MXPA05003949A - Fragmentos fab de anticuerpo completamente humano con actividad neutralizadora de interferon-gamma humano. - Google Patents

Fragmentos fab de anticuerpo completamente humano con actividad neutralizadora de interferon-gamma humano.

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Abstract

La invencion proporciona agentes de union selectivos de interfon-gamma (IFN?). Mas particularmente, la invencion proporciona anticuerpos y dominios de union a antigeno que se unen selectivamente a IFN? y que pueden usarse para prevenir o tratar condiciones relacionadas con enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como artritis reumatoide, lupus eritematoso sistemico y esclerosis multiple. Se proporcionan tambien moleculas de acido nucleico que codifican para los anticuerpos y dominios de union a antigeno, y vectores de expresion y celulas hospederas para la produccion de los mismos.

Description

FRAGMENTOS Fab DE ANTICUERPO COMPLETAMENTE HUMANO CON ACTIVIDAD NEUTRALIZADORA DE INTERFERON-GAMMA HUMANO Campo de la invención La invención se refiere a fragmentos Fab de anticuerpo completamente humano nuevos que se unen a interferón gamma humano (hlFNy) e inhiben su interacción con el receptor cognado, IFNy-R, y/o modifican las acciones biológicas desarrolladas por IFNy. Más particularmente, la invención se refiere a fragmentos Fab neutralizantes (Fabs) aislados a través de selecciones de afinidad de hlFNy de una biblioteca de despliegue de fagos que contiene fragmentos Fab únicos, los cuales se convierten después en anticuerpos IgG humanos de longitud completa. Estos anticuerpos completamente humanos nuevos para hlFNy que tienen las cualidades deseadas de la actividad neutralizadora de hlFNy, alta afinidad y larga vida promedio in vivo, se pueden usar para prevenir o tratar varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. También se proporcionan moléculas de ácido nucleico, vectores y células hospederas para la producción de los Fabs completamente humanos de la invención. Antecedentes de la invención Los anticuerpos han jugado un papel esencial en la investigación biofarmacéutica y en los esfuerzos de EEF.: 163147 descubrimientos de fármacos durante muchas décadas. La utilidad de los anticuerpos como agentes terapéuticos para el tratamiento de enfermedades humanas a sido idealizada durante mucho años gracias a su: a) larga vida promedio in vivo; b) capacidad de unirse a objetivos con alta afinidad y especificidad; y c) potencial para mediar funciones efectoras inmunes (tales como la fijación de complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) . La reducción del concepto de anticuerpo terapéutico a la práctica estaba severamente limitada, sin embargo, hasta ahora, por la inmunogenicidad adversa de los anticuerpos obtenidos de especies no humanas que restringían la utilidad clínica a largo plazo de los anticuerpos. Avances tecnológicos recientes han proporcionado nuevas formas para superar estas limitaciones al proporcionar un medio para obtener anticuerpos completamente humanos con menos inmunogenicidad y potencial terapéutico a largo plazo. Además, los desarrollos en métodos de bibliotecas combinatorias y la manipulación de anticuerpos han abierto oportunidades para la modificación de las funciones de afinidad a anticuerpos, vida promedio y/o efectoras . Una de estas tecnologías, la cual emplea bibliotecas de despliegue de fagos combinatorias y filamentosas de fragmentos de anticuerpo fusionados a la proteína de cápside del fago (la llamada "biblioteca de despliegue de fagos")/ se ha usado en forma efectiva para descubrir anticuerpos con alta afinidad, especificidad y actividad agonista o antagonista in vivo. El interferón gamma humano (hlFNy) es una linfocina producida por linfocitos T activados y células asesinas naturales. Manifiesta actividades antiproliferativas, antivirales e inmunomoduladores y se une a hlFNy-R, un receptor heterodimérico en la mayoría de las células primarias del sistema inmune; Langer et al., Intmunology Today, 9:393 (1988) , y desencadena una cadena de eventos que llevan a inflamación. Se sabe que la actividad antiviral e inmunomoduladora de IFNy tiene efectos benéficos en un número de condiciones clínicas. Sin embargo, existen muchos escenarios clínicos en los cuales se sabe que la actividad de IFNy tiene efectos dañinos. Por ejemplo, las enfermedades autoinmunes están asociadas con altos niveles de hlFNy en la sangre y existe ahora evidencia que sugiere que el secuestro de IFNy está asociado con el alivio sintomático de enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide (AR) , lupus eritematoso sistémico (LES) y esclerosis múltiple (EM) ; véase, por ejemplo, Skurkovich et al., Intern. Journal of Immunotherapy, 14:23-32 (1998); Gerez et al., Clin. Exp. Im unol. , 109:296-303 (1997). La actividad de IFNy también ha estado ligada a estados de enfermedad tales como caquexia, choque séptico y enfermedad de Crohn. Debido a que el bloqueo de la interacción de IFNy a su receptor representa la etapa más ascendente de la intervención a este respecto, un anticuerpo completamente humano con actividad neutralizadora de hlFNy representa un candidato de producto terapéutico atractivo. Un objetivo de la presente invención es emplear la tecnología de biblioteca de despliegue de fagos para identificar anticuerpos usando interferón gamma humano (hlFNy) como el objetivo terapéutico. Breve descripción de la invención La presente invención proporciona nuevos fragmentos Fab de anticuerpo completamente humano que se unen a interferón gamma humano (hlFNy) . En una modalidad, los fragmentos Fab de anticuerpo completamente humano se unen a hlFNy de una manera que inhibe parcial o completamente la interacción de hlFNy con su receptor cognado, hIFNy-R y de esta manera inhibe en forma parcial o completa la actividad de hlFNy; es decir, el anticuerpo es un antagonista de hlFNy. De preferencia, el hlFNy es hlFNy de mamífero. Muy preferiblemente, el hlFNy es un hlFNy humano que puede estar en formas asociadas a superficie celular o soluble, o fragmentos, derivados y variantes del mismo. Un anticuerpo de la presente invención puede prepararse al inmunizar un animal con hlFNy tal como hlFNy de murino o humano, de preferencia hlFNy humano, o con un fragmento inmunógeno, derivado o variante del mismo. Además, un animal puede ser inmunizado con células transfectadas con un vector que contenga una molécula de ácido nucleico que codifique para hlFNy de tal manera que hlFNy sea expresado y asociado con la superficie de las células transfectadas . Como alternativa, los anticuerpos pueden obtenerse al tamizar una biblioteca que comprenda secuencias de dominio de unión a anticuerpo o antígeno para unirse a hlFNy. Esta biblioteca se prepara convenientemente en bacterióf gos como fusiones de proteínas o péptidos a una proteína de cápside bacteriófaga que son expresadas sobre la superficie de partículas de fago ensambladas y las secuencias de ADN de codificación contenidas dentro de las partículas de fagos (la llamada "biblioteca de despliegue de fagos") . En un ejemplo, una biblioteca de despliegue de fagos contiene secuencias de ADN que codifican para anticuerpos humanos, tales como cadenas ligeras y pesadas variables . Los anticuerpos o dominios de unión a antígeno pueden ser glicoproteínas tetraméricas similares a los anticuerpos nativos, o pueden ser anticuerpos de cadena individual; fragmentos Fv, Fab, Fab' o F(ab)', anticuerpos biespecíficos , heteroanticuerpos u otros fragmentos, variantes o derivados de los mismos, los cuales sean capaces de unirse a hlFNy y neutralizar parcial o completamente la actividad de hlFNy. Los anticuerpos o dominios de unión a antígeno pueden producirse en líneas de células de hibridoma (células productoras de anticuerpos tales como células esplénicas fusionadas a células de mieloma de ratón, por ejemplo) o pueden producirse en líneas de células heterólogas transíectadas con moléculas de ácido nucleico que codifiquen para el anticuerpo o dominio de unión a antígeno. Un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende: a) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab como la mostrada en las Figuras 3-13 (SEQ ID NO: 65- SEQ ID NO: 86) ; b) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende sustituciones de aminoácido conservativas de la secuencia en a) ; c) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que es al menos aproximadamente 80% idéntica a la secuencia de a) ; o d) un fragmento o derivado de a) , b) o c) en donde el anticuerpo o dominio de unión a antígeno se une selectivamente a hlFNy. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión antígeno de la invención reconoce un epítope en hlFNy humano reconocido por un anticuerpo o dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab como la mostrada en las Figuras 3-13 igual a la anterior (SEQ ID NO: 65- SEQ ID NO: 86) y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Fab como - la mostrada en las Figuras 14-24 (SEQ ID NO: 87- SEQ ID NO: 108) . En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena Vi y h: en donde cada cadena Vi comprende secuencias de aminoácidos de CDR designadas CDRl (Vi) , CDR2 (Vx) y CDR3 (Va) separadas por secuencias de aminoácidos de armazón de CDRl (Vi) que se seleccionan del grupo que consiste en: TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01) TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 02) TGSSGSIASYYVQ (SEQ ID NO: 03) RATQSLLHGNGHNYLD (SEQ ID NO : 04); RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 05); SGDVLARKYAR (SEQ ID NO : 06); GGDNLGGKSLH (SEQ ID NO: 07) ; RSSQSLLHTNEYNYLD (SEQ ID NO: 08); TGSSGSIANNYVH (SEQ ID NO: 09) ; RASQYVSSNSLA (SEQ ID NO: 10) ; y RSSQSLLRSNGYNYLA (SEQ ID NO: 11) de CDR2 (Vi) que se seleccionan del grupo que consiste en: EDKERPS (SEQ ID NO: 12) ; EDNQRPS (SEQ ID NO: 13) ; EDDQRPS (SEQ ID NO: 14) ; MGSNRAS (SEQ ID NO: 15) ; KISNRFS (SEQ ID NO: 16) ; KDRERPS (SEQ ID NO: 17) ; DDSDRPS (SEQ TD NO: 18) ; LGSNRAP (SEQ ID NO: 19) ; EDDQRPS (SEQ ID NO: 20) ; GASNRAT (SEQ ID NO: 21) ; LASNRAS (SEQ ID NO: 22) y de CDR3 (Vi) que se seleccionan del grupo que consiste en: QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23); QSYDGSAWV (SEQ ID NO: 24); QSYDRNSLV (SEQ ID NO : 25) ; MQALQLPPT (SEQ ID NO: 26) ; MQATQLPYT (SEQ ID NO : 27); YSAADNRGV (SEQ ID NO: 28); QVDGSSDQRV (SEQ ID NO: 29) ; MQALQTPRT (SEQ ID NO : 30) ; QSYDNSNSFW (SEQ ID NO : 31); QQYGSSPIT (SEQ ID NO : 32) ; y VHGVHIPYT (SEQ ID NO: 33) en donde CDR1 (Vx) , CDR2 (Vx) y CDR3 (Vx) se seleccionan independientemente unas de otras; y en donde cada cadena Vh comprende secuencias de aminoácidos de CDR designadas CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) y CDR3 (Vh) separadas por secuencias de aminoácidos de armazón, CDRl (Vh) se selecciona del grupo que consiste en: GYYWS (SEQ ID NO: 34) SYAMS (SEQ ID NO: 35) GYYWS (SEQ ID NO: 36) NARMGVS (SEQ ID NO: 37); SYAMH (SEQ ID NO: 38) SYSMN (SEQ ID NO: 39) GYYWS (SEQ ID NO: 40) SGGYSWS (SEQ ID NO : 41); SNYMS (SEQ ID NO: 42); y SNEAGVG (SEQ ID NO: 43) CDR2 (Vh) que se selecciona del grupo que consiste en: EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44); AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) ; EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 46); HIFSNDEESYSTSLKS (SEQ ID NO: 47); VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 48) ; SISSGSSYRYDADSVKG (SEQ ID NO: 49) ; EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 50) ; YIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 51); VIYSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO : 52); y LLYWDDDKRYSPSLRS (SEQ ID NO: 53) CDR3 (Vh) se selecciona del grupo que consiste en: GRAR WRSRFDY (SEQ ID NO: 54) ; TSWNAGGPIDY (SEQ ID NO : 55); DRVGYSSSLLDY (SEQ ID NO: 56); DKGSRITIFGWGSAGFDY (SEQ ID NO : 57); LLLYEGFDP (SEQ ID NO : 58) ; DLVLTMTSRRAAFDI (SEQ ID NO: 59) ; DQWGTISGNDY (SEQ ID NO : 60); GWPTYVWGSYRPKGYFDY (SEQ ID NO: 61) ; GDWGYFDY (SEQ ID NO: 62); DADGGDYGY (SEQ ID NO: 63) ; y RLVRYGGYSTGGFDV (SEQ ID NO: 64) en donde CDRl (Vh) , CDR2 (Vh) y CDR3 (Vh) se seleccionan independientemente unas de otras . En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antigeno de la invención comprende una cadena Vi y Vh en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01) , CDR2 que tiene la secuencia EDKERPS (SEQ ID NO: 12) y CDR3 que tiene la secuencia QSYDSSNQWV (SEQ ID NO: 23); y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia GYY S (SEQ ID NO: 34) , CDR2 que tiene la secuencia EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44), y CDR3 que tiene la secuencia GRARNRSRFDY (SEQ ID NO: 54) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena Vi y Vh en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia TGSSGSIASNYVQ (SEQ ID NO: 02) , CDR2 que tiene la secuencia EDNQRPS (SEQ ID NO : 13) y CDR3 que tiene la secuencia QSYDGSA V (SEQ ID NO: 24); y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SYAMS (SEQ ID NO: 35) , CDR2 que tiene la secuencia AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45), y CDR3 que tiene la secuencia TSWNAGGPIDY (SEQ ID NO: 55) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena Vi y Vh en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia TGSSGSIASYYVQ (SEQ ID NO: 03) , CDR2 que tiene la secuencia EDDQRPS (SEQ ID NO: 14) y CDR3 que tiene la secuencia QSYDRNSLV (SEQ ID NO: 25) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SYAMS (SEQ ID NO: 35) , CDR2 que tiene la secuencia AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 45) , y CDR3 que tiene la secuencia DRVGYSSSLLDY (SEQ ID NO: 56); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antigeno de la invención comprende una cadena Vi y V^ en donde : la cadena i comprende CDRl que tiene la secuencia RATQSLLHGNGHNYLD (SEQ ID NO : 04), CDR2 que tiene la secuencia MGSNRAS (SEQ ID NO: 15) y CDR3 que tiene la secuencia MQALQLPPT (SEQ ID NO: 26); y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia GYYWS (SEQ ID NO: 36) , CDR2 que tiene la secuencia EINHSGSTNYNPSL S (SEQ ID NO: 4S) , y CDR3 que tiene la secuencia DKGSRITIFGWGSAGFDY (SEQ ID NO: 57) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vx y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a anticuerpo de la invención comprende una cadena Vi y Vh en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia RSSQSLVHSDGNTYLS (SEQ ID NO: 05), CDR2 que tiene la secuencia KISNRFS (SEQ ID NO: 16) y CDR3 que tiene la secuencia QATQLPYT (SEQ ID NO: 27) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia NAR GVS (SEQ ID NO: 37), CDR2 que tiene la secuencia HIFSNDEESYSTSLKS (SEQ ID NO: 47), y CDR3 que tiene la secuencia LLLYEGFDP (SEQ ID NO: 58); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vx y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena i y V^ en donde: la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia SGDVLARKYAR (SEQ ID NO: 06), CDR2 que tiene la secuencia KDRERPS (SEQ ID NO: 17) y CDR3 que tiene la secuencia YSAADN GV (SEQ ID NO: 28) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SYAMH (SEQ ID NO: 38) , CDR2 que tiene la secuencia VISYDGSNKYYADSVKG (SEQ ID NO: 48), y CDR3 que tiene la secuencia DLVLTMTSRRAAFDI (SEQ ID NO: 59) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vx y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena i y Vh en donde: la cadena Vx comprende CDRl que tiene la secuencia GGDNLGGKSLH (SEQ ID NO: 07) , CDR2 que tiene la secuencia DDSDRPS (SEQ ID NO: 18) y CDR3 que tiene la secuencia QVWDGSSDQRV (SEQ ID NO: 29) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SYSMN (SEQ ID NO: 39) , CDR2 que tiene la secuencia SISSGSSYRYDADSVKG (SEQ ID NO: 49), y CDR3 que tiene la secuencia DQWGTISGNDY (SEQ ID NO: 60) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vx y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena i y Vh en donde : la cadena Vi comprende CDRl que tiene la secuencia RSSQSLLHTNEYNYLD (SEQ ID NO: 08), CDR2 que tiene la secuencia LGSNRAP (SEQ ID NO: 19) y CDR3 que tiene la secuencia MQALQTPRT (SEQ ID NO: 30) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia GYYWS (SEQ ID NO: 40), CDR2 que tiene la secuencia EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 50), y CDR3 que tiene la secuencia GWPTYVWGSYRPKGYFDY (SEQ ID NO: 61) ; en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácido de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antigeno de la invención comprende una cadena Vi y Vh en donde: la cadena i comprende CDRl que tiene la secuencia TGSSGSIANNYVH (SEQ ID NO : 09), CDR2 que tiene la secuencia EDDQRPS (SEQ ID NO: 20) y CDR3 que tiene la secuencia QSYDNSNSFW (SEQ ID NO: 31) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SGGYS S (SEQ ID NO: 41), CDR2 que tiene la secuencia YIYHSGSTYYNPSLKS (SEQ ID NO: 51) , y CDR3 que tiene la secuencia GDWGYFDY (SEQ ID NO: 62); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena i y Vh en donde : la cadena i comprende CDRl que tiene la secuencia RASQYVSSNSLA (SEQ ID NO: 10), CDR2 que tiene la secuencia GASNRAT (SEQ ID NO: 21) y CDR3 que tiene la secuencia QQYGSSPIT (SEQ ID NO: 32) ; y la cadena Vh comprende CDRl que tiene la secuencia SNYMS (SEQ ID NO: 42) , CDR2 que tiene la secuencia VIYSGGSTYYADSV G (SEQ ID NO: 52), y CDR3 que tiene la secuencia DADGGDYGY (SEQ ID NO: 63); en donde CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón.
En otra modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena i y Vh en donde: la cadena Vi comprende CDR1 que tiene la secuencia RSSQSLLRSNGYNYLA (SEQ ID NO: 11), CDR2 que tiene la secuencia LASNRAS (SEQ ID NO: 22) y CDR3 que tiene la secuencia VHGVHIPYT (SEQ ID NO: 33) ; y la cadena Vh comprende CDR1 que tiene la secuencia SNEAGVG (SEQ ID NO: 43) , CDR2 que tiene la secuencia LLYWDDDKRYSPSLRS (SEQ ID NO: 53) , y CDR3 que tiene la secuencia RLVRYGGYSTGGFDV (SEQ ID NO: 64) ,- en donde CDR1, CDR2 y CDR3 en cada cadena Vi y Vh se separan por secuencias de aminoácidos de armazón. Los anticuerpos o dominios de unión a antígeno de la invención se derivan de secuencias de ácido nucleico de línea germinal presentes en ADN genómico que codifica para secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada. Los anticuerpos son codificados por secuencias de aminoácidos que son los productos de la redisposición de secuencias de línea germinal y mutación somática. En una modalidad, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención comprende una cadena Vi y una Vh en donde la cadena i comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??6 tal como en la figura 41 (SEQ ID NO: 130); y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH4 tal como en la figura 33 (SEQ ID NO: 122) ; y el anticuerpo se une selectivamente a un polipéptido IFNy. En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??d tal como en la figura 41 (SEQ ID NO: 130); y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH1 tal como en la figura 34 (SEQ ID NO: 123) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VK2 tal como en la figura 42 (SEQ ID NO: 131) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de linea germinal VH2 tal como en la figura 35 (SEQ ID NO: 124) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal V 2 tal como en la figura 43 (SEQ ID NO: 132) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH4 tal como en la figura 33 (SEQ ID NO: 122) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??3 tal como en la figura 44 (SEQ ID NO: 133) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH3 tal como en la figura 36 (SEQ ID NO: 125) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??3 tal como en la figura 45 (SEQ ID NO: 134) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH3 tal como en la figura 37 (SEQ ID NO: 126) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VK3 tal como en la figura 46 (SEQ ID NO: 135) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH3 tal como en la figura 38 (SEQ ID NO: 127) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??6 tal como en la figura 41 (SEQ ID NO: 130) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH4 tal como en la figura 39 (SEQ ID NO: 128) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VK2 tal como en la figura 43 (SEQ ID NO: 132) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH4 tal como en la figura 33 (SEQ ID NO: 122) . En otra modalidad, la cadena Vi comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VK2 tal como en la figura 43 (SEQ ID NO: 132) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal VH2 tal como en la figura 40 (SEQ ID NO: 129) . En otra modalidad, la cadena i comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal ??6 tal como en la figura 41 (SEQ ID NO: 130) ; y la cadena Vh comprende una variante redispuesta o somática de genes de línea germinal 7?1 tal como en la figura 34 (SEQ ID NO: 123) . Los agentes de unión selectivos de la invención (anticuerpo o dominio de unión a antígeno) inhiben parcial o completamente por lo menos una actividad de IFNy, tal como la unión de IFNy a IFNy-R. En una modalidad, un antagonista de IFNy, tal como un anticuerpo o dominio de unión a antígeno, se administra a un animal que ha experimentado o está en riesgo de desarrollar una enfermedad tipo lupus, artritis o síndrome tipo esclerosis múltiple. Un antagonista de IFNy puede usarse para prevenir y/o tratar nefritis por lupus, artritis reumatoide y/o esclerosis múltiple. Se proporcionan también composiciones que comprenden los anticuerpos o los dominios de unión a antígeno de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable . Breve Descripción de las figuras La figura 1 es una gráfica que ilustra los resultados de ELISA para la reactividad de clones Fab de fago predominantes para hlFNy. Las diluciones de fagos se llevaron a cabo usando un máximo de 100 µ? de suspensión de fagos prebloqueada con 2% de MPBS por pozo para dar una escala típica de 109 - 1011 fagos/pozo en el ELISA. Los grupos de fagos para ELISA se prepararon como se describe en el ejemplo 3. Los valores fueron de determinaciones de un solo punto y la OD40S se midió para la detección de señales . La figura 2 es una gráfica que ilustra los resultados de una ELISA de fagos clónales dependiente de dosis, de clones de Fabs predominantes "GP-A" y clones "BS-B" para reactividad a hlFNy. Se llevaron a cabo diluciones de fagos usando un máximo de 100 µ? de suspensión de fagos preblogueada con 2% de MPBS por pozo para dar una escala típica de 109 - 1011 fagos/pozo en el ELISA. Los grupos de fagos para ELISA se prepararon como se describió en el ejemplo 3. Los valores fueron a partir de determinaciones de un solo punto y la OD05 se midió para la detección de señales . La figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "BS-A" . La figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "BS-B" . La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "RD-B1" . La figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab " D-A2" . La figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "58C" . La figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "GP-A" .
La figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Pab "57D" . La figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "57E" . La figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "IFN-A La figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "67C" . La figura 13 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena pesada de Fab "59-A2 La figura 14 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "BS-A" • La figura 15 muestra la secuen ia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "BS-B" • La figura 16 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "RD-B1 La figura 17 muestra -la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "RD-A2 La figura 18 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "5'8C" . La figura 19 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "GP-A" • La figura 20 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "57D" . La figura 21 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "57E" . La figura 22 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "IFN-A" . La figura 23 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "67C" . La figura 24 muestra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la cadena ligera de Fab "59-A2". La figura 25 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de cadena ligera y pesada de Fabs "BS-A", "BS-B", "RD-A2", "RD-B1" , "IFN-A" , "57E" , "57D", "GP-A", "58-C", "67C" y "59-A2" . La figura 26 es una gráfica que ilustra la actividad de neutralización de los Fabs "BS-A" y "BS-B" medida en el ensayo de células A549. Los Fabs fueron purificados como se describe en el ejemplo 4 y se añadieron a concentraciones de Fab que variaban de 0.3-150 µg/ml. Se usó el anticuerpo Pharmingen B27 Ab (concentraciones que variaban de 0.01-5 ug/ml) como un control positivo. Las células fueron teñidas con azul Alamar 5 días después del tratamiento y se analizaron 4 horas después de la tinción en un lector de placa FL500. La figura 27 es una gráfica que ilustra la actividad de neutralización de IgG BS-A" e IgG "BS-B" medida en el ensayo de células A549. Las IgGs fueron purificadas como se describe en el ejemplo 4 y añadidas a concentraciones de IgG que variaban de 0.1-100 µg/ml. Se usó anticuerpo Pharmingen B27 Ab (concentraciones que variaban de 0.01-5 µ9/t?!) como un control positivo. Un anticuerpo irrelevante, AT-IgG (concentraciones que variaban de 0.01-5 µg/ml) , que no reacciona con hlFNy se usó como un control negativo. Las células fueron teñidas con azul Alamar 5 días después del tratamiento y se analizaron 4 horas después de la tinción en un lector de placa FL500. La figura 28 es un gráfica que proporciona una comparación de la afinidad y actividad de neutralización de IgGs "BS-A", "BS-B" , "RD-A2" , "RD-B" , "IFN-A" , "57E" , "57D" , "GP-A", "58-C" y "67C" medidas por BiaCore y en el ensayo de células A549. Los datos BiaCore se analizaron usando BIAEVALUATION. La figura 29 es un gráfica que ilustra la actividad de neutralización de IgG "BS-A" e IgG "BS-B" medida por BIACore. La respuesta de unión relativa (%) se gráfica contra la concentración de muestra (nM) . La figura 30 es una gráfica que proporciona una comparación de la afinidad de Fabs anti-IFNy "BS-?" , "BS-B", "IFN-A" , y "GP-A" y las IgGs correspondientes medida por BIACore . La figura 31 muestra una comparación de secuencias de aminoácidos de Fab mostradas en las figuras 3-24. Las secuencias de aminoácidos predichas de los Fabs de cadena pesada y ligera "BS-A", "BS-B", "RD-A2" , "RD-B1" , "IFN-A" , "57E", "57D", "GP-A", "58-C", "67C" y "59-A2" se compararon para identidad y similitud. Se usó el programa "BestFit" de GCG para obtener el porcentaje de identidad y similitud entre cada par de Fabs . La figura 32 muestra alineaciones de las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la cadena ligera y pesada de Fabs "BS-A" , "BS-B" , "RD-A2" , "RD-B1" , "IFN-A" , "57E", "57D", "GP-A", "58-C", "67C" y "59-A2" . La figura 33 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de Fab "BS-A" , "RD-A2" y "IFN-A" predichas (residuos 1-120, 1-127 y 1-126 inclusive en las figuras 3, 6 y 11, respectivamente) con la secuencia de línea germinal de la familia VH4. La secuencia de linea germinal comprende la secuencia de la región V 4-34, las secuencias de la región D 1-1, 3-3 ó 3-16 y la secuencia de la región J JH . FR1, FR2 y FR3 designan las tres regiones de armazón, CDR1, CDR2 y CDR3 designan las tres regiones de determinación de complementariedad y Hl, H2 y H3 designan las secuencias de empalme correspondientes entre las regiones de armazón y CDRs. Las diferencias entre "BS-A", "RD-A2" y "IFN-A" y las secuencias de línea germinal V, D o J están en negritas. La numeración de los residuos de aminoácidos de línea germinal en las figuras 33-46 es como la descrita en abat et al., Sequences of Proteins of Inununological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 4 ed. (1991). La figura 34 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena pesada de Fab "BS-B" y "59-A2" (residuos 1-121 y 1-120 inclusive en las figuras 4 y 13, respectivamente) predichas, con la secuencia de línea germinal de la familia VHl . La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 1-18, las secuencias de la región D 6-13, 1-1 ó 1-7 y la secuencia de la región J JH4. La figura 35 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab WRD-B1" predicha (residuos 1-119 inclusive en la figura 5) con la secuencia de línea germinal de la familia VH2. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 2-26, la secuencia de la región D 3-22 y la secuencia de la región J JH5. La figura 36 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "58C" predicha (residuos 1-119 inclusive en la figura 7) con la secuencia de línea germinal de la familia VH3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3-21, la secuencia de la región D desconocida y la secuencia de la región J JH4. La figura 37 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "GP-A" predicha (residuos 1-124 inclusive en la figura 8) con la secuencia de línea germinal de la familia VH3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3-30.3, la secuencia de la región D 3-10 y la secuencia de la región J JH3. La figura 38 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "57D" predicha (residuos 1-117 inclusive en la figura 9) con la secuencia de línea germinal de la familia VH3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3-53, la secuencia de la región D 3-16 y la secuencia de la región J desconocida . La figura 39 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "57E" predicha (residuos 1-118 inclusive en la figura 10) con la secuencia de línea germinal de la familia VH4. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 4-61, la secuencia de la región D 7-27 y la secuencia de la región J JH4. La figura 40 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "67C" predicha (residuos 1-119 inclusive en la figura 12) con la secuencia de línea germinal de la familia VH2. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 2-05, la secuencia de la región D 5-18 y la secuencia de la región J JH6. La figura 41 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Fab "BS-A", "BS-B" , "57E" y "59-A2" predichas (residuos 1-111, 1-110, 1-112 y 1-110 inclusive en las figuras 14, 15, 21 y 24, respectivamente) con la secuencia de línea germinal de la familia ??6. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 6a y las secuencias de la región J desconocida o JL2 o JL3. La figura 42 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de Fab "RD-B1" predicha (residuos 1-112 inclusive en la figura 16) con la secuencia de línea germinal de la familia VK2. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V A23 y la secuencia de la región J JK2. La figura 43 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de Fab "RD-A2" , "IFN-A" y "67C" predichas (residuos 1-112, 1-110, 1-112 y 1-110 inclusive en las figuras 17, 22 y 23, respectivamente) con la secuencia de línea germinal de la familia VK2. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V A19 y las secuencias de la región J JK3 , JK2 y JK2 , respectivamente. La figura 44 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab "58C" predicha (residuos 1-108 inclusive en la figura 18) con la secuencia de línea germinal de la familia ??3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 3h y la secuencia de la región J desconocida. La figura 45 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab WGP-A" predicha (residuos 1-106 inclusive en la figura 19) con la secuencia de línea germinal de la familia ??3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V 2-19 y la secuencia de la región J JL2 o JL3. La figura 46 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Fab "57D" predicha (residuos 1-108 inclusive en la figura 20) con la secuencia de línea germinal de la familia VK3. La secuencia de línea germinal comprende la secuencia de la región V A27 y la secuencia de la región J JK5. La figura 47 muestra una comparación de las clases de Fab. La comparación de clases de Fab se hizo usando el programa PileUp de GCG (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI 53711) para el análisis de comparación de varias secuencias. El símbolo (**) indica que la región de diversidad de coincidencia (D) más cercana o región de unión (J) , aunque está relacionada con secuencias de líneas germinales conocidas, no pudo determinarse. El símbolo (*) indica que ocurren variaciones en 1, 2 ó 3 residuos en comparación con la región de unión identificada.
Descripción detallada de la invención La presente invención proporciona agentes que se unen selectivamente ("agentes de unión selectivos") a la proteína interferón gamma humana (hlFNy) . De preferencia, los agentes son antagonistas o inhibidores de IFNy que inhiben parcial o completamente al menos una actividad de . IFNy, tal como la unión de IFNy a su receptor cognado. En una modalidad, los fragmentos de anticuerpo completamente humanos se unen selectivamente a IFNy de tal manera que bloqueen parcial o completamente la unión de IFNy a su receptor cognado y parcial o completamente inhiban la actividad de IFNy. El término "agente de unión selectivo" se refiere a una molécula que se une de preferencia a IFNy. Un agente de unión selectivo puede incluir una proteína, péptido, ácido nucleico, carbohidrato, lípido o compuesto de bajo peso molecular. En una modalidad preferida, un agente de unión selectivo es un anticuerpo, tal como anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales ( Abs) , anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados a CDR, anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) para anticuerpos que pueden ser marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos, regiones o derivados de los mismos, provistos mediante técnicas conocidas, incluyendo, pero no limitadas a corte enzimático, síntesis de péptidos o técnicas recombinantes . Los agentes de unión selectivos anti-IFNy de la presente invención son capaces de unirse a porciones de IFNy que inhiben la unión de IFNy al receptor IFNy-R. Los anticuerpos y dominios de unión a antígeno de la invención se unen selectivamente a IFNy, es decir se unen de preferencia a IFNy con una afinidad de unión mayor que a otros antígenos. Los anticuerpos pueden unirse selectivamente a IFNy humano, pero también se unen de manera detectable a IFNy no humano, tal como IFNy de murino. Como alternativa, los anticuerpos se pueden unir selectivamente a IFNy no humano, pero también se unen de manera detectable a IFNy humano. Como alternativa, los anticuerpos se pueden unirse exclusivamente a IFNy humano, sin unión detectable a IFNy no humano. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos en donde cada anticuerpo monoclonal reconocerá típicamente un solo epítope en el antígeno. El término "monoclonal" no está limitado a ningún método particular para hacer el anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos ' monoclonales de la invención pueden hacerse mediante el método de hibridoma como el descrito en Kohler et al., Nature, 256:496 (1975) o se pueden aislar de bibliotecas de fagos usando las técnicas como las descritas en la presente, por ejemplo. El término "dominio de unión a antígeno" o "región de unión a antígeno" se refiere a la porción del agente de unión selectivo (tal como una molécula de anticuerpo) que contiene los residuos de aminoácido que interactúan con un antígeno y confieren en el agente de unión su especificidad y afinidad para el antígeno. De preferencia, la región de unión a antígeno será de origen humano. En otras modalidades, la región de unión a antígeno se puede derivar de otras especies de animales, en particular roedores, tales como conejos, ratas o hámsteres. El término "epítope" se refiere a la porción de cualquier molécula capaz de ser reconocida por y unida por un agente de unión selectivo (tal como un anticuerpo) en una o más de las regiones de unión de antígeno del agente de unión. Los epítopes consisten normalmente en grupos de moléculas de superficie activa químicamente tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y tienen características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Por "inhibir y/o neutralizar el epítope" se intenta decir un epítope, el cual, cuando es unido por un agente de unión selectivo, da como resultado la pérdida de la actividad biológica de la molécula u organismo que contiene el epítope, in vivo, in vitro, in situ, muy preferiblemente in vivo, incluyendo la unión de IFNy a su receptor. El término "cadena ligera" cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a dos tipos distintos, llamados kappa (?) o lambda (?) con base en la secuencia de aminoácidos de los dominios constantes . El término "cadena pesada" cuando se usa en referencia a un anticuerpo se refiere a cinco tipos distintos llamados alfa, delta, épsilon, gamma y mu, con base en la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. Estos diferentes tipos de cadenas pesadas dan origen a cinco clases de anticuerpos, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, respectivamente, que incluyen cuatro subclases de IgG, llámense IgGx , IgG2 , IgG3 e IgG4. El término "región variable" o "dominio variable" se refiere a una porción de las cadenas ligera y pesada, típicamente alrededor de 120 a 130 aminoácidos de la terminal amino en la cadena pesada y alrededor de 100 a 110 aminoácidos en la cadena ligera, los cuales difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. La variabilidad de secuencias se concentra en aquellas regiones llamadas de determinación de complementar!edad (CDRs, por sus siglas en inglés) mientras que las regiones más altamente conservadas en el dominio variable son llamadas las regiones de armazón (FR, por sus siglas en inglés) . Las CDRs de las cadenas ligera y pesada son responsables de la interacción del anticuerpo con el antígeno. El término "región constante" o "dominio constante" se refiere a una porción de la terminal carboxi de la cadena ligera y pesada que no está implicada directamente en la unión del anticuerpo al antígeno pero que exhibe varias funciones efectoras, tales como interacción con el receptor Fe. El término "interferón gamma humano" o "polipéptido de interferón gamma humano" se refiere a los polipéptidos que comprenden la secuencias de · aminoácidos descritas en la publicación de PCT WO 83/04053, cuya descripción se incorpora a manera de referencia, y polipéptidos relacionados. Los polipéptidos relacionados incluyen la variantes alélicas; variantes de empalme; fragmentos; derivados; variantes de sustitución, supresión e inserción; polipéptidos de fusión y homólogos entre especies. También se abarcan las formas solubles de IFNy que son suficientes para generar una respuesta inmunológica . IFNy puede ser un polipéptido maduro, como el definido en la presente, y puede o no tener un residuo de metionina amino-terminal , dependiendo del método mediante el cual se prepare. El término "fragmentos" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende menos que la secuencia de aminoácidos de longitud completa. Este fragmento puede originarse, por ejemplo, a partir de un truncado . en el término amino, un truncado en el término carboxi y/o una supresión interna de un residuo de la secuencia de aminoácidos . Los fragmentos pueden resultar del empalme de ARN alternativo o de la actividad proteasa in vivo. El término "variante" cuando se usa en relación a IFNy o a un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de secuencia de aminoácidos en comparación con una secuencia nativa o no modificada. Por ejemplo, una variante de IFNy puede ser el resultado de uno o más cambios en una secuencia de aminoácidos de IFNy nativo. También a manera de ejemplo, una variante de un agente de unión selectivo de IFNy puede ser el resultado de uno o más cambios a una secuencia de aminoácidos de un agente de unión selectivo nativo o previamente no modificado. Las variantes pueden ser de ocurrencia natural, tales como variantes alélicas o de empalme, o se pueden construir artificialmente . Las variantes de polipéptidos pueden prepararse a partir de las moléculas de ácido nucleico correspondientes que codifican para las variantes. El término "derivados" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a un polipéptido o péptido, o a una variante, fragmento o derivado del mismo, que ha sido modificado químicamente. Ejemplos incluyen la fijación covalente de uno o más polímeros tales como polímeros hidrosolubles , carbohidratos N-enlazados u O-enlazados, azúcares, fosfatos y/u otras de estas moléculas. Los derivados se modifican de una manera que sea diferente de los péptidos o polipéptidos que ocurren naturalmente o de partida, ya sean el tipo o lugar de las moléculas unidas. Los derivados incluyen además la supresión de uno o más grupos químicos que están presentes naturalmente en el péptido o polipéptido. El término "fusión" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a la unión de un péptido o polipéptido, o fragmento, variante y/o derivado del mismo, con un péptido o polipéptido heterólogo . El término "biológicamente activo" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo, se refiere a un péptido o polipéptido que tiene al menos una actividad característica de IFNy o un agente de unión selectivo. Un agente de unión selectivo de IFNy puede tener actividad agonista, antagonista o neutralizadora o de bloqueo con respecto a por lo menos una actividad biológica de IFNy. El término "que ocurre naturalmente" cuando se usa en relación con materiales biológicos tales como moléculas de ácido nucleico, polipéptidos , células hospederas y similares, se refiere a aquellos que se encuentran en la naturaleza y no son manipulados por un ser humano. El término "aislado" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a un péptido o polipéptido que está libre de por lo menos un polipéptido contaminante que se encuentra en su ambiente natural, y que está de preferencia sustancialmente libre de cualquier otro polipeptido de mamífero contaminante que pudiera interferir con su uso terapéutico o de diagnóstico. El término "maduro" cuando se usa en relación con IFNy o con un agente de unión selectivo proteináceo de IFNy, se refiere a un péptido o polipéptido que carece de una secuencia líder. El término también puede incluir otras modificaciones de un péptido o polipéptido tales como el procesamiento proteolítico del término amino (con o sin una secuencia líder) y/o el término carboxi, el corte de un polipéptido más pequeño de un precursor más grande, glicosilación n-enlazada y/o o-enlazada, y similares. Los términos "cantidad efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" cuando se usan en relación con un agente de unión selectivo de IFNy, se refieren a una cantidad de un agente de unión selectivo que es útil o necesaria para soportar un cambio observable en el nivel de una o más actividades biológicas de IFNy. Este cambio puede ser un incremento o disminución en el nivel de la actividad de IFNy. El término "sustitución de aminoácidos conservativa o conservadora" se refiere a una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo no nativo de tal manera que haya muy poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en esa posición. Por ejemplo, una sustitución conservativa es el resultado del reemplazo de un residuo no polar en un polipéptido con cualquier otro residuo no polar. Además, cualquier residuo nativo en un polipéptido también puede ser sustituido con alanina, como se ha descrito anteriormente para la mutagénesis de escudriñamiento con alanina; Cunningham et al., Science, 244:1081-1085 (1989). Las reglas ejemplares para las sustituciones de aminoácidos conservadoras se describen en la tabla 1. Tabla 1 Sustituciones de aminoácido conservadoras Residuos Sustituciones Ejemplares Sustituciones Preferidas Originales ALA VAL, LEU, ILE VAL ARG LYS, GLN, ASN LYS ASN GLN, HIS, LYS, ARG GLN ASP GLU GLU CYS SER SER GLN ASN ASN GLU ASP ASP GLY PRO, ALA ALA HiS ASN, GLN, LYS, ARG ARG ILE LEU, VAL, MET, ALA, PHE, LEU NORLEUCINA LEU NORLEUCINA, ILE, VAL, MET, ILE ALA, PHE LYS ARG, GLN, ASN ARG MET LEU, PHE, ILE LEU PHE LEU, VAL, ILE, ALA, TYR LEU POR ALA ALA SER THR THR THR SER SER TRP TYR, PHE PHE TYR TRP, PHE, THR, SER PHE VAL ILE, MET, LEU, PHE, ALA, LEU NORLEUCINA Las sustituciones de aminoácidos conservadoras también abarcan residuos de aminoácido que ocurren no naturalmente los cuales están incorporados típicamente por síntesis de péptidos química en lugar de por síntesis en sistemas biológicos. Éstos incluyen peptidomiméticos y otras formas invertidas o revertidas de porciones de aminoácidos. Las modificaciones conservadoras a la secuencia de aminoácidos (y las modificaciones correspondientes a los nucleótidos de codificación) son capaces de producir polipéptidos IFNy (y agente de unión selectivo proteináceo del mismo) que tienen características funcionales y químicas similares a aquellas de IFNy o agentes de unión selectivos