CN112301431A - 基于鲨鱼抗体可变区v-nar的噬菌体文库及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供基于鲨鱼抗体可变区V‑NAR噬菌体的合成肽库及其构建方法,设计V‑NAR框架序列,包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列,利用重叠延伸PCR获得上述完整的V‑NAR基因片段,并将其克隆至噬菌粒载体,转化至大肠杆菌,构建合成噬菌体文库。本发明提供一种新型V‑NAR框架序列,可作为鲨鱼V‑NAR抗体库的通用骨架,为抗体库的构建提供新的理论基础;利用构建的噬菌体库所筛选的Anti‑PD‑L1纳米抗体,具有潜在应用价值,可为新型抗肿瘤药物研发与获得提供新品种;所构建的基于鲨鱼抗体IgNAR的V‑NAR噬菌体库,可作为不同抗原的筛选平台,具有极高的生物医学应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学与分子生物学领域,尤其涉及基于鲨鱼抗体可变区 V-NAR的噬菌体文库及其构建方法。
背景技术
鲨鱼体内存在一类只含重链的抗体IgNAR,其可变区V-NAR是目前已知 分子量最小的抗体片段,被称为纳米抗体。V-NAR具有亲和力高、稳定性强、 可溶性好、易偶联改造和良好的组织渗透能力等优势,因而在生物医药行业具 有广阔的应用前景。
噬菌体展示库是目前构建文库广泛应用的方法。虽然免疫文库的抗体靶特 异性较高,但是其存在局限性。例如,不仅免疫时间过长,只针对单一的免疫 抗原,而且对抗原的要求也苛刻。天然文库的多样性较为丰富,但其文库的抗 体结合力较弱。然而,合成抗体库具有库容大、多样性丰富、可用于筛选多种 抗原以及生产成本低等优势,是目前高亲和力抗体获得的主要来源,对于 V-NAR类药物的研发有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库 的构建方法,可作为鲨鱼V-NAR抗体库的通用骨架,为抗体库的构建提供新 的理论基础。
本发明的第二个目的在于,提供一种利用本发明构建方法构建获得的基于 鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库。
为了实现上述目的,本发明提供了基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体 文库的构建方法,设计V-NAR框架序列,包括FR区、CDR1区、HV2区以 及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列,利用重叠延伸PCR获得完整的 V-NAR基因片段,并将其克隆至噬菌粒载体,转化至大肠杆菌,构建合成噬 菌体文库;
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2 所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区, 所述CDR1区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,所述HV2区的氨基酸序列 如SEQ ID NO.6所示,所述HV4区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
作为一个优选方案,利用NNK突变的方法设计不同长度的CDR3,从而 使CDR3区序列多样化。比如设计3种不同长度的CDR3序列,分别为13、18 和22个氨基酸;同时利用NNK随机突变的方法,(N代表4种碱基,A、 T、C和G,K代表2种碱基,T和G)对序列随机化,减少终止子产生, 增加文库序列的多样性和有效性。
为实现上述的第二个目的,本发明提供了利用上述构建方法构建获得的基 于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库,保藏编号为:CCTCC NO:M 2020350。
在本发明的优选实施例中,利用固相筛选法从合成的噬菌体库中获得 PD-L1特异性纳米抗体,筛选获得5株抗PD-L1纳米抗体,其均与PD-L1特 异性结合,可阻断PD-1与PD-L1的结合,并具有优良的稳定性,所述抗体的 序列包括FR区、CDR区以及HV区;
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2 所示的FR2区、SEQ ID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区;
所述CDR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的CDR1区和SEQ ID NO.8——SEQID NO.12任一所示的CDR3区;
所述HV区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示的HV2区和SEQ ID NO.7 所示的HV4区。
利用生物信息学技术分析不同品种的鲨鱼V-NAR序列,并参考已报道的 关键位点的氨基酸,从而设计V-NAR框架序列。此外,对V-NAR框架进行一 级和高级结构预测,最终成功获得新型V-NAR框架序列。
为了构建多样性丰富、通用性好以及无抗原偏向性的高容量合成鲨鱼 V-NAR噬菌体文库,本发明通过设计一种新型鲨鱼V-NAR框架,以此框架为 基础,并使用NNK的方法在CDR3区中引入突变,构建获得了库容为1.9×109 cfu的基于鲨鱼抗体IgNAR可变区(V-NAR)的合成噬菌体文库,并且基因插 入率100%,多样性丰富。此外,从噬菌体文库中筛选获得PD-L1特异性纳米 抗体,其均与PD-L1特异性结合,可阻断PD-1与PD-L1的结合,并具有优良的稳定性。所以,可证实所构建的V-NAR噬菌体文库具有生物学活性,可作 为其它抗原的通用筛选平台。
