CN112301431A - 基于鲨鱼抗体可变区v-nar的噬菌体文库及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供基于鲨鱼抗体可变区V‑NAR噬菌体的合成肽库及其构建方法，设计V‑NAR框架序列，包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列，利用重叠延伸PCR获得上述完整的V‑NAR基因片段，并将其克隆至噬菌粒载体，转化至大肠杆菌，构建合成噬菌体文库。本发明提供一种新型V‑NAR框架序列，可作为鲨鱼V‑NAR抗体库的通用骨架，为抗体库的构建提供新的理论基础；利用构建的噬菌体库所筛选的Anti‑PD‑L1纳米抗体，具有潜在应用价值，可为新型抗肿瘤药物研发与获得提供新品种；所构建的基于鲨鱼抗体IgNAR的V‑NAR噬菌体库，可作为不同抗原的筛选平台，具有极高的生物医学应用价值。

Description

基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物医学与分子生物学领域，尤其涉及基于鲨鱼抗体可变区 V-NAR的噬菌体文库及其构建方法。
背景技术
鲨鱼体内存在一类只含重链的抗体IgNAR，其可变区V-NAR是目前已知 分子量最小的抗体片段，被称为纳米抗体。V-NAR具有亲和力高、稳定性强、 可溶性好、易偶联改造和良好的组织渗透能力等优势，因而在生物医药行业具 有广阔的应用前景。
噬菌体展示库是目前构建文库广泛应用的方法。虽然免疫文库的抗体靶特 异性较高，但是其存在局限性。例如，不仅免疫时间过长，只针对单一的免疫 抗原，而且对抗原的要求也苛刻。天然文库的多样性较为丰富，但其文库的抗 体结合力较弱。然而，合成抗体库具有库容大、多样性丰富、可用于筛选多种 抗原以及生产成本低等优势，是目前高亲和力抗体获得的主要来源，对于 V-NAR类药物的研发有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库 的构建方法，可作为鲨鱼V-NAR抗体库的通用骨架，为抗体库的构建提供新 的理论基础。
本发明的第二个目的在于，提供一种利用本发明构建方法构建获得的基于 鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库。
为了实现上述目的，本发明提供了基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体 文库的构建方法，设计V-NAR框架序列，包括FR区、CDR1区、HV2区以 及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列，利用重叠延伸PCR获得完整的 V-NAR基因片段，并将其克隆至噬菌粒载体，转化至大肠杆菌，构建合成噬 菌体文库；
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2 所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区， 所述CDR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述HV2区的氨基酸序列 如SEQ ID NO.6所示，所述HV4区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为一个优选方案，利用NNK突变的方法设计不同长度的CDR3，从而 使CDR3区序列多样化。比如设计3种不同长度的CDR3序列,分别为13、18 和22个氨基酸；同时利用NNK随机突变的方法，(N代表4种碱基，A、 T、C和G，K代表2种碱基，T和G)对序列随机化，减少终止子产生， 增加文库序列的多样性和有效性。
为实现上述的第二个目的，本发明提供了利用上述构建方法构建获得的基 于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020350。
在本发明的优选实施例中，利用固相筛选法从合成的噬菌体库中获得 PD-L1特异性纳米抗体，筛选获得5株抗PD-L1纳米抗体，其均与PD-L1特 异性结合，可阻断PD-1与PD-L1的结合，并具有优良的稳定性，所述抗体的 序列包括FR区、CDR区以及HV区；
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2 所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区；
所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8——SEQID NO.12任一所示的CDR3区；
所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7 所示的HV4区。
利用生物信息学技术分析不同品种的鲨鱼V-NAR序列，并参考已报道的 关键位点的氨基酸，从而设计V-NAR框架序列。此外，对V-NAR框架进行一 级和高级结构预测，最终成功获得新型V-NAR框架序列。
