MXPA97003956A

MXPA97003956A - Genes purificados que codifican antigenos de superficie de celulas de mamiferos;proteinas y anticuerpos

Info

Publication number: MXPA97003956A
Application number: MXPA/A/1997/003956A
Authority: MX
Inventors: Aversa Gregorio; E De Vries Jan; G Cocks Benjamin; J Chang Chiachun
Original assignee: Schering Corporation
Priority date: 1994-12-02
Filing date: 1997-05-29
Publication date: 1998-07-03

Abstract

La presente invención se refiere a genes purificados que codifican un antígeno de superficie de la célula T de un mamífero, reactivos relacionados con los mismos incluyendo proteínas purificadas, anticuerpos específicos yácidos nucleicos que codifican dicho antígeno. Se proveen también métodos para usar dichos reactivos y equipos de diagnóstico.

Description

GENES PURIFICADOS QUE CODIFICAN ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS; PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS.

La activación c'e las células T ¡átenles es crítica en la mayor parte de la..; respuestas de inm nidad y permiten que estas células ejerzan sus capacidades reguladoras y efectuadoras. Ver Paul (ed; 1993V Inmunología Ambiental 3d ed., Raven Press, N. Y. E! aumento de la adhesión entre las células T- y las células que presentan antígenos (APC) u otras formas de estímulos primarios, oci ejemplo, anticuerpos monoclonales ipmobilizados (mAb), pueden poteric -ir ¡r-señales receptoras de células T. La activación de las células T y la expansión de io célula T depende de la vinculación del receptor de célula T (TCR) y las señales co-estimuladoras provistas por células accesorias. Ver, por ejemplo, Jenkins y Johnson (1993) Curr. Opin. Inmunol. 5:361-367; Bierer y Hahn (1993) Semin.

Immunol. 5:361-367; Bierer y Hahn (1993) Semin. Immunol. 5: 249-26 : . June, et a!., (1990) Immunol.Todav 11 :211-216; y Jenkins (1994) Immunitv 1 443-446. Una interacción co-estimuladora importante y bien estudiada de las c lu'as T 'nvolucra CD28 o CTLA-4 sobre las células T con B7 o con B 70 (Jenkins (1994) Immunity 1 :443-446). Recientes estudios en ratones deficientes de CD28 ( Shahinian, et al. (1993) Science 261 :609-612; Green, et al. (1994) Inmunidad 1 : 501-508) y ratones transgénicos que expresan inmunoglobulina de CTLA-4 (Rónchele, et al. (1994) J Exp. Med. 179:809-817) han revelado que existen deficiencias en algunas respuestas de las células T a pesar de que estos ratones tienen respuestas de Inmunidad primaria normales y respuestas CTL normales a los vivos coriomeninyir.cos lingotificos y al virus de estomatitis vesicular. Como resultado ambo? estudios llegaron a la conclusión de que otras moléculas co-estim'..:! adora;; podrían estar apoyando la función de las células T. Sin embargo, la identificación de éstas moléculas que actúan corno intermediarias de distintas señales co-estimuladoras ha sido difícil. La incapacidad de modular, señales de activación evita ei c:;n:roi de! desarrollo o las respuestas fisiológicas inapropiadas en los sistemas irrnunitarios.

La presente invención provee por lo menos una molécula alternativa co-estimuladora, cuyos agonistas u antagonistas resultarán útiles para modular una plétora de las respuestas de inmunidad. La presente invención se basa; 'en parte, en el descubrimiento de un antígeno que actúa como co-estimulador de las células T. En particular, provee un gen que codifica una proteína glicosilada de 70 kDa designada SLAM, que expresa en los timocitos CD4+, CD8+ y en las células T de la memoria de CD45RO ele ad0 de la sangre periférica, y que es rápidamente inducido en las células T naturales después de la activación. La vinculación del gen SLAM estimula la porliferación de clones de las células T de CD4+ y mejora la proliferación específica de antígenos y la producción de citoquinas mediante la producción de las células T CD4+. Particularmente la producción de IFN-? están fuertemente sobreregulada, incluso en los clones de las células T CD4+ T auxiliares del tipo 2 (th2) mientras que no se observó ninguna inducción de la producción de IL-4 o IL-5 en los clones de Th1. Estos otros indican que las proteínas SLAM es una nueva molécula co-estimuladora de la células T, la cual cuando está vinculada a potencia a la expansión de la células T e inducción de un perfil de producción de citoquipa Th0/ h1. Se han descripto ambas realizaciones la humana y la de ratón, que habilitan los genes, anticuerpos de mamíferos y los usos de los mismos. Los equivalentes opcionales que exhiben una homología de secuencia significativa se hallan disponibles en las especies no-mamíferas. Además, la SLAM puede funcionar como su par fijador, para estimular otras células que expresan del mamífero en una interación homofílica. Más particularmente, la presente invención provee una proteína SLAM substancialmente pura o recombinante o un fragmento peptídico de la misma. Varias realizaciones incluyen una proíeína o un péptido que están relacionados entre una proteína o un péptido de un animal de sangre caliente que está seleccionado del grupo de aves y mamíferos incluyendo un humano o un ratón. Una proteína o péptido que comprende por lo menos un segmento poiipeptídico de la secuencia ¡dentificatoria N0.: 2, 4, 6, 8, 10, o 12; una proteína o un péptido que exhiben un patrón de modificación- de post-traducción distinto de un SLAM natural; o la proteína o péptido que son capaces de co-estimular una célula T con otra señal. La proteína o péptido puede comprender una secuencia de la porción extracelular o intracelular de una proteína SLAM; o puede ser una proteína de fusión. Otra realización consiste en una composición que comprenda una proteina SLAM y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención abarca también un anticuerpo que fija específicamente una proteína o péptido SLAM, por ejemplo, en el cuál la proteína SLAM es una proteína de mamífero incluyendo un humano o un ratón; el anticuerpo se crea contra una secuencia peptídica SLAM purificada de la SEC ID N°; 2, 4, 6, 8, 10 o 12; el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o el anticuerpo está rotulado. Los anticuerpos permiten también disponer de un método para purificar una proteína SLAM o un péptido de otros materiales en una mezcla que comprende poner en contacto la mezcla con un anticuerpo anti-SLAM separando el material de SLAM fijado de otros materiales. Otro aspecto de la invención consiste en un ácido nucleico aislado o recombinante que es capaz de codificar una proteína o péptido SLAM incluyendo un ácido nucleico que codifica una secuencia de SEC ID N°: 2, 4, 6, 8, 10, y 12 ; que incluye una secuencia de SEC ID N°; 1 , 3, 5, 7, 9 o 1 1 ; la cual codifica una secuencia de un dominio extracelular de una SLAM; o que codifica una secuencia de un dominio intracelular de un SLAM natural. Con una o con varias realizaciones de ácido nucleico incluyen también un vector de expresión de replica. La invención provee también un equipo o conjunto que contiene una proteína o fragmento SLAM substancialmente puro; un anticuerpo o receptor que se fija específicamente a SLAM; o un ácido nucleico o su complemento qi codifica un SLAM o péptido. Este equipo provee también métodos para detectar en una muestra la presencia de un ácido nucleico o una proteína o un anticuerpo que comprende someter dicha muestra a ensayo con dicho equipo. La invención provee también métodos para modular la fisiología de una célula, que comprende poner en contacto dicha célula con una SLAM o fragmento substancialmente puro; un anticuerpo o un par de fijación que se fija específicamente a SLAM; o un ácido nucleico que se codifica a un SLAM o un péptido. Algunas de las realizaciones específicas incluyen un método en el cual la célula es una célula T, y ia modulación de la fisiología consiste en la activación de la células T; o en la cual la célula consiste en un tejido y/o un organismo. Se provee también un método para utilizar el péptido SLAM mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica un polipéptido SLAM. La invención provee una célula un tejido o un órgano o un organismo que comprende un ácido nucleico que codifica un péptido SLAM. La invención provee también una ácido nucleico recombinante que provee también una secuencia de identidad de por lo menos 70% a lo largo de extensión de por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos a una secuencia de ácido nucleico SLAM de la SEC ID N°: 1 , 3, 5, 7, 9, o 1 1 que es útil, por ejemplo, como sonda o como cebador de PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) para un gen relacionado. Otra realización codifica un polipéptido que comprende por lo menos aproximadamente una identidad de por lo menos 60% a lo largo de una extensión de por lo menos aproximadamente 20 amino ácidos a una secuencia SLAM de la SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, o 12.

I. General La presente invención provee secuencias de amino ácidos y secuencias de ADN que codifican varias proteínas de mamíferos, que son los antígenos que se encuentran en las etapas tempranas de la activación de las células T, por ejemplo, que pueden activar una célula T. Entre estas proteínas están los antígenos que inducen la proliferación de las células T, entre otros efectos fisiológicos Los aptígenos de longitud total de los fragmentos serán útiles en la modulación fisiológica de las células que expresan el antígeno. Las proteínas serán también útiles como antígenos por ejemplo como inmunógenos para crear anticuerpos para varios anticuerpos en la proteína tanto epitopos lineales como conformacionales. Los anticuerpos monoclonales (mAb) se crearon para moléculas expresadas en la fase temprana de la activación de célula T. Un anticuerpo designado A12 tenía efectos agonísticos únicos en los clones de las células T y reconocía una molécula de activación temprana previamente no identificada designada SLAM. El anticuerpo A12 inducía directamente una proliferación de los clones de células T CD4+ que pertenecían a los subgrupos de ThO, Th1 , y Th2. En la ausencia de cualquier otro estímulo, A12 o su F(Ab')2 inducían la proliferación de los clones de las células T (B21 , ChT38, HY06, y TA23) mientras que de acuerdo con estudios previos, ver June, et al. (1990) Immunol. Today 11 : 211-216, la vinculación de CD28 resultaba ineficaz. Estos datos indican que SLAM actúan independientemente de CD28 y que juega un rol nuevo e importante en la célula T. Un ADN que codifica SLAM se aisló a partir de una genoteca de ADNc de células T mediante clonación de la expresión usando A12 para la selección. El ADNc de SLAM eran de 1860 pares de base de longitud y contenía un gran cuadro de lectura abierto que codificaba una proteína de transmembrana de tipo I con una secuencia líder hidrófuga N-terminal de 27 amino ácido, una región extracelular de 202 amino ácidos que contenían 8 sitios potenciales de N-glícosilacíón, una porción que comprendía una membrana hidrófuga de 22 amino ácidos y un dominio citoplásmico de 77 amino ácidos. Ver SEC ID N° : 1. Tres de los cuatro sitios centrales de fosforilación tyr en el dominio citoplásmico SLAM están de acuerdo con la secuencia de consenso de fosfotirosina-hidrofóbica-X-hidrofóbica determinado para fijarse a una clase de dominio SH2. Ver Zhou, et al. (1993) Células 72: 767-778. Los antisueros creados contra SLAM recombinante precipitaron una giicoproteina de 70 kD a partir de un clon de la células T CD4+ activada. El tratamiento con N-glicanasa de la SLAM inmunoprecipitada reveló un núcleo proteínico de 40 kDa, lo cual está correlacionado con el tamaño molecular predicho. SLAM exhibe características de un miembro en la familia supergénica de la ¡nmunoglobulina (Ig), con un dominio variable y un dominio constante y muestra cierto grado de homología con CD48 (26% de homología; ver Stauton and Thorley-Lawson (1987) EMBO J. 6: 3695-3701 ), LFA-3/CD58 (17% de homología; ver Seed (1987) Nature 329:840-842), y una molécula señaladora clonada recientemente que se expresa en NK de múridos y células T citotóxicas denominadas 2B4 (28% de homología; ver Mathew, et al. (1993) J. Immunol. 151 : 5328-5337). Usando reacción en cadena de polimerasa para detectar transcripciones de varios tejidos y tipos de células, resulta clara que SLAM se expresa principalmente en las células linfoides. O las células mononucleares activada de la sangre periférica (PBMC) confinen una transcripción 1 ,9 kb que corresponde al tamaño del ADNc de SLAM clonada y también una transcripción de 4 kb. El ARNm 4 kb está compuesto por lo menos por dos transcripciones diferentes, incluyendo una de ellas la codificación de una forma secretada de SLAM que carece de 30 amino ácidos incluyendo la región entera de transmembrana de 22 amino ácidos y otra que codifica la SLAM de transmembrana. Un clon de ADNc 2 kb alternativamente empalmado fue también identificado, y codificado a una forma de SLAM con un dominio citoplásmico truncado. El ARNm de SLAM se induce dentro de las dos horas después de la activación lo cual está correlacionado con su rápida aparición en las superficies de la célula T. El SLAM no se expresa en las células T naturales CD45RA"" pero puede ser expresado a bajos niveles en las células T, de memoria CD50RO elevad0 , en ausencia de activación in vitro. La expresión de SLAM es rápidamente inducida ( en 3 horas) en células T CD45RA elevad0 naturales, y puede ser mejorado en células T CD50RO ele ad0 después de la activación y se produce la expresión máxima a las 6-8 horas. Los timocitos fetales CD3 aj0 , CD4+, CD8 inmaduros expresan SLAM, mientras que los timocitos CD4+ o CD8+ simples CD3 a,° elevado son los más negativos. SLAM se expresa a niveles muy bajos en las células B periféricas, y están regulados con activación pero no están presentes en los monocitos. La presencia de SLAM en las células B y las células de T de memoria CD50RO e,evado? y las que se producen naturalmente a partir de una forma soluble de SLAM sugieren una amplia función de esta molécula. El descubrimiento del que la co-estimulación a través de SLAM realzan las respuestas proliferativas específicas de Ag-específicas e induce perfiles de producción de citoquina Th0/Th1 en los clones de células T, incluyendo los clones Th2, o sugiere que la interacción SLAM y su ligando contribuirán a la expansión de las células T y a la generación de las respuestas ThO o Th1 . Además de sus efectos estimuladores directos sobre los clones de células T, el SLAM actúa como una molécula co-estimuladora para la activación de las células T. Las respuestas proliferativas específicas de antígenos óptimas en las células T de la sangre periférica de dadores inmunizados con toxoides de tétanos (TT) o con derivados de proteínas purificados (PPD) se realzaron adicionalmente en una dosis que depende de la forma mediante la adhesión de A12 F (ab')2 lo cual indica que la vinculación específica de SLAM es responsable de la mejora en las respuestas de las células T. En general, se observó un aumento de 2 a 3 veces en la proliferación. De manera similar la proliferación específica de antígeno óptima de los clones de las células T CD4+ mejoraron en presencia de A12 F (ab')2 en una forma que dependía de dosis. Este incremento se observó con los clones de las células T CD4+ que pertenecen a los subgrupos Th2, ThO, y Th1 los efectos coestimuladores intermediados a través de las SLAM de las células T no se restringieron a las estimulación específica de Ag, ya que la proliferación de las células T inducida por mAb anti-CD3 de anillo incrementada por A12. Incluso a concentraciones óptimas de anti-CD3, se observó un aumento adicional de 2-3 veces en la proliferación, al vincular el SLAM mediante A12. La producción de citoquinas, por parte de un panel de clones de células T CD4+ pertenecientes a diferentes subgrupos estimulados por sus respectivos antígenos, se sobrereguló después de la vinculación de SLAM con A12. En partícula, mejoró enormemente la producción de IFN-? mediante A12 y A12 F (Ab')2. La co-estimulación de los clones Th2 con A12 o su F (Ab1)2 sobre reguló enormemente (5-17 veces) la producción de IFN-? , mientras que hubo muy pocos efectos de mejoras (menos de dos veces), o no hubo ninguno en la producción de IL-4 en los cuatro clones ensayados. Los niveles de la producción de IFN-? inducidos en presencia de los clones A12 mediantes los clones Th2, fueron comparables a los inducidos por el antígeno en los clones oe Th1 y ThO. Una coestimulación A12, también preferencialmente mejoró la producción de IFN-? mediante los clones ThO y Th1. En contraste con sus fuertes efectos inductores de IFN-? en los clones Th2, la coestimulacióp a través de SLAM no indujo producción de IL-4 y IL-5 mediante los clones Th1. Estos resultados indican que la coestimulación de la célula específica a través de SLAM da como resultado una inducción preferencial de la producción de IFN-? incluso en los clones de las células T de CD4+ específica de alérgenos del subgrupo Th2 invirtiendo de este modo el fenotipo de estas células a un perfil de producción de citoquina ThO planas. El patrón de producción de citoquina que define los clones de Th1 establecidos, sin embargo, no es alterado por la coestimulación a través de SLAM. Las células T de la sangre periférica activadas por PHA durante 5 días (PHA- blástico) proliferan directamente en respuesta a la estimulación con mAbs, anti-SLAM lo cuál indica que una vez que las células T son activadas a través del receptor de la célula T, la ligación directa de SLAM da como resultado la expansión de las células T. Además, la activación de estos PHA blásticos mediante los fragmentos anti-SLAM F (ab')2 durante 24 horas da como resultado niveles elevados de producción IFN-? mientras que el IL-4 fue ¡ndetectable, lo cual indica que la ligación de SLAM da como resultado un perfil de producción de citoquina Th1. El mAb anti-SLAM, en presencia de PHA, es capaz de inducir la expansión a largo término de las células T de la sangre periférica CD4+ altamente purificadas. Las células T continúan proliferando con un doble tiempo de 16 horas durante 9 semanas (que es el período de tiempo máximo que se analizó) en respuestas a las re-estimulaciones semanales con PHA (1 µg/ml) y mAb apti-SLAM (10 µg/ml). Estos resultados, como conjuntamente con la observación de que la vinculación de SLAM mediante F (ab')2 anti-SLAM mAb induce altos niveles de producción de IFN-? (por lo tanto un perfil de producción de fitoquina de tipo de Th1 ) en los clones de Th2 humanos, indican que el tratamiento con mAbs anti-SLAM F (ab')2 o con fragmentos F (ab')2 anti-SLAM humanizados pueden tener una utilidad clínica potencial en varias enfermedades. El F (ab')2 anti-SLAM, o composiciones de fijaciones similares, seria útil para tratar, por ejemplo, deficiencias de inmunidad de la célula T adquirida que se caracterizan por prolifereración de la célula T específica de antígeno tal como se observa en las infecciones de virus Herpes tal como la infección de citomegalovirus. La aceleración de la estauración del compartimiento de la célula T después de quimioterapia y/o terapia de radiación en pacientes con cáncer o después de terapia de ¡nmunosupresión que precede al trasplante de médula seria otra condición que se beneficiaría de la terapia precedente. El anticuerpo SLAM o las composiciones de adhesión pueden usarse por ejemplo como coadjuvantes para la vacunación o para compensar una falta de células T intermediado por HIV en pacientes con sida. Esta terapia puede redirigir también la enfermedad que cuesta la respuesta de Th2 (caracterizada por altos niveles de producción de IL-4 y IL-5) para curar la respuesta de ThO , o Th1 caracterizadas por la producción de IFN-? , por ejemplo, alergias a alimentos y drogas; rinitis; dermatitis atópica; astma; el hiper síndrome de IgE hiper eosinofilia; y enfermedades infecciosas tales como Lepra Lepromatosa, ver, Yamamura, et al. (1991) Science 254: 277-279; Leishmaniasis; enfermedad de Chagas; Esquistomiases; y Tripanosmiasis, ver, de Vries, et al. (eds.) (1995) lnterleudina-10 R.G. Landes Company, Austin, Texas, pp. 70 y 91. Varios estudios han indicado que los patrones de producción de citoquina de células T alterados están asociados con el avance de la patogénesis del sida. Las células mononucleales de la sangre periférica (PBMC) obtenidas a partir de individuos infectados con HIV-1 tempranamente una infección son relativamente normales con respecto a sus perfiles de producción de citoquina en respuestas a los antígenos de retorno. En esta etapa ansintomática, estos PBMC activados producen predominantemente IL-2, y únicamente niveles muy bajos e IL-4 e IL- - . Posteriormente en el rechazo al HIV, los perfiles cambian a niveles reducidos de producción de IL-2 y a crecientes niveles de IL-4 y IL-10. Ver, Clerici et al. (1993) J.CIin. Invest. 91 :759-765; y Clerici et al. (19941 J. Clin. Invest.:93:768-77S Además, las células Th2 parecen ser más susceptibles a la infección de HIV. Los anticuerpos SLAM o la composición de fijación podría resultar útil para redirigir las respuestas Th2 (que favorecen la producción de anticuerpos) a las respuestas Th1 (que dirigen las respuestas intermediadas por células). Esta terapia puede resultar beneficiosa por enfermedades causadas por complejos de inmunidad tales como glomerunefritis y artitris juvenil. A fin de identificar el el ligando natural para SLAM, se generó la proteína de fusión de SLAM-inmunoglobulina (SLAM-lg). La porción SLAM de SLAM-lg fijada específicamente a las células L es establemente transfectada con SLAM. Cualquier anillo de carbono, además, SLAM-lg inter-actúa homofílicamente en solución lo cual demuestra que el SLAM puede servir como auto-ligando. La fijación de SLAM-lg está también correlacionada con su expresión de SLAM. A diferencia y otros ligandos descriptos para las células T, SLAM expresada en las células T provee una señal proliferativa directa para los clones de la células T humana en ausencia de cualquier otro estímulo. Esta nueva actividad estimuladora provista por la interacción homofílica de SLAM o resistentes a la ciclosporina. Secuencias SLAM Humanas El nucleotido SLAM1 (pSURsIaml ) y las secuencias de amíno ácidos predicha se demuestra en las SEC ID N°: 1 y 2. La secuencia líder pre-dícha y las secuencias de transmembrana son los amino ácidos son 1-27, 237-258, aunque los límites naturales pueden ser diferentes, dependiendo también del tipo de célula. Un exop que encodifica el dominio de transmembrana que no está presente en SLAM3 (pSECsIam) humano incluye los nucleotidos 761 -780. La Cisternas se encuentran en los amino ácidos numerados. 53, 57, 102, 125, 150, 155, 189, y 217. Los fragmentos entre cisteinas y/o los sitios de glicosilación N-ligados son particularmente útiles para generar anticuerpos. El nucleotido humano SLAM2 (pSURslc.tt?2) y la secuencia de amino ácido predicha se describe en el SEC ID N°: 3 y 4. El SLAM2 humano aparentemente difiere de SLAM1 humano, por un evento de empalme diferencial que da como resultado una secuencia C-terminal diferente que comienza en el nucleotido 924.

