JP2018515586A - 骨減少症および骨粗鬆症の治療におけるＢ７ｈ受容体のリガンド - Google Patents

Abstract

骨粗鬆症または骨減少症の治療におけるＢ７ｈ受容体のリガンドの新規な使用、および骨粗鬆症または骨減少症の治療において有用な薬理活性剤のスクリーニングのためのターゲットとしてのＢ７ｈ受容体の使用が開示される。

Description

本発明は、骨減少症および骨粗鬆症の治療におけるＢ７ｈ受容体のリガンドの新規な使用に関する。

破骨細胞は、単球‐マクロファージ前駆体の細胞間融合によって形成される巨細胞であり、多核、豊富な液胞およびリソソームによって特徴付けられる。破骨細胞は、骨の発達およびリモデリング（再構築）において重要な役割を果たし、そこには、骨芽細胞および骨細胞も関わる。破骨細胞は、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ‐ＣＳＦ）および核因子ｋ‐Ｂリガンドの受容体アクチベータ（ＲＡＮＫＬ）の影響下、単球から分化する。

破骨細胞の機能は、ＲＡＮＫＬが、破骨細胞の膜上に発現する核因子カッパＢの受容体アクチベータ（ＲＡＮＫ）をトリガすることによって、刺激される。健康な骨においては、ＲＡＮＫＬの主要な起源は、骨吸収因子に応答する表面受容体として発現する骨芽細胞であり、それは、メタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって可溶性分子（ｓＲＡＮＫＬ）に分解する。さらに、ＲＡＮＫＬは、炎症中に、破骨細胞機能をサポートし得るストローマ細胞、リンパ球およびマクロファージによっても発現する。オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬの可溶性受容体であり、骨芽細胞およびストローマ細胞によって分泌され、ＲＡＮＫの刺激およびＲＡＮＫＬにより誘導される破骨細胞形成を抑制する。Ｍ‐ＣＳＦが、破骨細胞前駆細胞にあるそのコロニー刺激因子１受容体（ｃ‐ｆｍｓ）に結合すると、これらの細胞におけるＲＡＮＫの発現をアップレギュレーション（上向き調節）し、破骨細胞形成を促進する。破骨細胞の分化には、波打ち膜の形成を伴う細胞の極性化と、封鎖帯（ｓｅａｌｉｎｇ ｚｏｎｅ）、または明帯を形成するための破骨細胞の骨への封鎖とが含まれ、封鎖帯は、吸収窩を周囲から分離する。これは、骨の無機成分の脱灰および骨の有機成分の加水分解に導く、酸、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、カテプシンおよびＭＭＰの分泌部位である。次に、カップリングメカニズムが、吸収窩において、骨芽細胞の分化およびリクルートメントを促進し、吸収窩において、それらは、骨の有機成分を分泌し、その後、骨の有機成分は、ハイドロキシアパタイトにより石灰化される。マトリックス内に埋め込まれた一部の骨芽細胞が、骨細胞になり、骨芽細胞の機能を抑制し、リモデリングサイクルを終了させるスクレロスチンを分泌する。骨細胞が機械的な力にさらされると、スクレロスチンの発現が抑制され、これは、骨のリモデリングを最大ひずみ領域にターゲットする。

過剰な破骨細胞の活性は、病的な骨量減少につながり、過剰な破骨細胞の活性は、骨粗鬆症、関節リウマチおよび他の自己免疫疾患等の状態において検出され得る。この場合における、重要な役割は、炎症性サイトカインおよび獲得免疫であるとみられている。さらに、多発性骨髄腫等の免疫細胞が関わる一部の腫瘍は、ストローマ細胞、およびおそらくは骨髄腫細胞によるＲＡＮＫＬの高発現が原因とされる強度の限局性骨びらんによって特徴付けられる。固形癌の骨転移も、溶骨性である可能性があり、前立腺癌は、ＲＡＮＫＬの可溶性の形態の発現を通して、骨吸収を促進する可能性がある。

ＴＮＦ‐α、インターロイキン（ＩＬ）‐１、ＩＬ‐６およびＭ‐ＣＳＦ等のいくつかの炎症性サイトカインは、ＲＡＮＫＬの発現をアップレギュレーションし、破骨細胞の機能を刺激する。重要な役割は、骨芽細胞および滑膜細胞におけるＲＡＮＫＬの発現を誘導するＩＬ‐１７を分泌するタイプ１７Ｔヘルパー（Ｔｈ１７）細胞が、果たしている。さらに、ＩＬ‐１７は、骨の損傷に寄与し、サイトカインおよび破骨細胞の分化と活性をサポートする他の炎症性分子を生成するいくつかのタイプの免疫細胞のリクルートメントをサポートする。

Ｂ７ｈ（ＣＤ２７５、Ｂ７Ｈ２、Ｂ７‐ＲＰ１、ＩＣＯＳＬ、ＧＬ５０としても知られる）は、表面受容体のＢ７ファミリーに属し、Ｂ７ｈは、ＣＤ２８ファミリー^１−５に属するＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）に結合する。ＩＣＯＳが、活性化されたＴ細胞によって選択的に発現されるのに対し、Ｂ７ｈは、Ｂ細胞、マクロファージ、樹状細胞およびＴ細胞のサブセットを含む様々な細胞タイプによって発現される。しかしながら、Ｂ７ｈは、また、血管内皮細胞、上皮細胞、および線維芽細胞等の非造血起源の細胞によって、並びに多くの原発性腫瘍および腫瘍細胞株においても発現される。Ｂ７ｈの主な既知の機能は、ＩＣＯＳのトリガであり、それは、活性化されたＴ細胞のサイトカインの分泌を調節することによって、特に、インターフェロン（ＩＦＮ）‐γ（ヒトにおける）、ＩＬ‐４（マウスにおける）並びにＩＬ‐１０、ＩＬ‐１７およびＩＬ‐２１（当該両方の種）の分泌を増加させることによって、活性化されたＴ細胞のための共刺激分子として機能する。しかしながら、最近の報告によると、Ｂ７ｈとＩＣＯＳとの相互作用が、Ｂ７ｈを発現させる細胞の応答も調節可能な双方向シグナルをトリガできることが示された。マウスの樹状細胞においては、このＢ７ｈが介在する「リバースシグナリング」は、ＩＬ‐６の分泌の顕著な増加と共に、部分的な成熟を誘導する。ヒトの樹状細胞においては、これが、サイトカインの分泌を調節し、クラスＩ ＭＨＣ分子において、エンドサイトーシス抗原をクロスプレゼンテーションする能力を促進し、並びに内皮細胞への接着および遊走を抑制することが見出された。Ｂ７ｈ刺激は、また、内皮細胞および腫瘍細胞株の接着性および遊走性を抑制する。これらの効果には、内皮細胞におけるＥＲＫおよびｐ３８のリン酸化の減少、内皮細胞および腫瘍細胞におけるＦＡＫのリン酸化の減少並びにβ‐Ｐｉｘの下向き調節が伴う。最後に、Ｂ７ｈトリガは、ＮＯＤ‐ＳＣＩＤ‐ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌマウスに、ＣＦ‐ＰＡＣ１細胞を注入した際、およびＣ５７ＢＬ／６マウスに、Ｂ１６‐Ｆ１０細胞を注入した際に、肺転移の進展を抑制する。
［発明の目的および概要］

本説明は、破骨細胞におけるＢ７ｈ受容体の発現、並びに、破骨細胞の分化、成熟および／または活性の低減および／または抑制をトリガするＢ７ｈ受容体に関する。

本発明の目的は、骨粗鬆症または骨減少症の治療のための新規な化合物を提供することにある。

本発明によると、上記目的は、以降の特許請求の範囲に記載された方法により達成され、特許請求の範囲は、本説明の不可欠な部分を形成するものとして理解される。

一実施形態において、本開示は、骨粗鬆症および骨減少症の治療におけるＢ７ｈ受容体のリガンドの新規な使用について開示する。

さらなる実施形態において、本説明は、骨減少症および骨粗鬆症の治療に有用な薬理活性剤のスクリーニングのためのターゲットとしてのＢ７ｈ受容体の使用に関するものであり、薬理活性剤は、破骨細胞の分化、成熟および／または機能を阻害し、それにより、破骨細胞形成を抑制する。

