ES2609780T3 - Anticuerpos humanos de alta afinidad contra el receptor activado por proteasa 2 humano - Google Patents

Anticuerpos humanos de alta afinidad contra el receptor activado por proteasa 2 humano Download PDF

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Marc R. Morra
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Abstract

Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851) y que interactúa con la Val-42 y el Asp-43 del PAR-2 humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2- LCDR3 seleccionadas entre el grupo que consisten en: (a) las SEQ ID NOs: 100-102-104 / 108-110-112; y (b) las SEQ ID NOs: 700-702-704 / 708-710-712

Description

Anticuerpos humanos de alta afinidad contra el receptor activado por proteasa 2 humano
5 Campo de la invención
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión al antígeno de los mismos, que son específicos para el receptor activado por proteasa 2 (PAR-2).
Antecedentes
Los receptores activados por proteasa ("PAR'') son una familia de receptores acoplados a proteínas G con siete transmembranales. Entre los receptores acoplados a proteínas G con siete transmembranales, los PAR tienen un modo de activación único; es decir, los PAR son activados por una escisión proteolítica en el amino terminal, para
15 generar un nuevo dominio N terminal que sirve como "ligando anclado." El ligando anclado interactúa con el bucle extracelular 2 del receptor, dando así como resultado la activación del receptor. Actualmente existen cuatro miembros conocidos de la familia PAR, denominados PAR-1, PAR-2, PAR-3 y PAR-4.
El PAR-2 también se conoce como "C140" (documento US 5.874.400). Los PAR-2 tanto humanos como murinos comparten el dominio de escisión de la proteasa SKGRSLIG (los residuos 6-13 de la SEQ ID NO: 852 y los residuos 8-15 de la SEQ ID NO: 856). Esta secuencia es escindida entre los residuos R y S por diversas proteasas tales como la tripsina, así como la triptasa de los mastocitos, el complejo factor tisular/factor VIIa y factor Xa, la proteinasa de neutrófilos 3 (PR-3), la elastasa de leucocitos humana y las proteasas procedentes de organismos patógenos.
25 La actividad del PAR-2 ha sido implicada o asociada con diversas enfermedades y afecciones que incluyen enfermedades inflamatorias, dolor, afecciones gastrointestinales, enfermedades neurológicas y trastornos cardiovasculares (véase, por ejemplo, Linder et al., 2000, J. Immunol. 165: 6504-6510; Vergnolle et al., 2001, Nature Medicine 7: 821-826; Cenac et al., 2007, J. Clin. Investigation 117: 636-647; Vergnolle, 2004, British J. Pharmacol.
141: 1264-1274; Knight et al., 2001, J. Allergy Clin. Immunol. 108: 797-803; Schmidlin et al., 2002, J. Immunol. 169: 5315-5321). Los anticuerpos que se unen al PAR-2 tienen el potencial de antagonizar la actividad del PAR-2 in vivo. Los anticuerpos anti-PAR-2 son por lo tanto potencialmente útiles para el tratamiento y/o la mejora de diversas afecciones patológicas.
Los anticuerpos que se unen al PAR-2 y algunos de los usos terapéuticos de los mismos, se mencionan en el
35 documento US 5.874.400, en el documento US 2007/0237759, en el documento WO 2009/005726 y en el documento US 2010/0119506. No obstante, sigue habiendo una necesidad en la materia de nuevos agentes moduladores del PAR-2, incluyendo anticuerpos anti-PAR-2, que pueden usarse para el tratamiento de las enfermedades y de las afecciones mediadas por el PAR-2.
Sumario breve de la invención
La presente invención proporciona anticuerpos humanos según se definen en las reivindicaciones que se unen al PAR-2 humano. Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otros, para la inhibición de la señalización mediada por el PAR-2 y para el tratamiento de las enfermedades y de los trastornos causados por, o relacionados con, la
45 activación del PAR-2.
La presente invención incluye anticuerpos que interactúan con la región N terminal del PAR-2 y bloquean la escisión proteolítica en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (según se define en el presente documento) pero no bloquea la escisión proteolítica en uno o más de los sitios de escisión de la proteasa no activadores. Según ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PAR-2 que muestran dichas propiedades de bloqueo de la escisión proteolítica interactúan con aminoácidos específicos en las proximidades del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Por ejemplo, la presente invención proporciona anticuerpos anti-PAR-2 con una actividad de bloqueo de la escisión de la proteasa y que interactúan con la Val-42 y la Asp-43 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851) y que pueden interactuar adicionalmente con uno o más residuos del PAR-2 humano seleccionados entre el
55 grupo que consiste en la Ser-37, la Leu-38, la Ile-39, la Gly-40 y la Gly-44.
Según algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención se unen específicamente al PAR2 humano y al PAR-2 de mono, pero no se unen a al menos un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en el PAR-2 de ratón, de rata, de conejo, de perro y de cerdo. La presente invención también incluye anticuerpos que son capaces de inhibir o de atenuar la activación proteolítica del PAR-2 pero que no bloquean la escisión proteolítica del PAR-2. En el presente documento se describen algunos ejemplos de métodos para la medición/evaluación de la capacidad de un anticuerpo para bloquear la escisión o la activación proteolítica del PAR
2.
65 Los anticuerpos de la invención pueden ser completos (por ejemplo, un anticuerpo IgG1 o IgG4) o pueden comprender únicamente una porción de unión al antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab’)2 o scFv) y pueden
estar modificados para que afecten a la funcionalidad, por ejemplo, para la eliminación de funciones efectoras residuales (Reddy et al., 2000, J. Immunol. 164: 1925-1933).
En el presente documento se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que
5 comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 402, 406, 410, 426, 430, 434, 450, 454, 458, 474, 478, 482, 498, 502, 506, 522, 526, 530, 546, 550, 554, 570, 574, 578, 594, 598, 602, 618, 622, 626, 642, 646, 650, 666, 670, 674, 690, 694, 698, 714, 718, 722, 738, 742, 746, 762, 766, 770, 786, 790, 794, 810, 814, 818, 834 y 838, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia. El anticuerpo o la porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 98, 146, 338 y 714.
15 En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380, 384, 394, 404, 408, 418, 428, 432, 442, 452, 456, 466, 476, 480, 490, 500, 504, 514, 524, 528, 538, 548, 552, 562, 572, 576, 586, 596, 600, 610, 620, 624, 634, 644, 648, 658, 668, 672, 682, 692, 696, 706, 716, 720, 730, 740, 744, 754, 764, 768, 778, 788, 792, 802, 812, 816, 826, 836 y 840, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %
o al menos un 99 % de identidad en la secuencia. El anticuerpo o la porción de unión al antígeno de un anticuerpo
25 puede comprender una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 106, 154, 346 y 692.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que comprende un par de secuencias HCVR y LCVR (HCVR/LCVR) seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500,
35 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 714/692, 718/720, 722/730, 738/740, 742/744, 746/754, 762/764, 766/768, 770/778, 786/788, 790/792, 794/802, 810/812, 814/816, 818/826, 834/836 y 838/840. El anticuerpo o un fragmento del mismo puede comprender una HCVR y una LCVR seleccionadas entre el par de secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98/106, 146/154, 338/346 y 714/692.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio de la cadena pesada CDR3 (HCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 32, 56, 80, 104, 128, 152, 176, 200, 224, 248, 272, 45 296, 320, 344, 368, 392, 416, 440, 464, 488, 512, 536, 560, 584, 608, 632, 656, 680, 704, 728, 752, 776, 800 y 824,
o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia; y un dominio de la cadena ligera CDR3 (LCDR3) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 40, 64, 88, 112, 136, 160, 184, 208, 232, 256, 280, 304, 328, 352, 376, 400, 424, 448, 472, 496, 520, 544, 568, 592, 616, 640, 664, 688, 712, 736, 760, 784, 808 y 832, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia.
El anticuerpo o la porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender un par de secuencias de aminoácidos de HCDR3/LCDR3 seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8/16, 32/40, 56/64,
55 80/88, 104/112, 128/136, 152/160, 176/184, 200/208, 224/232, 248/256, 272/280, 296/304, 320/328, 344/352, 368/376, 392/400, 416/424, 440/448, 464/472, 488/496, 512/520, 536/544, 560/568, 584/592, 608/616, 632/640, 656/664, 680/688, 704/712, 728/736, 752/760, 776/784, 800/808 y 824/832. El anticuerpo o la porción de unión al antígeno de un anticuerpo puede comprender un par de secuencias de aminoácidos HCDR3/LCDR3 seleccionado entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 104/112, 152/160, 344/352 y 704/712. Algunos ejemplos no limitantes de anticuerpos anti-PAR-2 que tienen estos pares HCDR3/LCDR3 son los anticuerpos denominados H4H588N, H4H591 N, H4H618N y H4H581 P, respectivamente.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende adicionalmente un dominio de la cadena pesada CDR1 (HCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos 65 seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 28, 52, 76, 100, 124, 148, 172, 196, 220, 244, 268, 292, 316, 340, 364, 388, 412, 436, 460, 484, 508, 532, 556, 580, 604, 628, 652, 676, 700, 724, 748, 772, 796 y 820,
o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia; un dominio de la cadena pesada CDR2 (HCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 30, 54, 78, 102, 126, 150, 174, 198, 222, 246, 270, 294, 318, 342, 366, 390, 414, 438, 462, 486, 510, 534, 558, 582, 606, 630, 654,
5 678, 702, 726, 750, 774, 798 y 822, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia; un dominio de la cadena ligera CDR1 (LCDR1) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 36, 60, 84, 108, 132, 156, 180, 204, 228, 252, 276, 300, 324, 348, 372, 396, 420, 444, 468, 492, 516, 540, 564, 588, 612, 636, 660, 684, 708, 732, 756, 780, 804 y 828, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia; y un dominio de la cadena ligera CDR2 (LCDR2) que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 38, 62, 86, 110, 134, 158, 182, 206, 230, 254, 278, 302, 326, 350, 374, 398, 422, 446, 470, 494, 518, 542, 566, 590, 614, 638, 662, 686, 710, 734, 758, 782, 806 y 830,
o una secuencia sustancialmente similar de las mismas, que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos 15 un 98 % o al menos un 99 % de identidad en la secuencia.
Algunos ejemplos de anticuerpos y de fragmentos de unión al antígeno no limitantes comprenden los dominios HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 y LCDR3, respectivamente, seleccionados entre el grupo que consiste en: (i) las SEQ ID NO: 100, 102, 104, 108, 110 y 112 (por ejemplo, el H4H588N); (ii) las SEQ ID NO: 148, 150, 152, 156, 158 y 160 (por ejemplo, el H4H591 N); (iii) las SEQ ID NO: 340, 342, 344, 348, 350 y 352 (por ejemplo, el H4H618N); y (iv) las SEQ ID NO: 700, 702, 704, 708, 710 y 712 (por ejemplo, el H4H581 P). Las secuencias de aminoácidos de estos ejemplos de CDR están representadas en las Fig. 2 y 3.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo
25 que se une específicamente al PAR-2, en el que el anticuerpo o el fragmento comprende los dominios de las CDR de la cadena pesada y ligera contenidos en las secuencias de la cadena pesada y ligera, seleccionados entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/20, 22/24, 26/34, 42/44, 46/48, 50/58, 66/68, 70/72, 74/82, 90/92, 94/96, 98/106, 114/116, 118/120, 122/130, 138/140, 142/144, 146/154, 162/164, 166/168, 170/178, 186/188, 190/192, 194/202, 210/212, 214/216, 218/226, 234/236, 238/240, 242/250, 258/260, 262/264, 266/274, 282/284, 286/288, 290/298, 306/308, 310/312, 314/322, 330/332, 334/336, 338/346, 354/356, 358/360, 362/370, 378/380, 382/384, 386/394, 402/404, 406/408, 410/418, 426/428, 430/432, 434/442, 450/452, 454/456, 458/466, 474/476, 478/480, 482/490, 498/500, 502/504, 506/514, 522/524, 526/528, 530/538, 546/548, 550/552, 554/562, 570/572, 574/576, 578/586, 594/596, 598/600, 602/610, 618/620, 622/624, 626/634, 642/644, 646/648, 650/658, 666/668, 670/672, 674/682, 690/692, 694/696, 698/706, 714/716, 714/692, 718/720, 722/730, 738/740, 742/744, 746/754,
35 762/764, 766/768, 770/778, 786/788, 790/792, 794/802, 810/812, 814/816, 818/826, 834/836 y 838/840. El anticuerpo o el fragmento puede comprender las secuencias de las CDR contenidas en las HCVR y en las LCVR seleccionadas entre el par de secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 98/106, 146/154, 338/346 y 714/692. Los métodos y las técnicas para la identificación de las CDR en las secuencias de aminoácidos de las HCVR y de las LCVR son bien conocidos en la materia y pueden usarse para la identificación de las CDR en las secuencias de aminoácidos de las HCVR y/o de las LCVR especificadas divulgadas en el presente documento. Algunos ejemplos de las convenciones que pueden usarse para la identificación de los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chotia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de la secuencia, la definición de Chotia se basa en la ubicación de las regiones en bucle estructurales, y la definición de AbM es un compromiso entre las metodologías de Kabat y de Chotia. Véase, por
45 ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani et al., J. Mol. Biol. 273: 927-948 (1997); y Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86: 92689272 (1989). También hay disponibles bases de datos públicas para la identificación de las secuencias de las CDR en un anticuerpo.
