MXPA01003136A - Anticuerpos para antigeno de celulas delangerhans de mamifero y sus usos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la proteína purificada de superficie celular de DC de mamífero denominada Langerina, y anticuerpos que específicamente unen Langerina.

Description

ANTICUERPOS PARA ANTIGENO DE CÉLULAS DE LANGERHANS DE MAMÍFERO Y SUS USOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones que funcionan para controlar la fisiología, desarrollo, y diferenciación de las células de mamíferos, por ejemplo, células del sistema inmune de mamíferos. En particular, provee de anticuerpos, por ejemplo, agonistas y antagonistas, los cuales regulan la fisiología celular, desarrollo, diferenciación, o funciones de varios tipos celulares, incluyendo las células hematopoyéticas, y particularmente las células dendítricas, por ejemplo, células de Langerhans.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígenos que se requieren para la iniciación de una respuesta inmune específica. Ver, por ejemplo, Banchereau y Steinman (1998) Nature 392 : 242-52. Un tipo de DC se ejemplifica por las células de Langerhans (LC), células DC inmaduras que residen en el tejido no-linfoide, tal como la epidermis, y cuya función principal es capturar antígenos. Ver, por ejemplo, Steinman, et al. (1995) J. Exp. Med. 182 : 283-288.

La captura del antígeno se logra principalmente a través de estructuras endocíticas especializadas de la superficie membranal o a través de macropinocitosis, permitiendo así a las células de Langerhans concentrar los solutos que se encuentran presentes en grandes volúmenes de fluido. Ver, por ejemplo, Sallusto, et al. (1995) J. Exp. Med. 182:389-400. Concomitantemente con el procesamiento del antígeno en los organelos especializados de la ruta endocítica, las DC, tales como las células de Langerhans, migran al tejido linfoide secundario y llevan a cabo un número de modificaciones fenotípicas. Estos eventos de maduración finalmente se traducen en la presentación altamente eficiente del antígeno procesado, por las moléculas MHC apropiadas de las DC, a células T. En particular, el proceso de maduración de las células de Langerhans DC incluye la pérdida de receptores de adhesión tales como la E-caderina, y la desaparición de los granulos de Birbeck (BG), los cuales son característicos de LC. Contrariamente, una vez que se ha adquirido la función de presentación de antígeno, los receptores coestimulatorios tales como las moléculas CD80 y CD86 se regulan en DC para permitir la activación de las células T. Los eventos de maduración de DC pueden reconstituirse in vitro mediante TNF-a y el ligando CD40 los cuales mimetizan, respectivamente, la respuesta de las citocinas proinflamatorias que siguen al encuentro con el patógeno, y la respuesta al contacto con las células T en el tejido linfoide secundario. Ver, por ejemplo, Caux, et al. (1996) J. Exp. Med. 184:695-706.

Así, es evidente que las funciones altamente especializadas y anatómicamente localizadas de las DC se controlan mediante regulación estrecha de la expresión de un número de moléculas clave. Recientemente, los sistemas de cultivo se han vuelto accesibles para obtener grandes números de DC cuando se cultivan en presencia de citocinas. Usando dichos métodos de cultivo, las DC pueden obtenerse para estudios in vitro a partir de células progenituras hematopoyéticas CD34+ (HPC) presentes en sangre del cordón umbilical cuando las HPC se cocultivan con TNF- y GM-CSF (dichos cultivos se refieren como DC derivadas de CD34), o a partir de monocitos de sangre periférica cuando se cocultivan con GM-CSF e IL-4 (dichos cultivos se refieren como DC derivadas de monocitos). Ver, por ejemplo, Caux, et al. (1992) Nature 392:258-261 ; Chapuis, et al. (1997) Eur. J. Immunol. 27:431-441 ; Romani, et al. (1994) J.lnvest. Dermatol. 93:600-609. Estos métodos permiten ya sea, el aislamiento in vitro (ver, por ejemplo, Caux, et al. (1996).J. Exp. Med. 184:695-706), o, ex-wVo (a partir de varios órganos; ver por ejemplo, Grouard, et al. (1996) Nature 384:364-367; O'Doherty, et al. (1994) Immunol. 82:487-493; Zhou (1995) J. Immunol. 154:3821-3835) de subpoblaciones de DC fenotípicamente y funcionalmente diferentes. Consecuentemente, seria de gran beneficio poseer reactivos nuevos capaces de identificar marcadores que se expresan y asocian con subpoblaciones de DC diferentes. Esos marcadores se detectan usando anticuerpos, por ejemplo, monoclonales o policlonales. Dichos marcadores podrían permitir el monitoreo, caracterización, y/o aislamiento de subpoblaciones definidas de DCs inmaduras mediante la facilitación, por ejemplo, estudios de clasificación celular y funcionales. Así, existe la necesidad de herramientas que permitan un mejor entendimiento de las moléculas implicadas en la maduración de DC, presentación del antígeno, y los mecanismos de interacción de DC con otras moléculas, células y tejidos. La presente invención satisface estas necesidades al proveer el uso de reactivos y composiciones implicadas en la maduración y funcionamiento de DC.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de un anticuerpo que define y reconoce a un antígeno celular nuevo encontrado en células dendítricas (DC) y en células de Langerhans (LC). Este anticuerpo monoclonal se designó DCGM4 y el antígeno que reconoce ha sido designado Langerina. La invención abarca este anticuerpo y los métodos para su uso. Además, la invención está dirigida al reconocimiento de antígenos por este anticuerpo, junto con variantes de estas proteínas, por ejemplo, mutaciones (muteínas) de la secuencia natural, especies y variantes alélicas, proteínas de fusión, químicos miméticos, y otros análogos estructurales o funcionales. Se proveen también varios usos de estos anticuerpos diferentes y composiciones proteicas. La presente invención provee el anticuerpo que se une específicamente a la Langerina de mamífero. En una modalidad preferida el mamífero es un primate; o los anticuerpos son anticuerpos monoclonales, que interfieren con la unión de DCGM4 a la Langerina, o son marcados detectablemente, por ejemplo, con un marcador fluorescente o enzimático. La invención también provee métodos para detectar a la Langerina de mamífero, que comprende la unión de DCGM4 a Langerina. En varias modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo marcado o está inmovilizado a un substrato sólido; la Langerina se expresó sobre la superficie celular; la detección permite el aislamiento de una célula la cual comprende un ácido nucleico el cual expresa Langerina; o la detección además permite la purificación de Langerina. La invención también abarca un equipo para detectar a la Langerina con un compartimento que contiene a un anticuerpo. En modalidades preferidas, el equipo es un equipo de inmunoensayo fluorescente. La presente invención además provee métodos de modular una función inmune modulada por una célula que comprende el contacto de dicha célula con un anticuerpo descrito aquí. Por ejemplo, la modulación puede ser bloqueando la maduración o función de la célula DC. Aquí también se abarcan métodos para analizar una población de células DC, que comprenden la medición de la presencia de Langerina.

Típicamente, la medición es una determinación cuantitativa, por ejemplo, al medir la unión de un anticuerpo a Langerina. La invención también provee antígenos de Langerina de mamífero substancialmente puros. La Langerina humana y la Langerina de ratón se describen específicamente. La Langerina puede purificarse mediante, por ejemplo, inmunoafinidad, por ejemplo, usando un anticuerpo que se une específicamente a una Langerina de mamífero. Un anticuerpo preferido para esto es DCGM4. Junto con la Langerina de longitud total, la invención provee fragmentos que expresan un epítope inmunológico de dicha Langerina o que modulan una respuesta inmune, por ejemplo, una respuesta mediada por una célula DC, que incluye una célula Langerina+. La invención además provee ADN genómico de Langerina humana.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias aquí mencionadas se incorporan como referencia en su totalidad incluyendo todas las figuras, gráficas y dibujos.

General La presente invención provee anticuerpos que reconocen a una proteína de mamífero que exhibe propiedades características de DC significativamente funcionales que expresan moléculas. El anticuerpo se ejemplifica en una modalidad por un anticuerpo monoclonal designado DCGM4. La proteína de mamífero definida, por ejemplo, selectivamente reconocida, por el anticuerpo DCGM4 se designó Langerina. La proteína Langerina natural media varias respuestas fisiológicas que llevan a respuestas biológicas o fisiológicas en células blanco. En particular, las células DC de Langerhans son responsables de la presentación de antígenos, por ejemplo, presentación de haptenos en las reacciones de hipersensibilidad. El anticuerpo DCGM4 modula varías respuestas inmunológicas que afectan la maduración de DC y la presentación de antígeno. La Langerina es una proteína N-glucosilada de 40 kDa. La inmunoprecipitación con DCGM4 de extractos de DC y, la elución subsecuente con SDS-PAGE en amortiguador de muestra dan una banda homogénea de 40-42 kDa de masa molecular. Si el DTT se omitía durante todos los pasos de purificación, el perfil del gel no se modificaba, sugiriendo que la Langerina está presente en la membrana celular como una cadena única o como un homodímero con asociaciones no-covalentes. Los análisis bi-dimensionales confirmaron la masa molecular de la molécula e indicaron un pl de 5.2-5.5. Finalmente, la Langerina es una glucoproteína, y la mayoría de sus constituyentes carbohidratados se removieron mediante tratamiento con N-glucosilasa.

Recientemente se ha clonado un gen que codifica para Langerina humana. La secuencia nucleotídica se muestra en SEQ IDNO: 1. La secuencia de aminoácidos predicha se muestra en SEQ ID NO: 2. La proteína pronosticada es una lectina de membrana tipo II, con un dominio de reconocimiento de carbohidratos dependiente de calcio. Se encontró homología de los aminoácidos con el receptor Kupffer de ratón, rata y pollo y esto apoya las funciones de Langerina como receptor específico de las células de Langerhans para la captura de antígenos. El motivo EPN del dominio de reconocimientos de carbohidratos apoya el que las porciones de azúcar sean probablemente mañosa y glucosa. Las características identificadas que permiten a una experto en la técnica distinguir la Langerina de otras proteínas se listan debajo. • se une con especificidad al anticuerpo monoclonal DCGM4 • la forma N-glucosilada de la proteína de -40 kD, reducida o no reducida con un pl de 5.2-5.5 y que carece de enlaces disulfuro intercadena. • se expresó en subpoblaciones de células DC. • normalmente se expresó en la superficie celular de células de Langerhans. • después de la unión con DCGM4, la Langerina se transportó dentro de vesículas cubiertas endocíticas y participó en el acoplamiento de citomembrana; subsecuentemente la Langerina se asoció con los granulos de Birbeck.

Las células clonadas derivadas de la línea celular de hibridoma designadas DCGM4 a partir de la cual mAb DCGM4 se purificó han sido depositadas en American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas VA, USA, el 22 de septiembre, 1998 bajo el número de acceso de ATCC No. HB-12576. Debe entenderse que esta invención no está limitada a los métodos particulares, composiciones y anticuerpos descritos aquí, así como los métodos, composiciones y anticuerpos pueden, por supuesto variar. También debe entenderse que la terminología usada aquí es para el propósito de describir las modalidades particulares solamente, y que no pretende limitar al alcance de la presente invención el cual solamente está limitado por las reivindicaciones anexas.

II. Anticuerpos Los anticuerpos pueden generarse para varios mamíferos, por ejemplo, las proteínas de Langerina de primates y fragmentos de las mismas, tanto en sus formas nativas que ocurren naturalmente como en sus formas recombinantes, la diferencia es que los anticuerpos para la Langerina activa más probablemente reconocen epítopes que se encuentran presentes solamente en las conformaciones nativas. La detección del antígeno denaturalizado también puede ser útil en, por ejemplo, análisis de Western. Los anticuerpos Anti-idiotípicos también se contemplan, los cuales pueden ser útiles como agonistas o antagonistas de una proteína de Langerina natural o de un anticuerpo. Los anticuerpos, que incluyen fragmentos de unión y versiones de la cadena única, contra fragmentos predeterminados o del total de la proteína (por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2) pueden generarse mediante la inmunización de animales. Los anticuerpos monoclonales se preparan a partir de células que secretan el anticuerpo deseado. Estos anticuerpos pueden seleccionarse mediante su unión a las proteínas normales o defectuosas, o seleccionarse a partir de actividad agonística o antagonística. Estos anticuerpos monoclonales usualmente unirán con al menos un KD de alrededor de 1 mM, más usualmente al menos alrededor de 300 µM, típicamente al menos alrededor de 100 µM, más típicamente alrededor de 30 µM, preferiblemente al menos alrededor de 10µM, y más preferiblemente al menos alrededor de 3µM o mejor. Los anticuerpos, ejemplificados por el DCGM4, incluyendo fragmentos que se unen al antígeno, pueden tener un diagnóstico o valor terapéutico significativo. Estos pueden ser antagonistas potentes que se unan a Langerina e inhiban la interacción de unión o inhiban la capacidad de la interacción para mediar una respuesta biológica. También pueden ser útiles como anticuerpos no neutralizantes y pueden acoplarse a toxinas o radionúclidos de manera que cuando el anticuerpo se una al antígeno, una célula que lo exprese, por ejemplo, sobre su superficie, es aniquilada.

Además, este anticuerpo puede conjugarse con fármacos u otros agentes terapéuticos, ya sea directa o indirectamente mediante un enlazador, y puede efectuar el envío de fármacos. Los anticuerpos de esta invención también pueden ser útiles para aplicaciones de diagnóstico. Como anticuerpos de captura o no neutralizantes, pueden unirse a la Langerina sin inhibir las funciones de la Langerina sobre las células del sistema inmune, por ejemplo, las DC inmaduras. Como anticuerpos neutralizantes pueden ser útiles en los ensayos de unión competitiva. Estos también serán útiles en detectar o cuantificar la proteína Langerina o sus copartícipes de unión. Estos pueden usarse como reactivo para análisis de Western-blot, o para inmunoprecipitación o inmunopuríficación de la proteína Langerina. También serán útiles al evaluar las poblaciones celulares para determinar, por ejemplo, el estado fisiológico de una respuesta inmune. Los fragmentos de antígeno pueden unirse a otros materiales, particularmente polipéptidos, como polipéptidos fusionados o unidos covalentemente para usarse como inmunógenos. El antígeno puede purificarse como se describe más adelante, incluyendo los métodos de inmunoafinidad usando anticuerpos, por ejemplo, DCGM4. Un antígeno y sus fragmentos pueden fusionarse o unirse covalentemente a una variedad de acarreadores, tales como hemocianina de lapa, albúmina sérica de bovino, toxoide tetánico. Ver, por ejemplo, Microbiology, Hoeber Medical División, Harper y Row, 1969; Landsteiner (1962) Specificity of Serological Reactions, Dover Publications, New York; y Williams, et al. (1967) Methods in Inmunology and Inmunochemistry, Vol. 1 , Academic Press, New York, cada una de las cuales son incorporadas aquí como referencia, para descripciones de los métodos para la preparación de anticuerpos policlonales. Un método típico implica la hiperinmunización de un animal con el antígeno. La sangre del animal entonces se colecta poco tiempo después de que se repite la inmunización y se aislan las gamaglobulinas. En algunos casos, es deseable preparar anticuerpos monoclonales de varios hospederos mamíferos, tales como ratones, roedores, primates humanos, etc. Las descripciones de las técnicas para preparar dichos anticuerpos monoclonales pueden encontrarse, por ejemplo, en Stites, et al. (eds.) Basic and Clinical Immunology (4th ed.), Lange Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias aquí citadas Harlow y Lañe (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principies and Practice (2d ed.) Academic Press, New York; y particularmente en Kohler y Milstein (1975) en Nature 256: 495-497, el cual discute un método para generar anticuerpos monoclonales. Cada una de estas referencias están incorporadas aquí como referencias. Resumiendo brevemente, este método implica la inyección del animal con un inmunógeno. El animal entonces se sacrifica y se toman las células del bazo, las cuales entonces se fusionan con células de mieloma. El resultado es una célula híbrida o "hibridoma" que es capaz de reproducirse in vitro. Las poblaciones de hibridromas entonces se seleccionan para aislar clonas individuales, cada una de las cuales secreta una especie de anticuerpo singular al ¡nmunógeno. De esta manera, las especies de anticuerpos individuales obtenidas son los productos de células B inmortalizadas y clonadas del animal inmune generados en respuesta a los sitios específicos de reconocimiento para la sustancia ínumongénica. Otras técnicas adecuadas ¡mplicann la exposición de linfocitos a polipéptidos antigénicos o alternativamente, la selección de genotecas de anticuerpos en fagos o en vectores similares. Ver, Huse, et al. (1989) "Generation of Large Combinatorial Library of the Immunoglobulin Repertoire ¡n Phage Lambda," Science 246:1275-1281 ; y Ward, et al. (1989) Nature 341 :544-546, cada una de las cuales están incorporadas aquí como referencias. Los polipéptidos y los anticuerpos de la presente invención pueden usarse con o sin modificaciones, incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcarán mediante la unión, ya sea covalentemente o no covalentemente de una sustancia que provee una señal detectable. Una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación se conocen y se reportan extensivamente tanto en la literatura científica como en la literatura de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores, inhibidores, porciones fluorescentes, porciones quimoluminiscentes, partículas magnéticas, y similares. Las patentes que enseñan el uso de dichos marcadores incluyen las patentes de E.U.A: Nos. 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,966,345; 4,277,437; 4,275,149; y 4,366,241. También, pueden producirse inmunoglobulinas recombinantes, ver Cabilly, patente de E.U.A. no. 4,816,567; o pueden hacerse en ratones transgénicos, ver Méndez, et al. (1997) Nature Genetics 15:146-156. Estas patentes se incorporan aquí como referencias. Los anticuerpos de esta invención también pueden usarse para cromatografía de afinidad para aislar a la proteína. Las columnas pueden prepararse en donde el anticuerpo esté unido a un soporte sólido, por ejemplo, partículas tales como agarosa, Sefadex, o similares, en donde un lisado celular puede pasarse a través de la columna, la columna se lava, seguida de concentraciones increméntales de un desnaturalizante suave, en donde la proteína Langerina purificada será liberada. Alternativamente, el anticuerpo puede usarse para cuantificar e identificar muestras fraccionadas que contienen al antígeno. Los procedimientos de purificación de proteínas estándar, por ejemplo, cromatografía, serán usados para enriquecer y purificar la proteína Langerina con, por ejemplo, ensayos de ELISA para identificar las fracciones en donde la Langerina se separa. Las proteínas purificadas serán secuenciadas. Las secuencia permitirá la selección de secuencias de oligonucleótidos útiles como iniciadores o sondas. Alternativamente, las secuencias permiten la producción de segmentos de polipéptidos para hacer anticuerpos adicionales. Además, las proteínas purificadas pueden usarse para inmunización, permitiendo la producción de anticuerpos policlonales o monoclonales.

Los anticuerpos también pueden usarse para seleccionar genotecas de expresión para productos de expresión particular. Usualmente los anticuerpos usados en dichos procedimientos se marcarán con una sección que permita la fácil detección de la presencia del antígeno mediante unión con anticuerpos. Esto permitirá el aislamiento de una célula que exprese un ácido nucleico, por ejemplo, un vector, que codifica para el antígeno mediante, por ejemplo, el análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y el enriquecimiento. Alternativamente, un método de afinidad que usa anticuerpos de esta invención puede emplearse para inmovilizar y separar células que expresan a la Langerina, por ejemplo, codificada en un vector. Los anticuerpos generados contra cada proteína de Langerina también serán útiles para generar anticuerpos antiidiotípicos. Estos serán útiles para detectar o diagnosticar varias condiciones inmunológicas relacionadas a la expresión de los antígenos respectivos.

III. Proteína Lanqerina purificada La proteína Langerina humana puede aislarse de fuentes naturales usando técnicas de purificación bioquímica estándar y/o mediante el uso de anticuerpos para determinar la presencia del antígeno en procedimientos particulares de fraccionamiento. Las proteínas purificadas permiten tanto la determinación de la secuencia como la preparación de péptidos para generar otros anticuerpos para reconocer a dichos segmentos.