为了构建多样性丰富、通用性好以及无抗原偏向性的高容量合成鲨鱼 V-NAR噬菌体文库，本发明通过设计一种新型鲨鱼V-NAR框架，以此框架为 基础，并使用NNK的方法在CDR3区中引入突变，构建获得了库容为1.9×109 cfu的基于鲨鱼抗体IgNAR可变区(V-NAR)的合成噬菌体文库，并且基因插 入率100％，多样性丰富。此外，从噬菌体文库中筛选获得PD-L1特异性纳米 抗体，其均与PD-L1特异性结合，可阻断PD-1与PD-L1的结合，并具有优良的稳定性。所以，可证实所构建的V-NAR噬菌体文库具有生物学活性，可作 为其它抗原的通用筛选平台。
本发明所要保护的噬菌体库命名为大肠杆菌V-NAR Escherichia coli V-NAR，保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏地址：湖北省武汉市武昌区珞 珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072)，保藏日期是 2020年7月27日，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020350。
本发明的优点在于，本发明提供一种新型V-NAR框架序列，并使用NNK 的方法在CDR3区中引入突变，构建获得了库容为1.9×109cfu的V-NAR合成 噬菌体库，可作为鲨鱼V-NAR抗体库的通用骨架，为抗体库的构建提供新的 理论基础；利用构建的噬菌体库所筛选的Anti-PD-L1纳米抗体，均与PD-L1 特异性结合，并且具有优良的稳定性；所构建的基于鲨鱼抗体IgNAR的V-NAR 噬菌体库，可作为不同抗原的筛选平台，具有极高的生物医学应用价值。
附图说明
图1为新型V-NAR框架序列。
图2为V-NAR基因拼接示意图。
图3为PCR扩增V-NAR片段的DNA电泳图。
图4为抗体库中20个纳米抗体CDR3序列。
图5为ELISA初步鉴定PD-L1特异性纳米抗体。
图6为Anti-PD-L1纳米抗体经镍柱纯化后的SDS-PAGE图，其中泳道1 为Nb-P1；泳道2为Nb-P2；泳道3为Nb-P3；泳道4为Nb-P4；泳道5为Nb-P5。
图7为Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价，包括亲和力、热稳定性以 及特异性。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是， 以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限 制。
下面的实施例中所示实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂 和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：新型V-NAR框架的设计
通过PDB(https://www.rcsb.org)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 数据库获取2YWZ_A、AAP86762、4HGK_C、AAN75852、AAM33845、 Lep-12E1、ABY64741和Tom70等V-NAR纳米抗体氨基酸序列，并使用clustalw (https://www.ebi.ac.uk)和WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分 析V-NAR氨基酸序列。根据序列比对结果上骨架区相对应位置的氨基酸出现 频率的高低，确定V-NAR框架4个FR区的氨基酸序列。V-NAR框架的CDR1、 HV2和HV4区氨基酸序列，不仅要根据序列比对结果，还需参考已报道的V-NAR中有利于抗体稳定的特定位点氨基酸，最终确定V-NAR框架CDR1、 HV2和HV4区的氨基酸序列。V-NAR的CDR3区是与抗原结合的关键部位， 所以我们选择使用三种不同长度的CDR3(13、18和22个氨基酸)，并在每个 位置引入“NNK”(N代表4种碱基，A、T、C和G，K代表2种碱基，T和G) 随机化，增加文库多样性，从而提高合成文库的质量。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和CPHmodels 3.2Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)对这8种纳米抗体序列及设计的 V-NAR框架序列进行一级以及高级结构预测，从而确定V-NAR框架序列(图 1)。
实施例2：V-NAR基因的拼接
依据生物信息学和序列比对结果确定v-NAR的基本框架序列，利用重叠 延伸PCR扩增拼接得到V-NAR全长基因片段，总共3轮PCR。第1轮PCR 扩增获得FRl-FR3区DNA片段。第2轮PCR扩增获得CDR3-FR4区DNA片 段，第3轮PCR扩增获得完整的V-NAR全抗体基因片段(图3)。
V-NAR完成基因序列有两部份拼接而成，第一部分为基本框架序列，含 纳米抗体FR1-CDR1-FR2-HV2-FR2-HV4-FR3区域。第二部分为纳米抗体的 CDR3和FR4区，有不同长度随机序列拼接成。前两部分再拼接成全长序列。 基因拼接示意图如图3所示。
纳米抗体CDR3的长度在11个氨基酸到25个氨基酸之间，其平均值 为18.3个氨基酸，通常使用长度为13-22个氨基酸。因此，本发明中设计了 3个不同长度随机区域的CDR3(39bp、54bp和66bp)，所含随机氨基酸 数目分别为13，16，22个氨基酸，增加文库的多样性。因为大多数I型V-NAR 的CDR3区都含有两个半胱氨酸，并且在V-NAR结构稳定方面具有关键作 用，所以在CDR3随机引物中添加了两个半胱氨酸。