El nucleotido SLAM3 (pSECsIam) humano y la secuencia de amino ácido predicha se describe en la SEC ID N°: 5 y 6. La unión de empalme en la cual en la secuencia de dominio de transmembrana de SLAM1 fue suprimida está en el nucleotido 761 . El SLAM3 es secretado por las células COS transfectados con pSECsIam, codifica una forma soluble de SLAM. Usando cebadores específicos para esta forma soluble de SLAM para RT-PCR, se detectó el transcripto SLAM3 en diferentes tipos de células, lo cual confirma que es un ARNm genuin El nucleotido y la secuencia de amino ácido predicha de SLAM de ratón se muestra en SEC ID N°: 9, 10, 11 y 12. Una versión de SLAM de ratón es una proteína de transmembrana de tipo I que contiene 9 sitios potenciales de glicosilación ligados con N. El peso molecular no glicosilado predichos de 40.000. La secuencia que se muestra es para SLAM1 de ratón (en el plásmido pMSLAMI ) que es ADNc de SLAM de 1 ,8 kb abundante, sin embargo también se aisló otro SLAM2 de ADNc de 1.8 kb (en pMSLAM2), que representa aproximadamente 25% del ADNc. SLAM2 comparte aproximadamente el primer 1 kb de secuencia con la secuencia SLAM1 que contiene una secuencia diferente en su extremo 3'. Este ADNc de SLAM2 en pMSLAM2 codifica una proteína SLAM con un dominio citoplásmico diferente. La Tabla 1 muestra una alineación de la secuencia de la proteína SLAM seleccionadas humanas y de ratón. Tal como sucede en el caso de SLAM humano, el SLAM oe ratón tiene típicamente de inmuno globulina V y uno de C y comparte una extensa homología de amino ácido con SLAM humano en la molécula entera, contándose 88% sustituciontes conservativas. La homología a nivel nucleotidico es de aproximadamente 70 %. Esta proteína de ratón contiene 8 inserciones de amino ácidos separadas relativas a las de SLAM humano La cisteina en el dominio extracelular están todas conservadas en el contexto de las tres tirosinas en el dominio citoplásmico queda perfectamente retenido. Las dos tirosinas distantes del dominio citoplásmico no están presentes en las moléculas SLAM2 de ratón empalmadas codificada por pSLAM2 (SEC ID N°: 1 1 y 12) con la única porción de este dominio citoplásmico no comparte elevada homología con SLAM humano. Existe una forma alternativamente empalmada de SLAM humano con una cola citoplásmica diferente. La secuencia alternativa en pMSLAM2 no es homologa de la secuencia única de el SLAM2 humano (pSURslam2), pero sin embargo, la posición en la secuencia nucleotidica donde el exon alternativo está empalmado, es idéntica en ambas secuencias. Secuencias SLAM de ratón. El nucleotido SLAM1 (pMsIaml ) de ratón y la secuencia de amino ácido predicha se describe en la SEC ID N°: 9 y 10. La secuencia líder predicha y la secuencia de transmembrana son los amino ácidos 1 -28 y 242- 267, aunque los límites naturales pueden ser diferentes dependiendo también del tipo de célula. La cisteinas se encuentran en los residuos amino ácidos numerados 32, 133, 161 , 167, 212, 232, 276, y 310. Se encuentran sitios de glicosilación N-ligados potenciales en los residuos numerados 54, 58, 103, 126, 151 , 158, 192, 210 y 226. Los fragmentos entre cisteinas y/o sitios de glicosilación N-ligados son particularmente útiles para generar anticuerpos. El nucleotido de ratón SLAM2 (pMSLAM2) y ¡as secuencias de amino ácidos predicha se muestran en la SEC ID N°: 1 1 y 12. El punto después del cuál la secuencia de ratón SLAM2 difiere de SLAM1 de ratón comienza en el nucleotido 944. Tabla 1: Alineación de SLAM1 de ratón con SLAM1 humano. • indica una cisteina conservada; * indica amino ácidos directo; . indica un amino ácido conservado: las cisternas conservadas en el dominio citoplásmico están subrrayadas.

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Secuencias adicionales para proteínas de otras especies de mamíferos, por ejemplo de primates y roedores, deberían estar también disponibles. Las descripciones se dan a continuación se dan como ejemplo de un SLAM humano pero son también aplicables a realizaciones relacionadas con otras especies. La proteína SLAM humana aislada es una proteína que exhibe rasgos extructurales que son característicos de un antígeno de superficie de célula. La proteína se detecta fácilmente en tipos de células particulares, y otras expresan menores cantidades. Ver Tabla 2. El SLAM intermedia una respuesta bioquímica para la fijación de un anticuerpo, o de otros ligandos todavía no identificados, lo cual conduce a transducción de señal y respuesta celular. En particular, el antígeno SLAM ha sido aislado por clonación de expresión usando un anticuerpo específico. El antígeno SLAM se aisló y se caracterizó como una proteína que migra por electrofóresis de gel de polioacrilamida con una movilidad que es característica de una proteína de aproximadamente 70 kD. La proteína de núcleo, después del tratamiento con N-glicanasa, tiene la movilidad de una proteína de aproximadamente 40 kd. Tabla 2: Expresión celular de SLAM. El ARN de varias células y tejidos se sometió a transcripción inversa y PCR usando cebadores específicos de SLAM. Se proveen determinaciones cualitativas aproximadas, aunque un negativo simplemente significa que está por debajo de los niveles del umbral de detección. El Timo expresa también el mensaje.

TIPO DE CÉLULA EXPRESIÓN Células B transformadas con JY EBV + CD4+ CD20+ de células B purificadas + ' S11 de clon de célula T CD4* + S40 de clon de célula T CD4+ + B21 de clon de célula T CD4+ + B21 de clon de célula T CD4+activado + Células NK purificadas + Células NK purificadas + Hígado fetal - Médula fetal - Timo fetal + Intestino delgado - Cerebro - Riñon - Corazón - Líneas de Células pre-T FL508 + Línea de Célula pre-T TN92 + El antígeno SLAM debería estar presente en los tipos de tejidos identificados, y la ineteracción del antígeno con su par de fijación debería ser importante para intermediar en varios aspectos de la fisiología o desarrollo celular. II. SLAM Purificado Las secuencias de amino ácidos de SLAM de ratón y humano se muestra en SEC ID N°: 2,4,6, 8, 10 y 12. Estas secuencias de amino ácido que proveen amino a carboxi son importantes para proveer información sobre la secuencia en el antígeno que permitirá distinguir la proteína de otras proteínas y ejemplificar numerosas variantes. Además, las secuencias de los péptidos permiten la preparación de péptidos para generar anticuerpos que reconozcan dichos segmentos, y para permitir la preparación de sondas de oligonucleótidos, siendo ambas cosas estrategias para la detección o aislación, por ejemplo para la clonación que codifican dichas secuencias. Tal como se emplea aquí el término "SLAM humano" abarcará, cuando se emplea en el contexto de una proteína, las proteínas que tienen secuencias de amino ácidos tales, las que se muestran en SEC ID N°: 2, 4, 6 o 8 o de dichas proteínas o otra proteína altamente homologa derivada de humanos. Claramente, estas especies de humano ARNm representan variantes de empalme. También se refiere a un polipéptido de origen humano que exhibe una función biológica similar o que interactua con los componentes de fijación específicos de SLAM. Estos componentes de fijación, por ejemplo, los anticuerpos se fijan típicamente a SLAM con una elevada afinidad por ejemplo de por lo menos aproximadamente 100 nM, usualmente de más de aproximadamente 30 nM, preferentemente de más de aproximadamente 30 nM , preferentemente superior a aproximadamente a 10 nM , y aun más preferentemente a aproximadamente 3nM. Las proteínas homologas se encontrarían en especies de animales distintos de humanos.por ejemplo en primates o roedores. Las especies que no corresponden a mamíferos deberían poseer también proteínas y genes estructural o funcionalmente relacionados, por ejemplo, aves o anfibios. El término "polipéptído" incluye un segmento o fragmento significativo, y abarca una extensión de residuos de amino ácidos de por lo menos 8 amino ácidos, en general de por lo menos aproximadamente 12 amino ácidos, y tipicamente de por lo menos aproximadamente de 16 amino ácidos, preferentemente de por lo menos aproximadamente 20 amino ácidos, y, en realizaciones particularmente preferidas por lo menos aproximadamente 30 amino ácidos o más. El término "composición de adhesión" se refiere a las moléculas que se fijan con especificidad a SLAM, por ejemplo, en el modo del tipo de adhesión por pares o por interacción de anticuerpo-antígeno. Incluye también los compuestos que por ejemplo tal como las proteínas se asocian específicamente con SLAM incluyendo una interacción fisiológicamente relevante y natural de proteína a proteína ya sea covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero o un reactivo químico. El análogo funcional puede ser un antígeno con modificaciones estructurales, o puede ser una molécula que tenga una configuración molecular que inter-actúa^ con los determinantes de adhesión apropiados. Los compuestos pueden servir corno agonistas o antagonistas de la interacción de adhesión, ver por ejemplo, Goodman, et. al., (eds.) (1990) Goodman & Gilman. Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica (8a edición), Pergamon Press. Substancialmente puro significa típicamente que la proteína está libre de cualquier otra proteína contaminante, de ácidos nucleicos u otros agentes biológicos derivados de la fuente original del organismo. La pureza puede ser sometida a ensayo mediante métodos convencionales, típicamente por peso, y comúnmente será de una pureza de aproximadamente 40% generalmente de por lo menos aproximadamente una pureza del 50% y a menudo por lo menos de aproximadamente una pureza del 60%, y típicamente por lo menos de aproximadamente del 80% y preferentemente del 90%, y en la mayoría de las realizaciones preferidas era de por lo menos una pureza de aproximadamente 95%. Se le agregaron a menudo por poderes o excipientes. La solubilidad de un polipéptido o un fragmento depende del ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad de los polipéptidos, incluyendo la temperatura, el ambiente electrolítico, las características moleculares del tamaño del polipéptido y la naturaleza del solvente. Típicamente la temperatura a la cuál se le empleará el polipéptido está comprendida entre desde aproximadamente 4° C hasta aproximadamente 65°C. Usualmente la temperatura de uso es superior a aproximaoarnente 18°C. Un propósito de diagnóstico la temperatura usualmente será de aproximadamente temperatura ambiente o más caliente pero será inferior a la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para los propósitos terapéuticos, la temperatura será usualmente la temperatura del cuerpo, y típicamente de aproximadamente 37°C para los humanos y para los ratones, aunque bajo ciertas situaciones la temperatura puede elevarse o disminuir in situ o in vitro. El tamaño y la estructura del polipéptido deberían estar generalmente en un estado substancialmente estable y usualmente no deberían estar en estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferirle solubilidad, o por estar asociado con lípidos o detergentes en una manera que se aproximan a las interacciones naturales de bicapas de lípidos. El solvente y los electrolitos serán usualmente un buffer biológicamente compatible, y el tipo que se usa para la preservación de las actividades biológicas, y usualmente se aproximarará a un solvente acuoso fisiológico. Usualmente el solvente tendrá un pH neutro típicamente de aproximadamente 5 a 10 y preferentemente de aproximadamente 7,5. En algunas ocasiones, se agregarán uno o más detergentes, típicamente un solvente suave no desnaturalizado, por ejemplo CHS (Hemisuccinato de Colesterilo) o CHAPS (sulfonato de 3-[3-colamidopropil) dimetilamonio]-1 -propano) o en una concentración suficientemente baja para evitar una significativa fracturación de las propiedades estructurales o fisiológicas de las proteínas. III. Variantes Físicas Esta invención abarca también proteínas o péptídos que tienen una substancia de identidad de secuencia de amino ácido con la secuencia de amino ácido de SLAM. Las variantes incluyen especies o variantes alelicas. La homología de las secuencias de amíno ácidos o la identidad de secuencia se determina optimizando los apariamientos de los residuos si es necesario introduciendo espacios según se requiera. Ver también Needleham, et al., (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; Sankoff, et al. (1983) Capítulo uno en "Time Warps. String Edits. and Macromolecules: The Theorv and Practice of Sequence Comparisons". Addison-Wesley, Reading, MA;. y software de IntelliGenetícs, Mountain View, CA; y "University of Wisconsin Genetics Computer Group", Madison, Wl. La identidad de las secuencias cambia cuando se consideran las substituciones conservativas como apariamiento. Las substituciones comparativas incluyen típicamente substituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina, vaiina, isoleucina, leucina, ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, glutamina; serina, treopina; lisina, argenina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de amino ácidos homologas están destinadas típicamente a incluir las variaciones naturales alélicas y de interespecies en cada respectiva secuencia de proteína. Las proteínas o péptidos típicos homólogos tendrán una identidad de 25-100 % ( y pueden introducirse espacios), una identidad de 50-100 % ( si se incluyen substituciones conservativas) con las secuencias de amino ácidos de SLAM. Las mediciones de identidad serán de por lo menos aproximadamente 35% generalmente de aproximadamente 40% a menudo de por lo menos aproximadamente 50%, típicamente de por lo menos 60%, usualmente de por lo menos aproximadamente 70%, preferentemente de por lo menos aproximadamente 80%, y aun más preferentemente de por lo menos más aproximadamente de 90%. El ADN de SLAM aislado puede modificarse fácilmente mediante substituciones de nucleotidos, supresiones de nucleotidos, inserciones de nucleotidos, e inversiones de extensiones de nucleotidos. Estas modificaciones dan como resultado nuevas secuencias de ADN que codifican estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen actividad fisiológica, inmunogénica, antigénica, u otra actividad funcional similares. Esta secuencias modificadas pueden usarse para producir antígenos mutantes o para mejorar la expresión.

Mejorar la expresión puede involucrar amplificación génica, un aumento de la transcripción, aumento de la traducción y otros mecanismos. "SLAM mutante" abarca un polipéptido que por otra parte entraría dentro de la definición de identidad de secuencia del SLAM tal como se indicó más arriba pero que tiene una secuencia de amino ácido que difiere de la del SLAM que se encuentra normalmente en la naturaleza, ya sea mediante supresión, substitución o inserción. Esto incluye en general proteínas que tienen la significativa identidad con una proteína que tiene la secuencia de SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, o 12 y que comparte varias actividades biológicas por ejemplo, antigénicas o inmunogénicas con estas secuencias, y en las realizaciones preferidas contienen la mayor parte de las secuencias descriptas de longitud total. Las secuencias de longitud total serán típicamente las preferidas aunque también resultarán útiles versiones truncadas de las mismas. Pueden aplicarse conceptos similares a diferentes proteínas SLAM, particularmente a las que se encuentran en varios animales de sangre caliente, por ejemplo, en los mamíferos y las aves. Estas descripciones significan en general que abarcan todas las proteínas SLAM y que no se limitan a la realizaciones particulares de humano o de ratón específicamente discutidas. La mutagénesis SLAM puede llevarse también a cabo efectuando inserciones o supresiones de amino ácidos. Pueden generarse, substituciones, supresiones, insersiones o cualquier combinación de las mismas para llegar a una construcción final. Las inserciones incluyen funciones amino o carboxi terminales. Las mutaciones al azar puede llevarse a cabo bajo un codón objetivo y los mutantes expresados pueden rastrearse luego para la actividad deseada. Los métodos para efectuar mutaciones de substitución en sitios predeterminados en el ADN, que tienen secuencias bien conocidas son bien conocidos en el arte, por ejemplo, técnica de mutagénesis de cebadores M13 o técnicas de reacción de cadena de polimerasa ( PCR ). Ver por ejemplo, Sambrook, et al. (1989) Methods in Enzvmol. 154: 367-382. La presente invención provee también proteínas recombinantes por ejemplo proteínas heterólogas de fusión que usan segmentos de estas proteínas. Una proteína heteróloga es una fusión de proteínas o segmentos que naturalmente no están normalmente fusionadas de la misma manera. Un concepto similar puede aplicarse a las secuencias heterólogas de ácidos nucleicos. Además, puede preparse nuevas construcciones a partir de la combinación de dominios funcionales similares de otras proteínas. Por ejemplo, la adhesión al objetivo o al otro segmento puede ser "trocada" entre diferentes nuevos polipéptidos o fragmentos de fusión. Ver por ejemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1330-1336; y O'Dowd, et al., (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992. El método de fosforamidita descripto por Beaucage y Carruthers (1981) Tetra. Letts. 22: 1859-1862, producirán fragmentos de ADN sintéticos apropiados. A menudo podrá obtenerse un fragmento de doble hélice ya sea sintetizando la cadena complementaria y templando la cadena conjuntamente bajo condiciones apropiadas ya sea agregando la cadena complementaria usando polimerasa de ADN con una secuencia cebadora apropiada por ejemplo mediante técnicas de PCR. IV. Variantes Funcionales El bloqueo de la respuesta fisiológica a SLAMs puede ser el resultado de la inhibición de la adhesión del antígeno a su par de adhesión, por ejemplo, a otro mismo, probablemente a través de inhibición competitiva. Por lo tanto los ensayos in vítro de la presente invención se usan a menudo proteínas aisladas, membranas de células que expresan un SLAM recombinante asociado a membranas, fragmentos solubles que comprenden segmentos de adhesión de antígenos de estas proteínas o fragmentos adheridos a substratos de fases sólidas. Estos ensayos permitirán también diagnosticar la determinación de los efectos de cualquier modificación y mutación de segmento de adhesión, o las mutaciones y modificaciones del antígeno, por ejemplo, los análogos SLAM. Esta invención contempla también el uso de ensayos competitivos de rastreo de drogas, por ejemplo, aquellos en los cuales los anticuerpos neutralizantes para el antígeno o los fragmentos de adhesión compiten con un compuesto de ensayo para adherirse a ia proteína. "Derivados" de antígenos SLAM incluyen los mutantes de las secuencias de amíno ácido, la variantes de glicosilación, y los conjugados covalentes o agregados con otras opciones químicas. Los derivados covalentes pueden preparse mediante el enlace de las funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadenas laterales de amino ácidos SLAM o en los términos N- o C-, por ejemplo por medios convencionales. Ver por ejemplo, Lundbland and Noyes (1988) "Chemical Reagents for Protein Modification". vols.1-2, CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL; Hugli (ed.) (1989) "Techníques in Protein Chemistry". Academic Press, San Diego, CA; and Wong (1991)"Chemistry of Protein conjugation and Cross Linking". CRC Press, Boca Ratón, FL. En particular, se incluyen alteraciones de la glicosilación preparadas por ejemplo mediante la modificación de patrones de glicosilación de un polipéptido durante sus síntesis y procesamiento o en etapas de su procesamiento en etapas superiores. Ver, por ejemplo, Elbein (1987) Ann. Rev. Biochem. 56: 497-534. Asimismo, están también comprendidas las versiones de los péptidos con la misma secuencia de amino ácido primaria que tienen otras modificaciones menores incluyendo residuos de amino ácidos fosforilados, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina, o fosfotreonina. Los polipéptidos de fusión entre SLAMs y otras proteínas homologas heterólogas también se proveen. Muchos receptores de citoquina u otras proteínas de superficies son multiméricas, por ejemplo, son entidades homodiméricas y otras construcciones pueden tener varias ventajas incluyendo menor susceptibilidad a la disociación proteolítica. Entre los ejemplos típicos están las fusiones de un polipéptido repórter, por ejemplo, la luciferasa con un segmento o dominio de la proteína, por ejemplo, un segmento fijador de receptor de modo de que pueda ser fácilmente determinada la presencia o la ubicación del ligando fusionado. Ver por ejemplo, Dull, et al., Patente de los Estados Unidos N°. 4.859.609. Otras asociaciones de fusiones génicas incluyen ß-galactosidasa, trpE, Proteína A, ß-lactamasa, alfa amilasa, deshidrogenasa de alcohol, factor de apariamiento alfa de levadura y fragmentos de detección o purificación tales como una secuencia FLAG de la secuencia His6. Ver, por ejemplo, Godowski, et al., (1988) Scjencje. 241 : 812-816. Los péptidos de fusión se preparan típicamente o bien mediante los métodos recombinantes de ácido nucleico o bien por métodos sintéticos. Las técnicas para manipulación y expresión de ácido nucleico se han descripto en general por ejemplo en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory; y Ausubel, et al. (eds.) (1993) Current Protocols in Molecular Biology , Greene y Wiley, NY. Las técnicas para las síntesis de polipéptidos se han descripto por ejemplo en Merrifield (1986) Science 232: 341-347; Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Svnthesis: A Practical Approach , IRL Press, Oxford, and Grant (1992) Synthetic Peptides: A User's Guide. W.H. Freeman, NY. Esta invención contempla también el uso de derivados de SLAMs distintos de las variaciones de las secuencias de amino ácidoe o glicosilación. Dichos derivados pueden involucrar una asociación covalente o agregativa con las porciones químicas. Los derivados covalentes o agregativos serán útiles como inmunógenos, como reactivos en inmuno ensayos, o en los métodos de purificación tales como la purificación por afinidad de pares de adhesión, por ejemplo, otros antígenos. Un SLAM puede movilizarse por unión covalente a un soporte sólido ta! como SEPHAROSE, activada por bromuro de cianogeno por métodos que son bien conocidos en el arte, o puede ser absorvida sobre superficies de poliolefina con o sin entrecruzamiento de glutaraldehido, para ser enjuzado en el ensayo o purfificación de los anticuerpos anti-SLAM o en una composición de adhesión alternativa. Los SLAM pueden rotularse también con un grupo detectable por ejemplo, para ser usados en ensayos de diagnóstico. La purificación de SLAM puede efectuarse mediante un anticuerpo inmobilizado o por un par de adhesión complementario. Un fragmento o SLAM solubilizado de esta invención puede usarse como ¡nmunógeno para la producción de antisueros o anticuerpos específicos para la adhesión al antígeno, o fragmentos del mismo. Puede usarse un antígeno purificado para rastrear los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de adhesión de antígenos, abarcando fragmentos de adhesión de antígeno, de anticuerpos naturales. Los SLAM purificados pueden usarse también como reactivos para detectar los anticuerpos generados en respuesta a la presencia de niveles elevados de antígeno o de fragmento de célula que contienen el antígeno, pudiendo diagnosticar un estado fisiológico específido o anormal o una enfermedad. Esta invención contempla los anticuerpos creados contra la secuencia de amipo ácido codificada por la secuencias nucleotídicas que se muestran en SEC ID N° : 1 , 3, 5, 7, 9, o 1 1 o, fragmentos de las proteínas que las contienen. En particular, esta invención contempla anticuerpos que tienen afinidad de adhesión con o que están creados contra fragmentos específicos que se han predicho que están fuera de la bicapa de líquidos, tanto extracelulares como intracelulares.

