetaan, saattaa vaikuttaa komplementaaristen peptidiantigeenien tarjollaolotapaan.

Immunisaation tyypista (in vitro tai in vivo) riip-35 puen voidaan itse antigeeniin yhdistaa erilaisia muita li- 4i 90255 saaineita (apuaineita) immuunivasteen saatelemiseksi. Tallaiset apuaineet saattavat vaikuttaa myds komplemen-taaristen peptidiantigeenien tarjollaolotapaan.

Elainten seerumista otetut vasta-aineet ovat poly-5 klonaalisia, mika tarkoittaa sitå, etta ne ovat useiden soluryhmien tuottamien vasta-aineiden seos. Kun elaimet immunisoidaan komplementaarisilla peptideillå, jokin ala-ryhma kaikista vasta-aineista sitoutuu komplementaariseen peptidiin ja sen molekyylin, josta komplementaarinen pep-10 tidi on johdettu, reseptoriin. Tamå alaryhmå, joka myos koostuu joukosta vasta-ainetyyppeja, voidaan erottaa muis-ta vasta-aineista tavanomaisella affiniteettikromatogra-fialla. Tata puhdistettua alaryhmaa vasta-aineita kutsu-taan tavallisesti monospesifiseksi. Komplementaarisen pep-15 tidin monospesifisia vasta-aineita voidaan kayttSa resep-torien puhdistukseen, diagnostisten reseptorikokeiden te-kemiseen tai biologisen reaktion saåtelyyn.

Monospesifisia vasta-aineita voidaan tarkastella ryhmana vasta-aineita, joka on tuloksena antigeenin esiin-20 tymisesta erilaisissa konformaatioissa. Koska peptidianti-geenit ovat jossain maarin taipuisia, ne voivat esiintya monissa eri konformaatioissa eli kolmiulotteisina rakentei-na. Kukin tållainen konformaatio voisi johtaa hieman eri-laisten vasta-aineiden, jotka kaikki ovat monospesifisen 25 ryhman jasenia, muodostumiseen.

Kayttamalia alalia hyvin tunnettuja monoklonaali-menetelmia on mahdollista tuottaa suuria rnaaria monospesi-fisen ryhman tiettya vasta-ainetta. Tallaisista monoklo-naalisista vasta-aineista voitaisiin tutkia niiden kyky si-30 toutua voimakkaasti komplementaariseen peptidiin tai reseptoriin, kyky saada aikaan samankaltaisia biologisia reak-tioita kuin molekyyli, josta komplementaarinen peptidi on johdettu, tai kyky eståa biologinen reaktio. Siten on mahdollista tehda valikointi halutun reaktiotyypin mukaan 35 Komplementaarisia peptideja voidaan kMyttaa yhdessa 42 90255 apuaineiden kanssa rokotteiden muodostamiseen. Tålla ta-valla voidaan kåyttåå elimistdn immuunijårjestelmåå sen hormonijårjestelmien biologisen reaktion sååtelyyn. Anti-geenin esiintymismuoto voi vaatia erityisiå muunnoksia, 5 jotta varmistettaisiin halutun biologisen reaktion aikaan-saavien vasta-aineiden suurin populaatio. Kyseesså ole-valle biologisesti aktiiviselle peptidille komplementaari-set erilaiset peptidit saattavat saada aikaan erilaisen biologisen reaktion rokotuksen yhteydessa kolmiulottei-10 sissa konformaatioissaan vallitsevien erojen vuoksi.

Keksinnon mukaisesti valmistetut komplementaariset peptidit voivat olla komplementaarisia pienille peptideille tai proteiinien osille. Nåitå komplementaarisia peptidejå voidaan kåyttåå paljolti samalla tavalla kuin vasta-ainei-15 ta tållå hetkellå kåytetåån. Tåmån keksinndn mukaisesti suunniteltu polypeptidi voidaan esimerkiksi valmistaa komplementaariseksi tietylle osalle ainutlaatuista solu-pinnan proteiiniantigeenia, joka on luonteenomainen kyseesså olevalle kasvaimelle. Tållainen komplementaarinen 2Q polypeptidi voidaan kytkeå kemiallisesti moniin kiintoi-siin materiaaleihin, kuten biologiseen tax kemialliseen toksiinin, kuten risiinin A-ketjuun tai cis-platinayhdis-teisiin; rontgensåteitå låpåisemåttomåån aineeseen, kuten raskasmetalliin; radioisotooppiin; tai fluoresoivaan 25 aineeseen mainitaksemme vain muutamia monista mahdollisis-ta kiintoisista merkkiaineista tai aineista. Polypeptidi-materiaalikonjugaatti sitoutuisi spesifisesti kasvaimeen ja luovuttaisi siihen toksiinia tai merkkiainetta. Sel-laiset lååkkeiden luovutusjårjestelmåt kuin liposomit, 3Q biologisesti hajoavat polymeerit tai muut mielenkiinnon kohteena olevat kapselointiaineet voivat sisåltåå spesi-fisiå komplementaarisia polypeptidejå, jotka vapautetaan tiettyyn kohtaan.

Komplementaarisia polypeptidejå voidaan kåyttåå 35 tiettyjen aineiden aktiivisuuden kumoamiseen sitomalla 43 90255 ne esimerkiksi peptidihormoniin, entsyymin katalyytti-seen kohtaan tai peptiditoksiiniin. Hormonireseptoreista voidaan tehda inaktiivisia (antagonistilla) tai aktiivi-sia (agonistilla) antamalla polypeptideja, jotka ovat 5 komplementaarisia mainittujen reseptorien jollekin pro-teiiniosalle.

Tiettyjen entsyymien aktiivisille kohdille komple-mentaaristen polypeptidien pitåisi osoittautua farmakologisesti vaikuttaviksi. Monet diabeetikot saattavat esi- 10 merkiksi hyotyå insuliinia deaktivoivien entsyymien, glu-tationi-insuliinitranshydrogenaasin ja/tai insulinaasiksi kutsutun proteaasin, katalyyttisille kohdille komplemen-taarisen polypeptidin antamisesta.

Monia korkeasta verenpaineesta kårsiviå henkiloi- 15 ta saattaa auttaa angiotensiinijarjestelman håiritseminen kayttåmalla tMman keksinnon mukaisia menetelmia peptidien, jotka ovat komplementaarisia ainakin osalle angiotensino-geeniå, angiotensiini I:å ja/tai angiotensiini II:a, suun-nitteluun ja valmistukseen.

20 Endokrinologian alalia polypeptideja, jotka ovat komplementaarisia ainakin osalle hormonia, voidaan kayt-taa hormoonin biologisen vaikutuksen vahentåmiseen tai poistamiseen. Gravesin tautiin (eksoftalmusstruuma) nayt-taa esimerkiksi liittyvan kilpirauhasen liikatoiminta.

25 Tyrotropiinia vapauttavalle hormonille (TRHtlle) tai kil-pirauhasta stimuloivan hormonin (TSH:n eli tyrotropiinin) beeta-alayksikolle komplementaariset polypeptidit sitou- tuisivat nåihin hormooneihin ja helpottaisivat kilpirauhasen deaktivointia.

30 Taman keksinnon todennåkdisiin sovellutuksiin kuuluu veriryhmien identifioinnin helpottaminen. Erytro-syyttien pinnoilla esiintyy yli 1Q0 erilaista veriryhma-antigeenia, jotka erottavat toisistaan 14 tarkkarajaista geneettisesti itsenaistå ihmisen veriryhmajarjestelmaå.

35 Namå antigeeniset ryhmat identifioidaan tavallisesti agglu- 44 90255 tinoimalla erytrosyytit spesifisten antigeenien vasta-aineilla. Spesifisille veriryhmåantigeeneille komplemen-taarisia polypeptideja voidaan kayttaa vasta-aineiden si-jasta verityypitystarkoituksiin. Tietyn veriryhmaantigee-5 nin sisåltåmålle jollekin aminohapposekvenssille komple-mentaariset polypeptidit voidaan muuntaa ainakin divalent-tisiksi liittåmållå ne ristisidoksin sellaisiin aineisiin kuin glutaraldehydiin, tai ne voidaan kytkea fluoresoiviin variaineisiin tai radioisotooppeihin. Ensin mainitulla 10 tavalla muunnetut komplementaariset polypeptidit aggluti-noisivat erytrosyytteja, joissa on kohteena olava veriryh-måantigeeni. Fluoresoivalla aineella tai radioisotoopilla muunnetut komplementaariset polypeptidit sitoutuisivat erytrosyytteihin, jotka sisåltåvåt kohteena olevaa veri-15 ryhmåantigeenia, ja leimaisivat ne.

Peptidejå, jotka ovat komplementaarisia koriogo-nadotropiinin, biologisten nesteiden eraan raskausspesifi-sen komponentin beeta-ketjulle, voitaisiin kayttaa liitet-tyina merkkiaineeseen,kuten fluoresoivaan våriaineeseen, 20 radioisotooppiin tai entsyymiin, joka saa aikaan kromo-forisesti mitattavissa olevia tuotteita, helpottamaan tållå alalla vakiintunein keinoin tehtåviå raskaustestejå.

Avaimena immuunijårjestelmån moniin tårkeisiin puo-liin ovat tiedot, jotka koskevat T-solureseptoriin sitou-25 tuvan antigeenin aikaansaamaa T-solujen aktivoitumista. T-solureseptoriproteiineja ja vuonna 1984 nåitå molempia proteiineja koodaavia geenejå on kloonattu, eristetty ja mååritelty (Science, 25, s. 859 ja 25, s 1065). Kåyttå-mållå tåmån keksinnon yhteydesså kuvattuja menetelmiå 30 voidaan valmistaa T-solureseptorin eri osille komplementaarisia peptideja ja tutkia systemaattisesti T-solujen aktivointimekanismeja. Allergisiin reaktioihin tiedetåån liittyvån vålittyminen immunogloguliini E:n (IgE:n) kaut-ta. IgE:n osille komplementaariset peptidit tai proteiinit, 35 jotka sisåltåvåt IgE:lle komplementaarisia peptidisek- 45 90255 vensseja, voivat olla avuksi IgE-vMlitteisten allergia-oireiden lievityksesså.

Kollageenin, ihmiselimiston tårkeimmån rakenne-proteiinin, tuhoutumisella on suuri merkitys taudinsyn-5 nylle sairaustilaan joutuneessa isånnåsså. Aktivoitunut kollagenaasi, hydrolyyttinen lysosomaalinen metalloent-syymi, hyokkaa kollageenin kimppuun patologisten tilojen alkuvaiheessa. Kollagenaasin katalyyttiselle kohdalle komplementaaristen polypeptidien pitåisi olla kollagenaa-ig sia deaktivoivia aineita. Siitå syystå, etta nisakkaiden kollagenaasi hydrolysoi luonnossa esiintyvaa tyypin I kol-lageenia vain yhdesta tietystå kohdasta kussakin polypep-tidiketjussa, voidaan polypeptidiå, joka on komplemen-taarinen luonnossa esiintyvån tyypin I kollageenin talle 15 kohdalle, kåyttåå suojaamaan mainittua kollageenia kollagenaasin indusoimalta hajoamiselta.

Toksisille peptideille tai proteiineille komplemen-taarisia polypeptideja voidaan oikein annosteltuina kayt-tåa in vivo tai in vitro mainittujen materiaalien sitomi-20 seen ja niiden toksisuuden vahentåmiseen tai poistamiseen.

Menetelmia ja koostumuksia,joissa kåytetåån kek-sinnon mukaisia komplementaarisia peptidejS tai niiden vasta-aineita, voidaan kMyttaa myos hoidettaessa sairauk-sia, joihin liittyy jonkin proteiiniaineen yli- tai alituo-25 tanto, ja hoitoihin, joissa proteiiniaineen aiheuttaman biologisen reaktion voimistaminen tai heikentåminen on eduksi. Tarkemmin maariteltynå nama terapeuttiset koostumuk-set sisaltSvåt vaikuttavia maaria komplementaarisia peptide ja tai niiden vasta-aineita sekoitettuina farmaseutti-30 sesti hyvaksyttaviin kantoaineisiin. Tarkemmin ilmaistuna farmaseuttiset koostumukset, jotka sisMltavat aktiivisena aineosana keksinnon mukaisia komplementaarisia polypep-tideja tai niiden vasta-aineita, formuloidaan normaalisti sopivan kiintean tai nestemaisen kantaja-aineen kanssa 35 kulloinkin kaytettavSsta antotavasta riippuen. Parenteraa- 46 90 2 55 liset formulat ovat esimerkiksi tavallisesti injektoi-tavia nesteita, joissa kaytetåan kantajana farmaseutti-sesti ja fysiologisesti hyvåksyttåvia nesteita, kuten fysiologista suolaliuosta, tasapainotettuja suolaliu-5 oksia tms. Suun kautta annettavat formulat voivat puo-lestaan olla kiinteita, esimerkiksi tabletteja tai kap-seleita, tai nestemSisia Jiuoksia tai suspensioita.

Keksinnon mukaisissa terapeuttisissa menetelmisså komplementaarisia polypeptideja tai niiden vasta-aineita IQ voidaan antaa ihmisille tai mille tahansa muille kohde-organismeille erilaisin tavoin, kuten suun kautta, las-kimonsisaisesti, vatsaontelonsisåisesti, nenSnsisSisesti, ihonsisaisesti ja ihon alle. Alan ammattimies valitsee kulloisenkin antotavan ja annosteluohjelman ottaen huomi-15 oon potilaan erityispiirteet, tarvittavan hoidon luonteen ja/tai kyseessa olevan sairauden ja sairaustilan. Esimerkiksi vieraiden proteiinitoksiinien aiheuttamaa infek-tiota tai altistumista niille hoidetaan tavallisesti yhJ della tai kahdella annoksella paivassa muutamasta pMi-2q vasta muutamaan viikkoon; kun taas proliferatiivisen sairauden, kuten kasvainten tai sydvan, hoidossa annetaan yksi tai useampia annoksia paivassa kuukausien tai vuo-sien ajan. Taman keksinnon mukainen hoito komplementaari-silla peptideilla tai vasta-aineilla voidaan yhdistaa mui-25 hin hoitoihin, ja sita voidaan kayttaa yhdesså tai saman-aikaisesti muiden kemoterapeuttisten tai kemopreventiivis-ten aineiden kanssa hoitovaikutuksen aikaansaamiseksi nii-ta sairaustiloja tai tiloja vastaan, joihin ne ovat tehok-kaita.

30 Luetteloa taman keksinnon eri sovellutusten tallai- sista mahdollisista eduista ihmiskunnalle voitaisiin jat-kaa rajattomasti, ja siihen voisivat kuulua kaikki diagno-sointitavat, laåkkeiden vapauttaminen elimistoon, prote-iinien ja solujen silloitusmahdollisuudet, kasveista, bak-35 teereista tai hyonteisistS perSisin olevien myrkkyjen vai- 47 90255 kutuksen torjuminen ja kasvainten kasvun eståminen lukui-sin raekanismein, joihin kuuluu tiettyjen kasvainten kas-vulle vålttamåttomien kasvutekijoiden mitStointi. Tamån keksinndn kåyttokelpoisuus on paljon laajempi kuin tåsså 5 esitetyt erityisesimerkit.

Nukleiinihappojen pariutuvien nukJeotiditripletti-kodonisekvenssien vålisten riippuvuuksien merkitystå valais-tiin tarkemmin tutkimalla tiettyjen polypeptidien toiminta-aktiivisuuksia ja niiden valisia suhteita. Seuraavat esi-10 merkit sisållytetåån tahan tåmån keksinnon edullisten eri-tyissuoritusmuotojen esittamiseksi, eikS niita ole tarkoi-tettu keksintda rajoittaviksi, elleivat tassa esitetyt pa-tenttivaatiraukset sita erityisesti osoita.

Esimerkki 1A

15 Adrenokortikotrooppinen hormoni (ACTH, aminohapot 1-24 sisaltava fragmentti) ja sille komplementaarisen polypeptidin (HTCA, 1-24) suunnittelu ja valmistus

Synteettinen ACTH (fragmentti 1-24) saatiin Orga-nonilta (West Orange, NJ). ACTH:ta (1-24) koodaavan nRNArn 20 (lahetti-TNA:n) primaarirakenne saatiin Nakanishilta et al. (Nature 278 (1979) 423-427), ja se esitetaån taulu-kossa 8. mRNA-sekvenssin ylapuolella esitetaan vastaava ACTH:n (1-24) aminohapposekvenssi. Kun mRNA emSspariutet-tiin antiparalleelisessa suunnassa, oli tuloksena taulu-25 kossa 8 nakyva asianmukainen komplementaarinen nukleotidi-sekvenssi (cRNA) (kaannetty paralleeliseksi mRNA:n kans-sa). cRNA-sekvenssin alapuolella esitetaån HTCA:n, ACTH:

Ile (1-24) komplementaarisen polypeptidin, aminohapposek-venssi, joka saadaan lukemalla cRNA-sekvenssi suunnassa 3Q 5'-31 .

« 90255

TauHukko 8

ACTH, HTCA

ACTH: H,N-Ser Tyr Ser Met Glu His Phe Arg Trp Gly Lys

mRNA: 51-UCU UAC UCC AUG GAA CAC UUC CGC UGG GGC AAG

cRNA: 5'-GGG GUA CAC CUU CAC CGG GCG CCG CUU CUU GCC

5 HTCA:a H2N-Gly Val His Leu His Arg Ala Pro Leu Leu Ala

Pro Val Gly Lys Lys Arg Arg Pro Val Lys Val Tyr Pro-COOH

CCG GUG GGC AAG AAG CGG CGC CCG GUG AAG GUG UAC CCC-3' CAC CGG CUU GCC CCA GCG GAA GUG UUC CAU GGA GUA AGA-3'

His Arg Leu Ala Pro Ala Glu Val Phe His Gly Val Arg-COOH

Polypeptidin, jolla on edellS. esitetty HTCA:n aminohapposekvenssi, syntetisoi tåmån keksinnon tekijoil-le Peninsula Laboratories (San Carlos, CA).

