NO174971B - Fremgangsmåter for bestemmelse av polypetider som er komplementære til peptider eller proteiner som har en aminosyresekvens eller en nukleotidkodende sekvens som er minst delvis kjent - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for å bestemme strukturen til polypeptider som har spesielle strukturelle og biologiske aktiviteter og affiniteter.

Den systematiske konstruksjon av farmasøytiske midler har

nå nådd et punkt hvor medisinske farmakologister ofte kan forutsi aktiviteten til et spesielt farmakologisk middel ut fra kjennskap til dets struktur/funksjonsaktivitet på et kjemisk nivå. Denne kunnskap har vært spesielt nyttig i konstruksjonen av nye farmakologiske midler som er strukturelt beslektet med en mor-forbindelse, men som oppviser nye farmakologiske egenskaper eller aktiviteter.

For eksempel på området stereoid biokjemi og konstruksjon

er strukturen til diverse stereoider blitt modifisert på tallrike måter for tilveiebringelse av forsterkede eller spesialiserte aktiviteter. Et annet eksempel på systematisk drogekonstruksjon er i den medisinske kjemi hos de syntetiske penicilliner: syntetiske penicilliner er nå blitt konstruert som oppviser et antall aktiviteter som de ikke-syntetiske penicilliner ikke er i besittelse av. Disse forbedringer inkluderer en drøfting av oral aktivitet, bred-spektret aktivitet og aktivitet overfor penicillinase-produserende bakterier.

Imidlertid er det kjent relativt lite vedrørende struktur/- funksjonsaktivitetene til makromolekylære strukturer slik som proteiner. Mens det f.eks. er kjent at antistoffer binder seg til antigener, er de underliggende attraktive vekselvirkninger ufullstendig forstått. Enda mindre er kjent angående den underliggende mekanisme hos responsen til en antigenisk utfordring av å

produsere et protein, i form av et antistoff, som har evne til å binde et antigen.

Likeledes er vekselvirkningen hos peptidhormoner med deres hormonreseptorer ufullstendig forstått. Det er kjent at i både bindingsaffiniteten til peptidhormonet for sin reseptor og den iboende aktivitet hos det bundne hormon med hensyn til å

"stimulere" reseptoren, uttrykkes hormonal aktivitet. Ut fra kjente struktur/funksjons-slektskapsforhold hos ikke-protein-hormoner er det blitt postulert at bindingsaktivitet og iboende stimulerende aktivitet involverer separate strukturelle betraktninger. Visse kjemiske strukturer synes å sørge for binding av liganden, f.eks. et hormon, til dens reseptor. Atter andre

kjemiske strukturer synes å sørge for "stimulering" av reseptoren så snart hormonet er bundet til denne.

Midler som er i besittelse av bindingsaktivitet, men ikke iboende stimulerende aktivitet, er kjent som "blokkere" eller antagonister ved det at de blokkerer aktiviteten til det virkelige hormon. Et eksempel på et slikt blokkeringsmiddel er isoprotere-nol, en velkjent katekolamin-beta-blokker som ble konstruert basert på en viss kjennskap til struktur/funksjons-slektskapsforholdene mellom katakolaminer og deres reseptorer. Likeledes er agonister som både binder og aktiverer hormonale reseptorer blitt produsert. Ingen slike struktur/funksjons-slektskapsforhold er helt ut kjent for polypeptidhormonene. Således er det for tiden ingen måte hvorpå det blir mulig å foreta en nøyaktig systematisk konstruksjon av polypeptider med evne til spesifikt å vekselvirke med en spesiell proteinhormonreseptor eller med et spesielt polypeptidhormon.

Alle organismer som har et intakt immunsystem er i besittelse av den biologiske evne til å produsere en klasse av svært spesialiserte proteiner, kjent som immunoglobuliner. Immunoglobuliner produseres av spesialiserte celler i en immuno-kompetent organisme i respons til nærværet av et molekyl som er fremmed for nevnte organisme. Disse fremmede molekyler betegnes generelt antigener. Antigener blir operasjonelt definert som molekyler som har evne til å trekke ut dannelsen av et komplementært antistoff i en gitt organisme. Et spesifikt antistoff som således dannes, har evne til å binde seg til antigenet som stimulerte dets dannelse. Den biologiske funksjon av et spesifikt antistoff er å binde et fremmed antigen og således føre til dets inaktivering.

Vitenskapsmenn har lykkes i å manipulere immunsystemet til forskjellige organismer for å tilveiebringe en enorm orden av antistoffer som har vist seg nyttige både i terapeutisk og diagnostisk medisin. Nylig har vitenskapen, gjennom hybridom-teknologiens komme, utviklet en evne til å produsere monoklonale antistoffer som vil binde seg med spesifisitet til en valgt molekylstruktur betegnet determinanten. Anvendeligheten av slike spesifikke antistoffer er umåtelig stor, varierende fra nylig klinisk eksperimentering som antyder en betydelig fremtidig rolle med hensyn til å bekjempe kreft, og til en daglig klinisk rolle for antistoffer ved påvisning av tallrike sykdomstilstander gjennom undersøkelse av blodet.

Én svært interessant;men stort sett teoretisk anvendelse av antistoff-teknologi er på området anti-idiotypiske antistoffer.

Et anti-idiotypisk antistoff er et annet antistoff som har bindingsevne for idiotypen eller bindingspunktet i et første antistoff. Et slikt anti-idiotypisk antistoff oppviser trekk felles med antigenet som det første antistoff binder seg til.

Hvis man f.eks. utvikler antistoffer mot insulin og deretter fortsetter med å utvikle anti-idiotypiske antistoffer rettet mot anti-insulin-antistoffene, vil en del (idiotyp) av de anti-idiotypiske antistoffer oppvise insulin-lignende egenskaper.

Dette funn gir den teori troverdighet som går ut på at bindingspunktet til et antistoff er et tre-dimensjonalt negativt bilde av antigenet og at et anti-idiotypisk antistoff mot et første antistoff derfor er et positivt bilde av det opprinnelige antigen. Slike observasjoner antyder at hvis slike interaktive strukturer kunne konstrueres og produseres, så kunne en hel ny orden av biologisk aktive substanser, f.eks. polypeptidhormoner eller reseptorer for disse, utvikles som oppviser en bred orden av nye og nyttige aktiviteter.

Selv om antistoff-teknologi har avansert hurtig, har den fremdeles fundamentale teknologiske begrensninger. Vitenskap og medisin må f.eks. fremdeles benytte seg av en antistoff-produserende celle for å utvikle antistoffene. Derfor har vitenskapsmenn ingen direkte styring over antistoff-produksjon. En slik direkte styring ville være en svært betydelig fordel. Den ville tillate slike fremskritt som produksjon av menneske-fremstilte "antistoffer" som spesifikt kunne vekselvirke med, eller binde, ikke bare et utvalgt molekyl, men en forhåndsutvalgt del av molekylet. Den underliggende basis for den attraktive vekselvirkning mellom antistoffet og antigenet er fremdeles ufullstendig forstått.

Av den foranstående diskusjon fremgår det tydelig at antistoff-produserende celler har en mekanisme som vil fastslå

den kjemiske struktur hos et antigen og produsere en komplementært kjemisk struktur i form av et antistoff. En slik komplementaritet resulterer i en bindingsevne for den antigeniske struktur. Før foreliggende oppfinnelse ble gjort, i den hensikt å

konstruere eller formgi, en proteinstruktur som er komplementær til, og derfor har evne til å binde seg med en annen proteinstruktur, var det nødvendig med kjennskap til de kjemiske vekselvirkninger som underbygger bindingsfenomenet.

Alle proteiner eller peptider er primært polymerer av monomere aminosyreenheter. Det er generelt tyve forskjellige aminosyrer, idet hver av dem har forskjellig kjemisk struktur og således forskjellige kjemiske og fysikalske egenskaper. For eksempel er noen aminosyrer tilbøyelige til å være mer hydrofobe i natur mens andre er tilbøyelige til å være mer hydrofile av natur. Likeledes er noen aminosyrer tilbøyelige til å tiltrekke visse andre aminosyrer mens de avstøter atter andre aminosyrer. Derfor, innen ethvert gitt protein, er det en varietet av både tiltrekkende krefter og frastøtende krefter fra de enkelte aminosyrer i proteinet. I tillegg til disse interaktive krefter mellom aminosyrer i et gitt protein er det også interaktive krefter mellom aminosyrene og omgivelsene. De sistnevnte krefter er avhengig av om proteinet f.eks. beror i et vandig eller hydrofilt miljø eller i. et vannfritt eller hydrofobt miljø.

De interaktive krefter som oppvises av aminosyrene i et gitt protein er en hovedfaktor med hensyn til å bestemme den tre-dimensjonale eller "ternære", struktur for proteinet. Derfor er, ut fra ett syn, visse regioner i proteinet bindende eller tiltrekkende overfor visse andre regioner i det samme protein mens andre regioner kan være frastøtende overfor visse regioner i proteinet. Nettoresultatet er å gi hvert protein en karakteristisk form og derfor dets funksjonelle aktivitet.

Nylig er det bli.tt utviklet et hjelpemiddel for å karakterisere aminosyrer på bakgrunn av hydropati som reflekterer relativ hydrofilisitet og hydrofobisitet (Kyte et al., (1982)

J. Molec. Biol. vol. 156, s. 105-132). En hydropati-målestokk ble der utledet hvori de hydrofile og hydrofobe egenskaper for hver av de tyve aminosyre-sidekjeder ble tatt med i betraktningen. Et EDB-program ble benyttet for kontinuerlig å bestemme den gjennomsnittlige hydropati innen en polypeptidsekvens av forut-bestemt lengde. Dette studium viste at proteiner har svært distinkte regioner av hydrofobisitet og hydrofilisitet og at den intramolekylære, naturligvis i tillegg til den-interne disulfid-bindings-vekselvirkning i. slike regioner, kan utgjøre for den

tre-dimensjonale struktur hos proteinene.

Et enda nyere studium har antydet at amfifile proteinstrukturer, d.v.s. proteinstrukturer som inneholder både hydrofile og hydrofobe aminosyrer og regioner, spiller en betydelig rolle med hensyn til å opprettholde aktiviteten til både protein-hormoner og deres reseptorer (Kai.ser et al., (1984) Science vol. 223, s. 249-255). Dette studium antyder videre at amfifile strukturer i hormonreseptorer, f.eks., kunne være komplementære som et speilbilde av amfifile strukturer i selve hormonene. Derfor kunne vekselvirkningen mellom et hormon og dets reseptor bli mediert ved en spesifikk vekselvirkning mellom den amfifile struktur hos hormonet og en komplementær amfifil struktur hos reseptoren. En måte som dette konsept kan synliggjøres på, er å betrakte modellkonseptet med en lås og dens nøkkel, hvor lås-konfigurasjonen representerer den amfifile struktur hos reseptoren og konfigurasjonen med nøkkelen representerer den komplementære amfifile struktur hos hormonmidlet.

Følgelig ville et hjelpemiddel for systematisk konstruksjon av polypeptider som har evne til å binde seg eller vekselvirke med kjente peptider, proteiner eller protein-holdige reseptorer, være til stor nytte.. Eksempelvis bør praktisk kjennskap vedrørende konstruksjon av reseptor-interaktive strukturer hos proteinholdige hormoner føre til utvikling av hele nye klasser av syntetiske hormoner med større spesifisitet av aktivitet. Motsatt kunne man konstruere og produsere poly-peptider som er komplementære til kjente proteinholdige hormoner og som derfor har evne til å binde seg til disse hormoner. Slike konstruerte polypeptider kan f.eks. benyttes til å gjøre det komplementære hormon inaktivt.

Likeledes kunne slik kjennskap til protein- eller peptid-konstruksjon vise seg å være svært signifikant for mange områder av vitenskapelig forskning. Hvis f.eks. et syntetisk polypeptid som er komplementært til et proteinhormon, er strukturelt analogt med den biologiske reseptor for nevnte hormon, så skulle et antistoff som er rettet mot nevnte komplementære protein også binde seg til den egentlige hormonreseptor. Slike antistoffer ville være nyttige i studier og isolering av spesifikke hormon-reseptorer eller deler derav for derved å føre til en enda større forståelse av hormon-reseptor-vekselvirkninger. I tillegg skulle et syntetisk protein eller peptid som er komplementært til et spesielt protein være nyttig ved krystallisering av proteinet for det formål f.eks. å probe proteinstrukturen via røntgenstråle-krystallografi. Videre kunne detoksisiserende polypeptider bli konstruert for tett og spesifikt å binde seg til toksiske peptider som finnes i naturen og av og til tatt inn.

De ovenstående illustrasjoner er bare noen få av de tallrike mulige anvendelser som syntetisk protein- eller peptid-konstruksjon ville kunne åpenbare. Evnen til systematisk å konstruere et polypeptid som vil vekselvirke med eller binde seg til kjente proteiner, idet konstruksjonen er basert på strukturelle betraktninger av det kjente protein, ville klart utgjøre et vitenskapelig gjennombrudd av store proporsjoner på området peptid og/eller kjemi, og medisinsk farmakologi.

For klarhetens og konsistensens skyld defineres de følgende betegnelser med hensyn til deres generelle mening her.

Betegnelsen antiparallell, som refererer til nukleinsyre-pardannelser, indikerer en direksjonalitet med hensyn til de pardannede nukleinsyrer. Den opprinnelige nukleinsyre kan være i en 5'- til 3'-retning hvor 5' og 3' refererer til posisjoner på sukkerandelene som er involvert i nukleotidkobling. Den annen nukleinsyretråd som er base-pardannet eller komplementær til den opprinnelige nukleinsyretråd ligger i en 3'- til 5<1->retning når den er lineært innrettet med den opprinnelige tråd som har en 5'- til 3<1->direksjonalitet.

Den kodende nukleinsyre inneholder sekvensen av nukleotid-tripletter (kodoner) som spesifiserer en sekvens av aminosyrer når den leses i. en 5'- til 3'-retning. Den ikke-kodende (komplementære) nukleinsyre (eller nukleinsyretråd) er komplementær til den kodende nukleinsyre (eller nukleinsyretråd),

idet trådene ligger eller danner basepar i en antiparallell retning.

Betegnelsen hydropatisk komplementaritet, som refererer til de hydropatiske resultater (et relativt mål på hydrofilisitet og hydrofobisitet) i. aminosyrer indikerer en lav hydropati. tilsvarende en høy hydropati og vice versa.

Ved referanse til strukturer som omfatter aminosyrer, refereres de generelt til som peptider, polypeptider eller proteiner, idet denne rekkefølge betegner en økning i størrelse mellom f.eks. dipeptider, oligopeptider og proteiner som inneholder mange hundre aminosyrer.

Betegnelsen komplementær, eller komplement, anvendes her med en betydning som er basert på dens brukssammenheng. For eksempel er komplementære baser eller nukleotider slike som karakteristisk danner hydrogenbindinger (G-C og A-T eller A-U), komplementære kodoner, nukleinsyrer eller tråder derav er hydrogenbundne polynukleotid-komponenter i en dobbelt nukleinsyretråd slik som i den klassisk definerte dobbelte heliks. Komplementære aminosyrer som vanligvis har hydropatisk komplementaritet er slike som er dirigert av medlemmer av et par av komplementære kodoner.

Komplementære peptider eller polypeptider og deres beslektede op<p>rinnelige peptid eller protein er et par av peptider som er dirigert av komplementære nukleotid- eller aminosyre-sekvenser,

og har karakteristisk en bindingsaffinitet mellom medlemmer av et par. Polypeptider som er kom<p>lementære til et peptid eller minst en del av et protein, f.eks., har en bindingsaffinitet for peptid- eller proteindelen. Mens peptidbindings-affiniteter ikke forstås helt ut, kan de, delvis i det minste, forklares ved konseptet med amfifil sekundær struktur som er beskrevet av Kaiser et al., (Science (1984) vol. 223, s. 249-255).

En metode for å bestemme aminosyresekvensen i et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid

eller protein er ikke, før nå, blitt oppdaget. I ett aspekt innebærer metoden:

(a) å bestemme en første nukleotidsekvens av en første nukleinsyre som potensielt koder for biosyntesen av minst en del av det opprinnelige peptid eller protein; (b) å fastslå en annen nukleotidsekvens i en annen nukleinsyre som danner basepar med den første nukleotidsekvens i den første nuklein-syre, idet første og annen nukleinsyre danner par i

anti-parallelle retninger;

(c) å bestemme aminosyresekvensen i det komplementære polypeptid ved den annen nukleotidsekvens når den leses i samme leseramme som

den første nukleotidsekvens; og

(d) å oppnå et polypeptid som omfatter den aminosyresekvens som er bestemt i trinn c.

Dette er beskrevet i krav 1.

Det komplementære polypeptid hvis aminosyresekvens således bestemmes, kan oppnås på forskjellig måte, f.eks. ved kjemisk syntese, avledning fra et protein eller større polypeptid som inneholder nevnte aminosyresekvens, eller, hvis den annen nukleinsyre er DNA, innskytes den annen nukleotidsekvens i et plasmid for å danne en rekombinant DNA-plasmid-vektor og å transformere en encellet organisme med denne for å produsere en transformerende encellet organisme som biosyntetiserer nevnte komplementære polypeptid.

I ett aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse konstruksjon og produksjon av polypeptider med evne til spesifikt å vekselvirke med utvalgte mål-peptidstrukturer med kjent aminosyre-sekvens. Det henvises forøvrig spesielt til krav 4, 6 og 8-14.

Fig. 1 viser grafisk slektskapet mellom hydropatiske poeng

i aminosyrer som er spesifisert ved en nukleotidtråd som inneholder kodende informasjon og dens antiparallelle basepar-dannede komplementære eller ikke-kodende nukleotidtråd. Triplett-nukleotidkoden for hver tråd ble lest i 5'- til 3<1->retningen.

De hydropatiske poeng i de kodede aminosyrer avsettes mot de gjennomsnittlige hydropatiske poeng av komplementære kodede aminosyrer. Fig. 2 viser grafisk slektskapet mellom hydropatiske poeng av aminosyrer kodet av en kodende nukleotidtråd og dens antiparallelle basepar-dannede ikke-kodende nukleotidtråd. Triplett-nukleotidkoden til den kodende tråd ble lest i 5'- til 3<1->retningen, mens den for den ikke-kodende tråd ble lest i 3'-til 5'-retningen. De hydropatiske poeng av de kodede aminosyrer er avsatt mot de hydropatiske poeng av komlementært kodede aminosyrer. Fig. 3 viser grafisk bindingen av fri ACTH til mikrotiter-brønner belagt med HTCA (et komplementært peptid til ACTH) eller insulin. Bundet ACTH ble målt ved en enzym-forbundet immunoabsorbent-assay. Fig. 4 viser grafisk bindingen av ACTH til mikrotiter-brønner som hver er belagt med HTCA (3,7 nmol/brønn). Hver ACTH-tilsetning inneholdt 3,7 nmol løselig ACTH og var forhåndsblandet med de mengder av løselig HTCA som er inntegnet på abscissen. Bundet ACTH ble målt ved enzym-forbundet immunoabsorbent-assay

og fri ACTH beregnet ved differansen mellom total ACTH og bundet

ACTH.