ここより、本発明は、添付図面を参照して、専ら例示として説明される。
単球由来の破骨細胞（ＭＤＯＣ）における形態学的分析並びにＣＤ１４、Ｂ７ｈおよびカテプシン‐Ｋの発現。Ａ）Ｍ‐ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ）およびＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ）の存在下において培養された細胞が、０日目（Ｔ０）、１４日目（Ｔ１４）および２１日目（Ｔ２１）に、位相差顕微鏡によって撮影された。Ｂ）ＭＤＯＣにおけるＣＤ１４、Ｂ７ｈおよびカテプシン‐Ｋの発現は、Ｔ０、Ｔ１４およびＴ２１に、フローサイトメトリによって評価された。各パネルの数字は、陽性細胞の割合を示す。パネルは、５つの実験を表わす。 破骨細胞の分化に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果。単球は、０日目に加えられたＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下において、ＭＤＯＣへの分化を誘導された（Ｔ^０‐２１処理）。Ａ）細胞は、Ｔ１０およびＴ２１に、位相差顕微鏡によって撮影された。Ｂ）ＭＤＯＣにおけるＣＤ１４およびカテプシン‐Ｋの発現は、Ｔ１０およびＴ２１に、フローサイトメトリによって評価された。各パネルの数字は、インターナルネガティブコントロールに対する陽性細胞の割合を示す。パネルは、５つの実験を表わす。 破骨細胞の分化に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果。単球は、１４日目から加えられたＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下において、ＭＤＯＣへの分化を誘導された（Ｔ^{１４‐２１}処理）。Ａ）細胞は、Ｔ２１に、位相差顕微鏡によって撮影された。 Ｂ）ＭＤＯＣにおけるＣＤ１４およびカテプシン‐Ｋの発現は、Ｔ２１に、フローサイトメトリによって評価された。各パネルの数字は、インターナルネガティブコントロールに対する陽性細胞の割合を示す。パネルは、３つの実験を表わす。Ｃ）棒グラフは、２１日目に、各フィールドで計数された核の数（５つのフィールドからの平均）を示す。データは、３つの独立した実験からの平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０１）。 破骨細胞の分化に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果。単球は、７日目から加えられたＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下において、ＭＤＯＣへの分化を誘導された（Ｔ^７‐２１およびＴ^７‐１４処理）。Ａ）細胞は、Ｔ２１に、位相差顕微鏡によって、撮影された。Ｂ）ＭＤＯＣにおけるＣＤ１４およびカテプシン‐Ｋの発現は、Ｔ２１に、フローサイトメトリによって評価された。各パネルの数字は、インターナルネガティブコントロールに対する陽性細胞の割合を示す。パネルは、３つの実験を表わす。 分化した破骨細胞に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果。分化培養から２１日後、ＭＤＯＣは、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下において、さらに３日間培養（Ｔ^{２１‐２４}処理）され、洗浄後、さらに４日間（Ｔ２５‐Ｔ２８）培養された。Ａ）細胞は、Ｔ２４、Ｔ２５およびＴ２８に、位相差顕微鏡によって撮影された。Ｂ）ＭＤＯＣにおけるＣＤ１４およびカテプシン‐Ｋの発現は、Ｔ２４、Ｔ２５およびＴ２８に、フローサイトメトリによって評価された。各パネルの数字は、インターナルネガティブコントロールに対する陽性細胞の割合を示す。パネルは、３つの実験を表わす。 ＴＲＡＰ染色に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果。単球から分化したＭＤＯＣは、図２で記載の通り、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）を用いて、または用いないで処理された（Ｔ^{１４‐２１}処理）。２１日目に、細胞層が、ファーストガーネットＧＢＣベース溶液で染色され、ＴＲＡＰ活性が評価された。Ａ）ＴＲＡＰ陽性細胞（ｎ＝３）をモニタリングすべく、染色領域のマイクロ写真が、撮られた。Ｂ）棒グラフは、ＴＲＡＰ^＋細胞の割合を示す。データは、３つの独立した実験からの、コントロールに対する抑制の割合を平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０１）。 アクチンリモデリングに対するＢ７ｈのトリガの効果。単球から分化したＭＤＯＣは、図２で記載の通り、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）を用いて、または用いないで処理された（Ｔ^{１４‐２１}処理）。Ａ）細胞は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）‐ファロイジンマーキングアクチンを用いて染色され、２１日目に、蛍光顕微鏡で撮影された。Ｂ）棒グラフは、核周囲のＦアクチンリング陽性細胞の割合を示す。データは、３つの独立した実験からの、コントロールに対する増加の割合を平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０５）。 破骨細胞の溶骨作用に対するＢ７ｈのトリガの効果。単球が、オステオサーフェスプレートに播種され、図２で記載の通り、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（１μｇ／ｍｌ）または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）の存在下および不存在下において、破骨細胞への分化が誘導された（Ｔ^{１４‐２１}処理）。２１日目に、培養上清が採取され、カルシウム放出について調べられた。データは、２連で行われた４つの独立した実験からの、コントロールに対する抑制の割合を平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０５）。 骨粗鬆症のマウスモデルにおけるＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理の効果。 生後７週の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ｓＲＡＮＫＬ １ｍｇ／Ｋｇを、マウスＩＣＯＳ‐Ｆｃ（ｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃ）（ｎ＝３）１００μｇ／ｍｌ、またはヒト^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（ｎ＝３）１００μｇ／ｍｌ、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、コントロールグループ、ｎ＝３）のいずれかと共に、３日間にわたり、２４時間間隔で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスは、最後の注射から４時間後に殺された。Ａ）異なる注射がされたグループにおける、脛骨および大腿の非脱灰断面の染色。Ｂ）ヒストグラムは、皮質領域における石灰化した骨の割合の平均値±ＳＥＭを示す（処理を受けないコントロールマウスに対し、＊＊：ｐ＜０．０１または＊＊＊：ｐ＜０．００１）。 骨粗鬆症のマウスモデルにおけるＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理の効果。 生後７週の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスに、ｓＲＡＮＫＬ １ｍｇ／Ｋｇを、マウスＩＣＯＳ‐Ｆｃ（ｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃ）（ｎ＝３）１００μｇ／ｍｌ、またはヒト^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（ｎ＝３）１００μｇ／ｍｌ、またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、コントロールグループ、ｎ＝３）のいずれかと共に、３日間にわたり、２４時間間隔で、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスは、最後の注射から４時間後に殺された。Ａ）異なる注射がされたグループにおける、脛骨および大腿の非脱灰断面の染色。Ｂ）ヒストグラムは、皮質領域における石灰化した骨の割合の平均値±ＳＥＭを示す（処理を受けないコントロールマウスに対し、＊＊：ｐ＜０．０１または＊＊＊：ｐ＜０．００１）。 ＩＣＯＳ‐Ｆｃコンストラクトのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：１）。 ヒトＩＣＯＳのアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２９）。下線付きのアミノ酸が、ＩＣＯＳの細胞外部分（配列ＩＤ番号：２）に対応する。 ヒトＢ７ｈ受容体のアミノ酸配列（配列ＩＤ番号：２７）。 ＴＲＡＰ染色に対する抗Ｂ７ｈ抗体の効果。ＭＤＯＣは、１４日目（Ｔ^{１４‐２１}処理）または２１日目（Ｔ^{２１‐２４}処理）において、加えられたＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）またはα‐Ｂ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（１μｇ／ｍｌ）またはα‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いて、または用いないで処理された。２１日目に、細胞層は、ファーストガーネットＧＢＣベース溶液を用いて染色され、ＴＲＡＰ活性を評価した。Ａ）ＴＲＡＰ陽性細胞を評価すべく、染色領域のマイクロ写真が撮られた。Ｂ）データは、４つの異なるフィールドからのＴＲＡＰ^＋細胞の割合を平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ＜０．０１）。 ＭＤＯＣにおけるＢ７ｈシグナル伝達に対するＩＣＯＳ試薬および抗Ｂ７ｈ抗体の効果。分化したＭＤＯＣが、Ａ）ＩＣＯＳ‐Ｆｃ若しくはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ若しくは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ、またはＢ）α‐Ｂ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ若しくはα‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ抗体（５μｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて、２１日目に３０分間、処理され、または処理されなかった。その後、ホスホ‐ｐ３８の発現が、ウエスタンブロッティングによって評価された。また、同一のブロットが、コントロールとして抗ｐ３８抗体で、プローブされた。データは、３つの独立した実験からの、ホスホ‐ｐ３８発現の割合を平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊：ｐ＜０．０５）。 ＯＶＸによって誘導されたマウスの骨粗鬆症における、ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理の効果。マウスは、ＯＶＸを受け、２４時間後、ＩＣＯＳ‐ＦＣ（ｍｓＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ）（ｎ＝３）またはＰＢＳ（コントロールグループ、ｎ＝３）を用いて、４週間にわたり処理された。Ａ）ＰＢＳまたはＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理されたマウスの皮質骨を表わすイメージである。Ｂ）各マウスの６か所（３か所／足）において評価した、皮質領域における石灰化した骨の割合を示す棒グラフである。データは、平均値±ＳＥＭとして表されている（コントロールに対し、＊＊：ｐ＜０．０１）。

以下、本発明について、骨粗鬆症および骨減少症の治療のためのＢ７ｈ受容体の天然リガンドであるＩＣＯＳの新規な使用に関し、非限定的な例示によって、詳細に説明する。

本説明の範囲は、ＩＣＯＳの使用にのみ限定されることは一切なく、Ｂ７ｈ受容体の他のリガンド（例えば、モノクローナル抗体および遺伝子組み換え抗体／ヒト化抗体のいずれかの抗体並びにそれらのフラグメント等）が、骨粗鬆症および骨減少症の治療において用いられてよく、このようなリガンドは、破骨細胞の分化、成熟、および／または機能を低減／抑制可能であり、これにより、破骨細胞によって誘導される骨量減少を抑制し、破骨細胞におけるＢ７ｈ受容体の活性をトリガできることが、明らかである。

