MXPA05002818A

MXPA05002818A - Receptor del factor nuclear de celulas t activadas.

Info

Publication number: MXPA05002818A
Application number: MXPA05002818A
Authority: MX
Inventors: Guanghui Hu
Original assignee: Tanox Inc
Priority date: 2002-09-19
Filing date: 2003-09-19
Publication date: 2005-08-16
Also published as: JP2006500032A; WO2004027079A2; US20060292668A1; CA2497937A1; US20100173383A1; US20110124081A1; EP1562980A2; AU2003287008A1; EP1562980A4; US20090022710A1; CN1688601A; WO2004027079A3

Abstract

Se presenta un novedoso receptor que activa el factor nuclear de celulas T activadas ("NFAT") util para producir anticuerpos agonista y antagonistas que regulan la produccion celular y la expresion de receptores celulares y citoquinas. El receptor es una proteina transmernbrana de tipo 1 con 270 aminoacidos con una masa molecular calculada de aproximadamente 30 kD. El receptor tiene un peptido de senal putativo en el N-terminal (aminoacidos 1 a 42), un dominio de Ig (aminoacidos 43 a 150) en la region extracelular, un dominio transmembrana pronosticado (aminoacidos 164 a 186) y un motivo ITAM pronosticado (aminoacidos 220 a 235) en la region citoplasmica. El receptor activa las actividades del reportero promotor NFAT, IL-13 y TNF-a.

Description

RECEPTOR DEL FACTOR NUCLEAR DE CÉLULAS T ACTIVADAS CAMPO DE LA. INVENCIÓN Esta invención se relaciona, de manera general, con receptores celulares y, de manera particular, con receptores que activan el factor nuclear de células T activadas ("NFAT").

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los linfocitos T activados secretan citoquinas que regulan la actividad del sistema inmunitario y le permiten generar una respuesta inmunitaria eficaz . La regulación de la producción de citoquina puede darse en el nivel inicial de la transcripción del gen de la citoquina. Una familia de factores transcripcionales proteinicos designados "factor nuclear de células T activadas" (o NFAT, siglas en inglés de "nuclear factor of activated T cells") desempeña una función crucial en la regulación por transcripción de los genes de citoquina. Se sabe que las proteínas NFAT tienen un papel clave en la regulación de la transcripción de una amplia variedad de citoquinas y receptores de superficie celular que median importantes funciones inmunitarias , por ejemplo, interleucina-2 , interleucina-4 , interleucina-5, interleucina-13 , interferón-?, factor de la necrosis tumoral- , GM-CSF, CD40L y CTLA-4. Los miembros mejor conocidos y bien caracterizados de la familia NFAT son NFATl, NFAT2 , FAT3 y NFAT . La activación de la proteina NFAT está regulada por un proceso que involucra la desfosforilación de la proteina NFAT, la translocación nuclear y la unión con ADN . En células en reposo, las proteínas NFAT fosforiladas residen en el citoplasma y tienen una baja afinidad de unión por el ADN. Los diversos estímulos que disparan la movilización del calcio provocan la rápida desfosforilación de las proteínas NFAT mediante un proceso mediado por la proteína fosfatasa calcineurina dependiente de Ca2+/calmodulina . Las proteínas NFAT desfosforiladas con una señal de localización nuclear expuesta se translocan en el núcleo, donde se unen con el ADN con un aumento en la afinidad y median la transcripción del gen diana. Las proteínas NFAT se expresan no sólo en la células T, sino también en un variado grupo de tipos de células inmunitarias y no inmunitarias . Las proteínas NFAT han estado implicadas en la activación de mastocitos, linfocitos B y células NK. En estas células, las proteínas NFAT se activan al estimular los receptores acoplados con señales de calcio/calcineuxina, por ejemplo, los receptores de antígeno en células T y B, los receptores Fce en mastocitos y basófilos, los receptores Fey en macrófagos y células K, y los receptores acoplados a proteínas G heterotriméricas . Las siguientes patentes presentan polipéptidos que están asociados con la NFAT compleja de transcripción y con los polinucleótidos asociados, anticuerpos, y con los métodos y productos relacionados: patente de EE.UU. Núm. 5, 837, 840, otorgada a Crabtree, et al., el 17 de noviembre de 1998 (cedida al Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland- Stanford Jr. (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides" ; patente de EE.UU. Núm. 6,096,515 otorgada a Crabtree, et al., el 1 de agosto de 2000 (cedida al Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Jr. (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polynucleotides"; patente de EE.UU. Núm. 6,150,099, otorgada a Crabtree, et al., el 21 de noviembre de 2000 (cedida al Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Jr. (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides"; patente de EE.UU. Núm. 6,171,781, otorgada a Crabtree, et al., el 9 de enero de 2001 (cedida a El Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Júnior (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides"; patente de EE.UU. Núm. 6,197,925, otorgada a Crabtree, et al., el 6 de marzo de 2001 (cedida a Sara Lee Corporation (Winston-Salem, NC) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides"; patente de EE.UU. Núm. 6,312,899, otorgada a Crabtree, et al., el 6 de noviembre de 2001 (otorgada al Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Júnior (Palo Alto, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides" ; patente de EE.UU. Núm. 6,352,830, otorgada a Crabtree, et al., el 5 de marzo de 2002 (cedida a El Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Júnior (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides and screening methods for immunosuppressive agents"; y la patente de EE.UU. Núm. 6,388,052, otorgada a Crabtree, et al., el 14 de mayo de 2002 (cedida al Consejo de fideicomisarios de la Universidad Leland Stanford Júnior (Stanford, CA) ) titulada "NF-AT polypeptides and polynucleotides". Aunque se sabe mucho sobre las proteínas NFAT y el mecanismo mediante el cual afectan la producción de citoquina, sigue existiendo la necesidad de comprender la ruta del NFAT y de como usar este conocimiento para producir composiciones y métodos útiles para modular la ruta, incluidos los agonistas y antagonistas, tales como los anticuerpos que regulan la citoquina y la expresión del receptor de superficie celular y los métodos de tamizado que son útiles para identificar los fármacos que previenen o tratan las enfermedades relacionadas con la citoquina y el receptor.

SUMARIO DE IA INVENCIÓN Por lo tanto, un objeto de la invención es proporcionar novedosos receptores que activan el NFAT, con capacidad para interaccionar con las proteínas del ligando del factor nuclear de células T activadas . Otro objeto de la invención es proporcionar agonistas o antagonistas que se unen con receptores nativos que activan el NFAT e inhiben o activan la expresión o acción de dichos receptores. Otro objeto de la invención es proporcionar anticuerpos que se unen con los receptores que activan el NFAT, así como con los métodos para producir estos anticuerpos . Un objeto adicional de la invención es proporcionar secuencias de nucleótidos que codifican novedosos receptores que activan ' el NFAT capaces de interaccionar con las proteínas del ligando del factor nuclear de células T activadas . Otro objeto de la invención es proporcionar vectores que contienen secuencias de nucleótidos que codifican novedosos receptores que activan el NFAT y células hospedadoras que contienen dichos vectores. Otro objeto adicional de la invención es proporcionar un método de tamizado para identificar los agonistas y antagonistas del receptor que activa el NFAT y para determinar si es probable que las sustancias farmacéuticas provoquen efectos secundarios indeseables cuando se administran a un animal. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para bloquear o modular la expresión de un receptor activador del NFAT. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para diagnosticar la predisposición de un paciente a generar enfermedades provocadas por la expresión no regulada de . citoquinas . Un objeto adicional de la invención es proporcionar un método para prevenir o tratar en un mamífero las enfermedades mediadas por la proteína NFAT. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de diagnóstico para detectar los receptores activadores del NFAT expresados en células, tejidos o fluidos corporales específicos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para aislar y purificar receptores que activan el NFAT a partir de un cultivo de células recombinantes , contaminantes y entornos nativos. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para inducir la tolerancia en un mamífero que pueda experimentar una respuesta inmunitaria indeseable. 6 Estos y otros objetos se logran al proporcionar un novedoso receptor que activa el factor nuclear de células T activadas ("NFAT") que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID N0:1, la secuencia de nucleótidos que codifica para el receptor, y los vectores y células hospedadoras que expresan la secuencia de nucleótidos y producen el receptor. El receptor se usa para producir los anticuerpos agonista y antagonista útiles para afectar la producción celular de cxtoquinas y de receptores y ligandos celulares. Los anticuerpos son útiles para separar por tamizado los agonistas y antagonistas del receptor y para separar por tamizado las sustancias farmacéuticas con el fin de determinar si es probable que provoquen efectos secundarios, indeseables cuando se administran, con fines medicinales, a un animal. Otros objetos, particularidades y ventajas adicionales de la presente invención serán muy evidentes para los experimentados en la técnica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones El término "polipéptido purificado" se refiere a un polipéptido identificado y separado de por lo menos un polipéptido contaminante asociado, de ordinario, con el polipéptido purificado en su entorno nativo, en particular, a un polipéptido separado de su entorno celular. El término "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido identificado y separado de por lo menos un polinucleótido contaminante asociado, de ordinario, con el polinucleótido aislado en su entorno nativo, en particular, a un polinucleótido separado de su entorno celular . El término "nativo", cuando se usa para describir un polinucleótido, secuencia de polipéptidos u otra molécula, se refiere a un polipéptido, polinucleótido o a otra molécula tales como se les encuentra en forma natural, por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótidos que está presente en un organismo, tal como un virus o una célula procariótica o eucariótica que puede aislarse de una fuente natural y que no ha sido modificado a propósito para cambiar su estructura, propiedades o función. Un polinucleótido celular no .aislado que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1 es un polinucleótido nativo y un polipéptido celular no purificado que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 es un polipéptido nativo. El término "por ciento de identidad secuencial" se refiere al porcentaje de similitud secuencial determinado al comparar dos o más secuencias de nucleótidos o de aminoácidos. El por ciento de identidad puede 8 determinarse por medios electrónicos, por ejemplo, con el programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc., Madison Wisconsin) . El programa MEGALIGN crea alineaciones entre dos o más secuencias de conformidad con diferentes métodos, por ejemplo, el método de arracimado (ver, por ejemplo, Higgins, D. G. y P. . Sharp (1988) Gene 73:237-244). El algoritmo de arracimado agrupa secuencias por racimos después de examinar las distancias entre todos los pares. Los racimos se alinean por pares y después por grupos. El porcentaje de similitud entre dos secuencias de aminoácidos, por ejemplo, la secuencia A y la secuencia B, se calcula al dividir la longitud de la secuencia A, menos el número de residuos de espacio de la secuencia A, menos el número de residuos de espacio de la secuencia B, entre la suma de coincidencias de residuos entre la secuencia A y la secuencia B, por cien. Los espacios de poca o nula similitud entre las dos secuencias de aminoácidos no se incluyen en la determinación del porcentaje de similitud. El por ciento de identidad entre las secuencias de nucleótidos se contabiliza o calcula usando los métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, el método Jotun Hein presentado en Hein, J. (1990) Methods Enzymol . 183:626-645. La identidad entre secuencias también se puede determinar usando otros métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante la variación en las condiciones de hibridación.