Fig. 5 viser grafisk bindingen av antistoff for HTCA (anti-HTCA) til fikserte muse-adrenal (Y-l)-celler og inhibering

av denne binding ved ACTH.

Fig. 6 viser grafisk eluenten fra gelkromatografi av muse-adrenal (Y-l)-cellekomponenter som på forhånd var bundet til anti-HTCA. Fig. 7 viser grafisk bindingen av gamma (Y)-endorfin fra varierende mengder satt til mikrotiter-brønner belagt med: et peptid (gamma-odne) kodet av nukleotidtråden som er komplementær for bovin-gamma-endorfin, 40 yg/brønn; insulin, 20 enheter/brønn; eller bovin-serum-albumin (BSA), 200 yg/brønn. Fig. 8 viser nukleotid- og aminosyresekvenser for epidermal vekstfaktor (EGF), EGF-reseptor. Den nukleotidsekvens som er komplementær til nukleotidsekvensen for EGF-reseptor og den aminosyresekvens som kodes av den komplementære nukleotidsekvens når den leses i 3'- til 5'-retningen er også avbildet. For sekvensene av EGF- og EGF-reseptor representerer posisjonene med lavere nummerering 5<1->nukleotidretningen og den amino-terminale aminosyreretning. For sekvensene med det komplementære budskap til EGF-reseptoren representerer de lavere nummererte posisjoner 3'-nukleotidretningen og den amino-terminale aminosyreretning. Homologe sekvenser er innrammet. Figurene 9A og 9B viser visse nukleotid- og aminosyre-sekvenser av: peptidhormoner [EGF, i.nterleuki.n-2 (IL-2) og transferrin (TF)]; peptid-hormon-reseptorer [EGF-reseptor, IL-2-reseptor og TF-reseptor]; og komplementært budskap til reseptorene. For peptid-hormon- og reseptor-sekvensene representerer de lavere nummererte posisjoner 5'-nukleotidretningen og den amino-terminale aminosyreretning. For sekvensene i det komplementære budskap representerer de lavere nummererte posisjoner 3'-nukleotidretningen og den amino-terminale aminosyreretning. Det komplementære nukleotid ble lest i 3'- til 5'-retningen for å produsere den tilsvarende aminosyresekvens.

Vekselvirkningene mellom biologisk signifikante molekyler er en basis for intercellulære og i.nterorgan-kommuni.kas joner.

Når de spesielle biologisk signifikante kommuniserende molekyler f.eks. er peptid-hormoner og peptid-holdige cellulære reseptorer for disse, er det lenge blitt søkt etter en basis og rasjonell forklaring på deres kommuniserende vekselvirkninger.

Et tidligere uobservert og fundamentalt slektskap er funnet, som her beskrevet, å eksistere mellom anti-parallelle basepar-dannende tråder av nukleinsyrer. I ett aspekt kan dette slektskap gi foranledning til par av peptider hvor hvert medlem i et spesielt par har en affinitet for det annet medlem. Det grunn-leggende slektskap vises i tabell 1 hvor de forskjellige kodoner og deres komplementære (d.v.s. basepar-dannende) kodoner er presentert. Kodonene til den kodende tråd (f.eks. den tråd som inneholder den kodende informasjon som beskriver en aminosyre-sekvens) er representert som lest fra venstre mot høyre (5<1-> til 3'-retningen). Kodonene i den komplementære (d.v.s. ikke-kodende) anti-parallelle basepar-dannede tråd leses også i 5'- til 3'-retningen. Ikke-kodende og kodende nukleinsyretråder pardanner når de ligger i en anti-parallell retning (f.eks. kodende tråd fra venstre mot høyre som er 5' til 3' og ikke-kodende tråd fra venstre mot høyre som er 3' til 5') slik at de pardannede kodoner betraktes å ligge i motsatt observerbar retning (f.eks. venstre til høyre kontra høyre til venstre) når de leses i 5<1-> til 3'-retningen. De kodoner som er angitt i tabell 1 er blitt gruppert antydningsvis ved hydropati som definert av Kyte et al. Denne spesifikke gruppering anvendes for illustrerende formål.

Som det kan sees av tabell 1, oppviser de komplementære kodoner som danner par med kodoner for de hydrofobe (høy-hydropati-)aminosyrer en tendens til å kode for hydrofile (lav-hydropati-)aminosyrer. Den resiprokale situasjon er vist med kodoner av de hydrofile aminosyrer. For de svakt hydrofile aminosyrer (svakt negativ hydropati) kodes lignende aminosyrer for av de komplementære kodoner. Disse resultater er vist i grafisk form i fig. 1. Dette slektskap har stor biologisk signifikans, hvilket skal beskrives senere.

De pardannede kodoner (nukleotid—tripletter) i tabell 1 resulterer fra sammenligning av hypotetiske kodende nukleinsyretråder (RNA i dette tilfelle) og ikke-kodende nukleinsyretråder (RNA pardannet i en antiparallell retning). Begge tråder ble da lest i 5'- til 3<1->retningen og i samme leseramme for oppnåelse av de opprinnelige kodoner og deres komplementære (basepar-dannede) kodoner.

Av de 20 mulige komplementære kodoner for de hydrofobe aminosyre-kodende kodoner koder bare to (GCA og UCG) for hydrofobe aminosyrer. Av de 18 mulige komplementære kodoner for de hydrofile aminosyre-kodende kodoner kodet 13 for hydrofobe aminosyrer og 5 for svakt hydrofile aminosyrer.

Av de 20 mulige komplementære kodoner for de svakt hydrofile aminosyre-kodende kodoner kodet 10 for svakt hydrofobe aminosyrer, 5 kodet for sterkt hydrofile aminosyrer og 5 for sterkt hydrofobe aminosyrer, idet netto sammenligningseffekt var liten endring i hydropatisk karakter.

Tabell 2 gjengir de kodede aminosyrer og deres respektive komplementært kodede aminosyrer fra tabell 1 og inkluderer deres hydropatiske poeng. (Kyte et al., 1982).

Som vist i tabell 2 og grafisk illustrert i fig. 1, eksisterer et generelt slektskap som eksemplifisert ved sett av aminosyrer. For eksempel blir et første sett av aminosyrer dirigert (d.v.s. kodet for) av en første gruppe av kodoner og et annet sett (komplementært kodet) av aminosyrer dirigert av en annen gruppe av kodoner komplementært til den første gruppe av kodoner. Et slektskap mellom det første sett av aminosyrer og det annet sett av aminosyrer er funnet som kan være karakterisert som hydropati.sk inverst. I ett tilfelle blir komplementært kodede hydrofile (lav-hydropati-)aminosyrer dirigert av kodoner som er komplementære til dem som koder for de hydrofobe (høy-hydropati.-) aminosyrer. Dette slektskap kan betegnes hydropatisk komplementaritet.

Fig. 1 viser en rekke datapunkter fra tabell 2 som viser de hydropatiske poeng for aminosyrene som dirigeres av kodoner fra en kodende nukleinsyretråd kontra gjennomsnittlig hydropatiske poeng for de aminosyrer som dirigeres komplementært av kodonene fra den komplementært ikke-kodende tråd. En lineær regresjonsanalyse av disse data resulterer i en korrelasjons-koeffisient på -0,77. Et lignende mønster observeres ved beregning ved hjelp av et annet hydropatisk poengsystem som har noe annerledes verdier for tryptofan, tyrosin, glutamin og asparagin (data ikke vist, Hopp et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1981), vol. 78,

s. 3824-3828). Således har de ikke-kodende tråd-dirigerte aminosyre-hydropatiske poeng tendens til å være inverst beslektet med de kodende tråd-aminosyre-hydropatiske poeng, og dette slektskap er ikke vilkårlig og kunne finnes hos ethvert poengsystem som reflekterer aminosyreegenskaper som reflekterer hydrofobe og hydrofile tendenser, alene eller i. kombinasjon med andre fysikalske egenskaper hos aminosyrer.

Interessant nok oppstår det også et lignende slektskap når de komplementære kodoner leses i 3'- til 5<1->retningen. De kodende slektskap mellom komplementære kodoner lest i 3'- til 5'-retningen er vist i. tabell 3.

Som vist i tabell 3, av de 20 mulige kodoner som er komplementære til kodonene for hydrofobe aminosyrer, når de leses i 3'- til 5'-retningen, kodet ingen for hydrofobe aminosyrer, 16 kodet for hydrofile aminosyrer og 4 (UAU, ACA, AGG og UAC) kodet for svakt hydrofile aminosyrer.

Av de 18 mulige kodoner som er komplementære til kodonene for de sterkt hydrofile aminosyrer, lest i 3'- til 5'-retningen, kodet ingen for sterkt hydrofile aminosyrer, 16 for hydrofobe aminosyrer og 2 (UCU og UCC) for svakt hydrofile aminosyrer.

Tabell 4 angir de hydropatiske poeng for aminosyrer og

deres komplementer (d.v.s. aminosyrer som kodes komplementært eller kodes ved respektive komplementære kodoner) beskrevet i tabell 3.

Av de mulige komplementære kodoner til kodonene som koder for svakt hydrofile aminosyrer, lest i 3'- til 5'-retningen, koder 14 for svakt hydrofile aminosyrer, 2 (ACA og ACG) koder for sterkt hydrofile aminosyrer og 4 (UCG, UGU, AUA og AUG) koder for hydrofobe aminosyrer. Nettoeffekten her er liten endring i den gjennomsnittlige hydropatiske karakter hos de ikke-kodende tråd-aminosyrer.

Fig. 2 viser avsatte punkter for de hydropatiske poeng for de kodende-tråd-aminosyrer kontra de hydropatiske poeng for de ikke-kodende-tråd-aminosyrer. En lineær regresjonsanalyse av disse data resulterer i en korrelasjonskoeffisient på -0,77. Således, slik det var tilfellet for 5'- til 3'-retningen, i

3'- til 5'-retningen, er de ikke-kodende-tråd-aminosyre-hydropatiske poeng inverst beslektet med slike for den kodende tråd, og dette slektskap er ikke vilkårlig.

Disse slektskapsforhold av informasjon som inneholdes i den genetiske kode viser en hydropatisk komplementaritet for aminosyrer. Kodoner, når de leses i 5'- til 3'-retningen, for hydrofile og hydrofobe aminosyrer ble generelt komplementert av henholdsvis kodoner for hydrofobe og hydrofile aminosyrer. Den gjennomsnittlige tendens hos kodoner for "uladede" (svakt hydrofile) aminosyrer var for å være komplementert av kodoner for "uladede" aminosyrer.

Som vist ved disse observasjoner resulterer et nesten identisk mønster når det komplementære nukleotid-kodon leses i 3'- til 5'- snarere enn i 5'- til 3'-retningen. Siden det annet nukleotid av det komplementære kodon, uten hensyntagen til lese-retningen, aldri endrer seg, er dette annet nukleotid i triplett-kodonet den prinsipale determinant for den hydropatiske komplementaritet hos aminosyrer som er spesifisert ved komplementære kodoner. Dette synes i stor grad å resultere fra det faktum at overvekten (6 av 7) av hydrofile aminosyrer har adenin som sitt annet nukleotid-kodon mens det komplementære nukleotid uridin er det annet nukleotid i triplett-kodonet for de fleste (5 av 7) hydrofobe aminosyrer. Én av de to unntagelser fra ovennevnte i den hydrofobe gruppe (alanin) spolerer ikke alvorlig den ovennevnte generalitet da den har en annen base, cytosin, mens den annen base for den enkelte unntagelse i den hydrofile gruppe (arginin) har en annen base, guani.n. Derfor er det en praktisk perfekt gjensidig utveksling av hydrofobe og hydrofile aminosyrer hva enten det komplementære kodon leses i 5'- til 3'- eller 3'- til 5<1->retningen. Av de seks uladede (svakt hydrofile) aminosyrer med unntagelse av tyrosin er den annen base i de respektive kodoner enten en G eller C. Derfor vil kodonene for denne gruppe vanligvis resultere i en lignende type av aminosyrer uten hensyntagen til den retning som det komplementære kodon leses i.

Tabell 5 viser aminosyrer hvis kodoner inneholder en spesiell annen (middel-)base.

Gruppen av aminosyrer (U-gruppe) dirigert av en uridin-annen-base har en komplementært kodet gruppe av aminosyrer (A-gruppe) kodet av en adenin-annen-base, og vice versa. De cytosin- og guanin-dirigerte grupper (henholdsvis C-gruppe og G^gruppe) har samme slektskapsforhold.

Tabell 6 inneholder de hydropatiske poeng for aminosyrer dirigert av kodoner som har en spesiell annen-base og viser for lettvinthets skyld separat tilsvarende poeng for de komplementært kodede aminosyrer (komplement). Igjen er det hydropatisk komplementære slektskapsforhold illustrert.

Det kan tydelig sees av tabellene 2, 4 og 6 at peptider og deres komplementer er beslektet ved en generell inversjon av hydropatisk natur på en aminosyre ved aminosyre-basis, når sekvensene er innrettet på parallell eller antiparallell måte avhengig av utviklingsmetoden. Foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse, som vist ved benyttelse av de spesifikke kodon-slektskapsforhold som er vist i tabell 1 og tabell 3, er spesielle tilfeller av en mer generell definert metode for å utvikle komplementære peptider.

Når nukleinsyresekvenser ikke er kjent, kan de generelle metoder basert på annen-base-komplementaritet eller hydropatisk inversjon anvendes for å utvikle homologer av de spesifikt foretrukne komplementære peptider. For eksempel, når en aminosyresekvens, men ikke de spesielle kodoner for alt eller en del av et protein eller peptid er kjent, kan et komplementært peptid bli konstruert basert på de generelle slektskapsforhold som er vist i tabell 6. For en aminosyre i den opprinnelige protein- eller peptid-sekvens som har en annen-kodon-base av uridin (U-gruppe-aminosyre), er en aminosyre for A-gruppen substituert og vice versa. For en aminosyre i protein- eller peptid-sekvensen som har en annen-kodon-base av cytosin (C-gruppe), er en aminosyre fra guanidinet (G-gruppe) substituert og vice versa. Etter disse substitusjoner vil den således opp-nådde sekvens av aminosyrer være komplementær til respektive deler av det opprinnelige peptid eller protein.

Tabellene 1, 3 og 6 kan anvendes på generell måte når nukleinsyresekvensene ikke er kjent. I slike tilfeller, for en aminosyre i den opprinnelige peptid- eller proteinsekvens, er en aminosyre substituert fra det tilsvarende sett av ikke-kodende tråd-aminosyrer. Etter disse substitusjoner vil den således opp-nådde sekvens av aminosyrer være komplementær til de respektive deler av det opprinnelige peptid eller protein.

Som en ytterligere forlengelse av prinsippene i henhold til foreliggende oppfinnelse behøver den spesifikke direksjonalitet hos den komplementære aminosyresekvens ikke være kritisk. Som det er tydelig for en som er fagmann på området ved studium av hele den beskrivelse som her presenteres, kan sidestillelsen av aminosyrer i konstruksjon av komplementært polypeptid bli direksjonelt orientert på hvilken som helst av to måter.

Relativ til aminosyresekvensen som dirigerer posisjonering av aminosyrer som har spesiell hydropatisk karakter, kan de amino-terminale og karboksy-terminale direksjoner utveksles med hver-andre, idet begge konstruksjoner gir opphav til komplementære peptider. I enklere form, for ett eksempel, hvis den amino-terminale ende av en spesiell aminosyresekvens inneholder et valin (annen-kodonbase = U), så ville en komplementær aminosyre-sekvens inneholde, ved den amino-terminale ende eller den karboksy-terminale ende, en aminosyre som har en annen-kodonbase A

(LYS, ASN, ASP, GLN, GLU, HIS eller TYR), eller ved anvendelse av den generelle metode basert på tabell 6.

Den genetiske kode kan ha oppstått under utvikling som et resultat av den kjemiske likhet hos antikodoniske baser og deres respektive aminosyrer. Denne likhet resulterte kanskje i de mønstre som her er observert. En funksjonell og utviklings-messig fordel for dette fenomen kan bero på det faktum at annen-basen til kodoner for hydropatisk like aminosyrer er den samme. Før tilsynekomst av direksjonaliteten til nukleinsyre-avlesning ville kanskje en aminosyre fra den samme hydropatiske gruppe være til stede, og således ville de resulterende peptider eller proteiner være stort sett lik i. konf ormas jon, hva enten nukleinsyrer ble lest 5' til 3' eller 3' til 5'.

Foreliggende oppfinnelse vedrører, i et hovedaspekt, den oppdagelse at polypeptider som er komplementære til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein som har kjent aminosyre-sekvens eller nukleotid-kodende sekvens og har bindingsaffinitet til det opprinnelige peptid eller protein, kan konstrueres og bli. oppnådd. Hvis aminosyresekvensen til minst en del (f.eks. 4 til 5 aminosyrer) i et opprinnelig peptid eller protein er kjent, så kan informasjon om nevnte sekvens anvendes på flere måter for å bestemme konstruksjonen av et komplementært polypeptid.

En foretrukken måte å konstruere et komplementært polypeptid på benytter aminosyre-slektskapsforholdene som er oppregnet i tabell 3. Følgelig, for enhver posisjon av isoleucin i en bekreftet aminosyresekvens av hele eller en del av det opprinnelige peptid eller protein, substituer tyrosin. Som ett ytterligere eksempel, for hvert valin substituer glutamin eller histidin.

De resterende 18 aminosyrer er også substituert i henhold til de slektskapsforhold som er illustrert i tabell 3. Som vist senere her (f.eks. eksemplene 2A, 2B og 2C), nar peptid-hormon-reseptorpunkt-aminosyresekvensene benyttes som opprinnelige peptider eller proteiner, er det gitt statistisk signifikante og unike kodonretninger for deler av de peptid-hormoner som karakteristisk binder seg til disse reseptorpunkter og således er komplementære til disse. Ved videre eksaminasjon av eksemplene 2A, 2B og 2C

og også av figurene 8, 9A og 9B, er det vist at mer foretrukne substitusjoner ble gjort deri. for spesifikke aminosyrer basert på kjent nukleotidsekvens, f.eks. var serin substituert for

arginin og serin eller cystein substituert for treonin.

En annen foretrukken metode for å konstruere komplementære polypeptider innebærer bruk av de aminosyre-slektskapsforhold som er presentert i tabell 1. Følgelig leses en aminosyre-sekvens i det opprinnelige peptid, protein eller en del derav som er ønsket, ut fra den karboksy-terminale retning. Denne karboksy-terminale retning er substituert å korrespondere (d.v.s. gi retningene for aminosyreforskyvning) til den amino-terminale retning i det komplementære polypeptid. Så snart denne reversering av rekkefølge er nådd, kan substitusjoner gjøres i henhold til de aminosyre-slektskapsforhold som er vist i tabell 1. For eksempel, istedenfor hvert isoleucin substitueres et tyrosin, asparagin eller aspartinsyre. Videre substitusjoner for de andre 19 aminosyrer kan finne sted som dirigert av aminosyre-slektskapsf orholdene i tabell 1.