que ocurren naturalmente. En contraste, las modificaciones sustanciales en las características funcionales y/o químicas de IFNy (y agentes de unión selectivos proteinaceos del mismo) se pueden lograr al seleccionar sustituciones que difieran significativamente en su efecto al mantener a) la estructura de la base molecular en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de hoja o helicoidal, b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o c) el bulto de la cadena lateral. Los residuos que ocurren naturalmente pueden dividirse en grupos con base en las propiedades de la cadena lateral común: 1) Hidrofóbicos : norleucina, Met, Ala, Val, Leu, He; 2) Hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr; 3) Acidos: Asp, Glu; 4) Básicos: Asn, Gln, His, Lys , Arg; 5) Residuos que influencian la orientación de la cadena: Gly, Pro; y 6) Aromáticos: Trp, Tyr, Phe. Las sustituciones no conservadoras pueden incluir el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. La "identidad o similitud" de dos o más moléculas de ácido nucleico y/o polipéptidos proporciona una medida del parentesco de dos o más secuencias distintas. El término "identidad" se refiere a aminoácidos que son idénticos en posiciones correspondientes en dos secuencias de aminoácidos distintas. El término "similitud" se refiere a aminoácidos que son idénticos o son sustituciones conservadoras como las definidas arriba en posiciones correspondientes en dos secuencias de aminoácidos distintas . El grado de identidad o similitud puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero no limitados a los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. , ed. ; Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. ., et . , Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M. , y Griffin, H.G., eds . , Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, . and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., SIAM J". Applied Math. , 48:1073 (1998). Los métodos preferidos para determinar la identidad y/o similitud están diseñados para dar la coincidencia más amplia entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas de computadora disponibles públicamente. Los métodos de programas de computadora ejemplares para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programa GCG, incluyendo GAP; Devereux et al., Nucelic Acids Research, 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, adison, WI; BLASTP, BLASTN, y FASTA Altschul et al., J. Mol. Biol . , 215: 403-410 (1990)'. El programa BLAST X está disponible públicamente del Centro Nacional para la Información de Biotecnología (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al., NCB NL NIH Bethesda, D) . El algoritmo de Smith-Waterman bien conocido también se puede usar para determinar la identidad. Polipéptidos ???? Los polipéptidos IFNy, y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, se usan como moléculas objetivo para tamizar e identificar los agentes de unión selectivos de la invención. Cuando se desea preparar anticuerpos como agentes de unión selectivos, los polipéptidos IFNy son de preferencia inmunogénicos , es decir, desarrollan una respuesta inmune cuando se administran a un animal. Como alternativa, cuando se preparan anticuerpos mediante técnicas in vitro, los polipéptidos IFNy usados como moléculas objetivo también son capaces de unirse detectablemente a un anticuerpo o dominio de unión a antígeno . Los polipéptidos IFNy se preparan mediante métodos biológicos o químicos . Se conocen en la técnica los métodos biológicos, tales como la expresión de secuencias de ADN que codifican para IFNy recombinantes , véase, por ejemplo, Sambrook et al., citado anteriormente. Métodos de síntesis química tales como aquellos establecidos por Merrifield et al., J.'ñm. Chem. Soc. , 85:2149 (1963), Houghten et al., Proc Nati Acad. Sci. E.U.A, 82:5132 (1985) y Stewart and Young, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) también se pueden usar para preparar polipéptidos IFNy de la invención. Estos polipéptidos se pueden sintetizar con o sin una metionina en el término amino. Los polipéptidos IFNy sintetizados químicamente, o fragmentos o variantes de los mismos, se pueden oxidar usando métodos descritos en estas referencias para formar puentes de disulfuro. Los polipéptidos IFNy de la invención preparados mediante síntesis química tendrán por lo menos una actividad biológica comparable con la de los polipép idos IFNy correspondientes producidos en forma recombinante o purificados de fuentes naturales . Los polipéptidos IFNy pueden obtenerse mediante aislamiento de muestras biológicas tales como tejidos de origen y/o fluidos en los cuales se encuentren naturalmente los polipéptidos IFNy. Las fuentes para polipéptidos IFNy pueden ser de origen humano o no humano. El aislamiento de los polipéptidos IFNy que ocurren naturalmente puede lograrse usando métodos conocidos en la técnica, tales como separación mediante electroforesis seguida por electroelución, varios tipos de cromatografía (afinidad, inmuno-afinidad, tamiz molecular y/o intercambio iónico) y/o cromatografía de líquidos de alta presión. La presencia del polipéptido IFNy durante la purificación puede monitorearse usando, por ejemplo, un anticuerpo preparado contra polipéptido IFNy producido recombinantemente o fragmentos de péptidos del mismo . Los polipéptidos de la invención incluyen polipéptidos de IFNy aislados y polipéptidos relacionados con los mismos que incluyen fragmentos, variantes, polipéptidos de fusión y derivados como los definidos anteriormente en la presente . Los fragmentos de IFNy de la invención pueden ser el resultado de truncados en el término amino (con o sin una secuencia líder) , truncados en el término carboxi y/o supresiones internas al péptido. Estos fragmentos de polipéptidos IFNy pueden comprender opcionalmente un residuo de metionina amino terminal . Los polipéptidos de la invención serán inmunognénicos ya que serán capaces de desarrollar una respuesta a anticuerpos . Las variantes de polipeptido IFNy de la invención incluyen una o más sustituciones, adiciones y/o supresiones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de IFNy nativo. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser conservadoras, como se definió arriba, o no conservadoras, o cualquier combinación de las mismas. Las variantes pueden tener adiciones de residuos de aminoácidos ya sea en el término carboxi o en el término amino (en donde el término amino puede o no comprender una secuencia lider) . Las modalidades de la invención incluyen variantes de glicosilacion de IFNy y variantes de cisterna . Las variantes de glicosilacion de IFNy incluyen variantes en las que el número y/o tipo de sitios de glicosilacion ha sido alterado en comparación con el polipéptido IFNy nativo. En una modalidad, las variantes de glicosilacion de IFNy comprenden un número mayor o menor de sitios de glicosilacion n-enlazados en comparación con IFNy nativo. También se proporcionan variantes de glicosilacion de IFNy que comprenden una redisposición de cadenas de carbohidratos n-enlazadas en donde uno o más sitios de glicosilación n-enlazados (típicamente aquellos que ocurren naturalmente) son eliminados y uno o más sitios n-enlazados nuevos son creados. Las variantes de cisteina de IFNy comprenden un número mayor o como alternativa un número menor de residuos de cisteina en comparación con IFNy. En una modalidad uno o más residuos de cisteina son suprimidos o sustituidos con otro aminoácido (por ejemplo, serina) . Las variantes de cisteina de IFNy pueden mejorar la recuperación de IFNy biológicamente activo al ayudar al redoblez de IFNy en una conformación biológicamente activa después del aislamiento de un estado desnaturalizado. La preparación de las variantes de polipéptidos IFNy está dentro de la capacidad de experto en la técnica. En un enfoque, se puede introducir una o más sustituciones, supresiones y/o adiciones de aminoácidos en el IFNy nativo en donde la variante de IFNy retiene y conserva la estructura nativa de IFNy y/o por lo menos una de las actividades biológicas. Un enfoque es comparar secuencias de polipéptidos IFNy de una variedad de especies diferentes para determinar así e identificar las regiones de una similitud y/o identidad relativamente alta y baja. Se debe apreciar que esas regiones de un polipéptido IFNy que tienen identidad y/o similitud relativamente bajas, son menos propensas a ser esenciales para la estructura y actividad y por lo tanto pueden ser más tolerantes de alteraciones de aminoácido, especialmente aquellas que son no conservadoras . También se aprecia que incluso en regiones relativamente conservadas, se puede introducir sustituciones de aminoácidos conservadoras mientras se conserva la actividad. En otro enfoque, la relaciones estructura-función se pueden usar para identificar residuos en polipéptidos similares que sean importantes para su actividad o estructura. Por ejemplo, se pueden comparar un residuo de aminoácidos conservado entre IFNy y otros miembros de la familia de factor de necrosis tumoral para los cuales los análisis de estructura-función estén disponibles y, con base en esa comparación, predecir qué residuos de aminoácido en IFNy son importantes para actividad o estructura. Un experto en la técnica puede seleccionar sustituciones de aminoácidos químicamente similares para estos residuos de aminoácidos importantes y predichos de IFNy. En otro enfoque más, un análisis de una estructura secundaria o terciaria de IFNy (ya sea determinada mediante difracción de rayos X de cristales IFNy o mediante métodos de predicción de estructura) se puede llevar a cabo para determinar la localización de los residuos de aminoácido específicos en relación con las estructuras reales o predichas dentro de un polipéptido IFNy. Usando esta información, se puede introducir cambios de aminoácido de una manera que busque conservar lo más posible la estructura secundaria y/o terciaria de un polipéptido IFNy. En otro enfogue, los efectos de alterar los aminoácidos en posiciones específicas se pueden probar experimentalmente al alterar y al introducir sustituciones de aminoácido y probar los polipéptidos IFNy alterados para actividad biológica usando ensayos descritos arriba . Las técnicas como la mutagénesis de barrido con alanina (Cunningham et al., citado anteriormente) son particularmente adecuadas para este enfogue. Muchas secuencias alteradas pueden probarse convenientemente al introducir muchas sustituciones en varias posiciones de aminoácido en IFNy y tamizando la población de polipéptidos alterados como parte de una biblioteca de despliegue de fagos. Usando este enfogue, las regiones de un polipéptido IFNy que son esenciales para la actividad pueden ser fácilmente determinadas . Los métodos anteriores son útiles para generar variantes de IFNy que conserven la estructura nativa. De esta manera, los anticuerpos desarrollados contra cada una de estas variantes son propensos a reconocer un determinante estructural nativo o epítope de IFNy, y también son propenso a unirse a IFNy nativo. Sin embargo, en algunos casos podría ser deseable producir variantes de IFNy que no conservaran la estructura de IFNy nativa o que fueran parcial o completamente no llenadas. Los anticuerpos desarrollados contra estas proteínas reconocerán epitopes enterrados en IFNy. La invención proporciona también polipéptidos de fusión a IFNy que comprenden los polipéptidos IFNy, y un péptido o proteína heterólogo. Los péptidos o proteínas heterólogos incluyen, pero no están limitados a un epítope para permitir la detección y/o aislamiento de un polipéptido de fusión a IFNy; una proteína receptora de transmembrana o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular, o un dominio intramembranal e intracelular, un ligando o una porción del mismo que se una a una proteína del receptor de transmembrana/ una enzima o porción de la misma que sea catalíticamente activa; una proteína o péptido que promueva la oligomerización, tal como dominio de cremallera de leucina y una proteína o péptido que incremente la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina. Un polipéptido IFNy puede ser fusionado a sí mismo o a un fragmento, variante o derivado del mismo. Las fusiones se pueden hacer ya sea en el término amino o en el término carboxi de un polipéptido IFNy, y se pueden dirigir sin enlazador o molécula adaptadora o pueden ser a través de un enlazador o molécula adaptadora. Un enlazador o- molécula adaptadora puede ser diseñado también con un sitio de corte para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa, para permitir la separación de las porciones fusionadas. En una modalidad adicional de la invención, un polipéptido IFNy, un fragmento, variante y/o derivado es fusionado a una región Fe de IgG humana. En un ejemplo, una región de salto, ch2 y ch3 de IgG humana puede fusionarse ya sea en el término N o término C de los polipéptidos IFNy usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En otro ejemplo, una porción de regiones de salto y regiones ch2 y ch3 puede ser fusionada. El polipéptido de fusión Fe a IFNy producido de esta manera puede purificarse mediante el uso de una columna de afinidad de proteína a. Además, péptidos y proteínas fusionados a una región Fe han mostrado exhibir una vida promedio sustancialmente más grande in vivo que su contraparte no fusionada. Asimismo, una fusión a una región Fe permite la dimerización/multimerización del polipéptido de fusión. La región Fe puede ser una región Fe que ocurra naturalmente, o puede ser alterada para mejorar ciertas cualidades, tales como cualidades terapéuticas, tiempo de circulación, reducir la agregación, etc. Los derivados del polipéptido IFNy están incluidos en el alcance de la presente invención. Estos derivados son composiciones de polipéptido IFNy modificadas químicamente en las cuales el polipéptido IFNy está enlazado a un polímero. El polímero seleccionado es típicamente hidrosoluble de tal manera que la proteína a la cual esté unido no se precipite en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Dentro del alcance de los polímeros de polipéptido IFNy está incluida una mezcla de polímeros. De preferencia, para uso terapéutico de la preparación de producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable. El polímero hidrosoluble o mezcla del mismo puede ser por ejemplo, polietilenglicol (PEG) , monometoxi-polietilenglicol , dextrano (tal como dextrano de bajo peso molecular, de, por ejemplo, alrededor de 6 kD) , celulosa, u otros polímeros a base de carbohidratos, polivinilpirrolidona polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicero) y alcohol polivinílico . Un polímero hidrosoluble que se prefiere es polietilenglicol. Según se usa en la presente, polietilenglicol intenta abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido usadas para derivar otras proteínas, tales como mono- (alcoxi de Ci-C10) o ariloxi-polietilenglicol . También se abarcan por la invención las moléculas de entrelazamiento de PEG bifuncionales que pueden usarse para preparar multimeros de IFNy unidos covalentemente. Los métodos para preparar polipéptidos IFNy derivados químicamente se conocen en la técnica. A manera de ejemplo, la derivación de polipéptidos IFNy con PEG se pueden llevar a cabo usando procedimientos descritos en Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384. En una modalidad preferida, un derivado de polipéptido IFNy tendrá una sola porción de PEG en el término amino; véase la patente de E.U.A. No. 5,985,265, incorporada en la presente a manera de referencia. Los derivados del polipéptido IFNy descritos en la presente pueden exhibir un incremento o reducción de por lo menos una actividad biológica de IFNy en comparación con un polipéptido no modificado, o pueden exhibir vida promedio o estabilidad incrementada o disminuida. Agentes de unión selectivos de IFNy Los polipéptidos IFNy, y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, se pueden usar para identificar agentes de unión selectivos de IFNy. Como se definió arriba un agente de unión selectivo de IFNy abarca tanto agentes de unión proteináceos como no proteináceos y, en una modalidad preferida de la invención, el agente de unión selectivo es proteináceo. En otra modalidad preferida, el agente de unión selectivo es un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a IFNy, de preferencia IFNy humano. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos agonistas, los cuales incrementen el nivel de por lo menos una actividad biológica de IFNy; o anticuerpos antagonistas, lo cuales disminuyan el nivel de por lo menos una actividad biológica de IFNy. Los anticuerpos antagonistas de IFNy también pueden ser referidos como anticuerpos inhibidores o neutralizadores de IFNy. Aunque estos anticuerpos son modalidades preferidas de la invención, se entiende que otros agentes de unión selectivos proteináceos que sean agonistas o antagonistas de la actividad de IFNy también son abarcados por la invención. Como se describe en los ejemplos abajo, los anticuerpos anti-IFNy y dominios de unión a antígeno que inhiben por lo menos una actividad de IFNy han sido identificados. Las modalidades de la invención incluyen anticuerpos que comprenden una secuencia de Fab de cadena pesada como la mostrada en cualquiera de las figuras 3-13 y que comprende además una secuencia de cadena ligera kappa o lambda. Las secuencias de Fab de cadena ligera pueden ser como las mostradas en las figuras 14-24. Por ejemplo, un anticuerpo "BS-A" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 14 y 3, respectivamente; el anticuerpo "BS-B" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 15 y 4 , respectivamente; el anticuerpo "RD-B1" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 16 y 5, respectivamente; el anticuerpo "RD-A2" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 17 y 6, respectivamente; el anticuerpo "58C" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 18 y 7, respectivamente; el anticuerpo "GP-A" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 19 y 8, respectivamente; el anticuerpo W57D" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 20 y 9, respectivamente; el anticuerpo "57E" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 21 y 10, respectivamente; el anticuerpo "IFN-A" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 22 y 11, respectivamente; el anticuerpo "67C" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 23 y 12, respectivamente; el anticuerpo "59-A2" tiene secuencias de cadena ligera y pesada en las figuras 24 y 13, respectivamente. Los anticuerpos de la invención comprenden además una región Fe humana de cualquier isotipo, ya sea IgG, IgM, IgA, IgE o IgD. De preferencia, la región Fe es de IgG humana, tal como IgGl, IgG2 , IgG3 o IgG4. La invención proporciona también anticuerpos o dominios de unión a antígeno que comprenden fragmentos, variantes o derivados de las secuencias de Fab descritas en la presente . Los fragmentos incluyen dominios variables ya sea de las secuencias de Fab de cadena ligera o pesada que están unidos típicamente a dominios constantes ligeros o pesados. Las variantes incluyen anticuerpos que comprenden secuencias de Fab de cadena ligera que son al menos alrededor de 80%, 85%, 90%, 95% 98% ó 99% idénticas o similares a las secuencias de Fab, o los dominios variables correspondientes, en cualquiera de las figuras 14-24, o anticuerpos que comprenden secuencias de Fab de cadena pesada, o los dominios variables correspondientes, las cuales son por lo menos aproximadamente 80%, 85%, 90%, 95% 98% ó 99% idénticas o similares a las secuencias Fab en cualquiera de las figuras 3-13. Los anticuerpos pueden ser asociados típicamente con regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para formar anticuerpos de longitud completa. Los anticuerpos y dominios de unión a antigeno, y fragmentos, variantes y derivados de los mismos, de la invención conservarán la capacidad de unirse selectivamente a un polipéptido IFNy, de preferencia a un polipéptido IFNy humano. En una modalidad, un anticuerpo se unirá a un polipéptido IFNy con una constante de disociación (KD) de aproximadamente 1 n o menos, o alternativamente, 0.1 nM o menos, o alternativamente 10 pM o menos o alternativamente menos de ????. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales monoespecíficos , monoclonales, recombinantes, quiméricos, humanizados, completamente humanos, de cadena individual y/o biespecíficos . Los fragmentos de anticuerpo incluyen aquellas porciones del anticuerpo anti-IFNy que se unen a un epítope de un polipéptido IFNy. Ejemplos de estos fragmentos incluyen los fragmentos Fab F(ab'), F(ab)', Fv y sFv. Los anticuerpos pueden generarse mediante el corte enzimático de anticuerpos de longitud completa o mediante técnicas de ADN recombinante, tales como la expresión de plásmidos recombinantes que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican para regiones variables de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas del suero de animales inmunizados con un antígeno. Un antígeno es una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por un anticuerpo que además es capaz de inducir que un animal produzca un anticuerpo capaz de unirse a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopes . La reacción específica referida arriba intenta indicar que el antígeno reaccionará, de una manera altamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos . Los anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipéptido IFNy generalmente son desarrollados en animales (por ejemplo, conejos o ratones) mediante inyecciones subcutáneas o intraperitoneales múltiples de IFNy y un adyuvante. De acuerdo con la invención, puede ser útil conjugar un polipéptido IFNy, o una variante, fragmento o derivado del mismo a una proteína portadora que sea inmunogénica en las especies que serán inmunizadas, tales como heocianina de lapa en forma de cerradura, suero, albúmina, tiroglobulina de bovino o inhibidor de tripsina de soya.