以下の説明には、実施形態の完全な理解をもたらすべく、多数の具体的な詳細が、記載されている。実施形態は、具体的な詳細のうちの１または複数を省いても、または他の方法、成分、材料等を用いても実施可能である。他の例においては、実施形態の態様を曖昧にすることを回避すべく、周知の構造、材料または動作については、詳細に図示または説明していない。

本明細書にわたる「一実施形態」または「１つの実施形態」への言及は、当該実施形態に関し記載された特定の特徴、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。故に、本明細書の随所において現れる「一実施形態」または「１つの実施形態」という文言は、必ずしもすべてが同一の実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１または複数の実施形態において、任意の好適な態様で組み合わされてよい。

本明細書に記載の見出しは、専ら便宜上のためのものであり、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

本説明は、骨粗鬆症および骨減少症の治療におけるＢ７ｈ受容体のリガンドの新規な使用に関し、このようなリガンドは、好ましくは破骨細胞における、Ｂ７ｈ受容体の活性をトリガ／刺激できる。

一実施形態において、骨粗鬆症および骨減少症の治療において有用なＢ７ｈ受容体のリガンドは、
ａ）配列ＩＤ番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質、
ｂ）配列ＩＤ番号：２９に記載の上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質の相同体、
ｃ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに天然ＩＣＯＳタンパク質の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２９に記載の上記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ部分、
ｄ）配列ＩＤ番号：２に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域、
ｅ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ細胞外領域部分、または
ｆ）配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有し、且つ、Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域の相同体、から選択される。

一実施形態において、本説明は、骨減少症および骨粗鬆症の治療に有用な薬理活性剤のスクリーニングのためのターゲットとしてのＢ７ｈ受容体の使用に関し、薬理活性剤は、破骨細胞の分化、成熟および／または機能を阻害し、Ｂ７ｈ受容体に結合し、Ｂ７ｈ受容体の活性をトリガする。

さらなる実施形態において、本説明は、Ｂ７ｈ受容体のうちの少なくとも１つのリガンドおよび薬理的に許容される賦形剤を備える、骨粗鬆症および骨減少症の治療における使用のための医薬組成物を提供する。

一実施形態において、医薬組成物は、
ａ）配列ＩＤ番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質、
ｂ）配列ＩＤ番号：２９に記載の上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質の相同体、
ｃ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに天然ＩＣＯＳタンパク質の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２９に記載の上記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ部分、
ｄ）配列ＩＤ番号：２に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域、
ｅ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ細胞外領域部分、または
ｆ）配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有し、且つ、Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の上記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および／または機能の抑制能を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域の相同体、
から選択される、Ｂ７ｈ受容体のうちの少なくとも１つのリガンドを含有する。

さらなる実施形態において、本説明は、ａ）試験薬剤を供給する段階と、ｂ）Ｂ７ｈ受容体を発現する破骨細胞に、上記試験薬剤を接触するように配置する段階と、ｃ）上記試験薬剤の破骨細胞の成熟、分化および／または機能を低減させる能力を試験する段階と、ｄ）破骨細胞の成熟、分化および／または機能を低減させる上記試験薬剤を、骨減少症または骨粗鬆症の治療に有用な薬理活性剤として選択する段階であって、上記薬理活性剤は、Ｂ７ｈ受容体に結合し、Ｂ７ｈ受容体の活性をトリガする、選択する段階と、を備える、骨減少症または骨粗鬆症の治療における使用に適した薬理活性剤を識別する方法を提供する。上記方法は、破骨細胞による酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の分泌、破骨細胞における細胞アクチン細胞骨格組織、および／または破骨細胞によるカルシウム放出を測定する方法を提供することが好ましい。

異なる実施形態において、本説明は、骨粗鬆症または骨減少症を患う患者を供給する段階と、上記患者に、Ｂ７ｈ受容体のリガンドを含有する医薬を投与する段階と、それにより、上記患者の骨粗鬆症または骨減少症を軽減する段階と、を備える、骨粗鬆症または骨減少症を治療する方法に関する。

骨のリモデリングは、骨芽細胞および破骨細胞によって処理される複雑なプロセスであり、免疫システムが、サイトカインおよび表面受容体の活性を通して、これらの細胞の機能の調節に関与する。

本説明は、活性化されたＴ細胞によって発現されるＩＣＯＳの、破骨細胞によって発現されるそのリガンドＢ７ｈへの結合が、破骨細胞の成熟および機能を抑制することを示すことによって、リンパ球／骨細胞の相互作用に関する新規な経路を開示する。これらの効果は、ＩＣＯＳの組み換え可溶形態であるＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて検出された。これらの効果は、Ｂ７ｈに結合不可能なＩＣＯＳ‐Ｆｃの突然変異型である^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃによっては示されなかったので、特異的であった。

破骨細胞の分化に対する効果は、Ｍ‐ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬによって駆動される単球の破骨細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化中に、細胞をＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて処理することによって検出された。三週間の分化培養の始まりにおいて処理を開始したとき、ＩＣＯＳ‐Ｆｃは、ほぼ完全に分化を遮断した。しかしながら、最後の週に処理を開始したときもまた、ＩＣＯＳ‐Ｆｃでの処理により誘導された、細胞の多核化の減少並びに破骨細胞の形態学的特性および表現型特性の取得の阻止によって示される通り、ＩＣＯＳ‐Ｆｃは、分化を阻止した。培養が、第４週目に延長された場合ですら、細胞生存は正常であったので、この効果は、細胞毒性に起因するものではなかった。

さらに、培養の最後の週で処理を中断すると、細胞は、破骨細胞の分化経路を再開できたことから、この効果は、可逆的であった。分化の阻止には、アクチン細胞骨格の変化された組織が伴い、それは、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ処理された細胞において、破骨細胞上に検出されるびらん性裂孔と境界を区切る封鎖帯に典型的な極性化の兆候を有さない、Ｆ‐アクチンリングにおける核周囲分布を示した。これらのデータに基づき、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理された細胞は、ＴＲＡＰの発現の低減および溶骨作用の低減を示した。

第２の重要な点は、既に分化した破骨細胞に対するＩＣＯＳ‐Ｆｃの効果であり、この場合、ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理は、細胞の生存性への実質的影響なしに、細胞および核のサイズの顕著な減少を誘導した。この場合も、処理を中断すると、細胞は、再び拡大し、破骨細胞表現型を再開したことから、この効果は可逆的であった。

ｉｎ ｖｉｔｒｏでの破骨細胞の分化および機能に対するこれらの効果は、ＩＣＯＳ‐Ｆｃでの処理が、可溶性ＲＡＮＫＬの大量投与の処理によってマウスに誘導された全身の骨吸収を著しく抑制するということを示す、ｉｎ ｖｉｖｏでの結果によってサポートされた。これは、骨粗鬆症のマウスモデルであり、骨密度の減少の観点から卵巣摘出モデルと同等である。

免疫システムは、骨の形成を調節可能であり、骨量減少は、いくつかの慢性炎症および自己免疫疾患の共通的な特性である。実際、骨粗鬆症のリスクは、関節リウマチの患者で増大し、炎症性腸疾患または全身性エリテマトーデスおよび侵攻性局所的骨破壊は、特定の自己免疫疾患、癌および感染症の特性であり得る。

関節リウマチ患者は、骨粗鬆症、関節周囲の骨量減少および関節びらんといった、３つのタイプの骨の病変を示す。関節周囲の骨量減少および関節びらんは、関節リウマチに特有であり、自己免疫応答が襲う部位に作用する。ＩＬ‐１、ＩＬ‐６およびＴＮＦ‐α等の炎症性サイトカインは、滑液および滑膜内に豊富に存在し、滑膜線維芽細胞およびストローマ細胞上でＲＡＮＫＬを誘導し得る。さらに、ＲＡＮＫＬは、関節リウマチ患者の滑膜組織および滑液中に存在するＴ細胞およびＢ細胞によって発現され、ＲＡＮＫＬは、破骨細胞活性化に関与し得、関節リウマチマーカであるシトルリン化タンパク質に対する抗体は、破骨細胞に対する刺激効果を有し得る。対照的に、骨粗鬆症は、関節リウマチに特有ではなく、乾癬、強直性脊椎炎、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、炎症性腸疾患、尋常性天疱瘡等の慢性炎症性疾患およびその他において一般的に見られるものである。骨粗鬆症は、また、移植および加齢に関連する慢性炎症においても典型的である。慢性炎症においては、骨粗鬆症は、血液中の高レベルの炎症性サイトカイン、およびしばしばステロイド治療を含む複数の要因が原因であるとされている。