Som senere skal vises i eksemplene IA til 1H, når poly-peptider komplementære til gamma-endorfin og ACTH ble konstruert ved å følge en foretrukken variant av sistnevnte metode og ble oppnådd, ble det laget spesifikke aminosyre-substitusjoner basert på kjente nukleotidsekvenser. For eksempel ble for valin aspartinsyre eller histidin substituert; for leucin ble lysin eller glutaminsyre substituert; for fenylalanin - glutaminsyre; for arginin - alanin eller prolin; for lysin - leucin; for histidin - valin; for glycin - prolin eller alanin; for treonin - glycin eller arginin; for serin - glycin, arginin eller alanin; for tyrosin - valin; og for prolin - glycin eller arginin.

En annen foretrukken metode for å utvikle spesifikke sett av komplementære aminosyrer fra den generelle annen-base-gruppering er gitt nedenunder. For hver aminosyre skal det utvikles en liste av alle de mulige komplementære aminosyrer som kunne utvikles fra alle de mulige kodoner under lesning 3'-5'

og 5'-3' for den utvalgte aminosyre. Ut fra denne liste utvelges den aminosyre som opptrer hyppigst. For eksempel er det for valin 4 kodoner som kan leses i begge retninger for å utvikle et sett av mulige komplementer til valin.

Fra denne liste utvelges HIS som komplementet til VAL. Slike utvelgelser vil her bli referert som consensus-komplementer. Den følgende tabell gir utvelgelsene for hver av aminosyrene.

De som er familiære med produksjon og håndtering av peptider vil erkjenne at nærvær av en cysteinrest i en peptidsekvens kan føre til problemer med oksydasjon og dimerisering i noen situasjoner. Av slike grunner kan noen forskere ønske å erstatte cysteinrester i komplementære peptidsekvenser med en annen hydropatisk nøytral aminosyre, f.eks. serin, og slike substitusjoner er tatt med innen denne oppfinnelse.

En ytterligere foretrukken metode til å utvelge et spesifikt sett av komplementære aminosyrer fra den generelle annen-base-gruppering er å bestemme det oftest brukte (specie-spesifikke) kodon for hver aminosyre og å translatere det komplementære kodon enten 5' til 3' eller 3' til 5' (her referert til som "frekvens-baserte komplementer"). Således kan for hver aminosyre (og hver specie) to frekvens-baserte komplementære aminosyrer bli avledet og anvendt for å utvikle komplementære peptidsekvenser. Hvis et stopp-kodon (som signaliserer opphør av translasjon i celler) påtreffes i ovennevnte prosess, så kan det annet hyppigst benyttede kodon for den spesielle aminosyre bli anvendt (o.s;v.). Tabell 6B nedenunder gir de frekvens-baserte komplementer for aminosyrene under anvendelse av human-kodon-frekvenser som bestemt av Grantham et al., (Nuc. Acids. Res., 9, s. r43-r75, 1981).

En annen alternativ og foretrukken metode til å utvelge

et spesifikt sett av komplementære aminosyrer ut fra den generelle annen-base-gruppering er å bestemme det mest vanlig benyttede kodon for hver annen-base-gruppe. Siden kodonbruk-frekvens

varierer fra specie til specie kan denne løsning gi forskjellige utvelgelser for forskjellige specier. Ved anvendelse av de human-kodon-bruksfrekvenser som er utviklet av Grantham et al.,

(Nuc. Acid. Res., 9, s. r43-r75, 1981), ble de utvalgte forenklede komplementære aminosyrer i følgende tabell utviklet (nevnte komplementære aminosyrer blir her betegnet som "forenklede komplementer").

I noen tilfeller kan et peptid være selv-komplementært på grunn av spesielle trekk ved dets frekvens. En sekvens er selv-komplementær når den inneholder et inversjonspunkt i sin annen-base-sekvens. For eksempel:

Det er tydelig at dette tetrapeptid er sitt eget komplement med antiparallell orientering. Dette peptid har et antall andre antiparallelle komplementer med forskjellige sekvenser av aminosyrer som fremdeles har den samme annen-base-sekvens. Alle de antiparallelle komplementer kunne betraktes som annen-base-analoger.

Den spesielle natur av disse sekvenser kan føre til kompleksiteter for analyse av visse eksperimentelle resultater når et selv-komplementært peptid er til stede sammen med andre antiparallelle komplementer. Andre antiparallelle komplementer kunne ha egenskaper for konvensjonelle analoger (agonist- eller antagonist-effekter) eller kunne ha egenskaper som normalt assosieres med komplementer (ikke-konvensjonell antagonist og antistoffer som er konvensjonelle agonister og antagonister).

Uten hensyntagen til den detaljerte handlemåte for komplementer

i disse spesielle tilfeller kan det komplementære peptid-prinsipp anvendes for å utvikle nye molekyler med ønskelige, bioaktive egenskaper.

De komplementære polypeptider hvis sekvens ble bestemt ved en eller annen av de ovenfor beskrevne metoder basert på den opprinnelige aminosyresekvens eller nukleotidkodon-sekvensen kan så bli oppnådd ved kjemisk syntese, rettet biologisk syntese eller derivering (f.eks. ved eksisjon) fra peptider eller proteiner som inkluderer de målte aminosyre-sekvenser.

De komplementære aminosyre-slektskapsforhold som er beskrevet her tillater utforming, konstruksjon og anvendelse av mange polypeptidstrukturer omfattende aminosyre-sekvenser som er komplementære til ønskede sekvenser av aminosyrer. Den komplementære aminosyre-sekvens kan være et helt peptid eller polypeptid, som f.eks. her vist med HTCA og gamma-odne, som henholdsvis er komplementært til hele sekvensen av mål-peptidene ACTH (1-24) eller gamma-endorfin.

For spesielle formål kan et komplementært peptid bli

bundet til et større molekyl ved slike teknikker som kjemisk tverrbinding eller inkorporering i en større polypeptidstruktur. Komplementære peptider kan også bli knyttet til en fast matriks for slike anvendelser som affinitets-kromatografi.

Ved utførelsen av foreliggende oppfinnelse, spesielt når

en nukleotid-sekvens som koder for et mål-peptid er kjent, kan den bli benyttet for å dirigere aminosyre-sekvensen av komplement. I denne situasjon kan spesielle kodoner for isoleucin (AUU, AUC), leucin (UUA, CUA), treonin (ACU) eller serin (UCA), gi foranledning til komplementære kodoner som, når de leses i retningen 5<1> til 3' eller 3<1> til 5', er stopp-kodoner som koder for opphør av proteinsyntese. I denne situasjon ville annen-basen til stopp-kodonet bli anvendt for å utvelge en aminosyre av riktig hydropatisk komplementær karakter (fra de grupper som er vist i

tabellene 5 og 6). Valget fra en spesiell gruppe kan fortrinnsvis bli innsnevret ved optimalisering av hydropatisk komplementaritet. For eksempel med et ILE (+4,5 hydropatisk poeng) kodon (AUU eller UUA) kan et LYS (-3,9 hydropatisk poeng) velges fra den komplementære annen-base-A-gruppe; med et serin (-0,9 hydropatisk poeng) kodon (UCA) eller treonin (-0,9 hydropatisk poeng) kodon (AUC) kan et tryptofan (-0,9) eller serin (-0,9) velges fra annenbase-G-gruppen.

Omfanget av foreliggende oppfinnelse kan videre beskrives ved anvendelse av spesielle utførelsesformer. For eksempel er luteiniseringshormon frigjøringshormon (LH-RH) et dekapeptid hvis kodende nukleotidsekvens er ukjent, men har den aminosyresekvens som er vist i øverste linje i tabell 7.

Det er pålitelig forutsagt, basert på den kunnskap og de prinsipper som her er beskrevet, at de fleste, om ikke alle, av de komplementer som produseres ved de metoder som har til-

knytning til tabell 7, vil fremvise en affinitet for LH-RH og vise seg å være nyttige ved modulering av effektene av dette hormon.

Utvelgelsen av det eller de spesifikke komplementære peptid(er) som har de mest ønskelige biologiske eller biokjemiske egenskaper eller effekter i ethvert gitt tilfelle, vil avhenge av flere faktorer inklusive naturen av det biologiske system i hvilket det komplementære peptid skal anvendes, om det er diagnostisk eller terapeutisk nytte som er ønsket, og typen av biologisk effekt og handlemåte som forutsees for det komplementære peptid i det målrettede biologiske system. Avhengig av den ønskede effekt kan noen komplementære peptider bli foretrukket fremfor andre. Den følgende løsning antyder ett av mange mulige formgivnings-

skjemaer som kan anvendes for å utvikle komplementære peptid-sekvenser som vil gi respons i en biologisk, diagnostisk, eller fysikalsk assay i en konsentrasjon av komplementært peptid på

10 - A molar eller lavere. Denne komplementære peptidkonsentrasjon

-4

av 10 molar eller lavere (her referert til som den "minste komplementære peptidbindingsaktivitet") er en nyttig parameter ved utvelgelsé av passende komplementære peptider for bruk ved oppfinnelsen, da ut fra et praktisk standpunkt konsentrasjoner over hva som er etablert for den minste komplementære peptidbindingsaktivitet kan involvere upraktiske terapeutiske doseringer og føre til peptider hvis binding ikke er spesifikk nok til å være anvendelig for terapeutiske eller diagnostiske formål.

Den utvelgelsesløsning som beskrives i det følgende tillater fagmannen på området lett å oppnå komplementære peptider som er karakterisert ved den minste komplementære peptidbindingsaktivitet. Spesifikt, hvis nukleinsyresekvenser er kjent, så kan fire komplementære peptider bli formgitt direkte ut fra det som er åpenbart ovenfor (translatering av den komplementære nukleinsyre-sekvens enten 5' til 3' eller 3' til 5' og orientering av den påfølgende sekvens av aminosyrer enten amino-terminal til karboksy-terminal eller karboksy-terminal til amino-terminal).-Hvis ingen av disse komplementære peptider har det ønskede aktivitetsnivå, eller hvis nukleinsyresekvensen til målet ikke er kjent, så kan to komplementære peptider bli formgitt ut fra en aminosyre-målsekvens ved anvendelse av den consensus-komplement-løsning (tabell 6A) ved å orientere komplement-ami.no-syre-sekvensen enten amino-terminal til karboksy-terminal eller karboksy-terminal til amino-terminal. Hvis det ønskede aktivitetsnivå ikke er nådd, så kan fire ekstra komplementære peptider bli formgitt under anvendelse av kodonbruksfrekvens-komplement-løsningen (f.eks. tabell 6B) ved å translatere det specie-spesifikke, hyppigst anvendte kodon for hver aminosyre i mål-sekvensen til sitt 5'- til 3<1->komplement eller sitt 3'- til 5'-komplement og orientere komplement-aminosyresekvensen enten amino-terminal til karboksy-terminal eller karboksy-terminal til amino-terminal. To ytterligere komplementer kan formgis under anvendelse av den forenklede komplement-løsning (f.eks. tabell 6C) ved å identifisere den specie-spesifikke, hyppigst anvendte aminosyre for hver annen-base-gruppering, utvikle den komplementære aminosyre-sekvens på basis av annen-base-grupperingen for hver aminosyre i. mål-sekvensen og orientere komplement-aminosyre-sekvensen enten amino-terminal til karboksy-terminal eller karboksy-terminal til amino-terminal.

Det kan observeres, i. et spesielt system, at én orientering av peptidbindinger produserer mer ønskeli.ge komplementære peptider enn den annen, d.v.s. peptider som har den minste komplementære peptidbindings-aktivitet eller peptider som har et område av aktiviteter over den minste komplementære peptidbindings-aktivitet. I dette tilfelle kan forskere ønske å begrense sine anstrengelser til den mer ønskelige orientering for å forenkle ytterligere eksperimentering. I tillegg, hvis det ovennevnte formgivnings-skjerna har ført til et spesielt ønskelig komplementært peptid,

kan forskerne, noe som vanligvis gjøres, søke å finne enda mer ønskelige komplementære peptider ved selektiv utbytting av en eller flere aminosyrer i komplement-aminosyresekvensen med andre aminosyrer innen annen-base-grupperingen.

Formgivningen av aktive eller ønskelige komplementære peptider kan også bli avhjulpet ved fremstilling av en blanding av komplementære peptider, slik som man kunne oppnå i. fastfase-peptidsyntese som i en eller flere koblingsreaksjoner flere aminosyrereagenser kunne bli tilgått i ett trinn, fulgt av en gradienteluering av blandingen fra en affinitets-kromatografisk kolonne inneholdende mål-peptidet knyttet til den faste bærer. Det tettest bundne komplementære peptid vil bli eluert til sist. Strukturene av peptidene i de forskjellige elueringsfraksjoner kan bestemmes ved oppsamling av fraksjoner og sekvensering med konvensjonelle hjelpemidler. På denne måte kan mange peptider bli evaluert med et minimum av anstrengelser, og peptider som har den minste komplementære aktivitet kan lett oppnås.

En alternativ måte å bestemme ønskelige komplementære peptid-sekvenser på ville være å utvikle et sett av monoklonale antistoffer til mål-peptidet, og å sekvensere de hypervariable regioner i det gen som koder for•immunoglobulinet. Regioner av komplementaritet som finnes ved sekvensundersøkelse vil avsløre, når det er riktig sammensatt, en komplementær peptid-sekvens.

Ved formgivning av komplementære polypeptider kan de naturlige aminosyrer bli erstattet delvis eller helt ut ved analoger som har en lignende struktur eller hydropati. For eksempel kan alanin bli erstattet med a-amino-i-sosmørsyre, arginin av canavanin, aspartat av 3-hydroksyaspartat, leucin av norleucin, eller y-klorleucin, fenylalanin av 3-fenylserin eller D-fenylalanin, for å nevne bare noen få av de mange strukturelle analoger som er kjent for fagmannen på området. Anvendelsen av disse erstatninger for å konstruere et komplementært polypeptid ved en metode i henhold til foreliggende oppfinnelse er fastslått å være innen omfanget av oppfinnelsen.

Peptider som er komplementære til alle eller deler av naturlige hormoner kan anvendes for å utvikle antistoffer som gjenkjenner og binder hormonreseptorene. Disse antistoffer har egenskaper tilhørende anti-idiotypiske antistoffer til hormonet og kan derved bli anvendt for å rense reseptorer, for å stimulere den biologiske'respons som normalt assosieres med hormonet, eller å antagonisere effekten av det naturlige hormon. Den biologiske respons som skyldes antistoff av et peptid som er komplementært til et hormon, styres delvis ved den måte på hvilken en spesiell antistoff-produserende celle presenteres med antigenet (komplementært peptid). Visse presentasjoner kan være foretrukket, avhengig av den type respons som ønskes.

Generelt kobles peptider til bærersubstrater, f.eks. store proteiner, når de anvendes for å utvikle antistoffer. Et utvalg av koblingsteknologier er kjent for fagmannen på området. Den type kobling som anvendes kan påvirke presentasjonen av komplementære peptid-antigener.

Avhengig av typen av immunisering, in vitro eller in vivo, kan diverse andre additiver (adjuvanter) bli kombinert med antigenet selv for å moderere immun-respons. Slike adjuvanter kan også innvirke på presentasjonen av komplementære peptid-antigener .

Antistoffer som tas fra dyreserum er polykloniske, hvilket betyr at de er en blanding av antistoffer som produseres av et antall sett av celler. Når dyr immuniseres med komplementære peptider, vil et undersett av de totale antistoffer binde seg til det komplementære peptid og til reseptoren av molekylet fra hvilket det komplementære peptid ble avledet. Dette undersett, også sammensatt av et antall typer av antistoffer, kan separeres fra andre antistoffer ved konvensjonell affinitets-kromatografi.

Dette rensede undersett av antistoffer kalles vanligvis mono-spesifikt. Mono-spesifikke antistoffer til et komplementært peptid kan anvendes for å rense reseptorer, for å utføre diagnostiske assays for reseptorer, eller for å moderere biologisk respons.

De mono-spesifikke antistoffer kan betraktes som det sett

av antistoffer som resulterer fra presentasjonen av antigen i et utvalg av konformasjoner. Siden peptid-antigenene er noe fleksible, kan de anta mange forskjellige konformasjoner eller tre-dimensjonale strukturer. Kver av disse konformasjoner kunne resultere i utvikling av litt forskjellige antistoffer, hvorav alle er medlemmer av det mono-spesifikke sett.

Anvendelse av monoklonale teknikker som er velkjente på området gjør det mulig å produsere store mengder av et spesielt antistoff av det mono-spesifikke sett. Slike monoklonale antistoffer kunne klassifiseres med hensyn på sin evne til å binde seg sterkt til komplementært peptid eller reseptor, for å produsere biologiske responser lik det molekyl fra hvilket det komplementære peptid ble avledet, eller for å inhibere den biologiske respons. Således vil det være mulig å utvelge den type respons som ønskes.

Komplementære peptider kan anvendes i kombinasjon med adjuvanter for å utvikle vaksiner. På denne måte kan immun-systemet til en organisme anvendes for å moderere den biologiske respons for dets hormonsystemer. Presentasjonen av antigen kan kreve spesielle modifikasjoner for å sikre den høyeste populasjon av antistoffer som gir den ønskede biologiske respons. Forskjellige peptider som er komplementære til et spesielt bioaktivt peptid kan gi forskjellig biologisk respons etter vaksinasjon

på grunn av forskjeller i deres tre-dimensjonale konformasjoner.

De komplementære peptider som foreliggende oppfinnelse befatter seg med, kan være komplementære til små peptider eller deler av proteiner. Disse komplementære peptider kan benyttes meget, da antistoffer for tiden ofte benyttes. For eksempel kan et polypeptid bli fremstilt som komplementært til en spesiell del av et protein-holdig antigen med unik celleoverflate som karakteriserer et spesielt neoplasma. Et slikt komplementært polypeptid kan bli kjemisk koblet til mange materialer av interesse som f.eks.: et biologisk eller kjemisk toksin, f.eks. ricin-A-kjede eller cis-platina-forbindelser; en radio-opak substans som f.eks. et tungmetall; en radio-isotop; eller en fluorescerende forbindelse, for å nevne bare noen få av de mange mulige merkinger eller substanser av interesse. Polypeptid-material-konjugaten ville spesifikt binde seg til neoplasmaet og levere et toksin eller en merking til dette. Droge-utleveringssystemer slik som liposomer, bionedbrytbare polymerer eller andre innkapslende substanser av interesse kan ha spesifikke pendante komplementære polypeptider for utlevering til et spesielt punkt.