Asimismo, los agentes de agregación tales como alumbre se usan para incrementar la respuesta inmune . Después de la inmunización, los animales se sangran y el suero se ensaya para la concentración de anticuerpo anti-IFNy. Los anticuerpos monoclonales (mAbs) contienen una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos para antígeno, población que contiene sitios de unión a epítope sustancialmente similares. Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina que incluye IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de las mismas. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal de la presente invención se puede cultivar in vivo, in vi tro o in situ. La producción de altas concentraciones in vivo o in situ es un método de producción preferido. Los anticuerpos monoclonales dirigidos hacia IFNy se producen usando cualquier método que proporciona la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas de células continuas en cultivo. Ejemplos de métodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen métodos de hibridoma de Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975) y el método de hibridoma de células B humanas, Kozbor, J". Imunol, 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. , Nueva York, 1987) ; y Harlow and Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ; cuyos contenidos se incorporan completamente en la presente a manera de referencia. Los agentes de unión selectivos anti-IFNy que se prefieren incluyen anticuerpos monoclonales que inhiben parcial o completamente la unión de IFNy humano a su receptor cognado, hIFNy-R, o un anticuerpo que tenga sustancialmente las mismas características de unión específica, así como a fragmentos y regiones de los mismos. Los métodos preferidos para determinar la especificidad de anticuerpos monoclonales y la afinidad mediante inhibición competitiva pueden encontrarse en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1988) ; Colligan et al., eds . , Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience , N.Y. , (1992, 1993); y Muller, Meth. Enzymol., 92:589-601 (1983). Estas referencias se incorporan en" la presente a manera de referencia. También se proporcionan por la invención líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipéptidos IFNy. Los anticuerpos quiméricos son moléculas en las cuales diferentes porciones se derivan de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal de murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se usan principalmente para reducir la inmunogenicidad en aplicación y para incrementar los rendimientos en producción, por ejemplo, cuando los anticuerpos monoclonales de murino tienen producciones más altas a partir de hibridomas pero inmunogenicidad más alta en humanos, por lo que se usan anticuerpos monoclonales quiméricos de humano/murino . Se conocen en la técnica los anticuerpos quiméricos y los métodos para su producción. Cabilly et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al., JVature, 312:643-646 (1984); Neuberger et al., Nature, 314:268-270 (1985); Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 84:3439-3443 (1987); y Harlow and Lañe Antibodies: A Laoratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) . Estas referencias se incorporan en la presente a manera de referencia. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales quiméricos de la invención se pueden usar como un terapéutico. En este anticuerpo quimérico, una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre y cuando exhiban la actividad biológica deseada; véase,, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 4,816,567 y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 81:6851-6855 (1985). Según se usa en la presente, el término "anticuerpo quimérico" incluye inmunoglobulinas monovalentes, divalentes o polivalentes. Un anticuerpo quimérico monovalente es un dímero (HL) formado por una cadena H quimérica asociada a través de puentes de disulfuro con una cadena L quimérica. Un anticuerpo quimérico divalente es tetrámero (H2L2) formado por dos dímeros HL asociados a través de al menos un puente de disulfuro. Un anticuerpo quimérico polivalente también puede producirse, por ejemplo, al emplear una región CH que se agregue (por ejemplo, de una cadena H de IgM, o cadena µ) . Los anticuerpos quiméricos y de murino, fragmentos y regiones de la presente invención pueden comprender cadenas de inmunoglobulina pesada (H) y/o ligera (L) individuales. Una cadena H quimérica comprende una región de unión a antigeno derivada de la cadena H de un anticuerpo no humano específico para IFNy, la cual está enlazada por lo menos a una porción de una región C de la cadena H humana (CH) , tal como CHi o CH2. Una cadena L quimérica de acuerdo con la presente invención comprende una región de unión a antígeno derivada de la cadena L de un anticuerpo no humano específico para IFNy, enlazada a por lo menos una porción de una región C de cadena L humana (CL) . Los agentes de unión selectivos, tales como anticuerpos, fragmentos o derivados, que tienen cadenas H quiméricas y cadenas L de la misma o diferente especificidad de unión a región variable, también pueden prepararse mediante la sucesión adecuada de las cadenas de polipéptido individuales, de acuerdo con etapas de método conocidas; véase, por ejemplo, Ausubel et al., eds . Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, ?.?. (1993) y Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988) . Los contenidos de estas referencias son incorporados completamente en la presente a manera de referencia. Con este enfoque, los huéspedes que expresan cadenas H quiméricas (o sus derivados) se cultivan por separado a partir de huéspedes que expresan cadenas L quiméricas (o sus derivados) , y las cadenas de inmunoglobulina se recuperan por separado y luego se asocian. Como alternativa, los huéspedes "pueden ser co-cultivados y las cadenas dejadas asociar espontáneamente en el medio de cultivo, seguidas por la recuperación de la inmunoglobulina ensamblada, fragmento o derivado. Como un ejemplo, la región de unión a -antxgeno del agente de unión selectivo (tal como un anticuerpo quimérico) de la presente invención se deriva preferiblemente de un anticuerpo no humano específico para IFNy humano. Las fuentes preferidas para el ADN que codifica para este anticuerpo no humano incluyen líneas de células que producen anticuerpos, tales como líneas de células híbridas conocidas comúnmente como hibridomas . La invención proporciona también fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpo anti-IFNy, en donde los términos "fragmentos" , "variantes" , "derivados" y "fusiones" se definen en la presente. La invención abarca fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpo anti-IFNy que son funcionalmente similares al anticuerpo anti-IFNy no modificado, es decir, conservan al menos una de las actividades del anticuerpo no modificado. Además de las modificaciones descritas arriba, también se incluye la adición de secuencias genéticas que codifican para proteínas citotóxicas tales como toxinas vegetales y bacterianas. Los fragmentos, variantes, derivados y fusiones de anticuerpo anti-IFNy pueden producirse a partir de cualquiera de los huéspedes de esta invención. Los fragmentos adecuados incluyen, por ejemplo, Fab, Fab' , F(ab')2, Fv y scFv. Estos fragmentos carecen del fragmento Fe de un anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener una unión a tejido no específica que la de un anticuerpo intacto; Wahl et al., J". Nucí. Med. , 24:316-326 (1983). Estos fragmentos se producen de anticuerpos intactos usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo mediante el corte proteolítico con enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2) · La identificación de estas regiones de unión a antígeno y/o epítopes reconocidos por anticuerpos monoclonales de la presente invención proporciona la información necesaria para generar anticuerpos monoclonales adicionales con características de unión similares y utilidad terapéutica o de diagnóstico que son paralelas a las modalidades de esta solicitud. Las variantes de agentes de unión selectivos también se proporcionan. En una modalidad, variantes de anticuerpo y dominios de unión a antígeno comprenden cambios en las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y/o pesada que son naturalmente ocurrentes o son introducidos mediante manipulación in vitro de secuencias nativas usando técnicas de ADN recombinante . Las variantes que ocurren naturalmente incluyen variantes "somáticas" las cuales son generadas in vivo en las secuencias de nucleótidos de línea germinal correspondientes durante la generación de una respuesta de anticuerpo a un antígeno extraño. Las variantes codificadas por las mutaciones somáticas en las secuencias de cadena ligera y pesada variable de línea germinal que generan los Fabs ejemplares de la presente invención en secuencias se muestran en las Figuras 33 y 41 para Fab "BS-A", las figuras 34 y 41 para Fab "BS-B", las figuras 35 y 42 para "RD-B1" , las figuras 35 y 42 para Fab "RD-B1" , las figuras 33 y 43 para Fab "RD-A2" , las figuras 36 y 44 para Fab "58C" , las figuras 37 y 45 para Fab "GP-A" , las figuras 38 y 46 para Fab "57D" , las figuras 39 y 41 para Fab "57E" , las figuras 33 y 43 para Fab "IF -A", las figuras 40 y 43 para Fab U67C" y las figuras 34 y 41 para Fab "59-A2" . Las variantes de anticuerpos anti-IFNy y dominios de unión a antígeno también pueden prepararse mediante técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. En un ejemplo, los cambios de aminoácido pueden introducirse al azar a lo largo de una región de codificación de anticuerpo y las variantes resultantes pueden ser tamizadas para una actividad deseada, tal como la afinidad de unión para IFNy. Como alternativa, los cambios de aminoácido pueden introducirse en regiones seleccionadas de un anticuerpo IFNy, tal como las CDRs de la cadena ligera y/o pesada y regiones de armazón, y los anticuerpos resultantes pueden ser tamizados para unión a IFNy o alguna otra actividad. Los cambios de aminoácido abarcan una o más sustituciones de aminoácido en una CDR que varían de una sola diferencia de aminoácido a la introducción de todas las permutaciones posibles de aminoácidos dentro de una CDR dada, tal como CDR3. En otro método, la contribución de cada residuo dentro de una CDR a la unión a IFNy puede ser ensayada al sustituir al menos un residuo de la CDR con alanina Lewis et al., Mol. Immunol., 32:1065-1072 (1995). Los residuos que no son óptimos para la unión a IFNy pueden ser después cambiados para determinar así una secuencia más óptima. También se abarcan las variantes generadas mediante inserción de aminoácidos para incrementar el tamaño de una CDR, tal como CDR3. Por ejemplo, la mayoría de las secuencias CDR3 de cadena ligera tienen 9 aminoácidos de longitud. Las secuencias CDR3 de cadena ligera en un anticuerpo que son más cortas que 9 residuos pueden ser optimizadas para su unión a IFNy mediante la inserción de aminoácidos adecuados para incrementar la longitud de la CDR. En una modalidad, las variantes de anticuerpo o dominio de unión a antígeno comprenden uno o más cambios de aminoácido en una o más de las regiones CDR1, CDR2 o CDR3 de cadena pesada o ligera y opcionalmente una o más de las regiones de armazón de cadena pesada o ligera FR1, FR2 o FR3. Los cambios de aminoácido comprenden sustituciones, supresiones y/o inserciones de residuos de aminoácido. Las variantes ejemplares incluyen una variante de región variable de cadena pesada "BS-A" con uno o más cambios de aminoácido en las secuencias GYYWS (SEQ ID NO: 34) EINHSGSTNYNPSLKS (SEQ ID NO: 44) ; o GRARNWRSRFDY (SEQ ID NO : 54), o una variante de región variable de cadena ligera "BS-A" con uno o más cambios de aminoácido en las secuencias TGSSGSIASHYVQ (SEQ ID NO: 01) ; EDKERPS (SEQ ID NO: 12); o QSYDSSNQ V (SEQ ID NO: 23). Las variantes de región variable de cadena pesada y ligera de "BS-A" mencionadas arriba pueden comprender además uno o más cambios de aminoácido en las regiones de armazón. En un ejemplo, uno o más cambios de aminoácido pueden introducirse para sustituir un residuo de armazón mutado somáticamente con el residuo de línea germinal en esa posición. Cuando los cambios de aminoácido mencionados arriba son sustituciones, los cambios pueden ser sustituciones conservadoras o no conservadoras . Las variantes también pueden prepararse mediante "clasificación de cadena" ya sea de cadenas ligeras o pesadas; Marks et al., Biothecnology, 10:779-783 (1992). Típicamente, una sola cadena ligera (o pesada) se combina con una biblioteca que tiene un repertorio de cadenas pesadas (o ligeras) y la población resultante se tamiza para una actividad deseada, tal como unión a IFNy. Esta técnica permite el tamizado de una muestra más grande de diferentes cadenas pesadas (o ligeras) en combinación con una sola cadena ligera (o pesada) que - es posible con bibliotecas que comprenden repertorios tanto de cadenas pesadas como ligeras . Los agentes de unión selectivos de la invención pueden ser biespecíficos . Los agentes de unión selectivos biespecíficos de esta invención pueden tener varias configuraciones. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos simulan anticuerpos individuales (o fragmentos de anticuerpos) pero tienen dos sitios de unión a antígeno diferentes (regiones variables) . Los anticuerpos biespecíficos pueden producirse mediante técnicas químicas; véase, por ejemplo, Kranz et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 78:5807 (1981); por técnicas de "polidoma" ; patente de E.U.A. No. 4,474,893; o mediante técnicas de ADN recornbxnante. Los agentes de unión selectivos de la invención también pueden ser heteroanticuerpos . Los heteroanticuerpos son dos o más anticuerpos o fragmentos de unión a anticuerpo (Fab) enlazados juntos, cada anticuerpo o fragmento tiene una diferente especificidad. La invención se refiere también a anticuerpos "humanizados" . Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos se conocen bien en la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácido introducidos en un anticuerpo humano desde una fuente que es no humana. En general, los residuos no humanos estarán presentes en CDRs . La humanización puede llevarse a cabo siguiendo métodos conocidos en la técnica; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988), al sustituir regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de roedor por -las regiones correspondientes de un anticuerpo humano . Los agentes de unión selectivos de la invención, incluyendo anticuerpos quiméricos, injertados con CDR y humanizados pueden producirse mediante métodos recombinantes conocidos en la técnica. Los ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos se introducen en células hospederas y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en la presente y conocidos en la técnica. En una modalidad preferida los anticuerpos se producen en células hospederas de mamífero, tales como células CHO. Los anticuerpos completamente humanos pueden producirse mediante la expresión de ADN recombinante transfectado en células hospederas o mediante la expresión en células de hibridoma como se describió arriba. Las técnicas para crear versiones de ADN recombinante de las regiones de unión a antígeno de moléculas de anticuerpo que derivan la generación de anticuerpos monoclonales se abarcan dentro de la práctica de esta invención. Para hacer esto, moléculas de ARN mensajero específicas de anticuerpos son extraídas de células del sistema inmune tomadas de un animal inmunizado, y transcritas en ADN complementario (ADNc) . El ADNc es clonado después en un sistema de expresión bacteriano. Un ejemplo de esta técnica adecuada para la práctica de esta invención usa un bacteriófago filamentoso M13 derivado de un sistema de vector fagémido que tiene un secuencia líder que causa que la proteína Fab expresada migre al espacio periplásmico (entre la membrana de la célula bacteriana y la pared celular) o que sea secretado. Se puede generar y tamizar rápidamente un gran número de fragmentos de Fab funcionales para aquellos que se unen al antígeno. Estos agentes de unión selectivos de IFNy (fragmentos Fab con especificidad para un polipéptido ????) son abarcados específicamente dentro del término "anticuerpo" como se define, describe y reclama en la presente. También dentro del alcance de la invención están las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos quiméricos al empalmar los genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad para antígenos adecuada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica adecuada; tal como la capacidad para activar complemento y mediar el complemento humano ADCC; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 81:6851 (1984); Neuberger et al., Nature, 312:604 (1984). Un ejemplo es el reemplazo de una región Fe con la de un isotipo diferente. Los agentes de unión selectivos tales como anticuerpos producidos mediante esta técnica están dentro del alcance de la invención. En una modalidad preferida de la invención, los anticuerpos anti-IFNy son anticuerpos completamente humanos. Abarcados entonces por la invención están anticuerpos que se unen a polipéptidos IFNy y son codificados por secuencias de ácido nucleico que son variantes somáticas que ocurren naturalmente de una secuencia de ácido nucleico de inmunoglobulina de línea germinal humana, y fragmentos, variantes sintéticas, derivados y fusiones de la misma. Estos anticuerpos pueden ser producidos mediante cualquier método conocido en la técnica. Los métodos ejemplares incluyen la inmunización con un antígeno IFNy (cualquier polipéptido IFNy capaz de desarrollar una respuesta inmune, y conjugado opcionalmente a un vehículo) de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces de producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de la producción endógena de inmunoglobulina; véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci . , 90:2551-2555 (1993) ; Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Iwmunol., 7:33 (1993) . Como alternativa, los anticuerpos humanos pueden generarse a través del tamizado in vi tro de bibliotecas de anticuerpos de despliegue de fagos véase por ejemplo, Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991), incorporado en la presente a manera de referencia. Varias bibliotecas de despliegue de fagos que contienen anticuerpos han sido descritas y pueden prepararse fácilmente por un experto en la técnica. Las bibliotecas pueden contener una diversidad de secuencias de anticuerpos humanos, tales como fragmentos Fab, Fv y scFv, que pueden ser tamizadas contra un objetivo adecuado. El ejemplo 2 describe el tamizado de una biblioteca de fagos Fab contra IFNy para identificar las moléculas que se unen selectivamente a IFNy. Se apreciará que las bibliotecas de despliegue de fagos pueden comprender péptidos o proteínas que no sean anticuerpos que puedan ser tamizados para identificar agentes de unión selectivos de IFNy. Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un antígeno Id puede prepararse al inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) que la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal al cual un anti-Id se esté preparando. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización al producir un anticuerpo para estas determinantes idiotípicas (el anticuerpo anti-Id); véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No.. 4,699,880, la cual se incorpora completamente en la-presente a manera de referencia. El anticuerpo anti-Id puede usarse también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en otro animal, para producir un llamado anticuerpo anti-anti-Id. El anticuerpo anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al anticuerpo monoclonal original que indujo el anti-Id. De esta manera, al usar anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, también es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de especificidad idéntica. Producción de agentes de unión selectivos de IFNy Cuando el agente de unión selectivo de IFNy que será preparado es un agente de unión selectivo proteináceo, tal como un anticuerpo o un dominio de unión a antígeno, varios métodos biológicos o químicos para producir el agente están disponibles . Los métodos biológicos se prefieren para producir cantidades suficientes de un agente de unión selectivo para uso terapéutico. Las técnicas de ADN recombinante estándares son particularmente útiles para la producción de anticuerpos y dominios de unión a antígeno de la invención. Los vectores de expresión, células hospederas y métodos ejemplares para la recuperación del producto expresado se describen abajo. Una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo IFNy o dominio de unión a antígeno es insertada en un vector de expresión adecuado usando técnicas de ligación estándares. El vector se selecciona típicamente para ser funcional en la célula hospedera particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula hospedera de tal manera que la amplificación del gen y/o la expresión del gen pueda ocurrir) . Una molécula de ácido nucleico que codifique para un anticuerpo anti-IFNy puede ser amplificada/expresada en células procari ticas , de levadura, de insecto (sistemas de baculoviris) y/o eucariótica. La selección de la célula hospedera dependerá en parte de si un anticuerpo anti-IFNy va a ser modificado después de la transición (por ejemplo, glicosilado y/o fosforilado) . Sí así es, se prefieren células de levadura, insecto o mamífero. Para una revisión de vectores de expresión, véase Meth. Enz . V. 185, D.V. Goeddel, ed. Academic Press Inc., San Diego, CA (1990) . Típicamente, los vectores de expresión usados en cualquiera de las células hospederas contendrán uno o más de los siguientes componentes: un promotor, una o más secuencias potenciadoras , un origen de replicación, una secuencia de terminación de transcripción, una secuencia de intrones completa que contiene un sitio de empalme donador y aceptor, una secuencia líder para secreción, un sitio de unión a ribosomas, una secuencia de poliadenilación, una región polienlazadora para insertar el ácido nucleico que codifique para el polipéptido que será expresado y un elemento marcador selecciónatele . Cada una de estas secuencias se describe en mayor detalle abajo. Los componentes del vector pueden ser homólogos (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula hospedera) , heterólogos (es decir, de una especie que no sea la de la especie o cepa de la célula hospedera) , híbridos (es decir, una combinación de secuencias diferentes de más de una fuente) , sintéticas o secuencias nativas que normalmente funcionen para regular la expresión de inmunoglobulina. De esta manera, una fuente de componentes de vectores puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre y cuando los componentes sean funcionales en, y puedan ser activados por, la maquinaria de la célula hospedera. Un origen de replicación se selecciona con base en el tipo de célula hospedera que se esté usando para la expresión. Por ejemplo, el origen de replicación del plásmido pbr322 (no. de producto 303-3a, New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas mientras que varios orígenes de SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) o virus de papiloma (tales como HPV o BPV) son útiles para clonar vectores en células de mamífero. Generalmente, el componente del origen de replicación no se requiere para los vectores de expresión de mamífero (por ejemplo, el origen SV40 se usa comúnmente sólo porque contiene el promotor temprano) . Una secuencia de terminación de transcripción se localiza típicamente 3' del extremo de regiones de codificación de polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Normalmente, una secuencia de terminación de transcripción en células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia poli-T. Aunque la secuencia se clona fácilmente de una biblioteca o incluso se compra comercialmente como parte de un vector, también puede ser sintetizada fácilmente usando métodos para síntesis de ácido nucleico tales como aquellos descritos arriba.