Esimerkki IB

ACTH:n (1-24) sitominen siile komplementaariseen polypeptidiin HTCA (1-24)

Menetelmiå, joita kuvaavat yleisesti Johnson et al. (J. Immunol. 129 (1982) 2357-1359), kaytettiin osoit-tamaan komplementaaristen peptidien ACTH ja HTCA sitoutu-misaffiniteetti. l-25^ug/syvennys HTCA:ta tai insuliinia 20 karbonaatti-vetykarbonaattipåallystyspuskurissa lisSttiin 96-syvennyksisiin pyoreSpohjaisiin mikrotitrausmaljoihin, ja inkuboitiin lSmpotilassa 4°C 8 tuntia. Sitten levyt pestiin fosfaattipuskuroitua fysiologista suolaliuosta (PBS) ja Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 25 sisåltavalla puskurilla.

Insuliinilla paallystettyihin syvennyksiin ja joi-hinkin HTCA:11a paallystettyihin syvennyksiin lisåttiin lQ^ug synteettista ACTH:ta (1-24) PBS-Tween-puskurissa. Vertailusyvennykset (pelkka HTCA) sisalsivåt vain PBS-30 Tweeniå. Levyja inkuboitiin huoneen lSmpStilassa 2 tuntia ja pestiin sitten kolmesti PBS-Tween-puskurilla. Synteet-tisen ACTH 1-13:n amidin vastaista kaniinin antiseerumia (Accurate Biochemicals, Westbury, N.Y.) lisattiin kuhun-kin syvennykseen, ja levyjå inkuboitiin 1 tunti huoneen 35 lampotilassa. Kun oli pesty kolmesti PBS-Tween-puskurilla, 49 90255 lisåttiin alkaliseen fosfataasiin liitettyå vuohen anti-kaniini-IgG:ta (Miles Laboratories, Elkharbt, IN) PBS-Tween-puskurissa (laimennussuhde 1:300). Kun levyja oli inkuboitu 1 tunti huoneen låmpdtilassa, ne pestiin kol-5 mesti PBS-Tween-puskurilla, ja kutakin syvennysta kåsi- teltiin 200^ul:lla p-nitrofenyylifosfaattia (1 mg/ml kar-bonaatti-vetykarbonaattipuskurissa) 1 1/2 tuntia huoneen låmpotilassa. Sitten entsymaattinen reaktio pysaytettiin lisåamalla kuhunkin syvennykseen 3 N NaOH (50^ul), ja 10 mitattiin alkalisen fosfataasin tuotteen, p-nitrofenolin, optinen absorbanssi aallonpituudella 405 nm. Tå11a ELISA-måarityksellå (enzyme-linked immunoabsorbent assay) mitattiin påållystettyihin mikrotitraussyvennyksiin sitou-tunut ACTH.

15 Tåmån kokeen tulokset esitetåån kuvassa 3. Syn- teettinen ACTH (1-24) sitoutuu HTCArlla påållystettyihin mikrotitraussyvennyksiin, mutta ei insuliinilla påållystettyihin mikrotitraussyvennyksiin. ACTH:lle (1-13-amidi) spesifinen vasta-aine ei sitoudu HTCA-påållysteeseen, ei-20 ka ACTH sitoudu insuliinipåållysteeseen. Sitoutuneen ACTH:n moolimåårå oli suoraan verrannollinen HTCA-påål-lysteen konsentraatioon, mikå viittaa naiden kahden pep-tidin sitoutumiseen suhteessa 1:1 (tulosten analyysiå ei esitetå).

25 Mikrotitrauslevy preparoitiin ja kåsiteltiin ylei- sesti edellå esitetyllå tavalla, mutta se påållystettiin HTCA:lla (3,7 nmol/syvennys). Kuhunkin påållystettyyn syvennykseen lisåttiin liuos, joka sisålsi 3,7 nmol ACTH; ta ja kuvassa 4 abskissalla esitetyn måårån HTCA:ta.

30 ACHT:n sitoutumisen mittaaminen ELISA:11a osoitti, ettå noin 90 % ACTH-HTCA-sitoutumisesta oli spesifistå. Kuvan 4 tulosten Scatchard-analyysi (ei esitetå) osoitti.yhden yhtenåisen sitoutumiskohdan, jonka Kd on l,9^uM, joka on vertailukelpoinen vasta-aine-antigeenikompleksin affi-35 niteetin kanssa.

50 9 0 2 5 5

Esimerkki 1C T2 5 I-ACTH:n sitoutuminen 3'-5'-HTCA:han

Kayttamalla esimerkin 1A taulukossa 8 esitettya komplementaarista RNA(cRNA)-sekvenssia mutta lukemalla 5 cRNA suunnassa 3'-5' saatiin seuraava aminohapposekvens- si ja syntetisoitiin kemiallisesti vastaava peptidi (3* —51 — HTCA: H2N- Arg-Met-Arg-Tyr-Leu-Val-Lys-Ala-Thr-Pro-Phe-Gly-His-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Gly-His-Phe-His-Met-Gly-COOH.

10 Kayttamalla esimerkissS IB kuvattuja menetelmia paallystettiin polyvinyylimikrotitraussyvennykset 3'-5'-HTCArlla sen 1 mM liuoksesta tai BSA:lla.

BSA:lla ja 3'-5'-HTCA:11a paallystetyt syvennyk- 125 set pestiin ja kasiteltiin yhdellå kolmesta I-ACTH:n 15 (1-39) (New England Nuclear, Boston, MA) liuoksesta, jol- la oli eri konsentraatiot. Liuos poistettiin 45 min:n inkubointijakson jMlkeen, ja mikrotitraussyvennykset pestiin perusteellisesti. Mikrotitraussyvennykset ero- 125 tettxin toisistaan, ja mitattiin niiden I-sisaltc3 20 Beckman Gamma 5500-gammalaskurissa. Nåiden kasittelyjen 125 tulokset esitetaån taulukossa 9. Sitoutunut I-ACTH mitattiin kahtena rinnakkaismaarityksenå kolmella konsen-traatiolla leimaamattoman ACTH:n poissa ollessa ja sen ollessa lMsnå ylimaarin.

25 Taulukko 9

ACTH ja 3'-5'-HTCA

125

Sitoutunut CPM- I-ACTM

BSA- 3'-5'-HTCA- + ylimSarin ___paallyste paal lyste ACTH:ta -,n Vakeva 125I-ACTH 159 1819 616 160 1716 615

Suhteessa 1:3 laimennettu 125I-ACTH 155 601 287 165 590 299

Suhteessa 1:9 laimennettu 35 125l-ACTH 133 263 191 114 289 183 125 5i - 90255

Kuten taulukossa 9 esitetyt tulokset osoittavat, I-ACTH sitoutuu 3'-5'-HTCA-påållysteeseen muttei BSA: han, tunnettuun proteiiniin, jolla on laaja sitomiskyky.

125

Ylimaåraisen vapaan ACTH:n låsnåolo estaa I-ACTH:n 5 sitoutumisen 3'-5'-HTCA:11a påållystettyihin mikrotit- raussyvennyksiin. Tama tulos osoittaa seka komplementaa- risen peptidin affiniteetin alkuperaisen peptidin suhteen ettå sen tosiasian, ettå tallaisia komplementaarisia po- lypeptideja voidaan suunnitella ja valmistaa lukemalla 10 komplementaarisen nukleiinihapon kodonisekvenssi suun- nassa 3^51 ja syntetisoimalla kemiallisesti siten maa- ratty peptidi.

Esimerkki ID 125 1-ACTΗ:n sitoutuminen HTCA:n komponenttipepti-15 disekvensseihin Kåyttamaila esimerkin 1A taulukossa 8 esitettyå cRNA-sekvenssiS ja HTCA-sekvenssia syntetisoitiin sarja peptideja, jotka sisalsivat HTCA-aminohapposekvenssin karboksiterminaalisen osan. Eras pentameeri (5-meeri) 20 sisålsi aminohapposekvenssin H2N-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Eras dekameeri (lQ-meeri) sisålsi aminohapposek-venssin H2N-'Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Erås kaksikymmenjåseninen peptidi (20-meeri) sisålsi aminohapposekvenssin H2N-His-Arg-Ala-Pro-Leu-Leu-25 Ala-His-Arg-Leu-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg- COOH. Kullakin nåistå peptideistå påållystettiin mikrotit- raussyvennykset, ja påållystetyistå syvennyksistå tutkit- 125 tiin kyky sitoa I-ACTH:ta esimerkisså 1C kuvatulla ta-valla. Nåiden kåsittelyjen tulokset esitetaån taulukos-30 sa 10.

52 , 90 2 55 i—i

!>i EH

u <n m mm σι oo + ¾ N H rHOO m

CM CM .H

'«3 P w 8j£ Ξ H oo oo oo m

I :¾ Γ' co n in m rH

o :3 cn r-~ .—i cm cm cm

CM Cu r-H i—i ID ID

•S?

rH tC

>iH in o cm m cm oo Q M· in m ·μ· id m + < m m i—i h I (U a ή -p P w U d) >1 < Q) .Η

I g CM

Λ I .W CM rH iH CM CM

mo en m r-> vo m o.cn * «. men oo o cmiHQj oo m mcM ,h I—i 3

-P -P

3 I ·· C :« a

3 :3 EH

-P ευ

3 ·Η <C

0 i—t P >i C mm r^m id cm Η -p m «3· m m mm

03 + p CM CM

G QJ

•Η I -p Λ ή in Η p >, O CD (U H pg co i-η -3¾1-) moo M<m mm -P ε :3 cMm i—i in enen O c l :3 - in eo enen Μ V m a m m

3 O I

Ή Pi i—I

3 ε :3 3 O :3

Eh I X Pi 0)

1 I -P

<C < w ucntp cno mm m gmn jq ^ S S Π 1

G

.:. 3

G

§ 3 3

•P

^ i—I i—I

3 I m en H ....

· ffi I Γ-H r—I

E-i lo _

Γ) <N M (¾ K

<1 ^ ^ Ft ® P

λ ^ S ¥ 8 ¥

in <1) 4-5 H -pH

cm .¾ a m a m

. M 3 CM G CM

^ > ti rH CO -I

53 9 0 2 5 5

Kuten taulukossa 10 esitetyt tulokset osoittavat on kaikilla HTCA-sekvenssista peråisin olevilla peptideil-125 la kyky sitoa JI-ACTH:ta.

Esimerkki 1E

...... 1?5 5 Kaantexsesti suuntautunut HTCH ja I-ATHC:n (1-39) sitoutuminen siihen.

Syntetisoitiin 24-meerinen HTCA-variantti (R-HTCA), jonka aminohapposekvenssi oli kaånteisesti suuntautunut (aminoterminaalinen ja karboksiterminaalinen paa påinvas- 10 taisessa reunassa), ja silla oli seuraava sekvenssi: I^N-Arg-Val-Gly-His-Phe-Val-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-His-

Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Arg-His-Leu-His-Val-Gly-COOH.

125

Syvennysten paållystys ja I-ACTH:n sitominen tehtiin esimerkisså 1-C kuvatulla tavalla, ja tulokset esitetaan 15 taulukossa 11.

Taulukko 11 125 I-ACTH:n sitoutuminen R-HTCA:han CPM sitoutu- 125 nut I-ACTH (pulssia/min) BSA R-HTCA -fy liiraar in ACTH:ta 20 vSk. 125I-ACTH 159 10,392 303 160_10,709_325_

Subt .1:3 i2:5I-ACTH 155 2,997 140 lairr.. 16J>_3,209_121_

Suht. 1:9 125I-ACTH 133 1,101 65 laim. 1,14 1,161 69

Kuten taulukosta 11 ilmenee, R-HTCA-polypeptidilla, 25 joka on komplementaarinen ACTH:lle, on merkittava affini-teetti ACTH:n suhteen. Tama osoittaa tamån keksinnon eråån lisaaspektin; tassa erityisesti testattu kaanteinen suun-tautuminen mahdollistaa polypeptidien suunnittelun lisa-vaihtelun, jolla voidaan etsia kemiallisten, fysikaalis-30 ten ja biologisten vaikutusten optimaalista yhdistelmaa kyseessa oleviin olosuhteisiin tax kayttotarkoituksiin.

Jos HTCA ymmSrretaan aminohapposekvenssiltaan antiparallee-: liseksi ACTH-sekvenssiin nahden, on R-HTCA-sekvenssi pa- : ralleellinen ACTH-sekvenssiin nahden. Siten seka parallee- ; 35 lisilla etta antiparalleelisilla peptideilla tax polypep- 54 90 255 tideilla, jotka ovat komplementaarisia alkuperaiselle tai kohteena olevalle aminohapposekvenssilla, on todellinen affiniteetti tamSn suhteen. Alkuperaiselle peptidille tai proteiinille komplementaarisen polypeptidin komplementaa-5 risuus tai affiniteetti sSilyy riippumatta mainitun komplementaarisen polypeptidin aminoterminaalisesta ja karbok-siterminaalisesta suuntautumisesta.

Esimerkki IF

HTCA:n vasta-aineen valmistus ja ominaisuudet 10 HTCArn antigeeninen muoto valmistettiin kytkemalla 2Q0^ug HTCArta 20Q//ug:aan tulivuorokotilon hemosyaniinia (KLH, keyhole limpet hemocyanin) 6,7 mM glutaraldehydi-liuoksen avulla Avrameasin et al., menetelmien mukaises-ti (Immunochemistry 6 (1969) 53-66). Ylimååråinen glutar- 15 aldehydi poistettiin HTCA-KLH-konjugaatista johtamalla tuote Bio-Rad P-10-kolonnin låpi (BioRad, Richmond, CA).

Kaniinille annettiin kahden viikon valein kolme ruisketta, jotka sisalsivat 25^.ug HTCA-KLH:ta 0,5 ml:ssa taydellista Freundin apuainetta. Tuloksena olevasta kanii-20 nin antiseerumista eristettiin kokonaisimmunoglobuliini immuuniaffiniteettikromatografialla kolonnissa, joka si-sålsi vuohen anti-kaniini-immunoglobuliiniin liitettya Sepharose 4B:ta (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Ruot-si). Anti-HTCA-vasta-aineen puhdistamiseksi KLH-vasta-ai-25 ne poistettiin kokonaisimmunoglobuliinista johtamalla seos KLH:hon kytkettya Sepharose 4B:ta sisaltåvan kolonnin lapi. Suhteessa 1:300 laimennettu puhdistettu vasta-aine-valmiste (anti-HTC) detektoisi vahintaan 100 ng HTCA:ta epasuorassa ELISArssa.

30 ACTH:n ja anti-HTCA:n aikaansaama glukokortikoidi- hormonituotannon indusoituminen havaittiin viljellyisså nisåkassoluissa. Mikrotitraussyvennyksissa olevat hiiren lisamunuaiskasvainsoluviljelmåt (Y-l, kaksi rinnakkais-viljelmåa) kasiteltiin kasvualustalla, ACTHilla (10 mik-35 royksikkoa/syvennys) tai eri suhteissa laimennetulla anti- 55 90255 HTCA:11a. Tamån kokeen tulokset esitetåån taulukossa 12.

Taulukko 12

Lisays a Kortikosteroniekvivalentteja (^,ug/ml)^

Koe 1 Koe 2 5 ACTH 1,08 1,42 anti-HTCA 1:3 1,19 1,03 1:19 N.D. 0,78 1:30 N.D. 0;62 10 Alusta 0,66 0,68 aKaksi mikrotitrauslevyillå olevaa hiiren lisamunuais-solujen (Y—1) rinnakkaisviljelmaa kasiteltiin kasvualus-talla, ACTH:11a (10 mikroyksikkoå/syvennys) tai ilmoi-15 tetussa suhteessa laimennetulla HTCA:n vasta-aineella.

Kun oli inkuboitu 37°C:ssa 4 % C02 sisaltåvåsså atmos-fåarissa 18 tuntia, yhdistettiin replikaviljelmat ja tutkittiin niista glukokortikoidihormonin tuotanto kor-tikosteronin radioimmuunimSarityksella (RIA) (Smith et 20 al., Science 218 (1982) 1311-1212).

Kinnakkaiset annosvasteet tutkittaville naytteille ja kortikosteronistandardille mMåritettiin kymmenkertaiseksi kasvavalla alueella. MSSritysten vålinen variaatio oli 8,8 %.

25 cEi mååritetty.

Anti-HTCA:n aikaansaama hiiren lisamunuaiskasvainsolujen ACTH-reseptorin aktivoituminen osoittaa vasta-aineen ja ACTH:n valisen konfiguraatioanalogian. Normaali kanii-nin seerumi ja KLH:n vasta-aine eivat aiheuttaneet steroi-dogeenista vastetta (tulokset eivat nakyvissa) . Insuliini-: · reseptorien (Sege et al., Proc. Natl. Aca. Sci. (1978)) ja beeta-adrenergisten aineiden reseptorien (Schreiber ; et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 (1980) 7385-7389) akti- voitumista insuliinin tai beeta-adrenergisten aineiden vasta-aineita vastaan muodostettujen anti-idiotyyppisten 56 90255 vasta-aineiden vaikutuksesta on kuvattu. Siten on ole-massa analogiasuhde komplementaaristen peptidiligandien ja anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valilla.