本发明所要保护的噬菌体库命名为大肠杆菌V-NAR Escherichia coli V-NAR,保藏在中国典型培养物保藏中心(保藏地址:湖北省武汉市武昌区珞 珈山路16号武汉大学中国典型培养物保藏中心邮编430072),保藏日期是 2020年7月27日,保藏编号为:CCTCC NO:M 2020350。
本发明的优点在于,本发明提供一种新型V-NAR框架序列,并使用NNK 的方法在CDR3区中引入突变,构建获得了库容为1.9×109cfu的V-NAR合成 噬菌体库,可作为鲨鱼V-NAR抗体库的通用骨架,为抗体库的构建提供新的 理论基础;利用构建的噬菌体库所筛选的Anti-PD-L1纳米抗体,均与PD-L1 特异性结合,并且具有优良的稳定性;所构建的基于鲨鱼抗体IgNAR的V-NAR 噬菌体库,可作为不同抗原的筛选平台,具有极高的生物医学应用价值。
附图说明
图1为新型V-NAR框架序列。
图2为V-NAR基因拼接示意图。
图3为PCR扩增V-NAR片段的DNA电泳图。
图4为抗体库中20个纳米抗体CDR3序列。
图5为ELISA初步鉴定PD-L1特异性纳米抗体。
图6为Anti-PD-L1纳米抗体经镍柱纯化后的SDS-PAGE图,其中泳道1 为Nb-P1;泳道2为Nb-P2;泳道3为Nb-P3;泳道4为Nb-P4;泳道5为Nb-P5。
图7为Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价,包括亲和力、热稳定性以 及特异性。
具体实施方式
以下,结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是, 以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明,而非对本发明的限 制。
下面的实施例中所示实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂 和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1:新型V-NAR框架的设计
通过PDB(https://www.rcsb.org)和NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov) 数据库获取2YWZ_A、AAP86762、4HGK_C、AAN75852、AAM33845、 Lep-12E1、ABY64741和Tom70等V-NAR纳米抗体氨基酸序列,并使用clustalw (https://www.ebi.ac.uk)和WebLogo(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)分 析V-NAR氨基酸序列。根据序列比对结果上骨架区相对应位置的氨基酸出现 频率的高低,确定V-NAR框架4个FR区的氨基酸序列。V-NAR框架的CDR1、 HV2和HV4区氨基酸序列,不仅要根据序列比对结果,还需参考已报道的V-NAR中有利于抗体稳定的特定位点氨基酸,最终确定V-NAR框架CDR1、 HV2和HV4区的氨基酸序列。V-NAR的CDR3区是与抗原结合的关键部位, 所以我们选择使用三种不同长度的CDR3(13、18和22个氨基酸),并在每个 位置引入“NNK”(N代表4种碱基,A、T、C和G,K代表2种碱基,T和G) 随机化,增加文库多样性,从而提高合成文库的质量。利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和CPHmodels 3.2Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)对这8种纳米抗体序列及设计的 V-NAR框架序列进行一级以及高级结构预测,从而确定V-NAR框架序列(图 1)。
实施例2:V-NAR基因的拼接
依据生物信息学和序列比对结果确定v-NAR的基本框架序列,利用重叠 延伸PCR扩增拼接得到V-NAR全长基因片段,总共3轮PCR。第1轮PCR 扩增获得FRl-FR3区DNA片段。第2轮PCR扩增获得CDR3-FR4区DNA片 段,第3轮PCR扩增获得完整的V-NAR全抗体基因片段(图3)。
V-NAR完成基因序列有两部份拼接而成,第一部分为基本框架序列,含 纳米抗体FR1-CDR1-FR2-HV2-FR2-HV4-FR3区域。第二部分为纳米抗体的 CDR3和FR4区,有不同长度随机序列拼接成。前两部分再拼接成全长序列。 基因拼接示意图如图3所示。
纳米抗体CDR3的长度在11个氨基酸到25个氨基酸之间,其平均值 为18.3个氨基酸,通常使用长度为13-22个氨基酸。因此,本发明中设计了 3个不同长度随机区域的CDR3(39bp、54bp和66bp),所含随机氨基酸 数目分别为13,16,22个氨基酸,增加文库的多样性。因为大多数I型V-NAR 的CDR3区都含有两个半胱氨酸,并且在V-NAR结构稳定方面具有关键作 用,所以在CDR3随机引物中添加了两个半胱氨酸。
实施例3:V-NAR噬菌体库的构建及评价
将拼接成的V-NAR基因和pCANTAB5E噬菌粒载体分别进行Sfi I和Not I 内切酶酶切、连接且电转入大肠杆菌TG1。随后对利用2×TY培养基稀释 V-NAR合成文库,按照10-1、10-2、10-3到10-8(10倍)梯度稀释,取100μL 各个浓度的菌液涂布于含Amp的2×TY平板上,根据稀释倍数和相应平板上 的单菌落数目,检测V-NAR的库容。随机挑取20个单克隆,进行菌液PCR 以及测序,确定V-NAR目的基因插入率和多样性,图4为其中20纳米抗体的 CDR3区氨基酸变化。V-NAR文库质量评价见表1,包括库容量、基因插入 率以及基因多样性等。
表1.评价噬菌体文库的质量
实施例4:PD-L1特异性纳米抗体的筛选及初步鉴定