Como se usa aquí, la Langerina debe abarcar, cuando se usa en un contexto proteico, una proteína la cual, en un estado natural, exhibe las propiedades listadas anteriormente, o un fragmento significativo de dicha proteína, Por ejemplo, una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 2 o una subsecuencia de la misma. También se refiere a un polipéptido de mamífero, por ejemplo, polipéptido derivado de primate que exhibe funciones químicas similares o interactúa con componentes de unión específicos de la proteína Langerina. Estos componentes de unión, por ejemplo, anticuerpos, típicamente se unen con alta afinidad a la proteína Langerina, por ejemplo, al menos alrededor de 100 nM, usualmente mejor que alrededor de 30 nM, preferiblemente mejor que alrededor de 10 nM, y más preferiblemente mejor que alrededor de 3 nM. Uno de dichos componentes de unión preferidos es el anticuerpo DCGM4. La proteína purificada o fragmento del péptido son útiles para generar anticuerpos mediante métodos estándares, como se describe más adelante. Los péptidos sintéticos o proteínas purificadas puede presentarse en el sistema inmune para generar una composición de unión específica, por ejemplo, anticuerpos monoclonales o policlonales. Ver, por ejemplo, Coligan (1991 ) Current Protocols in Immunology Wiley/green; y Harlow y Lañe (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Press. El término polipéptido, como se usó aquí, incluye un fragmento significativo o segmento y abarca un grupo de residuos de aminoácidos de al menos alrededor de 8 aminoácidos, generalmente de al menos de 10 aminoácidos, más generalmente de al menos de 12 aminoácidos, frecuentemente de al menos de 14 aminoácidos, más frecuentemente de al menos de 16 aminoácidos, típicamente de al menos de 18 aminoácidos, más típicamente de al menos de 20 aminoácidos, usualmente de al menos de 22 aminoácidos, más usualmente de al menos de 24 aminoácidos preferiblemente de al menos de 26 aminoácidos, más preferiblemente de al menos de 28 aminoácidos, y, en modalidades particularmente preferidas, de al menos de 30 ó más aminoácidos. Preferiblemente, el fragmento exhibe una propiedad biológica en común con la Langerina de longitud total, por ejemplo, actividad inmunológica, que incluye compartir un epítope. Sustancialmente puro, en el contexto de polipéptidos, significa típicamente que la proteína esta libre de otras proteínas contaminantes, ácidos nucleicos, y otros derivados biológicos del organismo de la fuente original. La pureza puede ensayarse mediante métodos estándar, y ordinariamente será de al menos de alrededor de 40% de pureza, más ordinariamente de al menos de alrededor de 50% de pureza, generalmente de al menos de alrededor de 60%, más generalmente de al menos de 70% de pureza, frecuentemente de al menos de alrededor de 70% de pureza, más frecuentemente de al menos de alrededor de 80% de pureza, típicamente de al menos de alrededor de 85% de pureza, más típicamente de al menos de alrededor de 90% de pureza, preferiblemente de al menos de alrededor de 95% de pureza, más preferiblemente de al menos de alrededor de 98% de pureza, y en la mayoría de las modalidades preferidas de al menos de alrededor de 99% de pureza. Los análisis puede evaluarse en peso o porcentajes molares, por ejemplo, mediante tinción de gel, espectrofotometría, o marcado terminal. Una composición de unión o agente se refiere a las moléculas que se unen con especificidad a la proteína Langerina, por ejemplo, de una manera del tipo ligando-receptor, una interacción anticuerpo-antígeno o compuestos, por ejemplo, proteínas las cuales específicamente se asocian con la proteína Langerina, por ejemplo, en una interacción natural proteína-proteína fisiológicamente relevante, ya sea covalente o no covalente. La molécula puede ser un polímero, o un reactivo químico. Esto implica tanto una afinidad en la unión y una especificidad de la unión o selectividad. Un análogo funcional puede ser una proteína con modificaciones estructurales o puede ser una molécula no relacionada completamente, por ejemplo, la cual tiene una forma molecular que interactúa con los determinantes de unión apropiados. Las proteínas pueden servir como agonistas o antagonistas de un receptor, ver, por ejemplo, Goodman, et al. (eds. 1990) Goodman & Gilman's The Pharmacological Bases of Therapeutics (8 th ed.) Pergamon Press, Tarrytown, N.Y. Los fragmentos solubles tanto de los anticuerpos como de los antígenos de Langerina se proveen por la invención. La solubilidad de un polipéptido o de un fragmento depende del medio ambiente y del polipéptido. Muchos parámetros afectan la solubilidad del polipéptido, incluyendo la temperatura, medio ambiente electrolítico, tamaño y características moleculares del polipéptido, y naturaleza del solvente. Típicamente, la temperatura a la cual se usa el polipéptido tiene un rango de entre 4°C a alrededor de 65°C. Usualmente la temperatura de uso es mayor que alrededor de 18°C y más usualmente es mayor que alrededor de 22°C. Para propósitos del diagnostico, la temperatura usualmente será la de la temperatura ambiente o más caliente, pero menor a la temperatura de desnaturalización de los componentes del ensayo. Para propósitos terapéuticos, la temperatura usualmente será la temperatura corporal, típicamente alrededor de 37°C para los humanos, aunque bajo ciertas situaciones la temperatura puede incrementarse o disminuirse in situ o in vitro. Los electrolitos usualmente se aproximaran a las condiciones fisiológicas in situ, pero pueden modificarse a fuerza iónicas mayores o menores cuando sea ventajoso. Los iones actuales pueden modificarse, por ejemplo, para conformar los amortiguadores estándar usados en los contextos fisiológicos o analíticos. El tamaño y la estructura del polipéptido debe estar generalmente en un estado sustancialmente estable, y usualmente no en un estado desnaturalizado. El polipéptido puede estar asociado con otros polipéptidos en una estructura cuaternaria, por ejemplo, para conferir solubilidad, o asociada con lípidos o detergentes de una manera que se aproxima a las interacciones de lípidos en bícapas naturales. El solvente usualmente será un amortiguador biológicamente compatible, del tipo usado para preservación de las actividades biológicas, y usualmente se aproximará a los solventes fisiológicos. Usualmente el solvente tendrá un pH neutral, típicamente entre alrededor de 5 y 10, y preferiblemente alrededor de 7.5. En algunas ocasiones, se añadirá un detergente, típicamente uno suave no desnaturalizante, por ejemplo, CHS o CHAPS, o en una concentración suficientemente baja para evitar alteraciones significativas de las propiedades estructurales o fisiológicas del antígeno. La solubilidad se refleja mediante las medidas de sedimentación en unidades Svedberg, que son una medida para la velocidad de sedimentación de una molécula bajo condiciones particulares. La determinación de la velocidad de sedimentación fue clásicamente llevada a cabo en ultracentrífugas analíticas, pero típicamente ahora se lleva a cabo en ultracentrífugas estándar. Ver, Freifelder (1982) Physical Biochemistry (2d ed.), W.H. Freeman; y Cantor y Schimmel (1980) Biophysical Chemistry, partes 1-3, W.H. Freeman & Co., San Francisco; cada una de las cuales esta aquí incorporada como referencia. Como determinación burda, una muestra que contiene un polipéptido soluble putativo se centrifuga en una ultracentrífuga estándar alrededor de 50k rpm durante aproximadamente 10 minutos, y las moléculas solubles permanecerán en el sobrenadante. Una partícula soluble o polipéptido típicamente será menor que alrededor de 30S, más típicamente menor que alrededor de 15S, usualmente menor que alrededor de 10S, más usualmente menor que alrededor de 6S, y, en modalidades particulares, preferiblemente menor que alrededor de 4S, y más preferiblemente menor que alrededor de 3S.

Una proteína Langerina que específicamente se una a o que sea inmunoreactiva específicamente con un anticuerpo generado contra un ¡nmunógeno definido, tal como un inmunógeno que consiste de la proteína Langerina de la invención típicamente se determina en un inmunoensayo. El inmunoensayo típicamente usa antisuero policlonal el cual fue crecido, por ejemplo, para una proteína Langerina de la invención. Este antisuero se selecciona por tener una baja reactividad cruzada contra otros miembros potenciales de la familia de Langerina, por ejemplo, variantes alélicas de proteínas de Langerina preferiblemente de la misma especie, y cualquier reactividad cruzada tal se remueve mediante inmunoabsorción antes de usarse en el inmunoensayo. Para producir un antisuero para utilizarlo en un inmunoensayo, la proteína Langerina de la invención se aisló como se describe aquí. Por ejemplo, después de determinar la secuencia de ácido nucleico de Langerina usando los métodos descritos aquí, una proteína recombinante puede producirse en una línea celular de mamífero. Un hospedero apropiado, por ejemplo, una cepa no mezclada de ratones tales como Balb/c, se inmunizan con la proteína seleccionada, típicamente usando un adyuvante estándar, tal como el adyuvante de Freund, y un protocolo estándar de inmunización de ratones (ver Harlow y Lañe, mencionado anteriormente). Alternativamente, un péptido sintético derivado de la secuencia de ácido nucleico de Langerina puede conjugarse con una proteína acarreadora y usarse subsecuentemente como inmunógeno. El suero policlonal se colecta y se titula contra la proteína inmunogénica como un inmunoensayo, por ejemplo, un inmunoensayo en fase sólida con el inmunógeno inmovilizado en un soporte sólido. El antisuero policlonal con un título de 104 o mayor se selecciona y se prueba para su reactividad cruzada contra otras variantes de Langerina por ejemplo, variantes alélicas de Langerina, usando un inmunoensayo de unión competitiva tal como el descrito en Harlow y Lañe, anteriormente mencionado, en las páginas 570-573. Preferiblemente al menos dos variantes de Langerina se usan en esta determinación. Estos miembros de la familia de Langerina pueden producirse como proteínas recombinantes y aislarse usando técnicas estándar de biología molecular y de química de proteínas como se describe aquí. Los ¡nmunoensayos en el formato de la unión competitiva pueden usarse para las determinaciones de reactividad cruzada. Por ejemplo, la proteína Langerina de la invención puede inmovilizarse en un soporte sólido. Las proteínas añadidas al ensayo compiten con la unión al antisuero para los antígenos inmovilizados. La capacidad de las proteínas anteriores para competir con la unión del antisuero de las proteínas inmovilizadas se comparó con las proteínas Langerinas. El porcentaje de reactividad cruzada para las proteínas anteriores se calculó, usando cálculos estándar. Aquellos antisueros con menos de 10% de reactividad cruzada para cada una de las proteínas listadas anteriormente se seleccionaron y se muestrearon. Los anticuerpos que reaccionaron de manera cruzada se removieron del antisuero agrupado mediante ¡nmunoabsorción con las proteínas listadas anteriormente.

Los antisueros inmunoabsorbidos y agrupados fueron usados entonces en inmunoensayos de unión competitiva como se describió anteriormente para comparar una segunda proteína Langerina con la proteína inmunogénica (por ejemplo, variantes alélicas de Langerina). Para hacer esta comparación, las dos proteínas se ensayaron en un amplio rango de concentraciones y se determinó la cantidad de cada proteína requerida para inhibir el 50% de la unión de estos antisueros a la proteína inmovilizada. Si la cantidad de la proteína secundaria requerida era menor que dos veces la cantidad de la proteína de las proteínas seleccionadas o proteínas que se requiere, entonces la segunda proteína se dice que se une específicamente a un anticuerpo generado para el ¡nmunógeno. Se entiende que la proteína Langerina de la invención no es solamente la proteína caracterizada aquí, sino también otras proteínas Langerinas que son alélicas, no alélicas, o especies variante. Se entiende también que los términos incluyen mutaciones no naturales introducidas por mutación deliberada usando tecnología recombinante convencional tal como la mutación de sitio único, o mediante extirpación de secciones cortas de ADN que codifican para las proteínas respectivas, o mediante la substitución de aminoácidos nuevos, o añadiendo aminoácidos nuevos a la secuencia de Langerina. Dichas alteraciones típicamente menores mantendrán sustancialmente la inmunoidentidad de la molécula original y/o su actividad biológica. Así, estas alteraciones incluyen proteínas que son específicamente inmunoreactivas con una proteína Langerina designada que ocurre naturalmente. Las propiedades biológicas de las proteínas alteradas pueden determinarse mediante expresión de la proteína en una línea celular apropiada y midiendo el efecto apropiado, por ejemplo, de las células DC in vitro. Las modificaciones a las proteínas particulares consideradas menores incluyen sustitución conservativa de aminoácidos con propiedades químicas similares. Mediante la alineación de una proteína óptimamente con las proteínas de Langerinas y mediante el uso convencional de inmunoensayos como los descritos aquí para determinar la inmunoidentidad, uno puede determinar las composiciones de la proteína de la invención.

IV. Variantes físicas Esta invención también abarca las proteínas o péptidos que tienen homología substancial en las secuencias de aminoácidos con una proteína Langerina natural de mamífero o con un anticuerpo descrito anteriormente. Las variantes incluyen especies y variantes alélicas. Una persona que tiene experiencia en la técnica reconocerá que mucha de la discusión que sigue de las variantes se aplicará a las variantes tanto de los antígenos de Langerina como de los anticuerpos que lo reconocen. La homología de la secuencia de aminoácidos, o identidad de secuencia, se determinó mediante acoplamiento de residuos óptimos, si es necesario, introduciendo separaciones como se requirieron. Esto cambia cuando se consideran sustituciones conservativas como acoplamientos. Las sustituciones conservativas típicamente incluyen las sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. Las secuencias de aminoácidos homólogos pretende que típicamente se incluyan a las variaciones interespecies y alélicas naturales en cada secuencia de proteína respectiva. Las proteínas o péptidos homólogos típicos tendrán de 25-100% de homología (si las separaciones pueden introducirse), a 50-100% de homología (si las sustituciones conservativas se incluyen) con la secuencia de aminoácidos de la proteína de Langerina. Las mediciones de la homología serán al menos de alrededor de 35%, generalmente de al menos de 40%, más generalmente de al menos de 45%, frecuentemente de al menos de 50%, más frecuentemente de al menos de 55%, típicamente de al menos de 60%, más típicamente de al menos de 65%, usualmente de al menos de 70%, más usualmente de al menos de 75%, preferiblemente de al menos de 80%, y más preferiblemente de al menos de 80%, y en algunas modalidades particularmente preferidas, de al menos de 85% o más. Ver también Needleham, et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; Sankoff, et al. (1983) Capítulo Uno en Time Warps, Strinq Edits. y Macromolecules: The Theory and Practice of Sequence Comparison Addison-Wesley, Reading, MA; y paquetes de software de IntelliGenetics, Mountain View, CA; y the University of Wisconsin Genetics Computer Group, Madison, WT; cada uno de los cuales está incorporado aquí como referencia. Un ADN aislado, aislado como se describe posteriormente, que codifica para la proteína Langerina puede modificarse fácilmente mediante sustituciones nucleotídicas, deleciones nucleotídicas, inserciones nucleotídicas e inversiones de grupos de nucleótidos. Estas modificaciones resultan en una nueva secuencia de ADN que codifica para estos antígenos, sus derivados, o proteínas que tienen actividades fisiológicas, inmunogénicas, o antigénicas similares. Estas secuencias modificadas pueden usarse para producir antígenos mutantes o para mejorar la expresión. La expresión mejorada puede implicar amplificación génica, aumento en la transcripción, aumento en la traducción, y otros mecanismos. Dichos derivados de la proteína Langerina muíante incluyen mutaciones predeterminadas o sitio-específicas de la proteína respectiva o de sus fragmentos. La "proteína Langerina muíante" abarca a un polipéptido que de otra manera cae dentro de la definición de homología de la proteína de Langerina humana como se explicó anteriormente, pero que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la de la proteína de Langerina como se encuentra en la naturaleza, ya sea por el modo de deleción, sustitución, o inserción. En particular, "la proteína Langerina mutante sitio específico" generalmente incluye proteínas que lienen homología significativa con una proteína natural con propiedades que se describen aquí, y/o que comparten varias actividades biológicas, por ejemplo, antigénicas o inmunogénicas, con aquellas secuencias, y en algunas modalidades preferidas incluye, por ejemplo, formas naturales particularmente substiíuidas de las proíeínas. Se aplican conceptos similares a las distintas proteínas de Langerina, particularmente aquellas encontradas en varios mamíferos, por ejemplo, primates, incluyendo al humano. Como se estableció anteriormente, se hace énfasis en que las descripciones significan generalmente que abarcan a todas las proteínas Langerina de mamíferos. Aunque las mutaciones sitio específicas son predeterminadas, los mutantes no necesitan ser sitio específicas. La mutagénesis de la proteína de Langerina puede conducirse al hacer inserciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones, deleciones, inserciones, o cualquier combinación pueden generarse hasta alcanzar una construcción final. Las inserciones incluyen fusiones de amino- o carboxi- terminales. La mutagénesis al azar puede conducirse con un codón blanco y las mutantes expresadas pueden seleccionarse entonces por su actividad deseada. Los métodos para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en el ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas en el campo, por ejemplo, mediante mutagenésis con el iniciador M13 o con técnicas de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Ver también Sambrook, et al. (1989) y Ausubel, et al. (1987 y suplementos). Las mutaciones en el ADN normalmente no deberían de colocar a las secuencias codificantes fuera del marco de lectura y preferiblemente no deberán de crear regiones complementarias que podrían hibridar para producir estructuras de ARNm tales como las asas o rizos. La presente invención también provee de proteínas recombinantes, por ejemplo, proteínas de fusión heterólogas que usan segmentos de estas proteínas. Una proteína de fusión heteróloga es una fusión de proteína o segmento que normalmente no están fusionados de la misma manera. Así, el producto de fusión de una inmunoglobulina con un polipéptido de Langerina es una molécula proteica continua que tiene una secuencias fusionadas a un péptido característico eslabonado, típicamente construido como un producto de traducción individual y que exhibe propiedades derivadas de cada péptído fuente. Un concepto similar se aplica a las secuencias de ácido nucleico heterólogo. Además, las construcciones nuevas pueden hacerse a partir de dominios funcionales similares que se combinan de otras proteínas. Por ejemplo, los antígenos de unión u otros segmentos pueden "intercambiarse" entre diferentes polipéptidos de fusión nuevos o fragmentos. Ver, por ejemplo, Cunningham, et al. (1989) Science 243:1330-1339; y O'Dowd, et al. (1988) ¡ Biol. Chem. 263:15985-15992, cada uno de !os cuales esta incorporado aquí como referencia. Así, los nuevos polipéptidos quiméricos exhiben nuevas combinaciones de especifidades que resultaran de las uniones funcionales de los dominios biológicamente relevantes y de otros dominios funcionales. Los métodos de fosforamidita descritos por Beaucage y Carruthers (1981 ) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirán fragmentos de ADN sintéticos adecuados. Un fragmento de doble hebra frecuentemente se obtendrá ya sea mediante la síntesis de la hebra complementaria y el acoplamiento de la hebra bajo condiciones apropiadas o mediante la adición de la hebra complementaria usando ADN polimerasa con una secuencia iniciadora apropiada, por ejemplo, técnicas de PCR.

V. Variantes funcionales El bloqueo de la respuesta fisiológica mediada por las proteínas Langerina puede resultar a partir de la inhibición de la unión del antígeno a su pareja de unión natural, por ejemplo, a través de inhibición competitiva. Así, los ensayos in vitro de la presente invención frecuentemente usarán proteínas aisladas, membranas de la célula que expresan la proteína Langerina asociada a la membrana, fragmentos solubles que comprenden los segmentos de unión, o los fragmentos anclados a los substratos de fase sólida. Estos ensayos también permitirán la determinación diagnóstica de los efectos de ya sea las mutaciones y modificaciones de los segmentos de unión, como mutaciones y modificaciones de las proteínas, por ejemplo, análogos. En particular, la Langerina se expresó en las clonas DC, pero el antígeno se perdió después de la maduración de las células DC. Esta invención también contempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos, por ejemplo, en donde los anticuerpos que neutralizan al antígeno o a fragmentos de la pareja de unión compiten con un compuesto prueba para la unión de la proteína. De esta manera, los anticuerpos pueden usarse para detectar la presencia de cualquier polipéptido que comparta uno o más sitios de unión antigénicos de la proteína y pueden usarse también para ocupar sitios de unión en la proteína que podrían ¡nteractuar de otra manera con un elemento de unión. Además, los anticuerpos que neutralizan contra la proteína Langerina y de los fragmentos solubles del antígeno el cual contiene un sitio de unión de alta afinidad, pueden usarse para inhibir la función del antígeno en las células o tejidos, por ejemplo, células o tejidos que experimentan fisiología anormal o no deseada. Los "derivados" de los antígenos de Langerina, y de anticuerpos, incluyen mutantes de la secuencia de aminoácidos, variantes de glucosilación, y conjugados agregados o covalentes con otras porciones químicas. Los derivados covalentes pueden prepararse mediante la unión de funcionalidades a grupos que se encuentran en las cadena laterales de los aminoácidos de Langerina o en el N- o C-terminal, mediante métodos que son bien conocidos en el campo. Estos derivados pueden incluir, sin limitación, esteres alifáticos o amidas del carboxilo terminal, o cadenas laterales de residuos que contengan carboxilo, derivados O-acilo de residuos que contengan al grupo hidroxilo, y derivados N-acilo de los aminoácidos amino terminales o residuos que contienen al grupo amino, por ejemplo, lisina o arginina. Los grupos acilo se seleccionan del grupo con porciones alquilo que incluyen al alquilo C3 a C18 normal, con lo cual forma las especies aroilalcanoilo. El anclaje covalente a proteínas acarreadoras puede ser importante cuando las porciones inmunogénicas son haptenos. En particular, se incluyen las alteraciones a la glucosilación, por ejemplo, hechas mediante modificación de los patrones de glucosilación de un polipéptido durante su síntesis y procesamiento, o en pasos de procesamiento posteriores. Los medios particularmente preferidos para lograr esto son mediante la exposición del polipéptido a enzimas de glucosilación derivadas de células que normalmente proveen dicho proceso, por ejemplo, enzimas de glucosilación de mamífero. Las enzimas de deglucosilación también se contemplan. También se abarcan versiones de la misma secuencia primaria de aminoácidos la cual tiene otras modificaciones menores; incluyendo la fosforilación de residuos de aminoácidos, por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina o fosfotreonina. Un grupo principal de derivados son los conjugados covalentes de la proteína Langerina o fragmentos de la misma con otras proteínas o polipéptidos. Estos derivados pueden sintetizarse en cultivos recombinantes tales como en fusiones de N- o C- terminales o mediante el uso de agentes conocidos en el campo por su utilidad en el entrecruzamiento de proteínas a través de grupos laterales reactivos. Los sitios preferidos de derivatización de antígenos con agentes de entrecruzamiento están en grupos amino libres, porciones de carbohidratos, y residuos de cisteína. También se proveen los polipéptidos de fusión entre las proteínas Langerinas y otras proteínas homologas o heterólogas. Los polipéptidos homólogos pueden fusionarse entre diferentes marcadores de superficie resultando en, por ejemplo, una proteína híbrida que exhibe especificidad de unión al receptor. Similarmente, las fusiones heterólogas pueden construirse las cuales exhibirían una combinación de propiedades o actividades de las proteínas derivadas. Los ejemplos típicos son fusiones de un polipéptido reportero, por ejemplo, luciferasa, con un segmento o dominio de aminoácidos del antígeno, por ejemplo, un segmento de unión, de manera que se puede determinar fácilmente la presencia o localización del antígeno fusionado. Ver, por ejemplo, Dull, et al. patente de E.U.A. No. 4,857,609, la cual esta incorporada aquí como referencia. Otros patrones de genes de fusión incluyen a la ß-galactosidasa bacteriana, trpE, proteína A, ß-lactamasa, alfa amilasa, alcohol deshidrogenasa, y el factor de apareamiento alfa de levaduras. Ver, por ejemplo, Godowski, et al. (1988) Science 241 :812-816. El método de fosforamidita descrito por Beaucage y Carruthers (1981 ) Tetra. Letts. 22:1859-1862, producirá fragmentos de ADN sintético adecuados. Frecuentemente se obtendrá un fragmento de doble hebra ya sea por la síntesis de la hebra complementaria y la fijación de las hebras a un tiempo bajo condiciones apropiadas o mediante la adición de la hebra complementaria usando la ADN polimerasa con una secuencia de iniciador adecuada. Dichos polipéptidos también pueden tener residuos de aminoácidos que han sido modificados químicamente mediante fosforilación, sulfonación, biotinilación, o la adición o remoción de otras porciones, particularmente aquellas que tienen formas moleculares similares al grupo fosfato. En algunas modalidades, las modificaciones, serán útiles como reactivos de marcado, o servirán como blancos de purificación, por ejemplo, lígandos de afinidad. Las proteínas de fusión típicamente se realizarán mediante métodos de ácidos nucleicos recombinantes o mediante métodos de síntesis de polipéptidos. Las técnicas para la manipulación de ácidos nucleicos y su expresión se describen generalmente, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cur. Ed.), Volúmenes 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, el cual es incorporado aquí como referencia. Las técnicas para las síntesis de polipéptidos se describen, por ejemplo, en Merrifield (1963) J. Amer. Chem. Soc. 85:2149-2156; Merrifield (1986) Science 232: 341-347; y Atherton, et al. (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; y Dawson, et al. (1994) Science 266:776-779, cada una de las cuales esta incorporada aquí como referencia. Esta invención también contempla el uso de derivados de las proteínas Langerina diferentes a las variaciones en las secuencias de aminoácidos o en la glucosilación. Dichos derivados pueden implicar asociaciones covalentes o agregativas con porciones químicas. Estos derivados generalmente caen en tres clases: (1 ) sales, (2) cadenas laterales y terminales de los residuos con modificaciones covalentes, y (3) complejos de adsorción, por ejemplo con membranas celulares. Dichos derivados covalentes o agregativos son útiles como inmunógenos, como reactivos en inmunoensayos, o en métodos de purificación tales como la purificación por afinidad de antígenos o de otras proteínas de unión. Por ejemplo, un antígeno de Langerina puede inmovilizarse mediante uniones covalentes a un soporte sólido tal como la sefarosa activada con bromuro de cianógeno mediante métodos que son bien conocidos en el campo, o adsorberse sobre superficies de poliolefinas, con o sin entrecruzamiento de glutaraldehído, para utilizarlo en el ensayo o para la purificación de anticuerpos antiproteínas Langerinas u otros elementos de unión. Los antígenos de Langerina también pueden marcarse con un grupo detectable, por ejemplo radioiodinado mediante el procesamiento de cloramina T, unida covalentemente a quelatos de tierras raras, o conjugado con otra porción fluorescente para su uso en ensayos diagnósticos. La purificación de la proteína Langerina puede efectuarse mediante anticuerpos inmovilizados o elementos de unión. Un antígeno o fragmento de antígeno de Langerina solubilizado de esta invención puede usarse para la producción de antisuero o de anticuerpos específicos para la proteína o para fragmentos de la misma. El antígeno purificado puede usarse para seleccionar anticuerpos monoclonales ¿^ fragmentos de unión preparados mediante inmunización con varias formas de preparación impura que contiene la proteína. En particular, los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos naturales frecuentemente son equivalentes a los anticuerpos mismos. La proteína Langerina purificada puede usarse también como reactivo para detectar cualquier anticuerpo generado en respuesta a la presencia de niveles elevados de la proteína o de fragmentos celulares que contienen al antígeno, ambos pueden diagnosticarse de una condición anormal o de condiciones de enfermedad o fisiológicas especificas. Adicionalmente los fragmentos de antígeno también pueden servir como inmunógenos para producir otros anticuerpos a la presente invención, como se describe inmediatamente a continuación. Por ejemplo, esta invención contempla los anticuerpos crecidos contra secuencias de aminoácidos para las proteínas que tienen las propiedades descritas en el cuadro 1 , o fragmentos de éstas. En particular, esta invención contempla los anticuerpos que han tenido afinidad de unión o que han sido crecidos contra fragmentos específicos los cuales se pronostica que quedan fuera de la bicapa lipídica, por ejemplo, ya sea extracelularmente o en las estructuras de dominios ¡ntracelulares. La invención también provee los medios para aislar a un grupo de antígenos relacionados que exhiben tanto distinciones como similitudes en su estructura, expresión y función. La elucidación de muchos de los efectos fisiológicos de los antígenos se acelerará ampliamente por el aislamiento y caracterización de distintas especies variantes. En particular, la presente invención provee de sondas útiles para identificar las entidades genéticas homologas adicionales en diferentes especies. Los genes aislados permitirán la transformación de células que carecen de la expresión de la proteína Langerina correspondiente, por ejemplo, ya sea en tipos de especies o células las cuales carecen de los antígenos correspondientes y muestran una actividad biológica de fondo negativa. La expresión de los genes transformados permitirá el aislamiento de líneas celulares puras antigénicamente con variantes de especie definidas o únicas. Este método permitirá la detección y discriminación más sensible de los efectos fisiológicos de la proteína Langerina. Los fragmentos subcelulares también pueden aislarse y usarse, por ejemplo, citoplastos o fragmentos de membrana.