更年期エストロゲン欠乏は、破骨細胞の分化および機能に対するエストロゲンの抑制効果がなくなることに起因する、破骨細胞の活性の増大を伴い得るが、ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐１７等の炎症性サイトカインの生成の増加並びにＢ細胞およびＴ細胞のＲＡＮＫＬの発現の増加も伴い得る。

骨の形成の免疫制御における、重要な役割は、Ｔヘルパー細胞であるとみられている。Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞は、それぞれＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐４を分泌し、これらは、抗破骨細胞形成性サイトカインである。対照的に、Ｔｈ１７細胞は、高レベルのＲＡＮＫＬを発現し、間葉細胞上のＲＡＮＫＬの発現および炎症細胞のリクルートメントを誘導するＩＬ‐１７を分泌する。さらに、Ｔｈ１７細胞は、また、炎症部位において骨の形成を高める骨芽細胞の分化を誘導し得るＩＬ‐２２も分泌する。これらの細胞は、表面受容体を用いることによっても機能し得る。というのは、それらのＣＤ４０Ｌが、ストローマ細胞上のＣＤ４０を刺激して、これらの細胞がＲＡＮＫＬを発現することを誘導し得、ＲＡＮＫＬ／ＲＡＮＫ軸の活性をダウンレギュレーション（下向き調節）するＯＰＧの発現を抑制し得るからである。さらに、破骨細胞形成は、また、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によっても、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）の放出、および細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）の表面発現を通して抑制可能であり、ＣＴＬＡ４は、単球上に発現したそのリガンドＢ７．１およびＢ７．２に結合することによって、且つ、それらの破骨細胞への分化を防止することによって、破骨細胞の形成を抑制可能である。ＣＴＬＡ４およびＩＣＯＳの両方が、共刺激受容体のＣＤ２８ファミリーに属し、Ｂ７ファミリーに属する表面受容体を結合させるので、この発見は、興味深いものである。さらに、ＩＣＯＳもＴｒｅｇ機能に関与する。なぜなら、適切な条件においては、ＩＣＯＳトリガは、ナイーブＴｈ細胞からのＴｒｅｇ分化およびＴＧＦβ分泌を誘導でき、Ｔｒｅｇ細胞のサブセットが、高レベルのＩＣＯＳを発現するからである。破骨細胞に対するＢ７ｈのトリガよって示される効果は、Ｂ７．１／Ｂ７．２トリガによって示される効果より広範に思われる。理由は、Ｂ７ｈは、また、分化した破骨細胞の機能を可逆的に抑制するからである。

ヒトＢ７ｈ受容体は、配列ＩＤ番号：２７に記載のアミノ酸配列を有する。

Ｂ７ｈ受容体の天然リガンドであるヒトＩＣＯＳタンパク質は、配列ＩＤ番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する。

骨粗鬆症および骨減少症の治療に有用なＢ７ｈ受容体のリガンドは、天然、合成、または組み換え起源のＢ７ｈ受容体のリガンドから選択されてよく、これらとしては、例えば、ＩＣＯＳまたはその部分、低分子化合物、アプタマー、抗体、ペプチド、Ｂ７ｈ受容体優性陽性等が挙げられ、このようなリガンドは、Ｂ７ｈ受容体に結合し、Ｂ７ｈ受容体の活性をトリガ可能である。

Ｂ７ｈ受容体のリガンドは、分解を低減または防止すべく、半減期および／または可溶性を増大させるべく、毒性および／または免疫原性を低減すべく、１または複数の安定化分子に融合またはコンジュゲートされてよい。

哺乳類へのタンパク質の投与のために、タンパク質を安定化できる分子の使用は、当該技術分野において広く知られる技術である。

Ｂ７ｈ受容体のリガンドは、特異性、薬物動態および／または生体内分布を増大させるべく、抗体または抗体フラグメントにコンジュゲートされてよく、破骨細胞または別の骨成分に特異的に結合する抗体の特性を利用する。

Ｂ７ｈ受容体のリガンドにコンジュゲート可能な安定化分子は、とりわけ、以下から選択されてよい。

‐ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはそれらの誘導体。Ｂ７ｈ受容体のリガンド上に存在するアミノ基に結合可能なＰＥＧ誘導体としては、とりわけ、エポキシドＰＥＧ、アルデヒドＰＥＧ、ニトロフェニルカーボネートＰＥＧおよびスクシンイミジルエステルＰＥＧが挙げられる。Ｂ７ｈ受容体のリガンド上に存在するチオール基に結合可能なＰＥＧ誘導体としては、とりわけ、オルトピリジルジスルフィドＰＥＧが挙げられる。Ｂ７ｈ受容体のリガンド上に存在するヒドロキシル基に結合可能なＰＥＧ誘導体としては、とりわけ、Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミドまたはヒドロキシベンゾトリアゾールで活性化されたＰＥＧ‐ＣＯＯＨが挙げられる。他のＰＥＧ誘導体は、ｐＨ依存の加水分解性を持つＰＥＧポリアセタール、およびＰＥＧ‐デキストリン（ポリマー‐マスキング‐アンマスキング‐タンパク質治療（ＰＵＭＰＴ（ｐｏｌｙｍｅｒ‐ｍａｓｋｉｎｇ‐ｕｎｍａｓｋｉｎｇ‐ｐｒｏｔａｉｎ ｔｈｅｒａｐｙ））が典型である。
‐ポリ‐Ｌ‐リジンシトルアミド（リジンまたはエチルカルバミン酸スペーサーを介した）、スチレンマレイン酸無水物およびポリ‐ヒドロキシプロピルメタクリルアミド。
‐ヒトＦｃ抗体領域。

Ｂ７ｈ受容体のリガンドの、治療部位、すなわちＢ７ｈ受容体を発現する破骨細胞への送達を増大すべく、Ｂ７ｈ受容体のリガンドは、また、ハイパーグリコシル化またはマンノース残基にコンジュゲートされてよい。

ハイパーグリコシル化は、ｉｎ ｓｉｔｕでの化学反応または部位特異的突然変異誘発法のいずれかによって、行われてよく、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかのタンパク質グリコシル化をもたらす。Ｎ結合型グリコシル化においては、糖鎖は、トリペプチド配列Ａｓｎ‐Ｘ‐Ｓｅｒ／Ｔｈｒのアスパラギンに結合され、ここで、Ｘは、プロリン以外のアミノ酸を表わす。ポリシアル酸（ＰＳＡ）は、ハイパーグリコシル化に頻繁に使用される。高分子量のＰＳＡが、低分子量の薬およびペプチドの送達に好適である一方、より低分子量のＰＳＡが、粒子状薬物送達システムに加え、巨大タンパク質に用いられてよい。

マンノース残基へのコンジュゲートは、マンノース受容体へのコンジュゲートの結合を利用し、マンノース受容体は、クッパー細胞、マクロファージ、肺胞、単球由来の樹状細胞並びに血管およびリンパ内皮細胞のサブセット上で発現されると報告されている。マンノシル化タンパク質は、マンノース特異的レクチン、すなわち、マンノース受容体およびＭＢＰによって認識されてよい。

また、Ｂ７ｈ受容体のリガンドの送達は、当該技術分野において既知のコロイド状薬物送達システムを利用して増大されてよく、コロイド状担体は、とりわけ、ミクロ粒子、ナノ粒子およびリポソームから選択されてよい。ミクロ粒子は、一般的に、生分解性ポリマーで構成され、このようなものとしては、例えば、澱粉、アルギン酸塩、コラーゲン、ポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコライド）（ＰＬＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）等が挙げられる。通常、ナノ粒子は、キトサン、アルギン酸塩、ＰＣＬ、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（グリコライド）、ＰＬＧＡ等の天然ポリマーまたは合成ポリマーから製造される。細網内皮系による認識および摂取を阻害すべく、並びに循環時間を延長すべく、リポソームは、また、ＰＥＧで表面修飾されてよい。さらに、ｉｎ ｓｉｔｕで、感熱性ヒドロゲルは、温度変化に応答して、ゾル‐ゲル相転移を経る。

