CN107921083A

CN107921083A - 在治疗骨质减少症和骨质疏松症中的B7h受体配体

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Publication number: CN107921083A
Application number: CN201680044235.8A
Authority: CN
Inventors: U·迪安扎尼; C·L·吉格利蒂; E·博格吉奥
Original assignee: Universita degli Studi del Piemonte Orientale -Amedeo Avogadro
Current assignee: Universita degli Studi del Piemonte Orientale -Amedeo Avogadro
Priority date: 2015-05-27
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2018-04-17
Anticipated expiration: 2036-05-18
Also published as: ITUB20151014A1; CN107921083B; EP3229822B1; JP2018515586A; US20180305436A1; EP3229822A1; US11230587B2; WO2016189428A1

Abstract

本发明公开了B7h受体配体在治疗骨质疏松症或骨质减少症中的新用途以及使用B7h受体作为筛选用于治疗骨质减少症或骨质疏松症的药物活性剂的靶标。

Description

在治疗骨质减少症和骨质疏松症中的B7h受体配体

技术领域

本发明涉及B7h受体配体在治疗骨质减少症和骨质疏松症中的新用途。

背景技术

破骨细胞是由单核-巨噬细胞前体细胞的细胞-细胞融合形成的巨细胞，特征在于多核、丰富的空泡和溶酶体；它们在骨发育和重塑中起关键作用，其也涉及成骨细胞和骨细胞。在巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和核因子κB配体(RANKL)的受体激活剂的影响下，破骨细胞从单核细胞分化。

通过触发RANKL在破骨细胞膜上表达的核因子-κB(RANK)的受体激活剂来刺激破骨细胞功能。在健康骨中，RANKL的主要来源是成骨细胞，其响应骨吸收因子将RANKL表达为表面受体，并被金属蛋白酶(MMP)切割成可溶性分子(sRANKL)。此外，RANKL还可以由在发炎过程中支持破骨细胞功能的基质细胞、淋巴细胞和巨噬细胞表达。骨保护素(OPG)是RANKL的可溶性受体，由成骨细胞和基质细胞分泌，以抑制由RANKL诱导的RANK刺激和破骨细胞生成。M-CSF与其在破骨细胞祖细胞上的集落刺激因子1受体(c-fms)的结合上调这些细胞中RANK的表达并促进破骨细胞生成。破骨细胞分化包括细胞极化，形成皱褶膜和破骨细胞与骨的密封以形成密封区或透明区，其将吸收陷窝从周围分离。这是酸、耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶和MMP的分泌位点，导致骨的无机组分的脱矿化和其有机组分的水解。然后，偶联机制促进成骨细胞在吸收陷窝处的分化和募集，在那里它们分泌骨的有机成分，其之后被羟基磷灰石矿化。包埋在基质中的一些成骨细胞变成骨细胞并分泌硬骨素，其抑制成骨细胞功能并终止重塑周期。当骨细胞暴露于机械力时，硬骨素表达被抑制，这将骨重塑靶向最大应变区域。

过度的破骨细胞活性导致病理性骨质流失，并且可以在诸如骨质疏松症、类风湿性关节炎和其他自身免疫性疾病的病症中检测到，其中关键作用已被归因于炎性细胞因子和适应性免疫。此外，一些涉及免疫细胞如多发性骨髓瘤的瘤形成特征在于由基质细胞和可能的骨髓瘤细胞高度表达RANKL引起的强烈局灶性骨侵蚀。实体瘤的骨转移也可能是溶骨性的，并且前列腺癌可通过表达可溶形式的RANKL来促进骨吸收。

一些炎性细胞因子如TNF-α、白细胞介素(IL)-1、IL-6和M-CSF上调RANKL表达并刺激破骨细胞功能。17型T辅助细胞(Th17)分泌IL-17起关键作用，其诱导成骨细胞和滑膜细胞中RANKL的表达。此外，IL-17支持募集几种类型的免疫细胞，这些免疫细胞有助于骨损伤并产生支持破骨细胞分化和活性的细胞因子和其他促炎分子。

B7h(CD275，也称为B7H2、B7-RP1、ICOSL、GL50)属于B7家族的表面受体，它结合属于CD28家族^1-5的ICOS(CD278)。ICOS由活化的T细胞选择性表达，而B7h由多种细胞类型表达，包括B细胞、巨噬细胞、树突细胞和T细胞亚群。然而，B7h也由非造血起源的细胞如血管内皮细胞、上皮细胞和成纤维细胞表达以及在许多原发性肿瘤和肿瘤细胞系中表达。B7h的主要已知功能是触发ICOS，其通过调节其细胞因子分泌，特别是增加干扰素(IFN)-γ(在人中)、IL-4(在小鼠中)和IL-10、IL-17和IL-21(在两种物种中)的分泌，作为活化T细胞的共刺激分子起作用。然而，最近的报道显示B7h：ICOS相互作用可触发双向信号，也能调节B7h表达细胞的应答。在小鼠树突细胞中，这种B7h介导的“反向信号传导”诱导部分成熟，同时显著增强IL-6分泌。在人树突细胞中，发现其调节细胞因子分泌，促进在I类MHC分子中交叉呈递胞吞抗原的能力，并抑制对内皮细胞的粘附和迁移。B7h刺激还抑制内皮细胞和肿瘤细胞系的粘附和迁移。这些作用伴随着内皮细胞中ERK和p38的磷酸化减少；内皮细胞和肿瘤细胞中FAK的磷酸化减少和β-Pix的下调。最后，在用CF-PAC1细胞注射NOD-SCID-IL2Rγnull小鼠和用B16-F10细胞注射C57BL/6小鼠后，B7h触发抑制肺转移的发展。

发明内容

本说明书涉及B7h受体在破骨细胞中的表达和触发B7h受体以降低和/或抑制破骨细胞分化、成熟和/或活性。

本发明的目的是提供用于治疗骨质疏松症或骨质减少症的新化合物。

根据本发明，由于所附权利要求中指定的方法实现了上述目的，所附权利要求被理解为构成本说明书的组成部分。

在一个实施方案中，本发明公开了B7h受体配体在治疗骨质疏松症和骨质减少症中的新用途。

在另一个实施方案中，本说明书涉及使用B7h受体作为筛选用于治疗骨质减少症和骨质疏松症的药物活性剂的靶标，其中药物活性剂干扰破骨细胞的分化、成熟和/或功能，从而抑制破骨细胞生成。