En otro aspecto, la invención proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican para los anticuerpos anti-PAR-2 o para fragmentos de los mismos de la invención. Los vectores de expresión recombinantes portadores de los ácidos nucleicos de la invención, y las células hospedadoras en las que se han introducido dichos vectores, también están englobados por la invención, al igual que los métodos para la producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en unas condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la
55 recuperación de los anticuerpos producidos.
En el presente documento se describe un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 21, 25, 41, 45, 49, 65, 69, 73, 89, 93, 97, 113, 117, 121, 137, 141, 145, 161, 165, 169, 185, 189, 193, 209, 213, 217, 233, 237, 241, 257, 261, 265, 281, 285, 289, 305, 309, 313, 329, 333, 337, 353, 357, 361, 377, 381, 385, 401, 405, 409, 425, 429, 433, 449, 453, 457, 473, 477, 481, 497, 501, 505, 521, 525, 529, 545, 549, 553, 569, 573, 577, 593, 597, 601, 617, 621, 625, 641, 645, 649, 665, 669, 673, 689, 693, 697, 713, 717, 721, 737, 741, 745, 761, 765, 769, 785, 789, 793, 809, 813, 817, 833 y 837, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma. El anticuerpo o el fragmento del
65 mismo puede comprender una HCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 97, 145, 337 y 713.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende una LCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 19, 23, 33, 43, 47, 57, 67, 71, 81, 91, 95, 105, 115, 119, 129, 139, 143, 153, 163, 167, 177, 187, 191, 201, 211, 215, 225, 235, 239, 249, 259, 263, 273, 283, 287, 297, 307, 311, 321, 331, 335, 345, 355, 359, 369, 379, 383, 393, 403,
5 407, 417, 427, 431, 441, 451, 455, 465, 475, 479, 489, 499, 503, 513, 523, 527, 537, 547, 551, 561, 571, 575, 585, 595, 599, 609, 619, 623, 633, 643, 647, 657, 667, 671, 681, 691, 695, 705, 715, 719, 729, 739, 743, 753, 763, 767, 777, 787, 791, 801, 811, 815, 825, 835 y 839, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede comprender una LCVR codificada por una secuencia de ácidos nucleicos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 105, 153, 345 y 715.
En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 415, 439,
15 463, 487, 511, 535, 559, 583, 607, 631, 655, 679, 703, 727, 751, 775, 799 y 823, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351, 375, 399, 423, 447, 471, 495, 519, 543, 567, 591, 615, 639, 663, 687, 711, 735, 759, 783, 807 y 831, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma. El anticuerpo o el fragmento del mismo puede comprender las secuencias de las HCDR3 y de las LCDR3 codificadas por los pares de secuencias de ácidos nucleicos seleccionados entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 103/111, 151/159, 343/351 y 703/711.
25 En el presente documento también se describe un anticuerpo o un fragmento del mismo que comprende adicionalmente un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 27, 51, 75, 99, 123, 147, 171, 195, 219, 243, 267, 291, 315, 339, 363, 387, 411, 435, 459, 483, 507, 531, 555, 579, 603, 627, 651, 675, 699, 723, 747, 771, 795 y 819, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 413, 437, 461, 485, 509, 533, 557, 581, 605, 629, 653, 677, 701, 725, 749, 773, 797 y 821, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las
35 SEQ ID NO: 11, 35, 59, 83, 107, 131, 155, 179, 203, 227, 251, 275, 299, 323, 347, 371, 395, 419, 443, 467, 491, 515, 539, 563, 587, 611, 635, 659, 683, 707, 731, 755, 779, 803 y 827, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada entre el grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349, 373, 397, 421, 445, 469, 493, 517, 541, 565, 589, 613, 637, 661, 685, 709, 733, 757, 781, 805, 829, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología con la misma.
El anticuerpo o el fragmento del mismo puede comprender las secuencias de la CDR de la cadena pesada y ligera codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos de las SEQ ID NO: 97 y 105; de las SEQ ID NO: 145 y 153; de
45 las SEQ ID NO: 337 y 345; o de las SEQ ID NO: 713 y 715.
En el presente documento también se describe un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo que se une específicamente al PAR-2, que comprende una HCDR3 y una LCDR3, en las que la HCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6-X7 -X8 -X9 -X10 -X11 -X12 (SEQ 10 NO: 843)en la que X1es Ala o Val, X2 es Lys, X3 es Glyo Glu, X4 es Asp o Gly, X5 esPhe o Asp, X6 es Trp o Ser, X7 es Ser o Gly, X8 es Gly o Tyr, X9 es Tyr o Asp, X10 es Phe o Leu, X11 es Asp o Ala, y X12 es Tyr; y la LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6-X7 -X8 -X9 (SEQ ID NO: 846) en la que X1 es Met o Gln, X2 es Gln, X3 es Ala o Tyr, X4 es Thr o Lys, X5 es Gln, Ser o Ile, X6 es Phe o Ser, X7 es Pro, X8 es Thr o Leu, y X9 es Thr o está ausente.
55 Un anticuerpo aislado o un fragmento del mismo más específico que se une específicamente al PAR-2 puede comprender una secuencia HCDR1 de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 841), en la que X1 es Gly, X2 es Phe, X3 es Thr, X4 es Phe, X5 es Ser o Arg, X6 es Ser o Arg, X7 es Tyr, y X8 es Gly, Ala o Thr; una secuencia HCDR2 de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 842), en la que X1 es Ile, X2 es Ser, Gly o Thr, X3 es Tyr, Gly o Asp, X4 es Asp, Gly o Ser, X5 es Gly o Arg, X6 es Ile, Gly o Ala, X7 es Asn, Ser, Arg o Gly, y X8esLys, Alao Thr; una secuencia HCDR3 de lafórmula X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12 (SEQ ID NO: 843) en la que X1 es Ala o Val, X2 es Lys, X3 es Gly o Glu, X4 es Asp o Gly, X5 es Phe o Asp, X6 es Trp
o Ser, X7 es Ser o Gly, X8 es Gly o Tyr, X9 es Tyr o Asp, X10 es Phe o Leu, X11 es Asp o Ala, y X12 es Tyr; una secuencia LCDR1 de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6-X7 -X8 -X9 -X10 -X11 (SEQ ID NO: 844) en la que X1 es
65 Gln, X2 es Ser o Gly, X3 es Leu o Ile, X4 es Val o Ser, X5 es His, Asn o Thr, X6 es Ser, Asn o Tyr, X7 es Asp o está ausente; X8 es Gly o está ausente, X9 es Asn o está ausente, X10 es Thr o está ausente, y X11 es Tyr o está ausente;
una secuencia LCDR2 de la fórmula X1 -X2 -X3 (SEQ ID NO: 845) en la que X1 es Lys o Ala, X2 es Ile, Ala o Thr, y X3 es Ser; y una LCDR3 comprende una secuencia de aminoácidos de la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6-X7 -X8 -X9 (SEQ ID NO: 846) en la que X1 es Met o Gln, X2 es Gln, X3 es Ala o Tyr, X4 es Thr o Lys, X5 es Gln, Ser o Ile, X6 es Phe o Ser, X7 es Pro, X8 es Thr o Leu, y X9 es Thr o está ausente.
5 La invención engloba los anticuerpos anti-PAR-2 que tienen un patrón de glicosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación puede ser útil para eliminar sitios de glicosilación, o un anticuerpo que carece de una fracción de fucosa presente en la cadena de oligosacárido, por ejemplo, para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) (véase, Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). En otras aplicaciones, la modificación de la galactosilación puede realizarse con objeto de modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica según se define en las reivindicaciones que comprende un anticuerpo humano recombinante o un fragmento del mismo que se une específicamente al PAR-2 y
15 un portador farmacéuticamente aceptable. En el presente documento también se describe una composición que es una combinación de un inhibidor del PAR-2 y un segundo agente terapéutico. El inhibidor del PAR-2 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo. El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que ventajosamente se combine con un inhibidor del PAR-2. Algunos ejemplos de agentes que pueden combinarse ventajosamente con un inhibidor del PAR-2 incluyen, sin limitación, otros agentes que inhiben la actividad del PAR-2 (incluyendo otros anticuerpos o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos, inhibidores peptídicos, antagonistas de molécula pequeña, etc.) y/o agentes que interfieren en la señalización del PAR-2 secuencia arriba o secuencia abajo.
En el presente documento también se describen métodos para la inhibición de la actividad del PAR-2 mediante el
25 uso del anticuerpo anti-PAR-2 o de una porción de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención, en los que los métodos terapéuticos comprenden la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención. La invención proporciona el anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno o la composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en el que el paciente muestra uno o más síntomas o indicios de una enfermedad o de un trastorno causado por la actividad del PAR-2, en el que la enfermedad o el trastorno causado por la actividad del PAR-2 es una enfermedad o un trastorno seleccionado entre el grupo que consiste en dolor, prurito, asma, artritis reumatoide, fibrosis, dermatitis atópica, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, pancreatitis, úlcera, enfermedad de Crohn, cáncer y enfermedad de Netherton. El anticuerpo anti-PAR-2 o el fragmento de anticuerpo de la invención puede funcionar
35 para bloquear la interacción entre el PAR-2 y una proteasa (por ejemplo, tripsina o proteasas de serina de tipo tripsina) o inhibir de otra forma la activación del PAR-2 mediada por proteasa. Alternativamente, o adicionalmente, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden interferir en la interacción entre el ligando anclado del PAR-2 y uno o más de los bucles extracelulares del PAR-2 (véase, por ejemplo, MacFarlane et al., 2001, Pharmacological Reviews 53: 245-282 para un análisis general de la escisión y la activación proteolítica del PAR-2). El anticuerpo o el fragmento de anticuerpo puede usarse solo o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales.
La presente invención también incluye el uso de un anticuerpo anti-PAR-2 o de una porción de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno relacionado con, o causado por, la actividad del PAR-2 en un paciente, según se define en las
45 reivindicaciones.
Otras realizaciones serán evidentes a partir de una revisión de la descripción detallada que sigue.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Tabla de comparación de las secuencias de las regiones variables de la cadena pesada y las CDR de los anticuerpos H4H581P, H4H588N, H4H591N y H4H618N. Fig. 2. Tabla de comparación de las secuencias de las regiones variables de la cadena ligera y las CDR de los anticuerpos H4H581P, H4H588N, H4H591N y H4H618N.