［材料および方法］
［細胞］
書面によるインフォームドコンセントに署名した健康なドナーから得たヒトの血液サンプルから、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が、密度勾配遠心分離法によって得られた。破骨細胞が、ＣＤ１４^＋単球から作成され、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ１４ネガティブセレクションキット（ｃｏｄ．１９０５９、カナダのブリティッシュコロンビア州バンクーバーにあるＳｔｅｍＣｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、ＰＢＭＣから単離された。具体的には、０．５×１０^６の単球が、２４ウェルプレート（ｃｏｄ．６６２１６０、米国ノースカロライナ州キャピタルドライブモンローにあるＧｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ‐Ｏｎｅ社）に播種され、分化培地で２１日間培養された。分化培地は、ＤＭＥＭ（ｃｏｄ．４１９６６‐０２９ カナダのオンタリオ州バーリントン、米国にあるインビトロゲン社）および１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ：ｃｏｄ．１０２７０、インビトロゲン社）から構成され、組み換えヒトＭ‐ＣＳＦ（２５ｎｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．２１６‐ＭＣ、米国ミネソタ州ミネアポリスにあるＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＲＡＮＫＬ（３０ｎｇ／ｍｌ、ｃｏｄ．３９０‐ＴＮ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が添加されている。分化培地は、３日ごとに交換された。異なる時点において、細胞は、１μｇ／ｍｌのＩＣＯＳ‐Ｆｃ（配列ＩＤ番号：１‐ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列ＩＤ番号：３）に融合されたヒトＩＣＯＳの細胞外部分（配列ＩＤ番号：２）を含有する融合タンパク質）、または、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（配列ＩＤ番号：４‐マウスＩｇＧ１ Ｆｃ（配列ＩＤ番号：５）に融合されたヒトＩＣＯＳの細胞外部分（配列ＩＤ番号：２）を含有するキメラ分子）で処理された。コントロールは、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（配列ＩＤ番号：６‐Ｆ１１９Ｓ置換を保持するヒトＩＣＯＳの細胞外部分の突然変異型（配列ＩＤ番号：７）が、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列ＩＤ番号：３）に融合されたもの）、および、ｍｓＩＣＯＳｈｕＦｃ（配列ＩＤ番号２４：‐ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列ＩＤ番号：３）に融合されたマウスＩＣＯＳの細胞外部分（配列ＩＤ番号：２８）を含有する融合タンパク質）を用いて行われた。

［ＩＣＯＳクローニングおよび生成］
ヒトＩＣＯＳまたはマウスＩＣＯＳの細胞外部分が、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）プラスミド（ｃｏｄ．Ｖ８７０‐２０、インビトロゲン社）由来の修飾された真核細胞発現ベクターにクローニングされ、Ｄｉ Ｎｉｒｏ Ｒその他^６によってｐミニボディ（ｐＭＢ‐ＳＶ５）として報告された（ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ：１７６７８５２５）。このベクターは、元のものとは、次の点が異なる。すなわち、真核細胞における翻訳の開始に必要なＫｏｚａｋ配列（5' CCACATGG 3'‐配列ＩＤ番号：８）、培養上清中のタンパク質の放出を可能にすべく導入された分泌リーダー配列（5' GCTGGAGCCTGATCCTCCTGTTCCTCGTCGCTGTGGCTACA 3'‐配列ＩＤ番号：９）、タンパク質発現レベルを増大させるためのミニイントロン配列（5'GTAAGGGGCTCACAGTAGCAGGCTTGAGGTCTGGACATATATATG GGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAG 3'‐配列ＩＤ番号：１０）。生成されるタンパク質をターゲットするためのタグ配列が、導入された。これは、シミアン（Ｓｉｍｉａｎ）ウイルス‐５（ＳＶ５タグ）（5' GGCAAACCAATCCCAAACCCACTGCTGGGCCTGGATAGTACT 3'‐配列ＩＤ番号：１１）に由来し、タンパク質のモノクローナル抗体認識に有用である。このベクターは、目的のフラグメントを、配列ＩＤ番号３０および３１にそれぞれ記載のヌクレオチド配列を有する、免疫グロブリンＩｇＧ１（Ｆｃ）領域のヒトまたはマウスの定常フラグメントのコード配列を持つフレームへのクローニングを可能にした。

ＩＣＯＳ‐Ｆｃコンストラクト（配列ＩＤ番号：１）を生成するため、ヒトＩＣＯＳの細胞外部分をコードするヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１２）が、特異的プライマであるＩＣＯＳフォワードＢｓｓｈＩＩプライマ（5' GGCGCGCATGCCGAAATCAATGGTTCTGCC 3' ‐配列ＩＤ番号：１３、米国テキサス州ウッドランズにあるＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）およびＩＣＯＳリバースＮｈｅＩプライマ（5' GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC 3'‐配列ＩＤ番号：１４、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）で増幅された。増幅されたフラグメントは、ＢｓｓＨＩＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１９９Ｓ、米国マサチューセッツ州イプスウィッチにあるＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）酵素、および、ＮｈｅＩ（ｃｏｄ．Ｒ０１３１Ｓ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）酵素でダイジェストされた。ダブルダイジェストされたフラグメントは、上記のｐＭＢ‐ＳＶ５プラスミドにクローニングされた。ヌクレオチド配列が、シークエンシングによって決定された。

ＩＣＯＳ‐Ｆｃをコードする発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２１に記載されている。

ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（配列ＩＤ番号：４）クローニングの場合、ｐＭＢ‐ＳＶ５ベクターが、マウスＦｃ領域のコード配列（配列ＩＤ番号：３１）を含む点を除いては、上記と同一のプロトコールに従った。

ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃをコードする発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２２に記載されている。

ヒトの突然変異^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃコンストラクト（配列ＩＤ番号：６）を生成するため、ヒトＩＣＯＳの細胞外部分における突然変異Ｆ１１９Ｓが、ＢｓｅＲＩダイジェスト部位でアニーリングするフォワードプライマ（5' TCAATTTTTGATCCTCCTCCTTCTAAAGTAACTCTTACAGG 3'‐配列ＩＤ番号：１５、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）、および、ＩＣＯＳヒトリバースＮｈｅＩプライマ(5' GCTAGCAAGTTGTGATTCATAAATATGC 3'‐配列ＩＤ番号：１４、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）を用いて導入された。ヒトの突然変異^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳの細胞外部分のヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２６に記載されている。突然変異されたフラグメントは、ＢｓｅＲＩ（ｃｏｄ．Ｒ０５８１、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）酵素およびＮｈｅＩ酵素を用いてのダイジェスト後、ヒトＦｃ領域のコード配列を持つｐＭＢ‐ＳＶ５プラスミドにクローニングされた。

^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃをコードする発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２３に記載されている。

ヒトＦｃに融合されたマウスＩＣＯＳ（ｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦＣ）コンストラクト（配列ＩＤ番号：２４）を生成するために、マウスＩＣＯＳの細胞外部分をコードするヌクレオチド配列（配列ＩＤ番号：１６）が、特異的プライマであるＩＣＯＳマウスフォワードＢｓｓｈＩＩプライマ(5' TTGGCGCGCATGCCGAAATCAATGGCTCGGCCGATC 3'‐配列ＩＤ番号：１７、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社)、および、ＩＣＯＳマウスリバースＮｈｅＩプライマ（5' CTAGCTAGCTAGCCAGAGCTTCAGCTGGC 3'‐ 配列ＩＤ番号：１８、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ社）で増幅された。このクローニングで使用されたベクターは、マウスＦｃ領域のコード配列を持つｐＭＢ‐ＳＶ５であった。

ｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃをコードする発現ベクターのヌクレオチド配列は、配列ＩＤ番号：２５に記載されている。

プラスミドＤＮＡが、Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標） ＴＯＰ１０ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｃｏｌｉ細胞細菌（大腸菌；ｃｏｄ．Ｃ４０４０‐０３、米国カリフォルニア州のカールズバッドにあるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に形質転換された。得られたコロニーは、特異的プライマであるＰハイグロセンス（5' CTGCTTACTGGCTTATCG 3'‐配列ＩＤ番号：１９、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ)、および、Ｐハイグロアンチセンス（5' CAGATGGCTGGCAACTAG 3'‐配列ＩＤ番号：２０、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）を用いてスクリーニングされ、コンストラクトが、シークエンシングによって確認された。最後に、プラスミドＤＮＡが、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（ｃｏｄ．１６４４７１００、Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて、チャイニーズハムスターオヴァリアン‐サスペンション（ｏｖａｒｉａｎ‐ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）細胞株（ＣＨＯ‐ｓ）（ｃｏｄ．Ｒ８／００‐０７、インビトロゲン社）に、トランスフェクションされた。ベクター内のハイグロマイシン耐性の存在のおかげで、安定したクローンが得られた。この目的のために、クローンは、トランスフェクションされた細胞の完全選択を可能にする濃度０．２ｍｇ／ｍｌでのハイグロマイシン‐Ｂ（ｃｏｄ．１０６８７−０１０、インビトロゲン社）の選択の下、増殖された。細胞は、無血清のＩＭＤＭ培地（ｃｏｄ．ＢＥ１２‐９１５Ｆ０１、スイスのバーゼルにあるロンザ社）で増殖され、無血清培養上清が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ｃｏｄ．１７‐０６１８‐０１、米国ニュージャージー州ピスカタウェイタウンシップにあるＧＥヘルスケア社）を使用して、精製された。

［免疫蛍光］
破骨細胞表現型が、ＣＤ１４（ｃｏｄ．２１２７０１４６、ドイツのＦｒｉｅｓｏｙｔｈｅにあるＩｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ社）、カテプシン‐Ｋ（ｃｏｄ．ＢＳ１６１１Ｒ‐ＦＩＴＣ、米国マサチューセッツ州ウーバンにあるＢｉｏｓｓ社）およびＢ７ｈ（ｃｏｄ．ＦＡＢ１６５Ｐ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）にコンジュゲートされた適切なＦＩＴＣ、ＰＥ、およびＡＰＣモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を使用して、免疫蛍光およびフローサイトメトリ（米国カリフォルニア州サンディエゴにあるＢＤバイオサイエンス社）によって評価された。製造元の指示に従い、ＦＩＸおよびＰＥＲＭキット（ｃｏｄ．ＧＡＳ００３、インビトロゲン社）を用いた細胞透過を行った後、カテプシン‐Ｋのレベルが評価された。