附图说明

现在将参照附图仅以举例的方式描述本发明，其中：

-图1：单核细胞来源的破骨细胞(MDOC)中的形态学分析和CD14、B7h和组织蛋白酶-K表达。A)在M-CSF(25ng/ml)和RANKL(30ng/ml)存在下，在培养的第0天(T0)、第14天(T14)和第21天(T21)通过相差显微镜拍摄细胞。B)在T0、T14和T21通过流式细胞术评估MDOC中的CD14、B7h和组织蛋白酶-K表达。每个面板中的数字表示阳性细胞的百分比。面板代表5个实验。

-图2：ICOS-Fc对破骨细胞分化的影响。在存在或缺乏在第0天添加的ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)的情况下，单核细胞被诱导分化成MDOC(T^0-21处理)。A)在T10和T21通过相差显微镜拍摄细胞。B)在T10和T21通过流式细胞术评估MDOC中的CD14和组织蛋白酶-K表达。每个面板中的数字表示阳性细胞相对于内部阴性对照的百分比。面板代表5个实验。

-图3：ICOS-Fc对破骨细胞分化的影响。在存在或缺乏从第14天添加的ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)的情况下，单核细胞被诱导分化成MDOC(T^14-21处理)。A)在T21通过相差显微镜拍摄细胞。B)在T21通过流式细胞术评估MDOC中的CD14和组织蛋白酶-K表达。每个面板中的数字表示阳性细胞相对于内部阴性对照的百分比。面板代表3个实验。C)条形图显示在第21天在每个区域中计数的核的数量(来自5个区域的平均值)；数据表示为来自3次独立实验的平均值±平均标准误差(SEM)(*：相对于对照p<0.01)。

-图4：ICOS-Fc对破骨细胞分化的影响。在存在或缺乏从第7天添加的ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)的情况下，单核细胞被诱导分化成MDOC(T^7-21和T^7-14处理)。A)在T21通过相差显微镜拍摄细胞。B)在T21通过流式细胞术评估MDOC中的CD14和组织蛋白酶-K表达。每个面板中的数字表示阳性细胞相对于内部阴性对照的百分比。面板代表3个实验。

-图5：ICOS-Fc对分化的破骨细胞的影响。在分化培养21天后，将MDOC在存在和缺乏ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)的情况下再培养3天(T²¹ ^-24处理)，洗涤后再培养4天(T25-T28)。A)在T24、T25和T28通过相差显微镜拍摄细胞。B)在T24、T25和T28通过流式细胞术评估MDOC中的CD14和组织蛋白酶-K表达。每个面板中的数字表示阳性细胞相对于内部阴性对照的百分比。面板代表3个实验。

-图6：ICOS-Fc对TRAP染色的影响。如图2所示(T^14-21处理)，用或不用ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)处理从单核细胞分化的MDOC。在第21天，细胞层用快速石榴石GBC基础溶液染色，评估TRAP活性。A)染色区域的显微照片用于监测TRAP阳性细胞(n＝3)。B)条形图显示TRAP⁺细胞的百分比；数据表示为来自3次独立实验的抑制相对于对照的百分比的平均值±SEM(*：相对于对照p<0.01)。

-图7：B7h触发对肌动蛋白重塑的影响。如图2所示(T^14-21处理)，用或不用ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)处理从单核细胞分化的MDOC。A)细胞用异硫氰酸荧光素(FITC)-鬼笔环肽标记的肌动蛋白染色，并在第21天用荧光显微镜拍摄。B)条形图显示核周F肌动蛋白环阳性细胞的百分比；数据表示为相对于对照的来自3个独立实验的增加百分比的平均值±SEM(*：相对于对照p<0.05)。

-图8：B7h触发对破骨细胞溶骨活性的影响。将单核细胞铺板在Osteo表面平板上，并在存在和缺乏ICOS-Fc(1μg/ml)、ICOS-msFc(1μg/ml)或^F119SICOS-Fc(1μg/ml)下诱导分化为破骨细胞，如图2所示(T^14-21处理)。在第21天，收获培养上清液并检测钙释放。数据代表从一式两份进行的4个独立实验的相对于对照的抑制百分比的平均值±SEM。(*：相对于对照p<0.05)。

-图9：在小鼠骨质疏松症模型中用ICOS-Fc治疗的效果。

将1mg/Kg sRANKL连同小鼠100μg/ml ICOS-Fc(msICOS-huFc)(n＝3)或100μg/ml人^F119SICOS-Fc(n＝3)或磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组，n＝3)一起腹膜内(ip)注射至7周龄雌性C57BL/6小鼠，以24小时(hrs)的间隔注射3天。最后一次注射后4小时将小鼠处死。A)不同注射组的胫骨和股骨的未钙化切片的染色。B)显示皮质区域中钙化骨的平均值±SEM％的直方图(**：p<0.01或***：p<0.001，与不接受治疗的对照小鼠相比)。

-图10：ICOS-Fc构建体的氨基酸序列(SEQ ID No.:1)。

-图11：人ICOS的氨基酸序列(SEQ ID No.:29)；加下划线的氨基酸对应于ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:2)。

-图12：人B7h受体的氨基酸序列(SEQ ID No.:27)。

-图13：抗B7h抗体对TRAP染色的影响。用或不用在第14天(T^14-21处理)或在第21天(T^21-24处理)加入的ICOS-Fc(1μg/ml)或α-B7h/eBioscience(1μg/ml)或α-B7h/R&D Systems(1μg/ml)处理MDOC。在第21天，细胞层用快速石榴石GBC基础溶液染色，评估TRAP活性。A)染色区域的显微照片用于评估TRAP阳性细胞。B)数据表示为来自四个不同区域的TRAP⁺细胞百分比的平均值±SEM(*：p<0.05，**：p<0.01，与对照相比)。

-图14：ICOS试剂和抗B7h抗体对MDOC中B7h信号传导的影响。在第21天用或不用A)ICOS-Fc或ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc或B)α-B7h/eBioscience或α-B7h/R&D Systems抗体(5μg/ml)处理分化的MDOC 30分钟。然后，通过蛋白质印迹评估磷酸-p38的表达。还用抗-p38抗体作为对照探测相同的印迹。数据表示为来自3个独立实验的磷酸-p38表达百分比的平均值±SEM(*：相对于对照p<0.05)。