Un elemento génico de marcador seleccionable codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y crecimiento de una célula hospedera cultivada en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican para proteínas que: a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina a células hospederas procarióticas, b) complementan deficiencias auxotróficas de la célula o c) suministran nutrientes críticos no disponibles de medios complejos. Los marcadores seleccionables que se prefieren son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. Un gen de resistencia a neomicina también puede usarse para la selección en células hospederas procarióticas y eucarioticas. Otros genes de selección se pueden usar para amplificar el gen que será expresado. La amplificación es el proceso en el que los genes que están en mayor demanda para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son reiterados en t ndem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para células de mamífero incluyen dihidrofolato reductasa (DHFR) y timidina cinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo presión de selección a la cual sólo los transformantes son únicamente adaptados para sobrevivir en virtud del marcador presente en el vector. Presión de selección se impone al cultivar las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración de agente de selección en el medio sea cambiada sucesivamente, llevando de esta manera a la amplificación tanto del gen de selección como del ADN que codifique para el anticuerpo anti-IFNy. Como resultado, cantidades incrementadas de un anticuerpo se sintetizan del ADN amplificado. Un sitio de unión a ribosomas se necesita normalmente para el inicio de la transducción de ARNm y se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariontes) o una secuencia Kozak (eucariontes) . El elemento se localiza típicamente 3' al promotor y 5' a la secuencia de codificación del polipéptido que será expresado. La secuencia Shine-Dalgarno es variada pero es típicamente una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido de A-G) . Se han identificado muchas secuencias Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede sintetizarse fácilmente usando métodos descritos arriba y usados en vectores procarionticos . Una secuencia líder o de señal se usa para dirigir la secreción de un polipéptido. Una secuencia de señal puede colocarse dentro o directamente en el extremo 5' de una región de codificación de polipéptidos . Muchas secuencias de señal han sido identificadas y se pueden seleccionar con base en la célula hospedera usada para expresión. En la presente invención, una secuencia de señal puede ser homologa (que ocurra naturalmente) o heteróloga a una secuencia de ácido nucleico que codifique para un anticuerpo anti-???? o dominio de unión a antígeno. Una secuencia de señal heteróloga seleccionada debe ser una que sea reconocida y procesada, es decir, cortada, por una peptidasa de señal, por la célula hospedera. Para células hospederas procarióticas que no reconocen y procesan una secuencia de señal de inmunoglobulina nativa, la secuencia de señal es sustituida por una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa o líderes de enterotoxina II estables en calor. Para la secreción en levadura, una secuencia de señal de inmunoglobulina nativa puede sustituir la invertasa de levadura, factor alfa o líderes de fosfatasa ácida. En la expresión de células de mamífero la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias de señal de mamífero. En la mayoría de los casos, la secreción de un anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antígeno de una célula hospedera dará como resultado la remoción del péptido de señal del anticuerpo. De esta manera, el anticuerpo maduro carecerá de cualquier secuencia líder o de señal. En algunos casos, tales como cuando la glicosilación se desea en un sistema de expresión de células hospederas eucarióticas, se pueden manipular las diferentes presecuencias para mejorar la glicosilación o rendimiento. Por ejemplo, se puede alterar el sitio de corte de peptidasa de un péptido de señal particular, o añadir prosecuencias, las cuales también pueden afectar la glicosilacion. El producto de proteina final puede tener, en la posición -1 (en relación con el primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácido adicionales incidentes para la expresión, los cuales pueden no haber sido removidos totalmente. Por ejemplo, el producto de proteína final puede tener uno o dos aminoácidos encontrados en el sitio de corte de peptidasa, unido al término N. Como alternativa, el uso de algunos sitios de corte de enzima puede dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipéptido IFNy deseado, si la enzima corta en un área tal dentro del polipéptido maduro. Los vectores de expresión de la presente invención contendrán típicamente un promotor que sea reconocido por el organismo hospedero y ligado operablemente a una molécula de ácido nucleico que codifique para un anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antígeno. Un promotor ya sea nativo o heterólogo se puede usar dependiendo de la célula hospedera usada para la expresión y de la producción de proteína deseada . Los promotores adecuados para usarse con huéspedes procariónticos incluyen los sistemas promotores de beta-lactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Sus secuencias han sido publicadas, de esta manera haciendo posible que un experto en la técnica los ligue a las secuencias de ADN deseadas, usando enlazadores o adaptadores según se requiera para suministrar cualquier sitio de restricción requerido. Los promotores adecuados para usarse con huéspedes de levadura también se conocen bien en la técnica. Los potenciadores de levadura son adecuadamente usados con promotores de levadura. Los promotores adecuados para usarse con células hospederas de mamífero se conocen bien e incluyen aquellos obtenidos de los genomas de virus tales como virus de polioma, virus de viruela de las aves, adenovirus (tal como adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviario, citomegaloviurs , un retrovirus, virus de hepatitis B y muy preferiblemente virus simiano 40 (SV40) . Otros promotores de mamífero adecuados incluyen los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, promotores de choque térmico y el promotor de actina. Los promotores adicionales que pueden usarse para expresar los agentes de unión selectivos de la invención incluyen, pero no- están limitados a: la región promotora temprana de SV40; Bernoist and Chambón, Nature, 290:304-310 (1981) , el promotor CMV, el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous; Yamamoto, et al., Cell, 22:787-797 (1980), el promotor de timidina cinasa de herpes; Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 78:144-1445 (1981), las secuencias reguladoras del gen de metalotionina; Brinster et al., Nature, 296:39-42 (1982) ; vectores de expresión procarióticos tal como el promotor de beta-lactamasa; Villa-Kamaroff , et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 75:3727-3731 (1978), o el promotor tac; DeBoer, et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 80:21-25 (1983). También son de interés las siguientes regiones de control de transcripción de animales, las cuales exhiben especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos : la región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas; Swift et al., Cell, 38: 639-646, (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology, 7:425-415 (1987), la región de control de gen de insulina que es activa en células beta pancreáticas; Hanahan, ífature, 315:115-122 (1985), la región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides; Grosschedl et al., Cell, 38: 647-658, (1984); Adames et al., Nature, 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444 (1987); la región de control de virus de tumor mamario de ratón que es activa en células testiculares, de mama, linfoides y cebadas; Leder et al., Cell, 45: 485-495, (1986) , la región de control de gen de albúmina que es activa en el hígado; Pinkert et al., Genes and Devel . , 1:268-276 (1987) , la región de control de gen de alfafetoproteina que es activa en el hígado; Krumlauf et al., Mol. Cell . Biol . , 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science, 235:53-58 (1987), la región de control del gen alfa-l-antitripsina que es activa en el hígado; Kelsey et al., Genes and Devel . , 1:161-171 (1987) ; la región de control del gen beta-globina que es activa en células mieloides; Mogram et al., Nature, 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell, 46: 89-94, (1986), la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activa en células oligodendrocíticas en el cerebro; Readhead et al., Cell, 48: 703-712, (1987), la región de control del gen de cadena-2 ligera de miosina que es activa en el músculo esquelético; Sani, Nature, 314:283-286 (1985) y la región de control de gen de hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotálamo; Masón et al., Science, 234:1372-1378 (1986) . Una secuencia potenciadora puede ser insertada en el vector para incrementar la transcripción en células hospederas eucarióticas . Varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamífero se conocen (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfa-feto-proteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usará un potenciador de un virus. El potenciador SV40, el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus, potenciador de polioma, y potenciadores de adenovirus son elementos poteneiadores ejemplares para la activación de promotores eucarióticos . Aunque un potenciador puede ser empalmado en el vector en la posición 5' 6 3' a la región de codificación de polipéptido, típicamente se localiza en un sitio 5' desde el promotor. Los vectores que se prefieren para llevar a la práctica esta invención son aquellos que son compatibles con células hospederas bacterianas, de insecto y de mamífero. Estos vectores incluyen, entre otros, pCRII, pCR3 y pcADN3.1 (Invitrogen Company, San Diego, CA) , pBSII (Stratagene Company, La Jolla, CA) , pET15 (Novagen, Madison, I) , pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) , pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA) , pETL (VlueBacII; Invitrogen Carlsbad, CA) , pDSR-alpha (Publicación de PCT No. WO90/14363) y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY) . Los vectores posibles adicionales incluyen, pero no están limitados a, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vectores debe ser compatible con la célula hospedera seleccionada. Estos vectores incluyen pero no están limitados a plásmidos tales como derivados de plásmido Bluescript'5 (un fagémido a base de ColEl de alto número de copias Stratagene Company, La Jolla, CA) , plásmidos de clonación de PCR diseñados para clonar productos de PCR amplificados por Taq (por ejemplo, el equipo TOPO™ TA Cloning, derivados de plásmido PCRl.l®, Invitrogen, Carlsbad, CA) y vectores de levadura, virus o de mamífero tales como el sistema de vectores de baculovirus (derivados de plásmidos pBacPak, Clontech, Palo Alto, CA) . Las moléculas recombinantes pueden ser introducidas en células hospederas mediante transformación, transíección, infección, electroporación u otras técnicas conocidas . Las células hospederas pueden ser células hospederas procarióticas (tales como E. Coli) o células hospederas eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto o una célula de vertebrado) . La célula hospedera, cuando se cultiva bajo condiciones adecuadas, expresa un anticuerpo o dominio de unión a antígeno de la invención que puede ser recogido subsecuentemente del medio de cultivo (si la célula hospedera lo secreta en el medio) o directamente de la célula hospedera que lo produzca (si no es secretado) . La selección de una célula hospedera adecuada dependerá de varios factores, tales como los niveles de expresión deseados, modificaciones de polipéptido que se deseen o sean necesarias para actividad, tales como glicosilación o fosforilación, y facilidad de doblez en una molécula biológicamente activa. Se conocen en la técnica un número de células hospederas adecuadas y muchas están disponibles de la colección americana de tipos de cultivos (ATCC) , Manassas, VA. Ejemplos incluyen células de mamífero, tales como células de ovario de hámster Chino (CHO) (ATCC No. CCL61) células CHO DHFR; Urlaub et al . , Proc. Nati . Acad. Sci . EUA, 97:4216-4220 (1980) ; células 293 o 293T de riñon embrionario humano (HEK) (ATCC No. CRL1573) o células 3T3 (ATCC No. CCL92) . La selección de células hospederas de mamífero adecuadas y de métodos para transformación, cultivo, amplificación, tamizado y producción y purificación de productos se conocen en la técnica. Otras líneas de células de mamífero adecuadas son las líneas de células de mono COS-1 (ATCC No. CRL1650) y COS-7 (ATCC No. CRL1651), y la línea de células CV-1 (ATCC No. CCL70) . Células hospederas de mamífero ejemplares adicionales incluyen líneas de células de primate y líneas de células de roedor, incluyendo líneas de células transformadas. Las células diploides normales, cepas de células derivadas de cultivo in vi tro de tejido primario, así como explantes primarios, también son adecuados.- Las células candidatas pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúe de manera dominante. Otras líneas de células de mamífero adecuadas incluyen pero no están limitadas a, células N2A de neuroblastoma de ratón, células HeLa, células L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones S iss, Balb-c o NIH, líneas de células de hámster BH o HaK, las cuales están disponibles de la colección americana de tipos de cultivos, Manassas, VA) . Cada una de estas líneas de células se conoce y está disponible para los expertos en la técnica de la expresión de proteínas . Símilármente útiles como células hospederas adecuadas para la presente invención son las células bacterianas. Por ejemplo, las diferentes cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (ATCC No. 33694) DH5a, DH10 y C1061 (ATCC No. 53338) se conocen bien como células hospederas en el campo de la biotecnología. Varias cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp . , otras Bacillus spp., Streptomyces spp. y similares se pueden emplear también en este método. Muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica también están disponibles como células hospederas para la expresión de los polipéptidos de la presente invención. Las células de levadura que se prefieren incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisae. Además, cuando se desee, los sistemas de células de insecto pueden utilizarse en los métodos de la presente invención. Estos sistemas se describen por ejemplo, en Kitts et al., Biotechniques, 14:810-817 (1993), Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4:554-572 (1993) y Lucklow et al., J. Virol., 67:4566-4579 (1993). Las células de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 ( (Invitrogen, Carlsbad, CA) . La transformación o transfección de una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antígeno en una célula hospedera seleccionada se puede lograr mediante métodos bien conocidos incluyendo métodos tales como el método de cloruro de calcio, electroporación, microinyección, lipofección o deae-dextrano . El método seleccionado será en parte una función del tipo de célula hospedera que se usará. Estos métodos y otros métodos adecuados se conocen bien por el artesano experto, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., antes citado. También se pueden usar animales transgénicos para expresar agentes de unión selectivos glicosilados, tales como anticuerpos y dominio de unión a antígeno. Por ejemplo, se puede usar un animal productor de leche transgénico (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener agentes de unión selectivos glicosilados en la leche del animal. Como alternativa, se pueden usar plantas para producir agentes de unión selectivos glicosilados . Las células hospederas que comprenden (es decir, transformadas o transfectadas) un vector de expresión que codifica para un agente de unión selectivo de IFNy pueden ser cultivadas usando medios estándares bien conocidos por los expertos en la técnica. El medio contendrá normalmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y supervivencia de las células . Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son, por ejemplo, caldo Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB) . Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden ser complementados con suero y/o factores de crecimiento según se requiera por la linea de células particular que sea cultivada. Un medio adecuado para cultivos de insecto es el medio de Grace complementado con levadurolato, hidrolisado de lactaalbúmina y/o suero de becerro fetal según sea necesario. Típicamente, un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de células transíectadas o transformadas se añade como un complemento al medio. El compuesto que se usará será regido por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual fue transformada la célula hospedera. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable sea resistencia a kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será kanamicina. Otros compuestos para crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina. La cantidad de un anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antígeno producido por una célula hospedera puede ser evaluada usando métodos estándares conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, sin limitación, análisis Western blot, electroforesis con gel de SDS-poliacrilamida, electroforesis con gel de no desnaturalización, separación por HPLC, inmunoprecipitación y/o ensayos de actividad. La purificación de un anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antígeno que haya sido secretado en medio de células se puede lograr en una variedad de técnicas que incluyen cromatografía de afinidad, inmunoafinidad o intercambio iónico, cromatografía de tamiz molecular, electroforesis en gel preparativo o enfoque isoeléctrico, cromatoenfoque y cromatografía de líquidos de alta presión. Por ejemplo, los anticuerpos que comprenden una región Fe pueden purificarse de manera conveniente mediante cromatografía de afinidad con proteína A, la cual se une selectivamente a la región Fe. Las formas modificadas de un anticuerpo o dominio de unión a antígeno pueden prepararse con marcadores de afinidad, tales como hexahistidina u otro péptido pequeño tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Have, CT) o myc (Invitrogen) ya sea en su termino carboxilo o amino, y purificarse mediante una columna de afinidad de una etapa. Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a níquel, de esta manera una columna de afinidad a níquel (tal como la columna de níquel Qiagen°) se puede usar para la purificación de agentes de unión selectivos marcados con polihistidina, véase, por ejemplo, Ausbel et al., eds . , Current Protocols in Molecular Biology, sección 10.11.8, John iley & Sons, Nueva York (1993) . En algunos casos, podría requerirse más de una etapa de purificación. Los agentes de unión selectivos de la invención que son expresados en células hospederas procarióticas pueden estar presentes en forma soluble ya sea en el espacio periplásmico o en el citoplasma, o en una forma insoluble como parte de cuerpos de inclusión intracelulares . Los agentes de unión selectivos pueden ser extraídos de la célula hospedera usando cualquier técnica estándar conocida por el técnico experto. Por ejemplo, las células hospederas pueden ser Usadas para liberar los contenidos del periplasma/citoplasma mediante prensa francesa, homogenización y/o sonificación seguida por centrifugación. Las formas solubles de anticuerpo anti-IFNy o dominio de unión a antigeno presente ya sea en el citoplasma o liberadas del espacio periplásmico pueden ser purificadas más usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, los fragmentos Fab son liberados del espacio periplásmico bacteriano mediante técnicas de choque osmótico. Si un anticuerpo o dominio de unión a antígeno ha formado cuerpos de inclusión, éstos pueden unirse comúnmente a las membranas celulares internas y/o externas y de esta manera se encontrarán principalmente en el material de pella después de la centrifugación. El material de pella puede tratarse a pHs extremos o con un agente caotrópico tal como detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o tris-carboxietilfosfina a pH ácido para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. El agente de unión selectivo puede ser analizado después usando electroforesis en gel, inmunoprecipitación o similares. Si se desea aislar un anticuerpo o dominio de unión a antígeno solubilizado, el aislamiento se puede lograr usando métodos estándares tales como aquellos descritos abajo y en Marston et al., Meth. Enz . , 182:264-275 (1990). En algunos casos, un anticuerpo o dominio de unión a antígeno podría no ser biológicamente activo después del aislamiento. Varios métodos para el "redoblez" o conversión del polipéptido en su estructura terciaria y generar enlaces de disulfuro, pueden usarse para reestablecer la actividad biológica. Estos métodos incluyen exponer el polipéptido solubilizado a un pH normalmente por arriba de 7 y en presencia de una concentración particular de un caotropo. La selección del caotropo es muy similar a las selecciones usadas para las solubilización de cuerpos de inclusión, pero normalmente el caotropo se usa a una concentración más baja y no necesariamente es el mismo que los caotropos usados para la solubilización. En la mayoría de los casos la solución de redoblez/oxidación también contendrá un agente reductor o el agente reductor más su forma oxidada en una relación específica para generar un potencial de óxido-reducción particular que permita que ocurra la clasificación de disulfuro en la formación de los puentes de cisterna de la proteína. Algunos de los pares de óxido-reducción usados comúnmente incluyen cisteína/cistamina, glutationa (GSH) /ditiobis GSH, cloruro cúprico, ditiotreitol (DTT) /ditiano DTT, 2-mercaptoetanol (bME) /ditio-b (ME) . En muchos casos, se puede usar 'un co-solvente o se puede requerir incrementar la eficiencia del redoblez y los reactivos más comunes usados para este propósito incluyen glicerol, polietilenglicol de varios pesos moleculares, arginina y similares. Los anticuerpos y dominios de unión a antígeno de la invención también pueden prepararse mediante métodos de síntesis química (tales como síntesis de péptidos en fase sólida) usando técnicas conocidas en la técnica tales como aquellas descritas por Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc, 85:2149 (1963); Houghten et al., Proc Nati Acad. Sci . E.U.A, 82:5132 (1985), y Stewart and Young (Solid phase peptide synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984)). Estos polipeptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el término amino. Los anticuerpos y dominios de unión a antígeno químicamente sintetizados pueden ser oxidados usando métodos descritos en estas referencias para formar puentes de disulfuro. Los anticuerpos preparados de esta manera conservarán por lo menos una actividad biológica asociada con un anticuerpo o dominio de unión a antígeno anti-opgbp producido en forma recombinante o nativo. Ensayos para agentes de unión selectivos de IFNy Los métodos de tamizado para identificar agentes de unión selectivos que parcial o completamente inhiben por lo menos una actividad biológica de IFNy se proporcionan por la invención. La inhibición de la actividad biológica de IFNy incluye, pero no está limitada a, inhibir la unión de IFNy a su receptor cognado, IFNy-R, inhibir la actividad anti-proliferativa de IFNy en células A549 in vi tro, e inhibir la activación de monocitos por IFNy in vitro e in vivo. Los agente de unión selectivos de la invención incluyen anticuerpos anti-IFNy, y fragmentos, variantes, derivados y fusiones del mismo, péptidos, compuestos peptidomiméticos o compuestos organomiméticos . Los métodos de tamizado para identificar agentes de unión selectivos que pueden inhibir parcial o completamente una actividad biológica de IFNy pueden incluir ensayos in vi tro o in vivo. Los ensayos in vitro incluyen aquellos que detectan la unión de IFNy a IFNy-R y pueden usarse para tamizar agentes de unión selectivos de IFNy para su capacidad para incrementar o reducir la velocidad o grado de unión de IFNy a IFNy-R. En un tipo de ensayo, un polipéptido IFNy, de preferencia una forma soluble de IFNy tal como un dominio extracelular, es inmovilizado en un soporte sólido (por ejemplo, esferas de agarosa o acrílico) y un polipéptido IFNy-R es añadido ya sea en presencia o ausencia de una agente de unión selectivo de IFNy. Se mide el grado de unión de IFNy y IFNy-R con o sin un agente de unión selectivo presente . La unión puede detectarse mediante por ej emplo marcado radioactivo, marcado fluorescente o reacción enzimática . Como alternativa, la reacción de unión puede llevarse a cabo usando un sistema detector de resonancia plasmónica de superficie tal como el sistema de ensayo BIAcore (Pharmacia, Piscataway, NJ) . Las reacciones de unión pueden llevarse a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante . Los ensayos in vitro tales como aquellos descritos arriba se pueden usar adecuadamente para tamizar números rápidamente grandes de agentes de unión selectivos para efectos de la unión de IFNy a IFNy-R. Los ensayos pueden ser automatizados para tamizar compuestos generados en bibliotecas de despliegue de fagos, de péptidos sintéticos y de síntesis química . Los agentes de unión selectivos que incrementan o reducen la unión de JFNy a IFNy-R también pueden ser tamizados en cultivo de células usando células y lineas de células que expresen cualquier polipéptido. Las células y líneas de células pueden obtenerse de cualquier mamífero, pero de preferencia serán de algún humano u otra fuente de primate, canino o roedores. Como un ejemplo, la unión de IFNy a células que expresan IFNy-R sobre la superficie es evaluada en presencia o ausencia de agentes de unión selectivos y el grado de unión puede determinarse mediante, por ejemplo, citometría de flujo usando un anticuerpo biotinilado a IFNy.