实施例3：V-NAR噬菌体库的构建及评价
将拼接成的V-NAR基因和pCANTAB5E噬菌粒载体分别进行Sfi I和Not I 内切酶酶切、连接且电转入大肠杆菌TG1。随后对利用2×TY培养基稀释 V-NAR合成文库，按照10-1、10-2、10-3到10-8(10倍)梯度稀释，取100μL 各个浓度的菌液涂布于含Amp的2×TY平板上，根据稀释倍数和相应平板上 的单菌落数目，检测V-NAR的库容。随机挑取20个单克隆，进行菌液PCR 以及测序，确定V-NAR目的基因插入率和多样性，图4为其中20纳米抗体的 CDR3区氨基酸变化。V-NAR文库质量评价见表1，包括库容量、基因插入 率以及基因多样性等。
表1.评价噬菌体文库的质量
Figure BDA0002629907920000051
实施例4：PD-L1特异性纳米抗体的筛选及初步鉴定
将PD-L1蛋白和BSA用NaHCO3缓冲液稀释，浓度为100μg/mL，PD-L1 蛋白为实验组，BSA为对照组。每孔加入150μL，设置3个复孔，4℃下过夜 孵育。随后对反应孔用TBST(0.1％)缓冲液洗涤，并用3％脱脂牛奶在4℃ 下封闭2h。洗涤后加入100μL噬菌体库溶液，并在室温下孵育60min。接着 用TBST缓冲液洗涤10遍后，将200μL洗脱液加至孔内，并在室温下孵育10 min。孵育结束后，每孔再加入15μL中和缓冲液，即为第1轮筛选获得的阳 性噬菌体，并进行滴度测定。利用2×TY培养基将其进行稀释，并侵染对数期 TG1甘油菌，孵育30min。孵育后，分别取100μL菌液均匀涂布于含Kan的 2×TY平板上，根据稀释倍数和单菌落数目计算文库的滴度。随后将其在大肠 杆菌TG1中扩增，并用M13K07辅助噬菌体进行救援，进行下一轮筛选，共 计4轮。
从第4轮筛选后洗脱噬菌体的平板上随机挑取60个单菌落，分别进行噬 菌体扩增。使用NaHCO3溶液将PD-L1蛋白和BSA稀释为100μg/mL，每孔 加入150μL溶液，PD-L1蛋白为实验组，BSA为对照组，4℃，60rpm，过夜 孵育。
TBST(0.1％)缓冲液洗涤后并加入5％脱脂奶粉封闭1h。将扩增后的噬 菌体用TBST(0.1％)缓冲液稀释10倍。封闭结束后洗涤，并将100μL噬菌 体库溶液加至孔内，37℃，孵育1h。孵育后用TBST(0.1％)缓冲液洗涤， 并每孔加入200μL用5％的脱脂奶粉以1:5000的比例稀释的HRP标记的 Anti-M13抗体，25℃，60rpm孵育60min。注意此过程需在避光下完成。将 30％H2O2与ABTS溶液混合以配制成底物溶液。TBST(0.1％)缓冲液洗涤96 孔板后，将100μL ABTS底物溶液加入孔内进行显色，室温避光孵育10min。 将100μL浓H2SO4加至每孔以终止反应，并检测在405nm处的吸光度。根据 实验组和阴性对照组的吸光度比值确定阳性克隆(图5)，并将其于2×TY培养 基中培养后测序。结果显示有5个CDR3区不同序列的Anti-PD-L1纳米抗体。 FR1区序列如SEQ ID NO.1所示；FR2区序列如SEQ ID NO.2所示；FR3区序列如SEQ ID NO.3所示；FR4区序列如SEQ ID NO.4所示；CDR1区序列如 SEQ ID NO.5所示；HV2区序列如SEQ ID NO.6所示；HV4区序列如SEQ ID NO.7所示；CDR3区DNA序列如SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.1：ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLR
SEQ ID NO.2：TCWYRKKSGSGGRYVETV
SEQ ID NO.3：FSLRINDLTVEDGGTYRCGV
SEQ ID NO.4：CGDGTAVTVNP
SEQ ID NO.5：DASYGLGS
SEQ ID NO.6：TNEESISK
SEQ ID NO.7：NSGSKS
SEQ ID NO.8：PVSFWGRVCAWWSLHCLRFLFG
SEQ ID NO.9：LGGPFGVRCAMYRWWCGLRRRT
SEQ ID NO.10：GTELRWFSCMWKMLLCVRGWLV
SEQ ID NO.11：GFWGCLVYLCRLF
SEQ ID NO.12：VVPLCMFVFCMLV。
实施例4：Anti-PD-L1纳米抗体的构建表达及纯化
利用PCR技术扩增获得Anti-PD-L1纳米抗体基因序列，并对其进行Nde I 和Xho I双酶切，克隆至pET-24a(+)载体。随后将重组质粒转化如将表达质粒 转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中；从转化的平板上挑选单菌落接种到含卡 那抗性的5mL LB液体培养基中培养过夜，然后取1mL过夜培养的菌液转接 到含卡那抗性的100mL LB液体培养基中，37℃，180rpm培养到菌液OD600值在0.6左右；接着添加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM,30℃诱导10小时；诱 导表达结束后，9000rpm离心5分钟收集菌体；将菌体再次重悬于PBS缓冲 液中，并利用低温高压细胞破碎仪破碎菌体，将破碎后的菌体4℃，9000rpm， 20min，分别收集其上清以及沉淀；将沉淀重悬于PBS缓冲液中，并取适量上 清和溶解后的沉淀跑SDS-PAGE用于验证PD-L1纳米抗体的表达形式；用包 涵体洗涤液重悬沉淀并离心，重复3次；利用包涵体溶解液重悬沉淀，并进行 镍柱纯化，每个纯化后的蛋白(图6)分装后-80℃保存。