La disección de los elementos estructurales críticos que afectan varias funciones fisiológicas o de diferenciación provistas por las proteínas es posible usando las técnicas estándar de biología molecular moderna, particularmente en comparación con los miembros de las clases relacionadas. Ver, por ejemplo, la técnica de mutagénesis de búsqueda homologa descrita en Cunningham, et al. (1989) Science 243:1339-1336; y los métodos usados en O'Dowd, et al. (1988) J.Biol. Chem. 263:15985-15992; y Lechleiter, et al. (1990) EMBO J. 9:4381-4390; cada una de las cuales esta incorporada aquí como referencia. En particular, los dominios o segmentos funcionales pueden sustituirse entre las variantes de especies o proteínas relacionadas para determinar qué características estructurales son importantes tanto en la afinidad y especificidad de unión a la pareja, como en la transducción de la señal. Un arreglo de diferentes variantes será útil para seleccionar las moléculas que exhiben propiedades de interacción combinadas con variantes de especies diferentes de parejas de unión. La internalización del antígeno puede ocurrir bajo ciertas circunstancias, y puede ocurrir la interacción entre componentes intracelulares y segmentos de proteínas "extracelulares" implicados en las interacciones. Los segmentos específicos de interacción de Langerina con otros componentes intracelulares pueden identificarse mediante mutagénesis o métodos bioquímicos directos, por ejemplo, entrecruzamiento o métodos de afinidad. También serán aplicables los análisis estructurales mediante métodos cristalográficos u otros métodos físicos. Además la investigación de los mecanismos de función biológica incluirá el estudio de componentes asociados que pueden aislarse mediante métodos de afinidad o mediante métodos genéticos, por ejemplo, análisis de complementación de los mutantes. Se realizarán estudios adicionales sobre la expresión y el control de la Langerina. Los elementos controladores asociados con los antígenos pueden exhibir desarrollo diferencial, especificidad del tejido, u otros patrones de expresión. Son de interés las regiones genéticas hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3', por ejemplo, elementos de control. Los estudios estructurales de los antígenos llevarán a diseñar nuevas variantes, particularmente análogos que exhiban propiedades agonistas o antagonistas sobre elementos de unión. Esto se puede combinar con métodos de selección previamente descritos para aislar variantes que exhiban el espectro deseado de actividades. Las expresiones en otros tipos celulares frecuentemente resultan en diferencias en glucosilación en un antígeno particular. Varias especies variantes pueden exhibir funciones distintas basándose en las diferencias estructurales además de las secuencias de aminoácidos. Las modificaciones diferenciales pueden ser responsables para la función diferencial, y actualmente es posible la elucidación de los efectos. Así, la presente invención provee de reactivos importantes relacionados con las interacciones de elementos de unión al antígeno. Aunque la descripción que a continuación se presenta se ha enfocado principalmente sobre la proteína humana Langerina, aquellos expertos en el área inmediatamente reconocerán que la invención abarca otros antígenos cercanamente relacionados, por ejemplo, otras especies de primates o variante alélicas, así como variantes y otros miembros de la familia.

VI. Ácidos nucleicos Las propiedades de la proteína natural Langerina que se describió aquí permiten la purificación de la proteína. Estos proveen medios para aislar los ácidos nucleicos que codifican para dichas proteínas, y la determinación de la secuencia provee una manera de manejar a otros miembros de la familia Langerina. Dichas secuencias de nucleótidos y reactivos relacionados son útiles en la construcción de una clona de ADN útil para la expresión de la proteína Langerina, o, por ejemplo, el aislamiento de un gen homólogo a partir de otra fuente natural, incluyendo otros miembros de la familia. Típicamente, las secuencias serán útiles para aislar otros genes, por ejemplo, variantes alélicas o isoformas alternativamente procesadas, a partir del humano. Por ejemplo, una composición de unión específica tal como el DCGM4 podría usarse para seleccionar una genoteca de expresión hecha a partir de una línea celular la cual expresa una proteína Langerina. La selección puede ser la tinción estándar de la proteína expresada en la superficie, o mediante separación. La selección de la expresión intracelular también puede llevarse a cabo mediante varias tinciones o procedimientos de inmunofluorescencia. Las composiciones de unión podrían usarse para purificación por afinidad o clasificación de las células que expresan la proteína Langerina. Esta invención contempla el uso de ADN aislado o fragmentos para codificar una proteína Langerina biológicamente activa o un polipéptido de Langerina. Una secuencia nucleotídica que codifica para Langerina humana se muestra en SEQ ID NO: 1. Además, esta invención abarca el ADN aislado o recombinante el cual codifica para una proteína de Langerina biológicamente activa o polipéptido de Langerina el cual es capaz de hibridar bajo condiciones apropiadas con las secuencias de ADN. Dicha proteína Langerina biológicamente activa o polipéptido de Langerina puede ser un antígeno de longitud total, o un fragmento del mismo. Además, esta invención abarca el uso de ADN aislado o recombinante, o fragmentos del mismo, el cual codifica para proteínas las cuales son homologas a la proteína Langerina o las cuales fueron aisladas usando ADNc como sonda que codifica para una proteína de Langerina. El ADN aislado puede tener las secuencias regulatorias respectivas en los extremos 5' y 3', por ejemplo, promotores, mejoradores, señales de adición poly-A, y otras. Una ácido nucleico "aislado" es un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN, ADN, o un polímero mezclado, el cual se separa sustancialmente de otros componentes los cuales acompañan naturalmente a una secuencia nativa, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, y secuencias genómicas flanqueantes de las especies originales. El término ácido nucleico "aislado" abarca una secuencia de ácido nucleico la cual ha sido removida de su medio ambiente en el que naturalmente se encuentra, y también incluye a ADN aislado o clonado y análogos químicamente sintetizados o análogos biológicamente sintetizados mediante sistemas heterólogos. Una molécula substancialmente pura incluye las formas aisladas de la molécula. Alternativamente, una especie purificada puede separarse de los componentes del hospedero a partir de un sistema de expresión recombinante. Un ácido nucleico aislado generalmente será una composición homogénea de moléculas, pero contendrá, en algunas modalidades, menor heterogeneicidad. Esta heterogeneicidad se encuentra típicamente en los extremos del polímero o porciones no críticas a una actividad o función biológica deseable. Un ácido nucleico "recombinante" se define ya sea por su método de producción o por su estructura. En referencia a su método de producción, por ejemplo, un producto hecho mediante un proceso, el proceso es el uso de técnicas de ácido nucleico recombinante, por ejemplo, que implican la intervención humana en la secuencia de nucleótidos, típicamente selección o producción. Alternativamente, puede ser un ácido nucleico hecho mediante la generación de una secuencia que comprenda la porción de dos fragmentos que no son naturalmente contiguos a cada uno, pero se pretende que excluya a los productos naturales, por ejemplo, mutantes que ocurren naturalmente. Así, por ejemplo, se abarcan los productos hechos mediante células transformadas con cualquier vector que ocurra de manera no natural, tales como son ácido nucleicos que comprenden secuencias derivadas usando cualquier proceso de síntesis de oligonucleótidos. Esto frecuentemente se hace mediante el remplazo de un codón con un codón redundante que codifica al mismo aminoácido o a un aminoácido conservativo, mientras que típicamente se introduce o se remueve una secuencia del sitio de reconocimiento. Alternativamente, los oligonucleótidos sintéticos se usan para unir segmentos de ácidos nucleicos de funciones deseadas para generar una entidad genética única que comprende una combinación deseada de funciones que no se encuentran en las formas naturales comúnmente disponibles. Los sitios de reconocimiento para las «nzimas de restricción frecuentemente son el blanco de manipulaciones artificiales, pero otros blancos sitio-específicos, por ejemplo, promotores, sitios de replicación de ADN, secuencias de regulación, secuencias de control, u otras características útiles pueden incorporarse mediante diseño. Un concepto similar se pretende para los polipéptidos recombinantes, por ejemplo, un polipéptido de fusión. Específicamente se incluyen los ácidos nucleicos sintéticos los cuales, mediante redundancia del código genético, codifican para polipéptidos similares a los fragmentos de estos antígenos, y fusiones de secuencias de varias especies diferentes variables. Un "fragmento" significativo en el contexto de ácidos nucleicos es un segmento contiguo de al menos de alrededor de 17 nucleótidos, generalmente de al menos 20 nucleótidos, más generalmente de al menos 23 nucleótidos, ordinariamente de al menos 26 nucleótidos, más ordinariamente de al menos 29 nucleótidos, frecuentemente de al menos 32 nucleótidos, más frecuentemente de al menos 35 nucleótidos, típicamente de al menos 38 nucleótidos, más típicamente de al menos 41 nucleótidos, usualmente de al menos 44 nucleótidos, más usualmente de al menos 47 nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, más preferiblemente de al menos 53 nucleótidos, y en modalidades particularmente preferidas será de al menos 56 o más nucleótidos. Un ADN el cual codifica para una proteína Langerina será particularmente útil para identificar genes ARNm, y especies de ADNc que codifiquen para proteínas relacionadas u homologas, así como para ADNs que codifican para proteínas homologas. Deberían de existir homólogos en otros mamíferos, por ejemplo, primates. Varias proteínas Langerinas deberían ser homologas y éstas se abarcan aquí. Sin embargo, las proteínas inmutables que tienen relaciones evolucionarias más distantes con el antígeno pueden aislarse fácilmente bajo condiciones apropiadas usando estás secuencias si ellas son suficientemente homologas. Las proteínas de Langerina de primates son de particular interés. Esta invención abarca además las moléculas de ADN recombinante y fragmentos que tienen secuencias de ADN idénticas o altamente homologas a los ADNs aislados anteriormente aquí. En particular, las secuencias frecuentemente se unirán operativamente a segmentos de ADN los cuales controlan la transcripción, traducción, y la replicación del ADN. Alternativamente, las clonas recombinantes derivadas de las secuencias genómicas, por ejemplo, que contienen intrones, serán útiles para los estudios transgénicos, incluyendo, por ejemplo, células y organismos transgénicos, y para terapia génica. Ver, por ejemplo, Goodnow (1992) "Transgenic Animáis" en Roitt (ed.) Encvclopedia of Inmunoloqy Academic Press, San Diego, pp. 1502-1504; Travis (1992) Science 256:1392-1394; Kuhn, et al. (1991 ) Science 254:707-410; Capechi (1989) Science 244:1288; Robertson (ed. 1987) Teratocarcinomas and Embrvonic Stem Cells: A Practical Approach IRL Press, Oxford; Rosenberg (1992) J. Clínica Oncoloqv 10:180-199; y Cournoyer y Caskey (1993) Ann. Rev. Immunol. 11 :297-329; cada una de las cuales esta incorporada aquí como referencia. Las secuencias de ácido nucleico homologas, cuando se comparan, exhiben similitudes significativas. Los estándares para la homología de ácidos nucleicos son ya sea medidas para la homología generalmente usadas en la técnica mediante comparación de secuencia o se basan en las condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación se describen con mayor detalle a continuación. La homología sustancial en el contexto de la comparación de secuencias de ácidos nucleicos significa que los segmentos, o sus hebras complementarias, cuando se comparan, son idénticas cuando están alineadas óptimamente, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en al menos alrededor de 50% de los nucleótidos, generalmente al menos de 56%, más generalmente al menos de 59%, ordinariamente al menos de 62%, más ordinariamente al menos de 65%, frecuentemente al menos de 68%, más frecuente al menos de 71 %, típicamente al menos de74%, más típicamente al menos de 77%, usualmente al menos de 80%, más usualmente al menos de 85%, preferiblemente al menos de 90%, más preferible al menos de 95 a 98% o más, y en modalidades particulares, tan alto como alrededor de 99% o más de los nucleótidos. Alternativamente, la homología substancial existe cuando los segmentos hibridarán bajo condiciones de hibridación selectiva, a una hebra, o a su complemento, típicamente usando una secuencia como se describió. Típicamente, la hibridación selectiva ocurrirá cuando hay al menos alrededor de 55% de homología sobre una extensión de al menos alrededor de 14 nucleótidos, preferiblemente de al menos alrededor de 65%, más preferiblemente de al menos alrededor de 75%, y más preferiblemente de al menos alrededor de 90%. Ver, Kanehisa (1984) Nuc. Acids Res. 12:203-213, el cual está incorporado aquí como referencia. La longitud de la comparación de homología, como se describió, puede ser sobre extensiones largas, y en ciertas modalidades será sobre una extensión de al menos alrededor de 17 nucleótidos, usualmente de al menos 20 nucleótidos, más usualmente de al menos 24 nucleótidos, típicamente de al menos 28 nucleótidos, más típicamente de al menos 40 nucleótidos, preferiblemente de al menos 50 nucleótidos, y más preferiblemente de al menos de 75 a 100 o más nucleótidos.

Las condiciones severas, se refieren a la homología en el contexto de la hibridación, serán condiciones severas combinadas de sal, temperatura, solventes orgánicos y otros parámetros, típicamente aquellos controlados en las reacciones de hibridación. Las condiciones severas de temperatura usualmente incluirán temperaturas en exceso de alrededor de 30°C, más usualmente en exceso de alrededor de 37°C, típicamente en exceso de alrededor de 45°C, más típicamente en exceso de alrededor de 55°C, preferiblemente en exceso de alrededor de 65°C, y más preferiblemente en exceso de 70°C. Las condiciones severas de sal ordinariamente serán menores a alrededor de 1000 mM, usualmente menores a alrededor de 500 mM, más usualmente menores que alrededor de 400 mM, típicamente menores que alrededor de 300 mM, preferiblemente menores que alrededor de 200 mM, y más preferiblemente menores que alrededor de 150 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de algún parámetro singular. Ver, por ejemplo, Wetmur y Davidson (1968) J. Mol. Biol. 31 :349-370: Walker (ed. 1988) New Nucleic Acid Techniques Humana Press, Clifton, N. J.; Ross (ed. 1998) Nucleic Acid Hvbridization; Wiley, New York; o ver, por ejemplo, protocolos de hibridización recientes en el Internet en "Una Selección de Protocolos de Biología Molecular - Una lista de sitios con protocolos," por Griffin (1996) Analvtical Biochemistry 239:120-122.