La presente invención contempla la aislación de variantes de especies adicionales especialmente relacionadas. Los análisis de borrón Southern y Northern deberían establecer que existen entidades genéticas similares en otros mamíferos. Es probable que SLAM esté ampliamente extendido en variantes de especies por ejemplo, en roedores, carnívoros, artiodactilos, perisodáctilos y primarios. Esta invención provee medios para aislar un grupo de antígenos relacionados que exhiben diferencias y similitudes en la estructura, expresión y función; la determinación de muchos de los efectos fisiológicos de las moléculas se acelerará enormemente mediante la aislación y caracterización de las especies distintas adicionales variantes de las mismas. En particular, la presente invención provee sondas que son útiles para identificar entidades genéticas homologas adicionales en especies diferentes. Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de un SLAM correspondiente, por ejemplo cualquier tipo de célula o especie que carezca de los antígenos correspondientes y que exhiba una actividad de base negativa. Esto debería permitir el análisis de la función de SLAM en comparación con las células de control no transformadas. La dissección de los elementos naturales críticos que efecútan las varias funciones de activación o diferenciación intermediadas a través de estos antígenos es posible usando técnicas convencionales de biología particular moderna particularmente al comparar los miembros de la clase relacionada. Ver por ejemplo, la técnica de mutagénesis de exclaración de homólogos descripta en Cunningham, et al. (1989) Science 243: 1339-1336; y las realizaciones usadas por O'Dowd, et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 15985-15992; y Lechleiter, et al. (1990) EMBO J, 9: 43871- 4390. Las funciones intracelulares involucrarían probablemente segmentos del antígeno que son normalmente accesibles al citosol. Sin embargo, la internalización de las proteínas puede producirse bajo ciertas circunstancias, y pueden ocurrir interacciones entre componentes intracelulares y segmentos "extracelulares". Los segmentos específicos para la interacción de SLAM con otros componentes intracelulares puede identificarse mediante mutagénesis o medios bioquímicos directos, por ejemplo, entrecruzamiento o afinida. También podrá aplicarse análisis estructurales mediante métodos cristalográficos u otros métodos. La investigación adicional del mecanismo de la transducción de señal incluirá el estudio de los componentes asociados que pueden ser aislables por métodos de afinidad o por medios genéticos, por ejemplo, análisis de complementación de los mutantes. Se proseguirán estudios adicionales sobre la expresión y control de SLAM. Los elementos controladores que están asociados con los antígenos deberían exhibir patrones diferenciales ecológicos, de desarrollo, específicos de tejidos y otros patrones de expresión. Las regiones genéticas cadena arriba o cadena abajo por ejemplo, los elementos de control, son de interéz. En particular se han hallado variantes fisiológicas particulares, por ejemplo, formas múltiples alternativamente procesadas del antígeno, ver por ejemplo, SEC ID N°: 1 y 3. Por lo tanto, el empalme diferencial del mensaje puede conducir a una provisión de formas adheridas a la membrana, formas solubles y versiones modificadas del antígeno. Los estudios estructurales de los antígepos conducirán a diseñar nuevos antígenos, particularmente análagos que exhiben propiedades agonistas u antagonistas sobre la molécula. Esto puede combinarse con los métodos de rastreo previamente descríptos para aislar antígenos que exhiben los espectros de actividades deseados V. Anticuerpos Los anticuerpos pueden crearse para varios SLAM, incluyendo especies o variantes alélicas y fragmentos de las mismas, - tanto en sus formas naturales como en sus formas recombinantes. Adicionalmente los anticuerpos pueden crearse para SLAM ya sea en sus formas activas como en sus formas inactivas, incluyendo versiones naturales o desnaturalizadas. Los anticuerpos anti-idiotípicos también se han contemplado. Los anticuerpos incluyendo los fragmentos de adhesión y la versiones de cadena única, contra fragmentos determinados de los antígenos pueden crearse mediante inmunización de animales con conjugados de los fragmentos con proteínas inmunogénicas. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden ser rastreados para determinar la adhesión a los SLAM normales o defectuosos, o pueden rastrearse para determinar la actividad agonística o antagonísticas, por ejemplo, intermediados a través del antígeno o de su par de adhesión. Estos anticuerpos monoclonales usualmente se usarán con por lo menos de KD de aproximadamente 1 mM, más usualmente por lo menos aproximadamente 300 µM, típicamente por lo menos aproximadamente 100 µM, y más típicamente por lo menos aproximadamente 30 µM, preferentemente por lo menos aproximadamente 10 µM, y más preferentemente por lo menos aproximadamente de 3 µM o más. Los anticuerpos de esta invención pueden ser también útiles en aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizadores, pueden ser rastreados para determinar la capacidad de fijarse en los antígepos sin inhibir la adhesión de un par. Como anticuerpo neutralizadores pueden ser útiles en ensayos de adhesión competitivos. También serán útiles para detectar o cuantificar la proteína SLAM o sus pares de adhesión. Ver, por ejemplo, Chan (ed) (1987) Immunology A Practical Guide. Academic Press, Orlando, Fia, Price and Newman (eds.) (1991 ) Principies and Practice of Immunoassay. Stockton Press, N.Y.; and Ngo (ed) (1988) Nonisotopic Immunoassay. Plenum Press, N.Y Las absorciones entrecruzadas u otros ensayos identificarán los anticuerpos que exhiben varios espectros de especificidades, por ejemplo especificidades de especies únicas o compartidas. Además, los anticuerpos incluyendo los fragmentos de fijación de antígeno, de esta invención pueden ser potentes antagonistas que se fijan al antígeno y que inhiben la fijación funcional o inhiben la capacidad de un asociado de adhesión para producir una respuesta biológica. Asimismo, pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizadores y pueden acoplarse a toxinas o a radionúclido de modo que cuando el anticuerpo que fija el antígeno, una célula que lo expresa por ejemplo, en su superficie, es aniquilada. Además, estos anticuerpos pueden conjugarse con drogas o con otros agentes terapéuticos en forma directa o indirecta mediante un ligador, y pueden efectivizar la objetivación de la droga. Los fragmentos de antígeno pueden unirse a otros materiales particularmente a los polipéptídos en forma de polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para ser usados como inmunógenos. Un antígeno y sus fragmentos pueden fusionarse o pueden ligarse covalentemente a una variedad de inmunógenos tales como hemocianina de la lapa Fissurella, albúmina de suero bovino, toxoide de tétanos, etc. Ver Microbiología. Hoeber Medical División, Harper and Row, 1969; Landsteiner (1962) Especificidad de las Reacciones Serológicas, Dover Publícations, New York; Williams, et al. (1967) Métodos de Inmunología e Inmunoquímica vol. 1 , Academic Press, Nueva York; y Harlow y Lañe (1988) Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio. CSH Press, NY, para hallar descripciones y métodos para preparar antisueros policlonaies.

En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales a partir de varios huéspedes mamíferos tales como ratones, roedores, primates, humanos, etc L a descripción de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales puede hallarse por ejemplo en Stites, et al. (eds.) Inmunología Básica v Clínica (4ta. edición), Lange Medical Publicatíons, Los Altos, CA, y las referencias allí citadas; Harlow and Lañe (1988) Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio. CSH Press, Goding (1986) Anticuerpos Monoclonales: Principios y Práctica (2da. edición), Academic Press, New York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256:495-497, que discuten un método para generar anticuerpos monoclonales. Otras técnicas apropiadas involucran la exposición in vitro de linfocitos a los polipéptidos antigénicos o alternativamente a la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o en vectores similares. Ver, Huse, et al. (1989) "Generación de una Gran Genoteca Combinatoria del Repertorio de Inmunoglobulina en el fago lambda", Science 246:1275-1281 ; y Ward, et al. (1989) Nature 341 :544-546. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificaciones incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se rotularán uniendo, en forma covalente o no covalente una sustancia que provee una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de rótulos y técnicas de conjugación y se ha informado sobre las mismas extensamente tanto en la literatura científica como de patentes. Los rótulos apropiados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimioluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos rótulos incluyen las patentes Norteamericanas Nros. 3.817.837, 3.850.752; 3.939.350; 3.996.345; 4.277.437; 4.275.149; y 4.366.241. Asimismo, pueden producirse las inmunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, patente Norteamericana N° 4,816.567; Moore, et al., patente Norteamericana N° 4.642.334; y Queen, et al. (1989) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 10029-10033. Los anticuerpos de esta invención pueden usarse también para cromatografía de afinidad en la aislación de la proteína. Pueden prepararse columnas en las que los anticuerpos están ligados a un soporte sólido. Ver por ejemplo Wilchek et al. (1984) Meth. Enzvmol. 104:3-55. Los anticuerpos creados contra cada SLAM serán también útiles para crear anticuerpos anti-idiotípicos. Estos resultarán útiles para detectar o para diagnosticar varios estados ipmunológicos relacionados con la expresión de los antígenos respectivos. VI. Ácidos Nucleicos Las secuencias peptídicas descriptas y los reactivos relacionados son útiles para detectar, aislar o identificar un clon de ADN que codifica SLAM, por ejemplo, de una fuente natural. Típicamente será útil para aislar un gen de mamíferos, y podrán aplicarse procedimientos similares par aislar genes de otras especies, por ejemplo de animales de sangre caliente tales como aves y mamíferos. La hibridización cruzada permitirá la aislación de SLAM de otras especies. Una variedad de diferentes realizaciones estarían disponibles para aislar exitosamente un clon de ácido nucleico apropiado. La proteína purificada o los péptidos definidos son útiles para generar anticuerpos mediante métodos convencionales tal como se ha descripto más arriba. Los péptidos sintéticos o las proteínas purificadas pueden presentarse a un sistema de inmunidad para generar anticuerpos monoclonales o policlonales. Ver, por ejemplo Coligan (1991 ) Protocolos Corrientes en Inmunología Wiley/Greene; y Harlow y Lañe (1989) Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio. Cold Spring Harbor Press. Alternativamente, SLAM puede usarse como reactivo de fijación específico, y puede aprovecharse su especificidad de adhesión de modo muy similar a ia forma en la que se usaría un anticuerpo. Por ejemplo, la composición de adhesión específica podría usarse para rastrear una genoteca de expresión preparada a partir de líneas de células que expresan SLAM. El rastreo puede ser la coloración convencional del antígeno expresado en la superficie, o mediante lavado. El rastreo de la expresión, intracelular puede llevarse también a cabo mediante varios procedimientos de coloración o de inmunofluorescencia. Las composiciones adhesivas podrían usarse para purificación por afinidad o para elegir las células que expresan la proteína. Los segmentos de péptidos pueden usarse también para predecir los oligonucleótidos apropiados para rastrear una genoteca. Un código genético puede usarse para seleccionar los oligonucleótidos apropiados que son útiles como sondas para el rastreo. Ver, por ejemplo SEC. ID NO: 1 ó 3. En combinación con las técnicas de reacción de cadena de polimerasa, los oligonucleótidos sintéticos serán útiles para seleccionar los clones sintéticos serán útiles para seleccionar los clones correctos de una genoteca. Las secuencias complementarias se usarán también como sondas, cebadores, o cadenas antisentido En base a la identificación del dominio probablemente extracelular, varios fragmentos deberían ser particularmente útiles por ejemplo acoplados con el vector unido, o mediante técnicas poli-A complementarias de reacción en cadena de polimerasa o con ADN complementario de otros péptidos.

Esta invención contempla el uso de ADN aislado o de fragmentos para codificar un polipéptido SLAM correspondiente biológicamente activo. Además, esta invención cubre ADN aislado o recombinante que codifica una proteína biológicamente activa o un polipéptido que es capaz de hibridizarse bajo las condiciones apropiadas con las secuencias de ADN descriptas aquí. Dicha proteína o polipéptido biológicamente activo pueden ser un antígeno intacto o un fragmento, y tener una secuencia de aminoácido que se da a conocer por ejemplo en SEC. ID NO: 1 ó 3. Además, esta invención cubre el uso de ADN aislado o recombinante o fragmentos del misma que codifica proteínas que son homologas de SLAM o que han sido aisladas usando ADNc que codifica una SLAM como sonda. El ADN aislado puede consistir en las respectivas secuencias reguladoras en los flancos 5' y 3', por ejemplo, en los promotores, realzadores, señales de poli-A adición y otros. Un ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo un ARN, un ADN, o un polímero mixto, que está sustancialmente separado de otros componentes que acompañan naturalmente una secuencia natural por ejemplo ribosomas, polimerasas, y/o secuencias genómicas de flanqueo de las especies originarias. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que ha sido removida de su ambiente natural e incluye aislados de ADN clonados o recombinantes y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados por sistemas heterólogos. Una molécula sustancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. En general, el ácido nucleico estará en un vector o en un fragmento de menos de aproximadamente 50 kb, usualmente de menos de aproximadamente 30 kb, típicamente de menos de aproximadamente 10 kb, y preferiblemente de menos de aproximadamente 6 kb.

Un ácido nucleico aislado será generalmente una composición homogénea de moléculas, pero en algunas realizaciones contendrá una heterogeneidad menor. Esta heterogeneidad se encuentra típicamente en los extremos o porciones del polímero que no son críticos para una actividad o función biológica deseada. Un ácido nucleico "recombinante" se define o bien por su método de producción o por su estructura. Con referencia al método de producción, por ejemplo, un producto preparado mediante un procedimiento, el procedimiento se emplea para técnicas de ando nucleico re ombinantes por ejemplo involucra la intervención I u aria de ¡a secuencia nuc' otidica, típicamente en la selección o producción ?G.-;' ¡Ú¡¡ órn te, puede ser un ácido nucleico preparado mediante la generación de una secuencia que comprende ra porción de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos entre sí, pero significa que excluye productos naturales, por ejemplo los mutantes que se producen en forma natural. Por le tanto, abarca por ejemplo productos preparados mediante la transformación de células con cualquier vector que no se produce en forma natural, tal como los ácidos nucleicos que comprenden una secuencia derivada usando cualquier procedimiento oligonucleotídico sintético. Esto se hace a menudo para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica al mismo o con un aminoácido conservativo, introduciendo típicamente o removiendo un sitio de reconocimiento de una secuencia. Alternativamente, se lleva a cabo para unir entre sí los segmentos de ácido nucleico de funciones deseadas a fin de generar una entidad genética única que comprende una combinación de funciones deseada que no se encuentra en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción son a menudo el objetivo de dichas manipulaciones artificiales, pero otros objetivos específicos del sitio, por ejemplo promotores, sitios de réplica de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control u otras características útiles pueden también incorporarse según se desee. Se propone un concepto similar para un polipéptido recombinante, por ejemplo de fusión. Se incluyen específicamente los ácidos nucleicos sintéticos que por redundancia del código genético, codifican polipéptidos que son similares a los fragmentos de estos antígenos, y a las fusiones de secuencias de varias variantes de especies diferentes. Un "fragmento" significativo en el contexto de acido nucleico es un segmento continuo de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, generalmente de por lo menos aproximadamente 22 nucleótidos, comúnmente de por lo menos aproximadamente 29 nucleótidos, más a menudo de por lo menos aproximadamente 35 nucleótidos, típicamente de por lo menos aproximadamente 41 nucleótidos y usualmente de por lo menos aproximadamente 47 nucleótidos, preferentemente de por lo menos aproximadamente 55 nucleótidos, y en realizaciones particularmente preferidas será de por lo menos aproximadamente 60 nucleótidos o más. Un ADN que codifica para la proteina SLAM será particularmente útil para identificar genes, especies de ARNm, y de ADNc, que codifican proteínas relacionadas u homologas así como también ADN que codifica las proteínas homologas de diferentes especies. Existirán probablemente homólogos en otras especies incluyendo primates, roedores y aves. Varias de las proteínas SLAM deberían ser homologas y están abarcadas aquí. Sin embargo, incluso las proteínas que tienen una relación de evolución más distante con el antígeno, pueden aislarse rápidamente bajo condiciones apropiadas usando estas secuencias si son suficientemente homologas. Las proteínas SLAM de primate son particularmente interesantes. Los clones recombínantes derivados de las secuencias genómicas, por ejemplo que contienen intrones, serán útiles para estudios transgénicos incluyendo por ejemplo organismos y células transgénicas y para terapia génica. Ver, por ejemplo, Goodnow (1992) "Animales Transgénicos" en Roitt (ed.) Enciclopedia de Inmunología. Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991) Science 254:707-710; Capecchi (1989) Science 244:1288, Robertson (1987) (ed.) Teratocarcinomas y Células Progenitoras Embri?nicas: Una Realización Práctica, IRL Press, Oxford; y Rosenberg (1992) J. Clinical Oncoloav 10:180-199.

Homología sustancial en la comparación de la secuencia de ácido nucleico en ese contexto significa que o bien los segmentos o sus cadenas complementarias, cuando se comparan son idénticas a cuando están óptimamente alineadas, con inserciones o supresiones de nucleótidos apropiadas, en por lo menos aproximadamente 50% de los nucleótídos, generalmente en por lo menos aproximadamente 58%, comúnmente en por lo menos aproximadamente 65%, a menudo en por lo menos aproximadamente 71 %, típicamente en por lo menos aproximadamente 77%, usualmente por lo menos aproximadamente 85%, preferentemente por lo menos aproximadamente 95 a 98% o más, y en las realizaciones particulares, tan elevado como aproximadamente 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, existe homología sustancial cuando los segmentos se hibridizan bajo condiciones de hibridización selectiva, con una cadena o con su complemento usando típicamente una secuencia de SLAM por ejemplo en la SEC ID NO: 1 , 3, 5, 7, 9 u 11. Típicamente, la hibridización selectiva se producirá cuando existe por lo menos aproximadamente 55% de homología a lo largo de una extensión de por lo menos aproximadamente 30 nucleótídos, preferentemente de por lo menos aproximadamente 75% sobre una extensión de aproximadamente 25 nucleótidos, y aún más preferentemente por lo menos aproximadamente 90% hasta aproximadamente 20 nucleótidos. Ver, Kanehisa (1984) Nuc Acids. Res.12:203-213. La longitud de comparación de homología descripta puede efectuarse sobre extensiones más largas y en algunas realizaciones se efectuará sobre una extensión de por lo menos aproximadamente 17 nucleótidos, usualmente de por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, típicamente de por lo menos aproximadamente 40 nucleótidos y preferentemente por lo menos aproximadamente 75 a 100 o más nucleótidos. Las condiciones de exigencia con referencia a la homología en el contexto de la hibridizacíón, serán condiciones de exigencia combinada en cuanto a sal, temperatura, solventes orgánicos, y otros parámetros, típicamente los que se controlan en las reacciones de hibridización. Las condiciones de temperatura exigentes usualmente incluirán temperaturas en exceso de aproximadamente 30°C, usualmente en exceso de aproximadamente 37°C, típicamente en exceso de aproximadamente 55°C, preferentemente en exceso de aproximadamente 70°C. Las condiciones de exigencia con respecto a la sal serán comúnmente inferiores a aproximadamente 1000 mM, usualmente inferiores a aproximadamente 400 mM, típicamente inferiores a aproximadamente 250 mM, y preferentemente inferiores a aproximadamente 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro único. Ver, por ejemplo, Wetmur and Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31 :349-370. SLAM de otras especies de mamíferos puede clonarse y aislarse mediante hibridización de especies cruzadas de especies estrechamente relacionadas. La homología puede ser relativamente baja entre especies relacionadas en forma distante y por lo tanto la hibridización de las especies que están relativamente estrechamente relacionadas es aconsejable. Alternativamente, la preparación de una preparación para anticuerpos que exhiba menos especificidad de especies será útil en las realizaciones de clonación de expresión.

Vil. Preparación de SLAM; Mimética El ADN que codifica el SLAM o los fragmentos del mismo puede obtenerse mediante síntesis química, rastreo con genotecas de ADNc, o rastreo de genotecas genómicas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas de células o muestras de tejidos Ver, por ejemplo, Okayama y Berg (1982) Biol. Mol Cel. 2:161 -170; Gubler y Hoffman (1983) Gen 25:263-269; y Glover (ed.) (1984) Clonación de ADN" Una Realización Práctica, IRL Press, Oxford. Alternativamente, las secuencias provistas aquí proporcionan cebadores de PCR que son útiles o que permiten la preparación sintética o de otro tipo de genes apropiados que codifican una SLAM. Este ADN puede expresarse en una amplia variedad de células huésped para la síntesis de una SLAM de longitud entera o fragmentos que pueden usarse a su vez, por ejemplo, para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de adhesión, para la construcción y expresión de moléculas modificadas; y para estudios de la estructura/función. Vectores, tal como se emplea aquí, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables, y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de ADN en el genoma del huésped. Ver, por ejemplo Pouwels, et al. (1985 y Suplementos) Vectores de Clonación: Un Manual de Laboratorio. Elsevier, N.Y.; y Rodríguez, et al. (1988) (eds.) Vectores: Una Observación de los Vectores de Clonación Molecular y Sus Usos. Buttersworth, Boston, MA. Para los propósitos de esta invención, las secuencias de ADN están ligadas operativamente cuando están funcionalmente relacionadas entre sí. Por ejemplo, el ADN para un lider de presecuencia o de secreción está ligado operativamente a un polipéptido si es que se expresa como preproteína o si participa para dirigir el polipéptido a la membrana de la célula o en la secreción del polipéptido. Un promotor está ligado operativamente a una secuencia codificadora, si controla la transcripción del polipéptido; un sitio de adhesión del ribosoma está ligado operativamente a una secuencia codificadora si está situado para permitir la traducción. Usualmente, ligado operativamente significa contiguo y en un marco de lectura pero sin embargo algunos elementos genéticos tales como genes represores no están ligados contiguamente sino que están aún adheridos a las secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión. Ver, por ejemplo, Rodriguez et al., capítulo 10, páginas 205-236; Balbas y Bolívar (1990) Métodos de Enzimologia 185: 14-37, y Ausubel, et al. (1993) Protocolos Corrientes de Biología Molecular, Greene y Wiley, NY. Ejemplos representativos de vectores de expresión apropiados incluyen pCDNA1 M pcDm ver Okayama, et al. (1985) Biol. Cel. Mol. 5:1 136-1 142; pNCI neo Poli-A, ver Thomas, et al. (1987) CeJ. 51 :503-512; y un vector de baculovirus tal como pAC 373 o pAC 610. Ver, por ejemplo, Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42:177-199. A menudo será conveniente expresar un polipéptido SLAM en un sistema que provee un patrón de glicosilación específico o definido. Ver, por ejemplo, Luckow y Summers (1988) Bio/Tecnología 6:47-55; y Kaufman (1990) Enzimol. Met. 185:487-51 1. La SLAM, o un fragmento de la misma puede manipularse por ingeniería genética para ligarla con fosfatidil inositol (Pl) a una membrana de célula, pero puede ser removida de las membranas mediante tratamiento con una enzima disociadora de fosfatidil inositol, por ejemplo fosfolipasa-C de fosfatidil inositol. Esto libera al antígeno en una forma biológicamente activa y permite llevar a cabo la purificación mediante procedimientos convencionales de química proteínica. Ver, por ejemplo, Low (1989) Biochim. Biophvs. Acta 988:427-454: Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991) J. Cell. Biol. 1 14:1275- 1283. Ahora que SLAM ha sido caracterizada, pueden prepararse fragmentos o derivados de la misma por procedimientos convencionales para la síntesis de péptidos. Estos incluyen procedimientos tales como los que han sido descríptos por Stewart y Young (1984) Síntesis de Péptidos en Fase Sólida. Pierce Chemical Co., Rockford, IL; Bodanszky y Bodanszky (1984) Los Principios de la Síntesis de Péptidos. Springer- Verlag, New York; y Villafranca (ed.) (1991 ) Técnicas de la Química Proteínica II. Academic Press, San Diego, Ca. VIII Usos La presente invención provee reactivos que serán útiles en aplicaciones para diagnóstico tal como se describe en esta solicitud en otra parte, por ejemplo en la descripción general de las condiciones intermediadas por la célula T, o más adelante en la descripción en los equipos de diagnóstico. Esta invención provee también reactivos que tienen un importante valor terapéutico. La SLAM (natural o recombinante), los fragmentos de la misma y los anticuerpos de la misma, junto con los compuestos identificados porque tienen afinidad de adhesión con SLAM, deberían ser útiles en el tratamiento de las condiciones que están asociadas con fisiología o desarrollo anormal incluyendo proliferación anormal, por ejemplo condiciones cancerosas, o condiciones degradativas. En particular, la modulación del desarrollo de las células linfoides se logrará mediante un tratamiento terapéutico apropiado usando las composiciones que se proveen aquí. Por ejemplo, una enfermedad o desorden asociado con expresión anormal o con señalamiento anormal de SLAM debería ser un prometedor objetivo para un agonista o antagonista del antígeno. El antígeno juega un rol en la regulación o desarrollo de las células hemayopoiéticas por ejemplo las células linfoides, que afectan las respuestas inmunológicas, por ejemplo, los desórdenes de autoinmunídad.