将PD-L1蛋白和BSA用NaHCO3缓冲液稀释,浓度为100μg/mL,PD-L1 蛋白为实验组,BSA为对照组。每孔加入150μL,设置3个复孔,4℃下过夜 孵育。随后对反应孔用TBST(0.1%)缓冲液洗涤,并用3%脱脂牛奶在4℃ 下封闭2h。洗涤后加入100μL噬菌体库溶液,并在室温下孵育60min。接着 用TBST缓冲液洗涤10遍后,将200μL洗脱液加至孔内,并在室温下孵育10 min。孵育结束后,每孔再加入15μL中和缓冲液,即为第1轮筛选获得的阳 性噬菌体,并进行滴度测定。利用2×TY培养基将其进行稀释,并侵染对数期 TG1甘油菌,孵育30min。孵育后,分别取100μL菌液均匀涂布于含Kan的 2×TY平板上,根据稀释倍数和单菌落数目计算文库的滴度。随后将其在大肠 杆菌TG1中扩增,并用M13K07辅助噬菌体进行救援,进行下一轮筛选,共 计4轮。
从第4轮筛选后洗脱噬菌体的平板上随机挑取60个单菌落,分别进行噬 菌体扩增。使用NaHCO3溶液将PD-L1蛋白和BSA稀释为100μg/mL,每孔 加入150μL溶液,PD-L1蛋白为实验组,BSA为对照组,4℃,60rpm,过夜 孵育。
TBST(0.1%)缓冲液洗涤后并加入5%脱脂奶粉封闭1h。将扩增后的噬 菌体用TBST(0.1%)缓冲液稀释10倍。封闭结束后洗涤,并将100μL噬菌 体库溶液加至孔内,37℃,孵育1h。孵育后用TBST(0.1%)缓冲液洗涤, 并每孔加入200μL用5%的脱脂奶粉以1:5000的比例稀释的HRP标记的 Anti-M13抗体,25℃,60rpm孵育60min。注意此过程需在避光下完成。将 30%H2O2与ABTS溶液混合以配制成底物溶液。TBST(0.1%)缓冲液洗涤96 孔板后,将100μL ABTS底物溶液加入孔内进行显色,室温避光孵育10min。 将100μL浓H2SO4加至每孔以终止反应,并检测在405nm处的吸光度。根据 实验组和阴性对照组的吸光度比值确定阳性克隆(图5),并将其于2×TY培养 基中培养后测序。结果显示有5个CDR3区不同序列的Anti-PD-L1纳米抗体。 FR1区序列如SEQ ID NO.1所示;FR2区序列如SEQ ID NO.2所示;FR3区序列如SEQ ID NO.3所示;FR4区序列如SEQ ID NO.4所示;CDR1区序列如 SEQ ID NO.5所示;HV2区序列如SEQ ID NO.6所示;HV4区序列如SEQ ID NO.7所示;CDR3区DNA序列如SEQ IDNO.8或SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12所示。
SEQ ID NO.1:ARVDQTPRSVTKETGESLTINCVLR
SEQ ID NO.2:TCWYRKKSGSGGRYVETV
SEQ ID NO.3:FSLRINDLTVEDGGTYRCGV
SEQ ID NO.4:CGDGTAVTVNP
SEQ ID NO.5:DASYGLGS
SEQ ID NO.6:TNEESISK
SEQ ID NO.7:NSGSKS
SEQ ID NO.8:PVSFWGRVCAWWSLHCLRFLFG
SEQ ID NO.9:LGGPFGVRCAMYRWWCGLRRRT
SEQ ID NO.10:GTELRWFSCMWKMLLCVRGWLV
SEQ ID NO.11:GFWGCLVYLCRLF
SEQ ID NO.12:VVPLCMFVFCMLV。
实施例4:Anti-PD-L1纳米抗体的构建表达及纯化
利用PCR技术扩增获得Anti-PD-L1纳米抗体基因序列,并对其进行Nde I 和Xho I双酶切,克隆至pET-24a(+)载体。随后将重组质粒转化如将表达质粒 转化入表达菌株E.coli BL21(DE3)中;从转化的平板上挑选单菌落接种到含卡 那抗性的5mL LB液体培养基中培养过夜,然后取1mL过夜培养的菌液转接 到含卡那抗性的100mL LB液体培养基中,37℃,180rpm培养到菌液OD600值在0.6左右;接着添加诱导剂IPTG至终浓度0.5mM,30℃诱导10小时;诱 导表达结束后,9000rpm离心5分钟收集菌体;将菌体再次重悬于PBS缓冲 液中,并利用低温高压细胞破碎仪破碎菌体,将破碎后的菌体4℃,9000rpm, 20min,分别收集其上清以及沉淀;将沉淀重悬于PBS缓冲液中,并取适量上 清和溶解后的沉淀跑SDS-PAGE用于验证PD-L1纳米抗体的表达形式;用包 涵体洗涤液重悬沉淀并离心,重复3次;利用包涵体溶解液重悬沉淀,并进行 镍柱纯化,每个纯化后的蛋白(图6)分装后-80℃保存。
实施例5:Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价
(1)将PD-L1蛋白稀释为5μg/mL和10μg/mL,每孔加入量为150μL, 包被于96孔板中,PD-L1蛋白为实验组,BSA为阴性对照组,同样进行稀释 并包被,4℃,60rpm,过夜孵育。用TBST(0.1%)缓冲液洗涤3遍后,将 200μL 3%脱脂奶粉加入每孔中进行封闭,并在4℃下孵育1h。将5株 Anti-PD-L1纳米抗体用TBST(0.1%)缓冲液稀释为0.625μg/mL、1.25μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL。封闭后用TBST(0.1%)缓冲液 洗涤,并加入200μL各梯度浓度的纳米抗体,37℃,孵育1h。TBST(0.1%) 缓冲液洗涤后,并添加200μL以1:5000的比例在3%脱脂奶粉中稀释的HRP 标记的Anti-HA抗体。25℃,60rpm,孵育60min,注意此过程需在避光下完 成。TBST(0.1%)缓冲液洗涤后,将100μL ABTS底物溶液加至孔内,25℃,60rpm,避光孵育10min进行显色。每孔加入100μL浓H2SO4终止显色,孵 育5min后用酶标仪检测在405nm处的吸光度。通过通过抗原、抗体浓度以 及405nm处的吸光度计算Anti-PD-L1纳米抗体的亲和力。