Esimerkki 1G

5 Anti-HTCA:n sitoutuminen hiiren lisåmunuaiskasvain- soluihin (Y-1)

Hiiren lisamunuaiskasvainsolut (Y-l) kiinnitettiin glutaraldehydilla mikrotitrauslevyn tasapohjaisiin syven-nyksiin. Kiinnitetyt solut kåsiteltiin sitten kaniinin IQ anti-KLH:11a, pelkallå kaniinin anti-HTCA:11a tai ACTH:n ollessa låsnå eri pitoisuuksina. Pesun jalkeen mikrotit-raussyvennykset kåsiteltiin kaniinin iimnunoglobuliinin vastaisella vuohen vasta-aineella, joka oli kytketty al-kalinen fosfataasi-entsyymiin. Kun sitoutumaton vasta-15 aine-fosfataasikompleksi oli pesty pois, lisattiin p-nitro-fenyylifosfaattia, ja seurattiin entsyymista riippuvaa absorbanssin kehittymistå aallonpituudella 405 nm. Kuten kuvassa 5 osoitetaan, ACTH salpasi anti-HTCA:n sitoutumi-sen annoksesta riippuvalla tavalla. Kavi ilmi, ettS ACTH 2Q ja anti-HTCA kilpailivat hiiren lisSmunuaiskasvainsoluil-la (Y-l) olevasta samasta sitoutumiskohdasta. Kaniinin anti-KLH:11a ei ollut vaikutusta (varjostettu alue).

Esimerkki 1H

ACTH-reseptorin puhdistus 25 Puhdistettu anti-HTCA kytkettiin kovalenttisesti syanogeenibromidilla aktivoituun Sepharose 4B:hen. Noin 8 10 hiiren lisåmunuaiskasvainsolua (Y-l) a&nikasiteltiin 5 min taajuudella 40 kHz (Branson E Module Bath Sonica-tor) fenyylimetyylisulfonyylifluoridin ollessa ISsnå pi-30 toisuutena 2 mM. Kun solujatteet oli poistettu sentrifu-goimalla, supernatanttineste johdettiin kromatografia-kolonnin lapi, joka sisSlsi anti-HTCAthan liitettya Sepharose 4B:ta. Perusteellisen pesun jSlkeen jaljelle jaa-nyt sitoutuva materiaali eluoitiin pylvååsta 0,1 M gly-35 siinillS (pH 2,0). Eluoitunut materiaali konsentroitiin 57 90255 dialysoimalla kuivaa polyetyleeniglykolia vastaan. Kon-sentroidulle materiaalille tehtiin sitten geelikromato-grafia kalibroidulla Sephacryl S-200-kolonnilla (Pharmacia, Fine Chemicals, Uppsala, Ruotsi). Geelikromatografia-5 fraktioista otetuista naytteistH tutkittiin ACTH-resepto-riaktiivisuus radioreseptorimenetelmalla. Lyhyesti ilmais-tuna tasså menettelyssa inkuboitiin edella mainittuja nayt-teita 18 tuntia 96-syvennyksisissa polyvinyylilevyissa, minka jalkeen sitoutumattomat aineet poistettiin huuhto- 10 malla. Sitten syvennyksiin lisattiin radiojodattua ACTH: 125 ta ( I-ACTH, 70^uCi/^,ug, New England Nuclear, Boston, MA) leimaamattoman ACTH-ylimaarMn lasnå tai poissa ol- lessa (10 ,ug/syvennys). Sitten levyt pestiin perusteelli- / 125 sesti, irrotettiin syvennykset levysta, ja mitattiin I- 15 ACTH Beckman 55Q0-gaimnalaskurilla. Kromatografiafraktiois- ta mitattiin myds absorbanssi aallonpituudella 280 nm.

Taman esimerkin tulokset esitetåan kuvassa 6.

125

Spesifisesti sitoutunut -I-ACTH saatiin våhen-tåmalla leimaamattoman ACTH-ylimaåran lasnåollessa sitou-20 tunut radioaktiivisuus (yleenså alle 10 %) leimaamattoman ACTH:n poissa ollessa sitoutuneesta radioaktiivisuudesta. Molekyylipainostandardien 159 kilodaltonia (kd), 67 kd, 45 kd ja 14,4 kd eluoitumispisteet osoitetaan nuolin.

ACTH-reseptoriaktiivisuuden molekyylipaino oli noin 25 80-100 kd, joka oli samanlainen kuin ACTH-reseptorille aiemmin raportoitu arvo, joka oli identifioitu fotoaffini-teettileimausmenetelmalla (Ramachandran et al., Proc.

, Natl. Acad. Sci. 77 (1980) 3697-3970).

Tassa esimerkissa kuvattu menettely valaisee taman 30 keksinnon mukaista yleista menetelmaa minka tahansa pep- tidi- tai proteiiniligandin reseptorinkohdan komponenttien vaImistamiseksi. Ensin hankitaan polypeptidi, joka on komp-lementaarinen ainakin osalle peptidia tai proteiinia. Sitten valmistetaan mainitulle komplementaariselle polypep-35 tidille vasta-aine. Tama vasta-aine kiinnitetaan sitten 58 90255 kemiallisin tai absorptiokeinoin kiinteåan matriisiin. Reseptoria sisåltavå nayte kasitellåån si tten ir.atriisiin kiinnitetylla vasta-aineella, jolloin reseptorikohdan korr.ponentit sitoutuvat spesif isesti. Lopuksi eluoidaan 5 sitoutuneet komponentit.

Es imerkki II

Ganimaendorfiini ja sille komplementaarisen poly-peptidin suunnittelu ja valmistus TSman keksinnon yleisen kåyttokelpoisuuden ja mer-10 kityksen valaisemiseksi edelleen tutkittiin toista paria toistensa suhteen aktiivisia komplementaarisia peptideja. Nakanashi et al. (Nature 278 (1979) 423-427) ovat esittii-neet naudan gammaendorfiinin esiasteen aminohapposekvens-sin asemien 104 ja 120 vSlisen jakson ja sita koodaavan 15 mRNA-sekvenssin. Taulukossa 13 esitetaån tama gammaendor-fiinin aminohapposekvenssi (merkintSna endo) ja vastaava niRNA-sekvenssi. Komplementaarinen RNA-saie (cRNA) , joka emas-pariutuu antiparalleellisessa suunnassa gaxnma-endoa vastaavan mRNA:n kanssa, on mRNA:n alapuolella; cRNA esi-20 tetaan taulukossa 5 paralleelisena mRNA:n kanssa. Polypep-tidi (gamma-odne), jonka sekvenssi maaråtaan lukemalla cRNA suunnassa 5'-3', on cRNA:n alapuolella (merkintåna ganuna-odne) .

Taulukko 13 or -endo: HjN-tyr-gly-gly-phe-met-thr-ser-glu

m-RNA: 5'-UAC-GGC-GGG-UUC-AUG-ACC-UCC-GAG

cRNA: 5'-CAG-CGU-GAC-AAG-GGG-CGU-UUG-GCU •odne: HjN-gln-arg-asp-lys-gly-arg-leu-ala

lys-ser-gln-thr-pro-leu-val-thr-leu-COOH AAG-AGC-CAA-ACG-CCC-CUU-GUC-ACG-CUG3' CUU-CUC-GGA-GGU-CAU-GAA-CCC-GCC-GUA31 leu-leu-gly-gly-his-glu-pro-ala-val-COOH

35 Peptidin, jolla on ganuna-odnen aminohapposekvenssi , 59 90255 syntetisoi tåmån keksinnon tekijoille Peninsula Laboratories (San Carlos, CA).

Esimerkki 1J

. Gamma-( Ϋ')-oden, gammaendoforfiinille ( \v-endolle) 5 komplementaarisen polypeptidin ominaisuudet

Synteettinen naudan gammaendorfiini saatiin Boehringer Mannheimilta (Indianapolis, IN) ja kaniinin vasta-aine synteettiselle gamma-endolle Accurate Biochemical-silta (Westbury, NY).

10 96-syvennyksisen pyoreapohjaisen mikrotitrauslevyn syvennykset paallystettiin (kayttamalla esimerkissa IB kuvattua menettelya) gamma-odnella (40^ug/syvennys), insu-liinilla (20 yksikkoa/syvennys) tai naudan seerumialbumii-nilla (BSA, 200^g/syvennys). Gammaendorfiinia inkuboitiin 15 vaihtelevina pitoisuuksina (jota nakyvat kuvan 7 abskis-salla) paållystetyissa syvennyksissa 1 tunti, rninka jal-keen levyt pestiin kolmesti PBS-Tween-puskurilla. Sitten levyt kasiteltiin kaniinin vasta-aineella gammaendorfiinille, pestiin ja kasiteltiin sitten kaniinin immunoglo-20 buliinin vastaisella vuohen vasta-aineella, joka oli kiin-nitetty alkaliseen fosfataasiin. Kun sitoutumaton vuohen vasta-aine oli pesty pois, sitoutunut alkalinen fosfataa-si-aktiivisuus mitattiin p-nitrofenyylifosfaatin avulla edella kuvatulla tavalla. Edella kuvattujen kasittelyjen 25 tulokset esitetåan kuvassa 7, jossa aallonpituudella 405 nm mitatun absorbanssin suuruus heijastaa gammaendorfiinin sitoutumisastetta gamma-odnella, insuliinilla tai BSA:11a > påallystettyihin syvennyksiin. Oli selvaa, etta gamma- endorfiini sitoutui merkittavasti kiinnitettyyn gamma-3Q odneen verrattuna sitoutumiseen kiinnitettyyn insuliiniin tai BSAriin. Kuvan 7 varjostettu alue edustaa gammaendor-fiinin sitoutumista liukoisen gamma-odne-ylimaaran lasna ollessa. Siten osoitetaan, etta toinen komplementaari-sista peptideista koostuva pari on vuorovaikutuksessa kes-35 kenaan affiniteettia ja ilmeistå yhdenmukaisuutta osoit-tavalla tavalla.

60 90255

Esimerkkl IK

Yleinen kayttdkelpoisuus komplementaaristen pep-tidien tuottamiseen

Esimerkkien 1A-1J tulokset valaisevat erityissovel-5 lutuksia yleisesta menetelmåsta proteiineille tai pepti-deille, joita koodaava nukleotidisekvenssi tunnetaan aina-kin osittain, komplementaaristen polypeptidien suunnitte-lemiseksi ja valmistamiseksi. Komplementaarinen nukleotidisekvenssi, joka luettuna suunnassa 5’-3' koodaa polybo peptidia, joka on komplementaarinen ainakin osalle ensim-maista proteiinia tai peptidia, voi olla esimerkiksi DNA. Mainittu DNA voidaan insertoida plasmidiin, jolloin muo-dostuu yhdistelma-DNA-siirtovektori. Yksisoluinen orga-nismi, soveltuvasti bakteeri, hiiva tai nisakassolu, voi-j_5 daan sitten transformoida yhdistelma-DNA-vektorilla, jolloin saadaan yksisoluinen transformanttiorganismi, joka syntetisoi biologisesti mainittua komplementaarista poly-peptidia. Tallaisiin insertointeihin ja transformointei-hin kåytettavat menetelmat ovat hyvin tunnettuja tahan 2q aiheeseen liittyvilla aloilla.

My6s menetelmat polypeptidien syntetisoimiseksi ke-miallisesti aminohapoista samoin kuin menetelmat polypeptidien saamiseksi esimerkiksi irrottamalla proteolyytti-sesti proteiineista, joilla on suurempi aminohapposek-25 venssi mutta jotka sisaltåvat halutun komplementaarisen amiinihapposekvenssin, ovat tunnettuja. Siten on kåytet-tavissa monia tapoja peptidi- tai proteiiniligandille komplementaaristen polypeptidien valmistamiseksi.

Esimerkki IL

30 Rasitusvasteen salpaaminen hiirissa adrenokorti- kotrooppiselle hormonille (ACTH:lle) komplementaarisella peptidi11a

Vasteena eriJaisille rasituksiJ]e eJaimet tuotta-vat adrenokortikotrooppista hormonia (ACTII:ta), joka vai-35 kuttaa lisamunuaissoluihin ja saa ne tuottamaan kohonneita 6i 90255 kortikosteronipitoisuuksia seerumiin. Jotta saataisiin - tutkituksi, kuinka tehokkaasti komplementaarinen peptidi, HTCA (katso esimerkki 1A), eståa in vivo ACTH-aktiivisuut- ta, tehtiin seuraavat koesarjat. Hiiriin (BALB/c) injek- 5 toitiin komplementaarista peptidiS HTCA, odotettiin jon-kin aikaa, aiheutettiin elåimille stressi, tapettiin ne, ja maåritettiin kortikosteronipitoisuus seerumissa tavan-omaisella immuunimåårityksellå.

Ensimmaisessa kokeessa injektoitiin BALB/c-hiiriin 1Q (8 ryhmaå, kussakin 3 hiirta) 1 mg HTCA:ta liuotettuna PBS:aan (fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuok-seen) . Kahteen ryhiriSan BALB/c-hiiria (3 hiirta ryhmåsså) injektoitiin pelkkåS PBS:aa. Kunkin hiiriryhman keski-maarainen kortikosteronitaso mdaritettiin erilaisten odo-3^5 tus- ja rasitusohjelmien jalkeen. Tulokset esitetaån tau-lukossa 14, jossa rasitus on upottaminen jååveteen 30 s:n ajaksi.

T aulukko 14 X )

Injektio Tapa Odotusaika (h) Stressi Kortikosteroni 20 i/ug/dl) PBS IM 0 ei 18 PBS IM 0 kylla 75 HTCA IM 0f5 " 90 HTCA IM 1,0 " 55 HTCA IM 2,0 " 40 HTCA IM 4.0 " 60 25 HTCA IP 0,5 " 95 HTCA IP 1,0 " 85 HTCA IP 2,0 " 75 HTCA IP 4,0 " 65 x) IH - lihaksensisåinen injektio IP - vatsaontelonsisainen injektio 50 Havaittu suurin vaikutus, noin 50-%:nen aleneminen seeru-min kortikosteronitasossa, esiintyi rasituksen tapahtues-sa 2 tuntia sen jalkeen, kun oli injektoitu 1 mg HTCA:ta. Toisessa kokeessa injektoitiin lihaksensisaisesti erilai-sia maåria HTCA:ta 3 BALB/c-hiiren ryhmiin. Hiirten annet-35 tiin odottaa 2 tuntia, ja aiheutettiin niille stressi upot- 62 90255 tamalla jååveteen. Taulukossa 15 esitetaån keskimåarai-set kortikosteronitasot seerumissa eri hiiriryhmille. Taulukko 15

Injektio Stressi Kortikosteroni (^ug/dl) PBS ei 8 PBS kyl]a 42 0/01 mg HTCA kylla 44 0,1 mg HTCA kylla 37 10 1,0 mg HTCA kyllå 30

Nama kokeet osoittavat yhdessa tarkasteltuina ACTHrlle komplementaarisen peptidin kyvyn alentaa korti-kosteronirasitusvastetta hiirissa.

Esimerkki 1M

^25 15 I-beetaendorfiinin sitoutumisen NG108-15-solui- hin estaminen gammaendorfiini]le komplementaariselJa peptidilla NG108-15-solujen tiedetaan sisaltåvan beetaendor- fiinireseptoreja, joita kutsutaan opiaattireseptoreiksi.

2q Beetaendorfiinin lisåksi gammaendorfiini ja muutamat bee- taendorfiinin analogit sitoutuvat naihin opiaattiresep- toreihin. GammaendorfiiniIle komplementaarisesta, esimer- kissa II kuvatusta peptidista, gamma-odesta tutkittiin 125 sen kyky estaå I-beetaendorfiinin sitoutuminen NG108- 25 15-soluilla oleviin opiaattireseptoreihin. Gammaendor- fiini on suuremman beetaendorfiinipeptidin fragmentti.

125

Erillisisså kokeissa maaritettiin I-beetaendor-fiinin spesifinen sitoutuminen NG108-15-soluihin, jotka oli siirrostettu mikrotitraussyvennyksiin, saattamalla 3Q aine kilpailemaan leimaamattoman beetaendorfiinin kanssa. Kokonaissitoutumisesta oli 70 % spesifista tavanomaisin perustein arvosteltuna.

125

Tatå koetta vårten I-beetaendorfiinia esi-inku-boitiin 30 min vaihtelevien maSrien kanssa komplementaa-35 rista peptidia, gamma-odnea, minkå jalkeen inkuboitiin 63 90255 30 min (37°C) NGlQ8-15-solujen kanssa mikrotitraussyven-» nyksisså. Inkuboinnin jålkeen solut pestiin kolmesti, ja mååritettiin soluihin liittynyt radioaktiivisuus Packard Multi-Prias-garranalaskurilla. Taulukko 16 osoittaa gamma-5 odnen kyvyn eståå ^^I-beetaendorfiinin (10 11 M, 2000 Ci/mxnol) sitoutuminen NG108-15-soluihin.

Taulukko 16 125

Gamma-odne-pitoisuus Spesifisen I-beeta-endorfii- nin inhibitio (%) 10 10"6 M 24,7 + 3,9 ΙΟ-5 M 36,0 + 2,1 10-4 M 75,0 + 0,6

Esimerkki IN

15 Katatonian indusoiminen hiirisså gammaendofiinille komplementaarisen peptidin vasta-aineilla

On tunnettua, ettå suuret annokset opiaattien kal-taisia aineita voivat indusoida elåimisså katatonisen tilan, joka estetaan tai poistetaan kasittelemalla opi-2Q aattiantagonistilla, naloksonilla. Analogisesti aiemmissa esimerkeissa, saatujen tulosten kanssa tutkittiin opiaatti-peptidille, gammaendorfiinille, komplementaarisen peptidin (gamma-odnen) kyky indusoida vasta-aineita, joilla on opiaattien ominaisuuksia.