Vil. Elaboración de la proteína Lanqerina: mimetización La Langerina puede aislarse de las fuentes naturales usando métodos estándar de bioquímica de proteínas. El anticuerpo DCGM4 puede usarse para seguir la ruta del proceso de purificación, o en varios métodos de inmunoafinidad. La proteína aislada puede usarse como material de inicio para la derivatización o modificación. La proteína puede usarse en formas nativas o desnaturalizadas. El ADN el cual codifica la proteína Langerina o fragmentos de la misma puede obtenerse mediante síntesis química, selección de genotecas de ADNc, o mediante selección de genotecas preparadas a partir de una amplia variedad de líneas celulares o de muestras de tejido. En particular, el anticuerpo DCGM4 puede usarse para expresar la clona del antígeno de proteína que codifica el ácido nucleico. Este ADN puede expresarse en una amplia variedad de células hospederas para la síntesis de una proteína de longitud total o fragmentos que pueden a su vez, por ejemplo, usarse para generar anticuerpos policlonales o monoclonales; para estudios de unión; para la construcción y precisión de moléculas modificadas; y para estudios de estructura/función. Cada antígeno o sus fragmentos pueden expresarse en células hospederas que son transformadas o transfectadas con vectores de expresión apropiados. Estás moléculas pueden purificarse substancialmente para quedar libres de proteínas o de contaminantes celulares, diferentes a aquellos derivados del hospedero recombinante, y por lo tanto son particularmente útiles en composiciones farmacéuticas cuando se combinan con un acarreador farmacéuticamente adecuado, amortiguador, y/o diluyente. El antígeno, o porciones del mismo, pueden expresarse como fusiones con otras proteínas. Los vectores de expresión típicamente son construcciones de ADN o ARN autoreplicante que contienen al gen del antígeno deseado o sus fragmentos, usualmente operativamente unido a elementos de control genético adecuados que se reconocen en una célula hospedera adecuada. Estos elementos de control son capaces de afectar la expresión dentro de un hospedero adecuado. El tipo específico de elementos de control necesario para afectar la expresión dependerá de la eventual célula hospedera utilizada. Generalmente, los elementos de control genético pueden incluir un sistema promotor procarionte o un sistema de control de expresión de promotor eucarionte y típicamente incluyen un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, mejoradores transcripcionales para elevar el nivel de la expresión de ARNm, una secuencia que codifica un sitio de unión adecuado para ribosomas, y secuencias que terminan la transcripción y la traducción. Los vectores de expresión usualmente también contienen un origen de replicación que permite que el vector se replique independientemente de la célula hospedera. Los vectores de esta invención contienen ADN que codifica para proteína Langerina, o a un fragmento de la misma, preferiblemente codifican para un polipéptido biológicamente activo. La secuencia dada en SEQ ID NO:1 puede usarse ventajosamente para preparar proteína Langerina. El ADN puede estar bajo el control de un promotor viral y puede codificar un marcador de selección. Esta invención además contempla el uso de dichos vectores de expresión los cuales son capaces de expresar en ADNc eucarionte que codifica para una proteína Langerina en un hospedero procarionte o eucarionte, en donde el vector es compatible con el hospedero y en donde el ADNc eucarionte que codifica para el antígeno se inserta dentro del vector de tal manera que el crecimiento del hospedero que contiene al vector expresa el ADNc en cuestión. Usualmente, los vectores de expresión son diseñados para su replicación estable en las células hospederas o por amplificación para incrementar de manera importante el numero total de copias del gen deseable por célula. No siempre se requiere necesariamente que un vector de expresión se replique en una célula hospedera, por ejemplo, es posible afectar la expresión transitoria del antígeno o de sus fragmentos en varios hospederos usando vectores que no contienen un origen de replicación reconocido por la célula hospedera. También ee posible usar vectores que causen integración del gen de Langerina o sus fragmentos dentro del ADN hospedero mediante recombinación o integrar un promotor el cual controla la expresión del gen endógeno por ejemplo, ver WO 96/29411 (incorporada aquí como referencia incluyendo todas las figuras y dibujos) que describe dicha tecnología. Los vectores, como se usaron aquí, comprenden plásmidos, virus, bacteriófagos, fragmentos de ADN integrables y otros vehículos que capacitan la integración de fragmentos de ADN dentro del genoma del hospedero. Los vectores de expresión son vectores especializados que contienen elementos de control genético que afectan la expresión de genes unidos operativamente. Los plásmidos son los más usados comúnmente de entre los vectores pero todas las demás formas de vectores que sirven a una función equivalente y los cuales son, o se volvieron, conocidos en el campo son adecuados para su uso aquí. Ver, por ejemplo, Pouweis, et aL (1985 y suplementos) Cloning Vectors: A Laboratorv Manual, Elsevier, N.Y.; y Rodríguez, et al. (eds. 1988) Vectors: A Survey of Molecular Cloninq Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Ma; los cuales son incorporados aquí como referencia. Las células transformadas incluyen células de mamífero preferiblemente, que han sido transformadas o transfectadas con vectores que contienen la secuencia del ácido nucleico de Largerina, típicamente construidos usando técnicas de ADN recombinante. Las células hospederas transformadas usualmente expresan el antígeno o sus fragmentos, pero para propósitos de la clonación, amplificación, y manipulación del ADN, no necesitan expresar la proteína. Esta invención además contempla el cultivo de células transformadas en un medio nutritivo, permitiendo así que la proteína se acumule en el cultivo. La proteína puede recuperarse, ya sea del cultivo o del medio de cultivo. Para propósitos de esta invención, la secuencias de ADN se unen operativamente cuando están relacionadas funcionalmente con las demás. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o un líder secretorio está operativamente unido a un polipéptido si éste se expresa como una preproteina o participa en la dirección del polipéptido a la membrana celular o en la secreción del polipéptido. Un promotor esta operativamente unido a una secuencia codificante si éste controla la transcripción del polipéptido; un sitio de unión a ribosoma esta operativamente unido a una secuencia codificadora si éste está en posición de permitir la traducción. Usualmente, las uniones operativas significan que se encuentran contiguas y en marco de lectura, sin embargo, ciertos elementos genéticos tales como los genes represores no se encuentran contiguamente unidos pero aun así se unen a las secuencias operadoras que a su vez controlan la expresión. Las células hospederas adecuadas incluyen los procariontes, eucariontes inferiores y eucariontes superiores. Los procariontes incluyen tanto ha organismos gram negativos como gram positivos, por ejemplo E. coli y B. subtilis. Los eucariontes inferiores incluyen levaduras, por ejemplo, S. cerevisiae y Pichia, y especies del genero Dictyostelium. Los eucariontes superiores incluyen a líneas celulares establecidas de cultivos de tejidos de células animales, tanto de origen no mamífero, por ejemplo, células de insectos, y aves, y de origen mamífero, por ejemplo, humanos, primates, y roedores. Los sistemas vector-hospedero procariontes incluyen una amplia variedad de vectores de muchas especies diferentes. Como se uso aquí, E. coli y sus vectores serán usados genéricamente para incluir vectores equivalentes usados en otros procariontes. Un vector representativo para amplificar ADN es pBR322 o muchos de sus derivados. Los vectores que pueden usarse para expresar las proteínas Langerinas o sus fragmentos incluyen, pero no están limitados a aquellos vectores que contienen al promotor lac (series-pUC); promotor trp (series pBR322-trp); promotor Ipp (las series pIN); lambda-pP o promotores pR(pOTS); o promotores híbridos tales como ptac (pDR540). Ver Brosius, et al. (1988) "Expression Vectors Employing, Lambda-, trp-, lac-, and Ipp-derived Promoters", en Rodríguez y Denhardt (eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, capitulo 10, pp.205-236, los cuales están incorporados aquí como referencias. Los eucariontee inferiores, por ejemplo, levaduras y Dictyostelium, pueden transformarse con vectores que codifican para proteínas Langerinas. Para propósitos de esta invención, el hospedero eucarionte inferior más común es la levadura de baker, Saccharomyces cerevisiae. Se usará para representar genéricamente a los eucariontes inferiores aunque también están disponibles un numero de otras cepas y especies. Los vectores de levaduras típicamente consisten de un origen de replicación (a menos que sea del tipo integrador), un gen de selección, un promotor, un ADN que codifica para la proteína deseada o su fragmento, y secuencias para la terminación traduccional, poliadenilación, y terminación transcripcional. Los vectores de expresión adecuados para levaduras incluyen aquellos promotores constitutivos tales como los promotores para el gen de la enzima 3-fosfoglicerato cinasa y varias otras enzimas glucolíticas o promotores inducibles tales como el promotor de alcohol deshidrogenasa 2 o el promotor de metalotionina. Los vectores adecuados incluyen derivados de los siguientes tipos: autoreplicadores de bajo numero de copias (tales como las series YRp), autoreplicadores del alto numero de copias (tales como las series YEp); tipos integradores (tales como las series Ylp), o mini cromosomas (tales como las series YCp). Las células para cultivo de tejidos de eucariontes superiores son las células hospederas preferidas para la expresión de la proteína Langerina funcionalmente activa. En principio, cualquier línea celular para cultivo de tejidos de eucariontes superiores puede utilizarse, por ejemplo, sistemas de expresión de baculovirus de insecto, ya sea de origen vertebrado o invertebrado. Sin embargo, se prefieren las células de mamíferos, para el proceso, tanto cotraducionalmente como postranscripcionalmente. La transformación o transfección y propagación de dichas células se ha vuelto un procedimiento de rutina. Los ejemplos de líneas celulares útiles incluyen células Hela, líneas celulares del ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares de riñon de rata joven (BRK), líneas celulares de insecto, líneas celulares de ave, y líneas celulares de mono (COS). Los vectores de expresión para dichas líneas celulares usualmente incluyen un origen de replicación, un promotor, un sitio de iniciación de traducción, sitios de procesamiento de ARN (si se usa ADN genómico), un sitio de poliadenilación, y un sitio de terminación de la transcripción. Estos vectores también contienen usualmente un gen de selección o un gen de amplificación. Los vectores de expresión adecuados pueden ser plásmidos, virus, o retrovirus que llevan promotores derivados, por ejemplo, de aquellas fuentes como del adenovirus, SV40, parvovirus, virus de la vacuna, o citomegalovírus. Los ejemplos representativos de los vectores de expresión adecuados incluyen pCDNAl ; pCD, ver Okayama, et al. (1985) Mol. Cell Biol. 5:1136-1142; pMCI neo Poly-A, ver Thomas, et al (1987) Cell 51 :503-512; y un vector baculovirus tal como el pAC 373 o pAC 610. Frecuentemente será deseable expresar un polipéptido de proteína Langerina en un sistema el cual provea un patrón de glucosilación definido o especifico. En estos caso, el patrón usual será el provisto naturalmente por el sistema de expresión. Sin embargo, el patrón será modificable mediante la exposición del polipéptido, por ejemplo, una forma no glucosilada, para proteínas de glucosilación apropiadas introducidas dentro de un sistema de expresión heteróloga. Por ejemplo, el gen de proteína Langerina puede cotransformarse con uno o más genes que codifican para enzimas de glucosilación de mamíferos u otras. Usando este método ciertos patrones de glucosilación de mamíferos se lograrán o se aproximarán en células procariontes o de otros tipos. La proteína Langerina, o fragmentos de la misma, pueden diseñarse para que se unan a una membrana celular mediante fosfatidil inositol (Pl), pero pueden removerse de las membranas mediante tratamiento con una enzima que rompa el fosfatidinilinositol, por ejemplo, fosfatidilinositol fosfolipasa-C. ésta libera el antígeno en su forma biológicamente activa, y permite la purificación mediante procedimientos estándar de química de proteínas. Ver por ejemplo, Low (1989) Biochim, Biophys. Acta 988: 427-454; Tse, et al. (1985) Science 230:1003-1008; y Brunner, et al. (1991 ) J. Cell Biol. 114:1275-1283. Los fragmentos o derivados de Langerina pueden prepararse mediante procesos convencionales por síntesis de péptidos. La fase sólida y la síntesis de fase sólida son aplicables ambos a los procedimientos a continuación. Estos incluyen procesos tales como los descritos en Bodanszky (1993) Principies of Peptide Synthesis; Springer-Verlag; Bodansky (1994) The Practice of Peptide Synthesis; Springer-Verlag; Jones (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis; Oxford University Press; Atherton y Sheppard (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach; TRL Press New York; Stewart y Young (1984) Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL, y ligación química, por ejemplo, Dawson, et al. (1994) Science 266: 776-779, un método para unir largos péptidos sintéticos mediante enlace peptídico, cada uno de los cuales está incorporado aquí como referencia. Por ejemplo, un proceso con azida, un proceso con cloruro ácido, un proceso con ácido anhídrido, un proceso con una mezcla de anhídridos, un proceso con esteres activos (por ejemplo, éster de p-nitrofenilo, éster de N-hidroxisuccinimida, o éster de cianometilo), un proceso con carbodiimidazol, un proceso óxido reductivo, o un proceso con diciclohexilcarbodiimida (DCCD)/aditivo pueden usarse. La síntesis de fase sólida y de fase de solución son ambas aplicables al proceso a continuación.

La proteína Langerina, fragmentos, o derivados se preparan adecuadamente de acuerdo con los procesos anteriormente descritos como típicamente se emplearon en la síntesis de péptidos, generalmente ya sea mediante el proceso denominado por pasos el cual comprende la condensación de un aminoácido al aminoácido terminal, uno por uno en secuencia, o mediante el acoplamiento de fragmentos peptídicos al aminoácido terminal. Los grupos amino que no se han usados en la reacción de acoplamiento típicamente se protegen para prevenir el acoplamiento a un sitio incorrecto. Si se adopta la síntesis de fase sólida, el aminoácido C-terminal se une a un acarreador insoluble o se mantiene a través de su grupo carboxilo. El acarreador insoluble no está limitado particularmente mientras tenga capacidad de unión a un grupo carboxilo reactivo. Los ejemplos de dichos acarreadores insolubles incluyen resinas halometílícas, tales como la resina clorometílica o la resina brometílica, las resinas hidroximetílicas, las resinas fenólicas, las resinas tert-alquiloxicarbonilo-hidrazidas, y similares. Un aminoácido con un grupo amino protegido se unió en secuencia a través de la condensación de sus grupos carboxilo activados y el grupo amino reactivado del péptido o cadena previamente formada, para sintetizar el péptido paso a paso. Después de sintetizar la secuencia completa, el péptido se separó del acarreador insoluble para producir el péptido. Este método de fase sólida está descrito generalmente por Merrifield, et al. (1963) en J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2156, el cual es incorporado aquí como referencia. La proteína preparada y fragmentos de la misma pueden aislarse y purificarse de mezclas de reacción mediante la separación de péptídos por ejemplo, mediante extracción, precipitación, electroforesis, y varias formas de cromatografía, y similares. La langerina de esta invención puede obtenerse en varios grados de pureza dependiendo del uso deseado. La purificación puede ser llevada a cabo mediante el uso de técnicas de purificación de proteínas expuestas aquí o mediante el uso de anticuerpos descritos aquí en cromatografía de afinidad inmunoabsorbente. Esta cromatografía de afinidad inmunoabsorbente se lleva a cabo mediante primero unir los anticuerpos a un soporte sólido y entonces poner en contacto a estos anticuerpos unidos con usados solubilizados de fuentes celulares apropiadas, usados de otras células que expresan la proteína, o usados o sobrenadantes de células que producen la proteína Langerina como resultado de las técnicas de ADN, ver más adelante.

VIII. Utilidad La presente invención provee reactivo el cual encontrará su uso en aplicaciones diagnosticas como se describió aquí en algún lugar, por ejemplo, en la descripción general para anormalidades fisiológicas o de desarrollo, o posteriormente en la descripción de los equipos. El antígeno será útil tanto en métodos, para aislar varios tipos celulares, por ejemplo, células de Langerhans, o para métodos forenses para determinar varias fuentes de muestras biológicas de especies. Esta invención provee reactivos con significativo valor terapéutico. La Langerina (que ocurre naturalmente o recombinante), fragmentos de la misma, muteinas y anticuerpos, junto con compuestos identificados como poseedores de afinidad de unión a la Langerina o anticuerpos, encuentran su uso en el tratamiento de condiciones que exhiben expresión anormal de Langerina o de sus ligandos o agentes de unión. Dichas anormalidades típicamente se manifestarán mediante trastornos inmunológicos. Adicionalmente, esta invención provee valor terapéutico en varias enfermedades o trastornos asociados con expresión anormal o mecanismos anormales de respuesta a ligando o al agente de unión. Se cree que los ligandos de Langerina o los agentes de unión están implicados en el desarrollo y maduración de DC. La Langerina también puede usarse como receptor para antígeno blanco de células dendríticas para permitir la respuesta inmune terapéuticamente relevante. Las Langerinas recombinantes, muteinas, anticuerpos agonistas, o antagonistas, o anticuerpos pueden purificarse y administrarse a un paciente. Estos reactivos pueden combinarse con ingredientes activos adicionales para su uso terapéutico, por ejemplo, en acarreadores convencionales farmacéuticamente aceptables o diluyentes, junto con estabilizadores y excipientes fisiológicamente inocuos. Estas combinaciones pueden ser estériles, por ejemplo, filtradas, y colocadas dentro de formas de dosis tales como la liofilización en viales de dosis o en almacenamiento en preparaciones acuosas estabilizadas. Esta invención también contempla el uso de anticuerpos o de fragmentos de unión del mismo los cuales no se unen completamente. El uso de Langerina o de fragmentos de la misma para seleccionar los elementos de unión o para compuestos que tienen afinidad de unión al antígeno de Langerina que pueden llevarse a cabo incluyendo el aislamiento de compuestos asociados. Los ensayos biológicos subsecuentes pueden entonces utilizarse para determinar si los ligandos putativos o agentes de unión pueden proveer unión competitiva, la cual puede bloquear la actividad estimuladora intrínseca. Los fragmentos de langerina pueden usarse como bloqueadcres o antagonistas en tanto que bloquee la actividad de los ligando o agentes de unión. Esta invención contempla además el uso terapéutico de anticuerpos Langerina como antagonistas. Este método será particularmente útil con otras variantes de especies de proteínas de Langerina y otros miembros de la familia. Las cantidades de reactivos necesarios para la terapia efectiva dependerán de muchos factores, incluyendo medio de administración, sitio blanco, vida fisiológica del reactivo, vida farmacológica, estado fisiológico del paciente, y otros medicamentos administrados. Así, las dosis de tratamiento deberán titularse para optimizar la seguridad y eficacia. Típicamente, las dosis usadas in vitro pueden proveer guías útiles en las cantidades útiles para la administración in situ de estos reactivos. Los ensayos animales de dosis efectivas para el tratamiento de trastornos particulares proveerán de otras indicaciones previsibles para la dosis en humanos. La dosis actual del reactivo, formulaciones o composiciones que modulan el desorden inmunológico dependen de muchos factores, incluyendo el tamaño y salud del organismo, sin embargo, un experto en la técnica puede usar técnicas que describen métodos y técnicas para determinar las dosis clínicas. Ver, por ejemplo, Spilker (1984) Guide to Clinical Studies and Developing Protocols, Raven Press Books, Ltd., New York, esp. pp. 7-13, 54-60; Spilker (1991 ) Guide to Clinical Triáis, Raven Press, Ltd., New York, esp. pp. 93-101 ; Craig y Stitzel (eds. 1986) Modern Pharmacology, 2d, ed., Little Brown and Co., Boston, esp. pp. 127-33; Speight (ed 1987) Avery's Drug Treatment: Principies and Practice of Clinical Pharmacology and Therapeutics, 3d ed., Williams and Wilkins, Baltimores, esp. pp. 50-56; Tallarida, et al. (1988) Principies of General Pharmacology, Springer-Verlag, New York, esp. pp. 18-20; Gilman, et al. (eds.) Goodman and Gilman's: The Pharmacological Bases cf Therapeutics, última edición, Pergamon Press, Remington's Pharmaceutical Sciences, última edición, Mack-Publishinq Co., Easton, Penn.; y Rich, et al (1998) Clinical Immunologv: Principies and Practice Vols. I & II, Mosbv, St. Louis, Mo, cada una de las cuales está incorporada aquí como referencia en su totalidad incluyendo todos los dibujos y figuras. Los métodos para la administración se discuten aquí y a continuación, por ejemplo, para administración oral, intravenosa, intraperitoneal, o intramuscular, difusión transdermal, y otras. Los acarreadores farmacéuticamente aceptables incluirán agua, salina, amortiguadores, y otros compuestos descritos, por ejemplo, en el índice Merck, Merck & Co.. Rahwav, New Jersey. Debido a la probabilidad de unión de alta afinidad, o al número de cambios, entre un ligando putativo o un agente de unión y sus elementos de unión, se esperará que bajas dosis de estos reactivos serán efectivas inicialmente. Así, los rangos de las dosis podrían ordinariamente esperarse que estén en las cantidades de concentraciones menores a 1 mM, típicamente menores a concentraciones de 10 µM, usualmente menos de 10 nM, preferiblemente menos de 10 pM (picomolar), y más preferiblemente menos de 1 fM (femtomolar), con un acarreador apropiado. Las formulaciones de liberación lenta, o los aparatos de liberación lenta, frecuentemente se utilizarán para administración continua. Otras condiciones de desarrollo anormales que se conocen en tipos celulares muestran poseer el antígeno de Langerina, por ejemplo, células DC y células epiteliales de la amígdala. Ver Brew y The Merck Manual of Diagnosis and Therapy Merck & Co., Rahwav, N:J.; y Thorn, et al. Harrison's Principies of Interna! Medicine McGraw-Hill, N.Y. Estos problemas pueden ser susceptibles a la prevención o tratamiento usando las composiciones provistas aquí. Las Langerinas, fragmentos de las mismas, y anticuerpos o sus fragmentos, antagonistas, y agonistas, pueden administrarse directamente al hospedero a ser tratado o, dependiendo del tamaño del compuesto, podría ser deseable conjugarlos con proteínas acarreadoras tales como ovalbúmina o albúmina sérica antes de su administración. Las formulaciones terapéuticas pueden administrarse en muchas formulaciones de dosis convencionales. Mientras que es posible para el ingrediente activo administrarse solo, actualmente es preferible su formulación farmacéutica. Las formulaciones comprenden al menos un ingrediente activo, como se definió anteriormente, junto con uno o más acarreadores aceptables del mismo. Cada acarreador debe ser tanto farmacéuticamente como fisiológicamente aceptable en el sentido de ser compatible con los otros ingredientes y no dañino al paciente. Las formulaciones incluyen aquellas administraciones adecuadas ya sea orales, rectales, nasales, o parenterales (incluyendo la subcutánea, intramuscular, intravenosa e intradermal). Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma de unidad de dosis y pueden prepararse mediante métodos bien conocidos en el campo de la farmacia. Ver, por ejemplo, Gilman, et al (eds. 1990) Goodman y Gilman's: The Pharmacoloqical Bases of Therapeutics, 8th, Ed., Pergamon Press; y Reminqton's Pharmaceutical Sciences, edición actual, Mack Publishing Co., Easton, Penn.; Avis, et al (eds. 1993) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Parenteral Medications Dekker, NY; Lieberman, et al. (eds. 1990) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Tablets Dekker, NY; y Lieberman, et al. (eds 1900) Pharmaceutical Dosaqe Forms: Disperse Systems Dekker, NY. La terapia de esta invención puede combinarse o usarse en asociación con otros agente terapéuticos.

Tanto los anticuerpos específicos a Langerina que ocurren naturalmente como sus formas recombinantes y las proteínas a Langerina de esta invención son particularmente útiles en equipos y métodos de ensayo que son capaces de seleccionar compuestos por su actividad de unión. Varios métodos de ensayo automatizados han sido desarrollados en los últimos años de manera que permiten la selección de decenas de miles de compuestos en un corto periodo. Ver, por ejemplo, Fodor, et al. (1991 ) Science 251 :767-773, el cual es incorporado aquí como referencia y el cual describe los medios para probar la afinidad de unión mediante una pluralidad de polímeros definidos sintetizados en un substrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados puede facilitarse ampliamente por la disponibilidad de grandes cantidades de proteína Langerina soluble purificada como se provee por esta invención. Esta invención es particularmente útil para seleccionar compuestos mediante el uso de antígenos recombinantes en cualquiera de una variedad de técnicas de selección de fármacos. Las ventajas del uso de proteínas recombinantes en la selección de ligandos específicos o agentes de unión incluyen: (a) la mejora en la renovación de la fuente del antígeno a partir de una fuente específica; (b) un número potencialmente mayor de moléculas antígenas por célula que dan mejor señal que el porcentaje de ruido en los ensayos; y (c) la especificidad variante de las especies (teóricamente se da una mayor especificidad biológica y a la enfermedad). La proteína purificada puede probarse en numerosos ensayos, típicamente en ensayos in vitro, los cuales evalúan la respuesta biológicamente relevante. Ver, por ejemplo, Coligan Current Protocols in Immunoloqy; Hodd, et al. Immunoloqy 3d ed, Raven Press, NY; y Methods in Enzvmoloqy Academic Press. Esto también será útil en la selección de un ligando que se une a la Langerina, por ejemplo, a partir de una célula ¡nteractuante. Un método para selección de fármacos utiliza una célula hospedera eucarionte o procarionte la cual se transforma establemente con moléculas de ADN recombinante que expresa antígenos de Langerina. Pueden aislarse las células las cuales expresan un antígeno de manera aislada a partir de otros antígenos funcionalmente equivalentes. Dichas células, pueden usarse ya sea en forma viable o fijada para ensayos estándar de unión proteína-proteína. Ver también, Parce, et al. (1989) Science 246:243-247; y Owicki, el al (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:4007-4011 ; las cuales son incorporadas aquí como referencias y describen métodos sensibles para detectar respuestas celulares. Los ensayos de competitividad son particularmente útiles, en donde las células (fuente de la proteína Langerina) se ponen en contacto y se incuban con un elemento de unión marcado o anticuerpo que tiene una afinidad de unión conocida al ligando, tal como el anticuerpo-1251, y una muestra prueba cuya afinidad de unión a la composición de unión ha sido medida. Las composiciones de unión marcadas que se encuentran libres y unidas son entonces separadas para asegurar el grado de unión al antígeno. La cantidad del compuesto prueba unido es inversamente proporcional a la cantidad de unión al receptor marcado de la fuente conocida. Numerosas técnicas pueden usarse para separar el antígeno unido del antígeno libre para evaluar el grado de unión. Este paso de separación típicamente podría implicar un procedimiento tal como la adhesión a los filtros seguido de un lavado, la adhesión a plástico seguido por lavado, o la centrifugación de las membranas celulares. Las células viables podrían también usarse para seleccionar los efectos de los fármacos sobre las funciones mediadas por la proteína Langerina, por ejemplo, niveles de segundos mensajeros, es decir, Ca++; proliferación celular; cambios en las cantidades de ¡nositolfosfato; y otros. Algunos métodos de detección permiten la eliminación del paso de separación, por ejemplo, un sistema de detección sensible proximal. Los colorantes sensibles a calcio serán útiles para detectar los niveles de Ca++, con un fluorímetro o un aparato de clasificación de la fluorescencia celular. Otro método utiliza membranas de células eucariontes o procariontes hospederas transformadas como fuente de proteína Langerina. Estas células se transforman establemente con vectores de ADN que dirigen la expresión de la proteína Langerina asociada a la membrana, por ejemplo, una forma modificada unida a la membrana. Esencialmente, las membranas podrían separarse de las células y usarse en un ensayo de unión del tipo receptor-ligando tal como el ensayo competitivo descrito más adelante. Otro método es el usar proteína Langerina purificada, solubilizada, no purificada o solubilizada, a partir de células eucariontes o procariontes hospederas transformadas. Esto permite un ensayo de unión "molecular" con las ventajas de incremento en la especificidad, la capacidad de automatizar, hasta continuar a pruebas con fármacos mayores. Otra técnica para la selección de fármacos implica un método que provee alta selección para compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a la Langerina y se describen en detalle en Geysen, la solicitud de patente europea 84/03564, publicada en septiembre 13 de 1984, la cual está incorporada aquí como referencia. Primero, grandes cantidades de diferentes péptidos pequeños o compuestos prueba se sintetizan en un substrato sólido, por ejemplo, espigas plásticas o alguna otra superficie adecuada, ver Fodor, et al. (1991 ). Entonces todas las espigas reaccionan con composiciones de unión a Langerina purificada, solubilizadas, no purificadas o solubilizadas, y lavadas. El siguiente paso implica la detección de la composición de unión unida. El diseño racional del fármaco también puede basarse en los estudios estructurales de las formas moleculares de la proteína Langerina y de otros efectores o análogos. Los efectores pueden ser otras proteínas las cuales median otras funciones en respuesta a la unión del antígeno, u otras proteínas que normalmente ¡nteractúan con el antígeno, por ejemplo, ligandos a Langerina. Un medio para determinar qué sitios interactúan con otras proteínas específicas es una determinación de la estructura física, por ejemplo, cristalografía de rayos X o técnicas bidimensionales de RMN. Estas proveerán la guía con la cual los residuos de aminoácidos formarán regiones moleculares de contacto. Para una descripción detallada de las determinaciones estructurales proteicas, ver, por ejemplo, Blundell y Johnson (1976) Protein Crvstalloqraphv, Academic Press, New York, la cual está aquí incorporada como referencia. La proteína Langerina purificada puede cubrirse directamente sobre placas para usarla en técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionados. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes a estos ligandos pueden usarse como anticuerpos de captura para inmovilizar al ligando respectivo sobre la fase sólida.