El término "variante", cuando se usa para describir una secuencia de polinucleótidos, se refiere a una secuencia de nucleótidos que difiere de su equivalente nativo en uno o más nucleótidos y tiene ya sea la misma función biológica o una similar a la de su equivalente nativo o no tiene la misma función biológica, ni similar, a la de su equivalente nativo, pero que es útil como sonda para identificar o aislar a su equivalente nativo. Las variantes preferidas son las secuencias de nucleótidos que tienen al menos 85 por ciento de identidad secuencial cuando se compara con su equivalente nativo, de preferencia, al menos de 90 a 95 por ciento de identidad secuencial y, con la máxima preferencia, de 99 por ciento de identidad secuencial, y las secuencias de nucleótidos que se unen con las secuencias nativas o con sus complementos en condiciones rigurosas . Las variantes que más se prefieren son las secuencias de nucleótidos que codifican para la secuencia de aminoácidos que su equivalente nativo, pero difieren de la secuencia de nucleótidos nativa únicamente con base en la degeneración del código genético. El término "variante", cuando se usa para describir una secuencia de polipéptidos , se refiere a una secuencia de aminoácidos que difiere de su equivalente nativo en uno o más aminoácidos, incluidas las 10 modificaciones, sustituciones, inserciones y supresiones, y tienen ya sea la misma función biológica o una similar a la de su equivalente nativo o no tienen la misma función biológica, ni similar, a la de su equivalente nativo, pero que es útil como inmunógeno para producir anticuerpos que se unen con su equivalente nativo, o como agonista o antagonista de su equivalente nativo. Las variantes preferidas son polipéptidos que tienen al menos 70 por ciento de identidad secuencial, cuando se comparan con su equivalente nativo, de preferencia, al menos 85 por ciento de identidad secuencial y, con la máxima preferencia, al menos 95 por ciento de identidad secuencial . Las variantes que más se prefieren son los polipéptidos que tienen sustituciones de aminoácidos conservadoras. El término "fragmento", cuando se usa para describir un polinucleótido, se refiere a un subconjunto de la secuencia de nucleótidos de su equivalente nativo que se une con su equivalente nativo o con su complemento en condiciones rigurosas . Los fragmentos preferidos tienen una secuencia de nucleótidos al menos de 25 a 50 nucleótidos consecutivos de la secuencia nativa. Los fragmentos que más se prefieren tienen una secuencia de aminoácidos al menos de 50 a 100 nucleótidos consecutivos de la secuencia nativa . El término "fragmento", cuando se usa para 11 describir un polipéptido, se refiere a un subconjunto de la secuencia de aminoácidos de su equivalente nativo el cual retiene alguna actividad biológica de su equivalente nativo o actúa como inmunógeno capaz de producir un anticuerpo que se une con su equivalente nativo. Los fragmentos preferidos tienen una secuencia de aminoácidos al menos de 10 a 20 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa. Los fragmentos que más se prefieren tienen una secuencia de aminoácidos al menos de 20 a 30 aminoácidos consecutivos de la secuencia nativa. El término "agonista" se refiere a cualquier molécula que promueva, aumente o estimule la función normal del receptor que activa el NFAT . ün tipo de agonista es una molécula que interacciona con el receptor activador del NFAT en una forma tal -que imita a su ligando, incluidos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. El término "antagonista" se refiere a cualquier molécula que bloquea, previene, inhibe o neutraliza la función normal del receptor que activa el NFAT. Un tipo de antagonista es una molécula interfiere con la interacción entre el receptor que activa el NFAT y su ligando, incluidos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Otro tipo de antagonista es un nucleótido antisentido que inhibe la adecuada transcripción del receptor nativo activador del NFAT. 12 El término "sustitución de aminoácido conservadora" quiere decir que ' en un polipéptido un aminoácido ha sido sustituido por un aminoácido que tiene una cadena secundaria semejante. Por ejemplo, la glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina tienen cadenas secundarias alifáticas; la serina y treonina tienen cadenas secundarias hidroxilalifáticas ; la asparagina y la glutamina tienen cadenas secundarias que contienen amida; la fenilalanina, tirosina y triptofano tienen cadenas -secundarias aromáticas; la lisina, arginina e histidina tienen cadenas secundarias básicas; y la cisteina y la metionina tienen cadenas secundarias que contienen azufre. Las sustituciones de aminoácidos conservadoras preferidas son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina. El término "condiciones rigurosas" quiere decir: (1) hibridación en formamida al 50% (vol/vol) con albúmina de suero de bovino al 0.1%, Ficoll al 0.1%, polivinilpirrolidona al 0.1%, solución amortiguadora de fosfato de sodio 50 mM a pH de 6.5 con NaCl 750 mM, citrato de sodio 75 mM a 42 °C; (2) hibridación en formamida al 50%, 5x de SSC (NaCl 0.75 M, citrato de sodio 0.075 M) , fosfato de sodio 50 mM (pH 6.8), pirofosfato de sodio 0.1%, solución de Denhardt 5x, ADN de esperma de salmón sometido a sonicación (50 µg/ml) , SDS al 0.1% y sulfato de dextrano 13 al 10% a 42°C; con lavados a 42°C en SSC 0.2x y SDS al 0.1% o lavado con NaCl 0.015 M, citrato de sodio 0.0015 M, Na2S0 al 0.1% a 50 °C o procedimientos similares que utilicen agentes de lavado de alta temperatura y con una fuerza iónica pequeña y agentes desnaturalizantes semejantes. El término "antisentido", como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier composición que contiene secuencias de nucleótidos que son complementarias de una secuencia de ADN o ARN especifica. El término "hebra antisentido" se usa con referencia a una hebra de ácidos nucleicos que es complementaria de la hebra de "sentido". Las moléculas antisentido incluyen ácidos nucleicos peptidicos que pueden ser producidos usando cualquier método, entre los que se incluyen la síntesis y la transcripción. Una vez que se han introducido en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar hebras dúplex y bloquear la transcripción o la traducción. A veces se usan las denominaciones "negativa" para referirse a la hebra antisentido y "positiva" para referirse a la hebra de sentido. El término "desactivación génica" se refiere a la' reducción total o parcial de la expresión de al menos una porción de un polipéptido codificado por un gen endógeno (tal como el receptor activador del NFAT) de una sola célula, de células seleccionadas o de todas las células de un mamífero. El mamífero puede ser un "heterocigótico desactivado génicamente" que tiene un alelo del gen endógeno alterado u "homocigótico desactivado génicamente" donde los dos alelos del gen endógeno están alterados. Esta invención no está limitada por ninguna metodología, protocolos, líneas celulares, vectores ni reactivos particulares descritos en la presente, puesto que éstos pueden variar. Además, la terminología usada en la presente sólo tiene la finalidad de describir modalidades particulares y su intención no es limitar el alcance de la presente invención. Como se utiliza en la presente y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un/una" y "el/la" incluyen la referencia a las plurales, a menos que el contexto indique claramente alguna otra forma, por ejemplo, la referencia a "una célula hospedadora" incluye una pluralidad de dichas células hospedadoras. Debido a la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos que activan el NFAT de la presente invención. Algunas de estas secuencias tendrán un elevado grado de homologación y algunas otras tendrán un mínimo grado de homologación con las secuencias de nucleótidos de cualquier secuencia de nucleótidos conocida y natural. La presente invención contempla todas y cada una 15 de las .posibles variaciones en la secuencia de nucleótidos que podrían prepararse seleccionando combinaciones basadas en las posibles elecciones de codones . Estas combinaciones se preparan de conformidad con la tripleta del código genético estándar, conforme se aplica a la secuencia de nucleótidos que codifica para el receptor activador del NFAT de origen natural y se considerará que específicamente se presentan todas estas variaciones. A menos que se defina de alguna otra manera, todos los términos técnicos y científicos, así como cualquier acrónimo, que se usen en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por alguien con experiencia ordinaria en la técnica del campo de la invención. No obstante que en la práctica de la presente invención se pueden usar cualesquiera métodos y materiales similares o equivalentes a los aquí descritos, en la presente se describen los métodos, dispositivos y materiales preferidos. Todas las patentes y publicaciones mencionadas aquí se incorporan en la presente por su sola mención, como referencia al grado permitido por la ley con el fin de describir y exponer las proteínas, enzimas, vectores, células hospedadoras y metodologías aquí reportadas, que puede utilizarse en la presente invención. Sin embargo, ningún elemento de la presente debe ser interpretado como 16 admisión que la invención no está · autorizada con antelación dicha exposición en virtud de la invención anterior .

Polipéptidos En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido purificado que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO: 2; una variante de SEQ ID NO: 2; un fragmento de SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:l; una variante de SEQ ID NO:l; y un fragmento de SEQ ID NO:l. Los polipéptidos purificados de la presente invención son, de preferencia, los receptores que activan el NFAT involucrados en la regulación transcripcional de varios genes receptores celulares y de citoquina. Los receptores se expresan, de preferencia, en células y tejidos relacionados con el sistema inmunitario humano, en especial, en neutrófilos, monocitos, linfocitos, mastocitos, tejido esplénico y tejido pulmonar. Los receptores se usan para crear los anticuerpos que se unen a los receptores e influyen en la estructura, propiedades o función del receptor, incluida la función biológica. De preferencia, los anticuerpos funcionan como agonistas del 17 receptor para activar la producción de citoquinas y receptores celulares o como antagonistas del receptor para inhibir la producción de citoquinas y receptores celulares.

Agonistas y antagonistas En otro aspecto, la presente invención proporciona agonistas y antagonistas que específicamente se unen con receptores que activan el NFAT e inhiben o activan la expresión o acción de los receptores. Los tipos de agonistas y antagonistas incluyen, aunque no se limitan a, polipéptidos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos , polisacáridos, oligosacáridos, nucleótidos, moléculas orgánicas, moléculas bioorgánicas, compuestos peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, y secuencias de control de la transcripción y . la traducción. En una modalidad, los antagonistas son una forma soluble de los receptores que activan el NFAT y los polipéptidos solubles derivados de los dominios extracelulares de los receptores activadores del NFAT que tienen la capacidad de unirse con el receptor que activa el NFAT. De preferencia, los antagonistas son péptidos seleccionados del grupo formado por los aminoácidos 43 a 150 de la SEQ ID NO: 2 o fragmentos del antagonista de los mismos. Estos antagonistas bloquean la unión del ligando 18 natural con los receptores que activan el NFAT al unirse con el ligando y evitar que el ligando se una con el receptor nativo. De preferencia, los agonistas y antagonistas son anticuerpos que se unen específicamente con los receptores e influyen en sus acciones y funciones biológicas, por ejemplo, para activar o inhibir la producción de citoquinas y receptores celulares. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos policlonales o monoclonales, de preferencia, son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos agonistas se usan para prevenir o tratar enfermedades caracterizadas por la expresión relativamente baja del receptor y de citoquina en comparación con estados no enfermos. Los anticuerpos antagonistas se usan para prevenir o tratar enfermedades caracterizadas por la expresión relativamente elevada del receptor y de citoquina en comparación con estados no enfermos . Los agonistas y antagonistas se usan para el tratamiento de varias enfermedades inmunitarias , que incluyen, pero que no se limitan a las enfermedades alérgicas, por ejemplo, asma, rinitis alérgica, dermatitis atópica, hipersensibilidad a los alimentos y urticaria; las enfermedades asociadas con los transplantes, entre las que se incluyen el rechazo al injerto y la enfermedad del 19 injerto contra el receptor; las enfermedades autoinmunitarias de la piel y las mediadas por el sistema inmunitario, que incluyen las enfermedades de la piel hullosa, el eritema multiforme y la dermatitis por contacto, la psoriasis; la artritis reumatoide, la artritis crónica juvenil; la enfermedad del intestino inflamado (es decir, la colitis ulcerativa, la enfermedad de Crohn) ; el lupus eritematoso sistémico; las espondiloartropatías; la esclerosis sistémica (esclerodermia) ; la miopatias inflamatorias idiopáticas (dermatomiositis, polimiositis ) ; el síndrome de Sjogren; la vasculitis sistémica; la sarcoidosis; la anemia hemolitica autominmunitaria (pancitopenia inmunitaria, la hemoglobinuria nocturna paroxismica) , la trombocitopenia autoinmunitaria (el púrpura trombocitopénico idiopático, la trombocitopenia mediada por el sistema inmunitario) ; la tiroiditis (enfermedad de Graves, la tiroiditis de Hashimoto, la tiroiditis linfocitica juvenil; la tiroiditis atrófica) ; la diabetes mellitus; las enfermedades renales mediadas por el sistema inmunitario · (glomerulonefritis , nefritis tubulointersticial) ; las enfermedades desmielinizantes de los sistemas nerviosos central y periférico, tales como la esclerosis múltiple, la polineuropatia desmielinizante idippática o síndrome de Guillain-Barre y la polineuropatia desmielinizante inflamatoria crónica; las enfermedades 20 hepatobiliares, como la hepatitis infecciosa (la hepatitis A, B, C, D, E y otros virus no hepatotrópicos ) , la hepatitis activa crónica autoinmunitaria, la cirrosis biliar primaria, la hepatitis granulomatosa y la colangitis esclerosante; las enfermedades pulmonares inflamatoria y fibrótica, como la fibrosis quistica, la enteropatia por sensibilidad al gluten y la enfermedad de Whipple; las enfermedades inmunológicas del pulmón, como la neumonía eosinofilica, la fibrosis pulmonar idiopática y la neumonitis por hipersensibilidad.