25 Gamma-odne (esimerkki II) konjugoitiin tulivuoriko- tilon hemosyaaniiniin (KLN) ja kåytettiin yhdessa Freun-din apuaineen kanssa vasta-aineiden muodostamiseen kanii-nissa tavanomaisella tavalla (katso esimerkki 1F). Seka normaalin etta indusoidun kaniinin seerumeja injektoi-30 tiin aivokammionsisåisesti (i c) ICR-naarashiiriin. In-jektoitaessa 50^ul normaalia kaniinin seerumia (laimen-nettu suhteessa 1:100) ei tuloksena ollut opiaattikatato-nian kaltaisen tilan indusoitumista. Injektoitaessa 50^ul komplementaarisella peptidilla (gamma-odne11a) indusoidun 35 kaniinin seerumia (laimennussuhde 1:100) oli tuloksena 64 90255 erinomainen katatonian indusoituminen, joka estyi injek-toitaessa samanaikaisesti i c 0,2 mg opiaattiantagonisti naloksonia.

Esimerkki 1 O

5 Antigeenisuussuhde kahden adrenokortikotrooppiselle hormonille (ACTH:lle) komplementaarisen peptidin valilla

Kaksi ACTH:lle komplementaarista peptidia, joita on kuvattu esimerkeisså IB ja 1C HTCA:na ja 3'-51-HTCA:na, liitettiin kumpikin tulivuorikotilon hemosyaniiniin (KLH) ig glutaraldehydin avulla (1 mg peptidiå, 1 mg KLH:ta, 30 mM glutaraldehydi 30 min huoneen lampdtilassa, minkå jalkeen dialyysi) antigeenien valmistamiseksi kaniinien immunisoin-tiin. Kahteen kaniiniin injektoitiin erikseen 250^ug pep-tidi-KLH-antigeeneja viikottain neljan viikon ajan. Kus-15 takin kaniinista otettiin verinåyte kaksi kertaa viikossa kolmen viikon ajan viimeisesta injektiosta lukien. Vasta-aineet, jotka edustavat kunkin kaniinin seerumin kokonais-immunoglobuliinia, puhdistettiin saostamalla ne seerumis-ta ammoniumsulfaattiliuoksella (50 % kyllaisesta) 4°C:sta, 2Q minka jalkeen tehtiin tavanomainen ioninvaihtokromatogra- fia DEAE-kolonnissa.

Jotta saataisiin tutkituksi kunkin immunoglobuliinin sitoutuminen kuhunkin peptidiin, tehtiin ELISA-maarityk-set. Naissa maarityksissa yhtå komplementaarisista pepti-25 deista levitettiin pSallysteeksi polykarbonaattilevyille karbonaattipaallystyspuskurista (pH 9,0) antamalla reagoi-da yon yli. Sitoutumaton peptidi poistettiin pesemållå levyt kolmesti fosfaattipuskuroidun fysiologisen suola-liuoksen (PBS) ja Tween 20:n seoksella. Peptidilla paallys-30 tettyihin syvennyksiin lisattiin eri maaria immunoglobu-liineja sekoitettuina PBS-Tween 20-liuokseen, ja inkuboi-tiin 1 tunti. Sitoutumaton immunoglobuliini poistettiin pesemalla PBS-Tween 20:11a. Kuhunkin syvennykseen lisattiin alkalinen fosfataasi-entsyymiin liitettya vuohen anti-35 kaniini-IgG:ta laimennettuna suhteessa 1:300. Tunnin kulut- 65 9 0 2 5 5 tua syvennykset pestiin PBS-Tween 20:llå sitoutumattomien sekundaaristen vasta-aineiden poistamiseksi. Jaljella ole-van sekundaarisen vasta-aineen måarå mååritettiin antamalla p-nitrofenyylifosfaatin reagoida jåljella olevan alkali-5 nen fosfataasi-entsyymin kanssa 15 min:n ajan, pysåytta-malla reaktio 3 M NaOH:lla ja mittaamalla syntynyt nitro-fenoli spektrofotometrisesti aallonpituudella 490 nm.

Taulukossa 17 annetaan kokeen tulokset. Taulukos-sa ei esitetå kolmea vertailunåytettå (ACTH-levyt + immu-1Q nlsoidun kaniinin immunoglobuliini, HTCA-levyt + normaa-lin kaniinin iittmunoglobuliini ja 3'-5 '-HTCA-levyt + nor-maalin kaniinin immunoglobuliini), joiden kaikkien absor-banssi oli alle 0,01 måårityksessa.

Taulukko 17 15 Lisatty vasta-aine Immunogeeni Absorbanssi aallonpi-(mg/ml) tuudella 490 nm HTCA:lla paallystetyt levyt 0,012 3'-5'-HTCA 0,08 + 0,04 0,04 3 '-5'-HTCA 0,24 + 0,08 0,11 3'-5'-HTCA 0,37+0,09 0,3 3’-5'-HTCA 0,91+0,11 0,11 HTCA 0,98 + 0,18 31-51-HTCA:11a paallystetyt levyt 25 0,012 HTCA 0,05 + 0,01 0,04 HTCA 0,12 + 0,06 0,11 HTCA 0,44 + 0,06 0,3 HTCA 1,39 + 0,21 3Q 0,11 3 '-S' - HTCA 0,89 + 0;23

Nama tulokset osoittavat, etta toisen komplemen-taarisen peptidin vasta-aineet tunnistavat toisen komple-mentaarisen peptidin ja sitoutuvat siihen. Nama kaksi 35 komplementaarista peptidia ovat siten antigeenisesti suku- 66 90255 laisaineita, vaikka niiden sekvensseissa on vain yksi ase-ma, jossa sama aminohappo esiintyy samassa absoluutti-sessa asemassa.

Esimerkki IP

5 Idiotyyppi: Anti-idiotyyppisyyssuhde adernokorti-

kotrooppisen hormonin (ATCHrn) vasta-aineiden ja ACTH-lle komplementaarisen peptidin vasta-aineiden valillS

Kayttamalla ACTH:lle tarkoitettua tavanomaista RIArta (radioimmuunimååritysta) (Immuno Nuclear Corpo-10 ration, luettelo nro 2400) maaritettiin ACTH:lle komplementaarisen peptidin (HTCA) vasta-aineiden kyky sitoutua ACTH:n vasta-aineisiin. Tavanomaisessa ACTH:lle tarkoite-tussa RIArssa leimattua ACTHrta lisataan tunnettuihin maa-riin radionuklidileimatun ACTH:n ja ACTH:n vasta-aineen 15 liuosta radionuklidileimatun ACTH:n sitoutumisen vasta-aineeseensa estamiseksi kompetitiivisesti. Sitoutuneen radioaktiivisen merkkiaineen maara maaritetaan immuuni-saostamalla vasta-aine ja mittaamalla sakassa oleva radio-aktiivisuus laskennalla.

20 Kokeessa kåytettiin leimaamatonta ACTI!:ta, komple- mentaarisella peptidillM HTCA immunisoitujen kaniinien immunoglobuliinia ja normaalikaniinien immunoglobuliineja kompetitiivisesti radionuklidileimatun ACTH:n kanssa RIA: ssa. Immunoglobuliiniliuokset (35 mg/ml) valmistettiin fos-

25 faattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen, ja ACTH

125 ja I—ACTH preparatoitiin RIA-pakkauksessa olevien oh- jeiden mukaan. Taulukossa 18 annetaan kompetitiokokeen tulokset.

6? 90255

Taulukko 3.8

Lisåtty kilpailija Spesifisen sitoutumisen prosent- tiosuus

Ei mitåan jqø 5 on

20 pg/ml ACTH

50 pq/ml ACTH 100 pg/ml ACTH

200 pg/ml ACTH , 500 pq/ml ACTH:

IgG-HTCA (1:10 laimennettuna iqG-HTCA (1:30 t, 10 IgG-HTCA (1:100 -

IqG-HTCA (1:300 » inn'6

IgG-HTCA ( 1: 1000, '

Normaali (1:100 " 94?4

Normaali (1:1000 " T

15 Nåmå tulokset osoittavat, etta ACTH:Ile komple- mentaarisen peptidin vasta-aineet tunnistavat ACTH:n vas-ta-aineet ja sitoutuvat niihin, ja osoittavat siten nåi-den vasta-aineiden idiotyyppi: anti-idiotyyppi-suhteen.

Esimerkki 1Q

2Q Elåimiå rokottamalla muodostettujen adrenokortiko- trooppiselle hormonille komplementaarisen peptidin vasta-aineiden aktiivisuus in vivo (ACTH) ACTH:Ile komplementaarinen peptidi (katso HTCA, esimerkki 1A) konjugoitiin tulivuorikotilon hemosyanii-25 niin (KLH) kåyttåmållå esimerkin 10 mukaista menettelyå. Immunisoitiin kullakin ajanhetkella kolme BALB/c-hiirtå (100^,ug kon jugaattia/Q, 2 ml taydellista Freundin apuai-netta paivana 0 vatsaontelonsisaisesti ja ihonalaisesti injektoituna, 100yUg konjugaattia/0,2 ml epataydellista 3Q Freundin apuainetta viikkoina 1, 2, 3 ja 4 vatsaontelonsisaisesti ja ihonalaisesti injektoituna). Immunisoitiin myos nel ja kaniinia (300^.ug konjugaattia/1,0 ml taydellista Freundin apuainetta injektoituna paivana 0, 200^,ug konjugaattia/1,0 ml epataydellista Freundin apuainetta 35 injektoituna påivinå 10, 20, 30, 40 ja 60).

68 90255

Hiirikokeen kullakin ajanhetkella tapettiin kolme hiirtå, keråttiin niiden veri ja annettiin sen hyytya, ja mååritettiin vasta-ainepitoisuudet seuraavalla kiinteå- faasiradioimmuunimåårityksellå (RIA). Polyvinyylimikrotit- 5 rauslevyn syvennykset påållystettiin HTCA:lla liuoksesta kåsin (0,25 mg/ml). Syvennykset pestiin Tween 20 sisåltå- valla fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuok- sella (PBS), ja lisattiin seerumia laimennettuna sarjassa 125 suhteessa 1:5. Tunnin kuluttua lisåttiin kaniinin I-10 leimattua anti-hiiri-immunoglobuliinia, ja syvennykset pestiin PBS-Tween 20:11a sitoutumattoman merkkiaineen poistamiseksi. Syvennykset irrotettiin ja niille tehtiin laskenta tiitterien måårittåmiseksi. Hiirikokeessa tiit-teri mååritetåån siksi seerumin laimennokseksi, joka an-15 taa tulokseksi 100 pulssia/min taustan yli. Seerumista analysoitiin kullakin ajanhetkella myos kortikosteroni-pitoisuus kaupallisella RIA:11a.

Kaniinikokeessa otettiin kullakin ajanhetkella 2 ml:n verinayte, annettiin sen hyytya ja sailytettiin 2Q pakastettuna analysointiin asti. Vasta-ainemåarat måaritettiin ELISA:11a seuraavasti. Polykarbonaattilevyn syvennykset påållystettiin HTCA:lla kåsittelemållå niitå yon yli liuoksella, joka sisålsi 0,25 mg/ml HTCA:ta. Sitten syvennykset pestiin, ja lisattiin seerumi laimennettuna 25 sarjassa suhteessa 1:5. Tunnin kuluttua lisattiin alkali-seen fosfataasiin konjugoitu vuohen anti-kaniini-immuno-globuliini (laimennettu suhteessa 1:300). Syvennykset pestiin tunnin kuluttua PBS-Tween 20:llå. Lisattiin p-nitro-fenolisubstraatti, ja annettiin reagoida 15 min ennen 30 reaktion pysåyttåmista 3 M NaOH:lla. Tiitterit mååritet- tiin spektrofotometrisesti mittaamalla adsorbanssi aallon-pituudella 490 nm. Kaniinikokeessa tiitteri mååritellåan siksi seerumin laimennokseksi, joka antaa absorbanssin 0,05 (tausta = 0,01). Seerumista analysoitiin kullakin 35 ajanhetkella myos kortikosteronipitoisuus kaupallisella RIA:11a.

69 90255

Taulukoissa 19 ja 2Q esitetMan nåiden kokeiden tu-lokset HTCA-vasta-ainetiittereinå ja seerumin kortiko-steronipitoisuuksina, jotka ilmoitetaan prosentteina ver-tailunåytteiden vastaavista arvoista (elåimet immunisoi-5 tiin pelkalla KLH:lla, ja otettiin verinaytteet saman oh-jelman mukaisesti kuin HTCA:ta saaneista elaimista). Taulukko 19

Paiva HTCA-tiitteri Kortikosteroni (% vertailu- nåytteestå) 10 0 316 100 7 125 158 14 3125 92 21 25300 78 28 15600 135 15 42 21600 111

Taulukko 20 Kaniinikoe Påivå HTCA-tiitteri Kortikosteroni (% vertailu- 20 naytteesta) 0 1,4 86 10 3,8 86 20 470 151 25 30 15000 320 40 104000 103 60 260000 35

Hiirikokeessa vertailunåytteiden kortikosteroni-30 pitoisuudet olivat lahellå normaalia viimeista ajanhet-kea lukuun ottamatta, jolloin taso oli noin kolminker-tainen normaaliin nahden. Vertailukaniinien kortikostero-nitasot olivat normaalia pienempia ja alenivat paivien 0 ja 30 valilla ja palautuivat normaalitasolle paivaån 35 60 mennessa.

70 9 0 2 5 5

Kununassakin kokeessa saatiin aikaan hormonin kal-taisen (ACTH) vasteen heraaminen, jota seurasi vasteen yleinen aleneminen. NMmå kokeet osoittavat komplementaari-sen peptidiantigeenin kyvyn saadella hormonivastetta in 5 vivo stimuloimalla reseptoria sitovan vasta-aineen tuo-tantoa. Antigeenin esiintymismuotoa ei yritetty muuttaa joko agonististen tai antagonististen vasta-aineiden tuot-tamiseksi, rnika voisi olla haluttua joissakin tilanteis-sa.

10 Esimerkki 1R

Komplementaarisen peptidin sitoutumiseen perustuva mahdollinen diagnostinen adrenokortikotrooppisen hormonin (ACTH) maaritys

Tutkittiin mahdollisuuksia kåyttaå ACTH:lie komp-25 lementaarista peptidiå, tarkemmin ilmaistuns esimerkin 1A mukaista HTCA:ta, seerumin ACTH-pitoisuuksien maarit-tamiseen kayttaroållå kiinteafaasiradiositoutumiskoetta.

Komplementaarista peptidiå (HTCA) liuotettiin fosfaattipuskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen pitoi-2q suudeksi 1 mg/ml, ja 200^ul:n nåytteet 96-syvennyksisen polyyinyylisen tutkimuslevyn (Microtest III, Falcon, luet-telo nro 3911) syvennyksiin. Syvennysten annettiin paal-lystyS y8n yli HTCA:11a lampotilassa 4°C. Paallystysliuos poistettiin, ja syvennykset pestiin kolmesti PBS :11a. Ra- 125 25 dionuklidileimattu ACTH ( I-ACTH, New England Nuclear NEX-65) laimennettiin 0,0005 % Tween 20 sisåltavalla PBS: 11a siten, etta 20^,ul liuosta sisålsi 50 pg (eli noin 30 000 pulssia/min) ACTH:ta.

Seeruminaytteet preparoitiin 96-syvennyksisessa 3Q kudosviljelylevysså valmistamalla seerumin laimennussarja PBS-Tween 20:een lopputilavuuden ollessa 180^ul/syvennys.

Sitten seeruminaytteet siirrettiin HTCA:11a paållystetyΙ- Ιο tutkimuslevylle ja annettiin inkuboitua. Lopuksi li-] 25 sattiin 20^,ul I-ACTH-liuosta, inkuboitiin, ja poistet-35 tiin koko 2Q0^ul:n nayte. Syvennykset pestiin kolmesti 7i 90255 PBS:llå, leikattiin ijrti levystå ja tehtiin laskenta gam- malaskurissa. Epaspesifinen sitoutuminen maaritettiin lisååmalla 5^ug leimaamatonta ACTHita joihinkin nåyttei- siin ennen niiden siirtåmistM tutkimuslevyIle.

5 Tassa kokeessa kdytetyt seeruminåytteet sisålsivåt joko 50 pg/ml tai 500 pg/ml ACTH:ta naudan sikioseerumissa (FCS). Taulukossa 21 olevat tulokset osoittavat kumma]le- 125 kin nåytteelle spesifisen I-ACTH-sitoutumisen prosentu-aalisen eston seerumin laimennussuhteen funktiona.

1Q Taulukko 21

Laimennussuhteen Spesifisen sitoutu- Spesifisen sitoutu- 10, miéen prosentuaali- misen prosentuaali- " nen inhibitio nen inhibitio 50 pg/ml 500 pg/ml 15 0 9i 85 -0,5 73 90 -1;0 40 77 -1,5 44 57 -2,0 9 53 -2,5 1 35 -3.0 0 32 20 -3’5 0 20

Spesifiseksi kokonaissitoutumiseksi maaritettiin 25 tåssa kokeessa 1000 pulssia/min, ja ominaisaktiivisuuden perusteella 5Q-%:nen spesifinen sitoutuminen vastaa 0,85 pg:aa ACTHrta seerumilaimennoksessa.

Kun maarå oli 50 pg/ml seeruminaytetta esiintyi 50 %:nen inhibitio kaupallise11a RIA-menetelmalla maari-3Q tettynå laimennussuhteen '*'^log-arvolla -1,1 (maåritetty graafisella interpolaatiolla). Pitoisuus seeruminayttees-sa on taman maSrityksen mukaan siten 54 pg/ml, joka on hyvin sopusoinnussa standardimenetelmien kanssa.