55 Fig. 3. El panel superior (A) muestra los péptidos marcados con biotina en C y en N terminal correspondientes a la secuencia que rodea el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (GTNRSSKGRSLIGKVDGT; SEQ ID NO: 852). Los sitios de escisión de la proteasa están indicados por el número 1 (un sitio de escisión de la proteasa no activador secuencia arriba) y por el número 2 (el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador). Los tamaños esperados de los fragmentos no escindidos y escindidos se indican en la parte superior de la tabla. El panel inferior (B) muestra los tamaños de los fragmentos que se observaron después de 0, 5 y 15 minutos de tratamiento con tripsina en presencia de los anticuerpos anti-PAR-2 o de un control negativo. Fig. 4. El panel superior (A) muestra los péptidos de ratón, de rata y humanos correspondientes a la secuencia que rodea los sitios de escisión de la proteasa del PAR-2 activadores (SEQ ID NO: 883, 858 y 852, respectivamente). Los sitios de escisión de la proteasa están indicados por los números 1 y 2 (sitios de escisión
65 de la proteasa no activadores secuencia arriba) y por el número 3 (el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador). Los tamaños esperados de los fragmentos no escindidos y escindidos se indican en la parte superior
de la tabla. El panel inferior (B) muestra los tamaños de los fragmentos que se observaron después de 0 y 5 minutos de tratamiento con tripsina en presencia de los anticuerpos anti-PAR-2 o de un control negativo. Fig. 5. Representación de los resultados del cartografiado del epítopo con un cribado con alanina para la unión del anticuerpo a la secuencia que rodea el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (la SEQ ID NO:
5 852). Los triángulos claros representan los sitios de escisión de la proteasa ubicados secuencia arriba del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. El sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador está indicado por un triángulo oscuro. Los números entre paréntesis indican la numeración de los aminoácidos en la secuencia completa del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). Los números en círculos bajo los residuos de aminoácidos indican el porcentaje de la T½ de la unión del anticuerpo al péptido mutante en el cribado con alanina con respecto a la T½ de la unión del anticuerpo al péptido natural, según se muestra en las Tablas 24-26 y 28. Si se llevan a cabo experimentos por duplicado, el porcentaje promedio de la T½ se muestra en el círculo. Los círculos negros con números blancos indican los aminoácidos que, cuando son cambiados a alanina, reducen la T½ de la unión del anticuerpo hasta un 30 % o menos de la T½ de la unión del anticuerpo al péptido natural. Dichos aminoácidos están definidos en el presente documento como los residuos con los que interactúa el anticuerpo.
Descripción detallada
Antes de describir la presente invención, debe entenderse que esta invención no está limitada a los métodos y las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento es únicamente con el fin de describir las realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, dado que el ámbito de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones anexas.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento
25 tienen el mismo significado al comprendido habitualmente por el experto habitual en la materia a la que pertenece esta invención. Según se usa en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado en particular, significa que el valor puede variar con respecto al valor indicado en no más de 1½. Por ejemplo, según se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores entre los mismos (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque en la práctica o en el ensayo de la presente invención puede usarse cualquier método o material similar o equivalente a los descritos en el presente documento, ahora se describen los métodos y los materiales preferidos.
Definiciones
35 Según se usa en el presente documento, las expresiones "receptor activado por proteinasa 2", receptor activado por proteasa 2" y "PAR-2", se refieren a la proteína PAR-2 completa. El PAR-2 humano está codificado por la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en la SEQ ID NO: 850 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 851. Las secuencias de aminoácidos de las moléculas del PAR-2 de especies no humanas (por ejemplo, de ratón, de mono, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) están disponibles en recursos públicos.
El término "fragmento del PAR-2", según se usa en el presente documento, significa un péptido o un polipéptido que comprende 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos ubicados secuencia arriba desde (es decir, N terminales a) el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (según se define a continuación en el presente documento)
45 y/o 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos contiguos ubicados secuencia abajo desde (es decir, C terminales a) el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Algunos ejemplos de fragmentos del PAR-2 están ilustrados en el Ejemplo 2, Tabla 2 (indicados como Péptidos "A" hasta "J"; es decir, las SEQ ID NOs: 852 hasta 861, respectivamente).
Las expresiones "PAR-2" y "fragmento del PAR-2", según se usan en el presente documento, se refieren a la proteína PAR-2 humana o a un fragmento, salvo que se especifique como procedente de una especie no humana (por ejemplo, "PAR-2 de ratón", fragmento del PAR-2 de ratón", "PAR-2 de mono", "fragmento del PAR-2 de mono" etc.).
55 Según se usa en el contexto de la presente divulgación, la expresión "sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador" significa la unión de los residuos de Arg-36 y de Ser-37 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). El sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador es el sitio que, cuando es escindido, da como resultado la formación del ligando PAR-2 anclado en la proteína natural.
El término "proteasa del PAR-2", según se usa en el presente documento, significa una enzima que es capaz de escindir el PAR-2 o un fragmento del PAR-2 en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Algunos ejemplos de proteasas del PAR-2 incluyen tripsina, catepsina G, acrosina, factor tisular VIIa, factor tisular Xa, proteasa de tipo tripsina de las vías respiratorias humanas, triptasa, proteasa de serina de tipo membrana 1 (MT-SP1), TMPRSS2, proteasa 3, elastasa, calicreína 5, calicreína 6, calicreína 14, proteína C activada, duodenasa,
65 gingipaínas R, Der p1, Der p3, Der p9, termolisina, serralisina y proteasa de T. denticla.
El término "anticuerpo", según se usa en el presente documento, pretende referirse a moléculas de inmunoglobulina que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por puentes de disulfuro, así como a los multímeros de las mismas (por ejemplo, la IgM). Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una 5 región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones en marco (FR). Cada VH y VL está formada por tres CDR y por cuatro FR, dispuestas desde el amino terminal hacia el carboxi terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En diferentes realizaciones de la invención, las FR del anticuerpo anti-Ang-2 (o de una porción de unión al antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias germinales humanas, o pueden estar modificadas de forma natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos puede ser definida basándose en
15 un análisis paralelo de dos o más CDR.
El término "anticuerpo", según se usa en el presente documento, también incluye fragmentos de unión al antígeno de moléculas de anticuerpo completas. Los términos "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión al antígeno" de un anticuerpo, y similares, según se usan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glicoproteína natural, obtenible enzimáticamente, sintética o modificada genéticamente que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden derivar, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas mediante el uso de cualquier técnica convencional adecuada, tal como una digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y la expresión del ADN que codifica para los dominios variable y opcionalmente constante
25 de un anticuerpo. Dicho ADN es conocido y/o está fácilmente disponible, por ejemplo, en fuentes comerciales, en colecciones de ADN (incluyendo, por ejemplo, colecciones de fago-anticuerpo), o puede ser sintetizado. El ADN puede ser secuenciado o manipulado químicamente o mediante el uso de técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, para crear residuos de cisteína, para modificar, añadir o delecionar aminoácidos, etc.
Algunos ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadena individual (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo, que consisten en los residuos de aminoácidos que mimetizan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada).
35 Otras moléculas modificadas, tales como diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y minicuerpos, también están englobadas en la expresión "fragmento de unión al antígeno", según se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo comprenderá normalmente al menos un dominio variable. El dominio variable puede tener cualquier tamaño o composición de aminoácidos, y generalmente comprenderá al menos una CDR que es adyacente o está en marco con una o más secuencias en marco. En los fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio VH asociado con un dominio VL, los dominios VH y VL pueden estar situados el uno respecto del otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener dímeros de VH-VH, de VH-VL o de VL-VL. Alternativamente, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio VH o VL monomérico.
45 En ciertas realizaciones, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente a al menos un dominio constante. Algunos ejemplos no limitantes de configuraciones de dominios variables y constantes que pueden encontrarse en un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención incluyen: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-Ch3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; y (xiv) VL-CL. En cualquier configuración de dominios variable y constante, incluyendo cualquiera de los ejemplos de configuraciones indicados anteriormente, los dominios variable y constante pueden estar unidos directamente entre sí, o pueden estar unidos por una bisagra completa o parcial, o por una región de conexión. Una región de bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos que dan
55 como resultado una unión flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una única molécula de polipéptido. Además, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo de la presente invención puede comprender un homodímero o un heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante indicadas anteriormente en una asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios VH o VL monoméricos (por ejemplo, mediante puentes de disulfuro).
Al igual que con las moléculas de anticuerpos completas, los fragmentos de unión al antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión al antígeno multiespecífico de un anticuerpo comprenderá normalmente al menos dos dominios variables diferentes, en el que cada dominio variable es capaz de unirse específicamente a un antígeno distinto o a un epítopo diferente del mismo antígeno.
65 Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los ejemplos de formatos de anticuerpos biespecíficos divulgados en el presente documento, puede ser adaptado para su uso en el contexto de un fragmento de unión al
antígeno de un anticuerpo de la presente invención mediante el uso de técnicas rutinarias disponibles en la materia.
La región constante de un anticuerpo es importante en la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y mediar en la citotoxicidad celular. Por lo tanto, el isotipo de un anticuerpo puede seleccionarse sobre la base de si es 5 deseable que el anticuerpo medie en la citotoxicidad.
El término "anticuerpo humano", según se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulinas germinales humanas. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos que no son codificados por las secuencias de las inmunoglobulinas germinales humanas (por ejemplo, mutaciones inducidas mediante una mutagénesis aleatoria o específica in vitro o mediante una mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR, y en particular en la CDR3. Sin embargo, el término "anticuerpo humano", según se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tales como de un ratón, en secuencias en marco humanas.
15 El término "anticuerpo humano recombinante", según se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados mediante medios recombinantes, tales como los anticuerpos expresados mediante el uso de un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descritos adicionalmente a continuación), los anticuerpos aislados a partir de una colección combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes (descritos adicionalmente a continuación), los anticuerpos aislados a partir de un animal (por ejemplo, de un ratón) que es transgénico para los genes de la inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) o los anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante anticuerpos o cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias génicas de inmunoglobulinas humanas en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos
25 recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de las secuencias de inmunoglobulinas germinales humanas. En ciertas realizaciones, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes son sometidos a una mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para las secuencias de la Ig humana, a una mutagénesis somática in vivo), y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivan de, y están relacionadas con, las secuencias germinales humanas de la VH y de la VL, puede no existir de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
Los anticuerpos humanos pueden existir en dos formas que están asociadas con una heterogeneidad en bisagra. En una forma, una molécula de inmunoglobulina comprende un constructo estable de cuatro cadenas de
35 aproximadamente 150-160 kDa en el que los dímeros se mantienen unidos entre sí mediante un puente de disulfuro entre las cadenas pesadas. En una segunda forma, los dímeros no están unidos a través de puentes de disulfuro intercatenarios, y se forma una molécula de aproximadamente 75-80 kDa con una cadena ligera y una pesada acopladas covalentemente (semianticuerpo). Estas formas han sido extremadamente difíciles de separar, incluso después de una purificación por afinidad.
La frecuencia de aparición de la segunda forma en varios isotipos intactos de IgG se debe, pero no se limita a, a las diferencias estructurales asociadas con el isotipo de la región de bisagra del anticuerpo. La sustitución de un único aminoácido en la región de bisagra de la bisagra de la IgG4 humana puede reducir significativamente la aparición de la segunda forma (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) hasta los niveles que se observan
45 normalmente mediante el uso de una bisagra de la IgG1 humana. La presente invención engloba anticuerpos que tienen una o más mutaciones en la región de bisagra, CH2 o CH3 que pueden ser deseables, por ejemplo, en la producción, para mejorar el rendimiento de la forma deseada del anticuerpo.
Un "anticuerpo aislado", según se usa en el presente documento, significa un anticuerpo que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de al menos un componente de su entorno natural. Por ejemplo, un anticuerpo que ha sido separado o extraído de al menos un componente de un organismo, tejido o célula en los que el anticuerpo existe de forma natural o es producido de forma natural, es un "anticuerpo aislado" para los fines de la presente invención. Un anticuerpo aislado también incluye un anticuerpo in situ en una célula recombinante, así como un anticuerpo que ha sido sometido a al menos una etapa de purificación o de aislamiento. Según ciertas realizaciones,
55 un anticuerpo aislado puede estar habitualmente exento de otro material celular y/o de productos químicos.