En particular, el antígeno demostró proveer una señal co-estimuladora para la activación de la céluia T. Por lo tanto, SLAM tiene un rol en las interacciones de célula T a célula T. Estas interacciones, conducen en los contextos particulares a una proliferación de células, a una síntesis de citoquina mejorada por parte de las células y a la consiguiente ampliación de ¡a proliferación de células T. Además, la producción de interferón-? inducido por SLAM sugiere que algunos agonistas de SLAM podrían dirigir las respuestas de la célula T hacia la vía ThO/Th1 y por lo tanto suprimirían una respuesta de tipo Th2. Entre estos agonistas debería haber varios anticuerpos que reconocen los epitopos apropiados, por ejemplo, que imitan la adhesión de SLAM a su ligando. A la inversa, los agonistas de SLAM, tales como la forma secretada en forma natural de SLAM o los anticuerpos bloqueadores pueden proveer una vía selectiva y poderosa para bloquear las respuestas de inmunidad en situaciones anormales, por ejemplo en desórdenes de autoinmunidad incluyendo artritis reumatoide, eritematosis lupus sistémica (SLE), tiroiditis autoinmune Hashimoto, así como también respuestas inflamatorias agudas y crónicas en las cuales la activación de la célula T, la expansión y/o la memoria inmuológica de la célula T juegan un rol importante. Ver también Samter, et al. (eds) Enfermedades Inmunológicas volúmenes 1 y 2, Little, Brown and Co. La supresión de la activación de la célula T, la expansión, y/o la liberación de citoquína por parte de la forma natural de SLAM secretada que puede producirse en grandes cantidades mediante métodos de recombinacíón o mediante anticuerpos bloqueadores, debería resultar eficaz en muchos desórdenes en los cuales son importantes las respuestas de la célula T anormal. El SLAM parece estar co-expresado con CD45RO, que es un marcador para las células T cebadas, o de la memoria. El SLAM está también ausente en las células CD45RA que representan el subgrupo de células T naturales. Como tal, SLAM puede servir también como marcador de diagnóstico para las células T de la memoria. Se conocen algunas condiciones anormales en cada uno de los tipos de células que demostraron poseer ARNm de SLAM, mediante el análisis de borrón Northern. Ver Berkow (ed.) El Manual Merck para Diagnóstico y Terapia. Merck & Co., Rahwaym N.J.; Thorn, et al. Principios de Harrison en Medicina Interna. McGraw-Hill, N.Y.; y Wheatherall, et al. (eds,) Texto de Medicina de Oxford. Oxford University Press, Oxford. Muchas otras enfermedades y estados médicos involucran a las células T o son intermediados por las células T y muchos de los mismos responderán al tratamiento con un agonista o antagonista de los que se proveen aquí. Ver, por ejemplo, Stites and Terr (eds; 1991) Inmunología Básica y Clínica Appleton and Lange, Norwalk, Connecticut; and Samter, et al. (eds) Enfermedades Inmunológicas Little, Brown and Co. Estos problemas deberían ser susceptibibles de ser prevenidos o tratados usando las composiciones que se proveen aquí. Los anticuerpos SLAM pueden purificarse y luego pueden ser administrados a un paciente, veterinario o humano. Estos reactivos pueden combinarse para uso terapéutico con ingredientes adicionales activos o inertes, por ejemplo con diluyentes o portadores convencionales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo coadyuvantes inmunogénicos junto con excipientes estabilizadores o presen adores fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden filtrarse en forma estéril y pueden colocarse en formas de dosificación tales como mediante liofilización en frascos de dosificación o almacenándolos en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención contempla también el uso de anticuerpos o fragmentos de adhesión de los mismos incluyendo formas que no complementan la adhesión. El rastreo de drogas usando SLAM o fragmentos de la misma puede llevarse a cabo a fin de identificar compuestos que tienen afinidad de adhesión u otros efectos biológicos relevantes sobre las funciones SLAM incluyendo asilación de los componentes asociados. Los subsiguientes ensayos biológicos pueden utilizarse luego para determinar si el compuesto tiene actividad estimuladora intrínseca y si es por io tanto un bloqueador o antagonista porque bloquea la actividad del antígeno. Asimismo, un compuesto que tiene actividad estimuladora intrínseca puede activar la ruta de señales y es por lo tanto un agonista porque simula la actividad de SLAM. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos bloquedores de SLAM como antagonistas y de anticuerpos estimuladores por ejemplo A12, como agonistas. Esta realización debería ser particularmente útil con otras variantes de especies SLAM. Las cantidades de reactivos que son necesarias para una terapia eficaz dependerán de muchos factores diferentes, incluyendo los medios de administración, el sitio del objetivo, el estado fisiológico del paciente y los otros medicamentos administrados. Por lo tanto, las dosificaciones de tratamiento deberían titularse a fin de optimizar la seguridad y la eficacia. Típicamente, las dosificaciones usadas in vítro pueden proveer una guía útil en las cantidades que son útiles para la administración in situ de estos reactivos. El ensayo en animales de dosis eficaces para el tratamiento de desórdenes particulares proveerá una indicación adicional predictiva de la dosificación humana. Se han descripto varias consideraciones, por ejemplo en Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman y Gilman's: Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica, octava edición., Pergamon Press, y Remington's Pharmaceutical Sciences. 17 ed. (1990), Mack Publishing Co., Easton, Penn. Los métodos para la administración se discuten aquí y a continuación por ejemplo en cuanto a la administración oral, intravenosa, intraperitoneal o intramuscular, a la difusión transdérmica, y otras. Los portadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, solución salina, buffers y otros compuestos descriptos por ejemplo en el índice Merck, Merck & Co., Rahway, New Jersey. Las gamas de dosificación serían comúnmente en proporciones inferiores a concentraciones de 1 mM, típicamep- -serían de concentraciones inferiores a aproximadamente 10 µM, usualm :nte inferiores a aproximadamente 100 nM, preferentemente inferiores a aproximadamente 10 pM (pico molar), y aún más preferentemente a aproximadamente 1 fM (femtomolar), con un portador apropiado. Las formulaciones de liberación lentas o un aparato de liberación lenta, podrán ser a menudo utilizados para administración continua o a largo término. Ver por ejemplo Langer (1990) Science 249: 1527-1533. La SLAM, los fragmentos de la misma, y los anticuerpos para la misma o sus fragmentos antagonistas y agonistas pueden administrarse directamente al huésped que debe ser tratado o, dependiendo del volumen de los compuestos, puede ser conveniente conjugarlos con proteínas portadoras tales como ovalbúmina o con albúmina de suero antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en cualquier formulación de dosificación convencional. Aunque es posible administrar al ingrediente solo se prefiere que esté presente como formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden típicamente por lo menos un ingrediente activo tal como se ha definido más arriba o conjuntamente con uno o más portadores aceptables para el mismo. Cada uno de los portadores debería ser farmacéutica y fisiológicamente aceptable en el sentido que debería ser compatible con los otros ingredientes y no debería ser perjudicial para el paciente. Las formulaciones incluyen las que son apropiadas para administración oral, rectal, nasal, tópica o parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradérmica). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificación unitaria y pueden prepararse mediante cualquier método que es bien conocido en la técnica farmacéutica. Ver, por ejemplo Gilman, et al. (eds.) (1990) Goodman and Gilman's" Las Bases Farmacológicas de la Terapéutica, octava edición, Pergamon Press; y Ciencias Farmacéuticas Remington's. 17 ed. (1990) Mack Publishíng Co., Easton, Penn.; Avis, et al. (eds.) (1993) Formas de Dosificación Farmacéutica: Medicaciones Parenterales, Dekker, New York; Lieberman, et al. (eds ) (1990) Formas de Dosificación Farmacéutica: Tabletas. Dekker, Nueva York; y Lieberman. et al. (eds,.) (1990) Formas de Dosificación Farmacéuticas: Sistemas Dispersos. Dekker, Nueva York. La terapia de esta invención puede combinarse o usarse en asociación con otros agentes. Tanto la forma natural como la recombinante de SLAM de esta invención resulta particularmente útil en equipos y en métodos de ensayo que son capaces de rastrear compuestos para determinar la actividad de adhesión a las proteínas. En años recientes, se han desarrollado varios métodos de ensayos automáticos que permiten rastrear ciento de miles de compuestos en un corto período de tiempo. Ver, por ejemplo Fodor, et al. (1991 ) Science 251 :767-773, que describe los medios de ensayo para determinar la afinidad de adhesión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos apropiados puede facilitarse enormemente mediante la disponibilidad de grandes cantidades de SLAM soluble purificado tal como el que se provee en esta invención. Otros métodos pueden también ser utilizados para emplear los residuos críticos en las interacciones de SLAM-SLAM. Puede llevarse a cabo por ejemplo análisis mutacional, ver Somoza, et al. (1993) J. Exptl. Md. 178:549-558, a fin de determinar los residuos específicos que son críticos en la interacción y/o señalamiento. Ambos dominios extracelulares, están involucrados en la interacción homofílica o en el dominio intracelular que provee interacciones que son importantes en el señalamiento intracelular.

Por ejemplo, los antagonistas pueden hallarse normalmente una vez que ha sido definido estructuralmente el antígeno, por ejemplo mediante datos de estructura terciaria. Actualmente es posible el ensayo de potenciales análogos de interacción mediante el desarrollo de métodos de ensayo altamente automatizados usando SLAM purificada. En particular, se podrán descubrir nuevos agonistas y antagnistas mediante el uso de las técnicas de rastreo aquí descriptas. Son particularmente importantes los compuestos que demostraron tener afinidad de adhesión combinada para un espectro de moléculas SLAM por ejemplo los compuestos que pueden servir como antagonistas para variantes de las especies de SLAM. Un método para rastrear drogas utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman en forma estable con moléculas de ADN recombinante que expresan SLAM. Pueden aislarse células que expresan SLAM aisladas de otras moléculas. Dichas células, en forma viable o fija, pueden usarse en ensayos de adición asociados con fijación convencional. Ver también, Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; y Owicki, et al. (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-401 1 , que describen métodos sensibles para detectar las respuestas celuiares. Otra técnica para el rastreo de drogas involucra una realización que provee un rastreo de alto rendimiento para compuestos que tienen afinidad de adición apropiada a SLAM y ha sido descripta detalladamente por Geysen, en la solicitud de Patente Europea 84/03564. publicada el 13 de Setiembre de 1984. En primer lugar, se sintetizan grandes cantidades de compuestos de ensayo que consisten en pequeños péptidos diferentes, sobre un sustrato sólido, por ejemplo varillas de plástico o cualquier otra superficie apropiada, ver Fodor et al. (1991 ). Luego se hacen reaccionar todas las varillas con SLAM solubilizada, sin purificar o solubilizada, y purificada, y se lava. La etapa siguiente involucra detectar la SLAM i ll l I i Ll (J?:,? ? ?? lacioiidl de la diuya puede estar también basado en estudios estructurales de las configuraciones moleculares de SLAM y otros efectuadores o análogos. Los efectuadores pueden ser otras proteínas que actúan como intermediarias de otras funciones en respuesta a la adhesión, u otras proteínas que normalmente interactúan con SLAM. Un medio para determinar cuáles son los sitios que interactúan con otras proteínas específicas consiste en la determinación de una estructura física, por ejemplo cristalografía por rayos X o técnicas de RMN bidimensional. Estas proporcionarán una guía con respecto a los residuos de aminoácido que forman regiones de contacto molecular. Para una detallada descripción de la determinación estructural de las proteínas, ver, por ejemplo, Blundell and Johnson (1976) Cristalografía de las Proteínas, Academic Press, Nueva York IX. Equipos Esta invención contempla también el uso de proteínas SLAM, fragmentos de las mismas, péptidos y sus productos de fusión en una variedad de equipos de diagnóstico, y los métodos para detectar la presencia de otra SLAM o asociado de adhesión. Típicamente, el equipo tendrá un compartimiento que contiene o bien un péptído SLAM definido o un segmento génico o un reactivo que reconoce a uno o a otro, por ejemplo anticuerpos o fragmentos de SLAM. Un equipo para ¡a determinación de la afinidad de adhesión de un compuesto de ensayo a una SLAM comprenderá típicamente un compuesto de ensayo; un compuesto rotulado, por ejemplo un asociado de adhesión o un anticuerpo que tiene una afinidad de adhesión conocida para SLAM; una fuente de SLAM (natural o recombinante); y medios para separar el compuesto adherido del compuesto rotulado libre, tal como una fase sólida para inmovilizar la molécula. Una vez rastreado los compuestos, pueden evaluarse aquellos que tienen afinidad de adhesión apropiada para el antígepo, en ensayos biológico:,» apropiados que son bien conocidos en la técnica. para determinar si actúan como agonistas o como antagonistas para la vía de señalamiento de SLAM. La disponibilidad de los polipéptidos SLAM recombinantes provee también patrones bien definidos para calibrar dichos ensayos. Un equipo preferido para determinar la concentración de por ejemplo SLAM en una muestra comprendería típicamente un compuesto rotulado, por ejemplo un anticuerpo o asociado de adhesión que tiene afinidad de adhesión conocida con el antígeno, una fuente de antígeno (natural o recombinante), y medios para separar el compuesto adherido del compuesto rotulado libre, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar SLAM. Normalmente se proveerán compartimientos que contienen los reactivos e instrucciones. Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de adhesión de antígeno, específicos para SLAM o sus fragmentos son útiles en aplicaciones de diagnóstico para detectar la presencia de niveles elevados de SLAM y/o sus fragmentos. Dichos ensayos de diagnóstico pueden emplear usados, células vivas, células fijas, inmunofluorescencia, cultivos de células, fluidos corporales y además pueden involucrar la detección de antígenos que están relacionados con el antígeno en el suero o similares. Los ensayos de diagnóstico pueden ser homogéneos (sin etapa de separación entre el reactivo libre y el complejo del par fijador de antígeno) o heterogéneo (con una etapa de separación). Existen varios ensayos comerciales tales como el de radioinmunoene.?yo (RÍA), el ensayo inmunoabsorbente ligado por enzimas (ELISA), el inmunoensayo enzimátíco (EIA), la técnica de inmunoensayo de multiplicación enzimática (EMIT), el inmunoensayo fluorescente rotulado con sustrato (SLFIA), y similares. Ver, por ejemplo Van Vanakis, et al. (1980) Enzimol. Met 70:1-525; Harlow y Lañe (1980) Anticuerpos: Un Manual de Laboratorio. CSH Press, NY; y Coligan, et al. (eds.) (1993) Protocolos Corrientes de Inmunología, Greene y Wíley, NY. Los anticuerpos anti-idiotípicos pueden tener uso similar para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra SLAM, ya que los mismos pueden diagnosticar vanos estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de SLAM puede dar como resultado la producción de varias reacciones inmunológícas que pueden diagnosticar estados fisiológicos anormales en condiciones proliferativas de células tales como cáncer o la activación anormal o diferenciación. Frecuentemente los reactivos para los ensayos de diagnóstico se suministran en equipos a fin de optimizar la sensibilidad del ensayo. Para la presente invención dependiendo de la naturaleza del ensayo del protocolo, y del rótulo, se provee un anticuerpo o par de fijación rotulado o sin rotular, o un SLAM rotulado. Esto usualmente se efectuó con otros aditivos tales como buffer, estabilizadores, materiales que son necesarios para la producción de señales, tales como substratos para enzimas, y similares. Preferentemente, el equipo contendrá también las instrucciones para el uso adecuado y para el descarte de los contenidos después de su uso. Típicamente el equipo tiene compartimientos para cada reactivo útil. Convenientemente, los reactivos se proveen en forma de un polvo liofilizado seco cuyo reactivo pueden reconstituirse en un medio acuoso que provee concentraciones apropiadas de reactivos para lleva! a C&LJO el ensayo. Cualquiera de los constituyentes antes mencionados del rastreo de la dogra y de los ensayos de diagnóstico podrán usarse sin efectuar ninguna modificación o pueden modificarse en una variedad de formas. Por ejemplo, en la rotulación puede llevarse a cabo uniendo en forma covalente o no covalente una porción que en forma directa o indirecta provee una señal detectable. En cualquiera de estos ensayos, el par de adhesión el compuesto de ensayo, SLAM o anticuerpos para el mismo pueden rotularse en forma directa o indirecta. Las posibilidades para la rotulación directa incluyen grupos de rótulos: radio rótulos, tales como 125 , , enzimas (Patente Norteamericana N°.: 3.645.090) tal como peroxidasa y fosfatos alcalinas y rótulos fluorescentes (Patente Norteamericana N°.: 3.940.475) que son capaces de controlar el cambio de intensidad de fluorescencia, el desplazamiento de la longitud de onda o las posibilidades de la polarización de la fluorescencia para la rotulación indirecta que incluye biotinilación de un constituyente seguido a la adhesión a la avidina unida a unos de los grupos de rótulos precedentes. Existen también numerosos métodos para separar SLAM fijado del SLAM libre o alternativamente el compuesto del ensayo fijado del libre. El SLAM puede inmovilizarse en varias matrices seguido por lavado. Entre las matrices apropiadas se incluyen las de plástico tales como una placa ELISA, filtros, y granulos. Ver, por ejemplo, Coligan, et al. (eds.) (1993) Protocolos Corrientes de in Inmunología , Vol.1 , Cap.2, Greene and Wiley, NY. Otras técnicas de separación apropiadas incluyen, sin limitación el método con fluorescencia con partículas magnetizables de anticuerpo descripto en Rattle, et al. (1994) Clin. Chem. 30: 1457-1461 , y la comparación doble de partículas magnéticas de anticuerpos descripta en la Patente Norteamericana N°. : 4.659.678. Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los varios rótulos, han sido descriptos extensamente en la literatura y no es necesario discutirlos aquí más detalladamente. Muchas de las técnicas involucran el uso de grupos carbonilo activados ya sea a través del uso de carbodümidas o éster activos para formar enlazos peptídicos, la formación de tioéteres por la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado como cloroacetilo, o una olefína activa tal como malemida para el enlace o similares. Las proteínas de fusión encontrarán también utilidad también en estas aplicaciones.

Otro aspecto de diagnóstico para esta invención involucra el uso de secuencias de oligonucleótidos o poligonucleótidos tomadas de las secuencias de SLAM. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del mensaje de SLAM en muestras de pacientes que se sospecha que tienen una condición anormal por ejemplo cáncer o un problema de desarrollo. La preparación de ambas secuencias nucleotídicas de ARN y ADN, la rotulación de las secuencias y el tamaño preferido de las secuencias ha recibido una amplia descripción y discusión en la literatura. Ver, por ejemplo, Langer-Safer, et al. (1982) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 79: 4381-4385; Caskey (1987) Science 236: 962-967; and Wilchek et al. (1988) Anal. Biochem. 171 :1-32. Los equipos de diagnóstico que prueba también la presencia cualitativa y cuantitativa de otros marcados también se han contemplado. El diagnóstico o prognosis puede depender de la combinación de indicadores múltiples usadas como marcadores. Por lo tanto, los equipos pueden ensayar combinaciones de marcadores. Ver, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Progreso del Factor de Desarrollo Res. 1 : 89-97. La adhesión de SLAM-lg a las células L transfectadas con SLAM demuestran que SLAM-lg puede interactuar consigo mismo como ligando. La electrofóresis de gel natural de SLAM-lg purificado indicó directamente con la existencia de formas de alto peso molecular de las moléculas de SLAM-lg, eran también capaces de interacción homofílica en solución. Si bien, las formas monoméricas y diméncas de SLAM-lg predominaron en el gen natural, no fueron bandas distintas lo cuál es significativo de una interacción moiecular para formar suficientemente débil susceptible de sufrir disociación durante la electrofóresis. En realidad el nivel de adhesión SLAM-lg a las células L que expresan SLAM fue inferior al que se observó cuando se emplearon concentraciones equivalentes de anticuerpos monoclonal, lo cual sugiere que la interacción de SLAM-SLAM es más débil que la interacción de mAb A12 con SLAM. Las interacciones entre otros miembros de la super familia de las Ig son substancialmente más débiles que la interacción de los anticuerpos (van der Merwe y Barclay (1994) TIBS 19: 354-358). En coincidencia con el hecho de que SLAM es un ligando para sí mismo, se observó adhesión de SLAM-lg en clones de células T y en células B transformadas con EBV-expresando ambos tipos de células niveles significativos de SLAM. Los niveles de SLAM sobre los niveles de células T de CD45RO+ de PBMC estuvieron correlacionados con los niveles de adhesión de SLAM-lg a continuación de la activación. Estos datos no excluyen el hecho de que pueda haber otros ligandos para SLAM pero no existe ninguna evidencia de otro ligando puesto que ningún tipo de células negativo SLAM ensayado hasta ei presente demostró a decisión a SLAM-lg que cuando se observó adhesión a SLAM-lg, fue proporcional al nivel de la expresión de SLAM.