Anticuerpo y su producción En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une con los receptores que activan el NFAT de la presente invención y con los métodos para producir este anticuerpo, incluidos los anticuerpos que funcionan como agonistas y antagonistas del receptor nativo activador del FAT. En una modalidad, el método incluye el uso de los receptores aislados que activan el NFAT o sus fragmentos antigénicos como un antigeno para la producción de anticuerpos que se unen con los receptores que activan el NFAT de la presente invención en un protocolo conocido para producir anticuerpos para antigenos, incluidos los anticuerpos monoclonales y policlonales . En otra modalidad, el método comprende el uso 21 de células hospedadoras que expresan receptores recombinantes activadores del NFAT como un antigeno. En una modalidad adicional, el método incluye el uso de vectores de expresión de ADN que contienen el gen receptor para expresar el receptor como un antigeno para producir los anticuerpos . Los métodos para producir anticuerpos, que incluyen los anticuerpos policlonales, monoclonales, monovalentes, humanizados, humanos, biespecificos y heteroconj gados, son bien conocidos por los experimentados en la técnica.

Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales pueden producirse en un mamífero inyectándole un inmunógeno solo o combinado con un adyuvante. Normalmente, el inmunógeno se inyecta en el mamífero usando una o más inyecciones subcutáneas o intraperitoneales . El inmunógeno puede incluir el polipéptido de interés o una proteína de fusión que contiene el polipéptido y otro polipéptido conocido por ser inmunogénico en el mamífero que será inmunizado. El inmunógeno también puede incluir células que expresan un receptor recombinante o un vector de expresión del ADN que contiene el gen del receptor. Ejemplos de estas proteínas inmunogénicas incluyen, pero no se limitan a, hemocianina 22 de la lapa ojo de cerradura, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino e inhibidor de la tripsina de soya. Los ejemplos de adyuvantes incluyen, pero no se limitan a: adyuvante completo de Freund y adyuvante MPL-TDM (Lipido A monofosforilo, dicorinomicolato de trehalosa sintético) . Cualquiera con experiencia en la técnica puede seleccionar el protocolo de inmunización sin experimentación excesiva.

Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando métodos de hibridoma, como los descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, un hámster u otro mamífero hospedador adecuado se inmuniza con un inmunógeno para producir linfocitos que producen o tienen la capacidad de producir anticuerpos que se específicamente se unen con el inmunógeno. Alternativamente, los linfocitos pueden inmunizarse in vitro. El inmunógeno incluirá, normalmente, el polipéptido de interés o una proteína de fusión que contiene el polipéptido. Por lo general, si se desean células de origen humano, se usan linfocitos sanguíneos periféricos (o PBL, siglas de "peripheral blood lymphocytes" ) . Si se desean células de origen mamífero no humano, se usan células del bazo o células del nodo línfico. Entonces se usan los linfocitos con una línea 23 celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, por ejemplo, polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, págs . 59-103 (Academic Press, 1986)). Las lineas celulares inmortalizada son, por lo regular, células de mamífero transformadas, en particular, células de mieloma humano, de roedor o de bovino. Normalmente, se usan líneas celulares de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que contenga, de preferencia, una o más sustancias que inhiban el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células parenterales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (o HGPRT, siglas de "hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase" ) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá, por lo regular, hipoxantina, aminopterina y tiirddina (medio ???) . El medio HAT evita el crecimiento de las células con deficiencia de HGPRT. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las que se fusionan con eficiencia, soportan la expresión estable de alta nivel del anticuerpo mediante las células productoras del anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas que más se prefieren son las líneas de mieloma de murino, como las que se derivan de los 24 tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11, que pueden obtenerse del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP2/0 o X63-Ag8-653, que pueden obtenerse de la American Type Culture Collection, Rockville, Md. EE.UU. También se ha descrito el uso de las lineas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano en _ la producción de anticuerpos monoclonales de humano (Kozbor, J. Immunol . 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)) . También se puede usar la linea celular de mieloma de ratón NSO (Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Wiltshire GB) . Para producir anticuerpos monoclonales de humano también se pueden usar las lineas celulares de mieloma de humano y de heteromieloma de ratón-humano, bien conocidas en la técnica. El medio de cultivo usado para cultivar células de hibridoma puede someterse a análisis para determinar la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el polipéptido de interés. De preferencia, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina por inmunoprecipitación o por ensayo- de unión in vitro, por ejemplo, radioinmunoensayo (o RIA por "radioimmunoassay" ) o ensayo inmunoabsorbente ligado con enzima (o ELISA) . En el área se conocen estas técnicas y ensayos. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede determinarse, por ejemplo, mediante- el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Después que las células de hzbridoma deseadas son identificadas, los clones pueden subclonarse limitando los procedimientos de dilución y el crecimiento usando métodos estándar. Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen el medio de Eagle modificado por Dulbecco y el medio RPMI-1640. De manera alternativa, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como ascitis en un mamífero . Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se aislan o purifican a partir del medio de cultivo o del fluido de ascitis mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulina, tales como: proteína A-Sepharose, cromatografía con hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía por afinidad. Los anticuerpos monoclonales también se pueden producir usando métodos de ADN recombinante, por ejemplo, los que se describen en la patente de EE.UU. Núm. 4,816,567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede aislarse fácilmente y someterse a secuenciación usando procedimientos convencionales, por 26 ejemplo, usando sondas de oligonucleótido que tienen la capacidad de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino (Innis M. et al. en "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic, San Diego, CA (1990), Sanger, F.S, et al. Proc. Nat. Acad. Sci. 74:5463-5467 (1977)). Las células de hibridoma descritas en la presente sirven como fuente preferida de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede ponerse en vectores de expresión. Los vectores se transfectan entonces en células hospedadoras , tales como células COS de simio, células ováricas de hámster chino (o células CHO, por "Chínese hámster ovary") o células de mieloma que de ninguna manera producen la proteína inmunoglobulina . Las células hospedadoras recombinantes se usan para producir los anticuerpos monoclónales deseados. El ADN también se puede modificar, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de dominios constantes de cadena pesada y ligera de humano en lugar de las secuencias homologas de murino o al unir covalentemente la secuencia de codificación de la inmunoglobulina con toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no es inmunoglobulina. Este polipéptido que no es inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno 27 de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico . Los anticuerpos monovalentes pueden producirse usando la expresión recombinante de una cadena ligera de inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada se trunca, por lo general, en cualquier punto de la región Fe para evitar la reticulación de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteina pertinentes son sustituidos con otro residuo de aminoácidos o se suprimen para evitar la reticulación. De manera similar, para la producción de anticuerpos monovalentes se pueden usar métodos in vitro. Para producir los fragmentos del anticuerpo se puede 'usar la digestión de anticuerpos, de preferencia, de fragmentos Fab, usando métodos conocidos. 'Los anticuerpos y los fragmentos del anticuerpo pueden producirse usando las bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas usando las técnicas descritas en McCafferty, et al., Nature 348:552-554 (1990). Clackson, et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks, et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos de murino y de humano, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de gran afinidad (intervalo n ) mediante revoltura de cadena (Marks, et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)), asi como por infección 28 combinatoria y recombinación in vivo como ' estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse, et al., Nuc. Acids. Res. 21:2265-2266 (1993)). De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de ibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. Adicionalmente, el ADN puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación de los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera humanas en el lugar de las secuencias de murino homologas (patente de EE.UU. Núm. 4, 816,567; Morrison, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:6851 (1984)), o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación de un polipéptido que no es inmunoglobulina. Normalmente, estos polipéptidos que no son inmunoglobulina son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que contiene un sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno y otro sitio de combinación de antigeno que tiene especificidad por un antigeno diferente . Los anticuerpos también pueden producirse mediante el uso de fusión eléctrica en vez de la fusión 29 química para formar hibridomas . Esta técnica está bien establecida. En lugar de la fusión, también se puede transformar una célula B para convertirla en inmortal usando, por ejemplo, un virus de Epstein Barr o un gen transformador, ver "Continuously Proliferating Human Cell Lines Synthesizing Antibody of Predetermined Specificity, " Zurawaki, V. R. et al . , en "Monoclonal Antibodies," ed. por Kennett R. H. et al, Plenum Press, N.Y. 1980, págs . 19-33.

Anticuerpos humanizados Los anticuerpos humanizados pueden producirse usando el método descrito "por Winter en Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); y Verhoeyen et al., Science, 239:1 534-1536 (1988). La humanización se logra al sustituir la CDR de ratón o secuencias de la CDR por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado cuenta con uno o más aminoácidos introducidos al mismo desde una fuente no humana. Estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos, donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son, por lo regular, anticuerpos de humano en los cuales algunos residuos CDR y, posiblemente, algunos residuos FR son sustituidos por los residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, de murino o bovino) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulina o fragmentos de inmunoglobulina, tales como Fv, Fab, Fab ' , F(ab')2 u otras subsecuencias de unión con antigeno de anticuerpos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales, los residuos de una región determinante complementaria (CDR) del receptor son reemplazados por los residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donador), como los de ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. Algunas veces, los residuos del armazón Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Los anticuerpos humanizados también contienen residuos que no se encuentran ni en el anticuerpo receptor ni en la CDR importada o secuencias del armazón. En general, los anticuerpos humanizados contienen prácticamente la totalidad de por lo menos uno y, por lo regular, dos dominios variables, donde todas o prácticamente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o prácticamente todas las regiones FR son las de una secuencia de consenso de 31 inmunoglobulina humana. Los anticuerpos humanizados contienen, en forma óptima, al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, por lo regular, la de una inmunoglobulina humana.

Anticuerpos de humano Los anticuerpos humanos o de humano pueden producirse usando varias técnicas conocidas en el campo, por ejemplo, las bibliotecas de exhibición de fagos, como se describe en Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol . , 227:381 (1991) y en Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Los anticuerpos monoclonales de humano pueden producirse usando las técnicas descritas en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, pág. 77 (1985) y Boemer et al., J. Immunol . , 147(1): 86-95 (1991). De manera alternativa, se tiene a la disposición animales transgénicos, por ejemplo, ratones, los cuales, después de la inmunización, pueden producir un repertorio completo de anticuerpos de humano en ausencia de la producción endógena de inmunoglobulina. Estos ratones transgénicos pueden obtenerse de Abgenix, Inc., Fremont, California, y de Medarex, Inc., Annandale, New Jersey. Se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región (JH) de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de la linea germinal produce la total inhibición 32 de la producción endógena del anticuerpo. La transferencia del arreglo del gen de la inmunoglobulina de la línea germinal humana en estos ratones mutantes de la línea germinal resultará en la producción de anticuerpos de humano con el desafío del antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos de humano también pueden derivarse de bibliotecas de exhibición de fagos (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991); Vaughan, et al., Nature Biotech 14:309 (1996)).