实施例5：Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价
(1)将PD-L1蛋白稀释为5μg/mL和10μg/mL，每孔加入量为150μL， 包被于96孔板中，PD-L1蛋白为实验组，BSA为阴性对照组，同样进行稀释 并包被，4℃，60rpm，过夜孵育。用TBST(0.1％)缓冲液洗涤3遍后，将 200μL 3％脱脂奶粉加入每孔中进行封闭，并在4℃下孵育1h。将5株 Anti-PD-L1纳米抗体用TBST(0.1％)缓冲液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL。封闭后用TBST(0.1％)缓冲液 洗涤，并加入200μL各梯度浓度的纳米抗体，37℃，孵育1h。TBST(0.1％) 缓冲液洗涤后，并添加200μL以1:5000的比例在3％脱脂奶粉中稀释的HRP 标记的Anti-HA抗体。25℃，60rpm，孵育60min，注意此过程需在避光下完 成。TBST(0.1％)缓冲液洗涤后，将100μL ABTS底物溶液加至孔内，25℃，60rpm，避光孵育10min进行显色。每孔加入100μL浓H2SO4终止显色，孵 育5min后用酶标仪检测在405nm处的吸光度。通过通过抗原、抗体浓度以 及405nm处的吸光度计算Anti-PD-L1纳米抗体的亲和力。
(2)将NbP1、NbP2、NbP3、NbP4、NbP55株Anti-PD-L1纳米抗体使用 NaHCO3溶液稀释为100μg/mL。分别将每种纳米抗体于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下孵育10min，各温度下设置3个平行。结束后于4℃ 保存。经各温度处理后的纳米抗体与抗原的结合力同样利用上述间接ELISA 检测(图7a)。
表2：Anti-PD-L1纳米抗体的CDR3区基因和氨基酸序列
Figure BDA0002629907920000081
(3)利用PD-L1和PD-L2蛋白的同源性检测Anti-PD-L1纳米抗体的与 PD-L1结合的特异性，方法同ELISA(图7b)。
(4)将HepG2细胞以1×105cell/mL的密度铺在共聚焦培养皿中，培养 18h。设置空白组和实验组，空白组只加入1mL DMEM培养基；使用DMEM 培养基将FITC标记的5株Anti-PD-L1纳米抗体稀释为50μg/mL，实验组加入 1mL已配制的FITC标记的Anti-PD-L1纳米抗体溶液。置于培养箱共孵育6h。 共孵育结束后，PBS溶液洗涤细胞并用4％多聚甲醛固定HepG2细胞，于培养 箱中放置15min。弃去4％多聚甲醛并用PBS缓冲液清洗。将DiI染料加至培 养皿，于培养箱中放置1h，进行细胞膜染色。弃去细胞膜染料并用PBS洗涤。 再加入Hoechst33342染料，37℃下静置15min，对细胞核进行染色。弃去细 胞核染料并洗涤，再加入1mL PBS缓冲液，于尼康共聚焦显微镜下观察 Anti-PD-L1纳米抗体与细胞结合情况(图7c)。
(5)将HepG2细胞以2×105cell/mL的密度铺在六孔板中，培养18h。弃 去培养基并清洗HepG2细胞。设置空白组和实验组，空白组只加入2mL DMEM 培养基，实验组加入2mL含有FITC标记纳米抗体(50μg/mL)的DMEM培 养基。于细胞培养箱中共孵育6h。共孵育结束后，用PBS缓冲液洗涤细胞并 消化孔内细胞。随后再加入1mL DMEM培养基终止消化，吹打孔内细胞并转 移至EP管，离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于PBS中，并用流式细胞仪检测 HepG2细胞荧光强度(图7d)。Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价见表2， 包括亲和力、热稳定性以及特异性。
表3纳米抗体的体外活性评价
Figure BDA0002629907920000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库及其构建方法
<130> /
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Ala Arg Val Asp Gln Thr Pro Arg Ser Val Thr Lys Glu Thr Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg
20 25
<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Thr Cys Trp Tyr Arg Lys Lys Ser Gly Ser Gly Gly Arg Tyr Val Glu
1 5 10 15
Thr Val
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Phe Ser Leu Arg Ile Asn Asp Leu Thr Val Glu Asp Gly Gly Thr Tyr