El término "que se une específicamente", o similares, significa que un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en las condiciones fisiológicas. La unión específica puede estar caracterizada por una constante de disociación de 1 x 10-6 M o menos. Los métodos para la determinación de si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, una diálisis en equilibrio, una resonancia de plasmón superficial, y similares. Por ejemplo, un anticuerpo "que se une específicamente" al PAR-2 humano, según se usa en el contexto de la presente invención, incluye anticuerpos que se unen al PAR-2 humano o a una porción del mismo (por ejemplo, un fragmento del PAR-2 que comprende el sitio de escisión de la proteasa activador) con una KD de menos de aproximadamente 1.000 nM, 65 de menos de aproximadamente 500 nM, de menos de aproximadamente 300 nM, de menos de aproximadamente 200 nM, de menos de aproximadamente 100 nM, de menos de aproximadamente 90 nM, de menos de
aproximadamente 80 nM, de menos de aproximadamente 70 nM, de menos de aproximadamente 60 nM, de menos de aproximadamente 50 nM, de menos de aproximadamente 40 nM, de menos de aproximadamente 30 nM, de menos de aproximadamente 20 nM, de menos de aproximadamente 10 nM, de menos de aproximadamente 5 nM, de menos de aproximadamente 4 nM, de menos de aproximadamente 3 nM, de menos de aproximadamente 2 nM,
5 de menos de aproximadamente 1 nM o de menos de aproximadamente 0,5 nM, medida en un ensayo de resonancia de plasmón superficial (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4, en el presente documento). Un anticuerpo aislado que se une específicamente al PAR-2 humano puede tener, sin embargo, una reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas del PAR-2 de otras especies.
Un anticuerpo "neutralizante" o "bloqueante", según se usa en el presente documento, pretende referirse a un anticuerpo cuya unión al PAR-2: (i) interfiere en la interacción entre el PAR-2 o un fragmento del PAR-2 y una o más proteasas, (ii) previene la escisión del PAR-2 o de un fragmento del PAR-2 por parte de una proteasa del PAR-2, (iii) inhibe la interacción entre el ligando del PAR-2 anclado y un bucle extracelular del PAR-2, y/o (iv) da como resultado la inhibición de al menos una función biológica del PAR-2. No es necesario que la inhibición causada por un
15 anticuerpo neutralizante o bloqueante del PAR-2 sea completa, siempre que sea detectable mediante el uso de un ensayo apropiado. Algunos ejemplos de ensayos para la detección de la inhibición del PAR-2 se describen en el presente documento.
Los anticuerpos anti-PAR-2 completamente humanos divulgados en el presente documento pueden comprender una
o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones en marco y/o en las CDR de los dominios de la cadena pesada y ligera, en comparación con las correspondientes secuencias de la línea germinal. Dichas mutaciones pueden ser fácilmente averiguadas mediante la comparación de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento con las secuencias de las líneas germinales disponibles, por ejemplo, en bases de datos públicas de secuencias de anticuerpos. La presente invención incluye anticuerpos y fragmentos de 25 unión al antígeno de los mismos, que derivan de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en los que uno o más aminoácidos de una o más de las regiones en marco y/o de las CDR están retromutados a los correspondientes residuos de la línea germinal o a una sustitución de aminoácidos conservativa (natural o no natural) de los correspondientes residuos de la línea germinal (dichos cambios en las secuencias se denominan en el presente documento "retromutaciones de la línea germinal"). Una persona experta habitual en la materia, partiendo de las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno que comprenden una o más retromutaciones individuales de la línea germinal o combinaciones de las mismas. En ciertas realizaciones, todos los residuos en marco y/o de las CDR de los dominios VH y/o VL están retromutados a la secuencia de la línea germinal. En otras realizaciones, únicamente algunos residuos están retromutados a la 35 secuencia de la línea germinal, por ejemplo, únicamente los residuos mutados que se encuentran en los primeros 8 aminoácidos de la FR1 o en los últimos 8 aminoácidos de la FR4, o únicamente los residuos mutados que se encuentran en la CDR1, en la CDR2 o en la CDR3. Adicionalmente, los anticuerpos de la presente invención pueden contener cualquier combinación de dos o más retromutaciones de la línea germinal en las regiones en marco y/o de la CDR, es decir, en las que algunos residuos individuales están retromutados a la secuencia de la línea germinal, mientras que otros ciertos residuos que difieren de la secuencia de la línea germinal se mantienen. Una vez obtenidos, puede comprobarse fácilmente que los anticuerpos y los fragmentos de unión al antígeno que contienen una o más retromutaciones de la línea germinal tienen una o más de las propiedades deseadas, tales como, una especificidad de unión mejorada, una afinidad de unión mejorada, unas propiedades biológicas antagonistas o agonistas mejoradas o potenciadas (según sea el caso), una inmunogenicidad reducida, etc. Los anticuerpos y los
45 fragmentos de unión al antígeno obtenidos de esta forma general están englobados en la presente invención.
En el presente documento también se describen anticuerpos anti-PAR-2 que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, se incluyen anticuerpos anti-PAR-2 que tienen las secuencias de aminoácidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones conservativas de aminoácidos con respecto a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de la HCVR, de la LCVR y/o de la CDR divulgadas en el presente documento. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 698 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos
55 de la SEQ ID NO: 698 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 698 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 698 con 2 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 706 con 8 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 706 con 6 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 706 con 4 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas. El anticuerpo puede comprender una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 706 con 2 o menos sustituciones de aminoácidos conservativas.
65 El término "resonancia de plasmón superficial", según se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno
óptico que permite el análisis de las interacciones en tiempo real mediante la detección de las alteraciones en las concentraciones de proteínas en una matriz de un biosensor, por ejemplo, mediante el uso del sistema BIAcore™ (Biacore Life Sciences division of GE Healthcare, Piscataway, NJ).
5 El término "KD", según se usa en el presente documento, pretende referirse a la constante de disociación en equilibrio de una interacción anticuerpo-antígeno en particular.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión al antígeno específico en la región variable de una molécula de un anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas de un antígeno y pueden tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos yuxtapuestos espacialmente procedentes de diferentes segmentos de la cadena polipeptídica lineal. Un epítopo lineal es aquel producido por residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En ciertas circunstancias, a un epítopo puede incluir fracciones de sacáridos, grupos fosforilo,
15 o grupos sulfonilo en el antígeno.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando se refiere a un ácido nucleico o a un fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean óptimamente, con las inserciones o las deleciones de nucleótidos apropiadas, con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe una identidad en la secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente un 95 % y más preferentemente de al menos aproximadamente un 96 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % de las bases de nucleótidos, medida mediante cualquier algoritmo conocido de identidad de secuencia, tal como FASTA, BLAST o Gap, según se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene una identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede codificar, en ciertos casos, para un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una similar a la del polipéptido
25 codificado por la molécula de ácido nucleico de referencia.
Al igual que se aplica a los polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias de péptidos, cuando están alineadas óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT mediante el uso de los pesos de los huecos por defecto, comparten al menos un 95 % de identidad en la secuencia, incluso más preferentemente al menos un 98 % o un 99 % de identidad en la secuencia. Preferiblemente, las posiciones de los residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es aquella en la que un residuo de aminoácido está sustituido por otro residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con unas propiedades químicas similares (por ejemplo, de carga o de hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácido conservativa no cambiará 35 sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieran entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad en la secuencia o grado de similitud puede ajustarse por aumento para corregir hacia una naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para la realización de este ajuste son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Algunos ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con unas propiedades químicas similares incluyen (1) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; (2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; (3) cadenas laterales que contienen una amida: asparragina y glutamina; (4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; (5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; (6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato y (7) las cadenas laterales que contienen azufre son cisteína y metionina. Los grupos para una sustitución de aminoácidos
45 conservativa son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparragina-glutamina. Alternativamente, una sustitución conservativa es cualquier cambio que tiene un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443-1445. Una sustitución "moderadamente conservativa" es cualquier cambio que tiene un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud en la secuencia para polipéptidos, que se denomina también identidad de secuencia, normalmente se mide mediante el uso de un programa informático de análisis de la secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares mediante el uso de mediciones de similitud asignadas a diversas sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por 55 ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como Gap y Bestfit que pueden usarse con los parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína natural y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, GCG Versión 6.1. Las secuencias de polipéptidos también pueden compararse mediante el uso de FASTA mediante el uso de los parámetros por defecto o recomendados, un programa en el que el GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, el FASTA2 y el FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones que mejor solapan entre la secuencia interrogante y la buscada (Pearson (2000), supra). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, mediante el uso de los
65 parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, y Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402.
Preparación de los anticuerpos humanos
Los métodos para la generación de anticuerpos monoclonales, incluyendo anticuerpos monoclonales totalmente humanos, son conocidos en la materia. En el contexto de la presente invención puede usarse cualquiera de dichos 5 métodos conocidos para la elaboración de anticuerpos humanos que se unan específicamente al PAR-2 humano.
Mediante el uso de la tecnología VELOCIMMUNE™ o de cualquier otro método conocido para la generación de anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos con una elevada afinidad por el PAR-2 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y se seleccionan según unas características deseables, que incluyen la afinidad, la selectividad, el epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón son sustituidas por una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, una IgG1 o una IgG4 natural o modificada. Mientras que la región constante seleccionada puede variar según el uso específico, la unión de alta afinidad del antígeno y las características de especificidad del objetivo residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-PAR-2 y los fragmentos de anticuerpos de la presente invención engloban proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían con respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unirse al PAR-2 humano. Dichas variantes de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia parental, pero muestran una actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. Asimismo, el anticuerpo anti-PAR-2-que codifica para las secuencias de ADN de la presente invención engloba secuencias que comprenden una o más adiciones, deleciones o sustituciones de nucleótidos cuando se comparan
25 con la secuencia parental, pero que codifican para un anticuerpo anti-PAR-2 o un fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo anti-PAR-2 o a un fragmento de anticuerpo de la invención. Algunos ejemplos de dichas variantes de secuencias de aminoácidos y de ADN se han analizado más arriba.
Dos proteínas de unión a un antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando son administradas a la misma dosis molar en unas condiciones experimentales similares, tanto en dosis únicas como en dosis múltiples. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en la magnitud de su absorción pero no en su tasa de absorción, y todavía pueden ser considerados bioequivalentes debido a que dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas
35 y están indicadas en la etiqueta, no son esenciales para adquirir las concentraciones eficaces del fármaco en el cuerpo, por ejemplo, durante el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico estudiado en particular.
En una realización, dos proteínas de unión a un antígeno son bioequivalentes si no hay ninguna diferencia de significación clínica en su seguridad, pureza y potencia.
En una realización, dos proteínas de unión a un antígeno son bioequivalentes si un paciente puede cambiar una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin que se espere un aumento en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o una disminución en la
45 eficacia, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
En una realización, dos proteínas de unión a un antígeno son bioequivalentes si ambas actúan mediante un mecanismo o mecanismos de acción comunes en las condiciones de uso, siempre que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede ser demostrada mediante métodos in vivo e in vitro. Algunas mediciones de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) una prueba in vivo en seres humanos o en otros mamíferos, en la que se mide la concentración del anticuerpo o de sus metabolitos en la sangre, en el plasma, en el suero o en otro fluido biológico en función del tiempo; (b) una prueba in vitro que se ha correlacionado con, y es razonablemente predictiva
55 de, los datos de biodisponibilidad humana in vivo; (c) una prueba in vivo en seres humanos o en otros mamíferos, en la que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o de su objetivo) en función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, la eficacia o la biodisponibilidad o la bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden construirse, por ejemplo, mediante la realización de diversas sustituciones de residuos o de secuencias o la deleción de residuos o de secuencias terminales o internas que no son necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de cisteína que no son esenciales para la actividad biológica puede ser delecionados o sustituidos por otros aminoácidos para prevenir la formación de puentes de disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la 65 renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos anti-PAR-2 que comprenden cambios de aminoácidos que modifican las características de glicosilación de los
anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan la glicosilación.
Características biológicas de los anticuerpos
5 Los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar a través de una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o de una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). La "citotoxicidad dependiente del complemento" (CDC) se refiere a la lisis de las células que expresan el antígeno por parte de un anticuerpo de la invención en presencia del complemento. La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo" (ADCC) se refiere a la reacción mediada por células en la que células citotóxicas no específicas que expresan los receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) reconocen el anticuerpo unido en una célula objetivo y así dan lugar a la lisis de la célula objetivo. La CDC y la ADCC pueden medirse mediante el uso de ensayos que son bien conocidos y están disponibles en la materia (véanse, por ejemplo, el documento U.S.