Graafisen interpolaation mukaan seeruminaytteen, 35 jossa pitoisuus oli 500 pg/ml, 50 %:nen inhibitio tapah-tui laimennussuhteen ulog-arvolla -2,0, kuten oli odo-tettua.

72 90255 Nåmå tulokset osoittavat komplementaarisen pepti-din sitoutumiseen perustuvien diagnostisten maåritysten kehittåmisen mahdollisuuden.

Esimerkki IS

125 5 I-adrenokortikotrooppisen hormonin sitoutumi- sen komplementaarisiin 5'-3' ja 3'-5'-peptideihin vertaa-minen Kåytettiin kiinteåfaasisitoutumiskoetta mååritet-taessa peptidien, joita vastaa RNA-såie on suunnassa 10 5'— 3' ja 3'—5' (katso esimerkit 1A ja 1C), kyky sitoa 125 I-ACTH:ta. Peptidit laimennettiin fosfaattipuskuroi-dulla fysiologisella suolaliuoksella (140 irunol/1 NaCl:a, 3 nuriol/1 KCl:a, 0,1 % NaN^iå, 20 mM fosfaattipuskuri, pH 7,4) pitoisuuteen 2 mg/ml, ja leitettiin 0,2 ml nåyte- 15 liuosta/syvennys polyvinyylikloridisiin mikrotitrauslevyi-hin (Becton and Dickinson, Oxnard, CA, USA). Kun levyjå oli pidetty 18 tuntia låmpotilassa 4°C, sitoutumaton pep-tidi poistettiin pesemalla kolmesti fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisålsi 0,1 % naudan 20 seerumialbumiinia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). 125 I-ACTH laimennettiin eri pitoisuuksiin fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisalsi 0,1 % naudan seerumialbumiinia, ja inkuboitiin sitå peptidillå påållystetyisså syvennyksisså 60 min lampotilassa 4°C.

25 Joihinkin syvennyksiin lisåttiin liukoisia peptidejå vaih- 125 televina pitoisuuksina I-ACTH:n lisåksi sitoutumisen spesifisyyden osoittamiseksi. Sitoutumaton merkkiaine pes-tiin inkuboinnin jålkeen pois fosfaattipuskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella, joka sisålsi 0,1 % naudan 30 seerumialbumiinia, ja kunkin syvennyksen radioaktiivisuus mitattiin gammalaskennalla. Spesifisesti sitoutunut radioaktiivisuus mååritettiin leimaamattoman ACTH:n aikaansaa-125 man · I-ACTH:n sitoutumisen estymisen kautta. Lisavertai- lunåytteiksi påå]lystettiin syvennyksiå insuliinilla tai 125 35 naudan seerumialbumiinilla (2 mg/ml) ennen I-ATGH:n lisååmistå.

73 90255 125 Nåissa kokeissa tapahtui puolet I-ACTH:n

maksimisitoutumisesta ACTH-pitoisuuden ollessa 0,1 mM

kummankin komplementaarisen peptidin ollessa kyseessa.

Havaittiin, ettcl yli 84 % sitoutumisesta oli spesifista, 5 ja insuliinilevyihin ja naudan seerumialbumiini-levyihin sitoutuminen oli alle 5 % sitoutumisesta komplementaari- nen peptidi-levyihin. Kumpikin komplementaarinen peptidi 125 kilpaili liuoksessa ollessaan samassa mSarin I-ACTH:n sitoutumisen eståmiseksi vastaavaan sorboituneeseen vas-10 tapuoleen.

Nama tulokset osoittavat, etta ACTH-systeemin ollessa kyseessa kompleroentaariset 5'-3' ja 3'-51-peptidit ovat yhta tehokkaita ACTH:n sitomisessa.

Esimerkki 2A

15 Peptidihormonireseptoriproteiineja koodaaville nuk- leiinihapoille komplementaaristen, kaanteisessa suunnassa luettujen nukleiinihappojen koodaamien polypeptidien ja peptidihormonien valiset homologiat

Komplementaaristen nukleiinihapposåikeiden koodaa-20 mien peptidien valilla vallitsee vaikeasti havaittava, mutta merkitseva funktionaalinen ja rakenteellinen riip-puvuussuhde. Tata suhdetta heijasti komplementaarisen nukleiinihapon lukeminen normaalissa kopiointisuunnassa 5'-3' (katso esimerkiksi taulukko 1, kuva 1 ja esimerkit 25 1A-1H). Kun komplementaariset nukleiinihapot luetaan pain- vastaiseen suuntaan eli 3'-5', kåy samalla tavoin ilmi ainutlaatuisia suhteita tuloksena olevien koodattujen ami-nohapposekvenssien valilla, kuten seuraavissa esimerkeissa osoitetaan.

30 Esimerkki 2B

Epidermaalinen kasvutekija (EGF), EGF-reseptori ja EGF-reseptorilie komplementaarinen viesti

Grayn et al. (Nature 303 (Lontoo 1983) 722) ja Scottin et al. (Science 221 (1983) 236) mukaiset EGF:n 35 aminohapposekvenssi ja sitå koodaava nukleotidisekvenssi 74 90255 (mRNA) esitetaan kuvassa 8. Kuvassa 8 esitetaan myos Ulrichin et al. (Nature 309 (Lontoo 1984) 418) mukaiset EGF-reseptorin osittainen aminohapposekvenssi ja sita koodaava nukleotidiosasekvenssi (cDNA).

5 Kuvan 8 viimeisesså sarakkeessa esitetaan EGF- reseptoria koodaavalle RNA-sekvenssille komplementaarinen nukleotidisekvenssi (RNA). Lahtokohtana kaytettiin EGF-reseptorin nukleotidisekvenssin ja siile komplementaarisen nukleotidisekvenssin oloa rinnakkain antiparalleellises-ti emåspariutuneina. Komplementaarinen nukleotidisekvenssi luettiin samassa lukukehyksesså koodaavan sekvenssin kanssa, mutta suunnassa 3'-5'. Siten saatiin komplementaarisen nukleotidisekvenssin ylåpuolelle merkitty koo-dattu aminohapposekvenssi. Kodoni XXX on terminaation sym-P5 boli. Kun kuvassa 8 esitettyjen aminohapposekvenssien ami-noterminaalinen suunta on pienemman numeron suunnassa, kay ilmi kaksi EGF-reseptorille komplementaarisen polypeptidin ja EGF:n homologia-aluetta (laatikoilla ymparoidyt alueet). Koko EGF-reseptorille komplementaarinen sekvenssi (ei ku-2Q vassa) analysoitiin, ja saatiin vain nåmå kaksi komple- mentaarista aminohappoaluetta. EGF:n aminohapposekvenssien 11-16 ja 24-29 havaittiin olevan homologisia aminohappo-sekvensseille 111-116 ja 149-154, joita vastaavasti koo-daa EGF-reseptorin nukleotidisekvenssille komplementaa-25 rinen sekvenssi.

Kuten kuvasta 8 kay ilmi, naiden kahden, kuudesta aminohaposta koostuvan EGF:ssa esiintyvån homologisen alu-een ollessa kyseessa, on kummassakin sekvenssisså viisi aminohappoa identtisia (83 %:nen homologia). Lisåksi nuk-3Q leotidisekvenssien ollessa kyseessa naiden kahden alueen vålillå vallitsee 67 %:nen ja vastaavasti 78 %:nen nukleo-tidihomologia, jolloin useimmat nukleotidien valiset erot eivåt vaikuta koodattuihin aminohappoihin (esimerkiksi kolmannen emåksen muutokset). Nåihin kahteen homologiseen 35 aminohappoalueeseen sisåltyy noin 23 % koko EGF-aminohap- 75 90255 posekvenssistå (12 ryhmaå 53:sta), ja tama homologia on niin silmiinpistavåa, etta on hyvin epåtodennåkoista, etta se edustaisi sattumanvaraista tapahtumaa. Sita, etta tama aminohappohomologia ei ole sattumanvaraista, tukee 5 voimakkaasti se havainto, etta kun sekvensseja ASP-GLY-TYR-X-LEU-ASN ja GLU-SER-LEU-X-SER-TYR (joissa X on mika tahansa aminohappo) tutkittiin the National Biomedical Research Foundationin (NBRF) proteiinisekvenssipankista saatuja 3060 proteiinia vastaan, vain EGF sisalsi nama j_0 sekvenssit. Tutkittu the National Biomedical Research Foundationin proteiinisekvenssitietokanta oli SIAO: (Blomquist) NEW. Pro:80 file. Kaikkiaan tutkittiin 3060 proteiinia, joihin sisåltyi 616 748 kuuden aminohapon pituista testi-segmenttia tai 619 803 viiden aminohapon pituista testi-segmenttiå. Jotta homologisten sekvenssien etsimista ei tehtåisi yksipuoliseksi asemissa, joissa ligandin ja re-septorin komplementin sekvenssit eroavat toisistaan, hy-våksyttiin yhteensopivaksi mika tahansa aminohapposekvens-si (X). Siten homologisten sekvenssien etsiminen ei ra-20 joittunut nimenomaan kuvassa 2 esitettyihin ligadi- tai reseptorikomplementtisekvensseihin, vaan salli minka tahansa aiminohapon sijoittamisen eroavisuuskohtiin. Tut-kityista 616 748 kuuden aminohapon pituisesta sekvens-sista, joista tutkittiin homologia, vain EGF sisalsi jonkin 25 naista sekvensseistS. Siten nåiden nimenomaisten aminohappo-selvenssien valinen riippuvuus heijastaa EGF:n ja sen resep-torin valistå merkityksellistå sukulaisuutta.

Esimerkki 2C

Peptidihormonien ja peptidihormonireseptoreja koo-30 daaville nukleotidisekvensseille komplementaaristen nuk- leotidisekvenssien koodaamien polypeptidien valisten aminohappo- ja nukleotidihomologioiden tilastollinen merkitse-vyys

Kahden nukleotidisekvenssin valisen homologian ti-35 lastollinen merkitsevyys maaritettiin laskemalla P -arvot, 3 76 90255 jotka ovat todennåkoisyyksiå sille, ettå tietty homologia esiintyy vahingossa. Kaytetty yhtålo oli Poisson-jakautu-man summamuoto.

ς N Λ-Νρ (Np)1 o --, e - i j^q jossa N on nukleotidien pituus homologisessa sekvenssisså, i on yhteensopivuuksien lukumåårå sekvenssisså ja p tietyn nukleotidin yhteensopivuuden todennåkoisyys. Ide-aalisen sattumanvaraisuuden ollessa kyseesså p = 0,25, ellei millåån nukleotidilla ole minkåånlaista etusijaa -^5 missåån asemassa. Sen måårittåmiseksi, oliko olemassa mitåån merkitsevåå poikkeamista sattumanvaraisuudesta, xnååritettiin kaikille kolmelle reseptorille empiirisesti p-arvot. Todellisuudessa p-arvot olivat aina alueella 0,25-0,27, ja siksi Pa-arvoja laskettaessa oletettiin yk-2Q sinkertaisuuden vuoksi, ettå p = 0,25. Kun N = 18 ja N = 15 sekvensseisså, joissa vallitsee ideaalinen sattuman-varaisuus, nukleotidiyhteensopivuuksien lukumaårå (i) on 4,5 ja vastaavasti 3,75. Poikkeaman sattumanvaraisuudesta måårittåmiseksi reseptorisekvensseisså, joissa N = 18 ja 25 N = 15, mååritettiin i-arvot empiirisesti kullekin reseptorille ja havaittiin niiden olevan 4,75 (1,41) ja vastaavasti 3,88 (1,45). Jotta i-arvoja pidettåisiin tilas-tollisesti merkitsevinå, niiden tuli olla suurempia kuin kaksi kertaa standardipoikkeama keskiarvosta (ts i 7,57, ™ kun N = 18 ja 1 6,78, kun N = 15). Siten Pa-arvoja 4,63 x -2 -2 10 , kun N = 18, ja 4,87 x 10 , kun N = 15, pidettiin tilastollisesti merkitsevinå. Pa-arvojen, jotka olivat -2 korkeintaan 4,63 x 10 18 nukleotidin tapauksessa ja _2 4,87 x 10 15 nukleotidin tapauksessa mååritettiin em-

35 piirisesti olevan tilastollisesti merkitseviå. Kuva 9A

77 90255 osoittaa, ettå EGF:n ja kahden EGF reseptorin kompleir.en- tin valisten nukleotidisekvenssihomologioiden lasketut -3 . -4

Pa-arvot ovat 1,60 x 10 ja 1,78 x 10 . Siten naiden sekvenssien valiset homologiat ovat hyvin merkitsevia, 5 ja emasyhteensopivuuksien lukumaåra on suurempi kuin viisi standardipoikkeamaa ideaaliselle sattumanvaraisuudelle lasketuista keskiarvoista.

Lisaanalyyseisså, jotka tehtiin yleisesti esimer-kin 2B mukaista menettelya noudattaen, tutkittiin muiden 10 peptidihormonien ja niiden reseptorien ja reseptoreille komplementaaristen polypeptidien valisia riippuvuuksia.

Kuvassa 9B esitetyt aminohappo- ja nukleotidisek-venssit saatiin seuraavista lahteista:

Interleukin -2 (IL-2) from Taniquchi et al (Nature 15 (Landon, 1984) Vol. 302, p, 305) and Devos et al (Nucl. Acid Res. (1983) Vol. VII, p. 4307).

Interleukin -2 Receptor (IL-2 Receptor) from Nikaido et al (Nature (London, 1984) Vol. 311, p. 631).

Transferrin (TF) from Yanq et al (Proc. Nat'l. Acad.

Sci. (1984) Vol. 81, p. 2752.

20

Transferrin Receptor.(TF Receptor )t from Schneider et al (Nature (London, 1984) Vol. 311, p. 675).

Kuten kuvissa 9A ja 9B esitetaån, saatiin saman-laisia tuloksia kuten EGF-systeemin yhteydessa havaitut, 25 kun IL-2:sta ja TFrsta tutkittiin homologia vastaavien reseptorikomplementtiensa kanssa. IL-2:n ollessa kysees-sa havaittiin kaksi 6 ja 5 aminohapon pituista homologia-aluetta (kuva 9A), joissa aminohappohomologia oli 83 ja vastaavasti 80 %. Lisaksi naiden kahden sekvenssin vali-3q nen nukleotidihomologia (61 ja vastaavasti 67 %) oli hyvin merkitseva (Pa = 4,26 x 10 ^ ja vastaavasti 3,56 x _3 10 ). Kummastakin aminohapposekvenssista (LEU-GLU-X-LEU- LEU-LEU ja TYR-ARG-MET-X-LEU, joissa X on mika tahansa aminohappo) tutkittiin homologisuus 3060 NBRF-sekvenssi-pankissa olevan proteiinin kanssa.

35 616 748 tutkitusta kuuden aminohapon pituisesta 78 90255 segmentista vain 7 proteiinilla, IL-2 mukaan luettuna, havaittiin olevan homologiaa sekvenssin LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU kanssa. Kun sekvenssistå LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU (jos-sa X on mika tahansa aminohappo) tutkittiin homologia 5 616 748 kuuden aminohapon pituisen testisegmentin suh- teen, 7 proteiinia sisalsi homologisia sekvenssejå. Nai-hin kuuluivat ihmisen IL-1, ihmisen ja hiiren Ig:n raskas alfaketju, E. colin ja S. typhimuriumin arabinoosioperonia såateleva proteiini, OX-174:n geeni k -proteiini ja Asper-1Q gillus amstelodamin mitkondrioiden proteiini 4. Kuitenkin vain yksi proteiini (IL-2) sisalsi taydellisen homologian IL-2:n kanssa, jossa X = HIS, ja vain yksi proteiini (Aspergillus amstelodamin mitokondrioiden proteiini 4) sisalsi taydellisen homologian IL-2 reseptorin komplementin, jos-15 sa X = THR, kanssa. Kun sekvenssi TYR-ARG-MET-X-LEU tutkittiin 613 803 viiden aminohapon pituista segmenttia vas-taan, vain IL-2 ja etelåafrikkalaisen rupisammakon hemo-globiinin alfaketju sisalsivat homologisia sekvenssejH. Yhteenvetona havaittiin nSiden kahden homologisen sekvens-2Q sin liittyvan ainutlaatuisesti IL-2:een.

TF:11a ja sen reseptorin komplement!11a oli monia alueita, joissa vallitsei merkitseva sekvenssihomologia, mutta tulisi huomata, ettei kaikkia homologia-alueita ole merkitty nakyviin tilarajoitusten vuoksi. Kuvassa 9B esi-25 tetyilla tyypillisilla sekvensseilla nukleotidihomologia on vahintaån 53 % ja Pa-arvot pienempia kuin tilastolli-sesti merkityksellisinå pidetyt. Kun aminohapposekvens-seista ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU ja GLU-PHE-X-LEU-PHE-SER (joissa X on mika tahansa aminohappo) tutkittiin homolo-30 gisuus NBBF-sekvenssipankista saatujen 3060 proteiinin kanssa, vain TF sisalsi kummankin sekvenssin. Jålkimmåinen sekvenssi ldydettiin vain transferriinista, kuten taas ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU loydettiin transferriinista, lakto-transferriinista ja vain kolmesta ei-sukulaisproteiinis-35 ta (bakteriaalinen tryptofaanisyntaasi, E.colin kolisiini 79 90255

El-immuniteettiproteiini ja influenssa C-hemaglutiniinin esiaste).