Anticuerpos biespecificos Los anticuerpos biespecificos se pueden producir por la coexpresión recombinante de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades. Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos monoclonales, de preferencia, de humano o humanizados, que tienen especificidades de unión al menos por dos antígenos diferentes. En la presente invención, una de las especificidades de unión es por el receptor activador del NFAT y la otra es por cualquier otro antígeno, de 33 preferencia, un receptor de superficie celular o subunidad receptora. Debido al surtido aleatorio de las cadenas pesada y ligera de la inmunoglobulina, estos hibridomas producen una mezcla potencial de diez anticuerpos diferentes. Sin embargo, sólo uno de estos anticuerpos tiene la estructura biespecifica correcta. La recuperación y purificación de la molécula correcta se logra, normalmente, por cromatografía por afinidad; Los dominios variables del anticuerpo que tienen las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina. La fusión se realiza, de preferencia, con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina que contiene al menos parte de las regiones de articulación, CH2 y CH3. De preferencia, la primera región constante de cadena pesada (CHl) que contiene el sitio necesario para la unión con la cadena ligera está presente al menos en una de las fusiones . Los ADN que codifican la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la inmunoglobulina se insertan en vectores de expresión separados y se cotransfectan en un organismo hospedador adecuado. Las técnicas adecuadas mostradas para producir anticuerpos biespecíficos se describen en Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .

Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados pueden producirse mediante los métodos de fusión de proteínas, por ejemplo, acoplando el grupo amina de un anticuerpo al grupo tiol de otro anticuerpo o de otro polipéptido. En caso necesario y usando los métodos conocidos, se puede introducir un grupo tiol. Por ejemplo, las inmunotoxinas que contienen un anticuerpo o fragmento -de anticuerpo y una toxina polipeptídica pueden producirse usando una reacción de intercambio de bisulfuro o al formar un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este fin incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato . Estos anticuerpos pueden usarse para dirigir células del sistema inmunitario hacia células indeseables o para tratar infecciones por VIH.

Polinucleótidos En otro aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por SEQ ID NO:l; una variante de la SEQ ID NO:l; un fragmento de la SEQ ID NO:l; una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tienen la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por la SEQ ID NO: 2; una variante de la SEQ ID NO: 2; y un fragmento de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el polinucleótido aislado contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por los aminoácidos 43 a 150 de la SEQ ID NO: 2 o por los fragmentos del antagonista de la misma. Los polinucleótidos aislados de la presente invención son, de preferencia, secuencias de codificación para los receptores que activan el NFAT involucradas en la regulación por transcripción de varios genes de receptor y de citoquina. Los polinucleótidos se usan para producir receptores activadores del NFAT que funcionan como antigenos en el proceso utilizado para producir los anticuerpos agonista y antagonista que específicamente se unen con receptores que activan el NFAT e inhiben o activan la expresión o acción de dichos receptores.

Vectores y células hospedadoras En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para los receptores activadores del NFAT de la presente invención y una célula hospedadora que contiene dicho vector., A manera de ejemplo, las células hospedadoras pueden ser células de mamífero (por ejemplo, células CHO) , 36 células procarióticas (por ejemplo, de E. coli) o células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) . De manera adicional, se proporciona un proceso para producir polipéptidos fusionados de vertebrado, que comprende cultivar células hospedadoras en condiciones adecuadas para la expresión del fusionado de vertebrado y la recuperación del mismo a partir del cultivo celular.

Expresión recomblnante de receptores activadores del NFAT Se suministraron receptores activadores del NFAT recombinantes, aislados y purificados, de conformidad con la presente invención mediante la incorporación de la secuencia de nucleótidos correspondiente en los vectores de expresión y al expresar la secuencia de nucleótidos en células hospedadoras adecuadas para producir el polipéptido .

Vectores de expresión Mediante el uso de técnicas bien conocidas se pueden preparar los vectores de expresión recombinantes que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido. Los vectores de expresión incluyen una secuencia de nucleótidos funcionalmente ligada con las secuencias de nucleótidos reguladores de la transcripción o la traducción, como los que se derivan de genes de 37 mamífero, microbio, virus o insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras incluyen promotores de la transcripción, operadores, potenciadores , sitios de unión ribosomales de mARN y las secuencias adecuadas que controlan el inicio y término de la transcripción y la traducción. Las secuencias de nucleótidos están "funcionalmente ligadas" cuando la secuencia reguladora se relaciona funcionalmente con la secuencia de nucleótidos del polipéptido adecuado. De este modo, una secuencia de nucleótidos promotora está funcionalmente ligada a una secuencia del receptor activador del NFAT si la secuencia de nucleótidos promotora controla la transcripción de la secuencia de nucleótidos adecuada. La capacidad para la replicación en las células hospedadoras deseadas, conferida, normalmente, por un origen de la replicación y un gen de selección por medio del cual se identifican los transformados, puede incorporarse de manera adicional en el vector de expresión. Además, en los vectores de expresión pueden incorporarse las secuencias que codifican para los péptidos de señal adecuados que no están naturalmente asociados con los receptores que activan el FAT. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos para un péptido de señal (guía secretora) pueden fusionarse en el marco con la secuencia de polipéptidos , de modo que el polipéptido se traduzca 38 inicialmente como una proteina de fusión que contiene el péptido de señal. Un péptido de señal que funciona en las células hospedadoras pretendidas aumenta la secreción extracelular del polipéptido adecuado. El péptido de señal puede escindirse del polipéptido después que el polipéptido ha sido secretado por la célula.

Células hospedadoras Las células hospedadoras adecuadas para la expresión de los receptores activadores del NFAT. incluyen células procariotas, de levadura, archae y otras células eucarióticas . En la técnica se conocen bien la clonación y los vectores de expresión adecuados para usarlos con hospedadores celulares bacterianos, fúngicos, de levadura y de mamífero, por ejemplo, Pouwels et al. Cloning Vectors : A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) . El vector puede ser un vector de plásmido, un vector de fago de una sola hebra o de doble hebra o un vector viral de ARN o ADN de una sola hebra o de doble hebra. Estos vectores pueden introducirse en células como polinucleótidos , de preferencia, como ADN, usando técnicas bien conocidas para la introducción de ADN y ARN en células. Los vectores, en el caso de vectores de vectores virales y de fago, también pueden introducirse y, de preferencia, se introducen en células como virus empacados o encapsulados por medio de 39 técnicas bien conocidas para la infección y transducción . Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En el último caso, la propagación viral se presentará, por lo general, sólo en células hospedadoras complementarias. Para producir la proteina usando ARN derivado de las presentes construcciones de ADN también se podrían utilizar sistemas de traducción acelular. Las procariotas útiles como células hospedadoras en la presente invención incluyen organismos gram negativos o gram positivos, tales como E. coli o Bacilli. En una célula hospedadora procariótica, un polipéptido puede incluir un residuo de metionina N-terminal para facilitar la expresión del polipéptido recombinante en la célula hospedadora procariótica. La Met N-terminal puede escindirse del polipéptido receptor activador del NFAT recombinante expresado. Las secuencias promotoras comúnmente utilizadas para los vectores de expresión de la célula hospedadora procariótica recombinante incluyen ß-lactamasa y el sistema promotor de lactosa. Los vectores de expresión de uso en células hospedadoras pr'ocarióticas incluyen, de manera general, uno o más genes marcadores fenotipicos seleccionables . ün gene marcador fenotipico seleccionable es, por ejemplo, un gene que codifica una proteina que confiere resistencia 40 antibiótica o que proporciona un requisito autotrófico. Ejemplos de vectores de expresión útiles para las células hospedadoras procarióticas incluyen a los que se derivan de plásmidos que pueden obtenerse en forma comercial, tal como el vector de clonación pBR322 (ATCC 37017) . El pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y, de esta manera, proporciona una forma sencilla para identificar las células transformadas. Para construir un vector de expresión usando el pBR322, en el vector pBR322 se insertan un promotor adecuado y una secuencia de ADN. Otros vectores que pueden obtenerse en forma comercial incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) , pGEMl (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, EE.UU.) y el pET (Novagen, Madison, Wisconsin, EE.UU.) y la serie de vectores pRSET (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, EE.UU.) (Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 37 (1991); Schoepfer, R. Gene 124: 83 (1993) ) . las secuencias promotoras comúnmente utilizadas para vectores de expresión de célula hospedadora procariótica recombinantes incluyen T7, (Rosenberg, A.H., Lade, B. N., Chui, D-S., Lin, S-W., Dunn, J. J., y Studier, F. W. (1987) Gene (Amst.) 56, 125-135), ß-lactamasa (penicilinasa) , sistema promotor de lactosa (Chang et al., Nature 275:615, (1978); y Goeddel et al., Nature 281:544, 41 (1979)), sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel et al., Nucí. Acids Res. 8:4057, (1980)) y promotor de tac (Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, pág. 412 (1982) ) . Las levaduras útiles como células hospedadoras en la presente invención incluyen a las' de los géneros Saccharomyces, Pichia, K. Actinomycetes y Kluyveromyces . Los vectores de levaduras contendrán, con frecuencia, un origen de secuencia de replicación de un plásmido de levadura 2u, una secuencia que replica en forma autónoma (ARS o "autonomously replicating sequence"), una región promotora, secuencias para la poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gene marcador seleccionable . Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otras, metalotioneina, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J. Biol . Chem. 255:2073, (1980)) u otras enzimas glicoliticas (Holland et al., Biochem. 17:4900, (1978)), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfof uctoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa . Otros vectores, y promotores adecuados para usarlos en la expresión de levadura se describen, de manera adicional, en Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991). Otros 42 promotores y vectores adecuados para la levadura y los protocolos de transformación de levadura son bien conocidos en la técnica. Los protocolos de transformación de levadura son conocidos por los experimentados en la técnica. Uno de estos protocolos es el descrito por Hinnen et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 75:1929 (1978). El protocolo Hinnen selecciona Trp.sup.+ transformados en un medio selectivo, donde el medio selectivo contiene 0.67% de base nitrogenada de levadura, 0.5% de casaminoácidos, 2% de glucosa, 10 µg/ml de adenina y 20 µg/ml de uracilo. Los sistemas para cultivar células hospedadoras de mamífero o de insecto bien conocidos en la técnica también podrían usarse para expresar receptores activadores del NFAT recombinantes, por ejemplo, sistemas de Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas en células de insectos (Luckow y Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)) o se pueden usar células del ovario de hámster chino (CHO) para la expresión en mamífero. Las secuencias de control por transcripción y por traducción para los vectores de expresión de células hospedadoras de mamífero pueden separarse de genomas virales. Las secuencias promotoras y las secuencias aumentadoras comúnmente utilizadas se derivan de: poliomavirus, adenovirus 2, virus 43 de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano. Las secuencias de ADN derivadas del genoma viral SV40 pueden usarse para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia del gen estructural en una célula hospedadora de mamífero, por e emplo, el origen SV40, promotor temprano y tardío, aumentador, sitios de empalme y poliadenilación. Los promotores virales temprano y tardío son particularmente útiles debido a que los dos pueden obtenerse con facilidad de un genoma viral en forma de un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral. Los vectores de expresión ilustrativos para usarlos en células hospedadoras de mamífero son bien conocidos e la técnica. Los receptores activadores del NFAT pueden, cuando aporten algún beneficio, expresarse como una proteína de fusión que tiene al receptor activador del NFAT unido a un segmento de fusión. El segmento de fusión ayuda, con frecuencia, a la purificación de la proteína, por ejemplo, al permitir que la proteína de fusión se aisle y purifique mediante cromatografía por afinidad. Las proteínas de fusión pueden producirse al cultivar una célula recombinante transformada con una secuencia de ácidos nucleicos de fusión que codifica para una proteína que incluye el segmento de fusión unido a cualquiera del extremo terminal carboxilo y/o amino de la proteína. Los 44 segmentos de fusión preferidos incluyen, aunque no se limitan a, glutatión-S-transferasa, ß-galactosidasa, un segmento de polihistidina capaz de unirse con un ión metálico divalente, y proteina de unión con maltosa.