Komplementære polypeptider kan benyttes for å nøytralisere aktiviteten til spesielle substanser ved binding, f.eks. til et peptid-hormon, det katalytiske punkt på et enzym eller et peptid-holdig toksin. Hormonreseptorer kan gjøres inaktive (ved en antagonist) eller aktiveres (ved en agonist) ved administrering av polypeptider som er komplementære til et protein-holdig segment i disse reseptorer.

Polypeptider som er komplementære til de aktive punkter i spesielle enzymer bør vise seg å være farmakologi.sk effektive.

For eksempel kan mange diabetikere dra nytte av administrering av et polypeptid som er komplementært til de katalytiske punkter i de insulin-deaktiverende enzymer glutation-insulin-transhydro-genase og/eller den protease som betegnes insulinase.

Mange hypertensive individer kan hjelpes ved interferering med angiotensin-systemet gjennom anvendelse av metoder i henhold til foreliggende oppfinnelse for å formgi og produsere peptider som er komplementære til minst en del av angiotensinogen, angiotensin I og/eller angiotensin II.

På området endokrinologi kan polypeptider som er komplementære til minst en del av et hormon bli anvendt for å nedsette eller lindre hormon-biologisk aktivitet. For eksempel synes i Graves 1 sykdom (eksoftalmisk gikt) en hyperfunksjon av skjold-bruskkjertelen å være involvert. Polypeptider som er komplementære til thyrotropin-frigjørende hormon (THR) eller til 3-subenheten av thyroid-stimulerende hormon (TSH eller thyrotropin) ville binde seg til disse hormoner og forenkle deaktivering av skjold-bruskkjertelen.

Blant mulige anvendelser for foreliggende oppfinnelse er forenklingen av blodgruppe-identifisering. Over 100 forskjellige blodgruppe-antigener er til stede på erytrocytt-overflater for å skjelne 14 vel-definerte genetisk uavhengige menneskeblodgruppe-systemer. Disse antigene grupper er vanligvis identifisert ved erytrocytt-agglutinering med antistoffer til spesifikke antigener. Polypeptider som er komplementære til spesifikke blodgruppe-antigener kan anvendes istedenfor antistoffer for blodtype-bestemmelsesformål. Polypeptider som er komplementære til en aminosyre-sekvens som inneholdes i et spesielt blodgruppe-

antigen kan modifiseres til å bli minst toverdig ved tverrbinding med slike midler som glutaraldehyd, eller kan kobles til fluorescerende farvestoffer eller radioisotoper. Komplementære poly-peptider med den tidligere modifikasjon ville agglutinere erytrocytter som har det mål-dannede blodgruppe-antigen. De fluorescerende eller radioisotop-modifiserte komplementære polypeptider ville binde seg til og merke erytrocytter som inneholder det mål-dannede blodgruppe-antigen.

Analogt kunne peptider som er komplementære til 3~kjeden

av korionisk gonadotropin, en graviditets-spesifikk komponent i biologiske fluider, bli benyttet, ved påsetting av en slik merking som f.eks. en fluorescerende farvestoff-radioisotop eller et enzym som gir kromoforisk målbare produkter, for å forenkle

graviditets-tester ved midler som er veletablert på dette område.

En nøkkel til mange viktige aspekter ved immun-systemet beror på kjennskap av T-celleaktivering av antigen som binder seg til T-cellereseptoren. T-cellereseptor-proteinene og, i 1984,

de gener som koder for begge proteiner, ble klonet, isolert og definert (Science V25 p859 og Science V25 pl065). Ved anvendelse av de metoder som er beskrevet ved foreliggende oppfinnelse, kan peptider som er komplementære til forskjellige segmenter i T-cellereseptoren bli fremstilt og T-celle-aktiveringsmekanismer systematisk undersøkt. Allergisk respons er velkjent for å involvere immunoglobulin E (IgE) mediering. Peptider som er komplementære til segmenter av IgE eller proteiner som inneholder peptid-sekvenser som er komplementære til IgE kan være til stor hjelp med hensyn til å gjøre IgE-medierte allergisymptomer lettere.

Destruksjonen av kollagen, hoved-strukturproteinet i det menneskelige legeme, under inflammasjon, er viktig i patogenese av en vert av sykdomstilstander. Aktivert kollagenase, et hydrolytisk lysosomalt metalloenzym, angriper kollagen proteolytisk i initieringen av patologiske tilstander. Polypeptider som er komplementære til det katalytiske punkt i kollagenase bør være kollagenase-aktiverende midler. På grunn av det faktum at pattedyr-kollagenase hydrolyserer kollagen av nativ type I ved bare ett spesielt punkt i hver polypeptidkjede, kan et polypeptid som er komplementært til den samme region av kollagen av nativ type I bli anvendt for å beskytte nevnte kollagen mot kollagenase-indusert nedbrytning.

Polypeptider som er komplementære til toksiske peptider eller proteiner tjener, når de administreres riktig,in vivo eller in vitro for å binde seg til nevnte materialer og redusere eller lindre deres toksisitet.

Fremgangsmåter og preparater som anvender de her beskrevne komplementære peptider, eller antistoffer til disse, tilbys også for behandling av sykdommer som assosieres med overproduksjon eller underproduksjon av en proteinholdig substans og for terapi hvor en økning eller senkning av den biologiske respons som forårsakes av en proteinholdig substans er nyttig. Spesielt omfatter disse terapeutiske preparater effektive mengder av de komplementære peptider eller antistoffer til disse i blanding med farmasøytisk akseptable bærere. Spesielt vil farmasøytiske preparater som inneholder de her beskrevne komplementære polypeptider, eller antistoffer til disse, som aktiv ingrediens, normalt bli blandet sammen med en passende fast eller flytende bærer, avhengig av den spesielle administreringsmåte som skal anvendes. For eksempel er parenterale blandinger vanligvis injiserbare fluider som anvender farmasøytisk og fysiologisk akseptable fluider, f.eks. fysiologisk saltløsning, balanserte saltløsninger, eller lignende, som vehikkel. Orale preparater kan på en annen side være faste, f.eks. som tabletter eller kapsler, eller flytende løsninger eller suspensjoner.

Signifikansen av slektskapsforhold mellom pardannelse av nukleotid-triplett-kodonsekvenser av nukleinsyrer er belyst ved studier vedrørende de funksjonelle aktiviteter og innbyrdes slektskapsforhold hos spesifikke polypeptider. De følgende eksempler inkluderes heri for å demonstrere de spesielle foretrukne utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse.

Eksempel IA

ADRENOCORTOCOTROPISK HORMON (ACTH,

FRAGMENT INNEHOLDENDE AMINOSYRER 1-24)

OG UTFORMING OG OPPNÅELSE AV DETS

KOMPLEMENTÆRE POLYPEPTID (HTCA, 1-24)

Syntetisk ACTH, fragment 1-24 ble skaffet fra Organon (West Orange, NJ). Den primære struktur for m-RNA (budbringer-RNA) som koder for ACTH (1-24) ble skaffet fra Nakanishi et al., (Nature (1979) vol. 278, s. 423-427) og er vist i tabell 8.

Over m-RNA-sekvensen er den tilsvarende aminosyre-sekvens for ACTH (1-24) vist. Når m-RNA ble basepar-dannet i antiparallell retning, ble resultatet den riktige komplementære nukleotid-sekvens (c-RNA) som er vist (snudd parallell mot m-RNA) i tabell 8. Under c-RNA-sekvensen er aminosyre-sekvensen til HTCA vist, idet det komplementære polypeptid til ACTH (1-24) resulterer fra lesning av c-RNA-sekvensen i retning 5<1> til 3' .

Et polypeptid som har aminosyresekvensen til HTCA som er vist ovenfor ble syntetisert for oss av Peninsula Laboratories (San Carlos CA).

Eksempel IB

BINDING AV ACTH (1-24) TIL DETS

KOMPLEMENTÆRE POLYPEPTID HTCA (1-24)

De metoder som generelt er beskrevet av Johnson et al., (J.Immunol (1982) vol. 129, s. 2357-1359 ble benyttet for å demonstrere bindingsaffiniteten hos de komplementære peptider ACTH og HTCA. Fra 1 til 25 mikrogram (ug) pr. brønn av HTCA

eller insulin i karbonat/bikarbonat-beleggspuffer ble satt til 96 brønners rund-bunnede mikrotiterplater og inkubert ved 4°C i 8 timer. Platene ble så vasket med fosfatpufret saltvann (PBS)-Tween 20 (Sigma Chem. Co., St.Louis, MO)-puffer.

Til de insulin-belagte brønner og til noen av de HTCA-belagte brønner ble det tilsatt 10 ug syntetisk ACTH (1-24) i PBS-Tween-puffer). Kontrollbrønner (HTCA alene) inneholdt bare PBS-Tween. Platene ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer og deretter vasket 3 ganger med PBS-Tween-puffer. Kanin-antisera rettet mot amidet av syntetisk ACTH 1-13 (Accurate Biochemicals, Westbury N.Y.) ble satt til hver brønn, og platene ble inkubert

i 1 time ved romtemperatur. Etter 3 vaskinger med PBS-Tween-puf f er, ble alkalisk fosfatase-konjugert geite-antikanin-Ig G (Miles Laboratories, Elkharbt, IN) i PBS-Tween-puffer (1:300 fortynning) tilsatt. Etter inokulering ved romtemperatur il time ble platene vasket 3 ganger med PBS-Tween-puffer, og hver brønn ble behandlet med 200 ul av p-nitrofenylfosfat (1 mg/ml i karbonat/bikarbonat-puffer) i 1,5 time ved romtemperatur. Den enzymatiske reaksjon ble så stoppet ved tilsetning av 50 ul av 3N NaOH til hver brønn, og den optiske absorbans av p-nitrofenol,det alkaliske fosfataseprodukt, ble målt ved 405 nm.

Det ACTH som var bundet til de belagte mikrotiterbrønner ble

I TC/ / I

målt ved denne enzym-forbundne immunoabsorbent-assay (ELISA).

Resultatene fra dette forsøk er vist i fig. 3. Syntetisk ACTH (1-24) er buridet av HTCA-belagte mikrotiterbrønner, men ikke

av insulin-belagte mikrotiterbrønner. Det antistoff som er spesifikt for ACTH (1-13 amid) binder seg ikke til belegget av HTCA, og heller ikke binder ACTH seg til belegget av insulin.

Den molare mengde av ACTH som var bundet, var direkte proporsjonal med konsentrasjonen av HTCA-belegg, hvilket antyder en 1:1-

binding av de to peptider (data-analyse ikke vist).

En mikrotiterplate ble preparert og behandlet generelt som beskrevet ovenfor, men ble belagt med 3,7 nmol/brønn HTCA. Til hver belagte brønn ble det tilsatt en løsning av 3,7 nmol ACTH kombinert med de mengder av HTCA som er angitt på abscissen i fig. 4.

Da ACTH-bindingen ble vurdert ved hjelp av en ELISA, viste det seg at ca. 90% av ACTH-HTCA-binding var spesifikk. En Scatchard-analyse (ikke vist) av dataene fra fig,. 4 viste et enkelt, ensartet bindingspunkt med en Kd på 1,9 mikromolar, sammenlignbar med den affinitet som vises av et antistoff/antigen-kompleks.

Eksempel lc

Binding av I<125>ACTH til 3'-5' H<TCA>

Ved å benytte den komplementære RNA (cRNA)sekvens som

er vist i tabell 8 i eksempel 1A, men ved å lese cRNA i retning 3■ til 5', ble følgende aminosyresekvens oppnådd og det respektive peptid (3'-5' HTCA) kjemisk syntetisert: H2N-Arg-met-Arg-Tyr-Leu-Val-Lys-Ala-Thr-Pro-Phe-Gly-His-Pro-Phe-Phe-Ala-Ala-Gly-His-Phe-His-Met-Gly-COOH.

Ved å benytte teknikker som beskrevet i eksempel 1B, ble polyvinyl-mikrotiterbrønner belagt med 3'-5' HTCA fra en 1mM løsning derav eller med BSA.

De brønner som var belagt med BSA og 3'-5' HTCA ble vas-

ket og deretter behandlet med én av tre l<øs>ninger av I <A>CT<H >(1-39) (New England Nuclear Boston, MA) som hadde forskjellige konsentrasjoner. Etter en 45 minutters inkubasjonsperiode ble løsningen fjernet og mikrotiterbrønnene vasket grundig. Mikro-titerbrønnene ble separert og jod<125->innholdet bestemt i en Beckman Gamma 5500 gamma-teller. Resultatene fra disse manipulasjoner er vist i tabell 9. Bundet <125>I-ACTH ble målt dobbelt i tre konsentrasjoner i fravær og nærvær av overskudd av umerket ACTH.

Som vist av dataene i tabell 9, binder <1>25I-ACTH seg til belagt 3'-5 HTCA, men ikke til belagt BSA, et velkjent protein med en bred bindingskapasitet. Bindingen av <125>I-ACTH til 3'-5' HTCA-belagte mikrotiterbrønner inhiberes ved nærvær av overskudd av fri ACTH. Dette resultat viser både affiniteten hos et komplementært peptid til et opprinnelig peptid og det faktum at slike komplementære polypeptider kan formgis og oppnås ved å lese sekvensen av komplementære nukleinsyre-kodoner i retningen 3' til 5' og kjemisk syntetiseres ved således rettede peptid.

EKSEMPEL ID

1 25

Binding av I-ACTH til komponent-peptid-sekvenser av HTCA

Ved å benytte cRNA-sekvensen og HTCA-sekvensen som vist

i tabell 8 i eksempel 1A, ble en serie av peptider som hadde en karboksyterminal del av HTCA-aminosyren syntetisert. En pentamer (5-mer) inneholdt aminosyresekvensen: H2N-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. En dekamer (10-mer) inneholdt aminosyresekvensen: H2N-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Et 20-tall-leddet peptid (20-mer) inneholdt aminosyresekvensen: ^N-His-Arg-Ala-Pro-leu-Leu-Ala-His-Arg-Leu-Ala-Pro-Ala-Glu-Val-Phe-His-Gly-Val-Arg-COOH. Hvert av disse peptider ble anvendt for

å belegge mikrotiterbrønner, og de belagte brønner ble testet på evne til å binde <125> I-ACTH som i beskrevet i eksempel 1C. Resultatene fra disse manipulasjoner er vist i tabell 10.

Som vist av dataene i tabell 10, oppviser alle peptidene fra HTCA-sekvensen evnene til å binde 1 25 I-ATCH.

EKSEMPEL 1E

HTCA med reversert direksjonalitet og binding

av <125>I-ACTH (1-39) til dette

En 2 4-mer HTCA variant (R-HTCA) med reversert aminosyre-sekvensdireksjonalitet (amino-terminale og karboksyterminale ender reversert) ble syntetisert og hadde følgende sekvens: H2N-Arg-Val-Gly-His-Phe-Val-Glu-Ala-Pro-Ala-Leu-Arg-His-Ala-Leu-Leu-Pro-Ala-Arg-His-Leu-His-Val-Gly-COOH. De brønnbeleggende og 1 25I-ATCH-bindende prosesser ble utført som beskrevet i eksempel 1-C, og de resulterende data er vist i tabell 11.

Som vist i tabell 11, har R-HTCA-polypeptidet, som er komplementært til ACTH, en signifikant affinitet for ACTH. Dette oppviser enda et annet aspekt ved foreliggende oppfinnelse,

den reverserte direksjonalitet som her spesifikt er testet, tillater en ytterligere variasjon i utformingen av polypeptider der hvor et optimalt sett av kjemiske, fysikalske og biologiske effekter kan søkes for en spesiell omstendighet eller anvendelse. Hvis HTCA forstås å ha en aminosyresekvens som er antiparallell med ACTH-sekvensen, så er R-HTCA-sekvensen parallell med ACTH aminosyresekvensen. Således har både parallelle og antiparallelle peptider eller polypeptider som er komplementære til en opprinnelig eller mål-aminosyresekvens effektivt affiniteter for disse. Komplementariteten eller affiniteten hos et komplementært polypeptid til et opprinnelig peptid eller protein bevares, uten hensyntagen til den aminoterminale og karboksy-

terminale direksjonalitet hos nevnte komplementære polypeptid.

EKSEMPEL 1F

FREMSTILLING OG EGENSKAPER AV ANTISTOFF MOT HTCA

En antigenisk form av HTCA ble fremstilt ved å koble

200 ug HTCA til 200 ug nøkkelhull-limpet-hemocyanin (KLH) med 6,7 mM glutaraldehyd i henhold til metodene til Avrameas et al (Immunochemistry (1969) Vol. 6, sidene 53 - 66). Overskudd av glutaraldehyd ble fjernet fra HTCA-KLH-konjugatet ved passasje gjennom en Bio-Rad P-10 kolonne (Bio-Rad, Richmond, CA).

Tre injeksjoner, inneholdende 25ug HTCA-KLH i 0,5 ml komplett Freunds adjuvant, ble administrert til en kanin med to ukers intervaller. Totalt immunoglobulin fra det resulterende kanin-antiserum ble isolert ved immunoaffinitetskromato-grafi på en kolonne av Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sverige) koblet til anti-kanin-immunoglobulin. For

å rense anti-HTCA-antistoffet, ble KLH-antistoff fjernet fra det totale immunoglobulin ved passasje gjennom en kolonne av Sepharose 4B koblet til KLH. En 1:300 fortynning av det rensede antistoffpreparat (anti-HTCA) ville påvise minst 100 ng av HTCA i en indirekte ELISA.

En induksjon av glukokortikoid-hormon-produksjon ved ACTH og anti-HTCA ble funnet hos dyrkede pattedyrceller. Dup-likatkulturer av muse-adrenal-tumor (Y-1)-celler i mikrotiterplater ble behandlet med dyrkningsmedier, ACTH (10 mikroenheter/brønn) eller varierende fortynninger av anti-HTCA. Resultatene fra dette forsøk er vist i tabell 12.

<a>duplikatkulturer av muse-adrenal (Y-1)-celler i mikrotiterplater ble behandlet med dyrkningsmedier, ACTH (10 mikroenheter/ brønn) eller de indikerte fortynninger av antistoff mot HTCA. Etter 18 h inkubering ved 37°C i 4% C02 ble replikatkulturer oppsamlet og analysert med hensyn på glukokortikoid-hormon-produksjon ved en radio-immunoassay (RIA) for kortikosteron (Smith et al, Science (1982), Vol. 218, s. 1311 - 1312).

<b>Parallell-doseresponser for eksperimentelle prøver og kortikosteron-standarden ble oppnådd over et tidobbelt område. Interassay-variasjon var 8,8%.

<c>Ikke utført

Aktiveringen av muse-adrenal-tumorcelle ACTH-reseptoren ved anti-HTCA indikerer en konfigurasjonal analogi med antistoffet og ACTH. Hverken normalt kaninserum eller antistoff mot KLH forårsaket en stereoidogenisk respons (data ikke vist). Aktivering av reseptorer for insulin (Sege et al., Proe. Nat'1. Aca. Sei. (1978) og for beta-adrenergiske midler (Schreiber

et al, Proe. Nat'1. Acad. Sei. (1980), Vol. 77, s. 7385 - 7389) ved anti-idiotypiske antistoffer utviklet mot antistoffer for insulin eller beta-adrenergiske midler er beskrevet. Således eksisterer et slektskap av analogi mellom komplementære peptid-ligander og anti-idiotypiske antistoffer.