-图15：用ICOS-Fc处理OVX诱导的小鼠骨质疏松症的效果。小鼠经历OVX，24小时后，用ICOS-FC(msICOS-msFc)(n＝3)或PBS(对照组，n＝3)处理4周。A)来自用PBS或ICOS-Fc处理的小鼠的皮质骨的代表性图像。B)在每个小鼠的6个切片(3个切片/腿)中评价的皮层区域中的钙化骨比例的条形图。数据表示为平均值±SEM(**：相对于对照p<0.01)。

具体实施方式

现在将通过非限制性实例，详细描述本发明关于ICOS(B7h受体的天然配体)在治疗骨质疏松症和骨质减少症中的新用途来。

本说明书的范围不限于仅使用ICOS，B7h受体的其他配体(例如抗体、单克隆抗体和基因工程/人源化抗体及其片段)可用于治疗骨质疏松症和骨质减少症，其中这些配体能够减少/抑制破骨细胞分化、成熟和/或功能，从而抑制由能够触发破骨细胞中的B7h受体活性的破骨细胞诱导的骨质流失。

在以下描述中，给出了许多具体细节以提供对实施方案的透彻理解。可以在没有一个或多个具体细节的情况下或者利用其他方法、部件、材料等来实施这些实施方案。在其他情况下，没有详细示出或描述公知的结构、材料或操作，以避免模糊实施方案方面。

本说明书对“一个实施方案”或“实施方案”的提及意味着结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性被包括在至少一个实施方案中。因此，本说明书在各个地方出现的短语“在一个实施方案中”或“在实施方案中”并不一定都指的是相同的实施方案。此外，特定特征、结构或特性可以以任何合适的方式在一个或多个实施方案中组合。

这里提供的标题仅仅是为了方便，并不解释实施方案的范围或含义。

本说明书涉及B7h受体配体在骨质疏松症和骨质减少症的治疗中的新用途，所述配体优选在破骨细胞中能够触发/刺激B7h受体活性。

在一个实施方案中，可用于治疗骨质疏松症和骨质减少症的B7h受体配体选自：

a)具有SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS蛋白；

b)与SEQ ID No.:29所示氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％序列同源性的人ICOS蛋白的同源物；

c)SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS部分，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或天然ICOS蛋白功能的能力；

d)具有SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域；

e)SEQ ID No：2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域部分，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或SEQ ID No.2所示氨基酸序列的功能的能力；或者

f)与SEQ ID No.:2所示氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％序列同源性的人ICOS胞外结构域的同源物，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的功能的能力。

在一个实施方案中，本说明书涉及使用B7h受体作为筛选可用于治疗骨质减少症和骨质疏松症的药物活性剂的靶标，其中药物活性剂干扰破骨细胞分化、成熟和/或功能，结合B7h受体并触发B7h受体活性。

在另一实施方案中，本说明书提供了用于治疗骨质疏松症和骨质减少症的药物组合物，其包含至少一种B7h受体配体和药学上可接受的载体。

在一个实施方案中，药物组合物包含选自以下的至少一种B7h受体的配体：

a)具有SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS蛋白；

d)具有SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域；

e)SEQ ID No：2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域部分，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或SEQ ID No.2所示氨基酸序列功能的能力；或者

在又一个实施方案中，本说明书提供了鉴定适合用于治疗骨质减少症和骨质疏松症的药物活性剂的方法，包括以下步骤：a)提供测试剂，b)使测试剂与表达B7h受体的破骨细胞接触，c)测试所述测试剂降低破骨细胞成熟、分化和/或功能的能力，d)选择降低破骨细胞成熟、分化和/或功能的测试剂作为用于治疗骨质减少症和骨质疏松症的活性剂，其中所述活性剂结合B7h受体并触发B7h受体活性。优选地，所述方法提供了通过破骨细胞、破骨细胞中细胞肌动蛋白细胞骨架组织和/或破骨细胞释放的钙来测量耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的分泌。

在不同的实施方案中，本说明书涉及治疗骨质疏松症或骨质减少症的方法，其包括以下步骤：提供患有骨质疏松症或骨质减少症的患者，向患者施用包含B7h受体配体的药物，从而减轻患者中的骨质疏松症或骨质减少症。

骨重塑是由成骨细胞和破骨细胞管理的复杂过程，免疫系统通过细胞因子和表面受体的活性参与调节这些细胞的功能。

本说明书公开了涉及淋巴细胞/骨细胞相互作用的新途径，通过显示由活化T细胞表达的ICOS与其由破骨细胞表达的配体B7h的结合，抑制破骨细胞成熟和功能。这些作用使用ICOS-Fc(ICOS的重组可溶形式)检测到，并且是特异性的，因为它们不被^F119SICOS-Fc(ICOS-Fc不能结合B7h的突变形式)展示。

在由M-CSF和RANKL驱动的单核细胞向破骨细胞的体外分化期间，通过用ICOS-Fc处理细胞来检测对破骨细胞分化的作用。当在三周分化培养开始时开始处理，ICOS-Fc几乎完全阻断了分化，但当在最后一周开始处理时，其也阻止了分化，如细胞多核性降低和获得性停止(arrest)用ICOS-Fc处理所诱导的破骨细胞形态和表型特征所示。这种作用不是由于细胞毒性，因为即使培养延长第四周，细胞存活也是正常的。

此外，由于在培养的最后一周中断治疗允许细胞重新开始破骨细胞分化路径，所以该作用是可逆的。分化的停止伴随着肌动蛋白细胞骨架的组织改变，在ICOS-Fc处理的细胞中，其在F-肌动蛋白环中显示核周分布，没有极化迹象，典型的是密封区限定了在破骨细胞上检测到的侵蚀性空隙。与这些数据一致，用ICOS-Fc处理的细胞显示出TRAP的表达降低和体外溶骨活性降低。

第二个关键点是ICOS-Fc对已分化的破骨细胞的作用，其中用ICOS-Fc处理引起细胞和细胞核大小的显著减少而对细胞活力没有实质影响。再一次，该作用是可逆的，因为细胞重新放大并在治疗中断时重新恢复破骨细胞表型。

这些对体外破骨细胞分化和功能的作用得到体内结果的支持，表明用ICOS-Fc处理显著抑制了通过用高剂量的可溶性RANKL处理的小鼠中诱导的全身性骨吸收，与在骨密度降低方面的卵巢切除模型相比，其是骨质疏松症的小鼠模型。

免疫系统能够调节骨形成，而骨质流失是几种慢性炎症和自身免疫疾病的共同特征。事实上，在类风湿性关节炎、炎性肠病或系统性红斑狼疮患者中骨质疏松症风险增加，侵袭性局部骨质破坏可能是某些自身免疫性疾病、癌症和感染的特征。