Esimerkki 2D

Tarkasteltaessa esimerkisså 2C esitettyjå tulok-5 sia ei voida juurikaan epåillå, etteivåtko ligandicn ja reseptorien nukleotidisekvenssit sisaltaisi hyvin merki-tyksellisia komplementaarisuusalueita. Namå ovat tahan men-nesså olleet ainoat ligandi-reseptoriparit, joiden amino-happo- ja nukleotidisekvenssit on tunnettu kokonaan. Siten 1Q kaikki tål 13. hetkella saatavissa olevat sekvenssitiedot tukevat sita hypoteesiå, etta reseptorin ja ligandin sitou-tumiskohdat ovat voineet kehittya komplementaarisista nuk-leotidisMikeista. On olemassa useita havaintoja, jotka tukevat sitå ajatusta, etta tåsså esitetyt komplementaari-15 set alueet saattavat itse asiassa koodata reseptorin si-toutumiskohdassa olevia aminohapposekvensseja. Komplemen-taarisia nukleotidisekvensseja havaittiin ensinnåkin aina sytoplasmakalvon ulkopuolisessa reseptorin osassa. EGF-reseptorin komplementissa havaitut kaksi homologista sek-20 venssici sijaitsivat esimerkiksi 100 000 daltonin ulkopuo-lisella alueella (alue, joka sitoo EGF:n reseptorissa), kun taas 60 000 daltonin sytoplasma-alueella (proteiini-kinaasiaktiivisuusalueella) ei havaittu homologisuuksia. Tamå havainto pati myos IL-2- ja TF-reseptorien sekvens-25 seille, silla kaikissa tapauksissa homologiat sijaitsivat ulkopuolisella alueella, joka osallistuu ligandin sito-miseen. Toiseksi ligandien koko (5-6 aminohappoa) on suun-nilleen sellainen, jonka voisi odottaa tayttavan koko-naisen reseptorikohdan, jos kaytetSSn esimerkiksi Niso-30 noffin et al. (The Antibody Molecule, Academic Press, NY 1984, s 29-38) esittåmiå vasta-aineen sitomiskohtia. Nåma sekvenssit nayttSvåt edustavan sitoutumiskohtia, joista yhden odotettaisiin sijaitsevan kussakin reseptorin ja ligandin kosketuskohdassa. Kolmanneksi ja tarkeimpanii 35 seikkana on osoitettu, kuten tassa hakemuksessa aiemmin on so 90255 kuvattu, ettå hormonit ACTH ja gammaendorfiini sitoutu-vat suurella affiniteetilla synteettisesti johdettuihin peptideihin, joita koodaa vastaavan hormonin mRNAille komplementaarinen RNA. Tåmå havainto osoittaa, etta pep-5 tidille komplementaariset aminohapposekvenssit todella sitovat tamdn peptidin, ja peptidille komplementaarisen sekvenssin taytyy siksi sisåltåå reseptorin kaltainen sitoutumiskohta. ACTH:n sitova "synteettinen" kohta oli lisaksi antigeenisesti sukua lisamunuais-ACTH-reseptoril-1q le. Kaiken kaikkiaan nåma havainnot osoittavat, etta pep-tidireseptorien sitoutumiskohdat saattavat alunperin olla lMhtoisin nukleiinihapon komplementaarisista sai-keista.

Jos nukleiinihappojen komplementaarisista saikeis-15 ta kehittyvat kahden proteiinin valiset sitoutumisvuoro-vaikutukset osoittautuvat niin yleiseksi biologiseksi il-mioksi kuin milta nMyttMa, on olemassa monia taman ajatuk-sen mahdollisia kMyttdtarkoituksia. Ligandisekvenssien tunteminen mahdollistaisi esimerkiksi reseptorien helpon 20 puhdistuksen ja karakterisoinnin kayttåmalla tasså edellå kuvattujen kaltaisia menetelmia. Arvokasta tietoa ligan-dikonformaatioista sitoutumiskohtaymparistoissa voidaan saada konstruoimalla tarkasti mSariteltyja ligandi-"sitoutumiskohta"-pareja. Reseptori-ligandiparien sitou-25 tumiskohtasekvenssien tunteminen mahdollistaa lopulta pien-ten, tarkasti maariteltyjen reseptori-antagonistien ja/tai -agonistien konstruoinnin, jotka ovat arvokkaita biologisten reaktioiden saatelyssS. Nåma havainnot saattavat olla tarkeita myos erilaistumisen ja alkionmuodostuksen tut-30 kimisessa ja ymmSrtamisessa. Esimerkiksi pelkåståån se, etta toinen solu kopioi DNA-sekvenssin ja toinen sen komp-lementin, voisi mahdollistaa solutunnistuksen ja -kommu-nikoinnin tuloksena olevien peptidien tai proteiinien kautta, jotka ovat keskenaan vuorovaikutuksessa. Tåssa 35 kuvatut ajatukset voivat esimerkiksi olla geneettisena si 90255 ja molekulaarisena perustana immuunijarjestelmån sisai-selle kuvantamiselle ja piirien muodostamiselle keskus-hermostossa.

Tåsså hakemuksessa, erityisesti esimerkeissa 2A-2C, 5 esitetyt havainnot kuvaavat menetelmåå polypeptidien val-mistamiseksi, joilla on affiniteetti solujen reseptori-kohtien tai tiettyjen peptidihormonien suhteen. Mainittu jnenetelmå koostuu sarjasta vaiheita. Ensin todetaan toisen nukleotidisaikeen toinen nukleotidisekvenssi, joka 10 emåspariutuu ensimmåisen nukleotidisaikeen kanssa, joka koodaa ainakin osaa peptidihormonin reseptorikohdan pro-teiinikomponentista. Sitten maåritetåån homologiset amino-happosekvenssit peptidihormonin ja aminohapposekvenssin, jota koodaa toinen nukleotidisekvenssi luettuna suunnas-15 sa 31-5', vålillå. Kun on loydetty nama homologiset ami-nohapposekvenssit, jotka nåyttavat saavan aikaan peptidihormonien karakteristisen sitoutumisen reseptorikohtiin-sa, voidaan valmistaa polypeptideja, jotka sisaltåvat ainakin osan ainakin yhdesta mainitusta homologisesta sek-20 venssista, esimerkiksi tavanomaisin kemiallisin tai bio-logisin synteesimenetelmin. Nåma polypeptidit, jotka sisaltåvat avainalueita homologian ja reseptorin ja peptidihormonin tai ligandin vålisen sitoutumisaffiniteetin kannalta, voidaan tutkia kåytetyin tavanomaisin menetel-25 min peptidihormonin tai ligandin agonisteina tai antago-nisteina.

Esimerkki 3A

Angiotensiini II ja komplementaaristen peptidien suunnittelu ja valmistaminen nukleiinihapposekvenssien 30 perusteella

Angiotensiinijårjestelma on seuraava:

Angiotensinogeeni _____^ angiotensiini I ___ 1 2

angiotensiini II

82 90255

Reaktio 1 on reniinientsyymin aikaansaama entsy-maattinen pilkkoutuminen, ja reaktio 2 on angiotensiiniå muuttavan entsyymin (ACE) aikaansaama entsymaattinen pilkkoutuminen. Angiotensinogeeni sisaltåa 453 aminohapporyh-5 mSa, angiotensiini I koostuu angiotensinogeenin 10 N-ter-minaalisesta ryhmSstå, ja angiotensiini II sisaltaa angiotensiini I:n 8 N-terminaalista ryhmaå. Angiotensiini II on aktiivinen molekyyli, joka kontrolloi verenpaineen saatelyå.

10 Rotan angiotensiini II:n nukleiinihapposekvenssi saatiin Ohkubon et al. mukaisesti (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2197-2200) lukemalla aniotensinogeenia vas-taava koko mRNA ja etsimalla angiotensiini II:ksi tiedetty aminohapposekvenssi (emakset 134-157) . Tama sekvenssi, sen 15 luetantatuote, sen komplementti ja suunnassa 3'-5' tehdyl-la luennalla maaritetyt komplementaariset aminohapot esi-tetaSn seuraavassa taulukossa:

Anciotensiini- ASP ARG VAL TYR ILE HIS PRO WE karboksipaa πιΒΝΛ (II) GAC CGC GUA UAC AUC CAC CCC UUU 3' CRM CUG GCG C AU AUG UAG GUG GGG AAA 5' -paa

20 3' R-luenta LEU ALA HIS MET END VAL GLY LYS

5' R-luenta VAL ALA TYR VAL ASP VAL GLY LYS

Koska luenta 3' suunnasta antoi tulokseksi termi-naatiosignaalin (UAG/END), korvattiin END ASP :11a. Komplementaariset peptidit valmistettiin tavanomaisella kiintea-25 faasisynteesilla (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA). Huomaa, etta kahdessa peptidisså peptidisidosten orien-taatio on paralleellinen ja kahdessa antiparalleelinen.

Sekvenssi

Merkinta N-paå C-paa 30

5CA-AII rotta LYS GLY VAL ASP VAL TYR ALA VAL

3CA-AII " (4ASP) LYS GLY VAL ASP MET HIS ALA LEU

5CP-AII " VAL ALA TYR VAL ASP VAL GLY LYS

3CP-AII " (5ASP) LEU ALA HIS MET ASP VAL GLY LYS

35 83 90255

Esimerkki 3B

Angiotensiini II ja komplementaaristen peptidien suunnittelu ja valmistaminen aminohapposekvenssien perus-teella (konsensuskomplementit) 5 Ihmisen angiotensiini II:n aminohapposekvenssi saatiin Tewksburyn et al. (BBRC 99 (1981) 1311-1315) måå-rittåmåstå ihmisangiotensinogeenifragmentin sekvenssista.

Kayttåmallå taulukossa 6A annettuja substituointeja suunniteltiin kaksi angiotensiini II:n konsensuskomplement-10 tia, joista toisessa peptidisidosten orientaatio oli pa-ralleelinen ja toisessa antiparalleellinen ja jotka esi-tetåån seuraavassa:

CCA-AII LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU

CCP-AII LEU-ALA-HIS-ILE-TYR-VAL-GLY-LYS

15

Namå komplementaariset peptidit valmistettiin ta-vanomaisella kiinteafaasisynteesillå (Triton Biosciende Inc., Alameda, CA).

Esimerkki 3C

20 Angiotensiini II ja komplementaaristen peptidien suunnittelu ja valmistus aminohapposekvenssien perusteella (yksinkertaistetut komplementit)

Kayttamalla edellisen esimerkin mukaista angiotensiini II:n aminohapposekvenssia ja taulukossa 6C esitet-25 tyja substituointeja suunniteltiin seuraava (antiparallee-linen) yksinkertaistettu (ihmisen) angiotensiini II:Ile komplementaarinen peptidi.

SCA-AII GLU-GLY-LEU-GLU-LEU-GLU-ALA-LEU

Tamå komplementaarinen peptidi valmistettiin ta-30 vanomaisella kiinteåfaasisynteesilla (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA).

Esime rkki 3D

Angiotensiini ja siile sukua olevien komplementaaristen peptidien suunnittelu ja valmistus 35 Angiotensiinisysteemin tunnetun reaktioverkoston 84 90255 perusteella valmistettiin komplementaarisia peptideja, joilla voisi olla monia hyodyllisia vaikutuksia.

Suunnitellaan komplementaaristen peptidien sitou-tumista koskevien havaintojen perusteella molekyylejå, 5 jotka voivat olla spesifisesså vuorovaikutuksessa yhden tai useamman angiotensiinisysteemin molekyylin kanssa. Naiden vuorovaikutusten seurauksena angiotensiinimole-kyylille ei tapahdu entsymaattista reaktiota. Siten voi-taisiin esimerkiksi vahentaa angiotensiini I:n muuttumis-10 ta angiotensiini II:ksi ilman ACE:n tai sen muiden toi-mintojen todellista inhibointia.

Esimerkin 3B mukaisen ihmisen angiotensiinifrag-mentin sekvenssin perusteella suunniteltiin seuraavat kaksi peptidia kåvttamalla konsensuskomplementtimenetelmaå. 15 CCA-AI glu-val-lys-gly-val-tyr-ile-his-ala-leu

CCA-A(1-13) VAL-TYR-HIS-GLU-VAL-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU

Nåmå komplementaariset peptidit valmistettiin kiinteafaasisynteesillM (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA) .

20 Molekyylin CCA-A(1-13) voitaisiin odottaa sitovan kaikkia kolmea edella esitettya angiotensiiniryhman ja-sentå ja siten eståvån reaktiot 1 ja 2 angiotensiini II:n kyvyn aktivoida reseptoriaan.

Esifflerkki 3E

25 Angiotensiini II ja metabolisesti mahdollisesti stabiilien komplementaaristen peptidien suunnittelu ja valmistus

Yhden angiotensiini II:Ile komplementaarisen pep-tidin (CCA-AII, esimerkki 3B) rakenteen perusteella suun-30 niteltiin muutamia johdoksia, joilla voisi olla paran-nettu metabolinen stabiilisuus erilaisten peptidaasien suhteen. Tiedetaan, etta monissa organismeissa esiintyy sekå amino- etta karboksipeptidaaseja. On tunnettua, etta monet peptidirakenteen muuntamiset voivat suojata pep-35 tideja naiden entsyymien vaikutukselta. Terminaalisten es 90255 aminoryhmien asylointi (Ac) ja terminaalisten karboksyy-liryhmien prolylointi ja amidointi (Am) ovat yleisia me-netelmia peptidien suojaamiseksi amino- ja vastaavasti karboksipeptidaaseilta.

5 Seuraavat molekyylit suunniteltiin nåiden periaat- teiden ja aktiivisen komplementaarisen peptidin CCA-AII rakenteen perusteella.

Merkinta______________ Rakenne___________ CCA-AII (Am) LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ΑΙΑ-LEU-Am

10 CCA-AII (PR09) . LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU-PRO

CCA-AII (Ac, Am) Ac-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU-Am

CCA-AII (Ac, PR09) Ac-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU-PRO

Molekyylit valmistettiin tavanomaisella kiintea-faasimenetelmalla (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA). 15 Kiinteafaasisynteesissa kaytettiin amideja amidoitujen peptidien valmistamiseen. Asylointi tehtiin antamalla etikkahappoanhydridin reagoida taysin suojatun peptidin kanssa taman ollessa viela kiinteafaasisynteesihartsilla.

Eras menetelma peptidien suojaamiseksi entsyymien 20 vaikutukselta on korvata luonnossa esiintyvat L-amino- hapot D-aminohapoilla. Tasta syysta suunniteltiin taysin D-muodossa oleva komplementaarinen peptidi CCA-AII:n (esi-merkki 3B) sekvenssin perusteella.

CCA-AII (taysin D-muodossa)

25 LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU

Tama molekyyli valmistettiin tavanomaisella kiinteaf aasisynteesilia (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA) .

Esimerkki 3F

30 Angiotensiini II:lie komplementaaristen peptidien vaikutus radionuklidileimatun angiotensiini II:n sitoutu-miseen reseptoriinsa

Sita, miten komplementaariset peptidit estavat angiotensiini II:n sitoutumista angiotensiini II-resepto-35 reihin, tutkittiin kayttamalla radioaktiivista angiotcn- 86 9 0 2 5 5 siini II:a. Kaniinin maksat homogenoitiin ja sentrifu-goitiin hiukkasten, jotka sedimentoituvat kiihtyvyysalu-eella 1000-100 000 x g, eriståmiseksi. Sitoutumisaktiivi-suus saatettiin liuosmuotoon l-%:sen digitoniinin avulla, 5 minka jalkeen tehtiin ammoniumsulfaattifraktiointi pitoi-suusalueella 49-65 % kyllåisen liuoksen pitoisuudesta ja sen jålkeen DEAE-selluloosakromatografia pH:ssa 7,5 kayt- tåmållå lineaarista gradlenttia 0,0----p- 0,3 M KC1. Tama osittain puhdistettu, liuosmuodossa oleva reseptoriprepa-20 raatti sitoi 17 pmol angiotensiini II:a/ng proteiinia Sctchard-analyysin mukaan, mika osoittaa puhtausastetta noin 0,1 %.

Tavanomainen mååritys, jolla tutkitaan angiotensiini II:n sitoutumista reseptoriinsa on seuraava: Koko 25 systeemi (lSO^ul) sisåltåå 30 mmol/1 Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mmol/1 K2EDTA, 0,2 mmol/1 PCMS, 0,25 nmol/1 ^25lJ-angiotensiini II (noin 100 000 pulssia/min), 100yug BSA: ta, 0,25 tilavuus-% Brij 99 ja 30^ug osittain puhdistet-tua reseptoria. Reaktio kåynnistetaan lisååmållå resepto-20 ri, ja naytteitå inkuboidaan 60 min låmpotilassa 20°C.

Reaktio pysaytetSan 1 ml :11a kylmaa liuosta joka sisaltaS 0,5 % hiilta/0,05 % dekstraania 100 mM Tris-HCl:ssa, pH 7,5. Putkia py6ritetaån ja annetaan niiden sitten seista 10 min låmpotilassa 4°C, minka jalkeen ne sentri-25 fugoidaan ja tehdåån laskenta supernatanteille, jotka si-såltåvåt proteiiniin sitoutuneen angiotensiini II:n.

Koko systeemi antaa naisså olosuhteissa sitoutuneen radioaktiivisuuden mååråksi yleenså noin 10 000 pulssia/min. Vertailunåyte, josta puuttuu reseptori, an-30 taa arvoja 50-200 pulssia/min, jotka våhennettiin tulok-sista. Kun reaktioseoksessa oli kylmåå angiogensiini II pitoisuutena 120^,uM, saatiin arvoja 50-2000 pulssia/min, mikå osoittaa, ettå sitoutuminen on låhes kokonaan spesi-fistå. Tutkittiin myos nåyte, joka sisålsi kylmåå angio-35 tensiini II pitoisuutena 20 nM. Radioaktiivisuuden jåån- 87 90255 nossitoutuminen tasså vertailunåytteesså oli 35-45 %. Angiotensiini II:Ile komplementaariset peptidit liuotet-tiin veteen lukuun ottamatta CCA-A (1-12), joka liuotet-tiin 3 %:seen DMSO-liuokseen, joka sisalsi 0,04 mol/1 5 etikkahappoa ja 0,05 mol/1 HC1. Nåiden kokeiden tulokset annetaan taulukossa 22. ID^g on se peptidipitoisuus, joka saa aikaan radionuklidileimatun angiotensiini II:n 50-%: sen inhibition.