Expresión y recuperación De conformidad con la presente invención, los receptores activadores del NFAT aislados y purificados pueden ser producidos por los sistemas de expresión recombinante anteriormente descritos. El método comprende cultivar una célula hospedadora transformada con un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido en condiciones suficientes para promover la expresión del polipéptido. El polipéptido se recupera entonces del medio de cultivo o de extractos celulares, dependiendo del sistema de expresión utilizado. Como es sabido por los experimentados en la técnica, los procedimientos para purificar un polipéptido recombinante variarán de conformidad con factores tales como el tipo de células hospedadoras utilizadas y de si el polipéptido recombinante es secretado o no en el medio de cultivo. Cuando se emplean sistemas de expresión que secretan el polipéptido recombinante, primero se puede concentrar al medio de cultivo. Después del paso de la concentración, el concentrado puede aplicarse a una matriz de purificación, 45 tal como un medio filtrante de gel. De manera alternativa, se puede usar una resina de intercambio aniónico, por ejemplo, una matriz o un sustrato que tiene grupos dietilaminoetilo (DEAE) colgantes'. Las matrices pueden ser de acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa u otros tipos comúnmente utilizados en la purificación de proteínas. También se puede utilizar un paso de intercambio catiónico. Los intercambiadores catiónicos adecuados incluyen varias matrices insolubles que contienen grupos sulfopropilo o carboximetilo . Adicionalmente, para purificar aún más la proteína, se pueden usar uno o más pasos de cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (RP-HPLC) que use un medio de RPHPLC hidrofóbico (por ejemplo, gel de sílice que tiene suspendidos grupos metilo u otros grupos alifáticos) , HPLC de intercambio iónico (por ejemplo, gel de sílice que tiene suspendidos grupos DEAE o grupos sulfopropilo (SP) ) o HPLC de interacción hidrofóbica (por ejemplo, gel de sílice que tiene suspendidos grupos fenilo, butilo u otros grupos hidrofóbicos) . Algunos o todos los pasos de purificación precedentes, en diversas combinaciones, son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para proporcionar un polipéptido recombinante aislado y purificado. El polipéptido recombinante producido en el cultivo bacteriano se aisla, normalmente, mediante la alteración inicial de las células hospedadoras, por centrifugación, por extracción de los glóbulos celulares si el polipéptido es insoluble, o del liquido sobrenadante si el polipéptido es soluble, seguido por uno o más pasos de concentración, salteado, intercambio iónico, purificación por afinidad o cromatografía por exclusión de tamaños. Finalmente, se puede utilizar la RP-HPLC para los pasos de purificación finales. Las células microbianas pueden alterarse usando cualquier método conveniente, incluidos: los ciclos de congelación-descongelación, sonicación, alteración mecánica o el uso de agentes de lisado celular.

Tamizado de agonistas y antagonistas En otro aspecto, la presente invención proporciona un método de tamizado para identificar los agonistas y antagonistas del receptor activador del FA . El método de tamizado incluye exponer el receptor que activa el NFAT ante un potencial agonista del NFAT//antagonista del NFAT y determinar si el agonista/antagonista potencial se une con el receptor. Si el agonista/antagonista potencial se une con el receptor, entonces hay bases para suponer que el potencial agonista/antagonista funcionará realmente como un agonista o antagonista cuando se administre in vivo a un paciente y se exponga al receptor nativo activador del NFAT. Los 47 agonistas del NFAT y los antagonistas del NFAT identificados usando el método pueden caracterizarse como un agonista o un antagonista al exponer las células capaces de producir citoquinas con el agonista/antagonista y medir la producción de citoquina en comparación con las células no expuestas. Los agonistas aumentarán la producción de citoquina; los antagonistas reducirán la producción de citoquina. Otro método de tamizado comprende transfectar las células con un gene reportero que contiene las secuencias de unión con ADN del NFAT. De preferencia, el potencial agonista/antagonista es un compuesto orgánico o un polipéptido, incluidos los anticuerpos. Los métodos de tamizado son útiles para identificar compuestos que pueden funcionar como fármacos para evitar o tratar enfermedades, en particular, enfermedades caracterizadas por la producción relativamente baja o relativamente elevada de citoquina, en comparación con los estados que no son de enfermedad.

Tamizado del efecto secundario adverso En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de tamizado para determinar si es probable que las sustancias farmacéuticas provoquen efectos secundarios indeseables asociados con la reducción o el aumento en la producción de citoquina y del receptor 48 celular cuando se administra a un animal para la indicación deseada. El método de tamizado comprende exponer los receptores que activan el NFAT ante la sustancia farmacéutica y determinar si la sustancia farmacéutica se une a los receptores o imitan la función biológica del ligando del receptor provocando un cambio en la producción de citoquina. Si la sustancia farmacéutica se une con los receptores o imita la función biológica del ligando del receptor, existe la probabilidad de que la sustancia farmacéutica provoque efectos secundarios adversos cuando se administre a un animal para la indicación deseada. Los efectos secundarios adversos resultan de un cambio indeseable en la producción de citoquina. Las sustancias farmacéuticas que pueden tamizarse con este método incluyen, aunque no se limitan a, polipéptidos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridós , oligosacáridos , nucleótidos, moléculas orgánicas, moléculas bioorgánicas, compuestos peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, y secuencias de control por transcripción y por traducción.

En una modalidad preferida, los anticuerpos que se administrarán para una indicación particular se tamizan para determinar si reaccionan en forma cruzada con los receptores activadores del NFAT y, por lo tanto, es probable que provoquen efectos secundarios indeseables 49 cuando se administren para la indicación deseada.

Modulación de la expresión del receptor En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para bloquear o modular la expresión de un receptor activador del NFAT celular al interferir con la transcripción o la traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el NFAT. El método comprende exponer una célula capaz de expresar un receptor activador del NFAT en una molécula que interfiere con la adecuada transcripción o traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el NFAT. La molécula puede ser una molécula orgánica, una molécula bioorgánica, un nucleótido antisentido, un nucleótido ARNi o una ribozima. En una modalidad preferida, el método comprende bloquear o modular la expresión de los receptores activadores del NFAT celular al exponer una célula a un polinucleótido que es antisentido o forma un triple hélice con el ADN que codifica para el receptor activador del NFAT o con el ADN que regula la expresión del ADN que codifica para el receptor que activa el NFAT. La célula se expone al polinucleótido antisentido o al polinucleótido formador de la triple hélice en una cantidad suficiente para inhibir o regular la expresión del receptor activador del NFAT. 50 Además, la presente invención proporciona un método para bloquear o modular la expresión de receptores activadores del NFAT en un animal al administrarle al animal un polinucleótido que es antisentido con o forma una triple hélice con el ADN que codifica para el receptor que activa el NFAT o con ADN que regula la expresión del ADN que codifica para el receptor que activa el FAT. Al animal se le administra un polinucleótido antisentido o un polinucleótido formador de la triple hélice en una cantidad suficiente para inhibir o regular la expresión del receptor activador del NFAT en el animal. De preferencia, el polinucleótido antisentido o el polinucleótido formador de la triple hélice es un polinucleótido de ADN o A N. Los métodos para exponer las células ante los polinucleótidos antisentido y para administrar los polinucleótidos antisentido en animales son bien conocidos en la técnica. En un método preferido, el polinucleótido se incorpora en el genoma celular usando los métodos conocidos y permitiendo que se exprese dentro de la célula. El polinucleótido antisentido expresado se une con los polinucleótidos que codifican para los receptores que activan el NFAT e interfiere con su transcripción o traducción . Los métodos son útiles para inhibir la expresión del receptor y la citoquina mientras se realiza la 51 investigación en varios tipos de células, por ejemplo, neutrófilos o mastocitos, y para prevenir o tratar la enfermedad animal caracterizada por el exceso en la producción de citoquina comparada con los estados que no son de enfermedad.

Diagnóstico de predisposición a la enfermedad En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para diagnosticar la predisposición de un paciente a generar enfermedades provocadas por la expresión no regulada de citoquinas . La invención tiene como base el descubrimiento de que la presencia de o el aumento en la cantidad de los receptores que activan el NFAT en ciertas células, tejidos o fluidos corporales del paciente indican que el paciente está predispuesto a ciertas enfermedades inmunitarias . En una modalidad, el método comprende recolectar del paciente una muestra celular, de tejido o de fluido corporal que se sabe contiene algunos, si es que los contiene, receptores que activan el NFAT, analizar en el tejido o fluido corporal la presencia del receptor que activa el NFAT en el tejido y predecir la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias, con base en la presencia del receptor que activa el NFAT en el tejido o fluido corporal. En otra modalidad, el método comprende recolectar del paciente una muestra celular, de tejido o de fluido corporal que se sabe contiene un nivel definido de receptores que activan el NFAT, analizar en el tejido o fluido corporal la cantidad del receptor que activa el NFAT que hay en el tejido y predecir la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias , con base en el cambio en la cantidad del receptor que activa el NFAT en el tejido o fluido corporal, en comparación con un nivel definido o probado establecido para la célula, tejido o fluido corporal normales. El nivel definido del receptor que activa el NFAT puede ser una cantidad conocida basada en los valores de la literatura o pueden determinarse con anticipación al medir la cantidad en células, tejido o fluidos corporales normales. De manera especifica, la determinación de los niveles del receptor que activa el NFAT en ciertos tejidos o fluidos corporales permite la detección de enfermedades inmunitarias, especifica y temprana antes de que se presente la enfermedad. Las enfermedades inmunitarias que pueden diagnosticarse usando el presente método incluyen, aunque no se limitan a, las enfermedades inmunitarias descritas en la presente. En la modalidad preferida, el tejido o fluido corporal es sangre periférica, leucocitos sanguíneos periféricos, los tejidos de biopsia, tales como las biopsias de pulmón o de piel, y el líquido sinovial y el tejido. 53 Prevención y tratamiento de enfermedades En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para prevenir o tratar enfermedades mediadas por la proteina NFAT en un mamífero . El método comprende administrar al mamífero una cantidad de un agonista o antagonista del receptor activador del NFAT, que previene o trata la enfermedad. El agonista o antagonista se une con el receptor que activa el NFAT y regula la expresión del receptor celular y de la citoquina para producir niveles de citoquina característicos de estados que no son de enfermedad. De preferencia, la enfermedad es una alergia, asma, una enfermedad autominmunitaria u otra enfermedad inflamatoria. Con la máxima preferencia, la enfermedad es una alergia o el asma. Las dosificaciones del agonista o antagonista del receptor que activa el NFAT varían de conformidad con la edad, tamaño y carácter del mamífero y enfermedad particulares . Los experimentados en la técnica pueden determinar las dosificaciones con base en estos factores. El agonista o antagonista puede administrarse en regímenes de tratamiento coherentes con la enfermedad, por ejemplo, una sola dosis o una cuantas dosis durante algunos días para mejorar un estado de enfermedad o dosificaciones periódicas durante un tiempo prolongado para prevenir la alergia o el asma. 54 Los agonistas y antagonistas pueden administrarse al mamífero en cualquier forma aceptable, que incluye la inyección, el uso de un implante y lo similar. Se prefieren las inyecciones e implantes debido a que permiten el control preciso del tiempo y los niveles de dosificación usados en la administración. Los agonistas y antagonistas se administran, de preferencia, en forma parenteral. Como se utiliza en la presente, por administración parenteral se entiende la inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal o un implante subcutáneo. Cuando se administra mediante una inyección, los agonistas y antagonistas pueden administrarse al mamífero en una formulación inyectable que contenga cualquier portador compatible con los agonistas y antagonistas y sea biocompatible, tales como los diversos vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes . Los vehículos acuosos, tales como . el agua, que no tienen pirógenos no volátiles, agua esterilizada y . agua bacteriostática también son adecuados para formar las soluciones inyectables. Además de estas formas de agua, se pueden usar otros varios vehículos acuosos. Estos incluyen composiciones inyectables isotónicas que pueden esterilizarse, tal como cloruro de sodio, solución de Ringer, dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio y solución de Ringer con lactato . Como sistemas disolventes para las composiciones también se pueden usar 55 vehículos no acuosos, tales como el aceite de semilla de algodón, el aceite de ajonjolí o el aceite de cacahuate, y ásteres tales como miristato de isopropilo. En forma adicional, se pueden añadir diversos aditivos que aumentan la estabilidad, la esterilidad y la isotonicidad de la composición éstos incluyen conservadores antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y amortiguadores. Sin embargo, todo diluyente o aditivo utilizado tendría que ser biocompatible y compatible con los agonistas y antagonistas de conformidad con la presente ' invención .