类风湿性关节炎患者表现出三种类型的骨受累：骨质疏松症、关节周围骨质流失和关节糜烂。关节周围骨质丢失和关节糜烂是特定于类风湿性关节炎的并且涉及被自身免疫反应击中的部位。炎性细胞因子例如IL-1、IL-6和TNF-α在滑液和滑膜中丰富，可诱导滑膜成纤维细胞和间质细胞上的RANKL。此外，RANKL在类风湿性关节炎患者的滑膜组织和液体中由T细胞和B细胞表达并且可以参与破骨细胞活化，并且针对类风湿性关节炎标记物瓜氨酸化蛋白质的抗体可能对破骨细胞具有刺激作用。相反，骨质疏松症不是类风湿性关节炎特定的，而是在例如银屑病、强直性脊柱炎、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、炎性肠病、寻常型天疱疮等慢性炎症性疾病中常见的。其在与移植和衰老相关的慢性炎症中也是典型的。在慢性炎症中，骨质疏松症归因于多种因素，包括血液中高水平的炎性细胞因子，并且通常是类固醇治疗。

更年期雌激素缺乏症可能涉及由于去除雌激素对破骨细胞分化和功能的抑制作用而增加的破骨细胞活性，而且增加炎性细胞因子例如TNF-α和IL-17的产生并增加B和T细胞的RANKL表达。

在骨形成的免疫控制中，关键作用已被归于T辅助细胞。Th1和Th2细胞分别分泌IFN-γ和IL-4，它们是抗破骨细胞生成细胞因子。相反，Th17细胞表达高水平的RANKL并分泌IL-17诱导间充质细胞上的RANKL表达和募集炎性细胞。此外，Th17细胞还分泌IL-22，其可诱导成骨细胞分化，增强炎症部位的骨形成。细胞也可以通过使用表面受体起作用，因为它们的CD40L可以刺激基质细胞上的CD40，诱导这些细胞表达RANKL并抑制OPG表达下调RANKL/RANK轴的活性。此外，通过转化生长因子β(TGFβ)的释放和T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的表面表达，还可以通过调节性T细胞(Treg)抑制破骨细胞，T淋巴细胞抗原4能够抑制通过结合单核细胞上表达的其配体B7.1和B7.2并阻止破骨细胞的分化而形成的破骨细胞。这一发现是有趣的，因为CTLA4和ICOS属于CD28家族的共刺激受体并结合属于B7家族的表面受体。此外，ICOS也参与Treg功能，因为在适当的条件下，ICOS触发可以诱导Treg分化和TGFβ从幼稚Th细胞的分泌，并且Treg细胞亚群表达高水平的ICOS。B7h触发破骨细胞所显示的效果似乎比B7.1/B7.2触发所显示的效果更宽，因为它也可逆地抑制分化的破骨细胞的功能。

人B7h受体具有SEQ ID No.:27所示的氨基酸序列。

人ICOS蛋白(B7h受体的天然配体)具有SEQ ID No.:29所示的氨基酸序列。

可用于治疗骨质疏松症和骨质减少症的B7h受体配体可选自天然、合成或重组来源的B7h受体配体，例如ICOS或其部分、小分子化合物、适体、抗体、肽、B7h受体显性阳性，其中这样的配体结合B7h受体并能够触发B7h受体活性。

B7h受体配体可以与一个或多个稳定化分子融合或缀合以降低或防止降解、增加半衰期和/或溶解度、减少毒性和/或免疫原性。

使用能够稳定蛋白质以将其施用于哺乳动物的分子是本领域广泛已知的技术。

可以将B7h受体配体缀合至抗体或抗体片段以增加特异性、药代动力学和/或生物分布，利用与破骨细胞或另一种骨组分特异性结合的抗体特性。

可以选择可以与B7h受体配体结合的稳定化分子，其选自：

-聚乙二醇(PEG)或其衍生物。能够连接存在于B7h受体配体上的氨基的PEG衍生物是环氧化物PEG、醛PEG、硝基苯基碳酸酯PEG和琥珀酰亚胺酯PEG；能够连接存在于B7h受体配体上的巯基的PEG衍生物是邻吡啶基二硫化物PEG；能够连接存在于B7h受体配体上的羟基的PEG衍生物是用N-羟基琥珀酰亚胺或羟基苯并三唑活化的PEG-COOH。其他PEG衍生物由具有pH依赖性水解的PEG-聚缩醛和PEG-糊精(聚合物掩蔽-揭膜蛋白疗法，PUMPT)表示。

-聚-L-赖氨酸柠檬酰胺(通过赖氨酸或乙基氨基甲酸酯间隔物)、苯乙烯马来酸酐和聚羟丙基甲基丙烯酰胺。

-人Fc抗体结构域。

为了增加B7h受体配体向治疗部位的递送，即表达B7h受体的破骨细胞，B7h受体配体也可以被高糖基化或与甘露糖残基缀合。

高糖基化可以通过原位化学反应或位点定向诱变进行，导致N-连接或O-连接的蛋白质糖基化。在N-连接的糖基化中，糖链连接于三肽序列Asn-X-Ser/Thr的天冬酰胺，其中X代表脯氨酸以外的氨基酸。聚唾液酸(PSA)经常用于高糖基化。大分子量PSA适用于输送低分子量药物和肽，而低分子量PSA可用于大蛋白质以及颗粒药物输送系统。

与甘露糖残基的缀合利用缀合物与甘露糖受体的结合，所述甘露糖受体据报道在枯否细胞、巨噬细胞、肺泡、单核细胞衍生的树突细胞以及血管和淋巴内皮细胞的亚群中表达。甘露糖基化蛋白质可被甘露糖特异性凝集素即甘露糖受体和MBP识别。

B7h受体配体的递送也可以利用本领域已知的胶体药物递送系统来增加，其中胶体载体可以选自微粒、纳米颗粒和脂质体。微粒通常由可生物可降解的聚合物例如淀粉、藻酸盐、胶原、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚己内酯(PCL)制成。纳米颗粒通常由天然或合成聚合物如壳聚糖、藻酸盐、PCL、聚乳酸(PLA)、聚(乙交酯)、PLGA制成。脂质体也可以用PEG进行表面修饰，以干扰网状内皮系统的识别和摄取并延长循环时间。而且，原位热敏水凝胶响应于温度的变化而发生溶胶-凝胶相变。