４％のパラホルムアルデヒド（ｃｏｄ．７６２４０、米国ミズーリ州セントルイスにあるＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、ガラスカバースリップ上に固定された細胞に対し、アクチン染色を行い、洗浄後、５％のＦＢＳ、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ｃｏｄ．０５４７９−２５０Ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および０．１％のトリトンＸ‐１００（ｃｏｄ．Ｔ９２８４、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含有する溶液を用いて、室温にて１時間、透過処理された。その後、カバースリップが、０．１％のトリトンＸ‐１００、１％のＢＳＡ、２％のＦＢＳの溶液中のＦＩＴＣ‐コンジュゲートされたファロイジン（ｃｏｄ．Ｆ４３２、インビトロゲン社）を用いて染色された。２時間後、細胞は、０．１％のトリトンＸ‐１００を加えたＰＢＳを用いて１０分間洗浄され、位相差顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ４０ ＣＦＬ（ドイツのオーバーコッヘンにあるカールツァイス社）によって観察され、Ｒｅｔｉｇａ ２００Ｒデジタルカメラ（カナダのブリティッシュコロンビア州サリーにあるＱＩｍａｇｉｎｇ社）で撮影され、マイクロイメージング用イメージプロプラスソフトウェア（米国メリーランド州ベテスダにあるＭｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、バージョン５．０）を用いて分析された。

［酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）アッセイ］
２５％のクエン酸塩溶液（クエン酸１８ｍｍｏｌ／ｌ、クエン酸ナトリウム９ｍｍｏｌ／ｌ、塩化ナトリウム１２ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．６）、６５％のアセトンおよび１０％のホルムアルデヒド（３７％）で構成された市販キット（ｃｏｄ．３８７Ａ−１ＫＴ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、ガラスカバースリップ上に、約３０秒間固定された細胞に対し、ＴＲＡＰ活性が、評価された。その後、カバースリップは、脱イオン水で洗浄され、ファーストガーネットＧＢＣベース溶液（７ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて染色され、コントラスト位相差顕微鏡によって観察された。ＴＲＡＰ陽性は、イメージングシステム（イメージプロプラス）を用いて分析された。

［カルシウム放出アッセイ］
単球（０．５×１０^６）が、２４ウェルオステオアッセイ表面培養プレート（ｃｏｄ．ＣＬＳ３９８７、米国ニューヨーク州コーニングにあるコーニング社）に播種され、上記のように、１４日目にＩＣＯＳ試薬を加え、ＭＤＯＣに分化させた。培養の２１日目に、細胞は、洗浄され、新鮮培地を用いて、さらに２４時間、インキュベートされた。その後、上清が回収され、カルシウムレベルが、カルシウム比色アッセイキット（ｃｏｄ．ＭＡＫ０２２−１ＫＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）によって評価された。

［ｉｎ ｖｉｖｏ分析］
Ｔｏｍｉｍｏｒｉ Ｙその他^７によって報告されているように、可溶性ＲＡＮＫＬ（ｃｏｄ．ＧＷＢ−Ｐ０９４５Ｉ、米国カリフォルニア州サンディエゴにあるＧｅｎＷａｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ社：１ｍｇ／ｋｇ）が、単独で、または１００μｇのｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃ（ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（配列ＩＤ番号：３）に融合されたマウスＩＣＯＳの細胞外部分（配列ＩＤ番号：２８）を含有する融合タンパク質）若しくは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃと組み合わせて、生後７週のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（ｃｏｄ．０５７、米国インディアナ州インディアナポリスにあるＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）に、３日間にわたり毎日、腹腔内注射された。コントロールのマウスには、ＰＢＳ、またはＲＡＮＫＬを含まない１００μｇのＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃまたは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃが注射された。マウスは、最後の注射から４時間後に殺され、分析のため、血液サンプル、脛骨、および大腿骨が採取された。マウスは、保険科学省（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の動物施設の中で、病原体のない状態で育てられ、大学倫理委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従い、扱われた。

脛骨および大腿骨のサンプルが、ＰＢＳで４％に希釈されたｐＨ６．９の濃縮中性緩衝ホルマリン（ｃｏｄ．Ｆ００３３、イタリアのベルガモ県マルティネンゴにあるＤｉａｐｔｈ社）中に、２日間にわたり、室温にて固定され、上昇する濃度（ａｓｃｅｎｄｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）のエタノール（ｃｏｄ．０２８６０‐２．５Ｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で、一晩脱水された後、少なくとも３日間にわたり、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）モノマー（ｃｏｄ．８００５９０２５００、ドイツのダルムシュタットにあるＭｅｒｃｋ社）にて、３ステップ含浸を行った。埋め込みについては、試料ブロックが、真空下、蓋なしのバイアルの中で、８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の安定化されたＭＭＡ、２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のプラストイドＮ（ｃｏｄ．５８６６、ドイツにあるロームファーマ社）に、２時間含浸され、蓋付きの１０ｍＬのガラスバイアル（ウォーターバス、ｃｏｄ．ＢＲ７７８０１２、Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ社）中で、３７℃にて一晩埋め込まれた。重合後、ガラスバイアルが除去され、湿った部分（５０ｍｍ）が、顕微鏡分析用の硬質材料の高品質なサンプル調製のための回転ダイアモンドソーブレードを備えたライカＳＰ１６００ソーミクロトーム上で切断され、ポリエチレンスライドの上に載せられた。切断は、骨の長軸に対し行われ、組織学的評価のために、断面は、ライトグリーン（ｃｏｄ．１１５９４１００２５、メルク社）および塩基性フクシン（ｃｏｄ．４７８６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて染色された。その後、断面は、材料の内容に対し知らされていない検査担当者によって、組織形態学的および形態計測学的に試験された。これらの測定は、光学顕微鏡を用いて行われ、ライカイメージングソフトウェア（ＤＦＣ３２０ライカデジタルカメラおよびソフトウェアライカＱＷｉｎＰｌｕｓｖ２．６）を用いて分析された。すべての測定は、倍率２０Ｘで行われた。皮質骨形態には、組織量、髄質量（Ｍｅ．Ｖ）および骨量（Ｂｖ＝組織量−Ｍｅ．ｖ）が含まれた。皮質骨および骨膜骨表面も測定された。

［ウエスタンブロッティング］
Ｔ２１において、ＭＤＯＣは、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃまたは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃまたは２つの異なる抗Ｂ７ｈ抗体、抗ヒトＢ７ｈ（ｃｏｄ．ＢＭＳ１６−５８８９−８２、米国カリフォルニア州サンディエゴにあるｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社；クローンＭＩＨ１２）および抗ヒトＢ７ｈ（ｃｏｄ．ＭＡＢ１６５１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社；クローン１３６７１６）のいずれかを用いて処理された。ＭＤＯＣは、５０ｍＭトリス‐ＨＣｌ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｃｏｄ．Ｓ７６５３、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｃｉｈ社）、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｃｏｄ．Ｅ６７５８、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ホスファターゼインヒビターカクテルおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（ｃｏｄ．Ｐ２８５０およびｃｏｄ．Ｐ８３４０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を含む１％ ＮＰ‐４０（ｃｏｄ．７４３８５ Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ）に、溶解された。その後、３０μｇのタンパク質が、１０％ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで分離され、Ｈｙｂｏｎｄ‐Ｃ Ｅｘｔｒａニトロセルロースメンブレン（ｃｏｄ．１０６０００１６、米国ニュージャージー州ピスカタウェイにあるＧＥヘルスケア社）に転写された。その後、当該メンブレンは、ホスホ‐ｐ３８‐ＭＡＰＫ（ｃｏｄ．９２１１、米国マサチューセッツ州デンバーにあるＣｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）およびｐ３８‐ＭＡＰＫ（ｃｏｄ．９２１２、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）に対する抗体を用いて、次に、抗ウサギＨＲＰ‐コンジュゲートされた二次抗体（ｃｏｄ．Ａ０５４５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、プローブされた。ＶｅｒｓａＤｏｃイメージングシステム（米国カリフォルニア州ハーキュリーズにあるＢｉｏ‐Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、化学発光を介して、バンドが検出され、マルチアナリストソフトウェア（バージョン１．１、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を用いて、デンシトメトリック（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ）分析が行われた。

［卵巣摘出］
Ｚｏｌｅｔｉｌ（登録商標）（６０ｍｇ／ｋｇ）およびＸｉｌａｚｉｎａ（登録商標）（２０ｍｇ／ｋｇ）の混合物を用いて、腹腔内麻酔をかけられた生後６／８週の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、両側卵巣摘出（ＯＶＸ）が行われた。手術から１日後、マウスは、ＰＢＳまたはｍｓＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ（４００μｇ）のいずれかの腹腔内注射を７回処理された（４日に１回を４週間にわたり）。マウスは、最後の注射から４日後に殺され、分析のために、器官および骨が、回収された。