EKSEMPEL 1G

Binding av anti-HTCA til muse-adrenal-tumor (Y-1)-celler

Muse-adrenal-tumor (Y-1)-celler ble fiksert ved glutaraldehyd i flatbunnede brønner i en mikrotiterplate. De fikserte celler ble så behandlet med kanin-anti-KLH eller kanin-anti-HTCA alene eller i nærvær av flere nivåer av ACTH. Etter vasking ble mikrotiterbrønnene behandlet med geite-antistoff til kanin-immunoglobulin, idet geiteantistoffet ble koblet til enzymet alkalisk fosfatase. Etter å ha vasket bort ubundet antistoff-fosfatase-kompleks, ble p-nitrofenylfosfat tilsatt, og den enzymavhengige utvikling av absorbans ved 405 nM ble overvåket. Som vist i fig. 5, blokkerte ACTH binding av anti-HTCA på doseavhengig måte. ACTH og anti-HTCA viste seg å være konkurransedyktige for samme bindingspunkt på muse-adrenal-tumor (Y-1)-cellene. Kanin-anti-KLH hadde ingen effekt (skygge-lagt region).

EKSEMPEL 1H

Rensing av 'ACTH-reseptor

Renset anti-HTCA ble kovalent koblet til cyanogenbromid-aktivert Sepharose 4B. Tilnærmet 10 muse-adrenal-tumor(Y-1)-celler ble ultralydbehandlet i 5 min. ved 40 KHz (Branson E

Module Bath Sonicator) i nærvær av 2mM fenylmetylsulfonylfluo-

rid. Etter fjerning av celledebris ved sentrifugering ble supernatantfluidet ført gjennom en kromatografisk kolonne inneholdende Sepharose 4B koblet til anti-HTCA. Etter intens vas-

king ble det resterende bindingsmateriale eluert fra kolonnen med 0,1M glycin, pH 2,0. Det eluerte materiale ble nøytrali-

sert og konsentrert ved dialyse mot tørr polyetylenglykol. Det konsentrerte materiale ble deretter underkastet gelkromatografi på en kalibrert kolonne av Sephacryl S-200 (Pharmacia, Fine Chemicals, Uppsala, Sverige). Alikvoter av gelkromatografi-fraksjonene ble analysert med hensyn på ACTH-reseptor-aktivitet ved en radio-reseptor-prosess. Kort sagt involverte denne prosess inkubering av de ovennevnte alikvoter i 96-brønners polyvinylplater i 18 h, fulgt av fjerning av ubundne materialer ved vasking. Radio-jodert ACTH (<125>I-ACTH, 70 mikrocurie/Mg,

New England Nuclear, Boston, MA) ble deretter satt til brønnene

i nærvær eller fravær av et umerket ACTH-overskudd (10 (ag/brønn). Platene ble deretter vasket grundig, og brønnene ble tatt ut

fra platen og malt med hensyn på <1>25I-ACTH med en Beckman Gamma 5500 gamma-teller. De kromatografiske fraksjoner ble også overvåket med hensyn på absorbans ved 280 nM. Resultatene fra dette eksempel er vist i fig. 6.

125

Spesifikt bundet I-ACTH ble funnet ved a subtrahere

den radioaktivitet som er bundet i nærvær av overskudd av umer-

ket ACTH (generelt mindre enn 10%) fra radioaktivitet bundet i fravær av umerket ACTH. Elueringspunktene for 158 kilodalton (K), 67K, 45K og 14,4K molekylvektstandardene er indikert ved piler.

ACTH-reseptoraktiviteten hadde en molekylvekt på ca. 80 til 100K, hvilket var lik det som tidligere er rapportert for en ACTH-reseptor identifisert ved en fotoaffinitetsmerke-teknikk (Ramachandran et al., Proe. Nat'1. Acad. Sei. (1980), Vol. 77, s. 3697-3970).

Den metode som er beskrevet i dette eksempel viser en generell metode i henhold til oppfinnelsen for oppnåelse av komponenter av ethvert peptid eller protein-ligand-reseptorpunkt. Et polypeptid som er komplementært til minst en del av peptidet eller proteinet tilveiebringes først. Et antistoff mot nevnte komplementære polypeptid fremstilles så. Antistoffet kobles deretter på kjemisk eller adsorptiv måte til en fast matriks. En reseptorholdig prøve behandles deretter med den antistoffkoblede matriks for spesifikt å binde komponenter i reseptorpunktet. Endelig elueres de bundne komponenter.

EKSEMPEL 11

Gamma-endorfin, utforming og oppnåelse

av dets komplementære polypeptid

For ytterligere å illustrere den generelle anvendelighet og signifikans ved foreliggende oppfinnelse ble et annet par av interaktive komplementære peptider studert. Posisjoner 104 til 120 av aminosyresekvensen til bovin-gamma-endorfin-forløper og mRNA-sekvens som koder for denne, ble vist av Nakanishi et al., (Nature(1979), Vol. 278, s. 423-427). Tabell 13 viser denne gamma-endorfin-aminosyresekvens (betegnet endo) og tilsvarende m-RNA-sekvens. Den komplementære streng av RNA (c-RNA) som basepardanner i antiparallell retning med m-RNA for gamma-endo er vist under m-RNA, cRNA er vist i tabell 5 parallell med m-RNA. Polypeptidet (gamma-odne) hvis sekvens er innrettet ved leting av c-RNA i retning 5' til 3' er vist under c-RNA (betegnet gamma-odne).

Et polypeptid med aminosyresekvensen til gamma-odne ble syntetisert for oss av Peninsula Laboratories (San Carlos, CA).

EKSEMPEL 1J

Egenskaper ved Gamma (y)-odne, det polypeptid som

er komplementært til gamma-endorfin (y-endo)

Syntetisk bovin-gamma-endorfin ble skaffet fra Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN), og kanin-antistoff for syntetisk gamma-endo ble skaffet fra Accurate Biochemicals (Westbury,

NY) .

Brønnene i en 96-brønners rundbunnet mikrotiterplate

ble belagt (ved den metode som er beskrevet i eksempel 1B)

med gamma-odne (40 pg/brønn), insulin (20U/brønn) eller bovin-serum-albumin (BSA, 200 ug/brønn). Varierende konsentrasjoner av gamma-endorf in (som vist på absissen i fig. 7) ble inkubert i de belagte brønner i 1h, hvoretter platene ble vasket 3 ganger med PBS-Tween puffer. Brønnene ble deretter behandlet med kanin-antistoff for gamma-endorfin, vasket og deretter behandlet med geite-antistoff mot kanin-immunoglobulin, idet geiteantistoffet var konjugert til alkalisk fosfatase. Etter å ha vasket bort ubundet geite-antistoffkonjugat ble den bundne alkaliske fosfataseaktivitet målt med p-nitrofenylfosfat som beskrevet tidligere. Resultatene for de ovenstående manipulasjoner er vist i fig. 7 hvor graden av absorbans ved 405 nM reflekterer graden av gamma-endorfin som binder seg til brønner som er belagt med gamma-odne, insulin eller BSA. Det var tydelig at gamma-endorfin bandt seg signifikant til det fikserte gamma-odne sammenlignet med dets binding til fiksert insulin eller BSA. Det skyggelagte område i fig. 7 representerer graden av gamma-endorfin som binder seg i nærvær av løselig overskudd av gamma-odne. Således er det vist at et annet par av komplementære peptider vekselvirker på en måte som viser affinitet og tilsynelatende kongruens.

EKSEMPEL 1K

Generell anvendelighet for

produksjon av komplementære polypeptider Resultatene fra eksemplene 1A til 1J viser spesielle anvendelser av en generell metode for utforming og oppnåelse

av polypeptider som er komplementære for proteiner eller peptider med i det minste delvis kjent nukleotidkodende sekvens.

For eksempel kan den komplementære nukleotidsekvens som koder for et polypeptid som er komplementært til minst en del av det første protein eller peptid ved lesning i retningen 5.'. til 3' være DNA. Nevnte DNA kan bli innskutt i et plasmid for å danne en rekombinant DNA-overføringsvektor. En encelle-organisme, passende en bakteriegjær eller pattedyrcelle, kan så

bli transformert med den rekombinante DNA-vektor for å produsere en transformant encelle-organisme som biosyntetiserer nevnte komplementære polypeptid. Teknikkene for slike innskudd og transformasjoner er velkjente på de relevante fagområder.

Teknikker med hensyn til kjemisk polypeptid-syntese ut fra aminosyrer, såvel som metoder for oppnåelse av polypeptider, f.eks. ved proteolytisk utsnitting fra proteiner som har en større aminosyresekvens, men inneholder den komplementære aminosyresekvens som er ønsket, er også kjent. Således er det til-gjengelig mange måter å oppnå polypeptider på som er komplementære til peptid eller proteinligand.

EKSEMPEL IL

Blokking av stress-respons hos mus ved et peptid som

er komplementært til adrenokortikotropisk hormon (ACTH)

I respons til diverse stress-faktorer produserer de adrenokortikotropisk hormon (ACTH), som virker på adrenal-celler for å produsere forhøyede serumnivåer av kortikosteron. For å teste effektiviteten til inhiberingen av aktivitet av ACTH

in vivo ved et komplementært peptid, HTCA (se eksempel 1A),

ble det følgende sett av eksperimenter utført. Mus (BALC/c) ble injisert med det komplementære peptid HTCA, holdt i et tidsrom, stresset, hodene ble hugget av, og serum-kortikosteron-nivåer ble bestemt ved konvensjonell immunoassay.

I det første eksperiment ble 1 mg HTCA oppløst i PBS (fosfatpufret saltvann) injisert i 8 sett av 3 BALB/c mus hver. To sett av 3 BALB/c mus ble injisert bare med PBS. Middel-kortikosteron-nivåene til hvert sett av mus ble bestemt etter varierende forsinkelse- og stress-regimer. Resultatene er vist i tabell 14, hvor stress er en 3 0 sekunders neddypping i isvann.

Den maksimale effekt som ble observert, ca. en 50% reduk-sjon i serum-kortikosteron, inntraff med stress som inntraff 2 timer etter intramuskulær injeksjon av 1 mg HTCA. I et annet eksperiment ble varierende mengder av HTCA injisert (IM) i sett av 3 BALB/c mus. Musene ble holdt i 2 timer og stresset med neddypping i isvann. Tabell 15 viser middel-serum-kortikosteron-nivåene for de forskjellige sett av mus.

Kombinert viser disse eksperimenter evnen hos et peptid

som er komplementært til ACTH med hensyn til å senke kortikosteron-responsen hos mus.

EKSEMPLE 1M

1 25

Blokking av binding av I-beta-endorfin til NG108-15 celler

ved et peptid som er komplementært til gamma-endorfin NG108-15-celler er kjent for å inneholde reseptorer for beta-endorfin kalt opiat-reseptorer. I tillegg til beta-endorfin, binder gamma-endorfin og flere analoge av beta-endorfin seg til disse opiat-reseptorer. Peptidet, gamma-ODNE, komplementært til gamma-endorfin som er beskrevet i eksempel II,

ble undersøkt med hensyn på sin evne til å inhibere

binding av <125>I-beta-endorfin til opiat-reseptor på NG108-15-celler. Gamma-endorfin er et fragment av det større peptid beta-endorfin.

I separate eksperimenter ble den spesifikke binding

125

av I-beta-endorfin til NG108-15-celler utplatet i mikrotiter-brønner bestemt ved konkurranse med umerket beta-endorfin. 70% av den totale binding var spesifikk ved konvensjonelle kriterier.

1 25

For dette eksperiment ble I-beta-endorfin pre-inkubert

i 30 minutter med varierende mengder av det komplementære peptid, gamma-ODNE, før en 30 minutters (37°C) inkubering med NG108-15-celler i mikrotiterbrønner. Etter inkuberingen ble cellene vasket tre ganger og celle-assosiert radiaktivitet bestemt med en Packard Multi-Prias gamma-teller. Tabell 16 viser evnen hos gamma-ODNE til a inhibere binding av <1>25I-beta-endorfin (10<_11>M, 2000 Cl/mmol) til NG108-15-celler.

EKSEMPEL IN

Induksjon av katatonier hos mus ved antistoffer

til et peptid som er komplementært til gamma-endorfin

Det er velkjent at store doser av opiat-lignende substanser kan indusere en katatonisk tilstand hos dyr som inhiberes eller reverseres ved behandling med opiat-antagonisten naloxon. I analogi med resultatene i tidligere eksempler, ble evnen hos et peptid (gamma-ODNE) komplementært til et opiat-peptid, gamma-endorf in, til å indusere antistoffer som har opiategenskaper, undersøkt.

Gamma-ODNE (eksempel II) ble konjugert til Keyhole Limpet Hemocyanin (KLN) og anvendt sammen med Freunds adjuvant for

å utvikle kanin-antistoffer på konvensjonell måte (se eksempel 1F). Både normal og indusert kaninserum ble injisert intra-cerebroventikulært (i.c.) til hun-ICR-mus. Injeksjon av 50 p.1 av normalt kaninserum (fortynnet 1:100) resulterte i ingen

induksjon av opiat-lignende katatonier. Injeksjon av 50 /xl av komplementært peptid (gamma-ODNE) indusert kaninserum (fortynnet 1:100) resulterte i en utmerket induksjon av katatonia, som ble reversert ved den samtidige i.c.-injeksjon 0,2 mg av opiat-antagonisten naloxon.

Disse resultater viser evnen hos et antistoff til et komplementært peptid til et opiat til selv å vise opiat-aktivitet.

EKSEMPEL 10

Antigenisk slektskapsforhold mellom to peptider

som er komplementære til adrenokortikotropisk hormon (ACTH)

To peptider som er komplementære til ACTH, beskrevet

i Eksemplene 1B og 1C som HTCA og 3'-5' HTCA, ble hvert koblet til Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) med glutaraldehyd (1 mg peptid, 1 mg KLH, 30 mM glutaraldehyd i 30 min ved romtemperatur fulgt av dialyse) for å fremstille antigener for kanin-immunisering. To kaniner ble injisert separat med 250 ug av peptid-KLH-antigener ukentlig i 4 uker. Av hver kanin ble det tatt blodprøve to ganger i uken i 3 uker etter siste injeksjon. Antistoffer som representerer det totale immunoglobulin fra serum fra hver kanin ble renset ved utfelling fra serum med 50% mettet ammoniumsulfat ved 4°C fulgt av standard ione-byttekromatografi på en DEAE-kolonne.

For å undersøke bindingen av hvert av immunoglobulinene til hvert av peptidene ble det utført enzymforbundne immunosor-bans-assays. I disse assays ble ett av de komplementære peptider belagt på polykarbonatplater i en karbonatbelegningspuffer ved pH 9,0 natten over. Ubundet peptid ble fjernet ved vasking tre ganger med fosfatpufret saltvann (PBS) - Tween 20. Varierende mengder av immunoglobuliner ble satt til peptidbelagte brønner i PBS-TWEEN 20 løsning og inkubert i én time. Ubundet immunoglobulin ble fjernet ved vasking med PBS-TWEEN 20. Til hver brønn ble det tilsatt en 1:300 fortynning av geite-anti-kanin-IgG koblet til alkalisk fosfatase-enzym..

Etter én time ble brønnene vasket med PBS-TWEEN 20 for fjerning av ubundne sekundære antistoffer. Mengden av gjenværende sekundært antistoff ble bestemt ved å omsette p-nitrofenylfosfat med det gjenværende alkaliske fosfatase-enzym i 15 minutter, stoppe, reaksjonen med 3M NaOH, og måle nitrofenol produsert spektrofotometrisk ved 4 90 nm.

Tabell 17 viser resultatene fra denne assay. Ikke vist er tre kontrollprøver (ACTH-plater + immunisert kanin-immunoglobulin, HTCA-plater + normalt kanin-immunoglobulin og 3'-

5' HTCA-plater + normalt kanin-immunoglobul) hvorav alle viste mindre enn 0,01 absorbans i assayen.

Disse resultater viser at antistoffer til ett komplementært peptid gjenkjenner og binder seg til et annet komplementært peptid. Således er de to komplementære peptider antigenisk beslektet selv om deres sekvenser har bare én posisjon hvor den samme aminosyre forekom i den samme absolutte posisjon .

EKSEMPEL 1P

Idiotype:Anti-idiotype slektskap mellom antistoffer til adrenokortikotropisk hormon (ACTH) og antistoffer

til et peptid komplementært til ACTH

Ved anvendelse av en standard radio-immunoassay (RIA) for ACTH (Immuno Nuclear Corporation, CAT, #2400). ble evnen hos antistoffer til et peptid (HTCA) komplementært til ACTH til å binde seg med antistoffer til ACTH bestemt. I en standard RIA for ACTH tilsettes umerket ACTH i kjente mengder til en løsning av radiomerket ACTH og antistoff til ACTH for å konkurrere bort bindingen av radiomerket ACTH til dets antistoff. Mengden av radiomerking som er bundet bestemmes ved immunoutfelling av antistoffet-og.telling av radioaktiviteten til utfellingsproduktet.

I eksperimentet ble umerket ACTH, immunoglobulin fra kaniner immunisert med det komplementære peptid HTCA, og immuno-globulinet fra normale kaniner anvendt for å konkurrere med radiomerket ACTH i RIA. Immunoglobulin (35 mg/ml)-løsninger ble fremstilt i fosfatpufret saltvann, og ACTH og <125>I-ACTH

ble tillaget som spesifisert i RIA-pakken. Tabell 18 gir resultatene fra denne konkurranseassay.

Disse resultater viser at antistoffer til et peptid som

er komplementært til ACTH gjenkjenner og binder seg til antistoffet til ACTH og definerer således et idiotype:anti-idiotype-slektskap mellom antistoffene.

EKSEMPEL 10

In vivo-aktivitet hos antistoffer til et peptid som er komplementært til adrenokortikotropisk hormon (ACTH)

utviklet ved dyrevaksinasjon

Et peptid komplementært til ACTH (se HTCA eksempel 1A)

ble konjugert til Keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) under anvendelse av den prosess som er beskrevet i eksempel 10. Tre BALB/c-

mus pr. tidspunkt ble immunisert (100 ug konjugert/0,2 ml komplett Freunds adjuvans på dag 0 injisert intraperitonealt og subkutant, 100 ug konjugat/0,2 ml ukomplett Freunds adjuvans ved uker 1, 2, 3 og 4 injisert intraperitonealt og subkutant). Fire kaniner ble immunisert (300 ug konjugert/1,0 ml komplett Freunds adjuvans injisert på dag 0, 200 ug konjugat/1,0 ml ukomplett Freunds adjuvans injisert på dagene 10, 20, 30, 40

og 60.