5.500.362 y el documento 5.821.337, y Clynes et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. (EE.UU.) 95: 652-656).
15 Alternativamente, o adicionalmente, los anticuerpos de la invención pueden ser terapéuticamente útiles en el bloqueo de una interacción con el PAR-2 o en una inhibición de la interacción con un componente del receptor. En el caso de los anticuerpos PAR-2 de la presente invención, los anticuerpos pueden funcionar, entre otros, mediante un bloqueo o un oscurecimiento del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Alternativamente, los anticuerpos de la invención pueden funcionar interfiriendo en la interacción entre el ligando anclado y uno o más bucles extracelulares (por ejemplo, el bucle 1, el bucle 2 y/o el bucle 3).
Más específicamente, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden mostrar una o más de las siguientes características: (1) capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, y a un PAR-2 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o a un fragmento del PAR25 2; (2) capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, pero no a un PAR-2 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o a un fragmento del PAR-2;
(3)
capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, y a un PAR-2 de mono o a un fragmento del PAR-2 de mono, pero no a un PAR-2 de ratón, de rata, de conejo, de perro o de cerdo o a un fragmento del PAR-2; (4) capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, y a un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 humano o a un fragmento del mismo; (5) capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, pero no a un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 humano o a un fragmento del mismo; (6) capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, y a un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o a un fragmento del mismo;
(7)
capacidad para unirse a un PAR-2 humano o a un fragmento del PAR-2 humano, pero no a un PAR-1, PAR-3 o
35 PAR-4 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o a un fragmento del mismo; (8) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 o de un fragmento del PAR-2; (9) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 humano o de un fragmento del PAR-2 y de un PAR-2 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o de un fragmento del PAR-2; (10) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 humano o de un fragmento del PAR-2, pero no de un PAR-2 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o de un fragmento del PAR-2; (11) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 humano o de un fragmento del PAR-2 y de un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 humano o de un fragmento del mismo; (12) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 humano o de un fragmento del PAR-2, pero no de un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 humano o de un fragmento del mismo; (13) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2
45 humano o de un fragmento del PAR-2 y de un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o de un fragmento del mismo; y/o (14) capacidad para bloquear la escisión proteolítica de un PAR-2 humano o de un fragmento del PAR-2 pero no de un PAR-1, PAR-3 o PAR-4 no humano (por ejemplo, de ratón, de mono, de rata, de conejo, de perro, de cerdo, etc.) o de un fragmento del mismo.
Según se usa en los anteriores puntos (8) -(14), el término "escisión proteolítica" significa la escisión de una molécula de PAR (PAR-1, PAR-2, PAR-3 o PAR-4) o de un fragmento de la misma por parte de una proteasa del PAR-2 o de otra enzima que es capaz de escindir el PAR-2 en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador.
55 La región N terminal del PAR-2 humano tiene al menos dos sitios de escisión de la proteasa "no activadores", es decir, unos sitios que son susceptibles de ser escindidos por la tripsina pero que no dan como resultado la activación del receptor. Los sitios de escisión de la proteasa no activadores N terminales están ubicados: (a) en la unión de los residuos de la Arg-31 y de la Ser-32 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851); y (b) en la unión de los residuos de la Lys-34 y de la Gly-35 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). Los sitios de escisión activadores y no activadores en el N terminal del PAR-2 se ilustran en la Fig. 5 (los triángulos blancos indican los sitios de escisión de la proteasa no activadores, y los triángulos negros indican el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador); véase también la Fig. 4. La presente invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 que bloquean el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador pero que no bloquean uno o ambos de los sitios de escisión de la proteasa no activadores. Para determinar si un anticuerpo candidato bloquea o no bloquea un sitio de escisión de la proteasa en particular, la
65 persona experta habitual en la materia puede hacer uso de cualquier ensayo adecuado, tal como los ejemplos de ensayos de bloqueo in vitro establecidos en el Ejemplo 8 en el presente documento. Según se ilustra en el Ejemplo
8, se demostró que el ejemplo de anticuerpo H4H581 P bloqueaba la escisión de la tripsina en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador y en el sitio de escisión de la proteasa no activador ubicado en la unión de los residuos de la Lys-34 y de la Gly-35 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851), pero no bloqueó la escisión en el sitio de escisión de la proteasa no activador ubicado en la unión de los residuos de la Arg-31 y de la Ser-32 del PAR-2
5 humano (SEQ ID NO: 851). Por el contrario, el anticuerpo de comparación usado en el Ejemplo 8 bloqueó la escisión en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador y en ambos sitios no activadores. Las capacidades de bloqueo diferencial de estos ejemplos de anticuerpos anti-PAR-2 refleja muy probablemente diferencias en las regiones particulares de la molécula del PAR-2 a las que se unen estos anticuerpos (véase, por ejemplo, el Ejemplo 9 del presente documento).
Según se usa en el presente documento, un anticuerpo "no se une" a una molécula objetivo especificada (por ejemplo, el PAR-2 de ratón, el PAR-2 de rata, el PAR-2 de conejo, el PAR-2 de perro, el PAR-2 de cerdo o a un fragmento de los mismos) si el anticuerpo, cuando se prueba su unión con la molécula objetivo a 25 ºC en un ensayo de resonancia de plasmón superficial, muestra una KD de más de 500 nM, o si se prueba la unión a la molécula
15 objetivo a 25 ºC en un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) muestra una CE50 de más de 50 nM, o no consigue mostrar ninguna unión en ningún tipo de ensayo o equivalente del mismo.
Algunos anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención son capaces de inhibir o de atenuar la activación del PAR2 en un ensayo celular in vitro. Un ejemplo no limitante de ensayo celular in vitro de la activación del PAR-2 se ilustra en el Ejemplo 6, en el presente documento. En este Ejemplo, se usan células que expresan el PAR-2 y que portan un constructo que comprende el NF-kB fusionado con una molécula indicadora (por ejemplo, luciferasa). En resumen, dichas células se combinan con un anticuerpo anti-PAR-2, seguido de un tratamiento con una proteasa del PAR-2. Las células que se tratan con la proteasa en presencia de un anticuerpo anti-PAR-2 inhibidor mostrarán una señal del indicador significativamente menor, o ninguna, en comparación con las células tratadas con la proteasa en
25 ausencia de un anticuerpo anti-PAR-2 inhibidor. La concentración del anticuerpo necesaria para conseguir la mitad de la inhibición máxima de la señal del indicador (CI50) puede calcularse mediante el uso de dicho ensayo. La presente invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 inhibidores que muestran una CI50 de menos de 300 nM cuando se prueba la activación del PAR-2 en un ensayo celular in vitro como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 con una CI50 de menos de 300, de 290, de 280, de 270, de 260, de 250, de 240, de 230, de 220, de 210, de 200, de 190, de 180, de 170, de 160, de 150, de 140, de 130, de 120, de 110, de 100, de 90, de 80, de 70, de 60, de 50, de 40, de 30, de 20, de 10, de 18, de 16, de 14, de 12, de 10, de 9, de 8, de 7, de 6, de 5, de 4, de 3, de 2 o de 1 nM cuando se prueba la activación del PAR-2 en un ensayo celular in vitro como se ha descrito anteriormente, en el que las células se incuban con el anticuerpo durante 1 h a 37 ºC, seguido de un tratamiento con tripsina 20 nM (o con otra proteasa del PAR-2) durante 5 h a 37 ºC.
35 La presente invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a uno o más de los siguientes péptidos: el Péptido A (GTNRSSKGRSLIGKVDGT, la SEQ ID NO: 852); el Péptido B (SLIGKVDGTSHVTG, la SEQ ID NO: 853); el Péptido C (SLIGKV, la SEQ ID NO: 854); el Péptido D (dominio N terminal del PAR-2 humano -IgG de ratón, la SEQ ID NO: 855); el Péptido E (LAPGRNNSKGRSLIGRLETQ, la SEQ ID NO: 856); el Péptido F (GTNRSSKGRSLIGRVDGT, la SEQ ID NO: 857); el Péptido G (gPNSKGRSLIGRLDTP, la SEQ ID NO: 858); el Péptido H (GTNKTSKGRSLIGRN TGS, la SEQ ID NO: 859); el Péptido I (GTNRTSKGRSLIGKTDSS, la SEQ ID NO: 86O); el Péptido J (GTSRPSKGRSLIGKADNT, la SEQ ID NO: 861); el Péptido K (ATNATLDPRSFLLRNPND, la SEQ ID NO: 862); el Péptido L (DTNNLAKPTLPIKTFRGA, la SEQ ID NO: 863); o el Péptido M (ESGSTGGGDDSTPSILPAP, la SEQ ID NO: 864). La información adicional relativa a estos
45 péptidos puede encontrarse en el Ejemplo 3 del presente documento. Estos péptidos pueden no contener marcajes
o fracciones adicionales, o pueden contener un marcaje o una fracción N terminal o C terminal. En una realización, el marcaje o a la fracción es biotina. En el ensayo de unión, la ubicación de un marcaje (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie a la cual está unido el péptido. Por ejemplo, si la superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina N terminal estará orientado de tal forma que la porción C terminal del péptido estará distal a la superficie.
Con respecto a los Péptidos mencionados anteriormente, la presente invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 con uno o más de los siguientes perfiles de unión: (1) se unen a los Péptidos A y B, pero no se unen al Péptido C; (2) se unen a los Péptidos A, B y D, pero no se unen al Péptido C; (3) se unen a los Péptidos A, B, D y F, pero no se unen
55 al Péptido C; (4) se unen a los Péptidos A, B, D y F, pero no se unen a ninguno de los Péptidos C o E; (5) se unen a los Péptidos A, B y D, pero no se unen a ninguno de los Péptidos K, L o M; (6) se unen a los Péptidos A, B y F, pero no se unen a ninguno de los Péptidos K, L o M; (7) se unen a los Péptidos A, B, D y F, pero no se unen a ninguno de los Péptidos K, L o M; y/o (8) se unen a al menos tres de los Péptidos A, B, C, D, E, F, G, I y J, pero no se unen al Péptido H. Otros perfiles de unión de los anticuerpos de la invención serán evidentes a partir de los ejemplos del presente documento.
Cartografiado de epítopos y tecnologías relacionadas
Para cribar los anticuerpos que se unen a un epítopo en particular (por ejemplo, aquellos que bloquean la unión de
65 la IgE a su receptor de alta afinidad), puede llevarse a cabo un ensayo de bloqueo cruzado rutinario, tal como el que se describe en Antibodies, Harlow y Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos
incluyen mutantes de cribado con alanina, transferencias de péptidos (Reineke, 2004, Methods Mol Biol 248: 443463) o un análisis por escisión del péptido. Además, pueden emplearse métodos tales como la escisión del epítopo, la extracción del epítopo y la modificación química de los antígenos (Tomer, 2000, Protein Science 9: 487-496).
5 El término "epítopo" se refiere al sitio de un antígeno ante el cual responden los linfocitos B y/o T. Los epítopos de los linfocitos B pueden estar formados tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente son conservados tras la exposición a disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados por un plegamiento terciario normalmente se pierden tras el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3 y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
La identificación ayudada por modificaciones (MAP), también conocida como identificación de anticuerpos basada en la estructura del antígeno (ASAP) es un método que clasifica grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
15 (AcMc) dirigidos contra el mismo antígeno según las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a las superficies de los antígenos modificadas químicamente o enzimáticamente (documento US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único, tanto notablemente diferente de, como parcialmente solapante con, el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite un rápido filtrado de anticuerpos genéticamente idénticos, de forma que la caracterización puede centrarse en los anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, la MAP puede facilitar la identificación de clones raros de hibridomas que producen AcMc que tienen las características deseadas. La MAP puede usarse para la clasificación de los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
La presente invención incluye anticuerpos anti-PAR-2 que se unen a un epítopo en o cerca de (por ejemplo, a 5, 10,
25 15 o 20 aminoácidos de) el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. En ciertas realizaciones, los anticuerpos anti-PAR-2 se unen a un epítopo ubicado secuencia arriba (es decir, N terminal a) el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. En otras ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-PAR-2 se unen a un epítopo ubicado secuencia abajo de (es decir, C terminal a) el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. En otras realizaciones más, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden unirse a un epítopo que incluye tanto las secuencias de aminoácidos ubicadas secuencia arriba del sitio de escisión de la proteasa del PAR2 activador como las secuencias de aminoácidos ubicadas secuencia abajo del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador.