［データ分析］
Ｄｕｎｎｅｔｔ法によるＡＮＯＶＡを用いて、統計分析が行われた。ｐ＜０．０５が、有意であると考えられた。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｉｎｓｔａｔソフトウェア（米国カリフォルニア州サンディエゴにあるＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて行われた。

［結果］
［破骨細胞におけるＢ７ｈ発現］
ＣＤ１４^＋単球をＭ‐ＣＳＦおよびＲＡＮＫＬを含有する分化培地で、２１日間培養することによって、単球由来の破骨細胞（ＭＤＯＣ）が得られた。ＭＤＯＣの分化を評価し且つＢ７ｈ発現をモニタリングすべく、本発明者らは、細胞形態を光学顕微鏡によって評価し、表面のＣＤ１４（単球をマーキング）、細胞内カテプシンＫ（破骨細胞をマーキング）およびＢ７ｈの発現を、ＭＤＯＣ分化培養の初日（０日、Ｔ０）および最終日（２１日、Ｔ２１）および中間の１４日目（Ｔ１４）に行われた３色免疫蛍光およびフローサイトメトリによって評価した（図１）。

［分化中の破骨細胞に対するＢ７ｈのトリガの効果］
ＭＤＯＣ分化培養中に、Ｂ７ｈは発現するので、本発明者らは、ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて、分化中のＭＤＯＣに対するＢ７ｈのトリガの効果を評価した。ＩＣＯＳ効果の特異性を評価すべく、細胞は、また、Ｂ７ｈに結合不可能なＩＣＯＳの突然変異型である^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ、または、ヒトＦｃγ受容体との相互作用を最小化すべく、ヒトＩＣＯＳがマウスＦｃγ部分に融合されているＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃのいずれかを用いて処理された。分化中のＭＤＯＣの処理は、培養のＴ０またはＴ１４に、ＩＣＯＳ試薬を分化培地に加えることによって、開始された。培養をＴ２１まで継続することで、Ｔ^０‐２１およびＴ^{１４‐２１}の処理を行った。

結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いるＴ^０‐２１の処理は、ＭＤＯＣの分化を強く抑制することを示した。１０日目（Ｔ１０）に、細胞は円形形状を呈し、Ｔ２１に、細胞は、紡錘状形態を獲得した。さらに、細胞は、破骨細胞の分化をマークするＣＤ１４ダウンレギュレーション（下向き調節）およびカテプシンＫアップレギュレーションの不全を示した。対照的に、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて処理された細胞は、ＭＤＯＣ形態および表現型に向かう典型的な進展を示し、未処理細胞との差異を示さなかった（図２）。

ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃのいずれかを用いたＴ^{１４‐２１}の処理は、ＭＤＯＣの分化の顕著な低速を示した。なぜなら、Ｔ２１において、細胞は、細胞サイズの低減および核濃縮、培養ウェルへの接着能力の低下、未処理細胞と比較し、１つの核のみを有する細胞数の増加、３より多い核を持つ細胞数の減少、並びにカテプシンＫのアップレギュレーション不全、とりわけ、ＣＤ１４ダウンレギュレーション不全を示した。さらに、いくつかの細胞は、未処理細胞には検出されなかった星状形態を呈した。対照的に、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて処理された細胞は、未処理細胞と同様であった（図３）。

ＩＣＯＳ‐Ｆｃ効果の可逆性を評価するために、細胞は、７日目（Ｔ７）に、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ、または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いて処理され、Ｔ１４に洗浄され、その後、Ｔ２１まで、ＩＣＯＳ‐Ｆｃ、ＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃ、または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃの存在下（Ｔ^７‐２１処理）または不存在下（Ｔ^７‐１４処理）下でインキュベートされた。結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いたＴ^７‐２１処理は、Ｔ^{１４‐２１}処理について上記したものと同様の形態および表現型を誘導することを示した。^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理された細胞は、未処理細胞との差異を呈さなかった。対照的に、Ｔ^７‐１４処理は、未処理細胞によって呈されたものに収束する形態および表現型を誘導した（図４）。

［分化した破骨細胞に対するＢ７ｈのトリガの効果］ 既に分化したＭＤＯＣの処理は、Ｔ２１に、細胞をＩＣＯＳ試薬で処理することで行われ、３日後（Ｔ２４）にそれらを分析することによって、Ｔ^{２１‐２４}処理が行われた。結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いたＴ^{２１‐２４}処理は、細胞および核のサイズの著しい減少を誘導し、および未処理細胞と比較して、カテプシンＫの発現が減少したことを示した。トリパンブルー色素排除試験による細胞の生存性の分析は、細胞は生存可能であることを示した。対照的に、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いたＴ^{２１‐２４}処理は、効果を示さなかった（図５）。

ＩＣＯＳ効果の可逆性を評価するために、Ｔ^{２１‐２４}処理がなされた細胞は、Ｔ２４に、洗浄され、１日（Ｔ２５）または４日間（Ｔ２８）にわたり、ＩＣＯＳ‐Ｆｃの不存在の分化培地でインキュベートされた。結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いて処理され、その後、ＩＣＯＳ‐Ｆｃの不存在下で増殖された細胞は、Ｔ２５に、拡大し始め、カテプシンＫをアップレギュレーションし、ＭＤＯＣ様の形態を呈し、Ｔ２８に、未処理細胞によって呈される形態に収束することを示した（図５）。トリパンブルー色素排除試験による細胞の生存性の分析は、細胞は生存可能であることを示した。対照的に、未処理であった細胞または^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理された細胞は、Ｔ２５およびＴ２８において、それらの形態および表現型を維持した。

［破骨細胞の機能に対するＢ７ｈのトリガの効果］
破骨細胞の骨の溶解作用は、ＴＲＡＰを含むいくつかの溶菌酵素を含有する細胞質内顆粒の内容物分泌するそれらの能力に関連することから、本発明者らは、ＩＣＯＳ試薬を用いたＴ^{１４‐２１}処理の、ＴＲＡＰ酵素アッセイによって評価されるＴＲＡＰ発現に対する効果を評価した。結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃで処理されたＭＤＯＣは、未処理細胞および^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理された細胞よりも、ＴＲＡＰ^＋細胞数の観点およびそれらの染色強度の観点から、低いＴＲＡＰ活性を呈することを示した。この結果は、主に、３個より多い核を持つ細胞において明白であった（図６）。

破骨細胞の機能の重要な側面は、封鎖帯によって境界を区切られるびらん領域（ｅｒｏｓｉｏｎ ａｒｅａ）において、波状縁を形成する細胞骨格組織であるので、本発明者らは、Ｔ^{１４‐２１}処理がなされたＭＤＯＣ細胞に、ＦＩＴＣ‐ファロイジンで細胞内染色を行い、細胞アクチン組織に対するＩＣＯＳ試薬の効果を分析した。結果は、未処理のＭＤＯＣにおいては、アクチンは、破骨細胞のびらん性裂孔と境界を区切る封鎖帯に典型的なパターンで、極性化されることを示した。対照的に、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃで処理された細胞においては、アクチンは、極性化の兆候なしで、典型的なＦ‐アクチンリング内の核周囲分布を呈した。^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃで処理された細胞は、未処理細胞のものと同様のパターンを呈した（図７）。

ＭＤＯＣの溶骨作用に対するＩＣＯＳの効果を評価すべく、本発明者らは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、結晶リン酸カルシウムからのカルシウム放出を促進するそれらの能力を評価した。ＭＤＯＣの分化は、Ｔ^{１４‐２１}プロトコールを用いて、ＩＣＯＳ試薬の存在下および不存在下で、生体骨材を模倣した無機結晶リン酸カルシウムで作られた合成界面で被覆されたウェルで、誘導された。Ｔ２１に、細胞は、洗浄され、新鮮培地でさらに２４時間培養され、その後、比色アッセイを用いて、培養上清中のカルシウムの放出が、評価された。結果は、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いたＴ^{１４‐２１}処理は、未処理のＭＤＯＣと比較して、カルシウム放出の顕著な低減を示し、これに対し、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃは、効果を示さなかったことを示した（図８）。

最後に、本発明者らは、マウスに可溶性ＲＡＮＫＬの大量投与を処理することによって、誘導された骨粗鬆症のモデルを使用して、ｉｎ ｖｉｖｏで、Ｂ７ｈのトリガの効果を評価した。雌のＣ５７ＢＬ／６マウス（生後７週）に、３日間にわたり毎日、ＲＡＮＫＬＥ（１ｍｇ／ｋｇ）を単独で、またはｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃ（マウスＩＣＯＳおよびヒトＦｃで形成された）若しくは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃ（１００μｇ／マウス）のいずれかと組み合わせて、腹腔内注射した。マウスは、最後の注射から４時間後に殺された。フクシンおよびライトグリーンで染色された脛骨の組織学的分析は、ＲＡＮＫＬが注入されたマウスにおいて、著しい骨量減少を示した。これは、ｍｓＩＣＯＳ‐ｈｕＦｃの併用処理によって著しく抑制されたが、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃの併用処理ではなされなかった（図９‐１および図９‐２）。