Taulukko 22 10 Angiotensiini II:n sitoutumisen eristettyyn maksa- reseptoriin estyminen komplementaaristen peptidien vaiku-tuksesta

Peptidi ID5Q (nM) ,c Angiotensiini II 15 15 CCA-AII 8-14 CCA-A (1-13) 40 CCA-AI 490 CCA-AII (An) 160 CCA-AII (Ac, Am) 3,100 CCA-AII (Pro 9) 40 20 CCA-AII (Ac, Pro 9) 1,350 CCA-AII (all D) >10,000 5CA-AII rotta 4,00 0 3CA-AII " (4 ASP) 5,000 5CP-AII " >10,000 3CP-AII " (5 ASP) >10,000 25

Esimerkki 4A

Luteinisoivaa hormonia vapauttava hormoni (LHRH) ja komplementaarisen peptidin suunnittelu ja valmistus Lutenisoivaa hormonia vapauttavalla hormoni11a 30 on monia erilaisia biologisia vaikutuksia, ja sen resep-toreja esiintyy otaksuttavasti monen tyyppisilla soluilla (Miller et al., Nature 313 (1985) 231-233). LHRG:n esi-astemuodon nukleiinihapposekvenssia on kuvattu (Seeburg ja Adelman, Nature 311 (1984) 666-668), ja sita kaytet-35 tiin seuraavassa komplementaarisen peptidin suunnittelussa.

ββ 90255 LHRH:ta vastaava sekvenssi, sen luentatuote, komplementti ja komplementin 5'-3'-luentatuote esitetåan seu-raavassa.

LHRH GLN-HIS-TRP-SER-TYR-GLY-LEU-ARG-PRO-GLY C -paa 5 tuRNA CAG-CAC-TCG-TCC-TAT-G«-CTG-CGC-CCT-QGA 3'"paa cRNA GTC-GTG-ACC-AGG-ATA-CCT-GAC-GCG-GGA-CCT 5'-paa 5CA-LHPH LEU-VAL-PRO-GLY-1LE-SER-GLN-ALA-ARG-SER N -paa

Komplementaarinen peptidi 5CA-LHRH valmistettiin kiinteafaasisynteesillå (Triton Biosciences Inc., Alame-10 da, CA).

Esimerkki 4B

LHRH:lie komplementaarisen peptidin (5CA-LHRH) vai-kutus LHRH:n stimuloimaan LH:n vapautumiseen aivolisake-soluista 15 Kåånteistå hemolyysipesåkemåaritysta (Smith et al.,

Method in Enzymology 124, s 443) kaytettiin tutkittaessa LHRH:Ile komplementaarisen peptidin (5CA-LHRH) vaikutusta LHRH:n stimuloimaan LH:n vapautumiseen aivolisakesoluis-ta. Maaritys tehtiin muuten viitteen mukaisesti, mutta 20 kokeissa, jotka on merkitty (Pre), komplementaarista pep-tidia ja LHRH:ta esi-inkuboitiin 1 tunti ennen dispergoi-tujen aivolisakesolujen lisaamista.

Pesakkeet analysoitiin maarittamallå pesåkepinta-ala tekemalla 125-500-kertaisten mikroskooppisuurennos-25 ten kuva-analyysi (Bioquant or Image Technology Corp.

Model 300). Tulokset annetaan kussakin kokeessa havaitun reaktion prosenttiosuutena vertailukokeeseen nahden (pe-såkkeet, joita muodostuu stimuloitaessa 5 x 10 M LHRH:11a).

30 Komplementaarisen peptidin (5CA-LHRH) vaikutus esi tetaan taulukossa 23.

89 90255

Taulukko 23 koe 1 koe 2 koe 3 koe 4 koe 5

Kasittely_(Pre) (No)_(Pre) (Pre) (ei) 5 Ei mitaan 7 5 o.03 2 2

Vert. 5xlO~10M LHRH 100 100 100 100 100

5xl0“10M LHRH+5CA-LHPH

10"Jm 77 61 NT 52 52 10 10~?M 82 52 68 63 70 10IM 110 74 98 81 81 10 'm 101 74 88 78 115 10~qM 105 83 NT 96 92 10 M 119 84 NT 95 123 5x10 LHRH+ soiratostatiini 15 _4

10 M 103 NT NT NT NT

5CA-LHRH

10“^M NT NT 2,7 NT NT

10-¾ NT NT 0,5 NT NT

10 M NT NT 0,5 NT NT

20 '

Tulokset osoittavat, etta komplementaarinen pep-tidi 5CA-LHRH estaå tassa kokeessa selvasti LHRH:n vai-kutuksia.

Esimerkki 4C

25 5CA-LHRH:n vasta-aineen vaikutus (A5CALHRH) LHRH:n stimuloimaan LH:n erittymiseen aivolisakesoluista

Kaanteinen hemolyysipesakekoe, jolla tutkittiin LH:n erittymista esikiimassa olevien rottien aivolisakesoluista, tehtiin oleellisilta osiltaan esimerkisså 4B 20 kuvatulla tavalla, paitsi ettM aivolisåkesoluja esi-inku-boitiin A5CALHRH:n tai normaalikaniinin seerumin (NRS) kanssa kaksi tuntia. Pesun jalkeen kaynnistettiin kaan-teisten hemolyysipesakkeiden muodostaminen lisaaraållå LHRH:ta ja anti-LH-antiseerumia. Kahden tunnin kuluttua 35 lisattiin komplementti 30 min:n ajaksi. Myos A5CALHRH:ta 90 9 0 2 5 5 lisåttiin samaksi pitoisuudeksi kåanteisten hemolyysi-pesakkeiden muodostuksen aikana. A5CALHRHB1 on IgG-fraktio antiseerumista, joka saatiin ensimmciisesta veri-naytteesta 40 påivån kuluttua koiraskaniinin immunisoin-5 nin aloittamisesta tulivuorikotilon hemosyaniiniin lii-tetylla 5CA-LHRH:lla (300^ug antigeenia 1 mlrssa tåydel-lista Freundin apuainetta, alkuinjektio paivåna 0, 200yUg antigeenia 1 mlrssa epataydellista Freundin apuainetta, injektiot paivina 10, 20, 30, 40, 50 ja 60). A5CALHRHB3 10 on peraisin kaniinista paivånå 60 otetusta kolmannesta verinSytteesta. A5CALHRHB1:n F(ab)2-fragmentit valmis-tettiin tavanomaisin menetelmin (Methods In Immunology, 3. p., 1977, s. 256). Tulokset esitetåan taulukossa 24.

91 90255

Taulukko 24

Kasittely___________% vertailunåytteesta__

Ei rnltaan 20 LHRH 5 x 10 M 100 (vertailu) 5 A5CALHRHB1 1:10 + LHRH 5xl0“J? M 140 1:25 + LHRH 5x10 ^ M 158 1:100 + LHRH 5xl0_i M 178 1Q A5CALHRHB1 F9Ab)2* 1:10 + LHRH 5xlO"J° M 75 1:25 + LHRH 5x10 M 132 1:100 + LHRH 5x10 1 M 146

NRS

-10 1:10 + LHRH 5x10 M 78 1:25 + LHRH 5x10 M 118 1:100 + LHRH 5xlO-1U M 93 A5CALHRHB3 20 1:5 5 1:10 3 1:25 10 1:100 28 A5CALHRHB 3 25 -10 1:5 + LHRH 5x10 27 1:10 + LHRH 5x10**:^ H 25 1:25 + LHRH 5xl0-1l:oM 46 1:100 + LHRH 5x10 M 184 3Q *)

AivolisSkkeet sisåltavåt raporttien mukaan vasta-aine-molekyylien FC-osan reseptoreja (Pouglande et al., Nature 261 (1976) 142; Buffa et al., Histochem 63 (1979) 261). A5CALHRH:n F(ab)2~fragmentit valmistettiin sen varmista-miseksi, ettei A5CALH:n vuorovalkutus epåspesifisten FC-reseptorien kanssa vaikuta aivolisakesolujen LHRH-stimu-loitumiseen.

92 90255 Nåmå tulokset osoittavat, ettå LHRH:lle komplemen-taarisella peptidillå immunised tujen kaniinien immuuni-seerumissa esiintyy sekå vasta-aineiden antagonisteja ettå niiden agonisteja.

5 Esimerkki 4D

LHRH:Ile komplementaaristen peptidien vasta-ainei-siin perustuva LHRH-solupintareseptorien immuunisytoke-miallinen tutkimus LHRH-reseptoreja esiintyy erilaisten solujen pin-10 noilla. On tunnettua, ettå 5 % aivolisåkesoluista sisål-tåå tållaisia reseptoreja, sillå ne reagoivat LHRH:hon vapauttamalla LH:ta. Seuraavat kokeet tehtiin sen osoit-tamiseksi, ettå LHRH:Ile komplementaaristen peptidien vasta-aineilla on kyky spesifisesti leimata LHRH-resepto-15 reja sisåltåviå aivolisåkesoluja.

Kun oli tehty tavanomaiset pesåkemååritykset (kuten esimerkisså 4B), kammiot infusoitiin natriumasetaa-tilla sitoutuneiden vasta-aineiden eluoimiseksi, ja tehtiin kiinnitys peråkkåin B5-fiksatiivilla, etanolilla, 20 Lugolin jodiliuoksella ja natriumtiosulfaatilla (Smith et al., Methods In Enzymology, 124, s 443). Levyt kåsi-teltiin vetyperoksidilla ja normaalivuohen seerumilla ennen vasta-aineiden lisååmistå sopivasti laimennettuina. Immuunisytokemia toteutettiin ABC-menetelmållå (Vector 25 Labs, Burlingame, CA) kåyttåen substraattina diaminobent-sidiiniå.

LH:ta sisåltåvåt solut vårjåttiin selektiivisesti LH-vasta-aineilla. Aiempien esimerkkien mukaisissa ko-keissa muodostuneet pesåkkeet sisålsivåt yleenså yhden 30 LH-pitoisen solun låhellå kunkin pyoreån pesåkkeen kes-kikohtaa. LHRH-reseptoreja sisåltåvåt solut vårjåttiin kåyttåmållå LHRH:Ile komplementaarisella peptidillå im-munisoitujen kaniinien immuuniseerumin IgG-fraktioita. (Katso esimerkki 4C). Tållåkin kertaa vårjåytyi yksi solu 35 pydreåtå tåplåå kohden, ja nåmå solut olivat samoja kuin 93 90255 ne, jotka sisålsivåt LH:ta. Vertailukokeet osoittivat, ettå reseptorin vårjåytyminen LHRH:n komplementein vasta-aineella voitiin eståå seka LHRHrlla (reseptorin tapahtu-van sitoutumisen kautta) etta LHRH:n komplementilla (vasta-5 aineeseen tapahtuvan sitoutumisen kautta) .

Nåmå kokeet osoittavat, ettå LHRH:n komplementin vasta-aineet vårjååvåt selektiivisesti aivolisåkesoluja, jotka sisåltåvåt LHRH-reseptoreja.

Esimerkki 5A

10 Ribonukleaasi A:n S-peptidi ja komplementaarisen peptidin suunnittelu ja valmistus Kåsiteltåesså naudan ribonukleaasi A (RNaasi), 124 aminohappoa sisåltåvå proteiini, proteolyyttisellå ent-syymillå, subtilisiinilla, RNaasi pilkkoutuu kahdeksi 15 fragmentiksi, joita kutsutaan S-peptidiksi, aminohappo- ryhmåt 1-20, ja S-proteiiniksi, aminohapporyhmåt 21-124. Rotan RNaasin mRNA-sekvenssi saatiin MacDonaldin et al. julkaisusta (J. Biol. Chem., 257 (1982) 14582-14585), ja sen sekvenssi on oleellisessa måårin homologinen naudan 20 RNaasin kanssa. Ryhmåt 4-23 ovat homologisia naudan RNaasin S-peptidin kanssa. Nauhdan RNaasia vastaava ole-tettu mRNA-rakenne johdettiin tekemållå mahdollisimman våhån emåsmuutoksia rotan mRNA-sekvenssiin, ja se esi-tetåån seuraavassa taulukossa:

25 Rotan RNaasin aminohapporyhmåt 4-23 ARG GLU SER SER ALA ASP LYS PHE LYS ARG GLN HIS MET ASP THR GLU GLY PRO SER LYS

Rotan RNaasi-ryhmiå 4-23 vastaava rotan mRNA-sekvenssi luenta suunnassa 5'-3'AGG GAA UCA UCG GCG GAU AAG UUU 30 AAG AGG CAG CAC AUG GAC ACA GAG GGU CCC UCC AGG

Naudan S-peptidiå vastaava oletettu mRNA, luenta suunnassa 5*-3' AAG GAA ACA GCG GCG GCU AAG UUU GAG AGG GAG CAC AUG GAC UCA UCG ACU UCC GCC GCG

Naudan S-peptidin aminohapposekvenssi LYS GLU THR ALA ALA 35 ALA LYS PHE GLU ARG GLU HIS MET ASP SER SER THR SER ALA

ALA

94 90255

Naudan S-peptidille komplementaarisen peptidin ami-nohapot måaritettiin nukleiinihapporakenteesta lukemalla komplementaarinen saie suunnassa 5'-3' olevassa lukukehyk-sessa seuraavan taulukon mukaisesti:

5 Komplementaarinen nukleiinihapporakenne naudan S-peptidille CGC GGC GGA AGU CGA UGA GUC CAU GUG CUC CCU CUC AAA CUU AGC CGC CGC UGU UUC CUU

Naudan S-peptidille komplementaarinen paralleelinen amino-happosekvenssi LEU PHE SER ARG ARG SER LEU LYS LEU PRO 10 LEU VAL HIS VAL SER ARG SER GLY GLY ARG

Koska kuudes kodoni tuotti terminaatiosignaalin (UGA/END), korvattiin END SER:lla. Kodonin 18 (UGU/CYS) kohdalla CYS korvattiin SER:11a. Nåma aminohapposubsti-tuoinnit pitSvåt ylla toisen emaksen komplementaarisuu-15 den naudan S-peptidin kanssa. Komplementaarinen peptidi valmistettiin tavanomaisella kiinteafaasisynteesilla (Triton Biosciences Inc., Alameda, CA).

Esimerkki 5B

Ribonukleaasi A:n S-peptidi ja komplementaarisen 20 peptidin sitominen ja puhdistus S-peptidille komplementaarisen peptidin vuorovaiku-tusta S-peptidin kanssa tutkittiin liittamalla kovalent-tisesti S-peptidi N-hydroksisukkinimidilla aktivoidulla silikageelillå sidottuun faasiin tavanomaisin kemialli-25 sin menetelmin. Peptidiseos, joka saatiin kasittelemalla komplementaarinen peptidi vetyfluoridlla tavanomaisin kemiallisin menetelmin, syotettiin suoraan S-peptidi-kromatografiapylvåaseen (3 mm x 44 mm), joka oli ennalta tasapainotettu joko 0,10 M Tris-asetaatissa, pH 7,0 tai 30 0,10 M Tris-asetaatissa pH 5,1, virtausnopeudella 1 ml/- min. Kolonnin eluaattia seurattiin mittaamalJa absorbans-si aaldonpituudella 226 nm. Naissa olosuhteissa liuotin-rintaman mukana eluoitui suuri piikki, joka koostui pep-tidista ja ei-peptidimateriaalista. Kolonnin huuhdottiin 35 45 ml:11a puskuria ja sitten 30 ml :11a vetta, ja sitten 90255 kolonniin syotettiin 0,10 M etikkahappoa, jonka mukana eluoitui aallonpituudella 226 nm absorboivaa materiaalia. Kåsiteltaesså tama eluoitunut materiaali kromatografises-ti Waters reversed phase C-18-kolonnilla kåyttåmallå vir-5 tausnopeutta 1 ml/min ja eluoimalla 35 min:n aikana gra- dientilla 10-%:nen liuos A---~> 40-%:nen liuos B (liuos A, 0,1 % trifluorietikkahappoa/vesi; liuos B, 0,1 % tri-fluorietikkahappoa/100-%:nen asetonitriili) saatiin yksi piikki, jonka retentioaika oli noin 26 min. Taman mate-10 riaalin sekventointi kaasufaasisekventointilaitteella (Applied Biosystems, Foster City, CA) vahvisti, etta sen rakenne oli identtinen syntetisoidun komplementaarisen peptidin kanssa. Vertailupeptidit eivat sitoutuneet S-peptidiaffiniteettikolonniin. Nama tulokset osoittavat 15 spesifisen sitoutumisen S-peptidin ja eraan sen komplemen-tin valilla ja myos sen, etta S-peptidiaffiniteettikolon-nia voidaan kayttaa epapuhtaiden peptidipreparaattien puhdistukseen.

Tassa kuvattujen erilaisten aminohappojen, element-20 tien, vaiheiden ja menettelyjen rakenteeseen, toimintaan ja jarjestelyyn voidaan tehda muutoksia poikkeamatta ta-mån keksinnon ajatuksesta ja piirista, joka maaritellaan seuraavissa patenttivaatimuksissa.