Alternativamente, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden unirse, en ciertas realizaciones, a un epítopo
35 ubicado en uno o más bucles extracelulares de la proteína PAR-2 (por ejemplo, el bucle extracelular 1, el bucle extracelular 2 y/o el bucle extracelular 3).
La presente invención incluye anticuerpos humanos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que interactúan con ciertos residuos de aminoácidos ubicados secuencia abajo del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos humanos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que interactúan con la Val-42 y la Asp-43 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). Además de con estos dos residuos, los anticuerpos humanos aislados o los fragmentos de unión al antígeno de los mismos también pueden interactuar con uno o más de los residuos ubicados secuencia abajo del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador: la Ser-37, la Leu-38, la Ile-39, la Gly-40 o la Gly-44 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 45 851). En ciertas realizaciones, el anticuerpo humano aislado o el fragmento de unión al antígeno del mismo no interactúa con la Lys-41 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos humanos aislados o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que interactúan con la Ser-37, la Leu-38, la Ile-39, la Gly-40, la Val-42 y la Asp-43 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851) y que no interactúan con la Lys-41 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851). Pueden usarse los procedimientos experimentales ilustrados en el Ejemplo 9 para determinar si un anticuerpo candidato anti-PAR-2 "interactúa con" o "no interactúa con" un residuo de aminoácido en particular del PAR-2. Por ejemplo, si se prueba la unión de un anticuerpo candidato a un péptido que tiene la SEQ ID NO: 879 (correspondiente a la región N terminal del PAR-2, en la que la Val-42 del PAR-2 está mutada a una alanina, véanse, por ejemplo, las Tablas 24-28) mediante el uso del procedimiento del Ejemplo 9, y la T1/2 del anticuerpo es menor del 30 % de la T1/2 observada cuando se prueba la unión del anticuerpo candidato al 55 péptido natural (la SEQ ID NO: 871), entonces, para los fines de la presente divulgación, se considera que el anticuerpo candidato "interactúa con" el aminoácido que estaba mutado a alanina (en este caso, la Val-42); es decir, la unión del anticuerpo candidato se reduce sustancialmente cuando el aminoácido correspondiente a la Val-42 está mutado a una alanina (dichos residuos están representados mediante círculos negros en la Figura 5). Por otro lado, se prueba la unión del anticuerpo candidato a un péptido que tiene la SEQ ID NO: 878 (correspondiente a la región N terminal del PAR-2, en la que la Lys-41 del PAR-2 está mutada a alanina, véanse, por ejemplo, las Tablas 24-28) mediante el uso del procedimiento del Ejemplo 9, y la T1/2 del anticuerpo es mayor o igual al 30 % a la T1/2 observada cuando se prueba la unión del anticuerpo candidato al péptido natural (la SEQ ID NO: 871), entonces, para los fines de la presente divulgación, se considera que el anticuerpo candidato "no interactúa con" el aminoácido que estaba mutado a alanina (en este caso, la Lys-41); es decir, la unión del anticuerpo candidato no se reduce
65 sustancialmente cuando el aminoácido correspondiente a la Lys-41 está mutado a una alanina (dichos residuos están representados mediante círculos blancos en la Figura 5).
En el presente documento se describen anticuerpos anti-PAR-2 que se unen al mismo epítopo que los ejemplos específicos de anticuerpos H4H581 P o H4H588N. En el presente documento también se describen anticuerpos anti-PAR-2 que presentan una competición cruzada por la unión al PAR-2 o a un fragmento del PAR-2 con cualquiera de los ejemplos de los anticuerpos específicos descritos en el presente documento (por ejemplo, el H4H581 P, el
5 H4H588N, el H4H591 N o el H4H618N).
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión a, un anticuerpo anti-PAR-2 de referencia mediante el uso de métodos rutinarios conocidos en la materia. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de prueba se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-PAR-2 de referencia descrito en el presente documento, se deja que el anticuerpo de referencia se una a la proteína o el péptido PAR-2 en condiciones de saturación. Después se evalúa la capacidad del anticuerpo de prueba para unirse a la molécula del PAR-2. Si el anticuerpo de prueba es capaz de unirse al PAR-2 después de la unión en saturación del anticuerpo de referencia anti-PAR-2, puede concluirse que el anticuerpo de prueba se une a un epítopo diferente al del anticuerpo anti-PAR-2 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de prueba no es capaz de unirse a la molécula 15 del PAR-2 después de la unión en saturación del anticuerpo anti-PAR-2 de referencia, entonces el anticuerpo de prueba puede unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo anti-PAR-2 de referencia descrito en el presente documento. Entonces puede llevarse a cabo una experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutaciones de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia de unión observada en el anticuerpo de prueba es de hecho debida a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, o si un bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de unión observada. Esta clase experimentos puede llevarse a cabo mediante el uso de un ELISA, un RIA, un Biacore, una citometría de flujo o cualquier otro ensayo de unión de anticuerpos cuantitativo o cualitativo disponible en la materia. De acuerdo con algunos de los aspectos descritos en el presente documento, dos anticuerpos se unen (o se solapan) al mismo epítopo si, por ejemplo, un exceso de 1, de 5, de 10, de 20 o de 100 veces de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 % pero preferentemente
25 en un 75 %, en un 90 % o incluso en un 99 % medido en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 1990: 50: 1495-1502). Alternativamente, se considera que dos anticuerpos se unen al mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácidos del antígeno que reducen o eliminan la unión de uno de los anticuerpos, reducen o eliminan la unión del otro. Se considera que los anticuerpos tienen "epítopos solapantes" si únicamente un subconjunto de mutaciones de aminoácidos que reduce o elimina la unión de uno de los anticuerpos, reduce o elimina la unión del otro.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-PAR-2 de referencia, se lleva a cabo la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: en una primera orientación se deja que el anticuerpo de referencia se una a la molécula del PAR-2 en unas condiciones de saturación, seguido de la
35 evaluación de la unión del anticuerpo de prueba a la molécula del PAR-2. En una segunda orientación se deja que el anticuerpo de prueba se una a la molécula del PAR-2 en unas condiciones de saturación, seguido de la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula del PAR-2. Si en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (saturante) es capaz de unirse a la molécula del PAR-2, entonces se concluye que el anticuerpo de prueba y el anticuerpo de referencia compiten por la unión al PAR-2. Como apreciará la persona experta habitual en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede no unirse necesariamente al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia, pero puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Selectividad de especie y reactividad cruzada de especie
45 Según ciertas realizaciones de la invención, los anticuerpos anti-PAR-2 se unen al PAR-2 humano pero no se unen al PAR-2 de otras especies. Alternativamente, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención, en ciertas realizaciones, se unen al PAR-2 humano y al PAR-2 de una o más especies no humanas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PAR-2 de la invención pueden unirse al PAR-2 humano y pueden unirse o no, según sea el caso, a uno o más de los PAR-2 de ratón, de rata, de cobaya, de hámster, de jerbo, de cerdo, de gato, de perro, de conejo, de cabra, de oveja, de vaca, de caballo, de camello, de mono cinomólogo, titi, rhesus o de chimpancé.
Inmunoconjugados
55 La invención engloba anticuerpos monoclonales anti-PAR-2 conjugados con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como una citotoxina, un agente quimioterapéutico, un inmunosupresor o un radioisótopo. Los agentes citotóxicos incluyen cualquier agente que sea perjudicial para las células. Algunos ejemplos de agentes citotóxicos y quimioterapéuticos adecuados para la formación de inmunoconjugados son conocidos en la materia, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081).
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido objetivo, o pueden 65 contener dominios de unión al antígeno específicos para más de un polipéptido objetivo. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244. Los anticuerpos anti-PAR-2 de
la presente invención pueden estar unidos a, o expresarse conjuntamente con, otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento del mismo puede estar unido funcionalmente (por ejemplo, mediante un acoplamiento químico, una fusión genética, una asociación no covalente o de cualquier otra forma) a una o más de otras entidades moleculares, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo, para
5 producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente invención incluye anticuerpos biespecíficos en los que un brazo de la inmunoglobulina es específico para el PAR-2 humano o un fragmento del mismo, y el otro brazo de la inmunoglobulina es específico para un segundo objetivo terapéutico, o está conjugado con una fracción terapéutica, tal como un inhibidor de la tripsina.
Un ejemplo de formato de anticuerpo biespecífico que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio CH3 de una inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio CH3 de una Ig, en los que el primer y el segundo dominio CH3 de una Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido y en los que al menos una diferencia en un aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a la Proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia en el aminoácido. En una realización, el primer dominio CH3 de
15 la Ig se une a la Proteína A y el segundo dominio CH3 de la Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a la Proteína A, tal como una modificación H95R (según la numeración de exón de IMGT; H435R según la numeración de la UE). El segundo CH3 puede comprender adicionalmente una modificación Y96F (según la IMGT; Y436F según la UE). Algunas modificaciones adicionales que pueden encontrarse en el segundo CH3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V821 (según la IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I según la EU) en el caso de anticuerpos de IgG1; N44S, K52N y V821 (según la IMGT; N384S, K392N y V422I según la EU) en el caso de anticuerpos de IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V821 (según la IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I según la EU) en el caso de anticuerpos de IgG4. Las variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descritas anteriormente están contempladas en el ámbito de la presente invención.
25 Formulación y administración terapéutica
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-PAR-2 o fragmentos de unión al antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de las composiciones terapéuticas según la invención se administrará con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que son incorporados en las formulaciones para proporcionar una mejora en la transferencia, la administración, la tolerancia, y similares. En el formulario conocido por todos los químicos farmacéuticos pueden encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas: Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras,
35 emulsiones de aceite en agua y de agua en aceite, emulsiones de carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen carbowax. Véase también Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52: 238-311.
La dosis del anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y del tamaño del sujeto al que se le va a administrar, de la enfermedad objetivo, de las condiciones, de la vía de administración, y similares. La dosis preferida normalmente se calcula según el peso corporal o el área superficial corporal. Cuando un anticuerpo de la presente invención se usa para el tratamiento de una afección o de una enfermedad asociada con la actividad del PAR-2 en un paciente adulto, puede ser ventajosa la administración por vía intravenosa del anticuerpo de la presente invención, normalmente en una única dosis de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 20 mg/kg de peso
45 corporal, más preferentemente de entre aproximadamente 0,02 y aproximadamente 7, de entre aproximadamente 0,03 y aproximadamente 5, o de entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, puede ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. Las dosis eficaces y la cronología para la administración de los anticuerpos PAR-2 pueden determinarse empíricamente; por ejemplo, puede monitorizarse el progreso del paciente mediante una evaluación periódica, y ajustar consecuentemente la dosis. Además, puede llevarse a cabo un ajuste interespecie de la dosis mediante el uso de métodos bien conocidos en la materia (por ejemplo, Mordenti et al., 1991, Pharmaceut. Res. 8: 1351).
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden ser usados para la administración de la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células
55 recombinantes capaces de expresar virus mutantes, endocitosis mediada por un receptor (véase, por ejemplo, Wu et al., 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432). Algunos métodos de introducción incluyen, pero no se limitan a, las vías intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede ser administrada mediante cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante una infusión o una inyección en bolo, mediante su absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, la mucosa oral, rectal y la mucosa intestinal, etc.), y pueden ser administrados junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede ser administrada por vía subcutánea o intravenosa con una aguja y una jeringa estándar. Además, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo de 65 administración en pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo de administración en pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo
de administración en pluma reutilizable utiliza generalmente un cartucho sustituible que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica del cartucho, y el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede ser fácilmente desechado y sustituido por un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo de administración en pluma puede entonces ser reutilizado. En un
5 dispositivo de administración en pluma desechable no hay ningún cartucho sustituible. Más bien, el dispositivo de administración en pluma desechable está precargado con la composición farmacéutica, contenida en un depósito en el interior del dispositivo. Una vez que el depósito se ha vaciado de la composición farmacéutica, se desecha la totalidad del dispositivo.