材料和方法

细胞

外周血单核细胞(PBMC)通过密度梯度离心从签署其书面知情同意书的健康捐献者的人血液样品获得。破骨细胞由CD14⁺单核细胞制备，用EasySep^TM人CD14阴性选择试剂盒(cod.19059,StemCells Techologies,Vancouver,BC,Canada)从PBMC分离。具体而言，将0.5×10⁶个单核细胞铺在24孔板(cod.662160,Greiner Bio-One,Capital DriveMonroe,NC,USA)中并在由DMEM(cod.41966-029Invitrogen,Burlington,ON,Canada,USA)、补充有重组人M-CSF(25ng/ml,cod.216-MC,R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)的10％胎牛血清(FBS；cod.10270,Invitrogen)和RANKL(30ng/ml,cod.390-TN,R&D Systems)组成的分化培养基中培养21天。分化培养基每3天更换一次。在不同的时间，用1μg/ml的ICOS-Fc(SEQ IDNo.:1-含有与人IgG1Fc(SEQ ID No.:3)融合的人ICOS胞外部分(SEQ ID No.:2)的融合蛋白)或ICOS-msFc(SEQ ID No.:4-嵌合分子，其含有与小鼠IgG1 Fc(SEQ ID No.:5)融合的人ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:2))处理细胞。使用^F119SICOS-Fc(SEQ ID No.:6-其中携带F119S取代的人ICOS的胞外部分的突变形式(SEQ ID No.:7)与人IgG1Fc(SEQ ID No.:3)融合)和msICOShuFc(SEQ ID No.:24-含有与人IgG1Fc(SEQ ID No.:3)融合的小鼠ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:28)的融合蛋白)进行对照。

ICOS克隆和生产

将人或小鼠ICOS的胞外部分克隆到源自pCDNA3.1/Hygro(+)质粒(cod.V870-20，Invitrogen)的修饰的真核表达载体中，并由Di NiroR.et al.⁶PubMed ID：17678525报道为p-微抗体(pMB-SV5)。该载体与最初的载体的不同之处在于Kozak序列(5’CCACATGG 3’–SEQ ID No.:8)，它是真核生物细胞中翻译起始所必需的；分泌前导序列(5'GCTGGAGCCTGATCCTCCTGTTCCTCGTCGCTGTGGCTACA3'-SEQ ID No：9)，其被引入以允许培养上清液中的蛋白质的释放；小内含子序列(5’GTAAGGGGCTCACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATAT ATGGGTGAC^AATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 3’-SEQ ID No.:10)以增加蛋白质表达水平。引入靶向产生的蛋白质的标签序列，其来源于猿猴病毒-5(SV5标签)(5’GGCAAACCAATCCCAAACCCACTGCTGGGCCTGGATAGTACT3’-SEQ ID No.:11)，并且用于单克隆抗体识别蛋白质。该载体允许分别用具有SEQ ID No.:30和31所示核苷酸序列的免疫球蛋白IgG1(Fc)结构域的人或小鼠恒定片段的编码序列在框内克隆感兴趣的片段。

为了产生ICOS-Fc构建体(SEQ ID NO：1)，编码人ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:12)的核苷酸序列使用以下特异性引物扩增：ICOS正向BsshII引物(5’GGCGCGCATGCCGAAATCAATGGTTCTGCC3’–SEQ ID No.:13,Sigma-Genosys,The Woodlands,TX,USA)和ICOS反向NheI引物(5’GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC3’-SEQ ID No.:14,Sigma-Genosys)。扩增的片段用BssHII(cod.R0199S,New England Biolabs inc,Ipswich,MA,USA)和NheI(cod.R0131S,New England Biolabs inc)进行酶消化。将双重消化的片段克隆到前述的pMB-SV5质粒中。核苷酸序列通过测序确定。

编码ICOS-Fc的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.:21所示。

在ICOS-msFc(SEQ ID No.:4)克隆的情况下，除了pMB-SV5载体含有小鼠Fc结构域的编码序列(SEQ ID No.:31)之外，遵循上述相同的方案。

编码ICOS-msFc的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.:22所示。

为了产生人突变^F119SICOS-Fc构建体(SEQ ID号：6)，用在BseRI消化位点退火的正向引物(5’TCAATTTTTGATCCTCCTCCTTCTAAAGTAACTCTTACAGG3’-SEQ ID No.:15,Sigma-Genosys)和ICOS人反向NheI引物(5’GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC 3’-SEQ ID No.:14,Sigma-Genosys)引入人ICOS的胞外部分中的突变F119S。人突变的^F119SICOS的胞外部分的核苷酸序列如SEQ ID No.:26所示。用BseRI(cod.R0581,New England Biolabs inc)和NheI酶消化后，将突变的片段克隆到具有人Fc结构域的编码序列的pMB-SV5质粒中。

编码^F119SICOS-Fc的表达载体的核苷酸序列如SEQ ID No.:23所示。

为了产生与人Fc(msICOS-huFc)构建体(SEQ ID No.:24)融合的小鼠ICOS，用以下特异性引物扩增编码小鼠ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:16)的核苷酸序列：ICOS小鼠正向BsshII引物(5’TTGGCGCGCATGCCGAAATCAATGGCTCGGCCGATC 3’–SEQ ID No.:17,Sigma-Genosys)和ICOS小鼠反向NheI引物(5’CTAGCTAGCTAGCCAGAGCTTCAGCTGGC 3’–SEQ ID No.:18,Sigma-Genosys)。用于克隆的载体是具有小鼠Fc结构域的编码序列的pMB-SV5。

编码msICOS-huFc的表达载体的核苷酸序列示于SEQ ID No.:25。

将质粒DNA转化入OneTOP10化学感受态大肠杆菌细菌细胞(大肠杆菌；cod.C4040-03,Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)。使用以下特异性引物筛选所得的菌落：P-潮霉素正义链(5’CTGCTTACTGGCTTATCG 3’–SEQ ID No.:19,Sigma-Genosys)和P-潮霉素反义链(5’CAGATGGCTGGCAACTAG 3'–SEQ ID No.:20,Sigma-Genosys)，并通过测序确认构建体。最后，使用FreeStyle^TM MAX试剂(cod.16447100,Life technologies)将质粒DNA转染到中国仓鼠卵巢悬浮细胞系(CHO-s)(cod.R8/00-07,Invitrogen)中。由于载体中存在潮霉素抗性，获得了稳定的克隆；为此，以0.2mg/ml的浓度用潮霉素-B(cod.10687-010,Invitrogen)进行选择使克隆生长，这允许完全选择转染的细胞。细胞在无血清IMDM培养基(cod.BE12-915F01,Lonza,Basel,Switzerland)中生长，使用Protein G Sepharose^TM4快速流动柱(cod.17-0618-01，GE Healthcare，Piscataway Township，NJ，USA)纯化无血清培养上清液。