Claims (29)

96 90255

1. Menetelma polypeptidin, joka on komplementaari-nen ainakin osalle alkuperaistå peptidia tai proteiinia, 5 valmistamiseksi, jolloin polypeptidin, alkuperåisen pep-tidin tai alkuperåisen proteiinin aminohapot mååritellåån kuuluviksi kodoniensa toisen emaksen mukaisiin ryhmiin (U/T, A, C tai G), ja todetaan aminohapposekvenssi ainakin osasta alku-10 peraista peptidia tai proteiinia; tunnettu sii-tå, etta korvataan kukin A-ryhman aminohappo U/T-ryhman aminohapolla; korvataan kukin U/T-ryhmån aminohappo A-ryhmån 15 aminohapolla; korvataan kukin C-ryhmån aminohappo G-ryhman aminohapolla; ja korvataan kukin G-ryhman aminohappo C-ryhman aminohapolla; ja 20 valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå edellå esitettyjen substituointien maaritteleman aminohapposek-venssin.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma polypeptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku- 25 peraista peptidia tai proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siita, etta todetaan kiinnostuksen kohteena olevissa lajeissa tai olevassa lajissa kunkin kodoniryhmån, jossa toinen emas on G, C, A ja U/T, tiheimmin kaytettyå kodonia vas-30 taava aminohappo; korvataan todetun sekvenssin kukin todettu aminohappo aminohapolla niiden aminohappojen joukosta, joiden vastaava toinen emas on komplementaarinen todetun sekvenssin kiinnostuksen kohteena olevissa lajeissa tai ole-35 vassa lajissa tiheimmin kaytetyn kodonin toiselle ernak- 97 90255 selle; valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå edellå esitettyjen substituointien mååritteleman aminohapposek-venssin.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå poly- peptidin, joka on komplementaarinen ainakln osalle alku-peråistå peptidiå tax proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå todetaan kiinnostuksen kohteena olevien lajien tai 10 olevan lajin sekvenssln kutakin aminohappoa vastaava ti-heimmin kåytetty sellainen kodoni, ettei komplementaari-sen kodonin lukeminen suunnassa 5':sta 3'teen johda lope-tuskodoniin; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ami-15 nohappo aminohapolla, jonka måårittelee todetun tiheimmin kåytetyn kodonin translaatio suunnassa 5':sta 3':een; valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå edellå esitettyjen substituointien måårittelemån aminohapposekvenssin.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå poly- peptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku-peråistå peptidiå tai proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå todetaan kiinnostuksen kohteena olevien lajien tai 25 olevan lajin sekvenssin kutakin aminohappoa vastaava tiheimmin kåytetty sellainen kodoni, ettei komplementaari-sen kodonin lukeminen suunnassa 3':sta 5'teen johda lope-tuskodoniin; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ami-30 nohappo aminohapolla, jonka måårittelee todetun tiheimmin kåytetyn kodonin translaatio suunnassa 3':sta 5':een; valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå edellå esitettyjen substituointien måårittelemån aminohapposekvenssin .

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå poly- 98 90255 peptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku-peråistå peptidiå tai proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siitå, etta (a) mååritetåån ensimmåisen nukleiinihapon ensim-5 måinen nukleotidisekvenssi, joka koodaa aminohapposek- venssiå, joka on ainakin osa alkuperåisestå peptidistå tai proteiinista; (b) todetaan toisen nukleiinihapon toinen nukleotidisekvenssi, joka emåspariutuu ensimmåisen nukleiiniha- 10 pon ensimmåisen nukleotidisekvenssin kanssa, jolloin en-simmainen ja toinen nukleiinihappo pariutuvat antiparal-leelisissa suunnissa; (c) mååritetåån komplementaarisen polypeptidin aminohapposekvenssi etsimallå aminohapposekvenssi, jota 15 koodaa toinen nukleotidisekvenssi luettuna samassa luku-kehyksesså ensimmåisen nukleotidisekvenssin kanssa; ja (d) valmistetaan polypeptidi, joka sisaltåa vai-heessa c mååritetyn aminohapposekvenssin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelma, 20 tunnettu siita, etta toinen nukleotidisekvenssi luetaan suunnassa 5'ssta 3':een.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta toinen nukleotidisekvenssi luetaan suunnassa 3':sta 5':een.

8. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta ensimmåinen nukleiinihappo maåritellåan lisaksi cDNAsksi.

9. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta ensimmåinen nukleotidisek- 30 venssi maåritellåan lisåksi låhetti-RNAsksi.

10. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, ettå ensimmåinen nukleotidisekvenssi ja toinen nukleotidisekvenssi mååritellåån lisåksi triplettinukleotidista koostuviksi.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå poly- 99 90255 peptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku-peraista peptidlå tai proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin iso-5 leusiini tyrosiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin va-liini glutamiinilla tai histidiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin leusiini asparagiinilla, asparagiinihapolla tai glutamiini-10 hapolla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin fe-nyylialaniini lysiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin kys-teiini treoniinilla; 15 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin me- tioniini tyrosiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ala-niini arginiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ar-20 giniini alaniinilla tai seriinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ly-siini fenyylialaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin asparagiini leusiinilla; 25 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin aspa- ragiinihappo leusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu-tamiini valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu-30 tamiinihappo leusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin his-tidiini valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin gly-siini proliinilla; 35 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin treo- 100 90255 niini tryptofaanilla tai kysteiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tryp-tofaani treoniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin se-5 riini arginiinilla tai seriinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tyro-siini isoleusiinilla tai metioniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin pro-liini glysiinillå; ja 10 valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå edella esitettyjen substituointien maaritteleman aminohapposekvenssin.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelma, tunnettu siitå, ettå 15 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ar- giini seriinillå; ja korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin treo-niini kysteiinillå.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma poly- 20 peptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku- peråistå peptidiå tai proteiinia, valmistamiseksi, tunnettu siitå, ettå luetaan todettu aminohapposekvenssi alkaen sen karboksiterminaalisesta suunnasta, siten ettå se vastaa 25 korvaavalla tavalla komplementaarisen polypeptidin amino-terminaalista suuntaa; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin iso-leusiini tyrosiinilla, asparagiinilla tai asparagiiniha-polla; 30 korvataan todetun cuninohapposekvenssin kukin va- liini asparagiinilla, asparagiinihapolla, histidiinillå tai tyrosiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin leu-siini lysiinillå, glutamiinilla tai glutamiinihapolla; 35 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin fe- ιοί 90255 nyylialaniini lysiinillå tai glutaminihapolla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin kys-teiini treoniinilla tai alaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin me-5 tioniini histidiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ala-niini arginiinilla, seriinillå, glysiinillå tai kysteii-nillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin argi-10 niini alaniinilla, seriinillå, treoniinilla tai prolii-nilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ly-siini leusiinilla tai fenyylialaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin aspa-15 ragiini isoleusiinilla tai valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin aspa-ragiinihappo isoleusiinilla tai valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu-tamiini leusiinilla; 20 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu- tamiinihappo leusiinilla tai fenyylialaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin his-tidiini valiinilla tai metioniinilla; korvataan todetun ciminohapposekvenssin kukin gly-25 siini proliinilla, seriinillå, treoniinilla tai alanii nilla; korvataan todetun ciminohapposekvenssin kukin treo-niini glysiinillå, seriinillå, arginiinilla tai kysteii-nillå; 30 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tryp- tofaani proliinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin se-riini glysiinillå, treoniinilla, alaniinilla tai arginiinilla; 35 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tyro- 102 9 0 2 5 5 siini isoleusiinilla tai valiinilla; ja korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin pro-liini glysiinilla, arginiinilla tai tryptofaanilla; ja valmistetaan polypeptidi, joka sisaltaa edellå 5 esitettyjen substituointien mååritteleman aminohapposekvenssin.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin va-10 liini asparagiinihapolla tai histidiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin leu-siini lysiinilla tai glutamiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin fe-nyylialaniini glutamiinihapolla; 15 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ar- giniini alaniinilla tai proliinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ly-siini leusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin his-20 tidiini valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin gly-siini proliinilla tai alaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin treo-niini glysiinilla tai arginiinilla; 25 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin se- riini glysiinilla, arginiinilla tai alaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tyro-siini valiinilla; ja korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin pro-30 liini glysiinilla tai arginiinilla.

15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma poly-peptidin, jolla on affiniteetti tietyn peptidiligandin solureseptorikohdan suhteen, valmistamiseksi, tunnettu siita, etta menetelma sisaltaa seuraavat vai- 35 heet: 1°3 90255 todetaan toisen nukleotidisåikeen, joka emåspariu-tuu ensimmåisen nukleotidisåikeen kanssa, joka koodaa ai-nakin osaa peptidiligandin reseptorikohdan proteiinikom-ponentista, toinen nukleotidisekvenssi; 5 maaritetaån peptidiligandin mahdolliset aminohap- posekvenssit, jotka ovat homologisia aminohapposekvens-seille, joita koodaa toinen nukleotidisekvenssi luettaes-sa mainittu sekvenssi suunnassa 3':sta 5':een; ja valmistetaan polypeptidi, joka sisaltaa ainakin 10 osan ainakin yhdestå mainitusta homologisesta aminohappo-sekvenssista.

16. Patenttivaatimuksen 1, 5, 11 tai 13 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, etta polypeptidi syn-tetisoidaan kemiallisesti.

17. Patenttivaatimuksen 1, 5, 11 tai 13 mukainen menetelma, tunnettu siitå, etta mainittu polypeptidi irrotetaan proteiinista tai suuremmasta polypep-tidista, joka sisaltaa mainitun aminohapposekvenssin.

18. Patenttivaatimuksen 1, 5, 11 tai 13 mukainen 20 menetelma, tunnettu siita, etta insertoidaan mainittua polypeptidiå vastaavan koodin sisåltavå DNA-nukleotidisekvenssi plasmidiin, jolloin muodostuu yhdis-telmå-DNA-vektori, ja transformoidaan silla yksisoluinen organismi, jolloin saadaan yksisoluinen transformanttior-25 ganismi, joka syntetisoi biologisesti mainittua polypep tidiå.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta yksisoluinen organismi vali-taan ryhmåstå, joka koostuu bakteereista, hiivoista ja 30 nisåkåssoluista.

20. Patenttivaatimuksen 1, 5, 11, 13 tai 15 mukainen menetelma, tunnettu siita, etta alkuperåiset peptidit tai proteiinit mååritellåån lisåksi solupinta-komponenteiksi ja komplementaarinen polypeptidi mååritel- 35 låån lisåksi konjugoiduksi toksiiniin tai diagnostiseen 104 90255 aineeseen, kuten fluoresoivaan merkkiaineeseen, jolloin konjugaatti tarttuu spesifisesti mainittuun solupintakom-ponenttiin.

21. Patenttivaatimuksen 1, 5, 11, 13 tai 15 mukai- 5 nen menetelmå, tunnettu siitå, etta alkuperåinen peptidi tai proteiini mååritellåån lisåksi ainakin osaksi hormoniksi ja komplementaarinen polypeptidi mååritellåån lisåksi mainittuun hormoniin sitoutuvaksi ja sen biolo-gista aktiivisuutta våhentåvaksi tai eståvåksi sitå kaut-10 ta.

22. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmå poly-peptidin, joka on komplementaarinen ainakin osalle alku-peråista peptidiå tai proteiinia, valmistcimiseksi, tunnettu siita, etta 15 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin iso- leusiini tyrosiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin va-liini histidiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin leu-20 siini glutamiinihapolla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin fe-nyylialaniini lysiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin me-tioniini tyrosiinilla tai histidiinilla; 25 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ly- siini fenyylialaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin aspa-ragiini leusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin aspa-30 ragiinihappo leusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu-tamiini leusiinilla tai valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin glu-tamiinihappo leusiinilla; 35 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin his- los 90255 tidiini valiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tyro-siini isoleusiinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin kys-5 teiini treoniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ar-giniini alaniinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin gly-siini proliinilla; 10 korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin tryp- tofaani treoniinilla tai proliinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin se-riini seriinilla tai arginiinilla; korvataan todetun cuninohapposekvenssin kukin treo- 15 niini kysteinillå tai seriinilla; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin pro-liini glysiinillå; korvataan todetun aminohapposekvenssin kukin ala-niini arginiinilla; 20 valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåa edella esitettyjen substituointien måårittelemån aminohapposekvenssin.

23. Patenttivaatimuksen 2, 3, 4, 5, 13 tai 22 mu-kainen menetelmå, tunnettu siita, ettå komple- 25 mentaarinen polypeptidi maåritellaan lisåksi sellaiseksi, etta siina sailyy komplementaarisuus tai sitoutumisaffi-niteetti alkuperåisen peptidin tai proteiinin suhteen riippumatta mainitun komplementaarisen polypeptidin ami-noterminaalisesta ja karboksiterminaalisesta suuntautumi- 30 sesta.

24. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelma, tunnettu siita, ettå valmistetaan polypeptideja joilla on affiniteetti polypeptidiligandin suhteen, sen solureseptorikohdan perusteella, joka menetelma sisåltåa 35 seuraavat vaiheet: 106 90255 todetaan toisen nukleotidisaikeen, joka emåspariu-tuu ensimmåisen nukleotidisaikeen kanssa, joka koodaa ainakin osaa peptidiligandin reseptorikohdan proteiini-komponenttista, toinen nukleotidisekvenssi; 5 mååritetåån peptidiligandin mahdolliset aminohap- posekvenssit, jotka ovat homologisia aminohapposekvens-seille, joita koodaa toinen nukleotidisekvenssi luettaes-sa tama suunnassa 3':sta 5'seen tax 5':sta 3'teen; mååritetåån polypeptidiligandin proteiiniresepto-10 rin ne aminohapposekvenssit, jotka vastaavat edeltåvan vaiheen mukaisia homologisia alueita; ja valmistetaan polypeptidi, joka sisåltåå ainakin osan ainakin yhdestå proteiinireseptorin mainitusta ami-nohapposekvenssistå.

25. Menetelma peptidiligandin reseptorikohdan kom- ponenttien saamiseksi seoksesta, tunnettu siitå, ettå hankitaan patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmis-tettu polypeptidi, joka on komplementaarinen ainakin 20 osalle peptidiligandia; valmistetaan mainitun polypeptidin vastainen vas-ta-aine; liitetaån vasta-aine kiinteåan matriisiin; kasitellaan seos matriisiin kiinnitetylla vasta-25 aineella, jolloin reseptorikohdan komponentit sitoutuvat spesifisesti; ja eluoidaan sitoutuneet komponentit.

26. Menetelma peptidin tai proteiinin detektoimi-seksi ja maårittåmiseksi naytteesta, joka sisaltaa mai-30 nittua maaritettavaa peptidia tai proteiinia, tun nettu siita, etta (a) valmistetaan polypeptidi, joka on komplementaarinen ainakin osalle mainittua peptidia tai proteiinia, kåyttåmallå patenttivaatimuksen 1, 5, 11, 13 tai 15 35 mukaista menetelmaå: 107 90255 (b) liitetåan mainittu komplementaarinen peptidi merkkiaineeseen jolloin muodostuu polypeptidin leimattu konjugaatti; (c) saatetaan nåyte, joka sisåltåa mååritettåvåå 5 peptidiå tai proteiinia, kosketukseen komplementaarisen polypeptidin leimatun konjugaatin kanssa, jolloin muodos-tuu kemiallinen kompleksi tai pari, jossa mååritettåvå peptidi tai proteiini on sitoutuneena komplementaarisen polypeptidin leimattuun konjugaattiin; ja 10 (d) detektoidaan ja måaritetaan mååritettåvå pep tidi tai proteiini analysoimalla peptidiin tai proteiinin sitoutunut leimattu konjugaatti.

27. Patenttivaatimuksen 26 mukainen menetelmå, tunnettu siitå, etta merkkiaine valitaan ryhmås- 15 tå, joka koostuu entsyymeistå, raskasmetalleista, radio-isotoopeista ja fluoresoivista yhdisteistå.

28. Menetelma organismin solupinnoilla tai nes-teisså olevien proteiiniaineiden reseptorien detektoimi-seksi, tunnettu siita, etta 20 (a) valmistetaan vasta-aineita, jotka sitoutuvat patenttivaatimuksen 1 mukaisesti valmistettuun polypep-tidiin, joka on komplementaarinen ainakin osalle mainit-tua proteiiniainetta, ja joilla vasta-aineilla on affini-teetti proteiiniaineen reseptorien suhteen; 25 (b) viedåån mainittuja vasta-aineita organismin solupinnoille tai nesteisiin in vitro; (c) detektoidaan mainitun proteiiniaineen resep-toreihin sitoutuneiden mainittujen vasta-aineiden låsnå- olo.

29. Menetelma peptidien tai proteiiniaineiden puh- distamiseksi, tunnettu siita, etta (a) valmistetaan polypeptidi, joka on komplementaarinen ainakin osalle mainittua peptidiå tai proteiiniainetta ja joka tuotetaan patenttivaatimuksen 1, 13, 14, 35 16, 17, 18 tai 19 mukaisella menetelmållå; 108 90255 (b) kiinnitetåån mainittu polypeptidi soveltuvaan kiinteåån tai polymeeriseen kantaja-aineeseen; (c) saatetaan kantaja-aine, johon polypeptidi on sidottu, kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisåltåå pep- 5 tidia tai proteiiniainetta, jolloin mainittu peptidi tai proteiiniaine sitoutuu selektiivisesti mainittuun sidot-tuun polypeptidiin; (d) huuhdotaan sidottua polypeptidiå sisaltava kantaja-aine, johon myos peptidi tai proteiiniaine on si- 10 toutunut, liuottimella sitoutumattoman aineen poistami-seksi; (e) peståan tai eluoidaan sitoutunutta polypeptidiå sisaltava kantaja-aine, johon myos polypeptidi on sitoutunut, toisella liuottimella halutun peptidin tai 15 proteiiniaineen poistamiseksi puhtaassa muodossa liuoksen mukana. 109 90255