En coincidencia con la evidencia bioquímica de que SLAM es un ligando natural para sí mismo, la células L transfectadas con SLAM pudieron proveer una señal co-estímuladora directa para los clones de las células T de CD4+. La vinculación de SLAM con A12 provee una señal co-estimuladora significativa para ¡a activación de la células T. Tal como se observó con mAb A12, agonístico, la activación de los clones de las células T de CD4+ a través de SLAM expresados en la células L en combinación con anti-CD3, conduce a un gran aumento en la proliferación. La co-estimulación de la proliferación con dosis subóptimas de anti-CD3 se observó contra transfectantes de SLAM. La estimulación provista por células L transfectadas con SLAM fue suficientemente substancial para conducir directamente a la proliferación de células T en ausencia de otros estímulos. En este sentido, la señal estimuladora directa provista por SLAM expresado en células L es única, y no se observa ni siquiera para las moléculas B7 co-estimuladoras clásicas (Jenkíns and Johnson (1993) Curr. Opin.

Immunol. 5: 361 -367) y B70 (Azuma, et ai. (1993) Nature 366: 76-79). El ligando para B7 es CD28, y mAb anti-CD28 no estimula directamente la proliferación de clones de las células T. Sin embargo, el mAb A12 'anti-SLAM o sus fragmentos F(ab)2 pueden inducir directamente la proliferación de células T. Las consecuencias de la vinculación de SLAM en los clones de las células T mediante SLAM en células L transfectadas o mediante mAb A12 o sus fragmentos F(ab)2 concuerdan. Por lo tanto, la vinculación directa de SLAM sin que estén vinculadas con otras moléculas en la interacción, resulta eficiente para inducir los efectos funcionales observados. Esto no evita la probable interacción de SLAM con las moléculas transductoras de señales, o disminuye la importancia de otras interacciones moleculares de la superficie celular para lograr los efectos funcionales más potentes de la vinculación de SLAM, tal como los efectos co-estimuladores a través de SLAM sobre ¡as células T estimuladas en una forma específica de antígeno. El gen SLAM se localizó en la interfaz de las bandas q21.3 y q22 del cromosoma humano 1. Esta región del cromosoma 1 parece ser un importante lugar para los genes que están involucrados en la interacciones de células a células. Los genes para las selectinas (Watson, et al. (1990) J. Exp. Med. 172:263-272), que son moléculas que están involucradas en el tráfico y adhesión de leucocitos, están también localizados en el 1q22-23. Otro gen que está en este lugar (1 q21.3-23) es el gen para la mielina Po (Pham-Dinh, eí al. (1993) Hum. Mol. Genet. 2: 2051 -2054), que es la proteína más abundante de la mielipa (Filbin, et al. (1990) Nature 344: 871 -872). Tal como SLAM, la mielina Po es un miembro de la super familia de las Ig (Williams and Barclay (1988) Annu. Rev. Immunol. 6: 381 - 405) y actúa también homofilicamente. La estructura normal de la mielina se basa en la auto-interacción de la Po, y las mutaciones heredadas en la mielina Po son responsables de las neuropatías de Charcot-Marie-Tooth, de tipo 1 b (Kulkens, et al. (1993) Nat. Genet. 5: 35-39; Hayasaka, et al. (1993) Nat. Gentet. 5: 31-34). Muchos miembros de las super familias de las Ig interactúan heterofilicamente con miembros relacionados de la familia siendo eminentes ejemplos CD2 con LFA-3 (Selvaraj, et al. (1987) Nature 326: 400-403) o CD48 (van der Merwe, et al. (1993) EMBO J. 12: 4945-4954); CD28 con B7-1 (Linsley. et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:5031-5035) o B7-2 (Freeman, et al. (1993) Science 262: 909-91 1 ; Azuma, et al. (1993) Nature 366:76-79); y TCR con MHC clase II (Matsui, et al. (1991) Science 254: 1788-1791). El hecho de que muchos miembros de la super familias de las lig puedan actuar de esta manera puede ser el resultado de la evolución después de la duplicación génica de un precursor que interactúa homofílicamente (Williams and Barclay (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:381-405). El SLAM y ia mielina Po pueden haber retenido una función primordial de los miembros de la super familias de los Ig para interactuar homofilicamente. El gen para CD48 se localiza en la misma parte del cromosoma 1 como SLAM del cromosoma en 1q21 -23 (Staunton et al. (1989) J. Exp. Med. 169: 1087-1099). Las CD48 que se informó que era un ligando de débil para CD2 (van der Merwe, et al. (1993) EMBO J. 12: 4945-4954), y 2B4, que es una molécula señaladora que se expresa en las células NK de múridos y en las células T citotóxicas (Mathew, et al. (1993) J. Immunol. 151 :5328-5737) para las cuales no se ha informado en ningún ligando, son las moléculas más estrechamente relacionadas para SLAM. Es interesante saber que SLAM. CD48 y 2B4 poseen todas un dominio V y C y que pueden distinguirse de otros miembros de las super familias de ¡as Ig por la conservación de las secuencias CXLXLXC, siendo la segunda cisteína la traba para el dominio C y la primera cisteina un residuo conservado probablemente entre los dominios V y C. La CD48 y 2B4 no han sido directamente verificadas todavía en cuanto a su capacidad para interactuar homofilicamente pero sin embargo se ha indicado que una forma soluble de CD48 tiende a agregarse en solución. La relación y la co-iocalizacíón cromosomal de CD48 y SLAM son indicativos de divergencias- de evolución que sigue en la duplicación génica. Se ha informado que otros miembros de la gran super familia de las Ig. interactúan homofilicamente, y estos incluyen la molécula (CD31 ) de adhesión de células endoteliales a plaquetas (Watt, et al. (1993) Blood 82: 2649-2663), la molécula de adhesión de ¡a célula glial A neuronas (Grumet and Edelman (1988) J. Cell. Biol. 106: 487-503), la molécula de adhesión célula A relacionada con la neuro-glia (Mauro, et al. (1992) J. Cell. Biol. 119: 191-202), la molécula de adhesión a la célula A neural o CD56 (Rao, et al. (1992) J. Cell. Biol. 118:937-949), y el antígeno carcinoembríónico (Zhou, et al. (1993) J. Cell. Biol. 122: 951 -960). Una forma alternativamente empalmada de SLAM que carece del exon de 90 pares de base correspondiente, y abarcando precisamente la región de transmembrana de SLAM codifica una forma secretada de SLAM. Esta molécula producida en forma natural expresada mediante las células T activadas, puede suprimir la función de las células T y puede formar parte de un lazo de retroalimentación negativa para atenuar o restringir localmente la activación intermediada por SLAM sobre la interacción de célula a célula. En la activación de las células T intermediada por SLAM es resistente a las ciclosporina en resistencia con la incapacidad de los anticuerpos anti-IL-2 para inhibir la proliferación de clones de célula T inducida por SLAM. Dados los potentes ejemplos co-estimuladores de la vinculación de SLAM sobre la proliferación las células T y la producción de citoquina Th1 , ¡a potencial actividad inmunosupresora de SLAM soluble puede convertirlo en un agregado eficaz para inhibir las respuestas inmunitarías que son relativamente resistentes a las ciclosporinas tal como las que se observan en el rechazo a los re-injertos (Pereira, et al. (1990) J. Immunol. 144: 2109-21 16; Zeevi, et al. (1988) Hum. Immunol. 21 : 143-153). La vinculación de SLAM tiene consecuencias únicas para la activación de ¡as células T en términos de su capacidad para modular los perfiles para la producción de citoquina con respecto al subtipo Th0/Th1 y bajo algunas circunstancias, y para inducir directamente la proliferación de las células T. La SLAM recientemente descripta parecen ser un miembro de las super familias Ig además de TCR, CD28, CTLA-4, CD4, y CD2, y su vinculación regula las respuestas de las células T. La presencia de SLAM sobre los linfocitos expresan que los linfocitos activados mismos pueden proveer un co-estímulo significativo. Esto no es inesperado, ya que el tipo de célula más predominante en los órganos linfoides son los linfocitos que son colaboradores estadísticamente siempre presentes, y la fuente principal de los factores de desarrollo de la célula T autocrina tal como IL-2. SLAM puede no solo proveer fuertes señales co-estimuladoras, sino que podría estar también involucrado en el mantenimiento de la segregación relativa y de la acumulación de linfocitos dentro de los órganos linfoides. Los principales trabajos sobre la co-eeíimulación de la célula T, se han basado en diferentes células que presentan antígenos y en las moléculas que las mismas expresan, particularmente B7, y B70, los ligandos para CD28 y CTLA-4 (Jenkips (1994) Immunity 1 : 443-446). Las células B son unas células que presentan antígenos que al ser activada expresa SLAM, que puede apoyar la colaboración de las células B-T que conduce a la producción Ig. En coincidencia con las funciones co-estimuladoras descriptas aquí paia SLAM, recientes estudios en ratones deficientes en CD28, han invocado un rol para las otras moléculas co-estimuladoras de la activación de las células T. (Green, et al. (1994) Immunitv 1 :501 -508; Shahínian, et al. (1993) Science 261 " 609-612) y han indicado que la co-estimulación provista por otras células T puede contribuir a la activación de las células T (Grenn, et al. (1994) Immunity 1 :501-508, Jenkínr (1994) Immunitv 1 : 443-446). Además de SLAM, las células T humanas activadas expresa en realidad las MHC de la clase II y B7 y demostraron ser capaces de presentar antígenos (Azuma, et al. (1993) J. Exp. Med. 177:845-850), enfatizando el potencial de las interacciones entre las células T, que pueden aliviar los requisitos de una constante de células que presenten antígenos durante la expansión clonal de las células T. Las SLAM solubles naturalmente producidas deberían proveer un antagonista útil para verificar adicionalmente ia importancia de las interacciones de SLAM-SLAM en el desarrollo de las reacciones inmunitarías humanas. Los anticuerpos monoclonales inhiben las síntesis de IgE dotada de IL-4 ¡o cual implica que las señales a través de SLAM o bien a las célula auxiliar T o a los niveles de células B, inhiben la interacción productiva de la célula T-B, que da como resultado al interrupción de IgE impulsada por IL-4 y la producción de IgE.

Este efecto puede ser directo, por ejemplo, a través de interacciones entre SLAM en las células T y SLAM en las células B o indirecto por ejemplo induciendo la producción de citoquinas mediante ia célula auxiliar T a la cual inhibe la síntesis de IgE impulsada por IL-4. El ¡nterferón-y es el ejemplo primario de dicha citoquina. Estos resultados sugieren también que las fórmulas solubles de SLAM con actividades agonistas pueden ser capaces de evitar la síntesis de IgE impulsada por IL-4 y/o IL-13, en pacientes atópicos y de este modo tendrán utilidad terapéutica para desregular las enfermedades alérgicas intermediadas por IgE. Además, el hecho de que la vinculación de SLAM induce preferencialmente la producción de citoquina Th1 , los agonistas de SLAM pueden tener utilidad clínica general para redirigir las respuestas de Th2 a respuesta de Th1 en enfermedades en las cuales está implicado un claro perfil de Th2 tal como la alergia, alguna' enfermedades auto-inmune o algunas enfermedades inflamatorias. Se incluye la tiroíditis de Hashimoto's Por otra parte, los antagonistas SLAM tendrán un efecto opuesto; es decir, bloquearán las respuestas de Th1 en las situaciones de enfermedad causadas en las situaciones de enfermedad causada por las células Th1 y las citoquinas derivadas de Th1 tal como enfermedades infectuosas incluyendo , por ejemplo, tuberculosis y lepra o enfermedades autoinmune, por ejemplo, artritis reumatoides y uveitis autoinmune. Estos reactivos terapéuticos serán útiles también para modular respuestas tales como las infecciones parasíticas, a fin de modular la reacción de una vacuna. Podrán llevarse a cabo muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse de su espíritu y alcance tal como resultará aparente para los expertos en la materia. Las realizaciones específicas que se describen aquí se ofrecen únicamente a modo de ejemplo y la invención se limitará únicamente de acuerdo a los términos de las reivindicaciones anexas, junto con el alcance total de equivalentes a los cuales tienen derecho distintas reivindicaciones. EJEMPLOS Métodos Generales Algunos de los métodos convencionales han sido descpptos o referenciados por ejemplo en Mapiatis, et al. (1982) Clonación Molecular. Al Manual de Laboratorio. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Clonación Molecular: Un Manual de Laboratorio , (2d ed.), vols 1 -3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Biology. Greene Publishing Associates, Brookiyn, NY; or Ausubel, et al. (1987 y Suplementos) Protocolos Corrientes en Biología Molecular , Greene and Wiley, Ney York, Innis, et al. (eds.) (1990) Protocolos de PCR' Una Guia para los Métodos y Aplicaciones . Academic Press, N.Y. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen métodos tales como precipitación de sulfato de amonio, , cromatografía en columna, electrofóresis, centrifugación , cristalízción y otros. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guía para la purificación de proteínas" en Métodos en Enzimologia vol. 182 y otros volúmenes de esta serie; y en las indicaciones del fabricante sobre el uso de los productos para la purificación de proteínas, por ejemplo, Pharmacia, Piscataway, N.J., o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite fusionar segmentos apropiados por ejemplo, para una secuencia FLAG o un equivalente que puede fusionarse a través de una secuencia removible por proteasa. Ver, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12: 69-70; Hochuli (1990) "Purificación de Proteína Recomibinantes con Absorbentes de Quelatos Metálicos" en Setlow (ed.) Ingeniería Genética, Principios y Métodos 12: 87-98, Plenum Press, N.Y; y Crowe, et al. (1992) Expresión de OÍA" El Sistema de Alto Nivel de Expresión y Purificación de Proteínas QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA. Las técnicas del cultivo de células han sido descriptas por Doyle, et al. (eds.) (1994) Cultivo de Células y Tejidos: Procedimientos de Laboratorio , John Wiley y Sons, NY. Los análisis FACS han sido descriptos en Melamed, et al. (1990) Citometría de Flujo y Clasificación Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Citometria Práctica de Flujo Liss, New York, NY; and Robínson, et al. (1993) Manual de los Métodos de Citometría de Flujo Wiley-Liss, New York, NY. La rotulación fluorescentes de los reactivos apropiados se llevó a cabo de acuerdo con métodos convencionales. EJEMPLO 1 : Preparación de mAb El anticuerpo A12 monoclonal anti-SLAM (lgG1 ) se generó en una fusión de esplenocitos de un ratón BALB/'c inmunizado con células mononucleares de sangre periférica activada durante 5 horas con acetato-12-0-tetradecanoil-13 (TPA) (1 ng/ml) y el ionóforo A23187 (500 ng/ml) (Calbiochem-Behring Corporation). Se emplearon procedimientos convencionales para rastrear los clones de producción apropiados y un hibridoma A12 se aisló clonalmente y se sometió a análisis normales, por ejemplo, determinación de ia capa productora y del tipo de inmunoglobulina. La iínea de célula de hibridoma A12 fue depositada en ATCC el 10 de noviembre de 1994 y se asignó el Número de Acceso ATCC HB1 1760. EJEMPLO 2: Clonación de SLAM Humano Las células COS-7 fueron transfectadas por electroporación tal como han sido descripto en Cocks, et al. (1993) Int. Immunol. 5:657-663, con un ADN de una genoteca de célula T de A10 CD8+ preparada como ácido descripto por McKinney and Parkmson (1987) J. Immunol. Methods 96:271-278. Las células transfectadas fueron coloreadas con mAb A12 antí-SLAM conjugado con FITC y se clasificaron con un instrumento de clasificación de células FACStar plus (Becton Dickinson). El plásmido ADN se aisló a partir de las células clasificadas usando un equipo de minipreparación Wizard Kit (Promega Corporation). El ADN plásmido se transformó en Escherichia coli (ElectroMAX, BRL) mediante electoporación para la amplificación y luego se introducen las células COS-7. Después de dos tandas de clasificación de SLAM, los clones de ADNc se enriquecieron hasta 45% de los clones de ADNc totales. Se secuenció un inserto de 1 ,8 kb en uno de estos clones (pSURsIaml ) en ambas cadenas usando el método de determinación de cadena dideoxi. Este plásmido fue depositado con ATCC el 10 de noviembre de 1994, y se asignó el número de ATCC 69713. Otros clones de ADNc que codifica las variantes de SLAM fueron aislados y caracterizados usando métodos convencionales. En particular, las construcciones que codifican una porción extracelular de SLAM, o una porción intracelular se prepararon mediante el uso de cebadores de PCR apropiados y pSURsIaml como modelo. EJEMPLO 3: Clonación de SLAM de un Ratón El ADNc de SLAM de ratón se clonó a partir de una genoteca de ADNc de timocitos temprana, es decir de timocitos de aß, CD4", CD8" , usando ADN que representa el dominio extracelular de SLAM humano como sonda de hibridización. Los timocitos fueron aislados y se colorearon con anticuerpos primarios durante 30 minutos a 4°C, se lavaron dos veces, y luego se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con FITC durante 30 min. a 4° C, antes de lavarlos tres veces. Los timocitos recientemente aislados fueron coloreados con anticuerpo monoclonal anti-SLAM de IgG, seguido por un anticuerpo anti-ratón de oveja conjugado-FITC. Las células se controlaron para determinar la coloración usando un instrumento FACScan (Becton-Dickinson). EJEMPLO 4: Preparación de Anticuerpos para SLAM Humano Se inmunizaron ratones C3H con células L establemente transfectadas con pSURsIaml . Los hibridomas se generaron mediante la fusión de esplenocitos con una línea de míeloma NJ1. La detección de las células de hibridoma que produce los anticuerpos monoclonales apropiados para SLAM humano fue por inmunofluorescencia y por citometría de flujo. Los sobrenadantes de hibridoma fueron rastreados para rastrear la reactividad con células L transfectadas con pSURsIaml en comparación con las células L sin transfectar como controles. EJEMPLO 5: Preparación de Anticuerpos para el SLAM de Ratón. Las ratas fueron inmunizadas con 107 células COS transfectadas con pMSLAML Los hibridomas se prepararon mediante fusión de células de nodulos linfáticos poplitealos de rata, con células de mieloma de ratón. El suero policlonal lúe también aislado de ratas EJEMPLO 6: Inmunoprecipitación de SLAM Humano. Las proteínas de las superficies de las células del clon B21 de células T de ThO, fueron radiorotuiadas con 125l-Na (Amersham) usando ia reacción catalizada por lactoperoxidasa. SLAM se inmunizó usando Pansorbin™ (Calbiochem) recubierto con IgE anti-ratón de conejo y con anti-suero anti-SLAM. Los inmuno precipitados, se efectuaron en un gel de acrilamida al 10% (ISS) bajo condiciones reductoras, y el gel seco se analizó con Phosphorimager (Molecular Dynamics). La SLAM natural migró de una manera difusa característica de las glicoproteínas, a una movilidad de característica de aproximadamente 70 kd. Si se trata SLAM durante la noche con 1 ,2 µl de N-glicanasa (Genzyme), la proteína migró a una movilidad característica de una proteína de aproximadamente de 40 kd. EJEMPLO 7. Expresión de SLAM en PBMC Humano La expresión de SLAM en PBMC humano se indujo mediante exposición de las células a anticuerpos anti-CD3 durante diferentes períodos de tiempo. Los linfocitos de sangre periférica se incubaron con anticuerpos anti-CD3 (1 µg/ml) durante 0, 1 , 2, 4, 8, o 24 horas El ARN se extrajo y se sometió a análisis Northern usando SLAM y sondas de actinas sucesivamente. Para el análisis de PCR, se seleccionaron cebadores apropiados para SLAM y para HPRT. Se sometieron 5 ng de cebadores ADNc a 30 ciclos de PCR. La señal de actina sirve como factor de normalización. Una especie de 4 kb resulta aparente en los puntos de tiempo de 2 y 4 horas y es mucho menos detectable en puntos de tiempo de 0, 1 , 8 y 24 horas. Una especie de 2 kb es menos detectable en los puntos de tiempo de suero de 0 y 1 hora, es elevada en el punto de 2 horas disminuye en las 4 horas y se estabiliza en los puntos de 8 y 24 horas.