(2)将NbP1、NbP2、NbP3、NbP4、NbP55株Anti-PD-L1纳米抗体使用 NaHCO3溶液稀释为100μg/mL。分别将每种纳米抗体于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃下孵育10min,各温度下设置3个平行。结束后于4℃ 保存。经各温度处理后的纳米抗体与抗原的结合力同样利用上述间接ELISA 检测(图7a)。
表2:Anti-PD-L1纳米抗体的CDR3区基因和氨基酸序列
(3)利用PD-L1和PD-L2蛋白的同源性检测Anti-PD-L1纳米抗体的与 PD-L1结合的特异性,方法同ELISA(图7b)。
(4)将HepG2细胞以1×105cell/mL的密度铺在共聚焦培养皿中,培养 18h。设置空白组和实验组,空白组只加入1mL DMEM培养基;使用DMEM 培养基将FITC标记的5株Anti-PD-L1纳米抗体稀释为50μg/mL,实验组加入 1mL已配制的FITC标记的Anti-PD-L1纳米抗体溶液。置于培养箱共孵育6h。 共孵育结束后,PBS溶液洗涤细胞并用4%多聚甲醛固定HepG2细胞,于培养 箱中放置15min。弃去4%多聚甲醛并用PBS缓冲液清洗。将DiI染料加至培 养皿,于培养箱中放置1h,进行细胞膜染色。弃去细胞膜染料并用PBS洗涤。 再加入Hoechst33342染料,37℃下静置15min,对细胞核进行染色。弃去细 胞核染料并洗涤,再加入1mL PBS缓冲液,于尼康共聚焦显微镜下观察 Anti-PD-L1纳米抗体与细胞结合情况(图7c)。
(5)将HepG2细胞以2×105cell/mL的密度铺在六孔板中,培养18h。弃 去培养基并清洗HepG2细胞。设置空白组和实验组,空白组只加入2mL DMEM 培养基,实验组加入2mL含有FITC标记纳米抗体(50μg/mL)的DMEM培 养基。于细胞培养箱中共孵育6h。共孵育结束后,用PBS缓冲液洗涤细胞并 消化孔内细胞。随后再加入1mL DMEM培养基终止消化,吹打孔内细胞并转 移至EP管,离心收集细胞。将细胞沉淀重悬于PBS中,并用流式细胞仪检测 HepG2细胞荧光强度(图7d)。Anti-PD-L1纳米抗体的体外活性评价见表2, 包括亲和力、热稳定性以及特异性。
表3纳米抗体的体外活性评价
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通 技术人员,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
<120> 基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库及其构建方法
<130> /
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> PRT
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Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Leu Arg
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<210> 2
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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1 5 10 15
Thr Val
<210> 3
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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1 5 10 15
Arg Cys Gly Val
20
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Cys Gly Asp Gly Thr Ala Val Thr Val Asn Pro
1 5 10
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Asp Ala Ser Tyr Gly Leu Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Asn Glu Glu Ser Ile Ser Lys
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asn Ser Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 8
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Pro Val Ser Phe Trp Gly Arg Val Cys Ala Trp Trp Ser Leu His Cys
1 5 10 15
Leu Arg Phe Leu Phe Gly
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Leu Gly Gly Pro Phe Gly Val Arg Cys Ala Met Tyr Arg Trp Trp Cys
1 5 10 15
Gly Leu Arg Arg Arg Thr
20
<210> 10
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Thr Glu Leu Arg Trp Phe Ser Cys Met Trp Lys Met Leu Leu Cys
1 5 10 15
Val Arg Gly Trp Leu Val
20
<210> 11
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Gly Phe Trp Gly Cys Leu Val Tyr Leu Cys Arg Leu Phe