免疫荧光

使用针对CD14(cod.21270146,Immunotools,Friesoythe,Germany)、组织蛋白酶-K(cod.BS1611R-FITC,Bioss Inc.,Woburn,MA,USA)和B7h(cod.FAB165P,R&D Systems)的适当FITC-、PE-和APC缀合的单克隆抗体(mAb)，通过免疫荧光和流式细胞术(BD,Bioscience,San Diego,CA,USA)评估破骨细胞的表型。使用FIX和PERM试剂盒(cod.GAS003,Invitrogen)按照制造商的说明在细胞透化后评估组织蛋白酶-K的水平。

对用4％多聚甲醛(cod.76240,Sigma-Aldrich,Saint Louis,MO,USA)固定在玻璃盖玻片上的细胞进行肌动蛋白染色，洗涤，然后用含有5％FBS、1％牛血清白蛋白(BSA,cod.05479-250G,Sigma-Aldrich)和0.1％Triton X-100(cod.T9284,Sigma-Aldrich)的溶液在室温下透化1小时。然后，在0.1％Triton X-100、1％BSA、2％FBS的溶液中用FITC缀合的鬼笔环肽(cod.F432,Invitrogen)对盖玻片染色。2小时后，细胞用PBS加0.1％Triton X-100洗涤10分钟，用相差显微镜Axiovert 40CFL(Carl Zeiss,Oberkochen,Germany)观察，用Retiga 200R数码相机(QImaging,Surrey,BC,Canada)拍摄，并用Image Pro Plus软件进行显微成像分析(Media Cybernetics,version5.0,Bethesda,MD,USA)。

耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)测定

使用由25％柠檬酸盐溶液(柠檬酸18mmol/l，柠檬酸钠9mmol/l，氯化钠12mmol/l，pH3.6)、65％丙酮和10％甲醛组成的商业试剂盒(cod.387A-1KT,Sigma-Aldrich)，在37％下评估固定于玻璃盖玻片上的细胞上TRAP活性约30秒。然后，用去离子水洗涤盖玻片，用快速石榴石GBC基础溶液(7mg/ml,Sigma-Aldrich)染色，并通过造影剂相显微镜观察。用成像系统(Image-Pro Plus)分析TRAP阳性。

钙释放测定

将单核细胞(0.5×10⁶)铺在24孔Osteo Assay表面培养板(cod.CLS3987,CorningInc.,Corning,NY,USA)上，如上所述分化成MDOC，在第14天加入ICOS试剂。培养21天，洗涤细胞并用新鲜培养基温育另外24小时。然后收集上清液，通过钙比色测定试剂盒(cod.MAK022-1KT,Sigma-Aldrich)评估钙水平。

体内分析

将可溶性RANKL(cod.GWB-P0945I,GenWay Biotech.Inc,San Diego,CA,USA；1mg/kg)单独或与100μg msICOS(含有与人IgG1Fc(SEQ ID No.:3)融合的小鼠ICOS的胞外部分(SEQ ID No.:28)的融合蛋白)或^F119SICOS-Fc的组合每天腹腔内注射入7周龄C57BL/6雌性小鼠(cod.057,Harlan Laboratories,Indianapolis,IN,USA)，共3天，如Tomimori Y.etal.⁷报道的。对照小鼠注射PBS或100μg ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc，但不注射RANKL。最后一次注射后4小时处死小鼠，收集血液样品、胫骨和股骨用于分析。在健康科学部的动物设施中在无病原体的条件下饲喂小鼠，并按照大学伦理委员会进行处理。

在室温下将胫骨和股骨样品固定在浓的中性缓冲福尔马林中2天，该福尔马林在PBS pH 6.9(cod.F0033,Diapth,Martinengo,BG Italy)中被稀释至4％并用升高浓度的乙醇(cod.02860-2.5L,Sigma-Aldrich)脱水过夜，然后在甲基丙烯酸甲酯(MMA)单体(cod.8005902500,Merck,Darmstadt,Germany)中进行三步浸渍至少3天。为了包埋，将样品块在真空下在无盖的小瓶中的80％(体积/体积)稳定的MMA、20％(体积/体积)Plastoid N(cod.5866,Rohm Pharma,Germany)中浸渍2小时并且在37℃嵌入加盖的10mL玻璃瓶(水浴，cod.BR778012,Sigma-Aldrich)中过夜。聚合后，将玻璃小瓶取出，并在具有旋转金刚石锯片的Leica SP 1600锯切片机(用于显微分析的硬质材料的高质量样品制备)上切割润湿部分(50mm)，并安装在聚乙烯载玻片上。在骨的长轴上进行切割，并使用浅绿色(cod.1159410025,Merck)和碱性品红(cod.47860,Sigma-Aldrich)对切片进行染色以进行组织学评估。然后由不知道材料身份的研究者对组织形态学和形态学进行检查。这些测量使用光学显微镜进行，并用Leica成像软件(DFC320Leica数码相机和Leica QWin Plusv2.6软件)进行分析。所有测量均在20×的放大倍数下进行。皮质骨形态包括组织体积，髓体积(Me.v)和骨体积(Bv＝组织体积-Me.v)。还测量了皮质内和骨膜骨表面。

蛋白质印迹

在T21时将MDOC用ICOS-Fc或ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc或两种不同的抗B7h抗体：抗人B7h(cod.BMS16-5889-82,eBioscience,Inc.San Diego,CA,USA；克隆MIH12)和抗人B7h(cod.MAB1651,R&D Systems；克隆136716)处理。

在50mM Tris-HCl pH 7.4、150mM NaCl(cod.S7653Sigma-Aldrich)、5mM EDTA(cod.E6758 Sigma Aldrich)、1％NP-40(cod.74385Sigma-Aldrich)中用磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物(cod.P2850和cod.P8340,Sigma-Aldrich)裂解MDOC。然后，将30μg蛋白质在10％SDS PAGE凝胶上运行并转移到Hybond-C额外的硝酸纤维素膜(cod.10600016,GeHealthcare,Piscataway,NJ,USA)上。然后用针对磷酸-p38-MAPK(cod.9211,CellSignaling Technology,Danvers,MA,USA)和p38-MAPK(cod.9212,Cell SignalingTechnology)的抗体探测该膜，之后用抗兔HRP-缀合的二抗(cod.A0545,Sigma-Aldrich)探测该膜。使用VersaDoc成像系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA,USA)通过化学发光检测条带，并使用Multi-Analyst软件(版本1.1,Bio-Rad Laboratories)进行密度测定分析。