IX. Equipos y cuantificación/detección Tanto las formas que ocurren naturalmente como las recombínantes de la molécula de Langerina de la invención son particularmente útiles en equipos y métodos de ensayo. Por ejemplo, estos métodos serian aplicados a la selección de actividad de unión, por ejemplo, ligandos o agentes de unión para estas proteínas. Varios métodos de ensayos automatizados se han desarrollado en los últimos años de manera que permiten la selección de decenas de miles de compuestos por año. Ver, por ejemplo, una estación de trabajo automatizada, BIOMEK y Beckman Instruments, Palo Alto, California, y Fodor, et al. (1991 ) Science 251 :767-773. la cual está incorporada aquí como referencia. La última describe los medios para probar la unión mediante un agente por una pluralidad de polímeros definidos sintetizados sobre un sustrato sólido. El desarrollo de ensayos adecuados para seleccionar un ligando o agente de unión o una proteína homologa agonista/antagonista puede facilitarse ampliamente mediante la disponibilidad de grandes cantidades de Langerina purificada, soluble en un estado activo tal como el provisto por esta invención. La Langerina purificada puede cubrirse directamente sobre platos para usarse en las técnicas de selección de agentes de unión o ligandos anteriormente mencionados. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes a estas proteínas pueden usarse como anticuerpos de captura para inmovilizar la proteína Langerina respectiva sobre la fase sólida, útil, por ejemplo, en los usos diagnósticos. Esta invención también contempla el uso de Langerina, fragmentos de la misma, péptidos, y sus productos de fusión en una variedad de equipos de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de la proteína Langerina o de sus ligandos o de agentes de unión. Alternativamente, o adicionalmente, los anticuerpos contra la molécula de Langerina pueden incorporarse dentro de equipos y métodos. Típicamente el equipo tendrá un compartimento que contenga ya sea la proteína Langerina, fragmento, péptido o segmento del gen o un reactivo el cual reconozca uno u otros de éstos. Típicamente, los reactivos de reconocimiento, en el caso de una proteína o fragmento de la misma, sería un receptor o anticuerpo, o en el caso de un segmento de gen, usualmente sería una sonda de hibridación. Un equipo preferido para determinar las concentraciones de Langerina en una muestra típicamente comprendería un compuesto marcado, por ejemplo, ligando, agente de unión, o anticuerpo, que tenga una afinidad de unión conocida por la Langerina, una fuente de Langerina (que ocurre naturalmente o recombinante) como control positivo, y un medio para separar el compuesto marcado libre del unido, por ejemplo una fase sólida para inmovilizar a la Langerina en la muestra de prueba. Normalmente se proveerán los compartimentos que contienen los reactivos, y las instrucciones. Esta invención también contempla el uso de proteína Langerina, fragmentos de la misma, péptidos, sus productos de fusión, y composiciones de unión en una variedad de equipos de diagnóstico y métodos para detectar la presencia de una composición de unión. Típicamente el equipo tendrá un compartimiento que contiene ya sea un péptido de Langerina definido o un segmento del gen o un reactivo que reconozca uno o los otros, por ejemplo, fragmentos del antígeno o anticuerpos. Ver, por ejemplo, Chen (ed.) (1987) Inmunoassay: A Practical Guide Academic Press, Orlando, FL; Price y Newman (eds.) (1991 ) Principies y Practice of Inmunoassav Stockton Press, New York; y Ngo (ed.) (1988) Nonisotopic Immunoassav Plenum Press, NY. Un equipo para determinar la afinidad de unión de un compuesto prueba a una proteína Langerina típicamente comprendería un compuesto prueba; un compuesto marcado, por ejemplo un anticuerpo que tenga afinidad de unión conocida por el antígeno; una fuente de proteína Langerina (que ocurra naturalmente o recombinante); y un medio para separar el compuesto marcado libre del unido; tal como una fase sólida para inmovilizar el antígeno. Una vez que los compuestos se seleccionan; aquéllos que tengan afinidad de unión adecuada al antígeno pueden evaluarse en ensayos biológicos adecuados, como son bien conocidos en el campo, para determinar si ellos exhiben actividad biológica similar a la del antígeno natural. La disponibilidad de los polipéptidos de proteína Langerina recombinantes también provee estándares bien definidos para calibrar dicho ensayo. Un método para determinar las concentraciones de la proteína Langerina en una muestra típicamente comprendería los pasos de: (1 ) preparación de membranas a partir de una muestra que comprende una fuente de proteína Langerina unida a membrana; (2) el lavado de las membranas y la suspensión de ellas en un amortiguador; (3) solubilización del antígeno mediante incubación de las membranas en un medio de cultivo al cual un detergente adecuado a sido añadido; (4) el ajuste de la concentración del detergente del antígeno solubílizado; (5) el poner en contacto e incubar dicha dilución con anticuerpos radiomarcados para formar complejos; (6) la recuperación de los complejos mediante filtración a través de filtros tratados con polietileneimina y (7) la medición de la radioactividad de los complejos recuperados. Los anticuerpos, incluyendo los fragmentos de unión al antígeno, específicos para la proteína Langerina o fragmentos son útiles en las aplicaciones diagnósticas para detectar la presencia de niveles elevados de proteína Langerina y/o sus fragmentos. Dichos ensayos diagnósticos pueden emplear usados, células vivas, células fijadas, inmunofluorescencia, cultivos celulares, muestras de tejido, fluidos corporales, y otros que puedan implicar la detección de antígenos relacionados a la proteína en el suero, o similares.

Los ensayos diagnósticos pueden ser homogéneos (sin el paso de separación entre que el complejo de proteína-proteína y el reactivo libre) o heterogéneos (con un paso de separación). Varios ensayos comerciales existen, tales como el radioinmunoensayo (RÍA), el ensayo ¡nmunoabsorbente unido a enzima (ELISA), inmunoensayo de enzima (EIA), la técnica de inmunoensayo de enzimas multiplicada (EMIT), el inmunoensayo fluorescente de substrato marcado (SLFIA), y similares. Por ejemplo, los anticuerpos no marcados pueden emplearse mediante el uso de un segundo anticuerpo el cual está marcado y el cual reconoce al anticuerpo a la proteína Langerina o a un fragmento particular de la misma. Ensayos similares también han sido extensivamente discutidos en la literatura. Ver, por ejemplo, Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratorv Manual. CSH, y Coligan (ed. 1991) y suplementos periódicos, Current Protocols In Immunoloqy Green/Wiley, New York. Los anticuerpos antiidiotípicos pueden tener usos similares para diagnosticar la presencia de anticuerpos contra proteína Langerina, la cual puede diagnosticarse de varios estados anormales. Por ejemplo, la sobreproducción de proteína Langerina puede resultar en la producción de varias reacciones inmunológicas que diagnosticarse de estados fisiológicos anormales asociados con las células de Langerhans (por ejemplo, dermatitis atópica, granuloma eosinofílico, histiocitosis, esclerosis sistémica y granulomatosis de células de Langerhans). También, ver, por ejemplo, Rich, et al. (1998) Clinical Immunoloqy: Principies and Practice Vols. I & II, Mosby, St. Louis, Mo. Frecuentemente, los reactivos para los ensayos diagnósticos se aportan en equipos, de manera que optimizan la sensibilidad del ensayo. Para el tema de la invención, dependiendo de la naturaleza del ensayo, se proveen el protocolo, y el marcador, el anticuerpo ya sea marcado o no marcado, o la Langerina marcada. Esto usualmente es en conjunción con otros aditivos, tales como amortiguadores, estabilizadores, materiales necesarios para la producción de señales tales como substratos para enzimas, y similares. Preferiblemente, el equipo también contendrá instrucciones para el uso apropiado y la disposición de los contenidos después del uso. Típicamente el equipo tiene compartimentos para cada reactivo útil. Deseablemente, los reactivos se proveen en forma de polvo seco liofilizado, en donde los reactivos pueden reconstituirse en un medio acuoso que provee la concentración apropiada de los reactivos para llevar a cabo el ensayo. Muchos de los constituyentes anteriormente mencionados de la selección del fármaco y el ensayo diagnóstico pueden usarse sin modificación o pueden modificarse en una variedad de sentidos. Por ejemplo, el marcado puede lograrse mediante la unión covalente o no-covalente de una porción la cual directa o indirectamente provee una señal detectable. En estos ensayos, el antígeno, compuesto prueba, proteína Langerina, o los anticuerpos del mismo pueden marcarse ya sea directa o indirectamente. Las posibilidades para marcar directamente incluyen grupos de marcado: radiomarcas tales como 125l, enzimas (patente de E.U.A No. 3,645,090) tales como peroxidasa y fosfatasa alcalina, y marcas fluorescentes (patente de E.U.A No. 3,940,475) capaces de monitorear el cambio en la intensidad de fluorescencia, cambio de longitud de onda, o polarización fluorescente. Ambas patentes se incorporan aquí como referencias. Las posibilidades para un marcado indirecto incluye la biotinilación de un constituyente seguido por la unión a un acoplador de avidína a uno de los grupos marcados anteriormente. Hay también numerosos métodos para separar la unión del antígeno libre, o alternativamente la unión del compuesto prueba libre. La proteína Langerina puede inmovilizarse en varias matrices siguiendo a los lavados. Las matrices adecuadas incluyen plásticos tales como los platos para ELISA, filtros, y camas. Los métodos para inmovilizar a la proteína Langerina a una matriz incluyen, sin limitación, adhesión directa al plástico, uso de un anticuerpo de captura, acopladores químicos y biotina-avidina. El último paso en este método implica la precipitación del complejo proteína-proteína por cualquiera de los varios métodos incluyendo aquellos que utilizan, por ejemplo, un solvente orgánico tal como el polietilenglicol, o una sal tal como el sulfato de amonio. Otras técnicas de separación adecuadas incluyen, sin limitación, el método de partículas magnetizables de anticuerpo fluorescente descrito en Rattie, et al. (1984) Clin. Chem. 30:1457-1461 , y el método de separación de partículas magnéticas de doble anticuerpo como se describe en la patente de E.U.A No. 4,659,678, cada una de las cuales está incorporada aquí como referencia.

Los métodos para unir proteínas o sus fragmentos a los diversos marcadores han sido excesivamente reportados en la literatura y no requieren discusión detallada aquí. Muchas de las técnicas implican el uso de grupos carboxilo activados ya sea a través del uso de carbodiimida o de esteres activos para formar enlaces peptídicos, la formación de tioéteres mediante la reacción de un grupo mercapto con un halógeno activado tal como el cloroacetilo, o una olefina activada tal como la maleimida, para la unión, o similares. Las proteínas de fusión también encontrarán uso en estas aplicaciones. Otro aspecto de diagnóstico de esta invención implica el uso de secuencias de oligonucleótidoe o polinucleótidos tomadas de la secuencia de la proteína Langerina. Estas secuencias pueden usarse como sondas para detectar niveles del mensajero al antígeno en muestras de pacientes que se sospecha tienen una condición anormal, por ejemplo, un desorden inmunológico. La preparación de las secuencias de nucleótidos tanto de ARN como de ADN, el marcado de las secuencias, y el tamaño preferido de las secuencias han recibido una amplia descripción y discusión en la literatura. Normalmente una sonda de oligonucleótidos debería tener al menos alrededor de 14 nucleótidos, usualmente al menos alrededor de 18 nucleótidos, y las sondas de polinucleótidos pueden ser mayores a varias kilobases. Varios marcadores pueden emplearse, más comúnmente radionúclidos, particularmente 32P. Sin embargo, también pueden emplearse otras técnicas, tales como el uso de biotina en nucleótidos modificados para la introducción dentro de un polinucleótido. La biotina sirve entonces como el sitio para unión a avidina o anticuerpos, que pueden marcarse con una amplia variedad de marcadores, tales como los radionúclidos, fluorescenos, enzimas o similares. Alternativamente, los anticuerpos pueden emplearse de manera que puedan reconocer dúplex específicos, incluyendo dúplex de ADN, dúplex de ARN y dúplex híbridos de ADN-ARN, o dúplex de proteína-ADN. Los anticuerpos a su vez pueden marcarse y llevar a cabo los ensayos en donde el dúplex esté unido a una superficie, de manera que después de la formación del dúplex en la superficie, la presencia del anticuerpo unido al dúplex pueda detectarse. El uso de sondas al nuevo ARN antisentido puede llevarse a cabo en cualquier técnica convencional tales como la hibridación de ácidos nucleicos, selección positiva y negativa, sondas recombinantes, liberación traduccional del híbrido (HRT), y arresto en la traducción del híbrido (HART). Esta también incluye técnicas de amplificación tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). También están contemplados los equipos de diagnóstico los cuales prueban también la presencia cuantitativa o cualitativa de otros marcadores. El diagnóstico o la prognosis puede depender de la combinación de indicaciones múltiples usadas como marcadores. Así, los equipos pueden ensayar la combinación de marcadores. Ver, por ejemplo, Viallet, et al. (1989) Progress in Growth Factor Res. 1 :89-97.

X. Aislamiento de los elementos de unión específicos a Lanqerina La descripción de la proteína de Langerina aquí provee los medios para identificar los ligandos a Langerina o los agentes de unión, como se describió anteriormente. Dichos ligando o agentes de unión deben unirse específicamente, por ejemplo, selectivamente, a la Langerina o fragmentos de la misma razonablemente con alta afinidad. Las constantes de unión típicas para ligandos o agentes de unión serán de al menos alrededor de 30 mM, por ejemplo, generalmente de al menos de 3 mM, más generalmente de al menos de 300 µM, típicamente de al menos de 30 µM, 3 µM, 300 nM, 30 nM, etc. Varias construcciones se han hecho disponibles las cuales permiten ya sea el marcado de Langerina para detectar sus ligandos o los agentes de unión, por ejemplo, la Langerina marcada directamente, fusionadas sobre marcadores para marcadores secundarios, es decir, BANDERA u otros epítopes anexos, etc, permitirán la detección de un agente de unión o ligando. Este puede ser histológico, como método de afinidad para purificación bioquímica, o para el marcado o selección en un método de clonación de expresión. Los sistemas de selección de doble híbrido también pueden ser aplicables haciendo apropiadas las construcciones con la disponibilidad de las secuencias de Langerina. Ver, por ejemplo, Fields y Song (1989) Nature 340:245-246. La proteína Langerina debería interaccionar con el ligando base, es decir, sobre su similaridad en estructura y función a otros marcadores celulares que exhiben especificidad de tipo celular y de desarrollo para la expresión. Los métodos para aislar un ligando se han hecho disponibles mediante la capacidad de purificar Langerina para programas de selección. Las construcciones solubles o de otros tipos usando secuencias de Langerina provistas aquí permitirán la selección o aislamiento de ligandos específicos a Langerina. Generalmente, la descripción de Langerinas será análogamente aplicable a las modalidades específicas individuales dirigidas a Langerina y/o reactivo de Langerina y composiciones. Sin elaboración posterior, se cree que una persona con habilidades ordinarias en la técnica puede, usando la descripción precedente, utilizar la invención presente hasta su mayor grado. Los siguientes ejemplo se proporcionan con el propósito de ilustración y para hacer y usar !a presente invención, y no se pretende, ni deben ser construidos, para limitar el alcance de lo que los inventores ven como su invención. A menos que se indique, partes son partes por peso, peso molecular es peso molecular promedio, temperatura es en grado centígrados, y presión es cercana a la atmosférica.

EJEMPLOS Métodos generales Algunos de los métodos estándar se describen en las referencias, por ejemplo, en Maniatis, et al. (1982) Molecular Cloninq, A Laboratorv Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press; Sambrook, et al. (1989) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual (2d ed.), vols 1-3, CSH Press, NY; Ausubel, et al., Bioloqy, Greene Publishing Associates, Brooklyn, NY; o Ausubel, et al. (1987 y Suplementos) Current Protocols in Molecular Bioloqy Greene/Wilev, New York; Innis, et al. (eds. 1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Aplications Academic Press, N.Y.; todas las cuales están incorporadas aquí como referencias. Los métodos para la purificación de proteínas incluyen aquellos métodos como la precipitación con sulfato de amonio, cromatografía en columna, electroforesis, centrifugación, cristalización, y otros. Ver, por ejemplo, Ausubel, et al. (1987 y suplementos periódicos); Deutscher (1990) "Guide to Protein Purification, "Methods in Enzimoloqy vol. 182, y otros volúmenes en esta serie; Coligan, et al. (1995 y suplementos) Current Protocols in Protein Science John Wiley y Sons, New York, NY; Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to Proteín and Peptide Purification for Microsequencinq, Academic Press, San Diego, CA; y la literatura de los fabricantes sobre el uso de productos de purificación de proteínas, es decir, Pharmacia, Piscataway, NJ, o Bio-Rad, Richmond, CA. La combinación con técnicas recombinantes permite la fusión de segmentos apropiados, es decir, a una secuencia BANDERA o a un equivalente el cual puede fusionarse vía una secuencia removible por proteasas. Ver, por ejemplo, Hochuli (1989) Chemische Industrie 12:69-70; Hochuli (1990) "Purification of Recombinant Proteins with Metal Chelate Absorbent" en Setlow (ed.) Genetic Engineering, Principie and Methods 12:87-98, Plenum Press, N.Y.; y Crowe, et al. (1992) QIA express: The High Level Expression & Protein Purification System QUIAGEN, Inc., Chatsworth, CA., las cuales son incorporadas aquí como referencias. Los análisis FACS se describen en Melamed, et al. (1990) Flow Cytometrv and Sortinq Wiley-Liss, Inc., New York, NY; Shapiro (1988) Practical Flow Cvtometrv Liss, New York, NY; y Robinson, et al. (1993) Handbook of Flow Cvtometrv Methods Wilev-Liss, New York, NY.

EJEMPLO 1 Clonas de las células dendríticas Colección v purificación de sangre del cordón umbilical CD34* HPC. Las muestras de sangre de cordón umbilical se obtuvieron de acuerdo a las guías institucionales estándar para muestras humanas. Las células que llevaban al antígeno CD34 se aislaron de las fracciones mononucleares mediante selección positiva con columnas de separación Minimacs (Mitenyi biotec, Bergish Gladbach, Germany), usando un anticuerpo monoclonal anti-CD34 (lmmu-133.3, Immunotech, Marseille, Francia) y microcamas cubiertas de IgG de cabra anti-ratón (Miltenyi Biotec). En todos los experimentos, las células aisladas fueron 80-99% CD34+ como se juzgó mediante tinción con anticuerpo monoclonal anti-CD34.

Factores Hematopoiéticos Las (rh) GM-CSF recombinantes humanas (rh) (actividad específica: 2x106 U-mg; Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ) se usaron a 100 ng/ml (200 U/ml); rhTNF-a (actividad específica: 2x107 U/mg; Genzyme, Boston, MA) se usaron a 2.5 ng/ml (50 U/ml); rhSCF (actividad específica: 4x105 U/mg; R&D, Abington, REINO UNIDO) se usaron a 25 ng/ml; rhlL-4 (actividad específica: 107 U/mg; Schering-Plough Research Institute) se usaron a 5 ng/ml; y rhTGF-ß1 (R&D) se usaron a 1 ng/ml.

Generación de células dendríticas de CD34* HPC Los cultivos de CD34+ HPC se estabilizaron como se describió en Caux, et al. (1992) Nature 392:258-261 , en la presencia de GM-CSF, SCF, y TNF- , en medio libre de endotoxinas que consistía de RPMI 1640 (Gibco BRI, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero fetal bovino inactivado con calor (FBS; Flow Laboratories, Irvine, REINO UNIDO), 10mM Hepes, 2mM L-glutamine, 5x10"5 M 2-mercaptoetanol y gentamicina (80 µg/ml) (referido como medio completo). Las células CD34+ HPC se sembraron en 25 a 75 cm2 de frascos de cultivo (Corning, New York; NY) a 2x104 células/ml. Las condiciones óptimas se mantuvieron mediante cultivos en división al día 4 con medio fresco que contenía GM-CSF y TNF-a. En algunos experimentos, el TNF-a se reemplazó al día 7 por TGF-ß. En otros experimentos, las DC se activaron al día 9 o al día 12 con células L fibroblasticas Ltk transfectadas establemente con el gen de ligando humano CD40 (L) (línea celular establecida por Dr. C. van Kooten (van Kooten, et al. (1994) Eur J Immunol 24:787-92). Brevemente, 105 células CD40L irradiadas (7,500 rads) se sembraron juntas con 5x105 DC derivadas de CD34 en presencia de GM-CSF.

Aislamiento de células epidérmicas Las suspensiones de células epidérmicas se obtuvieron a partir de piel normal de pacientes que llevaban a cabo cirugía plástica reconstructiva del pecho. La piel se cortó en secciones con un equipo keratome y las secciones dermoepidérmicas se trataron por 18 h a 4°C con 0.05% tripsina (Sigma) en solución salina balanceada de Hank's sin Ca2+ y Mg2+ (Seromed, Biochrom KG, Berlín, FRG). La epidermis se separó de la dermis con fórceps finos. Las suspensiones de las células de la capa epidérmica se obtuvieron mediante dislocación y filtración de los tejidos subsecuentes a través de una gasa estéril. El enriquecimiento de células de Langerhans se obtuvo mediante centrifugación en gradientes de densidad sobre Lymphoprep (Nycomed Pharma, Oslo, Noruega).

EJEMPLO 2 Anticuerpos y citometría de flujo Para la tinción de células únicas, las células se marcaron usando los siguientes mAbs: anti-E-caderina (SHE 79.7; Takara, Shiga, Japan), anti-MHC clase II (HLA-DR) (Becton Dickinson), y anti-Lag, todos se revelaron mediante inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con FITC (Dako, Glostrup, Denmark). Para doble tinción, las células se marcaron con mAb DCGM4 reveladas mediante inmunoglobulina de cabra anti-ratón conjugada con ficoeritrina (PE) (Dako), y después de la saturación en 5% de suero de ratón, con anti-CD1a conjugado con FITC (Ortho, Raritan, NJ). Los controles negativos se llevaron a cabo con mAbs murinos no relacionados. La fluorescencia se determinó con citometría de flujo FACSCAN (Becton Dickinson). Para el fenotipo intracitoplásmico, las células se tiñeron en PBS, 0.3% Saponina (Sigma) y 5% BSA usando el mismo procedimiento.