1 5 10 15
Arg Cys Gly Val
20
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Gly Asp Gly Thr Ala Val Thr Val Asn Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Ser Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Pro Val Ser Phe Trp Gly Arg Val Cys Ala Trp Trp Ser Leu His Cys
1 5 10 15
Leu Arg Phe Leu Phe Gly
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Gly Gly Pro Phe Gly Val Arg Cys Ala Met Tyr Arg Trp Trp Cys
1 5 10 15
Gly Leu Arg Arg Arg Thr
20
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Thr Glu Leu Arg Trp Phe Ser Cys Met Trp Lys Met Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Arg Gly Trp Leu Val
20
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Phe Trp Gly Cys Leu Val Tyr Leu Cys Arg Leu Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Val Pro Leu Cys Met Phe Val Phe Cys Met Leu Val
1 5 10
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgttagtt tttggggtag ggtttgtgcg tggtggtctt tgcattgttt gaggtttttg 60
tttggg 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttggggggc cttttggggt gaggtgtgcg atgtataggt ggtggtgtgg gttgaggcgg 60
cgtact 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtacggagc ttcgttggtt ttcgtgtatg tggaagatgt tgttgtgtgt taggggttgg 60
ttggtg 66
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtttttggg gttgtttggt ttatttgtgt aggcttttt 39
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgtgccgt tgtgtatgtt tgttttttgt atgttggtt 39

Claims (3)

1.基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法，其特征在于，设计V-NAR框架序列，包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列，利用重叠延伸PCR获得完整的V-NAR基因片段，并将其克隆至噬菌粒载体，转化至大肠杆菌，构建合成噬菌体文库；
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区，所述CDR1区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述HV2区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述HV4区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
2.根据权利要求1所述基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法，其特征在于，利用NNK突变的方法设计不同长度的CDR3，从而使CDR3区序列多样化。
3.利用权利要求1所述构建方法构建获得的基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库，其特征在于，保藏编号为：CCTCC NO:M 2020350。
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WO2003014161A2 (en) * 2001-08-10 2003-02-20 Aberdeen University Antigen binding domains from fish
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