Los ensayos de actividad in vi tro también pueden usarse para identificar agentes de unión selectivos que inhiban la actividad de IFNy. Ejemplos de ensayos incluyen el ensayo de proliferación de células A549 y el ensayo de expresión THP-1 HLA-DR. Los ensayos in vivo también están disponibles para determinar si un agente de unión selectivo es capaz de retrasar el desarrollo de proteinuria y de incrementar el tiempo de supervivencia en el modelo de ratón NZB x NZW Fl . Para aplicaciones de diagnóstico en ciertas modalidades, los agentes de unión selectivos de IFNy, tales como anticuerpo y dominios de unión a antígeno de los mismos, típicamente serán marcados con una porción detectable. La porción detectable puede ser cualquiera que sea capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 1251 , un compuesto fluorescente o quimioluminiscente , tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamia o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa o peroxidasa de rábano; Bayer et al., Meth. Enz., 184:138-163 (1990). Los agentes de unión selectivos de la invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido, tal como radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, ensayos de emparedado directos e indirectos (ELISAs) y ensayos de inmunoprecipitación (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, p . 147-158 (CRC Press, 1987)) para detección y cuantificación de polipéptidos IFNy. Los anticuerpos se unirán a polipéptidos IFNy con una afinidad que sea adecuada para el método de ensayo que se esté empleando. Los agentes de unión selectivos de la invención también son útiles para la formación de imágenes in vivo, en donde por ejemplo un agente de unión selectivo marcado con una porción detectable se administra a un animal, de preferencia en el torrente sanguíneo, y la presencia y localización del anticuerpo marcado en el huésped se ensaya. El agente puede ser marcado con cualquier porción que sea detectable en un animal, ya sea mediante resonancia magnética nuclear, radiología u otros medios de detección conocidos en la técnica. La invención se refiere también a un kit que comprende también un agente de unión selectivo de IFNy, tal como un anticuerpo o dominio de unión a antígeno, y otros reactivos útiles para detectar niveles de IFNy en muestras biológicas. Estos reactivos pueden incluir una actividad secundaria, un marcador detectable, suero de bloqueo, muestras de control positivas y negativas y reactivos de detección. Usos terapéuticos de agentes de unión selectivos de IFNy Los agentes de unión selectivos de la invención pueden usarse como terapéuticos . Los agentes de unión selectivos terapéuticos pueden ser agonistas o antagonistas de IFNy y, en una modalidad, son anticuerpos antagonistas anti-IFNy que inhiben por lo menos una de las actividades biológicas de un polipéptido IFNy in vitro o in vivo. Por ejemplo, un antagonista de IFNy inhibirá la unión de IFNy a IFNy-R. Como alternativa, un antagonista de IFNy estimulará la proliferación de carcinoma pulmonar humano in vitro como se indica por ND50 medible (una concentración que da 50% de proliferación) en un ensayo de proliferación de células A549 tal como el descrito en el ejemplo 1. Los antagonistas de IFNy, tales como los anticuerpos antagonistas anti-IFNy y dominios de unión a antígeno, se pueden usar para prevenir o tratar enfermedades autoinmunes y condiciones inflamatorias que incluyen, pero no están limitadas a las siguientes: pancreatitis aguda; ALS; enfermedad de Alzheimer; caquexia/anorexia, incluyendo caquexia inducida por SIDA; asma y otras enfermedades pulmonares; aterosclerosis ; síndrome de fatiga crónica; enfermedades asociadas con Clostridium, incluyendo diarrea asociada con Clostridium; condiciones e indicaciones coronarias, incluyendo insuficiencia cardiaca congestiva, restenosis coronaria, infarto de miocardio, disfunciones miocárdicas (por ejemplo, relacionadas con sepsis) e injerto de derivación coronaria; cáncer, tal como mieloma múltiple y mielógeno (por ejemplo, AML y CML) y otras leucemias, así como metástasis tumoral ; fiebre; glomerulonef itis ; enfermedad de injerto contra huésped/rechazo de transplantes; choque hemorrágico; enfermedad ocular inflamatoria como la que puede estar asociada con, por ejemplo, transplante de córnea; isquemia, incluyendo isquemia cerebral (por ejemplo, lesión cerebral como resultado de trauma, epilepsia, hemorragia o embolia, cada uno de los cuales puede llevar a neurodegeneración) ; deterioro del aprendizaje; esclerosis múltiple; miopatías (por ejemplo, metabolismo de proteínas musculares, especialmente en sepsis) ; neurotoxicidad (por ejemplo, como la inducida por SIDA) ; osteoporosis ; dolor, incluyendo dolor relacionado con cáncer; enfermedad de Parkinson; enfermedad periodontal; neurotoxicidad; trabajo de parto; psoriasis; lesión por reperfusión; choque séptico; efectos secundarios de terapia con radiación; enfermedad de la articulación mandibular temporal; alteraciones del sueño; uveítis; o una condición inflamatoria que resulte de tensión, calambres, daño a cartílagos, trauma, cirugía ortopédica, infección u otros procesos de enfermedad; diabetes, incluyendo diabetes mellitus tipo I de inicio juvenil, diabetes mellitus y resistencia a insulina (por ejemplo, como la asociada con obesidad) ; endometriosis, endometritis y condiciones relacionadas; fibriomialgia o analgesia; hiperalgesia; enfermedades inflamatorias del intestino, incluyendo enfermedad de Crohn; enfermedades pulmonares (por ejemplo, síndrome de insuficiencia respiratoria del adulto y fibrosis pulmonar); enfermedades neuroinflamatorias ; enfermedades y condiciones oculares, incluyendo degeneración ocular y uveítis; pitiriasis rubra pilaris (PRP) ; prostatitis (bacteriana o no bacteriana) y condiciones relacionadas; psoriasis y condiciones relacionadas; fibrosis pulmonar; lesión de reperfusión; condiciones inflamatorias de una articulación y enfermedades reumáticas, incluyendo, osteoartritis , artritis reumatoide, artritis juvenil (reumatoide) , poliartritis cero negativa, espondilitis alquilosante, síndrome de Reiter y artritis reactiva, enfermedad de Still, artritis psoriásica, artritis enteropática; polimiositis, dermatomiositis , escleroderma, esclerosis sistémica, vasculitis (por ejemplo, enfermedad de Kawasaki) , vasculitis cerebral, enfermedad de Lyme, artritis inducida por estafilococos ("séptica"), síndrome de Sjogren, fiebre reumática, policondritis y polimialgia reumática y artritis de células gigantes; choque séptico; lupus eritematoso sistémico (LES) nefritis; efectos secundarios de terapia con radiación; enfermedad temporal de las articulaciones mandibulares; tiroiditis; transplante de tejidos o una condición inflamatoria que resulte de tensión, calambre, daño a cartílagos, trauma y cirugía ortopédica. Más específicamente, los antagonistas de IFNy, tales como anticuerpos antagonistas anti-IFNy y dominios de unión a antígeno, se pueden usar para prevenir o tratar artritis (particularmente artritis reumatoide) , lupus eritematoso sistémico (LES) , enfermedad de injerto contra huésped (GvHD) , esclerosis múltiple y diabetes. Los antagonistas de IFNy de la invención, incluyendo los anticuerpos antagonistas y dominios de unión a antígeno, se administran solos o en combinación con otros antagonistas de IFNy terapéuticos, tales como los anticuerpos y dominios de unión a antígeno antagonistas anti-IFNy, se pueden usar para prevenir o tratar varias condiciones inflamatorias, condiciones autoinmunes y otras condiciones que lleven a pérdida de hueso. Dependiendo de la condición y el nivel deseado de tratamiento, dos, tres o más reactivos y agentes pueden administrarse. Estos agentes pueden proporcionarse juntos mediante la inclusión en la misma formulación o inclusión en un equipo de tratamiento, o se pueden proporcionar por separado. Cuando se administran mediante terapia génica, los genes que codifican para los agentes de proteína pueden ser incluidos en el mismo vector, opcionalmente bajo el control de la misma región promotora, o en vectores separados . Las moléculas particularmente preferidas en las clases mencionadas anteriormente son las siguientes : • Inhibidores de IL-l: proteínas IL-lra y receptores de IL-1 solubles. El inhibidor de IL-1 más preferido es anakinra . • Inhibidores de FNT-a: receptor de factor de necrosis tumoral soluble tipo I (sTNF-RI; -RI también es llamado el receptor p55) ; receptor de factor de necrosis tumoral soluble tipo II (también llamado el receptor p75) y anticuerpos monoclonales que se unen al receptor de FNT. Se prefiere más el sTNF-RI como el descrito en WO 98/24463, etanercept (Enbrel°) y Avakine°. Se describen inhibidores de FNT-a ejemplares en EP 422 339, EP 308 378, EP 393 438, EP 398 327 y EP 418 014. • Inhibidores de serina proteasa: SLPI, ALP, MPI, HUSI-I, BMI y CUSI. Estos inhibidores también pueden verse como moduladores de LPS ejemplares, ya que SLPI ha mostrado inhibir las respuestas a LPS. Jin et al., (1997), Cell 88(3): 417-26 (incorporado a manera de referencia) . Composiciones farmacéuticas Las composiciones farmacéuticas de los agentes de unión selectivos de IFNy están dentro del alcance de la presente invención. Estas composiciones comprenden una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un agente de unión selectivo de IFNy tal como un anticuerpo o un fragmento, variante, derivado o fusión del mismo, mezclado con un agente farmacéuticamente aceptable . En una modalidad preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos antagonistas anti-IFNy que inhiben parcial o completamente al menos una actividad biológica de IFÑy mezclados con un agente farmacéuticamente aceptable. Típicamente, los anticuerpos serán purificados suficientemente para su administración a un animal. Los agentes farmacéuticamente aceptables para usarse en las composiciones de la invención incluyen vehículos, excipientes, diluyentes, antioxidantes, conservadores, colorantes, agentes colorantes, saborizantes y diluyentes, agentes emulsificantes , agentes de suspensión, solventes, rellenos, agentes de volumen, reguladores de pH, vehículos de suministro, agentés de tonicidad, co-solventes , agentes humectantes, agentes acomplej ntes , agentes reguladores de pH, antimicrobianos y agentes tensioactivos , como se conocen bien en la técnica. Una solución salina de pH regulado neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero son vehículos adecuados ejemplares. También se incluyen en las composiciones los antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas, tales como albúmina de suero,' gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sal tales como sodio; agentes tensioactivos no iónicos tales como Tween, plurónicos o polietilenglicol . También a manera de ejemplo, los agentes de incremento de tonicidad adecuados incluyen halogenuros de metal alcalino (de preferencia cloruro de sodio o potasio) , manitol, sorbitol y similares. Los conservadores adecuados incluyen, pero no están limitados a, cloruro de benzalconio, timerosal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico y similares. También se puede usar como conservador peróxido de hidrógeno. Los co-solventes adecuados son por ejemplo glicerina, propilenglicol y polietilenglicol. Los agentes acomplej antes adecuados son por ejemplo, cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxi-propil-beta-ciclodextrina . Los agentes tensioactivos o agentes humectantes adecuados incluyen esteres de sorbitan, polisorbatos tales como polisorbato 80, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal y similares. Los reguladores de pH pueden ser reguladores de pH convencionales tales como acetato, borato, citrato, fosfato, bicarbonato o tris-HCl. El regulador de pH de acetato puede tener un pH de alrededor de 4.0-5.5 y el regulador de pH de Tris puede estar en el alrededor de 7.0-8.5. Los agentes farmacéuticos adicionales se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, Edición 18, A.R. Gennaro, ed. , Mack Publishing Company 1990, las porciones relevantes de la cual están incorporadas en la presente a manera de referencia. Las composiciones pueden estar en forma líquida o en una forma liofilizada o secada por congelación. Las formas lipofilizadas pueden incluir excipientes tales como sacarosa. Las composiciones de la invención son adecuadas para administración parenteral . En modalidades preferidas, las composiciones son adecuadas para inyección o infusión en un animal mediante cualquier ruta disponible para el trabajador capacitado, tales como rutas subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal , intracerebral (intraparenquimal) , intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial o intralesional . Una formulación parenteral será típicamente una solución acuosa isotónica estéril y libre de pirógenos, que contenga opcionalmente conservadores farmacéuticamente aceptable. La formulación farmacéutica óptima puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica dependiendo de la ruta de administración deseada, del formato de suministro y la dosis deseada. También se contemplan otras formulaciones por la invención. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o la introducción de un agente de unión selectivo de IFNy (tal como un anticuerpo) en liposomas. Puede usarse también ácido hialurónico, y éste puede tener el efecto de promover la duración prolongada en la circulación. Las composiciones farmacéuticas también incluyen la formulación de agentes de unión selectivos de iFNy (tales como anticuerpos) con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas o esferas bioerosionables o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o prolongada de un agente de unión selectivo que después puede ser suministrado como una inyección de depósito. Otros medios adecuados para el suministro incluyen dispositivos de suministro implantables , Una composición farmacéutica que comprende un agente de unión selectivo de IFNy (tal como un anticuerpo) se puede formular como un polvo seco para inhalación. Estas soluciones de inhalación también se pueden formular en un propelente licuado para suministro de aerosol. En otra formulación más, las soluciones pueden ser nebulizadas. Se contempla también que ciertas formulaciones que contienen agentes de unión selectivos de IFNy pueden administrarse oralmente. Las formulaciones administradas de esta manera se pueden formular con o sin los vehículos usados comúnmente en la mezcla de formas de dosis sólidas tales como tabletas y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula puede diseñarse para liberar la porción activa de la formulación en el punto en el tracto gastrointestinal en el que la biodisponibilidad se maximice y se reduzca al mínimo la degradación pre-sistémica. Los agentes adicionales pueden incluirse para facilitar la absorción de un agente de unión selectivo. Diluyentes, saborizantes , ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes desintegradores de tabletas y aglutinantes también pueden emplearse. Otra preparación puede incluir una cantidad efectiva de un agente de unión selectivo de IFNy en una mezcla con excipientes no tóxicos que sean adecuados para la fabricación de tabletas. Al disolver las tabletas en agua estéril, u otro vehículo adecuado, se pueden preparar soluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no están limitados a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato o bicarbonato de sodio, lactosa o fosfato de calcio; o agentes aglutinantes, tales como fécula, gelatina o acacia; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las formulaciones adicionales serán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que incluyen agentes de unión selectivos de IFNy en combinación con uno o más agentes terapéuticos. Las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro prolongado o controlado, tales como vehículos de liposomas, micropartículas bioerosionables o esferas porosas e inyecciones de depósito, se conocen bien por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, la descripción de Supersaxo et al. de micropartículas poliméricas porosas de liberación controlada para el suministro de composiciones farmacéuticas (véase WO 93/15722 (PCT/US/93/00829) cuya descripción se incorpora en la presente a manera de referencia . No obstante la forma de administración, la dosis específica puede calcularse de acuerdo con el peso corporal, área de superficie corporal o tamaño de los órganos. Una refinación adicional de los cálculos necesarios para determinar la dosis adecuada para el tratamiento que incluye cada una de las formulaciones mencionadas arriba se hace rutinariamente por los expertos en la técnica y está dentro del ámbito de tareas llevadas a cabo rutinariamente por ellos. Las dosis adecuadas pueden ser establecidas a través del uso de datos de respuesta a dosis adecuados . Se puede administrar además las presentes composiciones farmacéuticas mediante administración pulmonar, véase, por ejemplo, PCT WO94/20069, la cual describe el suministro pulmonar de proteínas químicamente modificadas, incorporada en la presente a manera de referencia. Para el suministro pulmonar, el tamaño de partícula debe ser adecuado para el suministro al pulmón distal . Por ejemplo, el tamaño de partícula puede ser de 1 µt? a 5 µp?, sin embargo, pueden usarse partículas más grandes, por ejemplo, si cada partícula es muy porosa . Como alternativa o además, las composiciones se pueden administrar localmente por medio de implantación en el área afectada de una membrana, esponja u otro material adecuado sobre el cual un agente de unión selectivo de IFNy haya sido absorbido o encapsulado. Cuando se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo puede ser implantado en un tejido u órgano adecuado, y el suministro de un agente de unión selectivo de IFNy puede ser directamente a través del dispositivo mediante administración en bolo o administración continua, o por medio de un catéter usando infusión continua. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en una formulación o preparación de liberación prolongada. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos configurados, por ejemplo, películas o microcápsulas . Las matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles, polilacturos (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 3,773,919, EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 157-227 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982), acetato de etilenvinilo o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico . Las composiciones de liberación prolongada también pueden incluir liposomas, los cuales pueden prepararse mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 82: 3S88-3692 (1985); EP 36,676; EP 88,046; y EP 143,949. Puede ser deseable en algunos casos usar una composición farmacéutica que comprenda un agente de unión selectivo de IFNy en una manera ex vivo. Aquí, células, tejidos u órganos que han sido removidos del paciente son expuestos a composiciones farmacéuticas que comprenden agentes de unión selectivos de IFNy después de lo cual las células, tejidos y/u órganos son implantados posteriormente de nuevo al paciente . En otros casos, una composición que comprende un agente de unión selectivo de IFNy puede suministrarse a través del implante en pacientes de ciertas células que hayan sido genéticamente manipuladas, usando métodos tales como aquellos descritos en la presente, para expresar y secretar los polipéptidos, agentes de unión selectivos, fragmentos, variantes o derivados. Estas células pueden ser células animales o humanas , y se pueden derivar del propio te ido del paciente o de otra fuente, ya sea humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. Sin embargo, para reducir la probabilidad de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células sean encapsuladas para evitar la infiltración de tejidos circundantes . Los materiales de encapsulación son típicamente cierres o membranas poliméricos semipermeables y biocompatibles que permiten la liberación del producto de proteína pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmunológico del paciente o por otros factores dañinos de los tejidos circundantes . Los métodos usados para la encapsulación en membranas de células son familiares para el experto en la técnica, y la preparación de células encapsuladas y su implantación en pacientes puede lograrse sin experimentación inadecuada. Véanse, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,892,538, 5011,472 y 5,106,627. Un sistema para encapsular células vivas se describe en PCT WO 91/10425 (Aebischer et al.). Las técnicas para formular una variedad de otros medios de suministro prolongados o controlados, tales como vehículos de liposomas, partículas o esferas bioerosionables, también se conocen por los expertos en la técnica y se déscriben. Las células, con o sin encapsulación, pueden ser implantadas en tejidos u órganos corporales adecuados del paciente. Una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de una composición farmacéutica que comprende un agente de unión selectivo de IFNy (tal como un anticuerpo anti-IFNy, o fragmento, variante, derivado y fusión del mismo) dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la cual se esté usando la composición, la ruta de administración y la condición del sujeto. Anticuerpos antagonistas de IFNy o dominios de unión a antígeno de la invención se administran en una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva para evitar y/o tratar una condición autoinmune y/o inflamatoria. Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar más completamente la invención pero no se consideran limitativos del alcance de la misma. Ejemplo 1 Reactivos y ensayos Los objetivos de tamizado usados en estos estudios fueron hlFNy preparados de: 1) expresión de un ADNc que codifica para hlFNy en E. coli como se describe en EP 0423845, o publicación de PCT O 83/04053; o 2) expresión de un ADNc que codifica para hlFNy en una célula hospedera CHO como sigue: se usó PCR (condiciones normales) para amplificar la secuencia de longitud completa que codifica para el IFNy humano usando ADNc listo maratón de bazo humano (Clontech) como una plantilla. La secuencia fue subclonada en un plásmido de expresión y el ADN se transformó en células DH10B (Gibco Life Sciences) , el ADN se preparó y se transfectó en células CHO mediante el método de fosfato de calcio (Speciality Media, Inc.) . Se usó un clon de linea de células de alta expresión para generar medio acondicionado libre de suero.