EJEMPLO 8: Expresión de superficie de SLAM en células mononucleares y en timocitos fetales. Para el análisis FACS, células mononucleares de sangre periférica de un dador sano se incubaron durante 6 horas con o sin TPA y A23187 Ca2+ se colorearon con cicromo anti-CD3 conjugado (Pharmingen), mAb A12 conjugado con PE, y CD45RO rotulado con FITC (Pharmingen). Además, los timocitos fetales se colorearon durante 30 min. con A12 conjugado con PE y que con antí-CD3 conjugado con FITC (Becton Dickinson) y se analizaron con FACScan (Becton Dickinson). Las células T de la sangre periférica sin estimular y las células T activadas (células CD3+) se colorearon con mAbs Dará CD45RO y A12. De manera similar, los timocitos fetales se colorearon con anti-CD3 y A12. Las células T sin estimular tenían sus poblaciones significativas: una con muy poco o ningún SLAM y sin CD45RO, que comprendía aproximadamente 49% de las células; y otra con bajo SLAM y alto CD45RO, comprendiendo esta subpoblacíón con aproximadamente 51 % de las células. La CD45RO es un marcador para las células T de la memoria, y SLAM parece estar positivamente correlacionado con su expresión. Las células T naturales, que son CD45RO" y carecen también de SLAM. El SLAM parece ser un marcador útil para un fenotipo de las células T de ia memoria. La células T activadas tenían dos subpoblaciones principales: ambas tienen SLAM elevado, pero una de ellas tienen bajo CD45RO lo cual constituye 46% de las células, y la segunda tenía CD45RO elevado. Una población menor, de aproximadamente 4% de las células no expresó ni CD45RO ni SLAM. Los timocitos fetales tenían un patrón para sugerir una progresión del desarrollo. Existe una subpoblación menor de célula, aproximadamente del 2% que no exhiben el SLAM ni CD3. Aproximadamente 13% de las células, presumiblemente células de desarrollo temprano exhiben bajo CD3 y alto SLAM. Aproximadamente 80% de las células presumiblemente en una etapa intermedia de desarrollo expresan CD3 y SLAM. Una pequeña subpoblación, d< -aproximadamente e1 5% de las células consiste en timocitos maduros que exhiben bajo SLAM pero alto CD3 Esto refleja probablemente una progresión de la expresión de SLAM con la maduración de timocitos. En las primeras etapas de maduración SLAM está altamente expresado pero eventualmente desaparece. EJEMPLO 9. Expresión Celular de SLAM Humano. El ARN de vanas células y tejidos se sometió a transcripción inversa y a PCR usando cebadores específicos de SLAM. Ver la Tabla 2 para la distribución de los tejidos de SLAM humanos. EJEMPLO 10: Expresión Celular de SLAM 1 de Ratón. Una sonda específica para ADN que codifica una porción del dominio extracelular de SLAM de ratón se usó para determinar la distribución de los tejidos del antígeno. Una sonda de ADN de 600 pares de base para SLAM de múridos se generó mediante una digestión límite Xhol/Pstl del plásmido pMSLAMI (que contenía ADNc de SLAM de ratón) y se purificó después de electrofóresis de gel usando un sistema Promega (Madison, Wl) DNA Clean Up. Todas las ondas se rotularon mediante cebado al azar El borón Northern de tejido múltiple se adquirió en Clontech y se sondeó usando Quick Hyb (Stratagene, La Jolla, CA). Los resultados muestran que SLAM se expresó en forma mucho más abundante en el baso que en el corazón al cerebro, lo;-, pulmones, el hígado, el músculo esqueletal, ios ríñones, o testículos. Los testículos parecieron tener más expresión que otros tejidos pero no tanta co o el timo. Aunque el timo no fue uno de los tejidos en el borón Northern, pudo expieearse allí el SLAM. El ADNc de SLAM de ratón se clonó a partir de los timocitos cxß, CD4", CD8" y además, un anticuerpo monoclonai que reconoce SLAM de ratón se adhirió específicamente al 90% de los timocitos recientemente aislados. La frecuencia de los clones SLAM en la genoteca de los timocitos fue de aproximadamente de 1 en 5000. EJEMPLO 1 1 : Distribución de Especies de Homólogos de SLAM. Se obtuvo ADN de varias especies, se digirió con EcoRI, se sometió a electrofóresis, a absorción y se transfirió y luego se hibridizó con una sonda SLAM humana 32P rotulada a 68° C incluyendo los nucleótidos 291 -901. El borón se lavó en 0,2 x SSC a 60° C. El análisis Southern de ADN genómico de diferentes especies indicó que el gen SLAM esta bien conservado entre los mamíferos entre los humanos, monos, ratones, perros, vacas, conejos, pero no se detectó en los pollos o en levaduras. Tampoco se detectó en la rata, pero no se proporcionó ningún control positivo. EJEMPLO 12: Mejora de la Producción de Citoquina Inducida por Antígepo mediante los Clones de Células T Estimulados de este Modo con el Anticuerpo A12 de Anti-SLAM. Los clones de las células T indicados, incluyendo los clones MoT72 (Th2) y MoT81 (ThO) de las células T CD4+ específico para el toxoide de tétano se cultivaron bajo condiciones similares a las utilizadas a los ensayos de proliferación, con las siguientes modificaciones: los cultivos se llevaron a cabo en placas de 24 pozos cultivando 106 células T con células B transformadas con EBV autólogo irradiado con 106, antígeno, y mAbs tal como se ha descripto para los ensayos de proliferación, en un mi de medio de Yssel. Los sobrenadantes se cosecharon 24 horas después y el contenido de citoquina fue determinado mediante de ELISA tal como ácido descripto por Chretien, et al. (1989) J, Immunol. Methods 1 17:67-81 ; o Favre, et al. M 989 Mol. Immunol. 26: 17-25. Los clones de las células T de CD4+ MoT72 (Th2) y M0T8I (ThO) son específicos para el toxoide del tétano, y se cultivaron en la forma descripic?. Ver Tabla 3. Los mAbs usados en este y en otros estudios funcionales de co-estimulación se purificaron a partir de ascitas mediante fraccionamiento con ácido caprílico ver McKinney and Parkinson (1987) J. Immunol Methods 96 271-278, seguido por precipitación con sulfato de amonio. Se produjeron F(Ab')2 mediante métodos convencionales digiriendo los mAbs con pepsina. Los mAbs de control usados fueron lgG1 de MOPC-21 y lgG1 de control de lgG1 (Pharmingen). Tabla 3: Producción de Cítoquina, IFN-? o IL-4. Tipo de línea de célula IFN-v sin anticuerpo control Ab A12 Ab T 2/NPl2 962 902 8303 Th2/NP44 1073 1319 7660 Th2/McT72 496 170 8585 Th0/ChT38 5207 7463 20569 Tho/MoT81 5423 6596 18176 T l/HY06 5982 5904 21946 Thl/TA20 8374 8070 15414 Tipo de linea de célula IL-4 sin anticuerpo control Ab A12 Ab Th2/N?l2 6636 6486 11104 Th2/NP44 • 11617 11738 10373 Th2/MoT72 8805 8542 16548 ThO/ChT38 12907 10102 15039 Tho/MoT81 8455 8451 11070 Thl/HY06 48 40 90 Thl/TA20 62 69 97 EJEMPLO 13: Actividad Co-estimuladora para la Activación de Células T Células mononucleares de la sangre periférica (105/pozo) de dadores recientemente inyectados, se estimularon con 1 µg/ml de toxoide de tétanos o con derivado de proteína purificado (PPD) en placas de 96 pozos de fondo plano en un medio Yssel de 200 µl en pozos por triplicado. Los cultivos se cosecharon 5 días después. Se agregó 1 µCi de 3H-Tdr a cada uno de los pozos en las últimas 16 horas de cultivo y se midió la proliferación mediante absorción 3H-Tdr usando un contador ß Se usaron los siguientes clones de células T de CD4+: ThO:B21 (Bacchett:; et al. (1990) J. Immunol. 144: 902-908);el MoT72 específico para el fragmento 947-960 de toxoide de tétano, y ChT38 específico para el fragmento 16 -35 del toxoide del tétano (preparado de acuerdo con Carballido, et al. (1993) J. Immunol. 150: 3582-3591. Th1 : HY-06 (Haanep, et al. (1991) J. Exp. Med. 174:583-592) específicos para proteína de shock cardíaco; TA20 y TA23 específico para derivados de proteína purificada (PPD). Th2: NP12 y NP44 (Th2) específico para Der-p1 (Yssel, et al. (1992) J. Immunol. 148:738-745). Todos los clones de las células T se cosecharon 5-7 días después de la re-estimulación con PHA y se irradiaron con PBMC alimentadoras y se cultivaron en un medio Yssel (5x104/pozo) en presencia o en ausencia de antígeno específico (1 µg/ml) o péptídos de tétanos (100 ng/ml), y 2,5 x 105 células B transformadas con EBV autólogas irradiadas (5000 rads), y con mAbs tal como se ha indicado. La proliferación se midió 3 días después. Inducción directa de la proliferación de clones de células T mediante mAb A12 anti-SLAM: Los clones B21 y ChT38 de la célula T se cultivaron en un medio de Yssel en presencia o en ausencia de mAbs y sus F(Ab')2 . La proliferación se midió 3 días más tarde. Se observó la proliferación dependientes de las dosis de las dos líneas de células. La proliferación de las células T específica de antígeno de los linfocitos de sangre periférica se incrementó mediante el anticuerpo A12 anti-SLAM: los fragmentos de PBMC de A12 indujeron una proliferación dependiente de la dosis. El PBMC de dadores inmunizados se estimuló con el toxoide del tétanos o con un derivado de proteína purificada con o sin fragmentos mAb. La co-estimulación de clones de células T inducida por antígeno mediante anticuerpo A12 : los clones de las células T NP12, AR142, ChT38, o HY06, se estimularon con su antígeno específico con o sin mAbs. Todos los resultados coincidieron con una interpretación, de que o bien los fragmentos A12 o Fab, pueden inducir la proliferación en una forma que depende de la dosis. La co-estimulación de la proliferación de clon de la células T inducido por anti-CD3 mediante el anticuerpo A12: los clones de B21 o TA20 de la célula T fueron estimulados con mAb en presencia o en ausencia de mAb A12 o mAb de lgG1. En cada uno de los casos, apareció proliferación dependiendo de la dosis con A12 pero no apareció con el anticuerpo de control. La proliferación dependía también de la cantidad de anti-CD3. EJEMPLO 14: Preparación de la Fusión de SLAM-lg A fin de identificar un ligando potencial para la molécula SLAM co-estimuladora de la célula T, se generó una proteína recombinante (SLAM-lg) que comprendía el dominio extracelular entero de SLAM fusionado con la porción Fe de la IgG humana. La SLAM-lg se preparó fusionando ADN que codifica SLAM con ADN que codifica la porción de Fe de IgG. El ADN que codifica el dominio extraceluiar de SLAM se generó mediante PCR usando el plásmido pSURsiaml como modelo y cebadores apropiados. Después de la digestión con Xhol el fragmento se fusionó con ADNc que codifica la proporción Fe de la cadena pesada lgG1. El vector de expresión SLAM-lg se transfectó a la célula COS y se purificó la afinidad SLAM-lg a partir de los sobrenadantes usando proteínas G-sepharose (Sigma). EJEMPLO 15: SLAM-lg se fija a SLAM expresados en las superficies de las células La SLAM-lg resultó eficaz para neutralizar el anticuerpo monocional A12 específico de SLAM, ¡o cual indicó que había retenido una conformación natural similar a la de SLAM de transmembrana. Se usó SLAM-lg conjugada con fluoresceina para los análisis fluorcitométricos de varios tipos de células, y no se adherió a muchos de los tipos de células ensayadas. Sin embargo, SLAM-lg se fijó a los tipos de células que habían demostrado expresar SLAM. EJEMPLO 16: Interacción intramolecular de SLAM-lg Los clones de B21 de las células T (Bacchetta, et al. (1990) J. Immunol 144: 902-908) y HY06 (Haanen, et al. (1991 ) J. Exp. Med. 174:583-592) han sido descríptos. Las líneas de las células del epitelio se generaron en la forma descripta por Galy and Spits Í1991 J. Immunol 147:3823-3830, mediante cultivo de timo fetal y de las líneas TEC, TEC, U937 han sido descriptas también por Galy and Spits (1991 ). Las células L transportadas en RPMI se transfectaron establemente con pSURsIaml . Los monocitos se purificaron mediante vaciamiento negativo, y células L de CD32 fueron provistas por Dr. K. Moore (DNAX, Palo Alto). El PBMC se aisló a partir de sangre periférica a partir de centrifugación sobre ficoll (Histopaque-1077, Sigma). SLAM-lg se fijó a las células L transfectadas con SLAM (células SLAM/L) y no a las células L sin transfectar lo cual indicó que SLAM interactúa homofílicamente desde la base. La fijación de SLAM-lg a transfectantes de SLAM es específica para la porción de SLAM de la molécula y no para Ig, y ya que la coloración se llevó a cabo en presencia de IgG en exceso en 30% del suero humano agregado. Además, los transfectantes SLAM no fueron coloreados por otras moléculas que contenían Fe tal como CD40-lg. La adhesión de SLAM-lg fue aproximadamente 5 veces inferior a la adhesión a las células SLAM/L observado durante una observación equivalente de mAb A12. La interacción de SLAM-lg con SLAM de superficie de células pudo ser especialmente inhibida mediante un exceso del anticuerpo monocional para SLAM La adhesión de SLAM-lg a las células transfectadas no fue inhibida por EDTA. Se ha descrípto mAb de anti-SLAM de A12 mAbs, de CD3 y de CD45RO conjugado con ficoeritrina fue adquirido en Becton-Dickinson. Las células coloreadas con mAbs, SLAM-lg o CD40-lg se lavaron tres veces con PBS, 2% de FCS y se analizaron usando un FACScan (Becton-Dickinson). Se usó SLAM-lg conjugada con fluoresceina para los análisis fluorcitométricos de varios tipos de células, y no se fijó a muchos de los tipos de células ensayadas incluyendo monocitos o líneas de células epiteliales tímicas. Sin embargo, SLAM-lg se fijó a las líneas de células B transformadas con EBV, y a los clones de las células T de CD4+, siendo ambos tipos de células los que se habían demostrado que expresan SLAM. En ninguno de los tipos de células sometidas a ensayo, se adheríó SLAM-lg a células que no expresaban SLAM.

Además, los niveles de SLAM-lg, se co-moduiaron con la expresión de SLAM en las células T de CD45RO+ después de la activación con anti-CD3. El nivel de coloración de SLAM-lg en relación a coloración Al 2 en diferentes tipos de células coincidió con el que se observó en los transfectantes de las células L que fueron 5 veces inferiores e independientes de Ca++ EJEMPLO 17: Interacción Intermolecular de SLAM-lg. Se llevó a cabo electrofóresis de gel usando geles adquiridos en Integrated Separation Systems y con un aparato multigel BioRad. SDS-electrofóresis se llevó a cabo bajo las condiciones descriptas usando el 10% y eiectrofóresis de gel natural de acuerdo con las intrucciones del fabricante empleando un gel de un gradiente de 2-25%. Los geles fueron coloreados con Azul Coomassie. Los patrones MW se adquirieron en Sigma. Puesto que una forma soluble de SLAM (SLAM-lg) pueden interactúar con el SLAM de superficies de células, se sometió a ensayo el hecho de si SLAM-lg interactuaría homofílicamente por ejemplo, se autoreconocerían en solución. El SLAM-lg purificado migra hasta una posición que coincide con su tamaño bajo electrofóresis de gel-SDS y forma una banda discreta bajo condiciones de reducción o sin reducción. Sin embargo SLAM-lg se torna anómalamente largo bajo electrofóresis de gel natural lo cual indica el agregado de moléculas SLAM-lg en solución. La CD40-lg y otras proteínas forman bandas abruptamente y de acuerdo con su tamaño mientras que bajo las mismas condiciones SLAM-lg forma una mancha que comienza con su tamaño predicho con 160.000 sin agregados hasta más de 500.000. Dentro de esta gama de peso moleculares existen dos bandas predominantes; una a -160.000 y la otra a -500.000 que corresponden a una y dos moléculas de SLAM-lg respectivamente. La filtración con gel de SLAM-lg confirmó la existencia de agregados de SLAM-lg. Bajo estas condiciones, aunque predomina la forma monomérica fue también prominente a un pico que correspondía a SLAM dimérico entre el material de peso molecular superior. EJEMPLO 18: La interacción homofílica de SLAM conduce a la activación de célula T. Se demostró también que SLAM expresado en células T activadas es una significativa molécula co-estimuladora. La vinculación de SLAM con A12 de mAb conduce a aumentar la proliferación de las células T y la producción de citoquinas. Un ligando natural para SLAM debería proveer también dicha señal co-estimuladora. Este resultado sugiere que el ligando natural para SLAM es el mismo SLAM. Por lo tanto, la capacidad de SLAM superficial para proveer señales estimuladoras para las células T fue sometida a ensayo. En las dosis subóptimas de anti-CD3, las células L que expresan SLAM proporcionaron una señal co-estimuladora directa para células T para prolíferar mientras que las células L sin transfectar resultaron ineficaces. Las células L/SLAM fueron también capaces de soportar directamente la proliferación de las células T en ausencia de anti-CD3 o de otras señales estimuladoras. Esta capacidad para estimular directamente las células T en ausencia de otros estímulos distingue a SLAM de otras moléculas co-estimuladoras incluyendo LFA-3 (Bierer and Hahn (1993) Semin. Immunol. 5:249-261 ), B7 (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367), y B70 (Azuma , et al.. (1993) Nature 366: 76-79), cada una de las cuales requiere señales adicionales para inducir la proliferación de las 5 células T. Puesto que las interacciones de SLAM-SLAM entre las células L y las células T tienen claros efectos funcionales, no lúe sorprendente que las células L transfectadas con SLAM pudieran distinguirse con células L sin transfectar mediante por los menos tres criterios. En primer lugar las células SLAM+ L son ?o resistentes al desprendimiento con EDTA lo cual requiere casi 30 min a 37° C en comparación con células L normales y con otros transfectantes de L que se desprenden al cabo de 5 min. En segundo lugar, los transfectantes de SLAM tienen un contacto estrictamente inhibido mientras que las células L sin transfectar, aunque tienen contacto inhibido continúan proliferando hasta cierto grado después de alcanzar la confluencia. En tercer lugar, los transfectantes SLAM tienen una morfología más alargada que resulta evidente en cultivos confluentes de monocapas donde las células están interligadas en contraste con las células L normales que tienen una apariencia más separada. Las células SLAM/L desprendidas no parecen adherirse más rápidamente en su suspensión.

-"'° EJEMPLO 19" La proliferación de las células T inducidas por interacción de SLAM-SLAM es resistentes a las cíclosporinas. La activación de las células T intermediada a través de TCR se inhiben mediante la ciclosporina. Para ensayar si la activación de la células T intermediada por SLAM era susceptible a la ciclosporinas, el clon de células T B21 se activó directamente con células SLAM/L en presencia de varias concentraciones de ciclosporinas. Las células SLAM/L fueron capaces de soportar directamente la proliferación de célula T incluso en presencia de 1 µg de ciclosporína. Es interesante, tener en cuenta que la ciclosporina en realidad mejoró la proliferación de las células T inducida por interacción homofílica de SLAM a concentraciones superiores a 100 ng/ml. A 2 µg/ml, la ciclospopnr aumentó la proliferación de células T inducida por células SLAM/L, hasta el doble. EJEMPLO 20: Localización cromosomal. La sonda (pSURs!am1), fue traducida por muesca con b?otina-14 dATP y se hibridizó in situ hasta una concentración final de 5 ng/µl a metafases de dos machos normales. La fluorescencia en el método de hibridización ¡n situ (FISH) se modificó a partir de lo descripto por Callen, et al. (1990). Ann. Genet. 33:219-221 , en el sentido de que los cromosomas fueron coloreados antes del análisis con ambas cosas, iodudo de prodidio (como contra coloración) y de DAPI (para la identificación de los cromosomas). Las imágenes de las preparaciones de metafases fueron capturadas mediante cámaras CCD y mejoradas por computadora. Se examinaron 20 metafases del primer macho normal para la señal fluorescente. Diesinueve de estas estas fases mostraron señales en uno o ambos cromátidos del cromosoma 1 en ia región 1 q21.2-1 q23; 34% de esta señal fue 1q21.3 y 59% fue en 1 q22. Esto indicó una probable ubicación cercana a la interfaz de estas dos bandas. Existió un total de cuatro puntos de base no específicos observados en estas veinte metafases. Se obtuvo un resultado similar para la hibridización de la sonda a 20 metafases en el segundo macho normal. El gen mapea en la misma región en la que está correlacionada con la susceptibilidad sistemica al lupus eritematosis. Los dos genes pueden ser iguales por ejemplo los reactivos SLAM pueden ser útiles ya sea como terapéutica directa para la enfermedad, o el gen puede ser un marcador genético útil para mapear dicho gen. EJEMPLO 21 . Kd de la interacción de SLAM-SLAM Las constantes de equilibrio para las interacciones de SLAM-SLAM se analizaron mediante resonancia plasmónica superficial usando un instrumento BIAcore ™ (Pharmacia). Se usó Ab 7D4. Se midieron la cinética de adhesión de Ab 7D4/SLAM-SLAM-lg y SLAM-lg/SLAM-lg y la afinidad. Aproximadamente 5 8.000 unidades de resonancia (RUs) de SLAM-ig se adhirieron lentamente a la matriz de dextrano en chip sensor a través de sus usinas, de acuerdo con el protocolo del fabricante (BIAcore ™ manual, Pharmacia Bíosensor). El buffer (fosfato-buffer salino, PBS, pH 7,0) se hizo pasar a través del flujo celular hasta que se removió toda la proteína disociable y la línea de base permaneció estable. 1° Las soluciones que contenían varias concentraciones del anticuerpo 7D4 en PBS (que oscilaban entre 10 nM a 500 nM) se hicieron pasar luego a través de la célula flujo celular. Se observó un aumento de la masa de proteína adherida, seguido por una disminución cuando se reemplazó la solución de proteína por buffer. El protocolo de análisis de datos no lineales O'Shannessy , et al. (1993) i 5 Anal. Biochem. 212:457-468, se empleó para analizar los datos a fin de determinar las constantes del régimen de asociación (Ka) y de disociación (Kd). Ver tabla 4. La constante kd de disociación en equilibrio se calculó luego a partir de la relación Kd/Ka . Se midió la cinética de adhesión de SLAM-lg/SLAM-lg de manera similar.

Después de la inmovilización de SLAM-lg al chip, se hicieron pasar soluciones de SLAM-lg a concentraciones constantes que oscilaban de 100 nM a 1500 nM a través del flujo celular a un régimen de flujo de µl/min. Desde las fases de asociación y disociación, se obtuvieron las correspondientes constantes del régimen y por lo tanto la constante de adhesión en equilibrio 25 Los regímenes Kon y koff pueden más lentos que otras interacciones de adhesión de células-células. La Kd es de 10-100 veces superior a la de otras interacciones de adhesión de célula a célula por ejemplo la interacción de célula CD2 con CD48 (aproximadamente 60-80 µM).

Tabla 4: Constante del Régimen de asociación y disociación 1 y constante de equilibrio aparente Kd para interacciones de SLAM/SLAM y SLAM/Ab 7D4.