EJEMPLO 3 Bioquímica Las proteínas fueron extraídas de DC derivadas de CD34 suplementadas con TGF-ß mediante adición, a una pastilla congelada de 100 µl/107 células, 50 mM de amortiguador Tris-HCL pH 8 con 150 mM NaCI, 5mM EDTA, 1 % Tritón x 100 e inhibidor de proteasa (Mini completo, Boeringer Mannheim). Después de 1 h a 4°C, las muestras se centrifugaron para remover los remanentes celulares. Los sobrenadantes se incubaron 1 h a 4°C con DCGM4 covalentemente unido a camas magnéticas de Dynabeads M-450 oveja anti-ratón (Dynal, Oslo, Noruega). Las camas se lavaron con amortiguador de extracción mediante el uso de un concentrador de partículas magnéticas Dynal y se hirvieron en la presencia de 50 µl de amortiguador de muestra SDS-PAGE o se resuspendieron en 100 µl de 0.5 M Glicina, 0.15 M NaCI pH 2.3 durante 4 minutos. Entonces, los sobrenadantes se neutralizaron con 3.5 µl de solución saturada Tris. El análisis SDS-PAGE se llevó a cabo con un PhastSystem en un gel de gradiente 10-15% (Pharmacia Biotech), y los geles se tiñeron con Coomassie R250. Los análisis 2-D se llevaron a cabo en un sistema de cama plana Multiphor II con Immobiline DryStrip pH 3-10 y Excelgel SDS 8-18% para la segunda dimensión (Pharmacia Biotech), y los geles se tiñeron con plata. Las muestras dializadas de las proteínas eluídas de IgG unidas a Dynabeads se digirieron con N-glucosidasa F (Boehringer-Mannheim) a 37°C durante toda la noche. Se depositaron 5 microlitros de las muestras originales o 10 microlitros de las muestras digeridas sobre nitrocelulosa, y se trataron con el equipo de detección de glucanos DIG (Boehrínger-Mannheim).

EJEMPLO 4 Purificación de Lanqerina Las células que expresan DCGM4 se usaron para la extracción de proteínas a gran escala. La proteína se solubilizó gentilmente, y la Langerina resultante se purificó usando los métodos estándar de purificación de proteínas. Se usaron métodos cromatográficos, y pudieron aplicarse las técnicas de inmunoafinidad. La proteína Langerina se siguió mediante SDS PAGE y/o inmunoensayos. Se usaron métodos diagnósticos para asegurar que la proteína estaba sustancialmente pura. La proteína purificada se usó para microsecuenciación de proteína. Ver, por ejemplo Matsudaira (ed. 1993) A Practical Guide to Protein and Peptide Purificatión for Microsequencing, Academíc Press, San Diego, CA. Los datos de la secuencia se usaron para buscar secuencias en las bases de datos, por ejemplo, GENBANK, para encontrar genes naturales que codifiquen la Langerina. Alternativamente, los datos de la secuencia fueron útiles para el aislamiento de ácidos nucleicos que codifican para Langerina usando, por ejemplo, iniciadores degenerados de PCR, etc. La proteína será usada para crecer anticuerpos adicionales.

Dichos cuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. La proteína puede usarse para ensayar y para determinar el título y la afinidad. Los métodos estándar de inmunización son disponibles, como se describió anteriormente.

EJEMPLO 5 Ensayo de internalización Las DC derivadas de CD34 suplementadas con TGF-ß se generaron como se detalló anteriormente y la ¡ntemalización se llevó a cabo como se describió (Celia, et al. (1997) J. Exp. Med. 185:1743-51 ). Se fijó una alícuota de células con RPMI, 0.1% glutaraldehído durante 5 minutos a temperatura ambiente y otra alícuota se usó sin fijar. Ambas muestras se tiñeron con mAb DCGM4 o mAb DCGM1 durante 40 min. en hielo, y se incubaron con IgG de cabra anti-ratón F (ab') 2 marcado con boitina (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) durante 1 hr en hielo. Las células se colocaron en un baño de agua a 37°C durante periodos de tiempos variables, enfriada sobre hielo y teñidas con PE-conjugado con estreptavidina (Becton Dickinson). Después del lavado, las células se analizaron mediante FACS. Las medidas de internalización se dan como el porcentaje de decremento de la intensidad de fluorescencia media en la superficie celular (MFI) en comparación con las muestras control mantenidas a 4°C. El porcentaje de decremento de MFI observado en las células fijadas se tomó como la medida de la tasa cero del anticuerpo a 37°C. los análisis de regresión lineal de las gráficas de Iog10" (porcentaje de fluorescencia media) contra tiempo se llevaron a cabo y las tasas de ingestión (K) y vida media (H/2) de los complejos unidos a la membrana se calcularon para la curva (m) de la línea recta resultante usando las relaciones k(%/m¡n)=-2,303m x 100, y l1/2 (min) = log2/m (Leslie, EJI 1980). En ésta el mAb DCGM1 el cual reconoce al receptor de mannosa de macrófagos se generó por los Solicitantes, y se usó como control positivo para la endocitosis mediada por receptor.

EJEMPLO 6 Generación y caracterización de anticuerpos monoclonales DCGM4 Los ratones BALB/c (Iffa Credo, Les Oncins, Francia) se inmunizaron con tres inyecciones i ntra perifonea I es de DC derivadas de CD34 (106 células) con adyuvante de Freund. (Sigma Chemical Co.,St. Louis, Mo). Tres días después de la inyección final, los esplenocitos se fusionaron con la línea celular de mielona murino SP2, usando polietilenglicol-1 ,000 (Sigma). ?_as células híbridas se colocaron en cajas de cultivo de tejidos Falcon de 96 pozos (Falcon, Lincoln Park, NJ) y se alimentaron con DMEM F12 (Life Technologies, Gaithersburg, MD) suplementado con estreptomicina (100 µg/ml), penicilina (100 u/ml), glutamina (2 mM), 10% suero de caballo (Life Technologies), 1% aditivo de medio de cultivo (CRTS, Lyon, Francia), 10-5M azacerina (Sigma), y 5 x 10"5M de hipoxantina. Los sobrenadantes se seleccionaron por su reactividad con DC derivado de CD34 y tres tipos celulares no relacionados, éstos fueron células polinucleares de sangre periférica, linfocitos T activados con PHA, y línea celular mieloide KGI (ATCC; Rockville, MD). Los hibridomas seleccionados se clonaron mediante dilución limitante y se produjeron ascitos en ratones BALB/c. El Mab DCGM4 se purificó mediante cromatografía de intercambio aniónico sobre DEAE A50 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y se acopló con fluoresceína y biotina usando procedimientos estándar. El isotipo de la Ig se determinó mediante ELISA usando un equipo de subtipos de Hibridoma de ratón (Boehringer-Mannheim, Germany).

EJEMPLO 7 Inmunohistoloqía Portaobjetos para microscopio con secciones de tejido crioseccionado fijados en acetona o preparaciones de células centrifugadas se incubaron con mAbs durante 60 min., y subsecuentemente con Ig de oveja anti-ratón biotinilada (El Sitio de Unión, Birmingham, Reino Unido) durante 30 min. siguiendo a la incubación con estreptavidina acoplada a fosfatasa alcalina (Biosource, CA, USA) durante 30 min., la actividad enzimatica se desarrolló usando substrato rojo rápido (Dako). Se hizo una doble tinción, con anticuerpo DCGM4 de lgG1 de ratón y lgG2b anti-CD1a (Immunotech) se revelaron mediante lgG1 de oveja anti-ratón (El Sitio de Unión) seguido por los complejos fosfatasa alcalina-antifosfatasa alcalina (Dako) (técnica APAAP), lgG2b biotinilado de oveja anti-ratón (El Sitio de Unión) seguido por ExtrAvidina-peroxidasa (Sigma). La unión de anti-sIgD-biotina de cabra y DCGM4-biotina (para la doble tinción con Lag), se revelaron directamente mediante ExtrAvidina-peroxidasa. La actividad de fosfatasa alcalina y la actividad peroxidasa se demostraron respectivamente usando el substrato azul rápido (Sigma) y 3 -amino-etilcarbazol (Sigma).

EJEMPLO 8 Microscopía electrónica Las suspenciones de células epidérmicas enriquecidas con células de Langerhans se incubaron con lgG1 (Sigma) de ratón, anti-CD1a (DMC1 mAb; REF), o DCGM4 durante 1 h a 4°C. después del lavado, las células se incubaron con IgG de cabra anti-ratcn conjugado con partículas de oro coloidal de 5 nm (GAM-nM) (Amersham, sede Francia) durante 30 min. a 4°C las células se fijaron inmediatamente durante 18 horas con 2% de glutaraldehído en amortiguador de cacodilato, seguido por un lavado durante al menos 24 h en amortiguador de cacodilato con sacarosa, o se calentaron a 37°C o a temperatura ambiente antes de la fijación. Las muestras se postfijaron por 1 hora con 1 % osmio en amortiguador de cacodilato con sacarosa, se deshidrataron y se embebieron en resina epóxica. Las secciones ultrafinas se postiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo, y se examinaron en un microscopio electrónico JEOL 1 ,200 EX (CMEABG, Université de Lyon, Lyon, Francia). Se llevo a cabo una evaluación cuantitativa de la densidad de antígeno en superficie celular de acuerdo a Lafferty, et al. (1981 ) J. Histochem Cytochem 29:49-56. Se contó el numero de granulos de oro unidos a lo largo de la membrana celular y la circunferencia total de la célula se medió sobre micrografias con un analizador minimop (Zeiss). Los resultados se expresaron como números de granulos de oro por 100 µm de membrana celular. Para cada grupo de células, se obtuvieron los conteos de al menos 20-30 secciones celulares. La media y la desviación estándar se determinaron subsecuentemente.

EJEMPLO 9 Microscopía confocal La tinción por immunofluorescencia intracelular se llevó a cabo como se describió previamente por Winzler et al. (1997) J. Exp. Med. 185:317-28. Las células sobre cubreobjetos cubiertos con polilisina y fijados durante 15 min. con 4% de paraformaldehído se lavaron en 10 mM glicina, entonces se permeabilizaron con 0.5% saponina, 0.2% BSA durante 30 min. Los cubreobjetos se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con anti-LAMP-1 (Pharmingen, San Diego, CA), anti-HLA-DR (Becton Dickinson) o anti-Lag (KAshishara, et al. J Invest Dermatol 87:603-607) a una concentración final de 5µg/ml en medio de permeabilización. Después de tres lavados, las células se incubaron durante 30 min. con un anticuerpo secundario marcado (burro anti-ratón acoplado a rojo-Texas (Vector Laboratories, Burlingame, CA), se lavaron y se incubaron con suero preinmune de ratón durante 30 min., se lavaron de nuevo, se postfijaron con 2% de paraformaldehído, y finalmente se incubaron durante 30 min con DCGNM4 acoplado a fluoresceína (FITC). Después de los lavados, los cubreobjetos se montaron sobre portaobjetos de vidrio con fluoromount (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL). La microscopía confocal se llevó a cabo usando el microscopio de barrido confocal lasser TCS 4D (Leica Lasertechnik GmbH, Heidelberg, Germany) con interfase de láser de iones de argón/criptón y filtros de fluorescencia y sectores que permitieron el registro simultáneamente de FITC y de marcadores rojo-texas Rovere, et al. (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. E.U.A. 95:1067-1072.

EJEMPL0 10 Selección del anticuerpo monoclonal DCGM4 reactivo contra la Lanqerina Los sobrenadantes de 854 hibridomas se seleccionaron por su reactividad sobre DC obtenidas de CD34+ HPC cultivadas durante 12 días en GM-CSF y TNF-a. En paralelo, los sobrenadantes se ensayaron por su reactividad sobre tres tipos celulares no relacionados, éstos son células polinucleares sanguíneas periféricas, linfocitos T activados con PHA y la línea celular mieloide KG1. El sobrenadante de un híbridoma, designado DCGM4 se encontró reactivo solamente con una subpoblación menor de DC y no con los otros tipos celulares de la selección diferencial. El hibridoma se clonó mediante dilución limitante. El anticuerpo se produjo en ascitos y subsecuentemente se purificó usando cromatografía DEAE. El MAb DCGM4 se encontró estar en el isotipo lgG1/k como se determinó mediante ELISA. Conforme la reactividad observada restringida a la subpoblación de DC apareció de particular interés, el mAb DCGM4 se seleccionó para análisis posteriores. Finalmente, los experimentos iniciales indican que LC fueron positivas a la tinción; los inventores denominaron Langerina al antígeno reconocido por mAb DCGM4.

EJEMPLO 11 Lanqerina se expresó selectivamente en células dendríticas inmaduras tipo Lanqerhans Las HPC CD34+ cultivadas con una combinación de GM-CSF y TNF-a durante 12 días se diferenciaron hacia CD1a+ DC (Caux, et al. (1996) J. Exp Med 184:695-706). La expresión de Langerina durante dicho cultivo se investigó. La Langerina se expresó mediante una subpoblación de células dendríticas CD1a+ derivadas de sangre del cordón umbilical HPC CD34+. La cinética de CD1 a y la expresión de Langerina durante el cultivo de HPC CD34+ en GM-CSF más TNF-a se determinó a varios tiempos, las células se recuperaron y se marcaron doblemente usando anti-CD1a-FITC y DCGM4 más IgG-PE anti-ratón. Los resultados son representativos de 5 experimentos. Ninguna tinción se detectó al día 0 o día 6, indicando que HPC CD34+ y su progenie inmediata no expresan Langerina. El antígeno apareció al día 7, en una pequeña subpoblación de células CD1a+. Entre los días 7 al día 12, la expresión de Langerina alcanzó un máximo, tiñendo entre 15 a 35% de células CD1 a+. La naturaleza dendrítica de las células que expresan Langerina en los cultivos se confirmó en preparaciones centrifugadas de células DCGM4+ seleccionadas por FACS. Caux, et al. (1996) J. Exp. Med. 184-706 ha mostrado además que HPC CD34+ se diferencian a lo largo de dos rutas independientes a partir de subpoblaciones de precursores distintos, identificados mediante expresión exclusiva mutuamente de CD1a y CD14 en tiempos tempranos durante el cultivo (día 5-7). Cuando dichos precursores se separaron mediante selección-FACS al día 6 y se cultivaron con GM-CSF y TNF-a durante 6 días más, !a Langerina se expresó mayormente en DC derivadas de CD1 a .(40%) en comparación con las DC derivadas de CD124 (16%). Las DC derivadas de CD1a han mostrado que exhiben características que están asociadas con las células de Langerhans, incluyendo la presencia de granulos de Birbeck. Siguiente, la distribución in situ de Langerina se examinó mediante análisis inmunohistológico de varios tejidos humanos. La Lagerina se expresó selectivamente mediante DC similares al LC. Los análisis inmunohistológicos de la expresión de Langerina se hicieron sobre secciones de piel, amígdala y pulmón. Dentro de la epidermis, la Langerina se encontró solamente en LC, las cuales también se tiñen con anticuerpos a anti-lag y anti-CD1a. En la piel, la tinción con mAb DCGM4, o mAb DCGM4 más anti-Lag o anti-CD1a, mostró la expresión de Langerina positiva por LC. En la amígdala, las células positivas a Langerina se encontraron en el epitelio (es decir, sobre el manto folicular de las células B). Unas pocas células se tiñeron ocasionalmente en las áreas de las células T, pero nunca se observaron en los centros germinales de las células Langerina+ en donde también fue notable la presencia en el epitelio de pulmón. En el pulmón, los mAb DCGM4 y contrateñidos con hematoxilina mostraron células Langerina+ similares a LC solamente en el epitelio bronquiolar. Las DC Langerina+ mostraron morfología dendrítica. Ninguna tinción se detectó con los mAbs control. Estos resultados fueron representativos de 5 experimentos. A diferencia de las DC derivadas de CD34, mAb DCGM4 no reaccionó con DC obtenidas de monocitos de sangre periférica cultivadas 6 días con una combinación de GM-CSF y IL-4, entonces, más adelante se confirmó la restricción de la expresión de Langerina. Similarmente, la Langerina no se detectó en los aislados de DC purificados ex-wVo de sangre periférica, ni en los centros germinales de DC aislados de la amígdala. Finalmente, mAb DCGM4 se analizó por su reactividad sobre un panel de diferentes tipos celulares derivados hematopoyéticamente. La Langerina no se detectó ni en los aislados ex-wVo de linfocitos T, linfocitos B, monocitos o granulocitos, ni en líneas celulares mieloides (HL60, KG1 , U937, THP1 ) o linfoides (Jurkat, JY, PREALP). Tomados en conjunto, los datos anteriores sugieren que la expresión de Langerina está restringida a un compartimento de DC inmaduras, y que subsecuentemente se pierde durante la maduración de DC.

EJEMPLO 12 La expresión de Lanqerina es regulada por TGF-ß y decrece siguiendo a la activación de CD40 Puesto que el mAb DCGM4 se encontró reactivo selectivamente con células DC inmaduras semejantes a LC, se investigó si los factores que influyen sobre la maduración DC podrían afectar los niveles de expresión de la Langerina. Los estudios in vitro e in vivo han mostrado que el TGF-ß juega un papel esencial en el desarrollo de LC. Por lo tanto, se evaluó el efecto de TGF-ß sobre la expresión de Langerina mediante DC derivadas de cultivo in vitro. Para hacer esto, las células del cordón umbilical HPC CD34+ se cultivaron durante 12 días en GM-CSF y TNF-a en ausencia o presencia de TGF-ß del día 7 al día 12. Subsecuentemente, las DC se cultivaron con células L transfectadas con CD40L durante 2 días. Las células se procesaron para tinción sin o después del pretratamiento con 0.1 % saponina, usando mAbs revelados mediante Ig anti-ratón conjugada con FITC. Los resultados son representativos de más de 5 experimentos. Las DC derivadas de CD34 se complementaron con TGF-ß durante los últimos tres días de cultivo (día 9-12). Esto resultó en una fuerte regulación de la expresión de Langerina. Además, para incrementar la proporción de células Langerin+, el TGF-ß incrementó el número medio de moléculas de superficie membranal por célula (93 x 103 en lugar de 33 x 103 sin TGF-ß). El efecto de TGF-ß se ejerció predominantemente sobre las DC derivadas de CD14, normalmente carentes de marcadores Langerhans tales como los granulos de Birbeck asociados con el antígeno Lag. La expresión de Langerina no se restringió a la membrana plasmática, pero también se detectó ¡ntracelularmente siguiendo a la permeabilización membranal. Los niveles de Langerina intracelular también mejoraron marcadamente mediante TGF-ß. También se encontró que aunque el TGF-ß incrementa también la expresión de los marcadores en LC Lag y E-caderina, Lag nunca se detectó en la superficie celular. La remoción de TNF-a, una atocina que se sabe induce la maduración de DC, por lo últimos tres días de cultivo, reguló la expresión de Langerina ya sea en la presencia o ausencia de TGF-ß. En esta línea con estos resultados, un fuerte decremento en la expresión de Langerina de superficie membranal se encontró asociada con un incremento de HLA-DR siguiendo a la activación con CD40L, una señal que dispara la maduración de DC que incluye la regulación de moléculas co-estimulatorias. Juntos, estos resultados confirman que el TGF-ß que induce un fenotipo en LC regula la expresión de Langerina, mientras que las señales que disparan la maduración de DC decresen la expresión de Langerina.

EJEMPLO 13 La Langerina intracelular y Lag co-localizan en DC inmaduras, pero se disocian una vez que se lleva a cabo la activación.

Una característica única de las células de Langerhans es la presencia de granulos de Birbeck intracitoplásmicos (BG). Puesto que la Langerina se encontró selectivamente expresada en DC tipo Langerhans, su relación con el antígeno Lag se examinó además. Así, las DC derivadas de CD34 suplementadas con TGF-ß, y las cuales contenían una alta proporción de células BG+ como se detectó mediante microscopía electrónica, se analizaron mediante tinción de doble fluorescencia y microscopía confocal. Las células DC derivadas de CD34 se suplementaron con TGF-ß del día 7 al día 9 de cultivo. La microscopía de barrido con láser confocal de doble tinción se llevó a cabo al día 9 y después de dos días subsecuentes a la activación de CD40L. Las vesículas positivas a Langerina y positivas a Lag se encontraron co-localizadas en las DC inmaduras del día 9. Después de la activación de CD40L, la tinción Langerina+Lag" se encontró cerca del núcleo. No se detectó ninguna co-localizacion entre langerina y HLA-DR o LAMP-1 , prescindiendo de la activación CD40L. La langerina y el Lag se encontró que exhiben una co-localización intracelular considerable. Sin embargo y sorprendentemente, la localización de los dos marcadores de segregó después de la activación con CD40L. Así, la langerina se encontró en la ausencia de Lag en cercana proximidad al núcleo, mientras que la expresión co-localizada de los dos marcadores solamente permaneció inmediatamente por debajo de la superficie de la membrana. Estos resultados indican que la Langerina es distinta al Lag, y que la Langerina se dirige hacia un compartimento celular profundo durante la activación DC. Finalmente, la Langerina nunca se encontró que co-localizara con el marcador lisosomal LAMP-1 , ni con HLA-DR, sin considerar la activación mediante entrecruzamiento de CD40.

EJEMPLO 14 La lanqerina se asoció con estructuras endocíticas y granulos de Birbeck Puesto que la Langerina se expresó en la superficie celular (como se detectó mediante FACS en la ausencia de permeabilización de membrana) se llevó a cabo microscopía electrónica sobre las suspensiones de células epidérmicas para analizar su distribución precisa. Las células de Langerhans son fácilmente reconocibles en dichas suspenciones, por su núcleo plegado, carencia de filamentos de queratina, pérdida de desmosomas y melamosomas, y la presencia de BG característicos. Una suspensión de células epidérmicas se obtuvo como se describió anteriormente. Los mAbs fueron revelados mediante lgG1 de cabra anti-ratón marcados con oro de 5 nm. CD1 a está homogéneamente distribuido en la superficie celular, en donde la Langerina frecuentemente se asoció con áreas de engrasamiento de la membrana. Las estructuras engrosadas en las citomembranas y las vesículas cubiertas se visualizaron después de la tinción con DCGM4 a 4°C. Después de la incubación a 37°C, se observaron las vesículas cubiertas que contenían partículas de oro citoplásmico y los granulos de Birbeck. La tinción con DCGM4 y partículas de oro se revelaron en el lado luminal de BG. Estos resultados fueron representativos de tres experimentos en muestras de piel diferentes. La tinción a 4°C con DCGM4 y partículas de oro de 5nm confirmaron que la Langerina está claramente asociada con la superficie celular en LC, aunque a densidades menores que CD1a (161.5 ± 97.1 contra 1589.1 ± 418.8 granulos de oro/100 µm membrana). Además de las partículas de oro particulares, un agrupamiento espontáneo se observó con DCGM4, aún cuando se pensó que el anticuerpo se había centrifugado. Un isotipo apareado con el lgG1 de ratón control no se unió a LC (1.3 ± 3.4 gránulos/100 µm). Ninguna marca de DCGM4 se observó en los queratinocitos o melanocitos presentes en las suspenciones celulares epidérmicas. Como se comparó con la distribución homogénea de CD1a, la Langerina no se distribuyó homogéneamente en la superficie celular, sino que frecuentemente se asoció con áreas particulares de engrasamiento de la membrana. Además, el DCGM4 indujo vesículas endocíticas cubiertas típicas de la membrana celular a 4°C. El número de vesículas cubiertas se mejoró significativamente (un promedio de 3.6 veces) mediante DCGM4, como se comparó con la tinción con anti-CD1a o el control de lgG1 de ratón.