El medio acondicionado de células CHO que contenía hlFNy fue concentrado, dializado y después purificado a través de varias etapas de cromatografía. La primera etapa fue cromatografía Q-HP (Pharmacia) usando una gradiente de NaCl estándar para separar las formas de hlFNy altamente glicosiladas contra las no glicosiladas . El grupo Q-HP se purificó más a través de una cromatografía de aglutinina de germen de trigo (EY Laboratories) . El material purificado fue más de 95% puro juzgado tanto por tinción con azul de Coomassie como SDS-PAGE teñida con plata. El material tuvo un bajo nivel de endotoxinas ensayado por el método gel-clot (Limulus Amebocyte Lysate) . La identidad de hlFNy se confirmó mediante Western blot, usando anticuerpo neutralizador anti-hlFNy de cabra de R & D Systems (número de catálogo AF-285-NA, número de lote ZW019011) . La concentración de proteínas final se determinó usando el método de coeficiente de extinción (0.66). Se generaron dos lotes de material respectivamente. El rendimiento fue de 40 mg/1. Los materiales finales se formularon en PBS . Expresión de proteína IFNyRl-Fc humana en células CHO · La proteína IFNyRl-Fc humana usada para la elución de anticuerpos de fago a partir del objetivo en estos estudios se preparó como sigue: se usó PCR (condiciones normales) para amplificar la secuencia de longitud completa que codifica para el IFNyRl humano usando ADNc listo maratón linfoide humano (comprado Clontech) como una plantilla. Se usó PCR (condiciones normales) para amplificar la secuencia que codificaba para la porción Fe de IgGl humana. Se usó PCR de traslape para generar una secuencia que codificaba para la construcción de fusión IFNyRl-Fc (aminoácidos l-Ser2 S del IFNyRl) y la secuencia fue subclonada en un plásmido de expresión. El ADN se transformó en células DH10B (Gibco Life Sciences) , se preparó el ADN y se transfectó en células CHO mediante el método de fosfato de calcio (Speciality Media, Inc.) . Se usó un clon de linea de células de alta expresión para generar el medio acondicionado libre de suero. El medio acondicionado de células CHO que contenía hIFNyRl-Fc fue concentrado y purificado a través de una columna Fast-Flow de Proteína-G estándar (Pharmacia) . La concentración final se determinó mediante A28o usando 1.44 como el coeficiente de extinción. La identidad de la muestra purificada se confirmó a través del análisis de secuencia N-terminal . El material se formuló en PBS . Anticuerpos Anticuerpo anti-hIFNy monoclonal, clon 2578.111, se compró de R & D Systems (número de catálogo ???285, número de lote 07) . El anticuerpo anti-hIFNy monoclonal, clon MMHG-1, se compró de Biosource (número de catálogo AHC4834, número de lote 10803-015) . El receptor 1 de IFNy humano recombinante (rhIFNy Rl) se compró de R & D Systems (número de catálogo 673-IR) . El peso molecular calculado del rhIFNy Rl es de 25,000 daltons . Como resultado de la glicosilación, la proteína recombinante migra como una proteína de 40-50 kDa en SDS-PAGE. Ensayo de proliferación de células A549 El ensayo de proliferación de células A549 usado para evaluar la neutralización de anticuerpos de IFNy es un ensayo de 96 pozos y se describe generalmente como sigue: en el día 1, 1) diluir anticuerpo en serie 1:2 a partir de la concentración más alta en medio de ensayo (F12K,5% FBS, Ix Pen/strep L-Glutamina) . Hacer un total de 10 diluciones a 4X la concentración deseada en el ensayo. Para duplicados, al menos 200 µ? finales se requieren para cada dilución; 2) diluir IFNy a concentración adecuada para pico, con base en 90% de la dosis efectiva en una curva de respuesta a dosis. Hacer el pico de ???? 4X la concentración deseada en el ensayo; 3) combinar 150 µ? de cada dilución 4xAb con 150 µ? del pico de IFNy 4X en tubos titertek. Mezclar por pipeteo. Cubrir y encubar una hora a temperatura ambiente. (Nota: la concentración de Ab e IFNy ahora a una concentración de ensayo de 2X) ; '4) (opcional) mientras Ab y IFNy se incuban, diluir IFNy para curva de titulación. Hacer 12 diluciones 1:3 iniciando a partir de 4000 ng/ml. Ya que se requieren 300 µ? para los triplicados en el ensayo, el volumen necesario al final de la dilución debe ser de al menos 400 µ? . Almacenar a 4°C hasta que se necesite; 5) antes de que se complete la incubación, tripsinizar las células A54 en 5 mi de tripsina. Añadir 20 mi de medio de ensayo al matraz y transferir a un cono de 50 mi y centrifugar a ½ a ¾ la velocidad en IEC, RT; 6) aspirar las células. esuspender en 7.5 mi de medio de ensayo. Contar 1:1 en azul tripano; 7) diluir células en medio de ensayo a 2.5 X 104 células/ml. Sembrar 0.1 mi en tubos falcón de 96 pozos para cada muestra para 2.5 X 104 células/pozo; 8) en una hora, añadir mezcla de 100 µ? Ab/IFNy a cada uno de los dos pozos para duplicados; y 9) incubar durante 5 días a 37°C, 5% de CO y alta humedad. En el día 5: 1) añadir 20 µ? de azul Alamar por pozo. Incubar durante 3-4 horas a 37°C, 5% de CO y alta humedad; 2) encender un lector de placa fluorescente FL500, remover las tapas de las placas y agitar durante 10 min, sin tapa; y 3) leer en el FL500. Ajustes: agitar 3 segundos a excitación media a 530/25, emisión a 590/35, sensibilidad de 34. Ej emplo 2 Tamizado de una biblioteca de Fab humanos Procedimiento de tamizado Los procedimientos generales para la construcción y tamizado de bibliotecas de Fab humanos se describen en Haard et al., (Advanced Drug Delivery Reviews, 31:5-31 (1998); J. Biol. Chem. , 274:18218-18230 (1999)). La biblioteca fue tamizada para fragmentos Fab que se unen a hlFNy mediante los siguientes procedimientos. Un inmunotubo Wunc fue recubierto con 4 mi de hlFNy a 0.39 µg/ml en carbonato de sodio 0.1 M, pH 9.6 a temperatura ambiente en un aparato Nutator durante 2 horas. Después de descongelar, se removió glicerol (15%) de una alícuota de solución de abastecimiento de fagos congelada Target Quest, NV (Amsterdam, Países Bajos) (4X 1012 pfu en 750 µ? por tubo) al añadir 1/5 volúmenes de (150 µ?) de solución de PEG (20% de polietilenglicol 8000, NaCl 2.5 M, se sometió a autoclave) y dejando el tubo en hielo durante una hora para precipitar el fago. Las partículas de fago precipitadas fueron peletizadas a 4000 rpm durante 15 minutos a 4°C, después resuspendidas en 500 µ? de PBS, pH 7.4. El inmunotubo recubierto con IFNy fue lavado 3 veces con 4 mi de PBS y bloqueado con 4 mi de MPBS al 2% temperatura ambiente durante una hora en un aparato Nutator. Al mismo tiempo, se añadieron 500 µ? de MPBS al 4% a la suspensión de fagos y se incubaron durante 30 min-una hora a temperatura ambiente para permitir el prebloqueo de las partículas de fago . El inmunotubo bloqueado se lavó con 2X de PBST (0.1% de Tween20 en PBS) y 2x con PBS. La mezcla de fagos prebloqueada fue añadida al inmunotubo lavado que contenía 3 mi de MPBS al 2%. Después de 30 minutos de incubación en un rotador seguidos por 1.5 horas de incubación en reposo a temperatura ambiente, se descartó la mezcla de fagos. El tubo se lavó primero 20x con PBST, después 20x con PBS . Las partículas de fago unidas fueron eluídas mediante incubación con 1 mi de reactivo de elución específico (hlFNy, GPNA, RDMA, BSMA o rhlFNy Rl, respectivamente) a 1 µ? en MPBS al 4%, pH 7.4 durante 90 min. en un rotador. Las partículas de fago eluídas fueron transferidas a tubos de polipropileno cónicos de 50 mi estériles y se almacenaron en hielo. Aproximadamente 20 µ? de cada elución de fago fue apartada para la titulación. Para la amplificación, las partículas de fago eluídas restantes fueron añadidas a un tubo cónico de 50 mi que contenía 5 mi de cultivo TG1 (OD590 de alrededor de 0.5) y 4 mi de 2x YT. La mezcla IFNection se incubó a 37°C sin agitación durante 30 minutos, después se centrifugó a 3500 rpm durante 20 min. La pella de células se suspendió en 1500 µ? de caldo 2xYT-AG y se colocó sobre cinco placas SOBCG a 300 µ?/placa. Las placas fueron incubadas a 30°C durante la noche. Después de 20 horas de incubación, las células fueron recubiertas con raspador de células de las placas, al cual 4 mi por placa de 2x YT-AG fueron añadidos . La etapa se repitió tres veces . Una porción pequeña de las células recuperadas se usó para el rescate de fagos (véase abajo) . La suspensión de células restantes se centrifugó a 3500 rpm durante 20 minutos. La pella de células se suspendió en un volumen medio del tamaño de pella de 50% de glicerol para hacer grupos de glicerol y se almacenó a -80°C.
El rescate de -fagos a partir de una suspensión de células amplificada se llevó a cabo como sigue. Aproximadamente 0.5 mi de suspensión de células amplificadas y plaqueadas recuperadas se usó para inocular 50 mi de 2x YT-AG a OD5go de aproximadamente 0.3. El cultivo se incubó a 37°C en un agitador a ??590 de 0.5. Diez mi del cultivo fueron IFNectados con 1 mi de fago auxiliar M13K07 (GIBCO BRL, número de catálogo 18311-019, 1.1 x 1011 pfu/ml) a M. 0. I. de 20 y se incubó en el incubador a 37°C durante 30 min. Las células IFNectadas fueron centrifugadas a 4000 rpm durante 20 min. La pella de células fue resuspendida en 50 mi de 2xYT-AK, transferida a un matraz de 250 mi e incubada a 30°C con agitación a 270 rpm durante 20 horas. El cultivo nocturno se centrifugó a 4000 rmp durante 20 min. para remover los restos celulares. El sobrenadante se centrifugó de nuevo para asegurar la remoción del resto celular. Aproximadamente un volumen de 1/5 de solución de PEG (20 % de PEG 8000, 2.5 de NaCl) se añadieron al sobrenadante para precipitar las partículas de fago. La mezcla se incubó sobre hielo durante al menos una hora, luego se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para recoger las partículas de fago precipitadas. La pella de fagos fue resuspendida en 1 mi de PBS y transferida a un tubo microcentrífugo . La suspensión de fagos se dejó sobre hielo durante una hora para permitir que la suspensión completa de partículas de fagos se moviera, luego se centrifugó a 14, 000 rpm durante 2 min. para remover los restos celulares residuales. La etapa de precipitación de fagos se repitió. La pella de fagos final se suspendió en 1.1 mi de PBS y se dejó sobre hielo durante un periodo extendido para asegurar la suspensión completa de las partículas de fago. La suspensión de fagos fue centrifugada a 14,000 rpm durante 2 min. para remover restos celulares residuales. 500 µ? de suspensión de fagos rescatada se usaron para hacer una solución de abastecimiento de glicerol por la adición de 250 µ? de glicerol al 50%. 100 µ? de la suspensión de fagos rescatada se reservaron para una ELISA de fondo de fagos (véase abajo) . Los 500 µ? restantes del fago rescatado se usaron para la siguiente ronda de paneo. ELISA de fondo de fagos Se llevó a cabo ELISA de fondo de fagos como sigue: hlFNy expresado en E. coli fue colocado en placas, 100 µ?/????, a 0.39 µg/ml en carbonato de sodio 0.1 M, pH 9.6 en una inmunoplaca axiSorb Nunc a temperatura ambiente con agitación suave durante dos horas . La placa recubierta se lavó tres veces con PBS, después se bloqueó con 300 µ?/???? de MPBS al 2% a temperatura ambiente en el agitador durante una hora. Para el control negativo, otra inmunoplaca Nunc que no había sido recubierta con el antígeno también se bloqueó con MPBS al 2%. Mientras tanto, 120 µ? de cada fondo de fagos rescatado fueron bloqueados con 120 µ? de MTBS al 0.8% en una placa de 96 pozos Costar 3790 y se dejaron a temperatura ambiente hasta que estuvieran listos para usarse. Ambas placas bloqueadas fueron lavadas 5 veces con TBST al 0.1% (TBS 10 mM de Tris-HC1, pH 7.5, 1 mM de EDTA, 150 mM de NaCl ; Tween-20 al 0.1%). La dilución de fagos prebloqueda se distribuyó (100 µ?/????) tanto a la placa recubierta con antígenos como a la placa de control negativa, y se incubaron a temperatura ambienten el agitador durante una hora. Después de que las placas se lavaron como se describió, 100 µ?/???? de conjugado monoclonal H P/anti-M13 diluido 1:1000 (Amersham Pharmacia Biotech, número de catálogo 27-9421-01) en 0.4% de MTBS se distribuyeron, y se incubaron a temperatura ambiente en el agitador durante una hora. Las placas se lavaron como se describió. Después de que se añadieron 100 µ?/???? del substrato 1-Step™ ABTS (Pierce, número de catálogo 37615) , las placas se incubaron durante una hora. La OD0s se midió para la detección de señal. Los fondos de fago positivos a ELISA se usaron como la fuente de clones individuales para análisis adicional . Ejemplo 3 Identificación de clones de fago de Fab que se unan a IFNy Visualizacion de fragmentos de ADN Se llevó a cabo la reacción en cadena de polimerasa (PCR) en una placa Thermowell de 96 pozos para identificar de esta manera los clones de longitud completa que contenían tanto cadena pesada como cadena ligera de los fondos de fagos positivos para ELISA. Típicamente, cada pozo contiene 25 µ? de mezcla de reacción de PCR (2.5 µ? de regulador de pH de PCR 10X, 21.625 µ? de agua, 0.25 µ? de dNTPs a 25 mM, 0.25 µ? de cebador 870-02 (mostrado abajo) a 10 pmol/µ?, 0.25 µ? de cebador 2182-83 (mostrado abajo) a 10 pmol/µ?, 0.125 µ? de polimerasa Taq a 5 unidades/µ?) . 870-02 5' - CCG ACT TTG CAC CTA GTT (SEQ ID NO: 109) 2182-83 5' - TTT GTC GTC TTT CCA GAC GTT AGT (SEQ ID NO: 110) Colonias individuales fueron recogidas y resuspendidas primero en un pozo en la placa de PCR, luego resuspendidas en el pozo correspondiente en un bloque de 96 pozos profundos llenado con 300 µ?/???? de caldo 2xYT-AG (caldo 2xYT-AG: 10 g de extracto de levadura, 16 g de bacto-triptona, 5 g de NaCl por litro de agua que contiene 100 µg/ml de ampicilina y 2% de glucosa) . Las condiciones de reacción de PCR fueron un ciclo de desnaturalización de 5 min. a 94°C, 40 ciclos de 45 sec . a 94°C, 45 sec . a 55°C, 1.5 min. a 72°C, seguido por un ciclo de extensión a 72 °C durante 10 min. Después de concluir la reacción de PCR, 3 µ?/???? de mezcla de reacción de PCR se corrieron en geles TAE 4x(24+2) extralargos al 1% que contenían 0.5 µ?/ml de bromuro de etidio (Embi Tec, número de catálogo GE-3820) a 120 voltios durante una hora. Mediante comparación con la escalerilla de ADN de 1 kb plus (Gibco BRL, número de catálogo 10787-018) , los clones con insertos mayores de 1.6 kb fueron identificados como clones de longitud completa. La identificación de clones de longitud completa únicos se llevó a cabo como sigue: la digestión con BstNI se llevó a cabo en insertos amplificados por PCR de los clones de longitud completa identificados. A 16 µ? de mezcla de reacción de PCR por muestra en una placa Thermo ell de 96 pozos, se añadieron 14 µ? de solución maestra de digestión con BstNI que contenía 3 µ? 10x de regulador de pH 2 (NEBL) , 0.3 µ? de BSA a 10 mg/ mi, 10 µ? de agua y 0.7 µ? de BstNI (NEBL). Las placas se incubaron a 60°C durante tres horas. Las muestras digeridas, de 13 µ? cada una, se corrieron en geles TAE 2x(24+2) extra largos al 4% que contenían 0.5 µ?/ml de bromuro de etidio (Embi Tec, número de catálogo GE-3817) a 100 voltios durante tres horas. Los clones únicos se identificaron con base en la diferencia en los patrones de fragmentos de BstNI. ELISA de fagos clónales Los fagos de Fab de clones de longitud completa únicos identificados fueron rescatados en el formato de 96-pozos. En un bloque de pozos profundos de 2 mi y 96 pozos, 480 µ?/???? de caldo 2xYTAG se inocularon con 20 µ? de cultivos nocturnos de los clones de longitud completa únicos seleccionados, y después se incubaron a 37°C, 300 rpm durante tres horas. A cada pozo se le añadieron 100 µ? de una dilución de fagos auxiliares M13K07 diluida 1:10 para IFNectar las células. El bloque se incubó a 37°C sin agitación durante 30 minutos, después se agitó cuidadosamente durante otros 30 minutos a 150 rpm. El bloque se centrifugó a 3600 rpm durante 20 min. para peletizar las células IFNectadas . La pella de células en cada pozo se suspendió en 480 µ? de caldo 2xYTAK (caldo 2xYT que contenía 100 µg/ml de ampicílina y 40 µg/ml de kanamicina) , después se incubaron a 30°C durante la noche durante aproximadamente 20 horas. Los restos celulares se separaron mediante centrifugación a 3S00 rpm durante 20 minutos . El sobrenadante de fagos rescatado se transfirió cuidadosamente a otro bloque de 96 pozos estéril . Los fagos rescatados se usaron para llevar a cabo ELISA de fagos clónales exactamente de la misma manera que la descrita en el ejemplo 2, ELISA de fondo de fagos. Los clones que dieron > 0.2 de OD405 neta se consideraron como candidatos de unión a IFNy. ELISA de rescate de fagos a gran escala La unión a IFNy específica de los clones de fago Fab únicos identificados se confirmó por la demostración de una unión de fagos Fab dependiente de concentración a IFNy en ELISA. Los fagos Fab se obtuvieron por rescate a gran escala. El rescate a gran escala de clones individuales se llevó a cabo como sigue : fagos Fab de clones de unión a IFNy únicos identificados fueron rescatados a gran escala. En un matraz estéril de 250 mi, 50 mi de caldo 2xYT-AG se inocularon con 200 µ? de cultivo nocturno del clon de unión a IFNy seleccionado, y se incubaron a 37°C, 2700 rpm hasta que la OD5go del cultivo alcanzara 0.5. Cinco mi de fago auxiliar M13K07 (GIBCO BRL, número de catálogo 18311-019, 1.1 x 1011 pfu/ml) se añadieron para infectar las células a una M.O.I de 20. La mezcla de células/fagos auxiliares se incubó a 37°C sin agitación durante 30 min., luego se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos para peletizar las células infectadas. La pella de células se suspendió en 50 mi de caldo 2xYTAK (caldo 2xYT que contenía 100 9/p?1 de ampicilina y 40 µg/ml de kanamicina) , después se incubaron 30°C con agitación a 270 rpm durante la noche durante alrededor de 20 horas. El cultivo nocturno se centrifugó 4000 rpm durante 20 minutos para remover los restos de células. El sobrenadante se centrifugó de nuevo para asegurar la remoción de los restos celulares . Al sobrenadante se le añadieron 10 mi (1/5 volúmenes) de solución de PEG (20% de PEG 8000, NaCl 2.5 M) para precipitar las partículas de fagos . La mezcla se incubó sobre hielo durante al menos una hora, y se centrifugó a 4000 rpm durante 20 min. para recoger las partículas de fagos precipitadas . La pella de fagos se resuspendió en 1 mi de PBS y se transfirió a un tubo micro-centrifugo . La suspensión de fagos se dejó sobre hielo durante una hora para permitir la suspensión completa de las partículas de fagos, y después se centrifugó a 14,000 rpm durante dos minutos para remover los restos de células residuales. Se repitió la etapa de precipitación de fagos. La pella de fagos final se suspendió en 1 mi de PBS y se dejó sobre hielo durante un periodo extendido para asegurar la suspensión completa de las partículas de fagos. La suspensión de fagos se centrifugó a 14,000 rpm durante dos minutos para remover restos de células residuales. La suspensión de fagos final se almacenó a 4°C. Se llevo a cabo la ELISA de los fagos como se describió en el ejemplo 2, ELISA de fondo de fagos. Por lo menos 6 concentraciones diferentes de fagos rescatados a gran escala, típicamente de lxl09 pfu/pozo a lxl011 pfu/pozo, se añadieron a los pozos correspondientes. Se identificaron un total de once clones de Fab. Los clones de Fab "IFN-A" , "57E" y "57D" se identificaron del fondo de fagos con elución con hlFN-y de E. coli . Los clones de Fab "GP-A" y "58C" se identificaron del fondo de fagos con elución con GPNA. Los clones de Fab "RD-A2" , "RD-B" y "59-A2" se identificaron del fondo de fagos con elución con RDMA. Los clones de Fab "BS-A" y "BS-B" se identificaron del fondo de fagos con elución con BSMA. El clon de Fab "67C" se identificó del fondo de fagos con una elución con hIFN-? Rl . La ELISA de fagos clónales dependiente de concentración de nueve clones únicos se llevó a cabo en preparaciones de fagos rescatadas a gran escala y se ilustra en la Figura 1 y Figura 2. Estos fagos de Fab pueden ser agrupados en tres grupos con base en sus perfiles de ELISA. El grupo A incluye clones de Fab "GP-A" y "BS-B" . Estos dos fagos de Fab son fuertes aglutinantes, con señales de ELISA que alcanzan saturación a 5E9 pfu/pozo. El grupo B incluye los clones de Fab "BS-A", "RD-A2" , "IFN-A" y "57E" . Éstos son fuertes para moderar los aglutinantes que muestran una adecuada curva de unión dependiente de concentración. El grupo C incluye clones de Fab "57D" , "58C" , "RD-B" y "67C" . Éstos son aglutinantes dependientes de concentración de IFNy débiles pero específicos . Análisis de secuencia de clones de Fab La confirmación de los clones de fago Fab de unión a IFNy únicos se llevó a cabo como sigue: moléculas de ADN plasmidico de los representativos de cada patrón de digestión con BstNi de Fab único se llevaron a cabo usando el equipo QIAfilter™ Plasmid tnidi (Qiagen, número de catálogo 12245) y se enviaron para la secuenciación. Las secuencias de todos los patrones BstNi de Fab confirmaron su carácter único y revelaron sus secuencias de cadena pesada y cadena ligera individuales (véase figuras 3-24) . Las secuencias de ADN y de aminoácidos predichas para las cadenas pesadas de Fabs "BS-A", "BS-B", "RD-B1" , "RD-A2", "58-C", "GP-A", "57D" , "57E", "IFN-A" , "67C" y "59-A2" (SEQ ID Nos: 65-86, respectivamente) se mostraron en las figuras 3-13, respectivamente. Las secuencias de ADN y de aminoácidos predichas para las cadenas ligeras de "BS-A" , "BS-B" , "RD-B1", "RD-A2" , "58-C" , "GP-A" , W57D" , "57E" , "IFN-A" , "67C" y "59-A2" (SEQ ID Nos: 87-108, respectivamente) se mostraron en las figuras 14-24, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de todos los once Fabs se compararon, como se muestra en la figura 31. Se usó el programa "BestFit" de GCG para obtener el porcentaje de identidad y similitud entre cada par de Fabs. Las coincidencias más cercanas en las cadenas pesadas están en "BS-A", " D-A2" e "IFN-A". Las secuencias de cadena pesada de "BS-A" y "RD-A2" tienen un armazón y CDR1 y CDR2 idénticos. Difieren únicamente en CDR3 , y tienen 92.6% de identidad y 93.4% de similitud. Con la excepción del primer aminoácido, las secuencias de cadena pesada de "BS-A" y "IFN-A" tienen un armazón y CDR1 y CDR2 idénticos y CDR3 diferente. Comparten 93.5% de identidad y 95.1% de similitud. Lo mismo es cierto para las secuencias de cadena pesada de "IFN-A" y "RD-A2", con una identidad de 90.5% y similitud de 92.1%. La secuencia de' aminoácidos de la cadena pesada de Fab "57E" muestra 88.1% de identidad y 89.0% de similitud con la secuencia de cadena pesada de "BS-A", 88.8% de identidad y 90.0% de similitud con la secuencia