卵巢切除术

在用(60mg/kg)和(20mg/kg)的混合物腹膜内麻醉的6/8周龄雌性C57BL/6小鼠中进行双侧卵巢切除术(OVX)。手术后一天，小鼠用七次腹膜内注射(每4天1次，持续4周)PBS或msICOS-msFc(400μg)处理。在最后一次注射后4天将它们处死，收集器官和骨头用于分析。

数据分析

使用ANOVA和Dunnett's检验进行统计分析。p<0.05被认为是显著的。用GraphPadInstat软件(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)进行统计分析。

结果

B7h在破骨细胞中的表达

通过在含有M-CSF和RANKL的分化培养基中培养CD14⁺单核细胞21天来获得单核细胞来源的破骨细胞(MDOC)。为了评估MDOC分化和监测B7h表达，在MDOC分化培养的开始(第0天，T0)和结束(第21天，T21)和中间第14天(T14)，本发明人通过光学显微镜评估细胞形态和通过三色免疫荧光和流式细胞术评估表面CD14、标记单核细胞、细胞内组织蛋白酶-K、标记破骨细胞和B7h的表达(图1)。

B7h触发对破骨细胞分化的影响

由于B7h在MDOC分化培养过程中表达，本发明人使用ICOS-Fc评价了B7h触发对MDOC分化的影响。为了评估ICOS作用的特异性，还用不能结合B7h的ICOS的突变形式^F119SICOS-Fc或其中人ICOS与小鼠Fcγ部分融合以最小化与人Fcγ受体的相互作用的ICOS-msFc处理细胞。通过将ICOS试剂添加至分化培养基，在培养的T0或T14开始分化MDOC的处理。继续培养到T21进行T^0-21和T^14-21处理。

结果显示用ICOS-Fc或ICOS-msFc的T^0-21处理有效抑制MDOC分化。在第10天(T10)细胞显示圆形，在T21时，它们获得纺锤形的形态；而且，它们表现出标记破骨细胞分化的缺陷性CD14下调和组织蛋白酶-K上调。相比之下，用^F119SICOS-Fc处理的细胞没有显示与未处理的细胞的任何差异，这表明向MDOC形态和表型的典型进展(图2)。

用ICOS-Fc或ICOS-msFc的T^14-21处理显示MDOC分化显著减慢，因为在T21时，细胞显示出细胞大小减少和细胞核固缩；粘附到培养孔的能力降低；仅有一个细胞核的细胞数量增加，与未处理的细胞相比，具有>3个细胞核的细胞数目减少；和缺陷性组织蛋白酶-K上调，尤其是CD14下调。此外，几个细胞显示出在未经处理的细胞中未检测到的星形形态。相比之下，用^F119SICOS-Fc处理的细胞与未处理的细胞相似(图3)。

为了评估ICOS-Fc作用的可逆性，在第7天(T7)用ICOS-Fc、ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc处理细胞，在T14洗涤细胞，然后在存在(T^7-21处理)或缺乏(T^7-14处理)ICOS-Fc、ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc的情况下温育至T21。结果显示，用ICOS-Fc或ICOS-msFc的T^7-21处理诱导了与上述T^14-21处理相似的形态和表型。用^F119SICOS-Fc处理的细胞与未处理的细胞没有显示任何差异。相比之下，T^7-14处理诱导的形态和表型与未处理的细胞所显示的合并(图4)。

B7h触发对分化的破骨细胞的影响

已经分化的MDOC的处理通过在T21用ICOS试剂处理细胞并在3天后分析(T24)以进行T^21-24处理来进行。结果显示，与未处理的细胞相比，用ICOS-Fc或ICOS-msFc的T^21-24处理诱导细胞和细胞核大小显著减少，并且降低了组织蛋白酶-K的表达。台盼蓝拒染试验分析细胞活力，表明细胞是活的。相比之下，用^F119SICOS-Fc的T^21-24处理没有显示出任何影响(图5)。

为了评估ICOS作用的可逆性，将T^21-24处理的细胞在T24洗涤，并在不存在ICOS-Fc的情况下在分化培养基中温育1(T25)或4天(T28)。结果显示，用ICOS-Fc或ICOS-msFc处理，然后在没有ICOS-Fc的情况下生长的细胞在T25开始扩大并上调组织蛋白酶-K，并在T28显示出MDOC样形态，与未处理的细胞所显示的合并(图5)。台盼蓝拒染试验分析细胞活力，表明细胞是活的。相比之下，未经处理或用^F119SICOS-Fc处理的细胞在T25和T28保持其形态和表型。

B7h触发对破骨细胞功能的影响

由于破骨细胞的骨溶解活性与其分泌含多种裂解酶(包括TRAP)的胞质内颗粒的含量有关，本发明人通过TRAP酶测定法评估了用ICOS试剂的T^14-21处理对TRAP表达的影响。结果显示，用ICOS-Fc或ICOS-msFc处理的MDOC表现出比未处理的细胞和用^F119SICOS-Fc处理的细胞在TRAP⁺细胞数量和其染色强度方面的TRAP活性更低。该结果在具有>3个细胞核的细胞中最明显(图6)。

由于破骨细胞功能的关键方面是细胞骨架组织以在由密封区域限定的侵蚀区域处形成皱褶边界，本发明人通过用FITC-鬼笔环肽对T^14-21处理的MDOC细胞的细胞内染色，分析了ICOS试剂对细胞肌动蛋白组织的影响。结果显示，在未经处理的MDOC中，肌动蛋白被具有典型的密封区域的模式极化，该密封区域限定破骨细胞的侵蚀性空隙。相比之下，在用ICOS-Fc或ICOS-msFc处理的细胞中，肌动蛋白在典型的没有极化迹象的F-肌动蛋白环中显示核周分布。用^F119SICOS-Fc处理的细胞显示出与未处理的细胞类似的模式(图7)。