Ved hvert tidspunkt i muse-eksperimentet ble tre mus av-livet, blodet oppsamlet og tillatt å klumpe seg, og deres antistofftitere ble bestemt ved den følgende fastfase-radio-immuno-assay (RIA). HTCA ble belagt i brønner av en polyvinylmikro-titerplate fra løsning (0,25 mg/ml). Brønnene ble vasket med fosfatpufret saltvann (PBS) inneholdende TWEEN 20, og serum i 1:5 seriefortynninger ble tilsatt. Etter én time ble 125I-kanin-anti-mus-immunoglobulin tilsatt og brønnene vasket med PBS-TWEEN 2 0 for fjerning av ubundet radiomerking. Brønnene

ble gjennomstukket og tellet for bestemmelse av titerne. For musestudiet er titer definert som den serumfortynning som produserer 100 tellinger pr. minutt over bakgrunnsaktiviteten. Også ved hvert tidspunkt ble serum analysert ved hjelp av kommersiell RIA med hensyn på kortikosteron-nivåer.

Ved hvert tidspunkt i kanin-eksperimentet ble 2 ml blod tatt ut, tillatt å klumpe seg og ble frosset inntil analysering. Antistofftitere ble bestemt ved en enzymforbundet immunosorbant-assay (ELISA) som følger. HTCA ble belagt ut fra en 0,25 mg/ml løsning på brønner av en polykarbonatplate natten over. Brøn-nene ble så vasket og serum tilsatt i 1:5 seriefortynninger. Etter én time ble geite-antikanin-immunoglobulin konjugert med alkalisk fosfatase (1:300 fortynning) tilsatt. I løpet av én time ble brønnene vasket med PBS-TWEEN 20. p-nitrofenolfosfat-substrat ble tilsatt og fikk reagere i 15 min før bråkjøling

méd 3M NaOH. Titere ble bestemt spektrofotometrisk ved absorbans ved 490 nm. For kaninstudiet er titer definert som den serumfortynning som produserer en absorbans på 0,05 (bakgrunnen lik 0,01). Også ved hvert tidspunkt ble serum analysert ved kommersiell RIA med hensyn på kortikosteron-nivåer.

Tabellene 19 og 2 0 presenterer resultater fra disse eksperimenter på grunnlag av antistoff til HTCA-titere og serum-kortikosteron-nivåer som prosent av kontroller (dyr immunisert med KLH alene og tatt blodprøve av etter samme plan som dem som får HTCA).

I muse-eksperimentet av kortikosteron-nivåer for kontroll-prøvene nær det normale med unntagelse av for det siste tidspunkt som var forhøyet til ca. 3 ganger det normale. Kortikosteron-nivået hos kontrollkaniner var under det normale og falt mellom dagene 0 og 3 0 og gjenvant seg til det normale nivå ved dag 60.

I begge eksperimenter ble en oppblomstring av hormonlig-nende (ACTH) respons utviklet og ble fulgt med en generell ned-gang i respons. Disse eksperimenter viser evnen hos komplementært peptid-antigen til å moderere hormon-respons in vivo ved

å stimulere antistoffproduksjon med reseptorbindingsaktivitet. Det ble ikke gjort noen anstrengelser for å endre antigenpresen-tasjon for produksjonen av enten agonistiske eller antagonistiske antistoffer slik som kunne være ønskelig i andre situasjoner.

EKSEMPEL IR

Potensiell diagnostisk assay for adrenokortikotropisk hormon (ACTH( basert på binding av komplementært peptid Potensialet for anvendelse av peptid som er komplementært til ACTH, spesifikt HTCA fra eksempel 1A, ved bestemmelse av ACTH-nivåer i serum ble undersøkt ved anvendelse av en fastfase-radiobindings-assay.

Komplementært peptid (HTCA) ble oppløst i fosfatpufret saltvann (PBS) ved 1 mg/ml og 200 ul alikvoter ble anbragt i brønner i en 96-brønners polyvinylassayplate (Microtest III, Falcon Cat. #3911). HTCA ble tillatt å belegge brønnene natten over ved 4°C. Belegningsløsningen ble fjernet, og brønnene

1 25

ble vasket tre ganger med PBS. Radiomerket ACTH ( I-ACTH, New England Nuclear NEX-65) ble fortynnet i PBS som inneholdt 0,0005% TWEEN-20 slik at det leverte 50 pg (eller ca. 30 000 cpm) i et 20 ul volum.

Serumprøver ble tillaget i en 96-brønners vevkulturplate ved seriefortynning av serum inn i PBS/TWEEN 20 slik at man fikk et sluttvolum på 180 ul/brønn. Serumprøvene ble deretter overført til den HTCA-belagte assay-plate og tillatt å inkubere.

125

■Endelig ble 20 ul av I-ACTH-løsning tilsatt, inkubert og hele prøven av 200 ul fjernet. Etter vasking tre ganger med PBS ble brønnene skåret ut fra platen og tellet i en gamma-teller. Ikke-spesifikk binding ble bestemt ved å tilsette 5 ug av umerket ACTH til noen av prøvene før overføring av dem til assay-platen.

Serumprøver som ble anvendt i dette studium inneholdt enten 50 pg/ml eller 500 pg/ml av ACTH tilsatt til føtalt kal-veserum (FCS).

Dataene i tabell 21 viser prosent inhibering av spesifikk <125>I-ACTH-binding som funksjon av serumfortynning for begge prøver.

Total spesifikk binding i denne assay ble bestemt til 1000 tellinger pr. minutt og, basert på spesifikk aktivitet,

er 50% spesifikk binding ekvivalent med 0,85 pg av ACTH i en serumfortynning.

For prøven med 50 pg/ml serum, som bestemt ved kommer-sielle radio-immuno-assay-teknikker, inntraff 50% inhibering ved en Log^Q fortynning på -1,1 (bestemt ved grafisk interpolering). Således måler denne assay serumprøven som 54 pg/ml,

i god overensstemmelse med standardmetoder.

Ved grafisk interpolering inntraff 50% inhibering for prøven med 500 pg/ml serum ved en Log^Q-fortynning på -2,0, som forventet.

Disse resultater viser muligheten av å utvikle diagnostiske assays basert på komplementær peptidbinding.

EKSEMPEL IS

Sammenligning av binding av <125>I-adrenokortikotropisk

hormon til 5'-3' og 3'-5' komplementære peptider

En fastfase-bindings-assay ble anvendt for å bestemme

muligheten hos både 5'-til-3'- og 3'-til-5'- komplementære-RNA-streng-peptider (se eksemplene 1A og 1C) for å binde 1 25I-ACTH. Peptidene ble fortynnet i fosfat-pufret saltvann (14 0 mM-NaCl/ 3mM-KCl/0,1% NaN3/20 mM-fosfatpuffer, pH 7,4) til 2mg/ml, og 0,2 ml/brønn ble anbragt i polyvinylklorid-mikro-titerplater (Becton and Dickinson, Oxnard, CA, USA). Etter 18 h ved 4°C ble ubundet peptid fjernet ved vasking tre ganger med fosfat-

pufret saltvann inneholdende 0,1% bovin-serum-albumin (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo, USA). 12<5>I-ACTH ble fortynnet til varierende konsentrasjoner med fosfatpufret saltvann inneholdende 0,1% bovin-serum-albumin og inkubert i peptid-belagte brønner i 60 minutter ved 4°C. Til noen brønner ble det tilsatt varierende konsentrasjoner av løselige peptider i tillegg til 1 25I-ACTH for å vise spesifisiteten ved binding. Etter inkubering ble ubundet radiomerkning vasket ut med fosfatpufret saltvann inneholdende 0,1% bovin-serum-albumin, og radioaktiviteten til enkeltbrønner ble målt ved gamma-strålingstelling. Mengden av spesifikt bundet radioaktivitet ble bestemt ved å blokkere 1 25 I-ACTH-binding med umerket ACTH. Ytterligere kontrollprø-ver inkuberte belegning av brønner med insulin eller bovin-serum-albumin (2 mg/ml) før tilsetning av 1 25I-ACTH.

I disse eksperimenter inntraff halv-maksimal binding av 1 25

I-ACTH ved 0,3 mM ACTH for begge komplementære peptider.

Mer enn 84% binding ble funnet å være spesifikk, og mindre enn

5% binding til komplementære peptidplater ble observert for insulin eller bovin-serum-albuminplater. Begge komplementære peptider, når de var tilstede i løsning, konkurrerte i lik ut-strekning om å blokkere <1>25I-ACTH som bindes til deres respektive sorberte motstykker.

Disse data viser at for ACTH-systemet er 5'-3' og 3'-5'komplementære peptider er like effektive med hensyn til å binde

ACTH.

EKSEMPEL 2A

HOMOLOGIER MELLOM PEPTIDHORMONER OG POLY-PEPTIDER KODET AV REVERST-LESTE NUKLEINSYRER KOMPLEMENTÆRE TIL NYKLEINSYRER

SOM KODER FOR PEPTID-HORMON-RESEPTOR-PROTEINENE

Subtile, men signifikante funksjonelle og strukturelle slektskapsforhold eksisterer mellom peptider som på kodende måte er spesifisert ved komplementære strenger av nukleinsyrer. Dette slektskap ble reflektert ved avlesning av den komplementære nukleinsyre i den normalt transkriberte 5' til 3'-retning (se for eksempel tabell 1, fig. 1 og eksempler 1A til 1H).

Når de komplementære nukleinsyrer leses i motsatt retning,

dvs. 3' til 5', er unike slektskapsforhold mellom de resulterende kodede aminosyresekvenser likeledes synlig som vist i de følgende eksempler.

EKSEMPEL 2B

EPIDERMAL VEKSTFAKTOR (EGF), EGF-RESEPTOR OG

KOMPLEMENTÆRT BUDSKAP TIL EGF-RESEPTOREN

Aminosyresekvensen til EGF og dens kodende nukleotid (mRNA)-sekvens er vist i fig. 8, tatt fra Gray et al., (Nature (London, 1983), Vol. 303, s. 722) og Scott et al., (Science

(1983), Vol. 221, s. 236). Også vist i fig. 8 er en partiell aminosyresekvens og partiell kodende nukleotidsekvens (c-DNA)

for EGF-reseptor, hentet fra Ulrich et al. (Nature London, 1984), Vol. 309, s. 418).

Den siste kolonne i fig. 8 viser nukleotid (RNA)-sekvensen som komplementær til RNA-sekvensen som koder for EGF-reseptoren. En antiparallell base-pardannende innretting av EGF-reseptor-nukleotidsekvensen og den komplementære nukleotidsekvens ble antatt. Den komplementære nukleotidsekvens ble lest i samme leseramme som den kodende sekvens, men i retning 3' til 5'.

Den kodede aminosyresekvens som er vist over den komplementære nukleotidsekvens ble således oppnådd. XXX-kodonet symboliserer terminering. Når de aminoterminale retninger i aminosyresekvensene som er vist i fig. 8 er i den nedre nummererte retning, viser det seg to homologe regioner (innrammet) av det EGF-reseptor-komplementære polypeptid og EGF. Hele EGF-reseptor-komplementær-sekvensen (ikke vist) ble analysert slik at man fikk. bare disse to komplementære aminosyreregioner. EGF-aminosyre-sekvenser 11-16 og 24-29 viste seg å være homologe med aminosyresekvenser 111-116 og 149 - 154 respektive kodet ved nukleotidsekvensen som er komplementær til den i EGF-receptoren.

Som vist i fig. 8, med de to homologe reioner i EGF bestå-ende av 6 aminosyrer, er 5 aminosyrer identiske i hver sekvens (83% homologi). Videre, hos nukleotidsekvensene er det henholdsvis 67 og 78% nukleotidhomologi mellom de to regioner, idet det meste av nukleotiddifferansene ikke innvirker på de kodede aminosyrer (f.eks. tredje base-endringer). De to homologe aminosyreregioner inkluderer tilnærmet 2 3% av den totale EGF-aminosyresekvens (12 av 53 rester), og homologien er så slående at det er høyst usannsynlig at den representerer noe som inntreffer vilkårlig. En ikke-vilkårlig basis for denne aminosyrehomologi er sterkt understøttet av den observasjon at når sekvensene ASP-GLY-TYR-X-LEU-ASN og GLU-SER-LEU-X-SER-TYR (hvor X er hvilken som helst aminosyre) ble klassifisert mot 3060 proteiner i pro-teinsekvensbanken i National Biomedical Research Foundation (NBRF), inneholdt bare EGF disse sekvenser. Proteinsekvens-databasen til National Biomedical Research Foundation som ble undersøkt var SIAO: (Blomquist) NEW. PRO: 80 file. I alt ble 3060 proteinsekvenser undersøkt, hvilket inkluderte 616 748 test-segmenter av 6 aminosyrer i lengde eller 619 803 test-segmenter av 5 aminosyrer i lengde. For ikke å la undersøkelsen etter homologe sekvenser helle i retning av differanse mellom ligand- og reseptorkomplementsekvensene, ble enhver aminosyre (X) akseptert som passende til. Således var undersøkelsen etter homologe sekvenser ikke begrenset til de spesifikke ligand- eller reseptor-komplementsekvenser som er vist i fig. 2, men snarere tillatt enhver aminosyresubstitusjon ved posisjoner av differanse. Av 616 748 segmenter av 6 aminosyrer i lengde som ble testet på homologi, inneholdt bare EGF en eller annen av disse sekvenser. Derfor reflekterer slektskapet mellom disse spesielle aminosyre-sekvenser et signifikant slektskap mellom EGF og dens reseptor.

EKSEMPEL 2C

STATISTISK SIGNIFIKANS AV AMINOSYRE- OG NUKLEOTID-HOMOLOGIER

MELLOM PEPTIDHORMONER OG POLYPEPTIDER KODET AV NUKLEOTIDSEKVENSER SOM ER KOMPLEMENTÆRE TIL NUKLEOTIDSEKVENSER

SOM KODER FOR PROTEINER I PEPTIDHORMON-RESEPTORENE

Den statistiske signifikans av homologi mellom hvilke

som helst to nukleotidsekvenser ble bestemt ved å beregne P a-verdier, som er sannsynlighetene for at en spesiell homologi inntraff tilfeldigvis. Den anvendte ligning var en summering av Poisson-fordelingen.

hvor N er lengden av nukleotider i den homologe sekvens, i er antall tilpasninger over sekvensen, og p er sannsynligheten for at ethvert gitt nukleotid vil passe. For ideell vilkårlighet

er p = 0,25 hvis det ikke er noen preferanse for ethvert nukleotid ved enhver posisjon. For å bestemme om det var noe signifikant avvik fra vilkårlighet ble p-verdier bestemt empirisk for alle tre reseptorer. I det aktuelle tilfelle var p-verdier alltid mellom 0,25 og 0,27, og derfor antok vi for enkelhets skyld p = 0,25 for beregning av Pa-verdiene. For N = 18 og N = 15 i sekvenser med ideell vilkårlighet er antall nukleotid-tilpasninger (i) henholdvis 4,5 og 3,75. For å bestemme avviket fra vilkårlighet av reseptor-sekvensene for N = 18 og N = 15, ble i-verdier bestemt empirisk for hver reseptor og funnet å være henholdsvis 4,75 (1,41) og 3,88 (1,45). For å bli ansett statistisk signifikant måtte i-verdier være større enn to standardavvik fra gjennomsnittet (dvs. i 7,57 for N = 18 og i 6,78 for N = 15). Således ble Pa-verdier 4,63 x 10~<2> for N = 18

_o

eller 4,87 x 10 for N = 15 ansett statistisk signifikant.

_2

Pa-verdier som var mindre enn eller lik 4,6 3 x 10 for 18 nu-_2

kleotider og 4,87 x 10 for 15 nukleotider, ble bestemt empirisk å være statistisk signifikante. Fig. 9A viser at nukleo-tidsekvenshomologiene mellom EGF og de to EGF-receptor-komple-_3 menter har beregnede Pa-verdier pa henholdsvis 1,60 x 10 og 1,78 x 10 -4. Således er homologiene mellom disse sekvenser sterkt signifikante, med antall basetilpasninger som er større enn 5 standardavvik fra middeltallene for ideell vilkårlighet.

I ytterligere analyser, utført generelt i henhold til metoden fra eksemepl 2B, ble slektskapsforholdene mellom andre peptidhormoner og deres reseptorer og reseptor-komplementær-polypeptider belyst.

Aminosyre- og nukleotidsekvensene som er vist i fig. 9B ble oppnådd fra følgende kilder: Interleukin -2 (IL-2) fra Taniguchi et al (Nature (Landon, 1984) Vol. 302, s. 305) og Devos et al (Nucl. Acid. Res.

(1983) Vol. VII, s. 4307).

Interleukin -2 Receptor (IL-2 Receptor) fra Nikaido et

al (Nature (London, 1984) Vol. 311, s. 631).

Transferrin (TF) fra Yang et al (Proe. Nat'1. Acad. Sei.

(1984) Vol. 81, s. 2752.

Transferrin Receptor (TF Receptor) fra Schneider et al (Nature (London, 1984) Vol. 311, s. 675).

Som vist i fig. 9A og 9B, ble det funnet resultater lik dem som ble funnet hos EGF-systemet, når IL-2 og TF ble under-søkt på homologi med sine tilsvarende reseptor-komplementer. For IL-2 ble det funnet to homologe regioner av 6 og 5 aminosyrer (fig. 9A) med henholdsvis 83 og 80% aminosyrehomologi. Dessuten var nukleotidhomologien mellom de to sekvenser (henholdsvis 61 og 67%) sterkt signifikant (henholdsvis Pa = 4,26

-3 -3

x 10 og 3,56 x 10 ). Begge aminosyresekvenser (LEU-GLU-X-LEU-LEU-LÉU og TYR-ARG-MET-X-LEU, hvor X er enhver aminosyre) ble klassifisert på homologier med 3060 proteiner i NBRF-sekvensbanken.

For 616 748 test-segmenter av 6 aminosyrer i lengde ble bare 7 proteiner, inklusive IL-2 funnet å ha homologi med LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU. Da sekvensen LEU-GLU-X-LEU-LEU-LEU (hvor

X er hvilken som helst aminosyre) ble klassifisert på homologier mot 616 748 test-segmenter av 6 aminosyrer i lengde, inneholdt 7 proteiner homologe sekvenser. Disse inkluderte human-IL-2, human- og muse-Ig-alfa-tung kjede, arabinose-operon-regulerende protein fra E. coli og S. typhimurium gen k-protein av OX-174 og protein 4 fra Aspergillus amstelodami mitochondria. Imidlertid inneholdt bare ett protein (ILr-2) komplett homologi med IL-2 hvor X=HIS og bare ett protein (protein 4 fra Aspergillus amstelodami mitochondria) inneholdt komplett homologi med IL-2-reseptor-komplement hvor X=THR. Da sekvensen TYR-ARG-MET-X-LEU ble klassifisert mot 619 803 segmenter av 5 aminosyrer i lengde, inneholdt bare IL-2 og hemoglobin-alfa-kjeden til den Sør-Afrikanske frosk ("toad") homologe sekvenser. Sett sammen ble de to homologe sekvenser funnet å være unikt assosiert med IL-2.