de cadena pesada de "RD-A2", y 89.0% de identidad y 90.7% de similitud con la secuencia de cadena pesada de IFN-A. La secuencia de aminoácidos de cadena pesada de Fab "BS-B" muestra 88.6% de identidad y 90.4% de similitud con la secuencia de cadena pesada de "57D" , 81.7% de identidad y 83.3% de similitud con la secuencia de cadena pesada de "GP-A" , y 83.9% de identidad y 84.7% de similitud con la secuencia de cadena pesada de 58C. Las coincidencias más cercanas en las cadenas ligeras son entre "59-A2" y "BS-A" con 90.8% de identidad y 91.7% de similitud, entre "BS-A" y "BS-B" con 89.0% de identidad y 90.9% de similitud, entre "57E" y "BS-A" con 88.2% de identidad y 90.9% de similitud, entre "57E" y "BS-B" con 89.7% de identidad y 91.5% de similitud y entre "59-A2" y "BS-B" con 88.2% de identidad y 88.2% de similitud. Sólo tres pares de Fabs, "59-A2"/"BS-B" , "57E"/"BS-A" y "IFN-A"/RD-A2 , coinciden estrechamente tanto en^ cadena pesada como en cadena ligera. Una comparación de secuencias de aminoácidos de regiones de determinación de complementariedad (CDRs) se muestra en la figura 25. Las CDR3s de cadena pesada de los once Fabs anti-IFNy comparten pocas similitudes. Los Fabs pueden agruparse de acuerdo con las similitudes de cualquiera de las CDRs de cadena pesada o las CDRs de cadena ligera, como se muestra en la figura 32. Los clones "BS-A", "IFN-A" y "RD-A2" tienen CDR1 y CDR2 de cadena pesada idénticas. Sin embargo, aparte de los mismos últimos tres residuos (FDY) , sus CDR3s de cadena pesada son muy diferentes. En forma interesante, IFN-A y RD-A2 también comparten CDR1 de cadena ligera de gran coincidencia (11/16 residuos idénticos), CDR2 (5/7 residuos idénticos) y CDR3 (8/9 residuos idénticos) . Los clones "BS-B", "59-A2", "GP-A" y "57D" tienen CDR1 y CDR2 de cadena pesada similares. Los clones "BS-B" y "59-A2" tienen CDR1 y CDR2 de cadena pesada idénticos pero CDR3 de cadena pesada muy diferente. Todas las tres CDRs de cadena ligera de los clones "59-A2", "BS-A" , "BS-B" y "57E" son muy similares. Ejemplo 4 Expresión, y purificación de Fabs solubles La cepa de E. coli HB2151 (Pharmacia) se transformó con ADN plasmídico de un aglutinante único. Los cultivos nocturnos del HB2151 transformado se hicieron en caldo 2xYT-AG a 30°C. 750 mi de 2xYT que contenía 100 g/ml de ampicilina y 0.1% de glucosa fueron inoculados con 7.5 mi de cultivo nocturno e incubados a 37°C con agitación (270 rpm) durante aproximadamente dos horas. Cuando la OD5S0 alcanzó 0.8-1.0, se añadió IPTG a 1 mM para la inducción. El cultivo se continuó haciendo a 30°C durante cuatro horas mientras se agitaba. El cultivo se centrifugó a 4000 rpm durante 20 minutos y el sobrenadante se descartó. La liberación periplásmica de Fab se logró usando el enfoque de choque Osmótico. Las células fueron suspendidas en 8 mi de TES helado (0.2 m de Tris, 0.5 mM de EDTA, 17.1% de sacarosa, pH 8.0) y se incubaron sobre hielo durante 5-10 con agitación suave ocasional. El tubo vacío se enjuagó con 8.8 mi de TES/¾0 (1:3), el cual se agrupó a la suspensión de células . La suspensión de células se incubó sobre hielo durante otros 20 minutos, y se centrifugó a 4000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante se transfirió cuidadosamente a otro tubo y se centrifugó de nuevo a 8000 rpm durante 20 minutos . ' El sobrenadante resultante fue la f acción periplásmica liberada con TES. La pella de células se resuspendió en 10 mi de TES/15 mM de gS0 , se incubó sobre hielo durante 15 minutos y después se centrifugó dos veces como se describió arriba. El sobrenadante final fue la fracción periplásmica liberada con Mg y se agrupó junto con la fracción periplásmica liberada con TES. Se añadió BSA como un vehículo y estabilizador a la fracción periplásmica hasta una concentración final de 1 mg/ml . La fracción periplásmica se dializó. con un cambio contra 2 L de regulador de pH de sonificacion (20 mM de Tris-HCl / 0.1 M de NaCl, pH 8.5) más inhibidores de proteasa a 4°C. La fracción periplásmica se añadió a un volumen de un décimo de resina TALON pre-equilibrada (Clontech) y se incubó a 4°C con agitación suave durante una hora. La mezcla de resina se centrifugó a 1300 rpm durante tres minutos y el sobrenadante se removió lo más posible . La resina se lavó con 10 volúmenes de regulador de pH de sonificacion y después se centrifugó a 1300 rpm durante tres minutos. El sobrenadante se descartó. La resina lavada se suspendió en un volumen de lecho de regulador de pH de sonificación y se empacó en una columna, la cual se lavó con 3 volúmenes de lecho de regulador de pH de sonificación. El Fab fue eluido con 2 volúmenes de lecho de imidazol 200mM. El Fab purificado se dializó en PBS, pH 7.4. Ejemplo 5 Clonación y expresión de anticuerpos IFNy humanos de longitud completa Los clones de Fab se convirtieron en anticuerpos de longitud completa mediante los siguientes procedimientos . Construcción de pDSR !9 :hlgGl CH El plásmido pDSRal9: IgGl de OPGL anti humano fue digerido con HindIII y BsmBI para remover la región de codificación para la región variable de OPGL anti-humana. El plásmido lineal pDSRal9 :hIgGl CH que contenía el dominio de región constante de IgGl humana de 1.0 kbp (dominios de CH1, salto, CH2 y CH3) se aisló con gel y se usó para aceptar las regiones variables anti-IFN-gamma derivadas de Fab. Construcción de cadena pesada pDSR l9 : anti-IFN gamma BS-A Las moléculas de ADNc de cadena pesada de Fab anti-IFN-garnma se clonaron en pDSRa.19 -.hlgGl CH para convertir los FAbs en IgGs de longitud completa. La construcción de un plásmido que codificaba para la cadena pesada de "BS-A" se describe aquí . Las otras cadenas pesadas de Fab se clonaron usando procedimientos similares . Para generar el Fab con una secuencia de señal, se llevó a cabo una PCR de tres etapas. Primero, los cebadores 2485-51 (mostrados abajo) y 2465-68 (mostrados abajo) se usaron con la plantilla de ADNc de Fab. Las condiciones fueron: 94°C durante 1 minuto, (94°C durante 20 seg., 48°C durante 30 seg. , 74°C durante 30 seg.) durante 4 ciclos, (94°C durante 20 seg., 66°C durante 30 seg., 74°C durante 30 seg.) durante 25 ciclos y 74°C durante 5 minutos con pfu polimerasa y el regulador de pH y nucleótidos adecuados. El producto de PCR se amplificó después con los cebadores 2148-98 (mostrado abajo) y 2465-68 (mostrado abajo) seguido por la amplificación con los cebadores 2489-36 (mostrado abajo) y 2465-68 (mostrado abajo) . El producto PCR final fue purificado por Qiagen, cortado con HindIII y BsmBI y purificado por Qiagen. Este fragmento que contenía el Fab con un sitio 5' Kozak (inicio de traducción) y la siguiente secuencia de señal para la expresión de mamífero: MDMRVPAQLLGLLLL LRGARC (SEQ ID NO: 111) , fue ligado en pDSRal9 :hIgGl CH. 2489-36 5'-CAG CAG AAG CTT CTA GAC CAC CAT GGA CAT GAG GGT CCC CGC TCA GCT CCT GGG (SEQ ID NO: 112), 2148-98 5'- CCG CTC AGC TCC TGG GGC TCC TGC TAT TGT GGT TGA GAG GTG CCA GAT (SEQ ID NO: 113) 2485-51 5'-G TGG TTG AGA GGT GCC AGA TGT CAG GTG CAG CTG CAG GAG-3 ' (SEQ ID NO: 114) 2465-68 5'-GT GGA GGC ACT AGA GAC GGT GAC CAG GGT 3' (SEQ ID NO: 115) Construcción de la cadena pesada de pDSR l9 : anti-IFN gamma BS- A Las moléculas de ADNc de cadena ligera de Fab fueron clonadas en pDSRal9 para convertir los FAbs en anticuerpos de longitud completa. La construcción de un plásmido que codificaba para la cadena ligera de WBS-A" se describe arriba. Los otros FAbs fueron clonados usando procedimientos similares. Para generar FAbs "BS-A" con una secuencia de señal, se llevó a cabo una PCR de tres etapas. Primero, los cebadores 2525-43 (mostrado abajo) y 2578-27 (mostrado abajo) se usaron con la plantilla de ADNc de Fab. Las condiciones de PCR fueron: 94°C durante 1 minuto, (94°C durante 20 seg., 48°C durante 30 seg., 74°C durante 30 seg.) durante 4 ciclos, (94°C durante 20 seg., 66°C durante 30 seg., 74°C durante 30 seg.) durante 25 ciclos y 74°C durante 5 minutos con pfu polimerasa y el regulador de pH y nucleótidos adecuados. El producto de PCR se purificó en gel y después se amplificó con los cebadores 2148-98 (mostrado abajo) y 2578-27 (mostrado abajo) . Segundo, los cebadores 2578-26 (mostrado abajo) y 2469-67 (mostrado abajo) se usaron de nuevo con la plantilla de ADNc de Fab. Las condiciones de PCR fueron: 94°C durante 1 minuto, (94°C durante 20 seg., 48°C durante 30 seg., 74°C durante 30 seg.) durante 4 ciclos, (94°C durante 20 seg., 66°C durante 30 seg., 74°C durante 30 seg.) durante 25 ciclos y 74°C durante 5 minutos con pfu polimerasa y el regulador de pH y nucleótidos adecuados . El producto de PCR se aisló en gel y se volvió a amplificar usando las mismas condiciones. Finalmente, los productos de PCR aislados se mezclaron y amplificaron con los cebadores 2489-36 (mostrado abajo) y 2469-67 (mostrado abajo) . El producto de PCR final se purificó por Qiagen, se cortó con Xbal y Salí, y se purificó con Qiagen. Este fragmento que contenía el Fab con un sitio 5' Kozak (inicio de traducción) y la siguiente secuencia de señal para la expresión de mamíferos : MDMRVPAQLLGLLLLWLRGARC (SEQ ID NO: 111), fue ligado en pDSRal9 2489-36 5'-C AGC AGA AGC TTC TAG ACC ACC ATG GAC ATG AGG GTC CCC GCT CA CTC CTG GG-3' (SEQ ID NO: 116) 2525-43 5'- TGG TTG AGA GGT GCC AGA TGT AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC-3' (SEQ ID NO: 117) 2578-27 5'GGC CGC GTA CTT GTT GTT GCT TTG TTT GGA G-3' (SEQ ID NO: 118) 2148-98 5'-CC GCT CAG CTC CTG GGG CTC CTG CTA TTG TGG TTG AGA GGT GCC AGA T-3' (SEQ ID NO: 119) 2578-26 5'-AGC AAC AAC AAG TAC GCG GCC AGC AGC TA- 3' (SEQ ID NO: 120) 2469-67 5'-GA AGT CGA CTA TGA ACA TTC TGT AGG AGC- 3' (SEQ ID NO: 121) Preparación de anticuerpos Vectores de expresión que contenían ADNc que codifica para anticuerpos de longitud completa de cadena pesada y ligera se transfectaron en células CHO y se cultivaron bajo condiciones para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera, y su secreción en el medio de células . El medio acondicionado se filtró a través de un filtro de acetato de celulosa de 0.45 µt? (Corning, Acton, ?) y se aplicó a una columna de proteina G Sefarosa (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) que había sido equilibrada con PBS - solución salina de pH regulado con fosfato de Dulbecco sin cloruro de calcio y sin cloruro de magnesio (Gibco BRL Products, Gran Isla, NY) . Después de la aplicación de la muestra la columna se lavó con PBS hasta que la absorbencia a 280 nm alcanzara la línea de base. La elución de la proteína se logró usando 100 mM de glicina, pH 2.5. Las fracciones fueron recogidas y neutralizadas inmediatamente por la adición de Tris-HCl 1M, pH 9.2. Los anticuerpos se detectaron mediante geles de SDS-poliacrilamida visualizado con tinción de Commassie. Las fracciones que contenían anticuerpos se agruparon, se concentraron y se diafiltraron en PBS usando ya sea Centricon 10 (Amicon) o para volúmenes más grandes Centriprep 10 (Amicon) . El anticuerpo aislado se caracterizó mediante filtración en gel en Superóse 6 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y mostró correr como una IgG monomérica. Ejemplo 6 Mediciones de afinidad, de Fab e IgG La constante de unión (Kd) , . la constante de velocidad encendida (ka) y la constante de velocidad apagada (kd) se determinaron mediante técnicas de resonancia plasmónica de superficie (BIAcore, Pharmacia, Piscataway, Mueva Jersey) . El análisis BIAcore de Fab y anticuerpo se llevó a cabo como sigue: los experimentos se llevaron a cabo usando BIACORE 2000 (BIACORE, Inc.) a temperatura ambiente. hlFNy expresado con CHO se inmovilizó en un microcircuito CM5. El Fab o IgG de Fab a varias concentraciones se inyectaron sobre la superficie de hu-IFNy. Los datos se analizaron usando software BIAEVALUATION 3.1 (BIACORE, Inc.). Los resultados se muestran en la figura 30. E emplo 7 Mediciones de actividad de Fab e IgG Ensayo de neutralización BIAcore La actividad de neutralización de IgGs convertidas en Fab se probó en BIAcore (véase e emplo 6) . Los resultados se muestran en la Figura 29. Una inhibición dependiente de concentración de la unión de hu IFNy a IFNy-Rl con una IC50 de 9 nM se observó para la IgG BS-B. Ensayo de proliferación de células A549 La actividad de neutralización de Fab e IgG medida en el ensayo de proliferación de A549 (descrito en el ejemplo 1) se llevó a cabo como sigue: células A549 se trataron con una mezcla de Fab o IgG dirigidos (varias concentraciones) y hlFNy expresado en CHO (2ng/ml o 5ng/ml) . Las concentraciones de Fab variaron de 0.3-150 µg/ml. Las concentraciones de IgG variaron de 0.1-100 µ9/p?1. Las concentraciones de anticuerpo de control positivo (Pharmingen B27) variaron de 0.01-5 µ9 p?1. Las células fueron teñidas con azul Alamar 5 días antes del tratamiento y se analizaron cuatro horas después de la tinción en un lector de placa FL500. Los resultados se muestran en la figura 26 para Fab BS-A, Fab BS-B y Fab GP-A y en la figura 27 para IgG BS-A e IgG BS-B. El Fab de BS-A y el Fab BS-B en la figura 26 e IgG BS-A e IgG BS-B en la figura 27 mostraron tener actividad de neutralización, medida como actividad de proliferación, a altas concentraciones, aproximadamente dos ordenes de magnitud más altas que la del control positivo. Aunque la presente invención se ha descrito en términos de modalidades preferidas, se entiende que variaciones y modificaciones ocurrirán para los expertos en la técnica. Por lo tanto, se intenta que las reivindicaciones anexas cubran todas estas variaciones equivalentes que pudieran estar dentro del alcance de la invención reclamada. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una región de unión a antígeno que comprende toda o parte de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO.-66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y/o SEQ ID NO: 86; en donde la región de unión a antígeno se une a una proteína de interferón gamma. 2. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO : 72 , SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 y/o SEQ ID NO: 86. 3. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 95% idéntica a por lo menos una de: SEQ ID NO: 72, SEQ JD NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82 O SEQ ID NO:86, O al menos 98% idéntica a por lo menos una de: SEQ ID NO: 66 o SEQ ID NO: 68. 4. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es por lo menos 98% idéntica a SEQ ID NO: 68. 5. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos es idéntica a SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84 o SEQ ID NO : 86. 6. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la región de unión a antigeno comprende además un cadena ligera kappa o lambda o un fragmento de la misma que comprende una región variable de cadena ligera. 7. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una segunda secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO.-94, SEQ ID NO.-96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106 o SEQ ID NO:108. 8. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la segunda secuencia de aminoácidos es por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106 o SEQ ID NO: 108. 9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, 2, 7 u 8, caracterizado porgue la región de unión a antígeno consiste en parte o todas de ambas secuencias de aminoácidos en un par de secuencias de aminoácidos, en donde el par se selecciona del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 88; SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 90; SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 92; SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 94; SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 96; SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 98; SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 100; SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 102; SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 104; SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 106; SEQ ID NO: 86 y SEQ ID NO: 108. 10. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la región de unión a antígeno consiste en parte o toda de SEQ ID NO: 68 y SEQ ID NO: 90. 11. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 88, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a SEQ ID NO: 66. 12. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 90, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a SEQ ID NO: 68. 13. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO : 92 , y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 70. 1 . El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porgue la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO:94; y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por .lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO : 72. 15. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 96, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO : 74. 16. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porgue la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 98, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 76. 17. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 100, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 78. 18. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antigeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 102, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO:80. 19. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 104, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 82. 20. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antigeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 106, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 84. 21. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a SEQ ID NO: 108, y en donde la región variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a SEQ ID NO: 86. 22. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una región de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO : 72 , SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO : 82 , SEQ ID NO: 84 o SEQ ID NO: 86, o un fragmento de una de estas secuencias, en donde la región de unión a antígeno se une a una proteína de interferón gamma. 23. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo aislado, caracterizado porque comprende una región de unión a antígeno que comprende toda o parte de una región variable de cadena pesada que incluye una CDR3 de cadena pesada que comprende una primera secuencia de aminoácidos seleccionada de un primer grupo que consiste en: SEQ ID NO: 54 o una variante de esta secuencia que comprende no más de cuatro alteraciones en relación a esta secuencia; SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 60 o SEQ ID NO: 63, o una variante de cualquiera de estas secuencias que comprende no más de dos alteraciones en relación a una de estas secuencias; SEQ ID NO: 57 o una variante de esta secuencia que comprende no más de ocho alteraciones en relación a esta secuencia; SEQ ID NO: 58 o una variante de esta secuencia que comprende no más de una alteración en relación a esta secuencia; SEQ ID NO: 61 o una variante de esta secuencia que comprende no más de cinco alteraciones en relación a esta secuencia; SEQ ID NO: 62 y SEQ ID NO: 64 o SEQ ID NO: 59, o una variante de una de estas secuencias que comprende no más de seis alteraciones en relación a una de estas secuencias; en donde una alteración es la sustitución, supresión o inserción de un solo aminoácido y en donde la región de unión a antigeno se une a una proteína de interferón gamma. 24. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la primera secuencia de aminoácidos se selecciona de un segundo grupo que consiste en: SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 y SEQ ID NO: 64. 25. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque la región de unión a antígeno comprende además toda o parte de una región variable de cadena ligera que incluye una CDR3 de cadena ligera que comprende una segunda secuencia de aminoácidos seleccionada de un tercer grupo de secuencias o una variante de esta secuencia, en donde el tercer grupo consiste en: SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO-.30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 y SEQ ID NO: 33 en donde la variante comprende no más de dos alteraciones en relación a una secuencia en el tercer grupo. 26. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la primera secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 56 y la segunda secuencia de aminoácidos es SEQ ID NO: 25. 27. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque la región variable de cadena pesada incluye además una CDR1 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID N0:34, SEQ ID N0:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO-.38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID N0.-41, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43. 28. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque la región variable de cadena pesada incluye además una CDR2 de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52 y SEQ ID NO: 53. 29. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque la región variable de cadena ligera incluye además una CDR1 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO : 11. 30. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizado porque la región variable de cadena ligera incluye además una CDR2 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. 31. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque comprende además una región Fe humana. 32. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, caracterizado porque el isotipo del anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en IgG, IgM, IgA, IgE e IgD. 33. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el isotipo es IgGi, IgG2, IgG3 o IgG . 3 . Una molécula de ácido nucleico caracterizada porque codifica para el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33. 35. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 36. Un método para prevenir o tratar una enfermedad autoinmune, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33. 37. Un método para prevenir o tratar una condición inflamatoria, caracterizado porque comprende administrar a un mamífero una cantidad efectiva del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en psoriasis, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, enfermedad inflamatoria del intestino y lupus eritematoso sistémico.
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