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Val Val Pro Leu Cys Met Phe Val Phe Cys Met Leu Val
1 5 10
<210> 13
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cctgttagtt tttggggtag ggtttgtgcg tggtggtctt tgcattgttt gaggtttttg 60
tttggg 66
<210> 14
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttggggggc cttttggggt gaggtgtgcg atgtataggt ggtggtgtgg gttgaggcgg 60
cgtact 66
<210> 15
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtacggagc ttcgttggtt ttcgtgtatg tggaagatgt tgttgtgtgt taggggttgg 60
ttggtg 66
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggtttttggg gttgtttggt ttatttgtgt aggcttttt 39
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgtgccgt tgtgtatgtt tgttttttgt atgttggtt 39
Claims (3)
1.基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法,其特征在于,设计V-NAR框架序列,包括FR区、CDR1区、HV2区以及HV4区和随机化的CDR3区氨基酸序列,利用重叠延伸PCR获得完整的V-NAR基因片段,并将其克隆至噬菌粒载体,转化至大肠杆菌,构建合成噬菌体文库;
所述FR区包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的FR1区、SEQ ID NO.2所示的FR2区、SEQID NO.3所示的FR3区和SEQ ID NO.4所示的FR4区,所述CDR1区的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示,所述HV2区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,所述HV4区的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
2.根据权利要求1所述基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库的构建方法,其特征在于,利用NNK突变的方法设计不同长度的CDR3,从而使CDR3区序列多样化。
3.利用权利要求1所述构建方法构建获得的基于鲨鱼抗体可变区V-NAR的噬菌体文库,其特征在于,保藏编号为:CCTCC NO:M 2020350。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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CN202010808119.7A CN112301431B (zh) | 2020-08-12 | 2020-08-12 | 基于鲨鱼抗体可变区v-nar的噬菌体文库及其构建方法 |
Publications (2)
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ID=74483686
Family Applications (1)
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WO2003014161A2 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Aberdeen University | Antigen binding domains from fish |
CN105531370A (zh) * | 2013-04-23 | 2016-04-27 | 阿伯丁大学理事会 | 治疗靶向特异性vnar结构域与icosl的分离 |
CN107074961A (zh) * | 2014-11-03 | 2017-08-18 | 默克专利股份公司 | 用于生成双特异性鲨鱼可变抗体结构域的方法及其用途 |
-
2020
- 2020-08-12 CN CN202010808119.7A patent/CN112301431B/zh active Active
Patent Citations (3)
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WO2003014161A2 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | Aberdeen University | Antigen binding domains from fish |
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CN107074961A (zh) * | 2014-11-03 | 2017-08-18 | 默克专利股份公司 | 用于生成双特异性鲨鱼可变抗体结构域的方法及其用途 |
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