For TF og dets reseptorkomplement var det mange regioner av signifikant sekvenshomologi, men det skal bemerkes at pga. plassbegrensninger er ikke alle homologiregioner vist. De re-presentative sekvenser som er vist i fig. 9B har minst 53% nukleotidhomologi og har Pa-verdier under dem som anses statistisk signifikante. Da aminosyresekvensene ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU

og GLU-PHE-X-LEU-PHE-SER (hvor X er hvilken som helst aminosyre) ble klassifisert med hensyn på homologier mot 3060 proteiner i NBRF-sekvensbanken, inneholdt bare TF begge sekvenser. Sistnevnte sekvens ble bare funnet i transferrin mens ILE-PRO-X-GLY-LEU-LEU ble funnet i transferrin, laktotransferrin og bare

tre ubeslektede proteiner (bakteriell tryptofan-syntase, E. coli colicin El immunitetsprotein og influenza C hemagglutinin-forløper).

EKSEMPEL 2D

Av de resultater som er presentert i eksempel 2C kan det være liten tvil om at nukleotidsekvensene for ligander og reseptorer inneholder sterkt signifikante regioner av komplementaritet. På det nåværende tidspunkt var disse de eneste ligand-reseptor-par for hvilke de komplette aminosyre- og nukleotidsekvenser var kjent. Således understøtter alle de tilgjengelige sekvensdata den hypotese at reseptor- og ligand-bindingspunkter kunne ha utviklet seg fra komplementære tråder av nukleinsyrer.

Det er flere observasjoner som støtter den idé at de komplementære regioner som her er vist faktisk kan kode for aminosyre-sekvenser i bindingsproduktet til reseptoren. For det første ble de komplementære nukleotidsekvenser alltid påvist i den del av reseptoren som er utvendig på den cytoplasmiske membran. For eksempel var de to homologe sekvenser som ble påvist i EGF-reseptor-komplementet i den 100 000 dalton-eksterne domene (den domene som binder EGF i reseptoren) mens ingen homologi ble påvist i den 60 000 dalton-cytoplasmiske domene (den domene som har protein-kinase-aktivitet). Dette funn var også tilfelle for IL-2- og TF-reseptorsekvensene, siden i alle tilfeller homologier var i den eksterne del som bidrar til ligand-binding. For det annet, for liganden, nærmer deres størrelse (5-6 aminsyrer)

seg hva man kunne forvente for å fylle et komplett reseptor-

punkt hvis man anvendte antistoffkombinerende punkter f.eks.

som vist av Nisonoff et al. (The Antibody Molecule (Academic Press, N.Y. 1984) s. 29 -39). Disse sekvenser synes å repre-sentere bindingspunkter, hvorav ett ville være forventet å være på hvert kontaktpunkt mellom reseptoren og liganden. For det tredje, og hva som er av størst betydning, er det demonstrert,

som tidligere beskrevet heri, at hormonene ACTH og gamma-endorfin binder seg med høy affinitet til syntetisk avledede peptider som kodes av RNA som er komplementær til den respektive hormon-mRNA. Denne observasjon viser at aminosyresekvenser som er komplementære til et peptid faktisk binder nevnte peptid, og derfor må den sekvens som er komplementær til peptidet inneholde et reseptorlignende bindingspunkt. Videre var det "syntetiske"

bindingspunkt for ACTH antigenisk beslektet med en ACTH-adrenal-celle-reseptor. I alt indikerer disse observasjoner at peptid-reseptor-bindingspunktene når alt kommer til alt kan bli avledet fra komplementære tråder av nukleinsyre.

Hvis protein-proteinbindings-vekselvirkninger som utvikler fra komplementære tråder av nukleinsyrer viser seg å være et så generelt fenomen i biologi som tenkt, er det mange potensielle anvendelser for denne idé. For eksempel ville kjennskap til ligand-sekvenser gjøre det lett å rense og karakterisere reseptorer under anvendelse av lignende metodologi som hva som tidligere er beskrevet her. Verdifull informasjon vedrørende ligand-konformasjoner i bindingspunktomgivelser kan oppnås ved å konstruere veldefinerte ligand-"bindingspunkt<l>,-par. Endelig vil kjenneskap til bindingspunktsekvensene for reseptor-ligandpar tillate konstruksjon av små, veldefinerte reseptor-agonister, og/eller antagonister som er verdifulle for manipulering av biologiske responser. Disse funn kan også være viktige ved undersøkelse og forståelse av differensiering og embryogenese. For eksempel kunne alene transkripsjon av en DNA-sekvens ved

én celle og dens komplement ved en annen tillate cellulær gjen-kjennelse og kommunikasjon via de resulterende peptider eller proteiner som øver vekselvirkning. De idéer som her er beskrevet kan f.eks. utgjøre en genetisk og molekylær basis for in-tern bildedannelse i immunsystemet og kretsdannelse i det sen-trale nervesystem.

De oppdagelser som her er beskrevet, spesielt i eksemplene 2A til 2C, beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av polypeptider som har affinitet for cellulære receptorpunkter av spesielle peptidhormoner. Nevnte fremgangsmåte omfatter en rekke trinn. For det første fastslås en annen nukleotidsekvens av en annen nukleotidstreng som danner basepar med en før-ste nukleotidstreng som koder for minst en del av en protein-holdig komponent av et peptid-hormon-reseptorpunkt. Homologe aminosyresekvenser mellom peptidhormonet og aminosyresekvensen som kodes av den annen nukleotidsekvens, lest i retningen 3'

til 5', bestemmes deretter.

Når man har funnet disse homologe aminosyresekvenser,

som viser seg ansvarlige for den karakteristiske binding av peptidhormoner til deres reseptorpunkter, kan polypeptider som omfatter minst en del av minst én av nevnte homologe sekvenser

bli fremstilt f.eks. ved rutinemessige kjemiske eller biologiske syntetiske metoder. Disse polypeptider, som inneholder nøkkel-regioner av homologi og reseptor-bindingsaffinitet med et peptid-hormon eller ligand, kan klassifiseres ved vanlig benyttede teknikker som agonister eller antagonister for peptidhormonet eller liganden.

EKSEMPEL 3A

ANGIOTENSIN II OG FORMGIVNING OG OPPNÅELSE AV KOMPLEMENTÆRE PEPTIDER BASERT PÅ NUKLEINSYRESEKVENSER

Angiotensinsystemet er vist nedenunder:

Angiotensinogen > Angiotensin I > Angiotensin II

1 2

Reaksjon 1 er en enzymatisk spalting ved enzymet renin,

og reaksjon 2 er en enzymatisk spalting ved angiontensin-omdan-nende enzym (ACE). Angiotensinogen inneholder 453 aminosyrerester, Angiotensin I består av de 10 N-terminale rester av Angiotensinogen og Angiotensin II inneholder de 8 N-terminale rester av Angiotensin I. Angiotensin II er det aktive molekyl som styrer blodtrykkkontrollen.

Nukleinsyresekvensen for Angiotensin II hos rotte ble oppnådd fra Ohkubo et al., (Proe. Nat. Acad. Sei. USA, 80,

s. 2197 - 2200, 1983) ved translatering av hele mRNA for angiotensinogen og observering av aminosyresekvensen (fra base 134

til 157) kjent for å være Angiotensin II. Sekvensen, dens translasjon, dens komplement, og de komplementære aminosyrer bestemt ved lesing i retningen 3' og 5<1> er vist i følgende tabell:

Siden 3'-lesing ga et termineringssignal (UAG/END), ble ASP satt i stedet for END. Komplementære peptider ble oppnådd ved konvensjonell fastfase-syntese fira Triton Biosciences Inc.

(Alameda, CA) for følgende komplementære peptider. Bemerk at to peptider har parallelle peptidbindingsorienteringer, og to har antiparallelle.

EKSEMPEL 3B

ANGIOTENSIN II OG FORMGIVNING OG OPPNÅELSE AV KOMPLEMENTÆRE PEPTIDER BASERT PÅ AMINOSYRESEKVENSER ( KONSENSUS- KOMPLEMENTER)

Aminosyresekvensen fra human Angiotensin II ble tatt fra sekvensen av et fragment av humant Angiotensinogen bestemt av Tewksbury et al. (BBRC, 99, s. 1311 - 1315, 1981).

Under anvendelse av de substitusjoner som er gitt i tabell 6A, ble to konsensus-komplementer av Angiotensin II utformet, ett med parallell peptidbindingsorientering og ett med antiparallell orientering som vist nedenunder:

Disse komplementære peptider ble oppnådd ved konvensjonell fastfasesyntese fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA).

EKSEMPEL 3C

ANGIOTENSIN II OG FORMGIVNING OG OPPNÅELSE AV KOMPLEMENTÆRE PEPTIDER BASERT PÅ AMINOSYRESEKVENSER ( FORENKLEDE KOMPLEMENTER)

Under anvendelse av aminosyresekvensen for Angiotensin

II fra det foregående eksempel og de substitusjoner som er vist i tabell 6C, ble følgende (anti-parallelle) forenklede komplementære peptid til Angiotensin II (humant) utformet.

SCA-AII GLU-GLY-LEU-GLU-LEU-GLU-ALA-LEU

Dette komplementære peptid ble oppnådd ved konvensjonell fastfasesyntese fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA).

EKSEMPEL 3D

Angiotensin og formgivning og oppnåelse av beslektede komplementære peptider

Basert på det kjente nettverk av reaksjoner i angiotensin-systemet ble komplementære peptider fremstilt som kunne avsløre

mangeartede velgjørende effekter.

Molekyler er utformet, basert på komplementaer-peptid-bin-dingsobservasjonene, som spesifikt kan vekselvirke med ett eller flere av angiotensinsystemmolekylene. Som et resultat av slike vekselvirkninger vil et angiotensihmolekyl ikke gjennomgå enzymatisk reaksjon. Således kunne omdannelsen av f.eks. angiotensin I til angiotensin II bli redusert uten faktisk å inhibere ACE eller dets andre funksjoner.

Basert på human-angiotensinogen-fragment-sekvensen for eksempel 3B ble de følgende to peptider utformet under anvendelse av konsensus-komplementmetoden.

CCA-AI GLU-VAL-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU CCA-A(1-13)VAL-TYR-HIS-GLU-VAL-LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU

Disse komplementære peptider ble oppnådd ved fastfasesyntese fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA).

Molekylet CCA-AM-13) kan forventes å binde alle tre medlemmer av antiotensinfamilien som er vist ovenfor, og derved inhibere reaksjoner 1 og 2 og inhibere muligheten hos Angiotensin II til å aktivere dets receptor.

EKSEMPEL 3E

Angiotensin II og formgivningen og oppnåelse av potensielt metabolisk stabile komplementære peptider

Basert på strukturen til ett av de komplementære peptider av Angiotensin II (CCA-AII, eksempel 3B) ble flere derivater utformet som kan vise forbedret metabolisk stabilitet overfor diverse peptidaser. Både amino- og karboksypeptidaser er kjent for å være tilstede i mange organismer. Det er kjent at mange modifikasjoner til peptidstrukturer kan beskytte peptider mot innvirkning av disse enzymer. Acylering (Ac) av terminale amino-grupper og prolyering og amidering (Am) av terminale karboksy-grupper er vanlige metoder for å beskytte peptider mot henholdsvis amino- og karboksypeptidaser.

De følgende molekyler ble utformet basert på disse prinsipper og strukturen til det aktive komplementære peptid CCA-AII.

Molekylene ble oppnådd ved konvensjonell fastfasekjemi fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA). Amidharpikser ble anvendt i fastfase-syntese for oppnåelse av amiderte peptider. Acylering ble utført ved omsetning av eddiksyreanhydrid med fullstendig beskyttet peptid mens det fremdeles var på harpik-sen i fastfase-syntesen.

En annen metode for å beskytte peptider mot enzymatisk angrep er å substituere D-aminosyrer for de naturlig forekom-mende L-aminosyrer. Av denne grunn ble et helt ut D-komplementært peptid utformet basert på sekvensen CCA-AII (eksempel 3B).

CCA-AII (helt ut D) LYS-GLY-VAL-TYR-ILE-HIS-ALA-LEU

Dette molekyl ble oppnådd ved konvensjonell fastfase-syntese fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA).

EKSEMPEL 3F

Effekt av peptider som er komplementære til Angiotensin II på bindingen av radiomerket Angiotensin II mot dens reseptor Inhibering av Angiotensin II som binder seg til Angiotensin II-reseptorer ved komplementære peptider ble testet ved måling via anvendelse av radiaktivt Angiotensin II. Kaninlever ble homogenisert og sentrifugert for isolering av partikler som sedimenterer mellom 1 000 og 100 000 G. Bindingsaktivitet ble solubilisert med 1% digitonin, fulgt av ammoniumsulfat-frak-sjonering mello 49 og 65% mettethet fulgt av DEAE-cellulose-kromatografi ved pH 7,5 under anvendelse av en lineær gradient mellom 0,0 og 0,3 M KC1. Det delvis rensede, solubiliserte reseptorpreparat bandt 17 pmol av Angiotensin II pr. ng protein da det ble analysert ved Scatchard-analyse, hvilket indikerer en renhet på tilnærmet 0,1%.

Standard-assay for binding av Angiotensin II til reseptoren er som følger: Det komplette system (150 /il) inneholder 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2,5 mM K2EDTA, 0,2 mM PCMS, 0,25 nM (125I) angiotensin II (ca. 100 000 cpm), 100 ug BSA, 0,25% (volum/vekt) Brij 99 og 3 0 y. q av delvis renset reseptor.

Reaksjonen initieres ved tilsetning av reseptoren, og prøver inkuberes i 60 minutter ved 2 0°C. Reaksjonen avsluttes med 1 ml av kald 0,5% trekull/0,05% dekstran i 100 mM Tris-HCl, pH 7,5. Rørene blir slynget og får deretter henstå i 10 minutter ved 4°C, hvoretter de sentrifugeres og deres supernatanter, som inneholder proteinbundet Angiotensin II, telles.

Det komplette system under disse betingelser gir regulært ca. 10 000 cpm av bundet radioaktivitet. En kontrollprøve som mangler reseptor gir verdier på 50 - 2 00 cpm som ble subtrahert fra disse data. Verdier på 50 - 2000 cpm ble oppnådd da 120 piM kaldt Antiotensin II var tilstede i reaksjonsblandingen, hvilket indikerer at praktisk talt all binding er spesifikk. En prøve

inklusive 20 nM kaldt Angiotensin II ble også kjørt. Restbin-ding av radioaktivitet i denne kontrollprøve var 35 - 45%. Komplementære peptider til Angiotensin II ble oppløst i vann, med unntagelse av CCA-A (1-13) som ble oppløst i 3% DMSO, 0,04 M eddiksyre og 0,05 M HCl. Resultater fra disse assays er gitt i tabell 22. ID5Q er ^en konsentrasjon av peptid som inhiberer binding av radiomerket Angiotensin II med 50%.

EKSEMPEL 4A

Luteiniserende hormon- frigjørende hormon ( LHRH) og utforming og oppnåelse av et komplementært peptid Luteiniserende hormon-frigjørende hormon har et stort utvalg av biologiske effekter, og reseptorer for det inntreffer antagelig på mange celletyper (Miller, et al., Nature, 313,

s. 231 - 233, 1985). Nukleinsyresekvensen for forløperformen av LHRH er blitt rapportert (Seeburg and Adelman, Nature, 311, s. 666 - 668, 1984) og ble anvendt i følgende utforming av et komplementært peptid. Sekvensen for LHRH, dens translasjon, dens komplement og translasjonen 5'-3' av dens komplement er vist nedenunder.

Det komplementære peptid 5CA-LHRH ble oppnådd ved fastfase-syntese fra Triton Biosciences Inc. (Alameda, CA).

EKSEMPEL 4B

Effekt av et peptid som er komplementært til LHRH ( 5CA- LHRH)

på LHRH- stimulert LH- frigivning fra pituitasre celler En revers hemolytisk plate-assay (Smith et al.), Method

in Enzymology, 124, s. 443) ble anvendt for å undersøke effek-

ten av et peptid (5CA-LHRH) som er komplementært til LHRH på LHRH-stimulert frigivning av LH fra pituitære celler. Denne assay ble utført som gjengitt, med unntagelse av at i de eksperimenter som er merket som (Pre), ble det komplementære peptid og LHRH preinkubert i 1 time før tilsetning til dispergerte pituitære celler.

Plater ble analysert ved bestemmelse av plateareal med

en bildeanalyse (Bioguant eller Image Technology Corp. Model 300) av 125x - 500x mikroskopiske forstørrelser. Resultatene er presentert som prosent respons av en spesiell assay mot en kontroll-assay (plater formet under stimulering ved 5xlO~<10>M LHRH).

Effekten av det komplementære peptid (5CA-LHRH) er presentert i tabell 23:

Resultatene viser en klar inhibering av effektene av LHRH i denne assay ved det komplementære peptid 5CA-LHRH.

EKSEMPEL 4C

Effekt av antistoff mot 5CA- LHRH ( A5CALHRH) på LHRH- stimulert LH- sekresjon ved pituitære celler

Den reverse hemolytiske plate-assay for LH-sekresjon ved dispergerte pituitære celler av proestrøse rotter ble utført i det vesentlige som beskrevet i eksempel 4B, med unntagelse av at de pituitære celler ble preinkubert med A5CALHRH eller det normale kaninserum (NRS) i 2 timer. Etter vasking ble reverse hemolytiske plateformasjoner initiert med tilsetning av LHRH og anti-LH-antiserum. To timer senere ble komplement tilsatt i 30 minutter. A5CALHRH ved samme konsentrasjon ble også tilsatt under revers hemolytisk platedannelse. A5CALHRHB1 er IgG-fraksjonen av antiserum fra første blodprøve ved 40 dager etter imrnunisering av en han-kanin med 5CA-LHRH koblet til Keyhole Limpet Hemocyanin (300 ug antigen i 1 ml komplett Freunds adjuvant, initiell injeksjon dag 0, 200 ug antigen i 1 ml inkom-plett Freunds adjuvant, injeksjoner på dager 10, 20, 30, 40, 50 og 60). A5CALHRHB3 er fra tredje blodprøve på kaninen ved dag 60. F(ab)2~fragmenter av A5CALHRHB1 ble produsert ved konvensjonelle metoder (Methods In Immunology, 3. utgivelse, s.

256, 1977). Resultatene er vist i tabell 24.

<*>Pituitære celler er rapportert å ha reseptorer for FC-delen av antistoffmolekyler. (Pouglane et al., Nature 261, 142 (1976), Buffa et al. Histochem 63 15 (1979)) F(Ab)2-fragmenter av A5CALHRH ble fremstilt for å sikre at enhver effekt på LHRH-stimulering av pituitære celler ikke skyldtes vekselvirkning av A5CALHRH med ikke-spesifikke FC-reseptorer.