Superficie Ligando Kr off Kd Inmovilizada (x 10 'V1) (s-1) SLAM-lg Ab 7D4 1 ,32 5,5 x 10" 4,2 nM SLAM-lg SLAM-lg 1 ,2 0,011 0,92 mM Se estimó que los errores standard de los parámetros eran: Kon, 20%; koff, 10%; Kd, 24%. "mw Fmt",*"m+" 'm LISTADO DE SECUENCIAS (1 ) INFORMACIÓN GENERAL (i) SOLICITANTE: Schering Corporation (ií) TITULO DE LA INVENCIÓN: GENES PURIFICADOS QUE CODIFICAN CÉLULAS DE MAMÍFEROS ANTIGENOS SUPERFICIALES; PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS (iii) CANTIDAD DE SECUENCIAS: 12 (iv) DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Schering - Plough Corporation (B) CALLE: 2000 Galloping Hill Road (C) CIUDAD: Kenilworth (D) ESTADO: New Jersey (E) PAÍS: USA - Estados Unidos de Norteamérica (F) COD. POSTAL: 07033-0530 (v) FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: Disco Floppy (B) COMPUTADORA. Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: 7, 1 (D) SOFTWARE Microsoft 5.1 a (vi) DATOS CORRIENTES DE LA SOLICITUD: (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: (C) CLASIFICACIÓN: (vií) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR (A) NUMERO DE LA SOLICITUD: Patente Norteamericana Acta No. 08/481.777 y Acta No. 08/348.792 (B) FECHA DE PRESENTACIÓN: 2 DE DICIEMBRE DE 1194 Y 7 DE JUNIO DE 1995 (viii) INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Lunn, Paul G. (B) NUMERO DE REGISTRO: 32.743 (C) NUMERO DE REFERENCIA/EXPENDIENTE: DX0436Q (ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: (A) TELEFONO: 908-298-5061 (B) TELEFAX: 908-298-5388 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICA DE LAS SECUENCIAS: (A) LONGITUD: 1 .716 pares de Dase (B) TIPO: Ácido Nucleico (C) CADENAS: Únicas (D) TOPOLOGÍA Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE. CDSB(B) LUGAR: 61..1065 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO.:1 : AGGCATCTGT GAGCAGCTGC CAGGCTCCGG CCAGGATCCC TTCCTTCTCC TCATTGGCTG 60 ATG GAT CCC AAG GGG CTC CTC TCC TTG ACC TTC GTG CTG TTT CTC TCC 108 Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Pfie Val Leu Ptte Leu Ser 1 5 10 15 CTG GCT TTT GGC GCA AGC TAC GGA ACA GGT GGG CGC ATG ATG AAC TGC 156 Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly 'Phr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys 20 2b 30 CCA AAG ATT CTC CGG CAG TTG GGA AGC AAA GTG CTG CTG CCC CTG ACA 204 Pro Lys lie Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr 35 40 45 TAT GAA AGG ATA AAT AAG AGC ATG AAC AAA AGC ATC CAC ATT GTC GTC 252 Tyr Glu Arg lie Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser lie His lie Val Val 50 55 60 ACA ATG GCA AAA TCA CTG GAG AAC AGT GTC GAG AAC AAA ATA GTG TCT 300 Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Clu Asn Lys lie Val Ser 65 70 75 80 CTT GAT CCA TCC GAA GCA GGC CCT CCA CGT TAT CTA GGA GAT CGC TAC 348 Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr 85 9o ' 95 AAG TTT TAT CTG GAG AAT CTC ACC CTG GGG ATA CGG GAA AGC AGG AAG 396 Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly lie Arg Glu Ser Arg Lys 100 105 no GAG GAT GAG GGA TGG TAC CTT ATG ACC CTG GAG AAA AAT GTT TCA GTT 444 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 120 " 125 CAG CGC TTT TGC CTG CAG TTG AGC- CTT TAT GAG CAG GTC TCC ACT CCA 492 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro 130 135 i40 GAA ATT AAA GTT TTA AAC AAG ACC CAG GAG AAC GGG ACC TGC ACC TTG 540 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 ATA CTG GGC TGC ACA GTG GAG AAG GGG GAC CAT GTG GCT TAC AGC TGG 588 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 AGT GAA AAG GCG GGC ACC CAC CCA CTG AAC CCA GCC AAC AGC TCC CAC 636 Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 CTC CTG TCC CTC ACC CTC GGC CCC CAG CAT GCT GAC AAT ATC TAC ATC 684 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 TGC ACC GTG AGC AAC CCT ATC AGC AAC AAT CC CAG ACC TTC AGC CCG 732 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro 210 215 220 TGG CCC GGA TGC AGG ACA GAC CCC TCA GAA ACA AAA CCA TGG GCA GTG 780 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val 225 230 235 240 TAT GCT GGG CTG TTA GGG GGT GTC ATC ATG ATT CTC ATC ATG GTG GTA 828 Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly V l He Met He Leu He Met Val Val 245 250 255 ATA CTA CAG TTG AGA AGA AGA GGT AAA ACG AAC CAT TAC CAG ACA ACA 876 He Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln Thr Thr 260 265 270 GTG GAA AAA AAA AGC CTT ACG ATC TAT GCC CAÁ GTC CAG AAA CCA GGT 924 Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Lys Pro Gly 275 280 285 CCT CTT CAG AAG AAA CTT GAC TCC TTC CCA GCT CAG GAC CCT TGC ACC 972 Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro Cys Thr 290 295 300 ACC ATA TAT GTT GCT GCC ACA GAG CCT GTC CCA GAG TCT GTC CAG GAA 1020 Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val Gln Glu 305 310 315 320 ACA AAT TCC ATC ACA GTC TAT GCT AGT GTG ACA CTT CCA GAG AGC 1065 Thr Asn Ser He Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser 325 330 335 TGACACCAGA GACCAACAAA GGGACTTTCT GAAGGAA?AT GGAAAAACCA AAATGAACAC 1125 TGAACTTGGC CACAGGCCCA AGTTTCCTCT GGCAGACATG CTGCACGTCT GTACCCTTCT 1185 CAGATCAACT CCCTGGTGAT GTTTCTTCCA CATACATCTG TGAAATGAAC AAGGAAGTGA 1245 GGCTTCCCAA GAATTTAGCT TGCTGTGCAG TGGCTGCAGG CGCAGAACAG AGCGTTACTT 1305 GATAACAGCG TTCCATCTTT GTGTTGTAGC AGATGAAATG GACAGTAATG TGAGTTCAGA 1365 CTTTGGGCAT CTTGCTCTTG GCTGGAACTG ATAATAAAAA TCAGACTGAA AGCCAGGACA 1425 TCTGAGTACC TATCTCACAC ACTGACCACC AGTCACAAAG TCTGGAAAAG TTTACATTTT 1485 GGCTATCTTT ACTTTGTTCT GGGAGCTGAT CATGATAACC TGCAGACCTG ATCAAGCCTC 1545 TGTGCCTCAG TTTCTCTCTC AGGATAAAGA GTGAATAGAG GCCGAAGGGT GAATTTCTTA 1605 TTATACATAA AACACTCTGA TATTATTGT? TAAAGGAAGC TAAGAATATT ATTTTATTTG 1665 CAAAACCCAG AAGCTAAAAA GTCAATAAAC AGAAAGAATG ATTTTGAGAA A 1716 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:2: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 335 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (C) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:2: Met Asp Pro Lye Glv Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser -, * 5* 10 15 Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys 20 25 30 Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser He Kis He Val Val 50 55 . 60 Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn L.vs He Va] Ser 65 70 75 8C Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Ty: 85 90 Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He A.rg Glu Ser A.rg Lys 100 105 110 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 120 125 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Th? Pro 130 135 140 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 Ser Glu Lys Ala Gly Th: His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro 210 215 220 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val 225 230 235 240 Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val He Met He Leu He Met Val Val 245 250 255 He Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asr, His Tyr Gln Thr Thr 250 265 270 Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Va Gln Lys Pro Gly 275 280 285 Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro Cys Thr 290 295 300 Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val Gln Glu 305 210 315 ¡20 Th- Asn Ser He Tht Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser 325 330 335 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID.NO:3: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1.852 pares de bases (B) TIPO: Ácido nucleico (C) CADENAS: Únicas (D) TOPOLOGÍA: Lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LUGAR: 61..954 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:3: TGGCATCTGT GAGCAGCTGC CAGGCTCCGG CCAGGATCCC TTCCTTCTCC TCATTGGCTG 60 ATG GAT CCC AAG GGG CTC CTC TCC TTG ACC TTC GTG CTG TTT CTC TCC 108 Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 CTG GCT TTT GGG GCA AGC TAC GGA ACA GGT GGG CGC ATG ATG AAC TGC 156 Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys 20 25 30 CCA AAG ATT CTC CGG CAG TTG GGA AGC AAA GTG CTG CTG CCC CTG ACA 204 Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr 35 40 45 TAT GAA AGG ATA AAT AAG AGC ATG AAC AAA AGC ATC CAC ATT GTC GTC 252 Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn Lye Ser He Hie He Val Val 50 55 50 ACA ATG GCA AAA TCA CTG GAG AAC AGT GTC GAG AAC AAA ATA GTG TCT 300 Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys He Val Ser 65 0 75 80 CTT GAT CCA TCC GAA GCA GGC CCT CCA CGT TAT CTA GGA GAT CGC TAC 34 S Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr 85 90 95 AAG TTT TAT CTG GAG AAT CTC ACC CTG GGG ATA CGG GAA AGC AGG AAG 396 Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg Glu Ser Arg Lys 100 105 110 GAG GAT GAG GG-A TGG TAC CTT ATG ACC CTG GAG AAA AAT GTT TCA GTT 444 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 12.0 ' 125 CAG CGC TTT TGC CTG CAG TTG AGG CTT TAT GAG CAG GTC TCC ACT CCA 492 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro 130 135 140 GAA ATT AAA GTT TTA AAC AAG ACC CAG GAG AAC GGG ACC TGC ACC TTG 540 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 ATA CTG GGC TGC ACA GTG GAG AAG GGG GAC CAT GTG GCT TAC AGC TGG 5S8 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp Hi Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 AGT GAA AAG GCG GGC ACC CAC CCA CTG AAC CCA GCC AAC AGC TCC CAC 636 Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 CTC CTG TCC CTC ACC CTC GGC CCC CAG CAT GCT GAC AAT ATC TAC ATC 684 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 TGC ACC GTG AGC AAC CCT ATC AGC AAC AAT TCC CAG ACC TTC AGC CCG 732 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro 210 215 220 TGG CCC GGA TGC AGG ACA GAC CCC TCA GAA ACA AAA CCA TGG GCA GTG 780 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val 225 230 235 240 TAT GCT GGG CTG TTA GGG GGT GTC ATC ATG ATT CTC ATC ATG GTG GTA 828 Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val He Met He Leu He Met Val Val 245 250 255 ATA CTA CAG TTG AGA AGA AGA GGT AAA ACG AAC CAT TAC CAG ACA ACA 876 He Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln Thr Thr 260 265 270 GTG GAA AAA AAA AGC CTT ACG ATC TAT GCC CAÁ GTC CAG AAA CCA GGT 924 Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Lys Pro Gly 275 280 285 GAC ACT CAT CAT CAG ACT TCG GAC TTA TTC TAATCCAGGA TGACCTTATT 974 Asp Thr His His Gln Thr Ser Asp Leu Phe 290 295 TTGAAATCCT TATCTTGACA TCTGTGAAGA CCTTTATTCA AATAAAGTCA CATTTTGACA 1034 TTCTGCGAGG GGCTGGAGCC C- GCCGGGC^ GATGTGGAG GCGGGCCGCG GCGGGGCTGC 1094 CTGGCCC-GTG CTGTTGGGGC TGCTGCTGGC GCTGTTAGTG CCGGGCGGTG GTGCCGCCAA 1154 GACCGGTGCG GAGCTCGTGA CTGCGGGTCG GTGCTGAAGC TGCTCAATAC GCACCACCGG 121 TGCGGCTGCA CTCGCACGAC ATCAAATACG GATCCGGCAG CGGCCAGCAA TCGGTGACCG 12"4 GCGTAGAGGT CGGAGCGACG AATAGCTACT GGCGGATCCG CGGCGGCTCG GAGGGGGGTG 1334 CCCGCGCGGG TCCCCGGTGC GCTGCGGGCA GGCGGTGAGG TCACACATGT GCTTACGGGC 1394 AAGAACCTGC ACACGCACCA CTTCCCGTCG CCGCTGTCCA ACAACCAGGA AGTGAGTGCC 1454 AAAGGGGAAG ACGGCGAGGG CGACGACCTG GACCTATGGA CAGTGCGCTG CTCTGCTCTG 1514 GACAGCACTG GGAGCGTGAG GCTGCTGTGG CGCCTTCCAG CATGTGGCAC CTCTGTGGTT 1574 CCTGTCAGTC ACGGTAGCAG TATGGAAGCC CCATCCGTGG GCAGCATGAG GTCCACGCAT 1634 GCCCAGTGCC AACACGCACA ATACGTGGAA GGCCATGGAA GGCATCTTCA TCAAGCCTAG 1694 TGTGGAGCCC TCTGCAGGTC ACGATGAACT CTGAGTGTGT GGATGGATGG GTGGATGGAG 1754 GGTGGCAGGT GGGGCGTCTG CAGGGCCACT CTTGGCAGAG ACTTTGGGTT TGTAGGGGTC 1814 CTCAAGTGCC TTTGTGATTA AAGAATGTTG GTCTATGA 1852 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.N0 4: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA (A) LONGITUD: 298 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: Lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:4: Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Gly Ala Ser yr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys 20 25 30 Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val ^ Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser He His He Val Val 50 55 60 Thr Met Ala Lys Set Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys He Val Ser 65 0 75 ' 80 Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr 85 90 95 Lys Phe Tyr Leu Giu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg Glu Ser Arg Lys 100 105 110 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 120 125 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro 130 135 140 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp Kis Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu A=n Pro Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro 210 215 220 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val 225 230 235 240 Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val He Met He Leu He Met Val Val 245 250 255 He Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn Hie Tyr Gln Thr Thr 260 265 270 Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Ly--- Pro Gly 275 280 285 Asp Thr His His Gln Thr Ser Asp Leu Phe 290 295 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:5: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD. 335 amino ácidos (B) TIPO amipo ácido (C) CADENA Única (D) TOPOLOGÍA Lineal (?¡) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE/CLAVE' CDS (B) LUGAR. 61 .975 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:5.