为了评估ICOS对MDOC的溶骨活性的影响，本发明人评估了它们在体外促进从结晶磷酸钙释放钙的能力。使用T^14-21方案，在存在和不存在ICOS试剂的情况下，在用由模拟活的骨材料的无机结晶磷酸钙制成的合成表面包被的孔中诱导MDOC分化。在T21时，将细胞洗涤并在新鲜培养基中再培养24小时，然后使用比色测定法在培养上清液中评估钙的释放。结果显示，与未处理的MDOC相比，用ICOS-Fc或ICOS-msFc的T^14-21处理显著降低钙释放，而^F119SICOS-Fc没有显示任何作用(图8)。

最后，本发明人使用通过用高剂量的可溶性RANKL处理小鼠诱导的骨质疏松症模型评估体内B7h触发的影响。将RANKL(1mg/kg)单独或与msICOS-huFc(由小鼠ICOS和人Fc形成)或者^F119SICOS-Fc(100μg/小鼠)的组合每天腹膜内注射至雌性C57BL/6小鼠(7周龄)，共3天。最后一次注射后4小时将小鼠处死。用品红和浅绿染色的胫骨的组织学分析显示注射RANKL的小鼠中明显的骨质流失，其通过与msICOS-huFc的协同处理被显著抑制，但是与^F119SICOS-Fc的协同处理不显著抑制(图9)。

抗B7h抗体引起的B7h触发对TRAP染色的影响

本发明人使用两种不同的抗B7h抗体(α-B7h/eBioscience和α-B7h/R&D Systems)评估了B7h触发对分化(T^14-21处理)和已经成熟的(T^21-24处理)MDOC(其被染色用于TRAP)的影响。T^14-21处理显示，未处理的MDOC以密集的TRAP染色呈现为巨细胞。用α-B7h/eBioscience的处理表现出对MDOC分化的显著抑制作用，与用ICOS-Fc获得的结果相比，多核TRAP阳性细胞的形成减少。相比之下，用α-B7h/R&D Systems的处理表现出最小的抑制作用。T^21-24处理显示未处理的MDOC以密集的TRAP染色呈现为巨细胞。用α-B7h/eBioscience的处理与用ICOS-Fc获得的结果相比表现出MDOC大小的显著抑制和多核TRAP阳性细胞的阳性降低。相反，用α-B7h/R&D Systems的处理则没有抑制作用。结果如图13所示。

B7h触发对MDOC信号传导的影响

为了研究B7h配体对MDCO分化和活性的抑制作用是否与它们对B7h的激动活性相关，本发明人评估了它们对作为MDOC中p38磷酸化的诱导进行评估的B7h信号传导的作用。在T21在不存在和存在ICOS-Fc或ICOS-msFc或^F119SICOS-Fc或α-B7h/eBioscience或α-B7h/R&D Systems(5μg/ml)的情况下处理MDOC 30分钟，然后通过蛋白质印迹评估磷酸-p38MAPK的表达水平；作为对照评估总p38MAPK的表达。结果显示，与未处理的细胞相比，磷酸-p38通过用ICOS-Fc和ICOS-msFc处理而上调，但用^F119SICOS-Fc处理不上调。用抗B7h抗体获得的结果显示磷酸-p38通过用α-B7h/eBioscience处理而上调，处于与用ICOS-Fc获得的水平相当的水平。相比之下，用α-B7h/R&D的处理显示出最小的效果。结果如图14所示。

ICOS-Fc处理在慢性骨质疏松小鼠模型中的作用

6/8周龄雌性C57BL/6小鼠接受OVX，24小时后，腹膜内注射PBS或总小鼠ICOS-Fc(由小鼠ICOS和小鼠Fc形成)，每4天一次，用持续4周。最后一次注射后4天将小鼠处死。矿化骨组织的形态测量结果显示注射PBS的小鼠中显著的骨质流失，并且ICOS-Fc处理显著抑制了骨质流失。结果如图15所示。

自然地，本发明的原理保持不变，在不脱离本发明的范围的情况下，对于仅以示例的方式描述和示出的内容，构造和实施方案的细节可以进行宽泛地变化。

参考文献

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7.Tomimori et al.Evaluation of pharmaceuticals with a novel 50-houranimal model of bone loss.J Bone Miner Res.2009；24:1194-205.

Claims

1.B7h受体配体，用于治疗患有骨质减少症或骨质疏松症的个体。

2.根据权利要求1所述的用于治疗的B7h受体配体，其中所述配体选自：

a)具有SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS蛋白；

c)SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS部分，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或功能的能力；

d)具有SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域；

f)与SEQ ID No.:2所示氨基酸序列具有至少80％、优选至少90％序列同源性的人ICOS胞外结构域的同源物，其具有结合B7h受体并抑制破骨细胞分化、成熟和/或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的功能的能力。

3.根据权利要求1或2所述的用于治疗的B7h受体配体，其中所述配体为可溶性形式。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用于治疗的B7h受体配体，其中所述配体通过注射、输注施用。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的用于治疗的B7h受体配体，其中所述配体与稳定分子融合或缀合。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的用于治疗的B7h受体配体，其中所述配体被高糖基化或缀合至甘露糖残基。

7.B7h受体作为筛选用于治疗骨质减少症或骨质疏松症的药物活性剂的靶标的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述药物活性剂干扰破骨细胞的分化、成熟和/或功能。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述药物活性剂结合B7h受体。

10.药物组合物，其包含用于治疗骨质疏松症和骨质减少症的至少一种B7h受体配体和药学上可接受的载体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中所述B7h受体的至少一种配体选自：

a)具有SEQ ID No.:29所示氨基酸序列的人ICOS蛋白；

d)具有SEQ ID No.:2所示氨基酸序列的人ICOS胞外结构域；或者

12.鉴定适合用于治疗骨质减少症或骨质疏松症的药物活性剂的方法，包括以下步骤：

a)提供测试剂，

b)使测试剂与表达B7h受体的破骨细胞接触，

c)测试所述测试剂降低破骨细胞成熟、分化和/或功能的能力，

d)选择降低破骨细胞成熟、分化和/或功能的测试剂作为用于治疗骨质减少症和骨质疏松症的活性剂，其中所述活性剂结合B7h受体。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述测试步骤c)包括通过破骨细胞、破骨细胞中细胞肌动蛋白组织和/或破骨细胞的钙释放来测量耐酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)的分泌。

14.一种治疗骨质疏松症或骨质减少症的方法，包括以下步骤：提供患有骨质疏松症或骨质减少症的患者，向所述患者施用包含B7h受体配体的药物，从而减轻所述患者中的骨质疏松症或骨质减少症。