Diagnóstico del polipéptido NFAT Los anticuerpos de la presente invención también pueden utilizarse en un método diagnóstico para detectar los receptores que activan el NFAT expresados en células, tejidos o fluidos corporales específicos o en sus componentes. El método comprende exponer células, tejidos o fluidos corporales o sus componentes ante un anticuerpo de la presente invención y determinar si las células, tejidos o fluidos corporales o sus componentes se unen al anticuerpo. Las células, tejidos o fluidos corporales o sus componentes que se unen a las células de anticuerpo, tejidos o fluidos corporales o sus componentes que se unen al anticuerpo se diagnostican como células, tejidos o fluidos corporales que contienen receptores activadores del 56 NFAT. Este método es útil para determinar si una célula, tejido o fluido corporal particular es alguno de un cierto tipo de célula, tejido o fluido corporal que con anterioridad se sabia que contenia receptores activadores del FAT. Se pueden usar varios métodos de diagnóstico conocidos en la técnica, por ejemplo, ensayos de unión competitiva, ensayos de emparedado directo o indirecto y ensayos de inmunoprecipitación conducidos ya sea en fases homogéneas o heterogéneas .

Purificación del polipeptido NFAT Los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en un método para aislar y purificar los receptores que activan el NFAT a partir de cultivos de células recombinantes , contaminantes y sus entornos nativos . El método comprende exponer una composición que contiene receptores activadores del NFAT y contaminantes ante un anticuerpo capaz de unirse con los receptores, permitiendo que los receptores que activan el NFAT se unan con el anticuerpo, separando los complejos anticuerpo-receptor de los contaminantes y recuperando de los complejos los receptores activadores del FAT. Se pueden usar varios métodos de purificación conocidos en la técnica, por ejemplo, los métodos de purificación por afinidad que del cultivo de células recombinantes o de 57 fuentes nativas recuperan los receptores que activan el NFAT. En este método, los anticuerpos contra los receptores activadores del NFAT se inmovilizan sobre un soporte adecuado, tal como una resina Sephadex o papel filtro, usando métodos bien conocidos en la técnica. El anticuerpo inmovilizado se pone en contacto a continuación con una composición de muestra que contiene los receptores que activan el NFAT, que se van a purificar, y los contaminantes. El soporte se lava entonces con un disolvente adecuado capaz de eliminar prácticamente todo el material de la muestra, con excepción de los receptores activadores del NFAT ligados al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, el soporte se lava con otro disolvente adecuado que quita del anticuerpo los receptores activadores del NFAT.

Método de inducción por tolerancia En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para inducir la tolerancia en un mamífero que pueda experimentar una respuesta inmunitaria indeseable. El método comprende administrar al paciente un antagonista del receptor activador del NFAT un cantidades suficientes para inhibir la translocación de la proteína NFAT en el núcleo celular y su posterior interacción con la proteína activadora del factor de la transcripción 1 (AP- 58 1) , un factor de la transcripción que se sabe interacciona con la proteina NFAT. De preferencia, el antagonista es un anticuerpo que se une con el receptor que activa el NFAT y previene que las proteínas NFAT se translocan en el núcleo e interaccionen con el AP-1. La tolerancia se induce mediante un proceso de señalización incompleta. Los autoantígenos estimulan solamente al receptor de células T y provocan un aumento en los niveles de calcio intracelular que activan las proteínas FAT. Las proteínas NFAT se unen entonces en sitios específicos del ADN de células T y dispara la expresión génica que induce la tolerancia. Sin embargo, las proteínas NFAT interaccionan, normalmente, con otro factor de transcripción conocido como AP-1. La interacción entre estos factores de transcripción induce una respuesta inmunitaria total, donde las células T luchan contra antígenos extraños. No obstante, si las proteínas NFAT no interaccionan con el AP-1, se produce un estado donde no hay respuesta de las células T, en el cual, las células T toleran los antígenos. Una respuesta inmunitaria completa a los antígenos extraños es la causa de muchas respuestas inmunitarias indeseables, por ejemplo, alergias y rechazos a los órganos transplantados. Por lo tanto, cualquier agente que evite la interacción del NFAT y el AP-1 evitará estas respuestas indeseables y destructivas e inducirá la 59 tolerancia . En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para inducir la tolerancia en un paciente con un transplante de órgano. En general, una respuesta inmunitaria completa ante los antigenos extraños del órgano transplantado es la causa del rechazo al órgano. Actualmente, el fármaco inmunosupresor ciclosporina es usado por pacientes con transplante para prevenir el rechazo al apagar la actividad de las proteínas NFAT. No obstante, este uso de la ciclosporina evita el inicio de la tolerancia de las células T a la proteína NFAT. Por lo tanto, la prevención de la interacción de la proteína NFAT y el AP-1 inducirá la tolerancia al órgano transplantado.

Animales con desactivación génica En otro aspecto, la presente invención proporciona un animal con desactivación génica que contiene un genoma . que tiene una alteración heterocigótica u homocigótica en su gen receptor endógeno activador del NFAT que suprime o previene la expresión de las proteínas receptoras activadoras del NFAT biológicamente funcionales . De preferencia, el animal con desactivación génica de la presente invención tiene una alteración homocigótica en su gen receptor endógeno activador del NFAT. De preferencia, el animal con desactivación génica de la presente invención 60 es un ratón. El animal con desactivación génica puede ser preparado con facilidad usando técnicas conocidas por los experimentados en el campo. La alteración génica puede lograrse de varias formas que incluyen la introducción de un codón de detención en cualquier parte de la secuencia de codificación del polipéptido que produce un polipéptido biológicamente inactivo, la introducción de una mutación en una secuencia promotora o en otra secuencia reguladora que suprima o prevenga la expresión del polipéptido, la inserción en el gen de una secuencia exógena que lo desactive, y la supresión de las secuencias del gen. Se dispone de varias técnicas para introducir secuencias de ADN especificas en la linea germinal de mamífero y para lograr la transmisión estable de estas secuencias (transgenes) a cada generación posterior. La técnica más comúnmente utilizada es la microinyección directa del ADN en los pronúcleos de oocitos fertilizados. Los ratones u otros animales derivados de · estos oocitos serán, con una frecuencia de aproximadamente 10 a 20%, los fundadores transgénicos que mediante reproducción darán lugar a las diferentes líneas de ratones transgénicos . Los métodos para generar animales transgénicos mediante la manipulación de embriones y la microinyección, en particular, de animales como ratones, se han vuelto convencionales en la técnica, por ejemplo, las patentes de 61 EE.UU. Núm. 4,736,866, 4,870,009, y 4,873,191, y en Hogan, B., anipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboxatory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986) . Para la producción de otros animales transgénicos se usan métodos similares. Para crear ratones con desactivación génica (asi como otros animales) , en los cuales se han suprimido genes específicos, se puede usar la tecnología del hemocitoblasto de embrión (o célula ES, por "Embryonic Stem cell") . Los hemocitoblastos de embrión totipotentes, que pueden cultivarse in vitro y modificarse genéticamente, se agregan a embriones de ratón o se microinyectan en estos embriones para producir un ratón quimérico que puede transmitir esta modificación genética a su descendencia. Mediante reproducción dirigida, se puede obtener de este modo un ratón que carece de este gen. Para la producción de animales genéticamente modificados se cuenta con otros métodos varios, por ejemplo, para la producción de ratones transgénicos se puede usar la técnica de la inyección intracitoplásmica de esperma (ICSI) . Este método se necesita que dentro del citoplasma de un oocito no fertilizado se microinyecte la cabeza de un espermatocito, provocando la fertilización del oocito y la posterior activación de las divisiones celulares adecuadas de un embrión preimplantado . Los embriones de ratón obtenidos de 62 este modo se transfieren a una hembra receptora seudopreñada . La hembra dará a luz una carnada de ratones. En la ICSI aplicada a la producción de ratones transgénicos, una suspensión de esperma o de cabezas de espermatocitos se incuba con una solución que contiene las moléculas de ADN deseadas (transgén) . Estas interaccionan con el esperma, el cual, una vez microinyectado, actúa como un vehículo portador del ADN extraño. Una vez dentro del oocito, el ADN se integra en el genoma, para dar lugar a un ratón transgénico. Este método produce rendimientos superiores (por encima ' de 80%) de ratones transgénicos que los que se obtienen hasta la fecha usando los protocolos tradicionales de microinyección pronuclear.

Ejemplos Esta invención puede ilustrarse en forma adicional mediante los ejemplos siguientes de modalidades preferidas de la misma, aunque se entenderá que estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no se pretende que limiten el alcance de la invención, a menos que, específicamente, se indique de otra manera. 63 Ejemplo 1 Identificación del gen del receptor activador del NFAT En la base de datos IPI (International Protein Index) de proteínas humanas no redundantes se buscaron moléculas novedosas que contengan: 1) dominio de inmunoglobulina (Ig) , 2) motivo para la activación basada en el inmunorreceptor de tirosina (o ??? por "immunoreceptor tyrosine-based activation motif") y 3) región transmembrana. Esas son características comunes compartidas por los receptores activadores de señal que median las funciones del sistema inmunitario, incluidos los componentes de TCR, BCR, FcsRI y muchos otros receptores activadores recientemente identificados (Isakov 1997 "ITIMs and ITAMs" Immunologic Research 16:85). Para la búsqueda del dominio Ig se usó un método basado en el modelo de Markov oculto o HMM, por "Hidden Markov Model" . El HMM, que se construyó a partir de una alineación de 113 dominios de Ig de confianza y calibró usando el programa HMMER, se obtuvo de la base de datos Pfam (versión 6.6) . Para buscar las proteínas que contienen el motivo ITAM, primero se construyó un perfil del motivo con el formato PROSITE, basado en las particularidades comunes del motivo ITAM, y para hacer la búsqueda se usó el software "seedtop" (NCBI) . La predicción de la región transmembrana de gran escala para todas las proteínas IPI se realizó usando el software 64 MHMM versión 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/). Se encontró que una secuencia de proteínas hipotética, etiquetada como "IPI00086590" satisfacía los tres criterios. Se usó el procedimiento de clonación in silico para deri-var su secuencia de cADN de lonqitud completa mostrada en SEQ ID NO: 2.

Ejemplo 2 Análisis cuantitativo por PCR en tiempo real de la expresión del gen del receptor activador del NFAT Los cebadores de oligonucleótido que tienen la secuencia Directa: 5' TCCTGCTCTTTGGCTTCACC e Inversa: 5' GCCGTGCCCACTACACTCA se seleccionaron de las secuencias de nucleótidos del receptor que activa el NFAT usando Primer Express 2.0 (Applied Biosystems, Inc.) y se sintetizaron y usaron en las reacciones por PCR para supervisar continuamente la expresión del polinucleótido del receptor que activa el NFAT en tiempo real. Los ARN se aislaron para medir el nivel de la expresión del polinucleótido del receptor que activa el NFAT en los siguientes tejidos y células: cerebro; corazón; riñon; hígado; pulmón, bazo, monocitos, Daudi, una línea celular de linfoma de Burkitt; HPB-ALL, una línea celular de leucemia de célula T; THP-1, leucemia monocítica aguda; linfocitos; Jurkat, una línea celular de leucemia de célula T; HMC-1; una línea celular 65 de mastocitos ; HUVAC; células del endotelio vascular humano primario; neutrófilos ; PBMC, células mononucleares de sangre periférica; y cuatro diferentes lotes de sangre de cordón cultivada in vítro derivados de muestras de mastocitos . El análisis cuantitativo en tiempo real por PCR se realizó con el sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 (Applied Biosystems, Inc.), usando reactivos Taqman, de conformidad con las instrucciones del fabricante. Como plantillas PCR se usaron cantidades iguales del cADN de la primera hebra de las fuentes de células indicadas arriba en reacciones para obtener el ciclo umbral (Ct) y el Ct se normalizó usando el Ct conocido de ARN 18S para obtener el ACt. Para comparar niveles relativos de la expresión génica del polinucleótido del receptor que activa el NFAT en diferentes lineas celulares, los valores Ct se calcularon usando el más bajo nivel de expresión como la base, los cuales fueron convertidos entonces en valores de diferencia de veces la expresión real. Los resultados se muestran en el Cuadro 1.