AGGCATCTGT GAGCAGCTGC CAGGCTCCGG CCAGGATCCC TTCCTTCTCC TCATTGGCTG 60 ATG GAT CCC AAG GGG CTC CTC TCC TTG ACC TTC GTG CTG TTT CTC TCC 108 Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 CTG GCT TTT GGG GCA AGC TAC GGA ACA GGT GGG CGC ATG ATG AAC TGC 156 Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg M=t Met Asn Cys 20 25 30 CCA AAG ATT CTC CGG CAG TTG GGA AGC AAA GTG CTG CTG CCC CTG ACA 204 Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr 35 40 45 TAT GAA AGG ATA AAT AAG AGC ATG AAC AAA AGC ATC CAC ATT GTC GTC 252 Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser He His He Val Val 50 55 60 ACA ATG GCA AAA TCA CTG GAG AAC AGT GTC GAG AAC AAA ATA GTG TCT 300 Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys He Val Ser 65 70 75 80 CTT GAT CCA TCC CAÁ GCA GGC CCT CCA CGT TAT CTA GGA GAT CGC TAC 348 Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr 85 90 95 AAG TTT TAT CTG GAG AAT CTC ACC CTG GGG ATA CGG GAA AGC AGG AAG 396 Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg Glu Ser Arg Lys 100 105 110 GAG GAT GAG GGA TGG TAC CTT ATG ACC CTG GAG AAA AAT GTT TCA GIT 444 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 120 125 CAG CGC TTT TGC CTG CAG TTG AGG CTT TAT GAG CAG GTC TCC ACT CCA 492 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro 130 135 140 GAA ATT AAA GTT TTA AAC AAG ACC CAG GAG AAC GGG ACC TGC ACC TTG 540 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 ATA CTG GGC TGC ACA GTG GAG AAG GGG GAC CAT GTG GCT TAC AGC TGG 533 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 AGT GAA AAG GCG GGC ACC CAC CCA CTG AAC CCA GCC AAC AGC TCC CAC 636 Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Prc Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 CTC CTG TCC CTC ACC CTC GGC CCC CAG CAT GCT GAC AAT ATC TAC ATC 684 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 TGC ACC GTG AGC AAC CCT ATC AGC AAC AAT TCC CAG ACC TTC AGC CCG 732 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro 210 215 220 TGG CCC GGA TGC AGG ACA GAC CCC TCA GGT AAA ACG AAC CAT TAC CAG 780 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln 225 230 235 240 ACA ACA GTG GAA AAA AAA AGC CTT ACG ATC TAT GCC CAÁ GTC CAG AAA 828 Thr Thr Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Lys 245 250 255 CCA GGT CCT CTT CAG AA.G AAA CTT GAC TCC TTC CCA GCT CAG GAC CCT 876 Pro Gly Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro 260 265 270 TGC ACC ACC ATA TAT GTT GCT GCC ACA GAG CCT GTC CCA GAG TCT GTC 924 Cys Thr Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val 275 280 285 CAG GAA ACA AAT TCC ATC ACA GTC TAT GCT AGT GTG ACA CTT CCA GAG 972 Gln Glu Thr Asn Ser He Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu 290 295 300 AGC TGACACCAGA GACCAACAAA GGGACTTTCT GAAGGAAAAT GGAAA 1020 Ser 305 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:6: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 305 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (x¡) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:6: Met Asp Pro Lys Gly Leu Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Gly Ala Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Arg Met Met Asn Cys 20 25 30 Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser L e Val Leu Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn L s Ser He His He Val Val 50 55 60 Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys He Val Ser 65 70 75 80 Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr 85 90 95 Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg Glu Ser Arg Lys 100 105 110 Glu Asp Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val 115 120 125 Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro 130 135 140 Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu 145 150 155 160 He Leu Gly Cys Thr Val Glu Lys Gly A«;p Hie Val Ala Tyr Ser Trp 165 170 175 Ser Glu Lye Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His 180 185 190 Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He 195 200 205 Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gip Thr Pne Ser Pro 210 215 220 Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Gly Lys Thr Asn His Tyr Gln 225 230 235 240 Thr Thr Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Lys 245 250 255 Pro Gly Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Ph<? Pr Ala Gln Asp Pro 26C 265 270 Cys Thr Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val 275 280 285 Gln Glu Thr Asr Ser He Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu 290 295 300 Ser 305 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:7: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1079 pares de bases (B) TIPO. Ácido Nucleico CADENA. Única TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA. (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LUGAR: 153..1073 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:7: GGACTCTGTT CCTGTCTTTC TGTCTATCTT CTTCCCAAGG CAGGCTATTG CTTTCTGTTT 60 AGAAGTATCA GGGCTATGAG AAAAGGTATT TGAGAAAGAA AAAGCCAAGC AAGAAGTGGA 120 CTTTGGACTG CCTGTGTGAG TGGGGTGGGC GC ATG ATG AAC TGC CCA AAG ATT 173 Met Met Asn Cys Pro Lys He 1 5 CTC CGG CAG TTG GGA AGC AAA GTG CTG CTG CCC CTG ACA TAT GAA AGG 221 Leu Arg Gln Leu Giy Ser Lys Val Leu Leu Pro Leu Thr Tyr Glu Arg 10 15 20 ATA AAT AAG AGC ATG AAC AAA AGC ATC CAC ATT GTC GTC ACA ATG GCA 269 He Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser He His He Val Val Thr Met Ala 25 30 35 "-•P" AAA TCA CTG GAG AAC AGT GTC GAG AAC AAA ATA GTG TCT CTT GAT CCA 317 Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn Lys He Val Ser Leu Asp Pro 40 45 50 55 TCC GAA GCA GGC CCT CCA CGT TAT CTA GGA GAT CGC TAC AAG TTT TAT 365 Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu Gly Asp Arg Tyr Lys Phe Tyr 60 65 70 CTG GAG AAT CTC ACC CTG GGG ATA CGG GAA AGC AGG AAG GAG GAT GAG 413 Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg Glu Ser Arg Lys Glu Asp Glu 75 80 85 GGA TGG TAC CTT ATG ACC CTG GAG AAA AAT GTT TCA GTT CAG CGC TTT 461 Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys Asn Val Ser Val Gln Arg Phe 90 95 100 TGC CTG CAG TTG AGG CTT TAT GAG CAG GTC TCC ACT CCA GAA ATT AAA 509 Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln Val Ser Thr Pro Glu He Lys 105 110 115 GTT TTA AAC AAG ACC CAG GAG AAC GGG ACC TGC ACC TTG ATA CTG GGC 557 Val Leu Aen Lys Thr Gln Glu Asn Gly Thr Cys Thr Leu He Leu Gly 120 125 130 135 TGC ACA GTG GAG AAG GGG GAC CAT GTG GCT TAC AGC TGG AGT GAA AAG 605 Cys Thr Val Glu Lys Gly Asp His Val Ala Tyr Ser Trp Ser Glu Lys 140 145 150 GCG GGC ACC CAC CCA CTG AAC CCA GCC AAC AGC TCC CAC CTC CTG TCC 653 Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala Asn Ser Ser His Leu Leu Ser 155 160 165 CTC ACC CTC GGC CCC CAG CAT GCT GAC AAT ATC TAC ATC TGC ACC GTG 701 Leu Thr Leu Gly Pro Gln His Ala Asp Asn He Tyr He Cys Thr Val 170 175 180 AGC AAC CCT ATC AGC AAC AAT TCC CAG ACC TTC AGC CCG TGG CCC GGA 749 Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln Thr Phe Ser Pro Trp Pro Gly 185 190 195 TGC AGG ACA GAC CCC TCA GAA ACA AAA CCA T. G GCA GTG TAT GCT GGG 797 Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys Pro Trp Ala Val Tyr Ala Gly 200 205 2.10 215 CTG TTA GGG GGT GTC ATC ATG ATT CTC ATC ATG GTG GTA ATA CTA CAG 845 Leu Leu Gly Gly Val He Met He Leu He Met Val Val He Leu Gln 220 225 230 TTG AGA AGA AGA GGT AAA ACG AAC CAT TAC CAG ACA ACA GTG GAA AAA 893 Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His Tyr G.n Thr Thr Val Glu Lye 235 240 245 AAA AGC CTT ACG ATC TAT GCC CA GTC CAG AAA CCA GGT CCT CTT CAG 941 Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val Gln Lye Pro Gly Pro Leu Gin 250 255 260 AAG AAA CTT GAC TCC TTC CCA GCT CAG GAC CCT TGC ACC ACC ATA TAT 989 Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln Asp Pro Cys Thr Thr He Tyr 265 270 275 GTT GCT GCC ACA GAG CCT GTC CCA GAG TCT GTC CAG GAA ACA AAT TCC 1037 Val Ala Ala Thr Glu Pro Val Pro Glu Ser Val Gln Glu Thr Asn Ser 280 285 290 295 ATC ACA GTC TAT GCT AGT GTG ACA CTT CCA GAG AGC TGACAC 1079 He Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser 300 305 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:8: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 307 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D)TOPOLOGIA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:8: Met Met Asn Cys Pro Lys He Leu Arg Gln Leu Gly Ser Lys Val Leu 1 5 10 15 Leu Pro Leu Thr Tyr Glu Arg He Asn Lys Ser Met Asn Lys Ser He 20 25 30 His He Val Val Thr Met Ala Lys Ser Leu Glu Asn Ser Val Glu Asn 35 40 45 Lys He Val Ser Leu Asp Pro Ser Glu Ala Gly Pro Pro Arg Tyr Leu 50 55 60 Gly Asp Arg Tyr Lys Phe Tyr Leu Glu Asn Leu Thr Leu Gly He Arg 65 70 75 80 Glu Ser Arg Lye Glu Aep Glu Gly Trp Tyr Leu Met Thr Leu Glu Lys 85 90 95 Asn Val Ser Val Gln Arg Phe Cys Leu Gln Leu Arg Leu Tyr Glu Gln 100 105 110 Val Ser Thr Pro Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gly 115 120 125 Thr Cys Thr Leu He Leu Gly Cys Thr Val Gl- Lys Gly Asp His Val 130 135 140 Ala Ty- Ser Trp Ser Glu Lys Ala Gly Thr His Pro Leu Asn Pro Ala 145 150 155 • ISO Aen Ser Ser His Leu Leu Ser Leu Thr Leu Gly Pro Gln Hie Ala Asp 165 170 175 Asn He Tyr He Cys Thr Val Ser Asn Pro He Ser Asn Asn Ser Gln 180 185 190 Thr Phe Ser Pro Trp Pro Gly Cys Arg Thr Asp Pro Ser Glu Thr Lys 195 200 205 Pro Trp Ala Val Tyr Ala Gly Leu Leu Gly Gly Val He Met He Leu 210 215 220 He Met Val Val He Leu Gln Leu Arg Arg Arg Gly Lys Thr Asn His 225 230 235 240 Tyr Gln Thr Thr Val Glu Lys Lys Ser Leu Thr He Tyr Ala Gln Val 245 250 255 Gln Lys Pro Gly Pro Leu Gln Lys Lys Leu Asp Ser Phe Pro Ala Gln 260 265 270 Asp Pro Cys Thr Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Clu Pro Val Pro Glu 275 280 285 Ser Val Gln Glu Thr Asn Ser He Thr Val Tyr Ala Ser Val Thr Leu 290 295 300 Pro Glu Ser 305 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO:9: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1.200 pares de bases (B) TIPO" Ácido Nucleico (C) CADENA. Única (D) TOPOLOGÍA Lineal (u) TIPO DE MOLÉCULA. ADNc (ix) CARACTERÍSTICA (A) NOMBRE/CLAVE" CDS (B) (B) LUGAR: 61 .1089 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA' SEC. ID. NO:9" TCCTGCCGAG CTGAGCTGAG CTGAGCTCAC AGCTGGGACC CTGTCTGCGA TTGCTGGCTA 6C ATG GAT CCC AAA GGA TCC CTT TCC TGG AGA ATA CTT CTG TTT CTC TCC 108 Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg He Leu Leu Phe Leu Ser 1 10 15 CTG GCT TTT GAG TTG AGC TAC GGA ACA GGT GGA GGT GTG ATG GAT TGC 156 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Gly Val Met Asp Cys 20 25 30 CCA GTG ATT CTC CAG AAG CTG GGA CAG GAC ACG TGG CTG CCC CTG ACG 204 Pro Val He Leu Gln Lys Leu Gly Gln Asp Thr Trp Leu Pro Leu Thr 35 40 45 AAT GAA CAT CAG ATA AAT AAG AGC GTG AAC AAA AGT GTC CGC ATC CTC 252 Asn Glu His Gln He Asn Lys Ser Val Asn Lys Ser Val Arg He Leu 50 55 60 GTC ACC ATG GCG ACG TCC CCA GGA AGC AAA TCC AAC AAG AAA ATT GTG 300 Val Thr Met Ala Thr Ser Fro Gly Ser Lys Ser Asn Lys Lys He Val 65 70 75 80 TCT TTT GAT CTC TCT AAA GGG AGC TAT CCA GAT CAC CTG GAG GAT GGC 348 Ser Phe Asp Leu Ser Lye Gly Ser Tyr Pro Asp His Leu Glu Asp Gly 85 90 95 TAC CAC TTT CAÁ TCG AAA AAC CTG AGC CTG AAG ATC CTC GGG AAC AGG 396 Tyr His Phe Gln Ser Lys Asn Leu Ser Leu Lys He Leu Gly Asn Arg 100 105 110 CGG GAG AGT GAA GGA TGG TAC TTG GTG AGC GTG GAG GAG AAC GTT TCT 444 Arg Glu Ser Glu Gly Trp Tyr Leu Val Ser Val Glu Glu Asn Val Ser 115 120 125 GTT CAG CAÁ TTC TGC AAG CAG CTG AAG CTT TAT GAA CAG GTC TCC CCT 492 Val Gln Gln Phe Cys Lys Gln Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Val Ser Pro 130 135 140 CCA GAG ATT AAA GTG CTA AAC AAA ACC CAG GAG AAC GAG AAT GGG ACC 540 Pro Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Gl».. Asn Gly Thr 145 150 155 160 TGC AGC TTG CTG TTG GCC TGC ACA GTG AAG AAA GGG GAC CAT GTG ACT 583 Cys Ser Leu Leu Leu Ala Cys Thr Val Lys Lys Gly Asp His Val Thr 165 170 175 TAC AGC TGG AGT GAT GAG GCA GGC ACC CAC CTG CTG AGC CGA GCC AAC 636 Tyr Ser Trp Ser Asp Glu Ala Gly Thr His Leu Leu Ser Arg Ala Asn 180 185 - 190 CGC TCC CAC CTC CTG CAC ATC ACT CTT AGC AAC CAG CAT CAÁ GAC AGC 684 Arg Ser His Leu Leu His He Thr Leu Ser Asn Gln Hie Gln Asp Ser 195 200 205 ATC TAC AAC TGC ACC GCA AGC AAC CCT GTC AGC AGT ATC TCT AGG ACC 732 He Tyr Asn Cye Thr Ala Ser Asn Pro Val Ser Ser He Ser Arg Thr 210 215 220 TTC AAC CTA TCA TCG CAÁ GCA TGC AAG CAG GAA TCC TCC TCA GAA TCG 780 Phe Asn Leu Ser Ser Gln Ala Cys Lys Gln Glu Ser Ser Ser Glu Ser 225 230 235 240 AGT CCA TGG ATG CAÁ TAT ACT CTT GTA CCA CTG GGG GTC GTT ATA ATC 828 Ser Pro Trp Met Gln Tyr Thr Leu Val Pro Leu Gly Val Val He He 245 250 255 TTC ATC CTG GTT TTC ACG GCA ATA ATA ATG ATG AAA AGA CAÁ GGT AAA 876 Phe He Leu Val Phe Thr Ala He He Met Met Lys Arg Gln Gly Lye 260 265 270 TCA AAT CAC TGC CAG CCA CCA GTG GAA GAA AAA AGC CTT ACT ATT TAT 924 Ser Asn Hie Cys Gln Pro Pro Val Glu Glu Lys Ser Leu Thr He Tyr 275 280 285 GCC CAÁ GTA CAG AAA TCA GGG CCT CAÁ GAG AAG AAA CTT CAT GAT GCC 972 Ala Gln Val Gln Lys Ser Gly Pro Gln Glu Lys Lys Leu His Asp Ala 290 295 300 CTA ACA GAT CAG GAC CCC TGC ACA ACC ATT TAT GTG GCT GCC ACA GAG 1020 Leu Thr Asp Gln Aep Pro Cys Tnr Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu 305 310 315 320 CCT GCC CCA GAG TCT GTC CAG GAA CCA AAC CCC ACC ACA GTT TAT GCC 1068 Pro Ala Pro Glu Ser Val Gln Glu Pro Asn Pro Thr Thr Val Tyr Ala 325 330 335 AGT GTG ACA CTG CCA GAG AGC TGACCCATAT ACCCAGTGAA AGGACTTTTT 1119 Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser 340 GAAGGAGGAT AGAAGAACCA AAATCCACAC TGAACTGGAC CCCGGGGTCC AAGTTCTCTG 1179 TGACAGAAAC TGCACATCTG T 1200 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO 10. (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 343 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:10: Met Asp Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg He Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Thr Gly Gly Gly Val Met Asp Cys 20 25 30 Pro Val He Leu Gln Lys Leu Gly Gln Asp Thr Trp Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Asn Glu His Gln He Asn Lys Ser Val Asn Lys Ser Val Arg He Leu 50 55 60 Val Thr Met Ala Thr Ser Pro Gly Ser Lys Ser Aen Lys Lys He Val 65 70 75 80 Ser Phe Asp Leu Ser Lys Gly Ser Tyr Pro Asp His Leu Glu Asp Gly 85 90 95 Tyr His Phe Gln Ser Lys Asn Leu Ser Leu Lys He Leu Gly Asn Arg 100 105 110 Arg Glu Ser Glu Gly Trp Tyr Leu Val Ser Val Glu Glu Asn Val Ser 115 120 125 Val Gln Gln Phe Cys Lys Gln Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Val Ser Pro 130 135 140 Pro Glu He Lye Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Glu Asn Gly Thr 145 150 155 160 Cye Ser Leu Leu Leu Ala Cys Thr Val Lys Lys Gly Asp His Val Thr 165 170 175 Tyr Ser Trp Ser Asp Glu Ala Gly Thr His Leu Leu Ser Arg Ala Asn 130 185 190 Arg Ser His Leu Leu .s He Thr Leu Ser Asn Gln His Gln Asp Ser 195 200 205 He Tyr Asn Cys Thr Ala Ser Asn Pro Val Ser Ser He Ser Ara Th: 210 215 220 Phe Asn Leu Ser Ser Gln Ala Cye Lys Gln Glu Ser Ser Ser Glu Ser 225 230 235 240 Ser Pro Trp Met Gln Tyr Thr Leu Val Pro Leu Gly Val Val He He 245 250 255 Phe He Leu Val Phe Thr Ala He He Met Met Lys Arg Gln Gly Lys 260 265 ' 270 Ser Asn Hie Cys Gln Pro Pro Val Glu Glu Lye Ser Leu Thr He Tyr 275 280 285 Ala Gln Val Gln Lys Ser Gly Pro Gln Glu Lye Lys Leu His Asp Ala 290 295 300 Leu Thr Asp Gln Asp Pro Cys Thr Thr He Tyr Val Ala Ala Thr Glu 305 310 315 320 Pro Ala Pro Glu Ser Val Gln Glu Pro Asn Pro Thr Thr Val Tyr Ala 325 330 335 Ser Val Thr Leu Pro Glu Ser 340 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC.ID.NO: 1 1 : (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1140 pares de bases (B) TIPO. Ácido Nucleico (C) CADENA: Única (D) TOPOLOGÍA: Lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LUGAR: 61..1047 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO: 1 1 : TCCTGCCGAG CTGAGCTGAG CTGAGCTCAC AGCTGGGACC CTGTCTGCGA TTGCTGGCTA 60 ATG GAT CCC AAA GGA TCC CTT TCC TGG AGA ATA CTT CTG TTT CTC TCC 108 Met Aep Pro Lys Gly Ser Leu Ser Trp Arg He Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 CTG GCT TTT GAG TTG AGC TAC GGA ACA GGT GGA GGT GTG ATG GAT TGC 156 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Tnr Gly Gly Gly Val Met Asp Cys 20 25 30 CCA GTG ATT CTC CAG AAG CTG GGA CAG GAC ACG TGG CTG CCC CTG ACG 204 Pro Val He Leu Gln Lye Leu Gly Gip Asp Tin. Trp Leu Pro Leu Thr 35 40 45 AAT GAA CAT CAG ATA AAT AAG AGC GTG AAC AAA AGT GTC CGC ATC CTC 252 Asn Glu His Gln He Asn Lys Ser Val Asn Lys Ser Val Arg He Leu 50 55 60 GTC ACC ATG GCG ACG TCC CCA GGA AGC AAA TCC AAC AAG AAA ATT GTG 300 Val Thr Met Ala Thr Ser Pro Gly Ser Lys Ser Asn Lys Lys He Val 65 70 75 80 TCT TTT GAT CTC TCT AAA GGG AGC TAT CCA GAT CAC CTG GAG GAT GGC 348 Ser Phe Asp Leu Ser Lys Gly Ser Tyr Pro Asp His Leu Glu Asp Gly 85 90 95 TAC CAC TTT CAÁ TCG AAA AAC CTG AGC CTG AAG ATC CTC GGG AAC AGG 396 Tyr His Phe G n Ser Lys Asn Leu Ser Leu Lys He Leu Gly Asn Arg 100 105 110 CGG GAG AGT GAA GGA TGG TAC TTG GTG AGC GTG GAG GAG AAC GTT TCT 444 Arg Glu Ser Glu Gly Trp Tyr Leu Val Ser Val Glu Glu Asn Val Ser 115 120 125 GTT CAG CAÁ TTC TGC AAG CAG CTG AAG CTT TAT GAA CAG GTC TCC CCT 492 Val Gln Gln Phe Cye Lys Gln Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Val Ser Pro 130 135 140 CCA GAG ATT AAA GTG CTA AAC AAA ACC CAG GAG AAC GAG AAT GGG ACC 540 Pro Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Glu Asn Gly Thr 145 150 155 160 TGC AGC TTG CTG TTG GCC TGC ACA GTG AAG A?iA GGG GAC CAT GTG ACT 588 Cys Ser Leu Leu Leu Ala Cye Thr Val Lys Lye Gly Asp Hie Val Thr 165 170 175 TAC AGC TGG AGT GAT GAG GCA GGC ACC CAC CTG CTG AGC CGA GCC AAC 636 Tyr Ser Trp Ser Asp Glu Ala Gly Thr His Leu Leu Ser Arg Ala Asn 180 185 190 CGC TCC CAC CTC CTG CAC ATC ACT CTT AGC AAC CAG CAT CAÁ GAC AGC 684 Arg Ser Kis Leu Leu His He Thr Leu Ser Aen Gln His Gln Asp Ser 195 200 205 ATC TAC AAC TGC ACC GCA AGC AAC CCT GTC AGC AGT ATC TCT AGG ACC 732 He Tyr Asn Cys Thr Ala Ser Asn Pro Val Ser Ser He Ser Arg Thr 210 215 220 TTC AAC CTA TCA TCG CA GCA TGC A?G CAG GAA TCC TCC TCA GAA TCG 11 Phe Asn Leu Ser Ser Gln Ala Cys Lys Gln Glu Ser Ser Ser Glu Ser 225 230 235 240 AGT CCA TGG ATG CAÁ TAT ACT CTT GTA CCA CTG GGG GTC GTT ATA ATC 828 Ser Pro Trp Met Gln Tyr Thr Leu Val Pro Leu Gly Val Val He He 245 250 ' 255 TTC ATC CTG GTT TTC ACG GCA ATA ATA ATG ATG AAA AGA CAÁ GGT AAA 876 Phe He Leu Val Phe Thr Ala He He Met Met Lys Arg Gln Gly Lys 260 265 270 TCA AAT CAC TGC CAG CCA CCA GTG GAA GAA AAA AGC CTT ACT ATT TAT 924 Ser Asn Hie Cye Gln Pro Pro Val Glu Glu Lys Ser Leu Thr He Tyr 275 280 285 GCC CAÁ GTA CAG AAA TCA GGG GTA CGT TCT ATG CCT CAC CTT GCG GGA 972 Ala Gln Val Gln Lye Ser Gly Val Arg Ser Met Pro His Leu Ala Gly 290 295 300 GTG TCT GTC ATA TTT CGC ACA GGA TTT CTG ATA GCT GCC TTG CAC ACA 1020 Val Ser Val He Phe Arg Thr Gly Phe Leu He Ala Ala Leu His Thr 305 310 315 320 ACC ATG GTC CTG CAG GGA CTC CTA GAG TAGATGAACT TAAGAAAGCA 1067 Thr Met Val Leu Gln Gly Leu Leu Glu 325 GAAAAGTCAA GAACAAGAGC TCCCCCAGTG TCACTGACCC TTATATTGTT TGAACTTGTA 1127 GAAAACAGTG ACA 1140 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID.NO:12: (i) CARACTERÍSTICA DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 329 amino ácidos (B) TIPO: amino ácido (D) TOPOLOGÍA: Lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: Proteína (x¡) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. NO:12: Met Aep Pro Lye Gly Ser Leu Ser Trp Arg He Leu Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Phe Glu Leu Ser Tyr Gly Thr Gly Cly Gly Val Met Asp Cys 20 25 30 Pro Val He Leu Gln Lys Leu Gly Gln Asp Thr Trp Leu Pro Leu Thr 35 40 45 Asn Glu His Gln He Asn Lys Ser Val Asn Lys Ser Val Arg He Leu 50 55 60 Val Thr Met Ala Thr Ser Pro Gly Ser Lys Ser Asn Lys Lys He Val 65 70 75 80 Ser Phe Asp Leu Ser Lys Gly Ser Tyr Pro Asp His Leu Glu Asp Gly 85 90 95 Tyr His Phe Gln Ser Lye Aen Leu Ser Leu Lys He Leu Gly Asn Arg 100 105 110 Arg Glu Ser Glu Gly Trp Tyr Leu Val Ser 'Val Glu Glu Asn Val Se: 115 120 125 Val Gln Gln Phe Cys Lys Gln Leu Lys Leu Tyr Glu Gln Val Ser Pro 130 135 140 Pro Glu He Lys Val Leu Asn Lys Thr Gln Glu Asn Glu Asn Gly Thr 145 150 155 160 Cys Ser Leu Leu Leu Ala Cys Thr Val Lys Lys Gly Asp His Val Thr 165 170 175 Tyr Ser Trp Ser Asp Glu Ala Gly Thr His Leu Leu Ser Arg Ala Asn 180 185 190 Arg Ser His Leu Leu His He Thr Leu Ser Asn Gln His Gln Asp Ser 195 200 205 He Tyr Aen Cye Thr Ala Ser Asn Pro Val Ser Ser He Ser Arg Thr 210 215 220 Phe Asn Leu Ser Ser Gln Ala Cys Lys Gln Glu Ser Ser Ser Glu Ser 225 230 235 240 Ser Pro Trp Met Gln Tyr Thr Leu Val Pro Leu Gly Val Val He He 245 250 255 Phe He Leu Val Phe Thr Ala He He Met Met Lys Arg Gln Gly Lys 260 265 270 Ser Asn His Cys Gln Pro Pro Val Glu Glu Lys Ser Leu Thr He Tyr 275 280 285 Ala Gln Val Gln Lys Ser Gly Val Arg Ser Met Pr<- His Leu Ala Gly 290 295 300 Val Ser Val He Phe Arg Thr Gly Phe Leu He Ala Ala Leu Hie Thr 305 310 315 320 Thr Met Val Leu Gln Gly Leu Leu Glu 325

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descripto y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma cómo la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo: 1. Una proteína SLAM substancialmente pura o recombinante o un fragmento peptídico de la misma: 2. Una proteína o péptido de acuerdo con la reivindicación 1 , seleccionada del grupo que consiste en: a) una proteína o péptido de un animal de sangre calientes seleccionado del grupo que consiste en aves y mamíferos incluyendo un humano o un ratón; b) una proteína o péptido que comprende por lo menos un segmento de polipéptido de la secuencia de SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10 o 12; c) una proteína o péptido que exhibe un patrón de modificación pos- translacional que es distinto de SLAM natural; d) una proteína o péptido que es capaz de estimular una célula T con otra señal. 3. Una proteína o péptido de acuerdo con la reivindicación 1 , que comprende una secuencia de una porción extracelular o intracelular de SLAM. 4. Una proteína de fusión que comprende un péptido de la reivindicación 1. 5. Una composición que comprende una proteína de la reivindicación 1 y un portador farmacéutica aceptable. 6. Un anticuerpo que fija específicamente una proteína o péptido de la reivindicación 1. 7. Un anticuerpo de la reivindicación 6, donde: a) dicho SLAM es una proteina de mamíferos incluyendo humanos o ratones. b) dicho anticuerpo se crea contra una secuencia peptídica purificada de la secuencia de SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, o 12; c) dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal; o d) dicho anticuerpo está rotulado. 8. Un método para purificar una proteína o péptido SLAM de otros materiales en una mezcla que comprende poner en contacto dicha mezcla con un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 6 y separar SLAM fijado de otros materiales. 9. Un ácido nucleico aislado o recombínante que es capaz de codificar una proteína o péptido de la reivindicación 1. 10. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9 donde dicho ácido nucleico: a) codifica una secuencia de SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, o 12; b) comprende una secuencia de SEC ID N° : 1 , 3, 5, 7, 9, o 11 ; o c) codifica una secuencia de un dominio extracelular de SLAM natural, o d) codifica una secuencia de un dominio intracelular de SLAM natural. 1 1. Un vector de expresión o réplica de la reivindicación 9. 12. Un equipo que comprende: a) SLAM substancialmente puro o un fragmento de la reivindicación 1 ; b) un anticuerpo o receptor que se fija específicamente a SLAM; o c) un ácido nucleico que codifica a SLAM o un péptido. 13. Un método para detectar en una muestra la presencia de un ácido nucleico una proteípa o un anticuerpo que comprende someter a dicha muestra a ensayo con un equipo de la reivindicación 12. 14. Un método para modular la fisiología de una célula que comprende poner en contacto dicha célula con: a) SLAM substancialmente puro o un fragmento de la reivindicación 1 ; -inmup i " 'i b) un anticuerpo o un par de adhesión que se fija específicamente a SLAM. o c) un ácido nucleico que codifica una SLAM o un péptido 15 Un método de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha célula es una célula T y dicha modulación de la fisiología es la activación de dicha célula T. 16. Un método de acuerdo con la reivindicación 14, donde dicha célula está en un tejido y/o en un organismo. 17. Un método de expresión de SLAM que comprende expresar un ácido nucleico de la reivindicación 9. 18. Una célula tejido, órgano u organismo que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 9. 19. Un ácido nucleico recombinante que comprende la secuencia de por lo menos una identidad de aproximadamente 70 % sobre una extensión de por lo menos aproximadamente 30 nucieótidos de una secuencia de ácido nucleico SLAM de la SEC ID N° : 1 , 3, 5, 7, 9, o 11. 20. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 19, que codifica además un polipéptido que comprende por lo menos aproximadamente 60% de identidad sobre una extensión de por lo menos aproximadamente 20 amino ácidos para una secuencia SLAM de SEC ID N° : 2, 4, 6, 8, 10, o 12. 21. Un método para la manufactura de una composición farmacéutica para modular una célula inmunitaha que comprende mezclar una proteína SLAM con un portador farmacéuticamente aceptable. 22. Una composición farmacéutica para modular una célula de inmunidad que comprende una proteína SLAM y un portador farmacéuticamente aceptable. 23. El uso de una proteína SLAM para modular una célula de inmunidad. 24. El uso de una proteína SLAM para la manufactura de un medicamento para modular una célula de inmunidad.