Notablemente, las vesículas cubiertas inducidas durante la tinción con DCGM4 contenían partículas de oro. Además, cuando las células se les permitió elevar la temperatura antes de la fijación, la tinción con DCGM4 se observó dentro de las vesículas cubiertas después de 2 min. a 37°C. Estos datos demuestran que la Langerina se asoció con estructuras características de los primeros pasos de endocitosis mediada por receptores. La tinción con DCGM4 a 4°C también resultó en la formación de estructuras engrosadas en la citomembrana en la superficie celular.

Consistentemente, siguiendo al DCGM4 a 4°C, los BG marcados con oro se observaron en continuidad con la membrana celular, y se encontraron dentro del citoplasma cuando las células se calentaron arriba de 37°C durante 2 min.

Los BG se marcaron en sus lámelas estriadas centrales o en el bulbo. Tomados en conjunto, estos resultados indican que la Langerina se asoció con estructuras endocíticas y que también puede tener acceso a los granulos de Birbeck de la membrana celular.

EJEMPLO 15 La lanqerina media la internacionalización rápida en DC Para examinar más el papel de la Langerina en la endocitosis, nosotros analizamos su capacidad para internalizar DCGM4 como ligando. Las DC derivadas de CD34 suplementadas con TGF-ß se marcaron a 4°C con mAbs y subsecuentemente se bíotinilaron con un anticuerpo secundario F(ab')2. Las células se incubaron a 37°C durante períodos de tiempo indicados y se midió la internalización como decremento de anticuerpo unido a la superficie determinado mediante el análisis de FACS usando conjugados de estreptavidina-PE. El MAb DCGM4 se internalizó rápidamente a 37°C, con cinética similar como un mAb receptor de anti-manosa (control positivo). En las células fijadas, no se detectó ningún decremento en la fluorescencia de la superficie celular. Los resultados se analizaron como porcentaje de decremento de la intensidad de fluorescencia media (MFI), en comparación con las muestras control mantenidas a 4°C. Se encontró que el anticuerpo fue muy rápidamente internalizado mediante DC a 37°C, pero no a 4°C. Aproximadamente 75% de! DCGM4 unido a la superficie membranal se internalizó completamente en un minuto a 37°C, con cinética similar a la del receptor de anti-manosa mAb DCGM1 , usado como control positivo para la endocitosis mediada por receptor. En un experimento representativo, la vida media (t ?) de DCGM4 en la citomembrana se calculó ser de 4.5 minutos a 37°C, con una tasa de ¡nternalización de k=15.3%/min. La desaparición rápida del mAb DCGM4 de la superficie celular no se debió a la disociación del anticuerpo, puesto que no se observó decremento en la fluorescencia en DC fijadas con glutaraldehído incubadas a 37°C. Finalmente, la Langerina no exhibió especificidad del receptor de tipo mañosa, como el DCGM4 falló para inhibir la toma de Dextrán-FITC a 37°C y la unión del anticuerpo no se inhibió mediante manan a 4°C.

Estos resultados están de acuerdo con los análisis de microscopía electrónica anteriores y demuestran que la Langerina está implicada en el proceso de endocitosis rápida mediante DC.

EJEMPL0 16 La aparición de la lanqerina en la superficie celular resulta en la formación de granulos de Birbeck Puesto que la presencia de Langerina en la superficie celular resultó en la formación de CMS y la detección de BG con oro como se visualizó mediante microscopía electrónica, se investigó el papel potencial de la Langerina en la superficie celular en la formación de BG. Una suspensión celular epidérmica se obtuvo como se describió anteriormente. Las células se incubaron con un exceso de mAb DCGM4 o anti-CD1a a 4°C, y se procesaron inmediatamente para microscopía electrónica, o se dejaron a temperatura ambiente durante 5 min. antes de la fijación. Las LC incubadas con DCGM4 exhibieron una acumulación sorprendente de granulos de Birbeck en la región perinuclear. El efecto se observó predominantemente a 4°C, puesto que el calentamiento subsecuente resulta en vacuolización. El tratamiento con anti-CD1a mAb falló al inducir cambios significativos en el citoplasma de LC, ya sea en las células mantenidas a 4°C o e las que se mantuvieron a temperatura ambiente.

Este tratamiento resultó en un incremento considerable de BG densamente empacados en el citoplasma de LC, con una acumulación marcada en la región perinuclear alrededor de Golgi. Los BG exhibieron una porción en expansión de forma elongada, redonda, o irregular en adición a partes típicas en forma de rodillo. Además, el citoplasma de LC tratadas con DCGM4 se llenó de numerosas vesículas redondas o elongadas. Cuando las LC se calentaron hasta la temperatura ambiente (5 min) siguiendo a la incubación con exceso de DCGM4, se observó un incremento en la fusión entre BG únicos y pequeños en forma de rodillo y los componentes vesiculares grandes. Además, numerosas vesículas de varios tamaños y formas ocuparon un volumen considerable en el citoplasma de LC. En contraste con DCGM4, la incubación de la suspenciones de células epidérmicas con un exceso de anti-CD1a mAb solamente llevó a la formación de algunas vesículas pequeñas pero a ningún otro cambio significativo en el citoplasma de LC. Notablemente, no se observó ninguna acumulación de BG perinucleares, incluso cuando las células se les permitió calentarse antes de la fijación. Similarmente, la incubación con un lgG1 de ratón control o con mAb anti-E-caderina no modificaron los granulos de BG. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que la Langerina de superficie celular participa activamente en la formación de BG resultando en su acumulación perinúclear.

EJEMPLO 17 La Lanqerina es una proteína N-glucosilada de 40 KDa La inmunoprecipitación con DCGM4, a partir de extractos de DC y, la elución subsecuente con SDS-PAGE en amortiguador de muestra produjeron una banda homogénea de 40-42 kDa de masa molecular. El análisis SDS-PAGE de Langerina inmunopurificada en condiciones reductoras y no reductoras se llevó a cabo. Si el DTT se omitió a lo largo de todos los pasos de purificación, el perfil no se modificó en el gel, sugiriendo que la Langerina está presente en la membrana celular como una cadena única o como homodimero con asociaciones no covalentes. Los análisis de 2-D de Langerina inmunopurificada se llevaron a cabo estableciendo la masa molecular de la molécula e indicando que la Langerina tuvo un pl de 5.2-5.5. Finalmente, un análisis de dot-blot de la Langerina usando (1 ) creatinasa de E. coli como control no glucosilado, (2) transferrina como control positivo N-glucosilado, (3) N-glucosidasa, (4) Langerina, y (5) Langerina tratada con N-glucosidada, demostraron que la Langerina es una glucoproteína, y que la mayoría de sus constituyentes carbohidratos se removieron mediante tratamiento con N-glucosilasa.

EJEMPLO 18 Aislamiento de ácido nucleico que codifica para Lanqerina Numerosos métodos están disponibles para aislar un gen que codifique a una proteína purificada especialmente cuando existen anticuerpos que reconocen a la proteína. Un método es determinar los métodos para purificación de la proteína y subsecuentemente determinar la secuencia peptídica. Dando suficiente información de la secuencia y utilizando oligonucleótidos redundantes, las técnicas de PCR o hibridización permitirán el aislamiento de genes que codifiquen las proteínas de Langerina. Otra alternativa es generar anticuerpos adicionales a la proteína Langerina, los cuales pueden aislarse mediante métodos de immunoafinidad usando los anticuerpos DCGM4. Ver anteriormente. Estos anticuerpos son aplicables en la técnicas de "toma panorámica", tales como las descritas por Seed y Aruffo (1987) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:3365-3369. Las técnicas de expresión de fagos también son aplicables para seleccionar genotecas de cDNA derivadas de subpoblaciones de células T o DC apropiadas enriquecidas en la expresión de Langerina. La interferencia de la glucosilación en el reconocimiento de anticuerpos generalmente será menos problemático en los sistemas de selección de fago. También son aplicables las técnicas de clasificación celular en una genoteca de expresión de mamífero. Otro método para la selección y expresión de genotecas es usar anticuerpo para seleccionar subpoblaciones sucesivas de genotecas. Las siguientes proveen un método para seleccionar usando poblaciones pequeñas de células sobre portaobjetos teñidos con una composición de marcado especifico, por ejemplo, un anticuerpo. Por ejemplo, en el día 0, los cubreobjetos de dos cámaras se cubrieron con permanox con 1 mi de fibronectina por cámara, 10 ng/ml en PBS, por 30 min. a temperatura ambiente. Se enjuagaron una vez con PBS.

Entonces se sembraron células COS a 2-3 x 105 de células por cámara en 1.5 mi de medio de crecimiento. Y se incubaron toda la noche a 37°C. En el día 1 por ejemplo se preparará 0.5 mi de una solución de 66 µg/ml DEAE-dextran, 66 µM cloroquina, y 4µg de ADN en DME libre de suero. Para cada prueba, se preparó un control positivo, por ejemplo, de una construcción de cADN de IL-10-BANDERA de humano a diluciones de 1/200 y un control negativo. Las células se enjuagaron con DME libre de suero. Se añadió la solución de ADN y se incubó 5 h a 37°C. Se removió el medio y se añadió 0.5 mi de 10% DMSO en DME durante 2.5 min. Se removió y se lavó una vez con DME. Se añadieron 1.5 mi de medio de crecimiento y se incubaron durante la noche. En el día 2, se cambió el medio. En los días 3 ó 4 las células se fijaron y tiñeron. Se enjuagaron las células dos veces con solución salina amortiguada de Hank's (HBSS) y se fijaron en 4% de paraformaldehído (PFA)/glucosa durante 5 min. Se lavaron 3X con HBSS. Los portaobjetos pudieron almacenarse a -80°C después de la remoción de todo el líquido. Para cada cámara, se llevaron a cabo incubaciones de 0.5 mi como sigue. Se añadió HBSS/saponina (0.1%) con 32µl/ml de 1M NaN3 durante 20 min. las células se lavaron entonces con HBSS/saponina 1X. El anticuerpo soluble, por ejemplo, DCGM4, se añadió a las células y se incubó durante 30 min. Las células se lavaron dos veces con HBSS/saponina. Se añadió el anticuerpo secundario, por ejemplo, anticuerpo Vector anti-ratón a una dilución de 1/200, y se incubó durante 30 min. Se preparó la solución de ELISA, por ejemplo, solución de peroxidasa de rábano Vector Élite ABC, y se preincubó durante 30 min. Usando, por ejemplo, una gota de la solución A(avidina) y una gota de la solución B(biotina) por 2.5 mi de HBSS/saponina. Las células se lavaron dos veces con HBSS/saponina. Se añadió solución de HRP ABC y se incubó durante 30 min. Las células se lavaron dos veces con HBSS, el segundo lavado durante 2 min., el cual cierra las células. Entonces se añadió el vector del ácido diaminobenzoico (DAB) durante 5 a 10 minutos. Usando 2 gotas del amortiguador más 4 gotas del DAB más 2 gotas de H2O2 por 5 mi de agua destilada cristalina. Cuidadosamente se removió la cámara y se enjuagaron los portaobjetos en agua. Se dejaron secar al aire durante unos pocos minutos, entonces se añadió una gota de montura Crystal y un cubreobjetos. Se hornearon durante 5 min. a 85-90°C. Alternativamente, las proteínas de Langerina se usaron para purificar por afinidad o clasificar las células que expresan el ligando. Ver, por ejemplo, Sambrook, et al. (anteriormente mencionado) o Ausubel, et al. , (anteriormente mencionado) ambos están incorporados aquí como referencias EJEMPLO 19 Lanqerina enómica humana Se ha determinado la secuencia genómica (SEQ ID NO:3) y la organización exón-intrón de la Langerina humana. La secuencia genómica incluye la secuencia de cADN de Langerina (SEQ ID NO: 1 ) y 6 exones separados por cinco intrones. La secuencia nucleotídica de exones 1-6 se provee en SEQ ID NOS 4-9 respectivamente. Esta secuencia genómica de 10,663 nucleótidos incluye a los nucleótidos 3251 y 1808 en los extremos 5'y 3 'del exon 1 y 6 respectivamente y se pronosticó que incluye las secuencias del promotor de Langerina humana. El exón 1 (SEQ ID NO: 4) corresponde a las posiciones 3252-3371 de SEQ ID NO: 3. El exón 2 (SEQ ID NO: 5) corresponde a las posiciones 3467-3583 de SEQ ID NO: 3 . El exón 3 (SEQ ID NO: 6) corresponde a las posiciones 5051-5425 de SEQ ID NO: 3. El exón 4 (SEQ ID NO: 7) corresponde a las posiciones 6020-6171 de SEQ ID NO: 3. El exón 5 (SEQ ID NO: 8) corresponde a las posiciones 7252-7370 de SEQ ID NO: 3. El exón 6 (SEQ ID NO: 9) corresponde a las posiciones 7871-8855 de SEQ ID NO: 3. La Langerina humana es una lectina dependiente de Ca++ del tipo II transmembranal de 328 aminoácidos. La traducción de aminoácidos de los 6 exones muestra que el exón 1 codifica para la porción NH2-terminal del dominio intracelular (24 aminoácidos), mientras que tanto la porción proximal a la membrana del dominio intracelular (19 aminoácidos) como el dominio transmembranal entero (20 aminoácido) se codifican por el exón 2. El exón 3 codifica la porción de reconocimiento de tipo no-carbohidrato de la membrana proximal del dominio extracelular (125 aminoácidos). El dominio extracelular de reconocimiento a carbohidratos (CRD) se codifica por las uniones de los exones 4 (51 aminoácidos), 5 (39 aminoácidos) y el inicio del exón 6 (50 aminoácidos) este último terminando la porción -COOH de la molécula. Notablemente, el CRD de Langerina comparte la estructura de tres exones de las otras lectinas transmembranales que incluyen a los receptores de las células de Kuppfer, a la lectina hepática de rata, y al receptor IgE de baja afinidad CD23, con la secuencia codificante interrumpida mediante intrones en posiciones análogas. La disponibilidad de la secuencia de Langerina genómica ahora permite la identificación de elementos promotores de la Langerina humana, que se espera están situados dentro de los nucleótidos 500-600 5' del codón de iniciación ATG en la posición 48 del exón 1. Por analogía, en el receptor de células de Kuppfer de rata, homólogo a la Langerina humana, el sitio de iniciación de la transcripción está situado 51 bases hacia el extremo 5' del codón de inicio de la traducción ATG. Dos secuencias nucleotídicas han sido identificadas hacia 5' en el inicio de la transcripción, que son candidatos para la regulación de la expresión génica. Una es una secuencia repetida concatenada de 54 bases de los nucleótidos -151 al -98 y del -97 al -44, y la otra es una secuencia heptanucleotídica (GAGGCAG) que se encuentra repetida 4 veces en las 380 bases 5' del sitio de unión (G.W. Hoyle and R. L. Hill, J. Biol Chem, 1991 , 266:1850-1857). La Langerina humana se expresa específicamente en las células de Langerhans, un subtipo de células dendríticas inmaduras especializadas en la captura y procesamiento de los antígenos. Así, será factible construir secuencias codificadoras de ADN de antígenos de elección para la expresión selectiva de blancos en las células de Langerhans bajo el control de elementos promotores de la Langerina. Las secuencias de Langerina humana permiten la identificación de la secuencia genómica de Langerina homologa de ratón. Esta información será clave para la construcción de ratones deficientes en el gen de Langerina, para explorar más allá la función de la Langerina y de los granulos de Birbeck, los organelos endocíticos únicos de las células de Langerhans que son inducidos mediante la unión a Langerina. La secuencia de Langerina humana también capacita la secuenciación de mutaciones posibles en el gen de Langerina en los pacientes que sufren de trastornos inmunológicos de etiología desconocida.

EJEMPLO 20 Mapeo cromosomal de la Lanqerina humana La localización cromosomal se llevó a cabo mediante mapeo de la radiación del híbrido (RH) (D.R. Cox et al., Science, 1990, 250: 245-250), usando el panel de radiación híbrida G3 de Stanford (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Brevemente, dos oligonucleótidos (U863 y L1180) usados para amplificar el cADN en Langerina mediante reacción de PCR se seleccionaron puesto que ellos también amplificaron una región de ADN genómico humano. Las reacciones de PCR se llevaron a cabo con U863/L1180 sobre el panel G3 de Stanford en 83 clonas cubriendo el genoma humano. Los datos de PCR se cedieron al Stanford Human Genome Center Rhserver (LIENHYPERTEXTE mailto:rhserver(5)pax¡I.Stanford.edu rhserver(a>paxil.stanford.edu) para el mapeo usando el programa estadístico RHMAP (RHMAP). Los resultados del servidor RH indicaron una cercanía de los marcadores SHGC-58922 (LOD puntaje: 8.67) y SHGC-12714 (LOD puntaje 7.74). Ambos marcadores están localizados sobre el cromosoma 2, unidos al locus GDB D2S292 (SHGC fuente AFH203yb6|: SHGC-1610 marcador microsatelital). Los genes que mapean cerca del locus D2S292 incluyen f: precursores del factor de crecimiento transformante alfa (2p13), dinactina (2p13), la forma gama actina del músculo liso entérico (2p13), anexina IV (2p13), MAD (2p12-13), alfa-CP1 , respuesta de crecimiento temprano 4, nucleolisina TIA-1 , la proteína tirosinfosfatasa P, el substrato 80K-H de la proteincinasa C, glutamin-fructosa 6-fosfato transaminasa, proteína de respuesta al ácido retinóico, RAB.1A, y pleckstrina. Los resultados localizan al gen de la Langerina humana en el cromosoma 2p13, en la vecindad del locus D2S292. La localización de la Langerina humana permitirá seguir los trastornos genéticos inmunológicos para una potencial asociación con la región del cromosoma 2p13.

EJEMPLO 21 Identificación de la Lanqerina de ratón Usando la secuencia nucleotídica de la Langerina de humano, se llevó a cabo una búsqueda en la base de datos NCBI. Esto permitió identificar dos ESTs de ratón (AA764540 y AA423304) que exhiben considerable homología con la secuencia humana. Estas ESTs se usaron para extender la secuencia, usando RACE-PCR en una genoteca de cADN de pulmón de ratón: se determinó la región de codificación entera, con la excepción del extremo 5' terminal. Nueve nucleótidos que completan la secuencia se identificaron subsecuentemente mediante secuenciación de una clona cósmida de ratón. Se obtuvo una serie de 1756 nucleótidos que se muestra en SEQ ID NO: 10.

Se identificó un marco de lectura abierto de 978 nucleótidos (posiciones 266-1243 en la serie SEQ ID NO: 10), que codifica a una lectina dependiente de Ca++ de tipo II transmembranal pronosticada de 326 aminoácidos (SEQ IDNO: 11). La secuencia de aminoácidos de ratón presenta considerable homología (66.6%) con la Langerina humana (alineamiento mostrado en el cuadro 1 ), con conservación de las características estructurales claves de la molécula (es decir motivos ricos en prolina intracítoplásmicos como sitios potenciales de transducción de la señal, y dominios de reconocimiento de carbohidratos extracelulares (CRD) con un motivo EPN como se encuentra en la Langerina humana e indicativo de la especificidad de unión a mañosa). Estos datos indican que la molécula de ratón identificada anteriormente es homologa de la Langerina humana. La proteína Langerina de ratón se ha expresado exitosamente en células de mamífero (fibroblastos murinos COP5), los cuales se han usado para inmunización de ratones para producir anticuerpos monoclonales (mAbs). Se ha aislado una cantidad de mAbs que reconocen a la proteína Langerina de ratón 7 de estos mAbs exhiben reactividad cruzada a la Langerina humana. Los epítopes reconocidos por los mAbs de reactividad cruzada han sido mapeados todos para el dominio intracitoplásmico usando formas truncadas de la proteína Langerina humana recombinante. Esto es consistente con la remarcablemente alta conservación de la cola citoplásmica (primeros 30 residuos) de Langerina humana y de ratones (ver cuadro 1 ).