Cuadro 1 Conjunto 1 de tejido/célula/línea celular Expresión relativa Cerebro 530 Corazón 432 Riñon 258 Hígado 191 Pulmón 1411 Bazo 4108 onocitos 19550 Daudi 443 HPB-ALL 3 THP-1 18441 Linfocitos 28570 Jurkat 4 Mastocitos cultivados 5082 HMC-1 344 HUVEC 1 Conjunto 2 Célula/Línea celular Expresión relativa HMC-1 1 Daudi 3 THP-1 81 Neutrófilos 362 PB C 79 Mastocitos cultivados (lote 1, semana 4) 23 Mastocitos cultivados (lote 1, semana 7) 56 astocitos cultivados (lote 2, semana 7) 84 Con referencia al Cuadro 1, los datos muestran que se encontró que el mARN del receptor que activa el NFAT era muy expresado en neutrófilos, monocitos primarios y lineas celulares monociticas, linfocitos y mastocitos cultivados in vitro. La expresión se detectó en tejidos del bazo y pulmón. En contraste, el nivel de expresión en el resto. de los tejidos y células (de cerebro, corazón; riñon, hígado, Daudi, HPB-ALL, Jurkat, HUVAC) era muy bajo.

Ejemplo 3 Clonación molecular y caracterización del receptor que activa el NFAT Dos cebadores oligo que abarcan el codón de metionina inicial (5'-CACCATG GAGAACCAGCCTG) y el codón de detención (5 ' -ACCTGGTCTATGAAAATCTC) , respectivamente, se usaron para clonar el cADN del receptor activador del NFAT a partir de monocitos humanos por medio de RT-PCR. Dos clones de cADN se aislaron y sometieron a secuenciación, encontrándose que eran idénticos a la secuencia de la región de codificación derivada de la clonación in-silico mostrada en la SEQ ID N0:1. La secuencia derivada de la clonación in-silico representa, probablemente, la región de 68 codificación completa del polinucleótido del receptor que activa el NFAT, puesto que contiene un motivo Kozak perfecto y tiene varios codones de detención en el marco que preceden a la metionina de inicio pronosticada. Además, tiene un péptido de señal putativo que inicia a partir de la metionina de inicio supuesta. Se pronosticó que el receptor que activa el NFAT era una proteína transmembrana de tipo I de 270 aminoácidos con una masa molecular calculada de aproximadamente 30 kD, un péptido de señal putativo en el N-terminal (aminoácidos 1 a 42), un dominio Ig (aminoácidos 43 a 150) en la región extracelular, un dominio transmembrana (aminoácidos 164 a 186) y un motivo ITAM (aminoácidos 220 a 235) en la región citoplásmica . Se localiza en el cromosoma 22gl3.2. La alineación del cADN con la secuencia genómica mostró que la región de codificación del polinucleótido receptor activador del NFAT contiene seis exones. En la región extracelular se encontró un sitio de N-glicosilación potencial (aminoácidos 107 a 110). El "norte electrónico", basado en la distribución de las fuentes de la biblioteca EST correspondientes, indicó que el receptor que activa el NFAT se expresa, preferentemente, en leucocitos. Mediante el uso de un SCANSITE basado en la web, mismo que fue diseñado para la búsqueda de motivos en el interior de las proteínas que probablemente serán fosforiladas por proteína 69 quinasas especificas o se unirán a dominios (http://scansite.mit.edu/), se pronosticó que el receptor activador del NFAT contenía un sitio de unión en la región citoplásmica para el dominio SH2 de Lck (linfocito proteína tirosina quinasa específica) , una molécula adaptadora de activación muy común en la transducción por señalización .

Ejemplo 4 Expresión del receptor activador del NFAT Para determinar el producto génico receptor que activa el NFAT, la región de codificación del polinucleótido que expresa el receptor activador del NFAT se sometió a subclonación en un vector de expresión pcDNA 3.1 de mamífero (INVITROGEN, CA) , con una etiqueta V5 fusionada en el marco con el C-terminal o el N-terminal, y después se sometió a transfectación transitoria en células 293T con Lipofectamine 2000. Toda la muestra de proteína celular se preparó volviendo a suspender 8 X 105 células en 100 ul de ddH20 y calentándolas a 98 °C durante 5 minutos después de añadir un volumen igual de 2 X el amortiguador de carga de la muestra. Las proteínas se separaron en 15% de SDS-PAGE y se transfirieron a la membrana. El receptor etiquetado que activa el NFAT fue detectado como una banda de proteína predominante de aproximadamente 35 kD y una 70 banda menor de aproximadamente 30 kD mediante la transferencia Western con un anticuerpo monoclonal anti-VS. Estas bandas de proteina no estaban presentes en las células transfectadas solamente con el vector de plásmido.

Ejemplo 5 Localización celular del receptor activador del NFAT Para determinar si el receptor que activa el NFAT se expresa en la superficie de la membrana, células 293T se sometieron a transfectación con la construcción del receptor activador del NFAT con una etiqueta V5 en su extermina! ' y las células se lisaron con el método de congelación-descongelación. Las células volvieron a suspenderse en 1 X de un amortiguador de lisis y se congelaron-descongelaron tres veces. La fracción de membrana insoluble se separó de las proteínas solubles mediante centrifugación a la máxima velocidad en una microcentrífuga . Las proteínas se separaron en 15% de SDS-PAGE . El receptor que activa el NFAT estaba presente principalmente en la fracción de membrana, · conforme se detectó mediante anticuerpos monoclonales anti-V5. Fue baja la detección en la fracción soluble. A continuación se realizó la tinción para inmunofluorescencia para determinar la ubicación y orientación del receptor que activa el NFAT en la membrana. 71 El receptor activador del NFAT se fusionó con la etiqueta V5 ya sea en el N-terminal o en el C-terminal y se sometió a transfección en células 293T. Las células se lavaron y pre-incubaron a 4°C durante 30 minutos en el amortiguador de disociación celular libre de enzimas (Invitrogen) que contenia 1% de BSA. Las células se incubaron entonces con anticuerpos monoclonales Anti-V5 conjugados con FITC (10 µg/ml) (Invitrogen) en el mismo amortiguador durante 30 minutos. Después de tres lavados, las células se volvieron a suspender en 1 X de PBS con/sin fijación mediante 1% de paraformaldehído y se analizaron por microcopia fluorescente (ZEISS Axioskop, Alemania) . Se encontró que el receptor activador del NFAT con etiqueta en el N-terminal fue detectado por anticuerpos monoclonales anti-V5 en la membrana tanto de células vivas (no fijadas) como fijadas en metanol, mientras que el receptor activador del NFAT con etiqueta en el C-terminal se detectó solamente en la membrana de células fijadas en metanol. Estos resultados muestran que el receptor que activa el NFAT es una proteina transmembrana que tiene el N-terminal expuesto hacia el exterior de la membrana celular.

Ejemplo 6 Activación del NFAT con el receptor activador del NFAT Se sabe que el primer nivel en la regulación de 72 la activación o inhibición de una respuesta inmunitaria se realiza en el sitio receptor e implica módulos de proteina en la región citoplásmica de las subunidades del receptor. Los estudios recientes llevaron a la identificación de dos tipos de módulos, el ITAM (motivo de activación basado inmunorreceptor de tirosina) y el ITIM (motivo de inhibición basado en el inmunorreceptor de tirosina) . Estos poseen residuos de tirosina conservados que se sometieron rápida, pero transitoriamente, a la fosforilación después del ligado del receptor y activan o terminan las rutas de transducción de la señal (Isakov ' 1998 "ITA s: immunoregulatory scaffolds that link immunoreceptors to their intracellular signaling pathways" Receptors Channels 5:243) . Con frecuencia se ha encontrado que el dominio de la inmunoglobulina (Ig) está implicado en la interacción ligando-receptor. La coexistencia del dominio Ig y el motivo ITAM en el receptor activador del NFAT de la proteina de membrana, junto con la expresión preferida en tejidos y células inmunitarias , sugiere muy fuertemente que las funciones del receptor que activa el NFAT como un receptor activador en el sistema inmunitario. Se han probado tres factores de transcripción comunes (NFAT, NF-?? y AP-1) como potenciales objetivos corriente abajo en la ruta de señalización del receptor que activa el NFAT mediante el ensayo del reportero de 73 luciferasa en HMC-1 (una linea de mastocitos humanos), en la cual se encontró que el receptor que activa el NFAT estaba moderadamente expresado usando el análisis por PCR en tiempo real. Se realizó un típico ensayo con luciferasa de la siguiente forma: la HMC-1 se sembró en una placa de cultivo de 24 cavidades con una densidad de 0.2 millones de células por mililitro de medio. Los tres plásmidos, reportero de luciferasa (donde la región promotora contiene NFAT, AP-1 o el sitio de unión NF-??) , el plásmido de expresión del receptor activador del NFAT y pRLSV40, se sometieron a co-transfectación en células HMC-1. Las células se cosecharon de 40 a 46 horas después de la transfección y se lisaron en un amortiguador de lisis pasiva (Promega, Inc.) . Las actividades de la luciferasa de luciérnaga y de Renila se analizaron usando el kit para el ensayo de la luciferasa doble (Promega, Inc.) y el luminómetro TD-20 (Turner Design) . Los resultados se muestran en los Cuadros 2 a 7. 74 Cuadro 2 Ensayo NFAT - reportero luciferasa Plásmido Actividad relativa de la luciferasa Únicamente vector 1.0 V5-353 79.8 V5-353Y1A 0.6 V5-353Y2A 1.6 V5-353Y12A 0.8 Cuadro 3 Ensayo NF-?? - reportero luciferasa Plásmido Actividad relativa de la luciferasa Únicamente vector 1.0 V5-353 1.0 V5-353Y1A 0.7 V5-353Y2A 0.3 V5-353Y12A 0.3 EK 3 233.0 Cuadro 4 Ensayo AP-1 - reportero luciferasa Plásmido Actividad relativa de la luciferasa Únicamente vector 1.0 V5-353 1.5 V5-353Y1A 1.1 V5-353Y2A 1.6 V5-353Y12A 1.4 MEKK3 200.0 Cuadro 5 Ensayo IL-13 - reportero luciferasa Plásmido Actividad relativa de la luciferasa Únicamente vector 1.0 V5-353 19.2 V5-353Y1A 1.3 V5-353Y2A 1.5 V5-353Y12A 1.3 Cuadro 6 Ensayo TNF-c - reportero luciferasa Plásmido Actividad relativa de la luciferasa Únicamente vector 1.0 V5-353 5.1 V5-353Y1A 1.3 V5-353X2A 1.5 V5-353Y12A 1.2 Cuadro 7 Ensayo inhibición del NFAT mediante CsA - reportero luciferasa Concentración del inhibidor CsA (uM) Actividad relativa de la luciferasa 0.0 31.7 0.5 8.4 1.0 6.4 2.0 7.5 4.0 5.5 8.0 4.8 Con referencia a los Cuadros 2 a 7, los datos muestran que la sobreexpresion del receptor activador del NFAT-con NFAT activado con V5-353 es aproximadamente de 80 veces (Cuadro 2) , pero no con NF-?? (Cuadro 3) o AP-1 (Cuadro 4) . La transfección únicamente con vector se usó como control negativo; el control negativo no activó ninguno de los tres factores de transcripción (Cuadros 2, 3 y 4) . En los casos NF-?? y AP-1, como control positivo se usó MEKK3, el cual se sabe que puede activar el NF-?? y AP-1 (Cuadros 3 y 4) . Para confirmar que el polipéptido aislado es un receptor de activación del NFAT, se realizaron dos experimentos adicionales: 1) el afecto de la sobreexpresión del receptor que activa el NFAT en la transcripción de los genes regulados con NFAT (IL-13 y TNF-a) y 2) el efecto del inhibidor conocido de la ruta de señalización calcineurina/NFAT sobre la activación del NFAT mediada por el receptor activador del FAT. Se seleccionaron el IL-13 y el TNF-ot debido a sus papeles principales en las respuestas inmunitarias . La región promotora (que contiene el sitio de unión con NFAT) de cualquiera de 1L13 o TNF-cc se insertó en el vector de plásmido del reportero luciferasa sin promotor (DB Bioscience Clontech) , el cual se sometió entonces a co-transfección en H C-1. Se encontró que la sobreexpresión del receptor que activa el NFAT regula de manera importante la transcripción del IL-13 y TNF-oc aproximadamente 19 y 5 veces, respectivamente, en comparación con los controles únicamente con vector (Cuadros 5 y 6) . Adicionalmente, un inhibidor de NFAT conocido, la ciclosporina A (CsA) , redujo drásticamente la actividad estimuladora del receptor activador del- NFAT (Cuadro 7) . Tomados en conjunto, estos 78 datos indican que la sobreexpresion del receptor que activa el NFAT puede activar el NFAT.