Disse resultater viser nærvær av både antagonistiske og agonistiske antistoffer i immunserumet til kaniner immunisert med et peptid som er komplementært til LHRH.

EKSEMPEL 4D

Immunocytok- jemisk assay for LHRH- celle- overflate- reseptorer

basert på antistoffer til peptider som er komplementære til LHRH

Diverse celler har reseptorer for LHRH på sine overflater. Det er velkjent at 5% av pituitære celler har slike reseptorer, siden de gir respons på LHRH ved frigjøring av LH. De følgende eksperimenter ble utført for å vise evnen hos antistoffer til peptider som er komplementære til LHRH med hensyn til spesifikt å merke slike pituitære celler som inneholder LHRH-reseptorer.

Etter at standard-plateassays blir utført (som i eksempel 4B), ble kammerne infusert med natriumacetat for å eluere de bundne antistoffer og fiksert sekvensielt i B5 fiksativ, etanol, Lugols jodid og natriumtiosulfat (som beskrevet i Smith et al., Methods in Enzymology, 124, s. 443). Dekkglassene ble behandlet med hydrogen-peroksyd og normalt geiteserum før påføring av passende fortynninger av antistoffene. Immunocytokjemi ble utført med ABC-metoden (Vector Labs, Burlingame, CA) med diaminobenzidin som substrat..

Celler inneholdende LH ble selektivt farvet med antistoffer til LH. Generelt inneholdt plater som dannet seg i assays fra tidligere eksempler én LH-holdig celle nær sentrum av hver sirkulære plate. Celler som presenterer LHRH-reseptorer ble farvet med IgG-fraksjoner av immunserum fra kaniner immunisert med et peptid som er komplementært til LHRH (se eksempel 4c). Igjen ble én celle per sirkulær plate farvet, og disse var de samme celler som inneholdt LH. Kontrollforsøk viste at reseptorfarving ved antistoff til komplementet av LHRH kunne bli blokkert med både LHRH (ved binding til reseptor) og ved komplementet til LHRH (ved binding til antistoffet).

Disse forsøk viser at antistoffene til komplementet av LHRH selektivt farver pituitære celler som presenterer LHRH-reseptorer.

EKSEMPEL 5A

Ribonuklease A S- peptid og utforming

og oppnåelse av et kom<p>lementært peptid.

Behandling av bovin-ribonuklease A (RNase), et 124 amino-syrers protein, med det proteolytiske enzym, subtilisin, spalter RNase til to fragmenter betegnet S-peptid, aminosyrerester 1-2 0 og S-protein, aminosyrerester 21-124. m-RNA-sekvensen for rotte-

RNase ble oppnådd fra MacDonald et al. (J. Biol. Chem., 257,

p. 14582-14585, 1982), som viser vesentlig sekvenshomologi med bovin-RNase. Rester 4 til 23 deler homologi med S-peptidet fra bovin-S-peptid. En putativ M-RNA-struktur for bovin-RNase ble avledet ved å gjøre det minste antall baseendringer i rotte-m-RNA sekvensen og er vist i følgende tabell: Rotte-RNase-aminosyrerester 4-2 3 ARG GLU SER SER ALA ASP LYS

PHE LYS ARG GLN HIS MET ASP THR GLU GLU PRO SER LYS

Rotte m-RNA sekvens for rotte-RNase-rester 4-23 ved å lese 5'

til 3' AGG GAA UCA UCG GCG GAU AAG UUU AAG AGG CAG CAC AUG GAC ACA GAG GGU CCC UCC AGG

Putativ m-RNA for bovin-S-peptid ved å lese 5' til 3<1> AAG GAA

ACA GCG GCG GCU AAG UUU GAG AGG GAG CAC AUG GAC UCA UCG ACU UCC

GCC GCG

Aminosyresekvensen i bovin-S-peptid LYS GLU THR ALA ALA ALA

LYS PHE GLU ARG GLU HIS MET ASP SER SER THR SER ALA ALA

Aminosyrene for det komplementære peptid til bovin-S-peptid

ble bestemt fra nukleinsyrestrukturen ved å lese den komplementære tråd i 5'- til 3<1->lese-rammen som vist i følgende tabell: Komplementær nukleinsyrestruktur for bovin-S-peptid CGC GGC GGA

AGU CGA UGA GUC CAU GUG CUC CCU CUC AAA CUU AGC CGC CGC UGU UUC CUU

Den parallelle komplementære aminosyresekvens for bovin-S-peptid

LEU PHE SER ARG ARG SER LEU LYS LEU PRO LEU VAL HIS VAL SER ARG SER GLY GLY ARG

Siden det sjette kodon gav et termineringssignal (UGA/END), ble SER substituert for END. For kodon 18 (UGU/CYS), ble SER substituert for CYS. Disse aminosyresubstitusjoner opprettholder annenbase-komplementaritet med bovin-S-peptidet. Det komplementære peptid ble oppnådd ved konvensjonell fastfasesyntese fra Triton Biosciences Inc.

(Alameda, CA).

EKSEMPEL 5B

Ribonuklease A S- peptid oa binding og rensning

av et komplementært peptid.

Vekselvirkning mellom det S-peptid-komplementære peptid med S-peptid ble undersøkt ved kovalent å koble S-peptid til en N-hydroksy-suksinimid-aktivert silikagel-bundet fase under anvendelse av konvensjonell kjemi. Den peptidblanding som ble oppnådd fra hydrogenfluoridbehandling av det komplementære peptid under anvendelse av konvensjonell kjemi ble anvendt direkte på den S-peptid-kromatografiske kolonne (3 mm x 44 mm), på forhånd ekvilibrert ved enten 0,10 M Tris-acetat, PH 7,0 eller 0,10 M Tris-acetat, PH 5,1, ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Kolonnens avløp ble overvåket ved absorbans ved 226 nm. Under disse betingelser ble en stor topp sammensatt av peptid og ikke-peptidmateriale oppnådd ved løsningsmiddelfronten. Kolonnen ble vasket med 45 ml puffer, fulgt av 30 ml vann, og deretter ble 0,10 M eddiksyre påført i kolonnen som eluerte 226 nm absorberende materiale. Kromatografi av dette eluerte materiale på en Waters reversert fase C-18-kolonne under anvendelse av en strømnings-hastighet på 1 ml/min. og en gradienteluering for 10 % løsning A til 40 % løsning B i løpet av 35 min. (løsning A, 0,1 % trifluoreddiksyre/vann; løsning B, 0,1 % trifluoreddiksyre/100 % aceto-nitril) gav en enkelt topp med en retensjonstid på tilnærmet 26 minutter. Sekvensering av dette materiale ved anvendelse av en gassfase-sekvensator (Applied Biosystems, Foster City, CA) bekreftet at dens struktur var identisk med det syntetiserte komplementære peptid. Kontrollpeptider bandt seg ikke til S-peptid-affinitetskolonnen. Disse resultater viser en spesifikk binding mellom S-peptidet og ett av dets komplementer og viser også at S-peptid-affinitetskolonnen kan anvendes for å rense råpreparater av peptid.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært (dvs. har bindingsaffinitet) til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: a) å bestemme en første nukleotidsekvens av en første nuklein-syre, idet den første nukleotidsekvens koder for en aminosyresekvens av minst en del av det opprinnelige peptid eller protein; og b) å fastslå en annen nukleotidsekvens av en annen nukleinsyre som danner basepar med den første nukleotidsekvens av den første nukleinsyre, idet den første og den annen nukleinsyre danner par i antiparallelle retninger; c) å bestemme aminosyresekvensen av det komplementære polypeptid ved å finne aminosyresekvensen som kodes av den annen nukleotidsekvens når den leses i samme leseramme som første nukleotidsekvens; og d) å oppnå et polypeptid som omfatter den aminosyresekvens som er bestemt i trinn c.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den annen nukleotidsekvens leses i retningen 5<1> til 3<1>.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den annen nukleotidsekvens leses i retningen 3' til 5'.

4. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen av minst en del av det opprinne lige peptid eller protein substituere istedenfor hvert isoleucin i den fastslåtte aminosyresekvens, tyrosin; substituere istedenfor hvert valin i den fastslåtte amino syresekvens, glutamin eller histidin; - substituere istedenfor hvert leucin i den fastslåtte amino- syresekvens, asparagin, aspartinsyre eller glutaminsyre; substituere istedenfor hvert fenylalanin i den fastslåtte aminosyresekvens, lysin; substituere istedenfor hvert cystein i den fastslåtte amino syresekvens, treonin; - substituere istedenfor hvert metionin i den fastslåtte amino- syresekvens, tyrosin; substituere istedenfor hvert alanin i den fastslåtte amino syresekvens, arginin; substituere istedenfor hvert arginin i den fastslåtte amino syresekvens, alanin eller serin; substituere istedenfor hvert lysin i den fastslåtte amino syresekvens, fenylalanin; - substituere istedenfor hvert asparagin i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; - substituere istedenfor hver aspartinsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; substituere istedenfor hvert glutamin i den fastslåtte amino syresekvens, valin; substituere istedenfor hver glutaminsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; substituere istedenfor hvert histidin i den fastslåtte amino syresekvens, valin; substituere istedenfor hvert glycin i den fastslåtte amino syresekvens, prolin; substituere istedenfor hvert treonin i den fastslåtte amino syresekvens, tryptofan eller cystein; substituere istedenfor hvert tryptofan i den fastslåtte aminosyresekvens, treonin; substituere istedenfor hvert serin i den fastslåtte amino syresekvens, arginin eller serin; substituere istedenfor hvert tyrosin i den fastslåtte amino syresekvens, isoleucin eller metionin; substituere istedenfor hvert prolin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin; og oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovennevnte substitusjoner.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4, karakterisert ved å: substituere istedenfor hvert arginin i den fastslåtte amino syresekvens, serin; substituere istedenfor hvert serin i den fastslåtte amino syresekvens, serin; og substituere istedenfor hvert treonin i den fastslåtte amino syresekvens, cystein.

6. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen av minst en del av det opp rinnelige protein eller peptid; å lese den fastslåtte aminosyresekvens, ved å starte fra karboksy-terminalretningen derav, for på substituerende måte å tilsvare den aminoterminale retning av det komplementære polypeptid; substituere istedenfor hvert isoleucin i den fastslåtte aminosyresekvens, tyrosin, asparagin eller aspartinsyre; - substituere istedenfor hvert valin i den fastslåtte amino- syresekvens, asparagin, aspartinsyre, histidin eller tyrosin; substituere istedenfor hvert leucin i den fastslåtte amino syresekvens, lysin, glutamin eller glutaminsyre; - substituere istedenfor hvert fenylalanin i den fastslåtte aminosyresekvens, lysin eller glutaminsyre; substituere istedenfor hvert cystein i den fastslåtte amino syresekvens, treonin eller alanin; substituere istedenfor hvert metionin i den fastslåtte amino syresekvens, histidin; substituere istedenfor hvert alanin i den fastslåtte amino syresekvens, arginin, serin, glycin eller cystein; substituere istedenfor hvert arginin i den fastslåtte amino syresekvens, alanin, serin, treonin eller prolin; substituere istedenfor hvert, lysin i den fastslåtte amino syresekvens, leucin eller fenylalanin; - substituere istedenfor hvert asparagin i den fastslåtte aminosyresekvens, isoleucin eller valin; substituere istedenfor hver aspartinsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, isoleucin eller valin; substituere istedenfor hvert glutamin i den fastslåtte amino syresekvens, leucin; substituere istedenfor hver glutaminsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin eller fenylalanin; substituere istedenfor hvert histidin i den fastslåtte amino syresekvens, valin eller metionin; substituere istedenfor hvert glycin i den fastslåtte amino syresekvens, prolin, serin, treonin eller alanin; substituere istedenfor hvert treonin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin, serin, arginin eller cystein; substituere istedenfor hvert tryptofan i den fastslåtte aminosyresekvens, prolin; substituere istedenfor hvert serin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin, treonin, alanin eller arginin; substituere istedenfor hvert tyrosin i den fastslåtte amino syresekvens, isoleucin eller valin; substituere istedenfor hvert prolin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin, arginin eller tryptofan; og oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovenstående substitusjoner.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved å: substituere istedenfor hvert valin i den fastslåtte amino syresekvens, aspartinsyre eller histidin; substituere istedenfor hvert leucin i den fastslåtte amino syresekvens, lysin eller glutamin; substituere istedenfor hvert fenylalanin i den fastslåtte aminosyresekvens, glutaminsyre; substituere istedenfor hvert arginin i den fastslåtte amino syresekvens, alanin eller prolin; substituere istedenfor hvert- lysin i den fastslåtte amino syresekvens, leucin; substituere istedenfor hvert histidin i den fastslåtte amino syresekvens, valin; substituere istedenfor hvert glycin i den fastslåtte amino syresekvens, prolin eller alanin; substituere istedenfor hvert treonin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin eller arginin; substituere istedenfor hvert serin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin, arginin eller alanin; substituere istedenfor hvert tyrosin i den fastslåtte amino syresekvens, valin; og substituere istedenfor hvert prolin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin eller arginin.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som har affinitet for det cellulære reseptorpunkt for en spesiell peptid-ligand, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå en annen nukleotidsekvens i en annen nukleotidtråd som danner basepar med en første nukleotidtråd som koder for minst del av en proteinholdig komponent i et peptidligand-reseptorpunkt; å bestemme hvilke som helst aminosyresekvenser i peptid- liganden som er homologe med aminosyresekvenser som kodes av den annen nukleotidsekvens når nevnte annen sekvens leses i retning 3' til 5<1>; og å fremstille et polypeptid som omfatter minst en del av minst én av nevnte homologe aminosyresekvenser.

9. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, hvor aminosyrene i polypeptidet, det opprinnelige peptid eller opprinnelige protein er definert som inneholdt i grupper (U, A, C eller G) i henhold til den annen base av deres kodoner, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen av minst en del av det opp rinnelige peptid eller protein; å substituere istedenfor hver A gruppe aminosyre, en amino syre av U gruppen; å substituere istedenfor hver U gruppe aminosyre, en amino syre av A gruppen; å substituere istedenfor hver C gruppe aminosyre, en amino syre av G gruppen; å substituere istedenfor hver G gruppe aminosyre, en amino syre av C gruppen; og å oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovenstående substitusjoner.

10. Fremgangsmåte for å påvise og bestemme et peptid eller protein i en prøve som inneholder peptidet eller proteinet som skal bestemmes, karakterisert ved at den omfatter: (a) å oppnå et polypeptid som er komplementært til minst en del av nevnte peptid eller protein, ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til krav 1, 4, 6, 8 eller 9; (b) kjemisk å koble det komplementære polypeptid til en merking for dannelse av et merket konjugat av polypeptidet; (c) å bringe prøven som inneholder peptidet eller proteinet som skal bestemmes, i kontakt med det merkede konjugat av det komplementære polypeptid og derved danne et kjemisk kompleks eller par hvor peptidet eller proteinet som skal bestemmes blir bundet til det merkede konjugat i det komplementære polypeptid; og (d) å påvise og bestemme peptidet eller proteinet som skal bestemmes, ved analyse med hensyn på det merkede konjugat som er bundet til peptidet eller proteinet.

11. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen av minst en del av det opp rinnelige peptid eller protein; substituere istedenfor hvert isoleucin i den fastslåtte aminosyresekvens, tyrosin; substituere istedenfor hvert valin i den fastslåtte amino syresekvens, histidin; substituere istedenfor hvert leucin i den fastslåtte amino syresekvens, glutaminsyre; substituere istedenfor hvert fenylalanin i den fastslåtte aminosyresekvens, lysin; substituere istedenfor hvert metionin i den fastslåtte amino syresekvens, tyrosin eller histidin; substituere istedenfor hvert lysin i den fastslåtte amino syresekvens, fenylalanin; substituere istedenfor hvert asparagin i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; substituere istedenfor hver aspartinsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; substituere istedenfor hvert glutamin i den fastslåtte amino syresekvens, leucin eller valin; - substituere istedenfor hver glutaminsyre i den fastslåtte aminosyresekvens, leucin; substituere istedenfor hvert histidin i den fastslåtte amino syresekvens, valin; substituere istedenfor hvert tyrosin i den fastslåtte amino syresekvens, isoleucin; substituere istedenfor hvert cystein i den fastslåtte amino syresekvens, treonin; substituere istedenfor hvert arginin i den fastslåtte amino syresekvens, alanin; - substituere istedenfor hvert glycin i den fastslåtte amino- syresekvens, prolin; substituere istedenfor hvert tryptofan i den fastslåtte aminosyresekvens, treonin eller prolin; substituere istedenfor hvert serin i den fastslåtte amino syresekvens, serin eller arginin; substituere istedenfor hvert treonin i den fastslåtte amino syresekvens, cystein eller serin; substituere istedenfor hvert prolin i den fastslåtte amino syresekvens, glycin; substituere istedenfor hvert alanin i den fastslåtte amino syresekvens, arginin; å oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved hjelp av de ovennevnte substitusjoner.

12. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen til minst en del av det opp rinnelige peptid eller protein; å fastslå det hyppigst anvendte kodon for hver aminosyre i sekvensen for den eller de specier som er av interesse, slik at 5'- til 3'-avlesningen av det komplementære kodon ikke resulterer i et stoppkodon; å substituere istedenfor hver aminosyre i den fastslåtte aminosyresekvens, den aminosyre som er definert ved 5'-til 3'-translasjon av komplementet av det fastslåtte hyppigst anvendte kodon; - å oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovennevnte substitusjoner.

13. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: - å fastslå aminosyresekvensen til minst en del av det opp rinnelige peptid eller protein; å fastslå det hyppigst anvendte kodon for hver aminosyre i sekvensen for den eller de specier som er av interesse, slik at 31 - til 5'-avlesningen av det komplementære kodon ikke resulterer i et stoppkodon; å substituere istedenfor hver aminosyre i den fastslåtte aminosyresekvens, den aminosyre som er definert ved 3'-til 5'-translasjon av komplementet av det fastslåtte hyppigst anvendte kodon; å oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovennevnte substitusjoner.

14. Fremgangsmåte for bestemmelse av et polypeptid som er komplementært til minst en del av et opprinnelig peptid eller protein, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: å fastslå aminosyresekvensen til minst en del av det opp rinnelige peptid eller protein; å fastslå aminosyren som tilsvarer det hyppigst anvendte kodon for den eller de specier som er av interesse, for hver gruppe av kodoner med annen-baser G, C, A, og U/T; - å substituere istedenfor hver aminosyre i den fastlåtte sekvens, den fastslåtte aminosyre fra gruppen av aminosyrer med annen-base som er komplementær til annen-basen til det hyppigst anvendte kodon i den eller de specier som er av interesse, for aminosyren i den fastslåtte sekvens; - å oppnå et polypeptid som omfatter aminosyresekvensen bestemt ved de ovennevnte substitusjoner.