［抗Ｂ７ｈ抗体によるＴＲＡＰ染色に対するＢ７ｈのトリガの効果］ 本発明者らは、２つの異なる抗Ｂ７ｈ抗体（α‐Ｂ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅおよびα‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、分化中（Ｔ^{１４‐２１}処理）のＭＤＯＣおよび既に成熟した（Ｔ^{２１‐２４}処理）ＭＤＯＣに対するＢ７ｈのトリガの効果を評価した。ＭＤＯＣは、ＴＲＡＰのための染色がなされた。Ｔ^{１４‐２１}処理は、未処理のＭＤＯＣは、濃くＴＲＡＰ染色がされた巨細胞として現われることを示した。αＢ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅでの処理は、多核ＴＲＡＰ陽性細胞の低減された形成と共に、ＭＤＯＣの分化の顕著な抑制を示し、ＩＣＯＳ‐Ｆｃで得られた結果に相当するものであった。対照的に、α‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いた処理は、最小の抑制効果を示した。Ｔ^{２１‐２４}処理は、未処理のＭＤＯＣは、濃くＴＲＡＰ染色がされた巨細胞として現われることを示した。αＢ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅでの処理は、ＭＤＯＣのサイズの顕著な抑制および多核ＴＲＡＰ陽性細胞の低減された陽性を示し、ＩＣＯＳ‐Ｆｃで得られた結果に相当するものであった。対照的に、α‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓを用いた処理は、抑制効果を示さなかった。結果は、図１３に示されている。

［ＭＤＯＣシグナル伝達に対するＢ７ｈのトリガの効果］
Ｂ７ｈリガンドのＭＤＯＣの分化および活性に対する抑制効果が、それらのＢ７ｈに対するアゴニスト作用と相互関連するかどうかを調べるため、本発明者らは、ＭＤＯＣへのｐ３８のリン酸化反応の誘導として評価し、Ｂ７ｈシグナル伝達に対するそれらの効果を評価した。Ｔ２１に、ＭＤＯＣは、ＩＣＯＳ‐ＦｃまたはＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃまたは^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃまたはα‐Ｂ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはα‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（５μｇ／ｍｌ）のいずれかの不存在下または存在下において、３０分間処理された。その後、ホスホ‐ｐ３８ＭＡＰＫの発現レベルが、ウエスタンブロッティングによって評価され、トータルｐ３８ＭＡＰＫの発現が、コントロールとして評価された。結果は、未処理細胞と比較し、ホスホ‐ｐ３８は、ＩＣＯＳ‐ＦｃおよびＩＣＯＳ‐ｍｓＦｃを用いた処理ではアップレギュレーションされ、^{Ｆ１１９Ｓ}ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理では、アップレギュレーションされないことを示した。抗Ｂ７ｈ抗体で得られた結果は、ホスホ‐ｐ３８は、α‐Ｂ７ｈ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅを用いた処理では、ＩＣＯＳ‐Ｆｃで得られたものと同等のレベルで、アップレギュレーションされたことを示した。対照的に、α‐Ｂ７ｈ／Ｒ＆Ｄを用いた処理は、最小の効果を示した。結果は、図１４に示されている。

［骨粗鬆症の慢性マウスモデルでのＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理の効果］
生後６／８週の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスがＯＶＸを受け、その２４時間後に、ＰＢＳまたはトータルマウスＩＣＯＳ‐Ｆｃ（マウスＩＣＯＳおよびマウスＦｃによって形成された）のいずれかを、４週間にわたり４日ごとに、腹腔内注射した。マウスは、最後の注射から４日後に殺された。石灰化した骨組織の形態計測によると、ＰＢＳが注射されたマウスにおいては、顕著な骨量減少が示され、骨量減少は、ＩＣＯＳ‐Ｆｃを用いた処理によって、顕著に抑制された。結果は、図１５に示されている。

本発明の原理は同一のまま、本発明の範囲から逸脱することなく、構造および実施形態の詳細は、専ら例示として説明および図示されたものに対し、広範囲な変更がなされてよいことは当然のことである。

［参考文献］
1. Swallow et al. B7h, a novel costimulatory homolog of B7.1 and B7.2, is induced by TNF-α. Immunity 1999;11:423-432.
2.Redoglia et al., Characterization of H4: a mouse T lymphocyte activation molecule functionally associated with the CD3/T cell receptor. Eur J Immunol 1996;26:2781-9.
3.Buonfiglio et al. Characterization of a novel human surface molecule selectively expressed by mature thymocytes, activated T cells and subsets of T cell lymphomas. Eur J Immunol. 1999;29:2863-74.
4.Hutloff et al. ICOS is an inducible T cell co-stimulator structurally and functionally related to CD28. Nature1999; 397:263-266.
5.Buonfiglio et al. The T cell activation molecule H4 and the CD28-like molecule ICOS are identical. Eur J Immunol 2000;30:3463-7.
6. Di Niro et al. Construction of miniantibodies for the in vivo study of human autoimmune diseases in animal models. BMC Biotechnology 2007;7:46.
7. Tomimori et al. Evaluation of pharmaceuticals with a novel 50-hour animal model of bone loss. J Bone Miner Res. 2009;24:1194-205.

Claims (14)

1. 骨減少症または骨粗鬆症を患う被験者の治療における使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
2. 前記リガンドは、
   ａ）配列ＩＤ番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質、
   ｂ）配列ＩＤ番号：２９に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質の相同体、
   ｃ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２９に記載の前記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ部分、
   ｄ）配列ＩＤ番号：２に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域、
   ｅ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ細胞外領域部分、または
   ｆ）配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有し、且つ、Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域の相同体、
   から選択される、請求項１に記載の使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
3. 前記リガンドは、可溶性の形態である、請求項１または２に記載の使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
4. 前記リガンドは、注射、輸液によって投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
5. 前記リガンドは、安定化分子に融合またはコンジュゲートされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
6. 前記リガンドは、ハイパーグリコシル化される、またはマンノース残基にコンジュゲートされる、請求項１から４のいずれか一項に記載の使用のためのＢ７ｈ受容体のリガンド。
7. 骨減少症または骨粗鬆症の治療に有用な薬理活性剤のスクリーニングのためのターゲットとしてのＢ７ｈ受容体の使用。
8. 前記薬理活性剤は、破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つを阻害する、請求項７に記載の使用。
9. 前記薬理活性剤は、Ｂ７ｈ受容体に結合する、請求項７または８に記載の使用。
10. 骨粗鬆症または骨減少症の治療における使用のための、Ｂ７ｈ受容体の少なくとも１つのリガンドおよび薬理的に許容される賦形剤を備える医薬組成物。
11. 前記Ｂ７ｈ受容体の少なくとも１つのリガンドは、
    ａ）配列ＩＤ番号：２９に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質、
    ｂ）配列ＩＤ番号：２９に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有する、ヒトＩＣＯＳタンパク質の相同体、
    ｃ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２９に記載の前記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ部分、
    ｄ）配列ＩＤ番号：２に記載のアミノ酸配列を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域、
    ｅ）Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列のヒトＩＣＯＳ細胞外領域部分、または
    ｆ）配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％相同な配列を有し、且つ、Ｂ７ｈ受容体への結合能、並びに配列ＩＤ番号：２に記載の前記アミノ酸配列の破骨細胞の分化、成熟および機能のうちの少なくとも１つの抑制能を有する、ヒトＩＣＯＳ細胞外領域の相同体、
    から選択される、請求項１０に記載の医薬組成物。
12. ａ）試験薬剤を供給する段階と、
    ｂ）Ｂ７ｈ受容体を発現する破骨細胞に、前記試験薬剤を接触するように配置する段階と、
    ｃ）破骨細胞の成熟、分化および機能のうちの少なくとも１つを低減させる前記試験薬剤の能力を試験する段階と、
    ｄ）破骨細胞の成熟、分化および機能のうちの少なくとも１つを低減させる前記試験薬剤を、骨減少症または骨粗鬆症の治療に有用な薬理活性剤として選択する段階であって、前記薬理活性剤は、Ｂ７ｈ受容体に結合する、選択する段階と、を備える、骨減少症または骨粗鬆症の治療における使用に適した薬理活性剤を識別する方法。
13. 前記試験する段階ｃ）は、破骨細胞による酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）の分泌、破骨細胞における細胞アクチン組織および破骨細胞によるカルシウム放出のうちの少なくとも１つを測定する段階を含む、請求項１２に記載の方法。
14. 骨粗鬆症または骨減少症を患う患者を供給する段階と、
    前記患者に、Ｂ７ｈ受容体のリガンドを含有する医薬を投与する段階と、
    それにより、前記患者の骨粗鬆症または骨減少症を軽減する段階と、を備える、骨粗鬆症または骨減少症を治療する方法。