Numerosos dispositivos de administración en pluma y autoinyectores reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Algunos ejemplos incluyen, pero no se limitan a, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), la pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), la pluma HUMALOG MIX 75/25™, la pluma HUMALOG™, la pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianapolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca),
15 NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), la pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar sólo unos pocos. Algunos ejemplos de dispositivos de administración en pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), la FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y la KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park IL), por nombrar sólo unos pocos.
En ciertas situaciones, la composición farmacéutica puede ser administrada en un sistema de liberación controlada. En una realización, puede usarse una bomba (véase, Langer, supra; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng.
25 14:201). En otra realización, pueden usarse materiales poliméricos; véase Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Ratón, Florida. En otra realización más, puede colocarse un sistema de liberación controlada en las proximidades del objetivo de la composición, requiriendo así únicamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, 1984, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, páginas 115-138). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer, 1990, Science 249: 1527-1533.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas de dosificación para inyecciones intravenosas, subcutáneas, intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden ser preparadas mediante métodos conocidos públicamente. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden ser preparadas, por
35 ejemplo, mediante la disolución, la suspensión o la emulsificación del anticuerpo o de su sal descrito anteriormente en un medio acuoso o en un medio oleoso estéril usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares, etc., que puede usarse junto con un agente solubilizante apropiado, tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (polioxietileno (50 mol) un aducto de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como medio oleoso se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse junto con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección así preparada se introduce preferentemente en una ampolla apropiada.
45 Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para un uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas de dosificación en una dosis unitaria adecuada para que se ajusten a una dosis de los principios activos. Dichas formas de dosificación en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anteriormente mencionado anticuerpo contenida es generalmente de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en la forma de inyección, se prefiere que el anteriormente mencionado anticuerpo esté contenido en desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 100 mg, y en desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 250 mg para las demás formas de dosificación.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
55 Los anticuerpos de la invención son útiles, entre otros, para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad del PAR-2, incluyendo enfermedades o trastornos asociados con la activación proteolítica del PAR-2. Algunos ejemplos de enfermedades y de trastornos que pueden ser tratados con los anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención incluyen afecciones dolorosas tales como dolor nociceptivo y dolor visceral, así como el dolor asociado con afecciones tales como la inflamación, una incisión postoperatoria, una neuropatía, una fractura ósea, una quemadura, una fractura osteoporósica, cáncer de hueso, gota, migraña, cefalea, fibromialgia, etc. Los anticuerpos de la invención también pueden usarse para el tratamiento, la prevención y/o la mejora de afecciones inflamatorias tales como una inflamación articular, una inflamación de las vías respiratorias (por ejemplo, asma), una inflamación de la piel, una dermatitis (por ejemplo, dermatitis atópica, dermatitis alérgica
65 por contacto, etc.), una enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), glomerulonefritis, cistitis intersticial, una inflamación de la vejiga, hiperalgesia, artritis reumatoide, artrosis, artritis inflamatoria, esclerosis múltiple, síndrome
anti-fosfolípidos, deficiencia en antitripsina alfa 1, etc. Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse para el tratamiento de afecciones fibróticas, que incluyen, por ejemplo, esclerodermia, cirrosis biliar, fibrosis posterior a un trasplante, fibrosis renal, fibrosis pulmonar, fibrosis hepática, fibrosis pancreática, fibrosis testicular, cicatrices hipertróficas y queloides cutáneos. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención son útiles para el 5 tratamiento de afecciones gastrointestinales (por ejemplo, enfermedad celiaca, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, gastroparesis idiopática, pancreatitis, síndrome del intestino irritable (IBS) y úlceras (incluyendo úlceras gástricas y duodenales)); lesión pulmonar aguda; lesión renal aguda; y septicemia. Los anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención también son útiles para el tratamiento del prurito; por ejemplo, picores dérmicos/pruritoceptivos, neuropáticos, neurógenos y psicógenos, así como del prurito asociado a la dermatitis atópica, la psoriasis, las cicatrices por quemaduras (picor por quemaduras), las cicatrices hipertróficas, los queloides, la insuficiencia renal y la insuficiencia hepática. Otros usos terapéuticos de los anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención incluyen el tratamiento, la prevención y/o la mejora de la enfermedad de Alzheimer, de la enfermedad de Netherton, de una angiogénesis patológica, de la urticaria crónica, del angioedema, de la mastocitosis, de la endometriosis, de la infertilidad (por ejemplo, de la infertilidad masculina asociada a una fibrosis testicular), de enfermedades mediadas
15 por los mastocitos, de la enteritis inducida por la toxina A de Clostridium difficile y del cáncer (por ejemplo, cáncer de células sanguíneas, cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de piel, cáncer de estómago, etc.).
Terapias de combinación
La presente invención se refiere a regímenes de administración terapéutica que comprenden la administración de un anticuerpo anti-PAR-2 de la presente invención junto con al menos un componente terapéuticamente activo adicional. Algunos ejemplos no limitantes de dichos componentes terapéuticamente activos adicionales incluyen 25 otros antagonistas del PAR-2 (por ejemplo, un anticuerpo anti-PAR-2 o un inhibidor de molécula pequeña del PAR-2 (por ejemplo, N1-3-metilbutiril-N4-6-aminohexanoil-piperazina; ENMD-1068)), inhibidores de citocinas (por ejemplo, un inhibidor de la interleucina-1 (IL-1) (tal como rilonacept o anakinra, un antagonista de molécula pequeña de la IL-1
o un anticuerpo anti-IL-1); un inhibidor de la IL-18 (tal como un antagonista de molécula pequeña de la IL-18 o un anticuerpo anti-IL-18); un inhibidor de la IL-4 (tal como un antagonista de molécula pequeña de la IL-4, un anticuerpo anti-IL-4 o un anticuerpo anti-receptor de la IL-4); un inhibidor de la IL-6 (tal como un antagonista de molécula pequeña de la IL-6, un anticuerpo anti-IL-6 o un anticuerpo anti-receptor de la IL-6); fármacos antiepilépticos (por ejemplo, gabapentina); e inhibidores del factor de crecimiento nervioso (NGF) (por ejemplo, un antagonista de molécula pequeña del NGF o un anticuerpo anti-NGF); cochicina a bajas dosis; ácido acetilsalicílico; los AINE; esteroides (por ejemplo, prednisona, metotrexato, etc.); ciclosporina A a bajas dosis; factor de necrosis tumoral
35 (TNF) o inhibidores del receptor del TNF (por ejemplo, un antagonista de molécula pequeña del TNF o del TNFR o un anticuerpo anti-TNF o TNFR); inhibidores de la síntesis de ácido úrico (por ejemplo, alopurinol); promotores de la excreción de ácido úrico (por ejemplo, probenecid, sulfinpirazona, benzbromarona, etc.); otros inhibidores inflamatorios (por ejemplo, inhibidores de la caspasa 1, de p38, de IKK1/2, de CTLA-4lg, etc.); y/o corticosteroides. El (los) componente(s) activo(s) adicional(es) puede(n) ser administrado(s) antes de, junto con, o después de, la administración del anticuerpo anti-PAR-2 de la presente invención.
Usos diagnósticos de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-PAR-2 de la presente invención también pueden usarse para la detección y/o la medición del
45 PAR-2 en una muestra, por ejemplo, con fines diagnósticos. Por ejemplo, puede usarse un anticuerpo anti-PAR-2, o un fragmento del mismo, para el diagnóstico de una afección o de una enfermedad que se caracteriza por la expresión aberrante (por ejemplo, una sobreexpresión, una subexpresión, una ausencia de expresión, etc.) del PAR
2. Algunos ejemplos de ensayos diagnósticos para el PAR-2 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-PAR-2 de la invención, en el que el anticuerpo anti-PAR-2 está marcado con un marcador detectable o con una molécula indicadora. Alternativamente, puede usarse un anticuerpo anti-PAR-2 sin marcar en aplicaciones diagnósticas junto con un anticuerpo secundario que está marcado de una forma detectable. El marcaje detectable o la molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, una fracción fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, peroxidasa de rábano picante o luciferasa. Algunos
55 ejemplos de ensayos específicos que pueden usarse para la detección o la medición del PAR-2 en una muestra incluyen un ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) y un ensayo de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que pueden usarse en los ensayos diagnósticos del PAR-2 incluyen cualquier muestra de un tejido o de un fluido obtenible a partir de un paciente que contenga unas cantidades detectables de la proteína PAR-2, o de fragmentos de la misma, en unas condiciones normales o patológicas. Generalmente, los niveles del PAR-2 se medirán en una muestra en particular obtenida a partir de un paciente sano (por ejemplo, de un paciente que no padece una enfermedad o una afección asociada con unos niveles o una actividad anormales del PAR-2) para establecer inicialmente un nivel en la situación inicial, o estándar, del PAR-2. Este nivel en la situación inicial del
65 PAR-2 puede compararse después con los niveles del PAR-2 medidos en las muestras obtenidas a partir de individuos sospechosos de padecer una enfermedad o una afección relacionada con el PAR-2.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se establecen para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y una descripción completas de cómo elaborar y utilizar los métodos y las composiciones de la invención, y no pretenden
5 limitar el ámbito de lo que los inventores contemplan como su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar una precisión con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero también deberían tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. Salvo que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es la atmosférica o cercana.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra el PAR-2 humano
Se administró un inmunógeno que comprende el péptido PAR-2 humano que tiene la secuencia de aminoácidos GTNRSSKGRSLIGKVDGT (la SEQ ID NO: 852) directamente, con un adyuvante para estimular la respuesta 15 inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende un ADN que codifica para las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera kappa de una inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria al anticuerpo se controló mediante un inmunoensayo específico para el PAR-2. Cuando se consiguió la respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para preservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y se seleccionaron
20 para identificar las líneas celulares que producen los anticuerpos específicos para el PAR-2. Mediante el uso de esta técnica, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-PAR-2 (es decir, anticuerpos que poseen los dominios variables humanos y los dominios constantes de ratón); algunos ejemplos de los anticuerpos generados de esta forma se denominaron como sigue: H2M588, H2M589, H1M590, H2M591, H1M592, H1M595, H2M609, H2M610, H2M611, H1M612, H1M613, H2M614, H1M615, H1M616, H3M617, H2M618, H1M619 y H3M620.
25 Los anticuerpos anti-PAR-2 también se aislaron directamente a partir de linfocitos B positivos para el antígeno sin fusionarlos con células de mieloma, según se describe en el documento U.S. 2007/0280945A1. Mediante el uso de este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-PAR-2 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); algunos ejemplos de los anticuerpos
30 generados de esta forma se denominaron como sigue: H1 H571, H1 H572, H1 H573, H1 H574, H1 H575, H1 H576, H1 H577, H1H578, H1H579, H1H580, H1H581, H1H583, H1H584, H1H585, H1H586 y H1H587.
Las propiedades biológicas de los ejemplos de anticuerpos anti-PAR-2 generados según los métodos de este Ejemplo se describen con detalle en los Ejemplos establecidos a continuación.
35 Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera
La Tabla 1 establece los pares de secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados, y sus correspondientes identificadores de anticuerpo. Las
40 denominaciones N, P y G se refieren a los anticuerpos que tienen las cadenas pesadas y ligeras con unas secuencias de las CDR idénticas pero con variaciones en regiones de la secuencia que están fuera de las secuencias de las CDR (es decir, en las regiones en marco). Por lo tanto, las variantes N, P y G de un anticuerpo en particular tienen unas secuencias de las CDR idénticas en sus regiones variables de la cadena pesada y ligera, pero difieren entre sí en sus regiones en marco.