Ejemplo 7 La activación del NFAT con el receptor que activa el NFAT está mediada por el motivo ITAM El análisis estructura-función de diferentes subunidades del receptor ha llevado a la identificación de ITAM en colas citoplásmicas de diferentes antigenos y receptores Fe. Estos receptores operan en una forma dependiente de la fosforilación de tirosina y utilizan PTK Syk/ZAP-70 para transducir las señales de activación (Cambier 1995 "Antigen and Fe receptor signaling" J Immunol 155:3281). Se demostró que el receptor que activa el NFAT de la presente invención actúa como receptor activador con un motivo ITAM pronosticado en las colas citoplásmicas (aminoácidos 220 a 235). Para determinar si el motivo ITAM media la transducción de la señal, se generaron tres imitantes del receptor que activa el NFAT (Y1A, Y2A y el mutante doble Y12A) al imitar las dos tirosinas del motivo ITAM (Y220 y Y231, designados Yl y Y2, respectivamente) en una alanina tanto en forma individual como en forma combinada. Todas la mutaciones se generaron por mutagénesis dirigida por PCR. Las secuencias cebadoras utilizadas fueron las siguientes: 79 Y1A directa: 5 ' -AGAATCTGTCGCCACAGCTCTG inversa : 5 ' -GCAGAGCTGTGGCGACAGATTCTG Y2A directa: -AGACCGAGGTCGCTGCCTGCATCG inversa: 5 ' -CGATGCAGGCAGCGACCTCGGTC Los cADN mutantes se subclonaron entonces individualmente en el vector de expresión pCDNA (Invitrogen) . A continuación se realizaron similares ensayos del reportero luciferasa para determinar el efecto de la sobreexpresión de cada mutante de tirosina en alariina sobre la activación del NFAT y la transcripción de genes regulados por el NFAT (IL-13 y TNF-a) . Se encontró que la actividad de la activación del NFAT de cada uno de los tres mutantes era virtualmente abolida, la señal obtenida del reportero luciferasa era comparable con la del control de únicamente con vector (Cuadros 2, 4 y 5) . Los resultados muestran que la activación de la señalización del receptor activador del NFAT es a través del motivo ITAM. En' la especificación, se han mostrado modalidades típicas preferidas de la invención y, aunque se usaron términos específicos, éstos se usan solamente en un sentido genérico y descriptivo y no con el propósito de limitar el alcance de la invención expuesto en las reivindicaciones siguientes. Obviamente, a la luz de las enseñanzas 80 anteriores son posibles muchas modificaciones y variaciones de la presente invención. Por lo tanto, se comprenderá que dentro del alcance de las reivindicaciones anexas, la invención puede ponerse en práctica en otra forma diferente a las específicamente descritas . 81

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un polipéptido purificado que contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por : SEQ ID NO: 2; una variante de la SEQ ID NO: 2; un fragmento de la SEQ ID NO: 2; una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: SEQ ID N0:1; una variante de la SEQ ID NO: 1; y un fragmento de la SEQ ID N0:1.
2. El polipéptido purificado según la Reivindicación 1, donde el polipéptido es un agonista o antagonista que específicamente se une con los receptores activadores del NFAT e inhibe o activa la expresión o la acción de los receptores .
3. El polipéptido purificado según la Reivindicación 2, donde el polipéptido es un antagonista seleccionado del grupo formado por formas solubles de los receptores ' que activan el NFAT y polipéptidos solubles derivados de los dominios extracelulares de los receptores activadores del NFAT que tienen la capacidad para unirse con el receptor activador del FAT. 82
4. El polipéptido purificado según la Reivindicación 3 contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por los aminoácidos 43 a 150 de la SEQ ID NO: 2 o fragmentos del antagonista de la misma. 5. El polipéptido purificado según la
Reivindicación 2, donde el agonista o. antagonista es un anticuerpo .
6. El polipéptido purificado según la Reivindicación 5, donde el anticuerpo se selecciona del grupo formado por anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, de humano, biespecificos y heteroconj ugados .
7. El polipéptido purificado según la Reivindicación 5, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .
8. ün polinucleótido aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo formado por: SEQ ID N0:1; una variante de la SEQ ID N0:1; un fragmento de la SEQ ID NO:l; una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: SEQ ID NO: 2; una variante de la SEQ ID NO: 2; un fragmento de la SEQ ID NO: 2.
9. El polinucleótido aislado según la Reivindicación 8 que contiene una' secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido que tiene una secuencia de 5 aminoácidos seleccionada del grupo formado por los aminoácidos 43 a 150 de la SEQ ID NO: 2 o por fragmentos del antagonista de la misma.
10. Un vector de expresión que contiene la secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 8. • 10
11. Una célula ospedadora aislada seleccionada del grupo formado por una célula hospedadora que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 10; una célula hospedadora que contiene la secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 8; y una célula hospedadora que contiene la 15 secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 9.
12. Un método de tamizado para identificar los agonistas y antagonistas del receptor que activa el NFAT, el método comprende: exponer un receptor que activa el NFAT ante un 20 potencial agonista del NFAT/antagonista del NFAT y determinar si el potencial agonista/antagonista se une con el receptor.
13. Un método de tamizado para determinar si es probable que las sustancias farmacéuticas provoquen efectos 25 secundarios indeseables asociados con la reducción o el 84 aumento en la producción de citoquina y del receptor celular cuando se administra a un animal para la indicación deseada, el método comprende: exponer los receptores que activan el NFAT ante una sustancia farmacéutica; y determinar si la sustancia farmacéutica se une con los receptores o imita la función biológica del ligando del receptor provocando un cambio en la producción de citoquina .
14. ün método para bloquear o modular la expresión de un receptor celular que activa el NFAT mediante la interferencia en la transcripción o traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el NFAT, el método comprende exponer una célula capaz de expresar un receptor activador del NFAT en una molécula que interfiere con la transcripción o traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el NFAT.
15. El método según la Reivindicación 14, donde la molécula se selecciona del grupo formado por nucleótidos antisentido, nucleótidos del ARNi y ribozimas que interfieren con la adecuada transcripción o traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el NFAT.
16. El método según la Reivindicación 14, donde 85 la molécula es un nucleótido antisentido que interfiere con l adecuada transcripción o traducción de un polinucleótido de ADN o ARN que codifica para el receptor que activa el" NFAT.
17. ün método para diagnosticar la predisposición de un paciente a generar enfermedades provocadas por la expresión no regulada de citoquinas, el método comprende: recolectar del paciente una muestra de células, tejido o fluido corporal que se sabe 'Contiene algunos, receptores activadores del NFAT, si los hay; analizar en el tejido o fluido corporal la presencia del receptor activador del NFAT en el tejido; y pronosticar la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias, con base en la presencia del receptor activador del NFAT en el tejido o fluido corporal .
18. ün método para diagnosticar la predisposición de un paciente a generar enfermedades provocadas por la expresión no regulada de citoquinas, el método comprende : recolectar del paciente una muestra de células, tejido o fluido corporal que se sabe contiene un nivel definido de receptores activadores del NFAT; analizar en el tejido o fluido corporal la 86 cantidad del receptor activador del NFAT en el tejido; y pronosticar la predisposición del paciente a ciertas enfermedades inmunitarias, con base en el cambio en la cantidad del receptor activador del NFAT en el tejido o fluido corporal, en comparación con un nivel definido o probado, establecido en células, tejido o fluidos corporales normales.
19. Un método para prevenir o tratar en un mamífero las enfermedades mediadas por la proteína NFAT, el método comprende administrar al mamífero una cantidad de un agonista o antagonista del receptor que activa el NFAT, dicha cantidad previene o trata la enfermedad.
20. El método según la Reivindicación 19, donde el agonista o antagonista del receptor que activa el NFAT es un anticuerpo.
21. Un método para producir un anticuerpo que se une con los receptores que activan el NFAT, que comprende un método seleccionado del grupo formado por: usar como antígeno los receptores aislados que activan el NFAT o fragmentos antigénicos del mismo; usar como antígeno las células hospedadoras que expresan los receptores activadores del NFAT recombinantes; y usar los vectores de expresión del ADN que contienen el gen receptor para expresar el receptor como un antígeno para producir anticuerpos. 87
22. El anticuerpo producido usando el método de la Reivindicación 21.
23. El anticuerpo según la Reivindicación 22, seleccionado del grupo formado por anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, de humano, biespecificos y heteroconjugados .
24. Un método de diagnóstico para detectar receptores que activan el NFAT expresados en células, tejidos o fluidos corporales específicos, el método comprende : exponer las células, tejidos o fluidos corporales o sus componentes ante los anticuerpos de la Reivindicación 22; y determinar si las células, tejidos o fluidos corporales o sus componentes se unen con el anticuerpo.
25. ün método para aislar y purificar los receptores que activan el NFAT del cultivo de células recombinantes, contaminantes y los entornos -nativos, el método comprende: exponer una composición que contiene receptores que activan el NFAT y contaminantes ante un anticuerpo capaz de unirse con los receptores; permitir que los receptores que activan el NFAT se unan con el anticuerpo; separar de los contaminantes los complejos anticuerpo-receptor; y recuperar de los complejos los receptores que activan el NFAT.
26. El método según la Reivindicación 25, donde el anticuerpo es un anticuerpo de la Reivindicación 22.
27. Un método para inducir la tolerancia en un mamífero que puede experimentar una respuesta inmunitaria indeseable, el método comprende administrar al paciente un antagonista del receptor activador del NFAT en cantidades suficientes para inhibir la translocación de la proteína NFAT en el núcleo celular y su posterior interacción con la proteína activadora del factor de la transcripción 1.
28. El método según la Reivindicación 27, donde el antagonista es un anticuerpo que se une con un receptor que activa el NFAT y evita que las proteínas NFAT se transloquen en el núcleo e interactúen con el AP-1. 29^ El método según la Reivindicación 26, donde el anticuerpo es un anticuerpo de la Reivindicación 22. 30. Un animal transgénico con desactivación génica, cuyo, genoma incluye una alteración heterocigótica u homocigótica en su gen del receptor endógeno activador del NFAT que suprime o previene la expresión de proteínas del receptor activador del NFAT biológicamente funcionales. 89