CUAEROl 1 1 10 20 30 40 -.. -. .. . 1. ,. -. .. _ ! i M T V E K E A P D A H F T V D K Q N I S L W P R E P P P K S G P S L V P G K T P aa angepna u aa i M L - - E E A P E A H F T V D X Q N I S L W P R E ? P P K Q D L S P V R X P L langepna de raton T V R A A L I C L A L V L V A S .V V L Q A, V L Y P R L M G T I L D V K S D .. A. Q...L r. Mayoría 60 80 41 T V R A A L I C L T L V L V A S V L L Q A V L Y P R F M G T I S D V K T N V Q L aa Langeppa hu aa 39 C I C V A F T C A L V L V T s I V L Q A V F Y P R L M G K I L D V K S D A Q M langepna de ratón L K G R V D N I S T L G S D L K T E S G G V D A A G V Q I Q I V N T S L G R V R Mayoría 90 100 110 1-0 si L K G R V D N I S T L D S E I K K N = D G M E A A G V Q I Q M V N E S L G Y V R aa Langeppa hu aa 79 L K G R V D N I S T L G S D K T E R G R V D D A E V Q M Q I V N T T L K R V R langepna de raton S Q i L S L E T s v e i A N A ? -. L i L T R S s E v s S L S A ? i P E L s D Mayoría 1 1 1 r- 130 140 ISO 160 -i S Q F L K L K T S V E K A N A Q I Q I L T R S W E E V S T L N A Q I P E L K S D aa Langerwa hu aa 119 S Q I L S L E T S M K I A N D Q L L I Í, T M S « G E V D S L S A K I P E L K R D langepna de raton 1 1 r 170 SO 190 200 161 E A S A L N T I R A L Q G S L E N M S K L L K R Q N D I I Q V V S O G W K aa Langepna hu aa 159 L D A S A L N T K V Q O l. Q N S L E iJ V N K -. ir K Q Q S D I L E V A R G W K langerina de ratón - , . , , 1 , 1 210 220 230 240 < 201 Y F K G N F Y Y F S L I P K T W Y S A E Q F C V S R N S H L T S V T S E S E Q E aa Langepna hu aa 199 Y F S G N F Y Y F S R T P K T Y S A E Q F C I S R K A H L T S V S S E S E Q K langepna de raton F L Y K A A G O L I H W I G L T K A G S E O D W S W V D D T S F N K V Q S A R F Mayoría 250 260 270 2S0 1 1 1 1_ 21 F L Y KTAGG L I Y W I G L T KA G M E GDK S WVDD T P FN KV Q S ARF aa Langepna hu aa 29 F L Y K A A DG I PH W I G L T KAG S EGDW Y V D Q T S FN K E Q S R R F langepna de ratón W I P G E P N N A G 1N N EH C G N I K A S , A LQ A W N DG P C ,D N T F L F I C X Mayoría 290 300 310 320 1 I I !_ 2Bi I P G E P N N A G N N E H C G N : K A P S L Q A M N D A P C D K T F L F I C K aa Langepna hu aa 279 W I P G E P N N A G N N E H C A N I R V S A L K C W N D G P C D N T F L F I C K langepna de ratón * ' ? v ° s T E Mayoría 321 R P Y V P S E P aa Langenna hu aa 319 R P Y V Q T T E langeppa de raton La disponibilidad de las secuencias codificadoras de la Langerina de ratón permitirán la realización de estudios (RT-PCR), Northerns, hibridización in situ) para determinar los patrones de expresión de la Langerina de varios tejidos. Además, la secuencia actual puede extenderse para identificar el ADN genómico con el objeto de construir ratones deficientes en el gen de Langerina. Dichos animales serían altamente valiosos para entendimientos posteriores sobre el papel de la Langerina en la regulación de la respuesta inmune. Los MAbs dirigidos contra la Langerina de ratón serán útiles para estudiar la expresión de la proteína en tejidos de ratón. También, el mAb puede inyectarse en el ratón para analizar el impacto de la presencia de Langerina sobre los sistemas de células dendríticas in vivo. Estos estudios serán importante para complementar los esfuerzos para dirigir el antígeno (es decir antígenos tumorales) hacia células dendríticas in vivo vía la Langerina de superficie celular con el objetivo de introducir inmunidad antitumor protectiva. Los experimentos de direccionamiento pueden, por ejemplo, llevarse a cabo mediante la inyección de los ratones (antes de una primera prueba con el tumor) con mAb contra Langerina humana a la cual el antígeno tumoral ha sido unido químicamente. Pueden hacerse muchas modificaciones y variaciones de esta invención sin apartarse del espíritu y el alcance, como será evidente apara los expertos en la técnica. Las modalidades específicas descritas aquí se ofrecen solamente a manera de ejemplo, y la invención está limitada solamente por los términos de los apéndices de reivindicaciones, junto con el alcance total de los equivalentes a los cuales dichas reivindicaciones están tituladas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Corporación Schering <120> 'Anticuerpos al Antígeno DC de Mamífero y sus Usos <130> SF0820K1 <140> EP 99 400 394.5 <141> 1999-02-18 <150> EP 98 402 374.7 <151> 1998-09-25 <160> 11 <210> 1 <211> 1547 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (56) ... (1039) <400> 1 ctggaaaggg cagccagaag cacctgtgct cccaggataa gggtgagcac tcagg atg 58 Met 1 act gtg gag aag gag gcc cct gat gcg cae ttc act gtg gac aaa cag 106 Thr Val Glu Lys Glu Ala Pro Asp Ala His Phe Thr Val Asp Lys Gln 5 10 15 aac ate tec etc tgg ecc cga gag cct cct ecc aag tec ggt cea tet 154 Asn He Ser Leu Trp Pro Arg Glu Pro Pro Pro Lys Ser Gly Pro Ser 20 25 30 ctg gtc ceg ggg aaa acá ecc acá gtc cgt gct gca tta ate tgc ctg 202 Leu Val Pro Gly Lys Thr Pro Thr Val Arg Ala Ala Leu He Cys Leu 35 40 45 acg ctg gtc ctg gtc gcc tec gtc ctg ctg cag gcc gtc ctt tat ecc 250 Thr Leu Val Leu Val Ala Ser Val Leu Leu Gln Ala Val Leu Tyr Pro 50 55 60 65 cgg ttt atg ggc acc ata tea gat gta aag acc aat gtc cag ttg ctg 298 Arg Phe Met Gly Thr He Ser Asp Val Lys Thr Asn Val Gln Leu Leu 70 75 80 aaa ggt cgt gtg gac aac ate age acc ctg gat tet gaa att aaa aag 346 Lys Gly Arg Val Asp Asn He Ser Thr Leu Asp Ser Glu He Lys Lys 85 90 95 aat agt gac ggc atg gag gca gct ggc gtt cag ate cag atg gtg aat 394 Asn Ser Asp Gly Met Glu Ala Ala Gly Val Gln He Gln Met Val Asn 100 105 110 gag age ctg ggt tat gtg cgt tet cag ttc ctg aag tta aaa acc agt 442 Glu Ser Leu Gly Tyr Val Arg Ser Gln Phe Leu Lys Leu Lys Thr Ser 115 120 125 gtg gag aag gcc aac gca cag ate cag ate tta acá aga agt tgg gaa 490 Val Glu Lys Ala Asn Ala Gln He Gln He Leu Thr Arg Ser Trp Glu 130 135 140 145 gaa gtc agt acc tta aat gcc caá ate cea gag tta aaa agt gat ttg 538 Glu Val Ser Thr Leu Asn Ala Gln He Pro Glu Leu Lys Ser Asp Leu 150 155 160 gag aaa gcc agt gct tta aat acá aag ate cgg gca etc cag ggc age 586 Glu Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys He Arg Ala Leu Gln Gly Ser 165 170 175 ttg gag aat atg age aag ttg etc aaa cga caá aat gat att cta cag 634 Leu Glu Asn Met Ser Lys Leu Leu Lys Arg Gln Asn Asp He Leu Gln 180 185 190 gtg gtt tet caá ggc tgg aag tac ttc aag ggg aac ttc tat tac ttt 682 Val Val Ser Gln Gly Trp Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe 195 200 205 tet etc att cea aag acc tgg tat agt gcc gag cag ttc tgt gtg tec 730 Ser Leu He Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln Phe Cys Val Ser 210 215 220 225 agg aat tea cae ctg acc teg gtg acc tea gag agt gag cag gag ttt 778 Arg Asn Ser His Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Ser Glu Gln Glu Phe 230 235 240 ctg tat aaa acá gcg ggg gga etc ate tac tgg att ggc ctg act aaa 826 Leu Tyr Lys Thr Ala Gly Gly Leu Hs Tyr Trp He Gly Leu Thr Lys 245 250 255 gca ggg atg gaa ggg gac tgg tec tgg gtg gat gac acg cea ttc aac 874 Ala Gly Met Glu Gly Asp Trp Ser Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe Asn 260 265 270 ? f- aag gtc caá agt gcg agg ttc tgg att cea ggt gag ecc aac aat gct 922 Lys Val Gln Ser Ala Arg Phe Trp He Pro Gly G3 u Pro Asn Asn Ala 275 280 285 ggg aac aat gaa cae tgt ggc aat ata aag gct ecc tea ctt cag gcc 970 Gly Asn Asn Glu His Cys Gly Asn He Lys Ala Pro Ser Leu Gln Ala 290 295 300 305 tgg aat gat gcc cea tgt gac aaa acg ttt ctt ttc att tgt aag cga 1018 Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Lys Thr Phe Leu Phe He Cys Lys Arg 310 315 320 ecc tat gtc cea tea gaa ceg tga c aggacaggct cccaagctca 1063 Pro Tyr Val Pro Ser Glu Pro 0 325 ctctttgagc tccaacgctt gttaaacatg aggaaatgcc tctttcttcc ccagactcca 1123 ggatgacttt gcacgttaat ttttcttgct tcaaaattgt cccacagtgg cattctggag 1183 tccgtctgtc ttggctggaa attctctgac gtcttggagg cagctggaat ggaaaggaga 1243 attcaggtta aagtgggagg ggtgggtaga gaggatttag aagttccaat tgccctgcta 1303 aggaggatca agacccgtaa tccggcacaa caccctgggg ttttccactc tttcagagaa 1363 acctcagctt catcacatca aagttactcc agagcaacca agcaattctc ctgatattgt 1423 catccagggc ttttcttggc caaaccccct agaatttcca tgtctctgct tagctgtgct 1483 ggcagctagc agctggctgt gtttgcagtg caaatagctc tgttcttgga aatcctgctc 1543 atgg 1547 <210> 2 <211> 328 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Val Glu Lys Glu Ala Pro .sp Ala His Phe Thr Val Asp Lys 1 5 10 15 Gln Asn He Ser Leu Trp Pro Arg Glu Pro Pro Pro Lys Ser Gly Pro 20 25 30 Ser Leu Val Pro Gly Lys Thr Pro Thr Val Arg Ala Ala Leu He Cys 35 40 45 Leu Thr Leu Val Leu Val Ala Ser Val Leu Leu Gln Ala Val Leu Tyr 50 55 60 Pro Arg Phe Met Gly Thr He Ser Asp Val Lys Thr Asn Val Gln Leu 65 70 75 80 Leu Lys Gly Arg Val Asp Asn He Ser Thr Leu Asp Ser Glu He Lys 85 90 95 Lys Asn Ser Asp Gly Met Glu Ala Ala Gly Val Gln He Gln Met Val 100 105 110 Asn Glu Ser Leu Gly Tyr Val Arg Ser Gln Phe Leu Lys Leu Lys Thr 115 120 125 Ser Val Glu Lys Ala Asn Ala Gln He Gln He Leu Thr Arg Ser Trp 130 135 140 Glu Glu Val Ser Thr Leu Asn Ala Gln He Pro Glu Leu Lys Ser Asp 145 150 155 160 Leu Glu Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys He Arg Ala Leu Gln Gly 165 170 175 Ser Leu Glu Asn Met Ser Lys Leu Leu Lys Arg Gln Asn Asp He Leu 180 185 190 Gln Val Val Ser Gln Gly Trp Lys Tyr Phe Lys Gly Asn Phe Tyr Tyr 195 200 205 Phe Ser Leu He Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala Glu Gln Phe Cys Val 210 215 220 Ser Arg Asn Ser His Leu Thr Ser Val Thr Ser Glu Ser Glu Gln Glu 225 230 235 240 Phe Leu Tyr Lys Thr Ala Gly Gly Leu He Tyr Trp He Gly Leu Thr 245 250 255 Lys Ala Gly Met Glu Gly Asp Trp Ser Trp Val Asp Asp Thr Pro Phe 260 265 270 Asn Lys Val Gln Ser Ala Arg Phe Trp He Pro Gly Glu Pro Asn Asn 275 280 285 Ala Gly Asn Asn Glu His Cys Gly Asn He Lys Ala Pro Ser Leu Gln 290 295 300 Ala Trp Asn Asp Ala Pro Cys Asp Lys Thr Phe Leu Phe He Cys Lys 305 310 315 320 Arg Pro Tyr Val Pro Ser Glu Pro 325 <210> 3 <211> 10663 <212> ADN <213> homo sapiens <400> 3 tccctgtccc cactccgcaa tttggtgttc actctacttt cctccatgac ttgactgagg 60 gacttgggtg actcctccct ggagatgact cttggcactg ctggagcatt tcatacaacc 120 caggtctctg ttccagtctt gttgattaaa cccatggttc tcctccaagc ataaggctgg 180 gcccaaccat agtctcaacc agagaaaggg aaaaagtgac caagctgttt tcttcctcca 240 tccttatcca gagaaaatat tagaacccca ggaacacagg aagaggagaa actaaaaaaa 300 tgagcacaga cttcccgttc tcatcacagc ggtgattttt ttggtcacta ggtctggcca 360 gagttcctct tctgtttgga agagcagggc attgtctgag tgcccgggag aactgcccac 420 cttcctgact ggaaagtgtg gccaaggcac ctgcctgctt ctctgtcttt tctcctgcca 480 ggccaggtgc cagatagagc atccagaggt ttgcacagga gaggtgctca ggaaagacct 540 gtagatgagc atgataatag gaagatggct tctgactccc tccctctcca caaagtggga 600 aatgaaactt 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gaccagtact tatctctagt ttttattaaa gtagagcaag 9060 gtctccaatg tcacgatctt ggtgatcttt cttcttgttt actgcacaat cttctagtct 9120 atagctcaat tcccaagaac aagtctcagc aggttcccca ctcttcacag agaeccagtt 9180 ccacaggcat cagttccaaa tcccaagtcc agtggctgaa gctggaatcc aggcagcagc 9240 caccacagag aggagaggag ggtggagtga gcacaggtct tcattaaggt cctcaggaaa 9300 agatgcttcc ttaaataact gtaaccagca gtgtgttgtt ctgggtgcaa atgggtcaca 9360 gctgagggca caggcttgta ttgtaagacc tgaaatacca cgtgctgctg tgacatttta 9420 tgcctcacag ggccccaaag acctaaccct gagttccctg cctctcacca gatatatect 9480 tgccctcggt ccccacctgg ctaatttcct atcatctgga ccagctgcat gccacccagt 9540 tttctactta atgggtttca cttctctgcc agcctgagaa actattcaaa caagccaatc 9600 acatcctcct acaggaatcc ggggcatctc atccttttat tactacaagg cctgcctccc 9660 acagccctgg ctggttcact ctgctcctga gggtgacccc atgtggccct gtgtggctta 9720 tgatatcttt ccccagtaga ctgtatttgt gactagtaaa ctgctgccag tctcacctgc 9780 acagtgtcaa atgtcttgtt ttggccatct tgtcctattt agagcagggg atccctccct 9840 caccaatgga ggaaatggga 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Homo sapiens <400> 4 ggeagecaga agcacctgtg ctcccaggat aagggtgagc actcaggatg actgtggaga 60 aggaggcccc tgatgcgcac ttcactgtgg acaaacagaa catctccctc tggccccgag 120 <210> 5 <211 > 117 <212 > ADN <213 > Homo sapiens <400> 5 agcctcctcc caagtccggt ccatctctgg tcccggggaa aacacccaca gtccgtgctg 60 cattaatctg cctgacgctg gtcctggtcg cctccgtcct gctgcaggcc gtccttt 117 <210> 6 <211> 375 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 atccccggtt tatgggcacc atatcagatg taaagaccaa tgtccagttg ctgaaaggtc 60 gtgtggacaa catcagcacc ctggattctg aaattaaaaa gaatagtgac ggcatggagg 120 cagctggcgt tcagatccag atggtgaatg agagcctggg ttatgtgcgt tctcagttcc 180 tgaagttaaa aaccagtgtg gagaaggcca acgcacagat ccagatctta acaagaagtt 240 gggaagaagt cagtacctta aatgcccaaa tcccagagtt aaaaagtgat ttggagaaag 300 ccagtgcttt aaatacaaag atccgggcac tccagggcag cttggagaat atgagcaagt 360 tgctcaaacg acaaa 375 <210> 7 <211> 152 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 7 atgatattct acaggtggtt tctcaaggct ggaagtactt caaggggaac ttctattact 60 tttctctcat tccaaagacc 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catgtctctg cttagctgtg ctggcagcta 600 gcagctggct gtgtttgcag tgcaaatagc tctgttcttg gaaatcctgc tcatggtatg 660 tccccagtgg tttcttcatc cacatcatct aaagcctgaa cccgttcttc tctggttcaa 720 gtcagtggct gacacggact tgtatctcct tcagagctcg gctggcaccc agcctccctt 780 ctccttccac tcccttagta cactggagtg ccgagccctg ccttccaccc agcgtccatc 840 cagcccctgt cctcacctct ccggcacctc ctcctccttc tgcatttcct atcttcctgt 900 gtcttgtgca tgggaagcag ccttcagtgc cttcatgaat tcaccttcca gcttcctcag 960 aataaaatgc tgcctgggtc aagga 985 <210> 10 <211> 1756 <212> ADN <213> Mus musculus <221> CDS <222> (266) .. (1243) <400> 10 ggcctctttg ctcgtttggt gtcttcagtt aagatgatta aaatgtctgt gtaccaggga 60 agtagtcagg tggcttcctc atcaaagccc aattcttagt caaaaggatg aagctgtggc 120 ctctgcctgg ctaatcgtct aagccaagaa ctgggaactt gggcatgaca aagtggcctg 180 ctttttggct catttcccgt ttctttctgg atgaaaaggt ccttggggag acggatattc 240 agcttttcct aagccagagg cagag atg ttg gag gag gct ecc gaa gcg cae 292 Met Leu Glu Glu Ala Pro Glu Ala His 1 5 ttc acá gtg gac aaa cag aac ate tet etc tgg cct cga gag cct cct 340 Phe Thr Val Asp Lys Gln Asn He Ser Leu Trp Pro Arg Glu Pro Pro 10 15 20 25 ecc aag caá gat ctg tet cea gtt ctg agg aaa cct etc tgt ate tgc 388 Pro Lys Gln Asp Leu Ser Pro Val Leu Arg Lys Pro Leu Cys He Cys 30 35 40 gtg gcc ttc acc tgc ctg gca ttg gtg ctg gtc acc tec att gtg ctt 436 Val Ala Phe Thr Cys Leu Ala Leu Val Leu Val Thr Ser He Val Leu 45 50 55 cag gct gtt ttc tat cct agg ttg atg ggc aaa ata ttg gat gtg aag 484 Gln Ala Val Phe Tyr Pro Arg Leu Met Gly Lys He Leu Asp Val Lys 60 65 70 agt gat gcc cag atg ttg aaa ggt cgt gtg gac aac ate age acc ctg 532 Ser Asp Ala Gln Met Leu Lys Gly Arg Val Asp Asn He Ser Thr Leu 75 80 85 ggt tet gat ctt aag act gaa aga ggt cgt gtg gac gat gct gag gtt 580 Gly Ser Asp Leu Lys Thr Glu Arg Gly Arg Val Asp Asp Ala Glu Val 90 95 100 105 cag atg cag ata gtg aac acc acc etc aag agg gtg cgt tet cag ate 628 Gln Met Gln He Val Asn Thr Thr Leu Lys Arg Val Arg Ser Gln He 110 115 120 ctg tet ttg gaa acc age atg aag ata gcc aat gat cag etc ctg ata 676 Leu Ser Leu Glu Tnr Ser Met LYS Ile Ala Asn AsP Gln Leu Leu He 125 130 135 tta acá atg age tgg gga gag gtt gac agt etc agt gcc aaa ate cea 724 Leu Thr Met Ser Trp Gly Glu Val Asp Ser Leu Ser Ala Lys He Pro 140 145 150 gaa ctg aaa aga gat ctg gat aaa gcc age gcc ttg aac ac aag gtc 772 Glu Leu Lys Arg Asp Leu Asp Lys Ala Ser Ala Leu Asn Thr Lys Val 155 160 165 caá gga cta cag aac age ttg gag aat gtc aac aag ctg etc aaa caá 820 Gln Gly Leu Gln Asn Ser Leu Glu Asn Val Asn Lys Leu Leu Lys Gln 170 175 180 185 cag agt gac att ctg gag atg gtg gct cga ggc tgg aag tat ttc teg 868 Gln Ser Asp He Leu Glu Met Val Ala Arg Gly Trp Lys Tyr Phe Ser 190 195 200 ggg aac ttc tat tac ttt tea cgc acc cea aag acc tgg tac age gca 916 Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Ser Arg Thr Pro Lys Thr Trp Tyr Ser Ala 205 210 215 gag cag ttc tgt att tet aga aaa gct cae ctg acc tea gtg tec tea 964 Glu Gln Phe Cys He Ser Arg Lys Ala His Leu Thr Ser Val Ser Ser 220 225 230 gaa teg gaa caá aag ttt etc tac aag gca gca gat gga att cea cae 1012 Glu Ser Glu Gln Lys Phe Leu Tyr Lys Ala Ala Asp Gly He Pro His 235 240 245 tgg att gga ctt acc aaa gca ggg age gaa ggg gac tgg tac tgg gtg 1060 Trp He Gly Leu Thr Lys Ala Gly Ser Glu Gly Asp Trp Tyr Trp Val 250 255 260 265 gac cag acá tea ttc aac aag gag caá agt agg agg ttc tgg att cea 1108 Asp Gln Thr Ser Phe Asn Lys Glu Gln Ser Arg Arg Phe Trp He Pro 270 275 280 ggt gaa ecc aac aac gca ggg aac aac gag cae tgt gcc aat ate agg 1156 Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly Asn Asr. Glu His Cys Ala Asn He Arg 285 290 295 gtg tet gcc ctg aag tgc tgg aac gat ggt ecc tgt gac aat acá ttt 1204 Val Ser Ala Leu Lys Cys Trp Asn Asp Gly Pro Cys Asp Asn Thr Phe 300 305 310 ctt ttc ate tgc aag agg ecc tac gtc caá acá act gaa tgacagatct 1253 Leu Phe He Cys Lys Arg Pro Tyr Val Gln Thr Thr Glu 315 320 325 ggcctgagct cggcatctgt ggggcaacag tgacctggct gaagagatgt ctctctccct 1313 gaggctccaa gattgctctg tacttacgtt tttttcttgc ttgaaaattg tcccaaacac 1373 agcctgtggt ctttctgtct tggctggcag ttctctgctc ctggaggcct tggaggagct 1433 tgggttaaac gggtgaggac ctgaaaaggg tgtagcagtc cttactgccc aggcgaggca 1493 ggtcagcaca ccaaacaggt tgtttagatt ttcctgatcc ttetcagaag ccttggctga 1553 ccatataaaa getacattea aatatgacca gtatttgagg agacagacat gcccaaattt 1613 aaccatgata caatttatac aacatgtatt agaacacctc atggtatgtt caaaatagta 1673 Lys Ala His Leu Thr Ser Val Ser Ser Glu Ser Glu Gln Lys Phe Leu 225 230 235 240 Tyr Lys Ala Ala Asp Gly He Pro His Trp He Gly Leu Thr Lys Ala 245 250 255 Gly Ser Glu Gly Asp Trp Tyr Trp Val Asp Gln Thr Ser Phe Asn Lys 260 265 270 Glu Gln Ser Arg Arg Phe Trp He Pro Gly Glu Pro Asn Asn Ala Gly 275 280 285 Asn Asn Glu His Cys Ala Asn He Arg Val Ser Ala Leu Lys Cys Trp 290 295 300 Asn Asp Gly Pro Cys Asp Asn Thr Phe Leu Phe He Cys Lys Arg Pro 305 310 315 320 Tyr Val Gln Thr Thr Glu 325

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado que selectivamente se une a un polipéptido de mamífero, dicho polipéptido caracterizado porque: a) se une con selectividad al anticuerpo monoclonal DCGM4; b) la forma natural de dicho polipéptido tiene un peso molecular mediante SDS PAGE de -?0 kD; y c) se expresa en la superficie celular de las células de Langerhans.

2.- El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es un anticuerpo monoclonal.

3.- Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la reivindicación 2.

4.- El hibridoma de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el número de acceso ATCC es HB-12576.

5.- Un método para analizar una población celular, que comprende la detección o la medición de la presencia de Langerina con dicho anticuerpo de la reivindicación 1.

6.- Una proteína sustancialmente pura de mamífero caracterizada por: a) un peso molecular mediante SDS PAGE de aproximadamente 40 kDa con glucosilación natural; y b) la unión selectiva a dicho anticuerpo de la reivindicación 1.

7.- Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2.

8.- Una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 11.

9.- Un fragmento de la proteína de conformidad con la reivindicación 7, la cual: a) expresa un epítope inmunológico de dicha Langerina; o b) modula una respuesta inmune.

10.- Una secuencia de ácidos nucleicos la cual codifica para una proteína que se muestra en SEQ ID NO: 2.

11.- La secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque comprende la región codificante mostrada en SEQ ID NO: 1.

12.- Una secuencia de ácidos nucleicos que codifican para una proteína que se muestra en SEQ ID NO: 11.

13.- La secuencia de ácidos nucleicos de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque comprende la región codificante mostrada en SEQ ID NO: 10.

14.- Una secuencia de ácidos nucleicos que se muestra en SEQ ID NO: 3 o un fragmento de la misma.

15.- Una secuencia de ácido nucleico que comprende cualquiera de las SEQ ID NO: 4-9.