Tabla 1
Nombre
SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR
H1H571N
458/466 H1H571P 474/476 H1H571G 478/480
H1H572N
482/490 H1H572P 498/500 H1H572G 502/504
H1H573N
506/514 H1H573P 522/524 H1H573G 526/528
H1H574N
530/538 H1H574P 546/548 H1H574G 550/552
H1H575N
554/562 H1H575P 570/572 H1H575G 574/576
H1H576N
578/586 H1H576P 594/596 H1H576G 598/600
H1H577N
602/610 H1H577P 618/620 H1H577G 622/624
H1H578N
626/634 H1H578P 642/644 H1H578G 646/648
H1H579N
650/658 H1H579P 666/668 H1H579G 670/672
H1H580N
674/682 H1H580P 690/692 H1H580G 694/696
H1H581N
698/706 H1H581P 714/692 H1H581G 718/720
H1H583N
722/730 H1H583P 738/740 H1H583G 742/744
H1H584N
746/754 H1H584P 762/764 H1H584G 766/768
H1H585N
770/778 H1H585P 786/788 H1H585G 790/792
H1H586N
794/802 H1H586P 810/812 H1H586G 814/816
H1H587N
818/826 H1H587P 834/836 H1H587G 838/840
Nombre
SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR Nombre SEQ ID NOs de la HCVR/LCVR
H2M588N
98/106 H2M588P 114/116 H2M588G 118/120
H2M589N
122/130 H2M589P 138/140 H2M589G 142/144
H1M590N
218/226 H1M590P 234/236 H1M590G 238/240
H2M591N
146/154 H2M591P 162/164 H2M591G 166/168
H1M592N
242/250 H1M592P 258/260 H1M592G 262/264
H1M595N
266/274 H1M595P 282/284 H1M595G 286/288
H2M609N
170/178 H2M609P 186/188 H2M609G 190/192
H2M610N
194/202 H2M610P 210/212 H2M610G 214/216
H2M611N
290/298 H2M611P 306/308 H2M611G 310/312
H1M612N
2/10 H1M612P 18/20 H1M612G 22/24
H1M613N
410/418 H1M613P 426/428 H1M613G 430/432
H2M614N
314/322 H2M614P 330/332 H2M614G 334/336
H1M615N
26/34 H1M615P 42/44 H1M615G 46/48
H1M616N
50/58 H1M616P 66/68 H1M616G 70/72
H3M617N
362/370 H3M617P 378/380 H3M617G 382/384
H2M618N
338/346 H2M618P 354/356 H2M618G 358/360
H1M619N
74/82 H1M619P 90/92 H1M619G 94/96
H3M620N
386/394 H3M620P 402/404 H3M620G 406/408
FP3B12F6N
434/442 FP3B12F6P 450/452 FP3B12F6G 454/456
Ejemplo 3. Unión del anticuerpo a los péptidos PAR-2
Se generaron péptidos sintéticos (Celtek Bioscience, Nashville, TN) del PAR-2 y secuencias relacionadas con el
5 PAR-2 para caracterizar los perfiles de unión de los anticuerpos anti-PAR-2. Se generaron formas tanto biotiniladas como no biotiniladas de los diversos péptidos para los ejemplos establecidos a continuación. Para las formas biotiniladas, se unieron covalentemente fracciones de biotina al péptido en el C terminal o en el N terminal a través de un conector de G4S. La Tabla 2 establece la secuencia y la derivación de estos péptidos.
10 Tabla 2
Denominación
Especie Gen Secuencia SEQ ID NO:
Péptido A
Humano PAR-2 GTNRSSKGRSLIGKVDGT 852
Péptido B
Humano PAR-2 SLIGKVDGTSHVTG 853
Péptido C
Humano PAR-2 SLIGKV 854
Péptido D
Humano PAR-2 SLIGKVDGTSHVTGKGVTVE TVFSVDEFSASVLTGKLTTVF LP -IgG2a de ratón 855
Péptido E
De ratón (Mus musculus) PAR-2 LAPGRNNSKGRSLIGRLETQ 856
Péptido F
De mono (Macaca mulatta) PAR-2 GTNRSSKGRSLIGRVDGT 857
Péptido G
De rata (Rattus norvegicus) PAR-2 GPNSKGRSLIGRLDTP 858
Péptido H
De conejo (Oryctolagus cuniculus) PAR-2 GTNKTSKGRSLIGRNTGS 859
Péptido I
De perro (Canis familiaris) PAR-2 GTNRTSKGRSLIGKTDSS 860
Péptido J
De cerdo (Sus scrofa) PAR-2 GTSRPSKGRSLIGKADNT 861
Péptido K
Humano PAR-1 ATNATLDPRSFLLRNPND 862
Péptido L
Humano PAR-3 DTNNLAKPTLPIKTFRGA 863
Péptido M
Humano PAR-4 ESGSTGGGDDSTPSILPAP 864
Se probó la capacidad de los anticuerpos anti-PAR-2 para unirse a los péptidos PAR-2. Se recubrieron varios péptidos PAR-2 (Tabla 3) en placas de 96 pocillos a una concentración de 2 μg/ml y se incubaron durante una 15 noche, seguido de un bloqueo con un agente de bloqueo adecuado durante una hora. De una forma similar, para los péptidos biotinilados (N terminal: biotinilado en el N terminal; C terminal: biotinilado en el C terminal), se recubrieron con avidina placas a 2 μg/ml, seguido de una incubación con los péptidos PAR-2 biotinilados a una concentración de 0,2 μg/ml, y se incubaron durante una hora. Se añadieron anticuerpos anti-PAR-2 purificados a la placa recubierta con los péptidos PAR-2 a una concentración final que varía desde 0,2 hasta 2,0 μg/ml y se incubaron durante una 20 hora a la temperatura ambiente. La detección de los anticuerpos unidos se determinó con anti-IgG de rata o humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA) y se desarrollo mediante una respuesta colorimétrica estándar mediante el uso de un sustrato de tetrametilbenzidina
(TMB). Se leyó la absorbancia a una DO450 durante 0,1 segundos.
La unión relativa (+++, ++, +) a los péptidos no biotinilados (sin biotina) o biotinilados A, B y C en comparación con ninguna unión (-) para cada anticuerpo anti-PAR-2 probado, según el valor observado de la DO450 (1,0 -4,0, 0,50 0,99, 0,1 -0,49, 0,0 -0,09, respectivamente) se muestra en la Tabla 3. Control: "Sam11", un anticuerpo monoclonal de ratón disponible comercialmente que se une al PAR-2 humano (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Tabla 3
Anticuerpo
Péptido A Péptido B Péptido C
Sin biotina
N terminal C terminal Sin biotina N terminal C terminal N terminal C terminal
H2M588N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H2M589N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H1M590N
+++ +++ +++ - - - - -
H2M591N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H1M592N
+++ +++ +++ - ++ +++ +++ +++
H1M595N
+++ + + + + + + - - - ++ -
H2M609N
+++ +++ +++ - - - - -
H2M610N
+++ +++ +++ - - - - -
H2M611N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H1M612N
+++ +++ +++ - - - - -
H1M613N
+++ +++ +++ - ++ +++ +++ +++
H2M614N
++ +++ +++ - - - - -
H1M615N
+ + + +++ +++ - - - - -
H1M616N
+++ +++ +++ - - - - -
H2M618N
+++ + + + + + + +++ + + + + + + - -
H1M619N
+++ +++ +++ - - - - -
H3M620N
+++ ++ +++ - - - - -
Control
- - - +++ +++ +++ - -
10 En un experimento similar se probaron anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados clonados en una IgG4 mutante humana (SEQ ID NO: 849) para evaluar su capacidad de unirse a las formas no biotiniladas y biotiniladas de los péptidos PAR-2 humanos (como se ha descrito anteriormente). Los resultados se muestran en la Tabla 4.
15 Tabla 4
Anticuerpo
Péptido A Péptido B Péptido C
Sin biotina
N terminal C terminal Sin biotina N terminal C terminal N terminal C terminal
H4H572P
- - - - - - - -
H4H573P
+++ +++ +++ - - - - -
H4H576P
+ - - - - - - -
H4H578P
+++ +++ +++ - - - - -
H4H579P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H4H580P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H4H581P
+ + + +++ +++ + + + +++ +++ + + +
H4H583P
+++ +++ +++ - - - - -
H4H584P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H4H585P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ + +
H4H587P
- - - - - - - +
H4H588N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H4H591N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
H4H618N
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - -
Control
- - - +++ +++ +++ - -
En otro experimento, se probaron anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados para evaluar su capacidad de unirse a los péptidos D, K, L y M no biotinilados (como se ha descrito anteriormente). Los resultados para los anticuerpos
20 quiméricos (por ejemplo, H2M588N) y para los anticuerpos completamente humanos (por ejemplo, H4H572P) se muestran en las Tablas 5 y 6, respectivamente. Para el Péptido D, la detección de los anticuerpos unidos se determinó con anti-k de ratón conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Southern Biotech, Birmingham, AL).
Tabla 5
Anticuerpo
Péptido D Péptido K Péptido L Péptido M
H2M588N
+++ - - -
H2M589N
+++ - - -
H1M590N
- - - -
H2M591 N
+ + + - - -
H1M592N
+ - - -
H1M595N
- - - -
H2M609N
+ - - -
H2M610N
- - - -
H2M611 N
+ - - -
H1M612N
- - - -
H1M613N
+ - - -
H2M614N
- - - -
H1M615N
- - - -
H1M616N
- - - -
H2M618N
+++ - - -
H1M619N
- - - -
H3M620N
- - - -
Control
+++ - - -
Tabla 6
Anticuerpo
Péptido D Péptido K Péptido L Péptido M
H4H572P
+ - - -
H4H573P
+ - - -
H4H576P
+ - - -
H4H578P
+ - - -
H4H579P
+++ - - -
H4H580P
+++ - - -
H4H581P
+++ + + +
H4H583P
++ - - -
H4H584P
+++ - - -
H4H585P
+++ + + +
H4H587P
+ - - -
H4H588N
+++ - - -
H4H591N
+++ + + +
H4H618N
+++ - - -
Control
+++ - - -
En otro experimento, se probaron anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados para evaluar su unión a los péptidos PAR-2 de ratón (Péptido E N terminal) y de mono (Péptido F N terminal) biotinilados en el N terminal (como se ha descrito anteriormente).
Tabla 7
Anticuerpo
Péptido E N terminal Péptido F N terminal
H2M588N
- +++
H2M589N
- +++
H1M590N
+ + + +++
H2M591N
- +++
H1M592N
- -
H1M595N
+++ +++
H2M609N
+++ +++
H2M610N
+++ +++
H2M611N
- + + +
H1M612N
+++ +++
H1M613N
- -
H2M614N
+++ +++
H1M615N
+++ +++
H1M616N
+++ +++
H2M618N
- +++
H1M619N
+++ +++
H3M620N
+++ ++
Control
- -
En otro experimento, se probaron anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados clonados en la IgG4 humana para evaluar su capacidad de unirse a las formas no biotiniladas y biotiniladas de los Péptidos E hasta J (como se ha descrito anteriormente). Los resultados se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Anticuerpo
Péptido E Péptido F N terminal Péptido G Péptido H Péptido I Péptido J
Sin biotina
N terminal Sin biotina N terminal C terminal
H4H572P
+ - - - - + - - -
H4H573P
+++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++
H4H576P
+ - - - - + - - -
H4H578P
+++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++
H4H579P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +
H4H580P
+ + + +++ + + + + + + +++ +++ - + + + +
H4H581P
+++ + + + +++ +++ + + + + + + - +++ +++
H4H583P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
H4H584P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ - +++ ++
H4H585P
+++ +++ +++ +++ +++ +++ + +++ +++
H4H587P
- - - - + - - - +
H4H588N
- - +++ - + - - - -
H4H591N
+ + +++ + + + + - +
H4H618N
- - +++ - - - - - -
Control
- - - - - - - - -
En otro experimento, se probaron anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados clonados en la IgG4 humana para evaluar
10 su capacidad de unirse a las formas no biotiniladas y biotiniladas de los péptidos PAR-2 (los Péptidos A, E, F y G; como se ha descrito anteriormente). En este experimento, los anticuerpos anti-PAR-2, diluidos sucesivamente tres veces desde 13,3 nM hasta 0,22 pM, se incubaron en placas recubiertas con el péptido durante una hora a la temperatura ambiente. Los valores de la absorbancia a 450 nm fueron analizados mediante un modelo de respuesta a la dosis sigmoideo de GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc. La Jolla, CA) y se indican los valores de la CE50
15 (Tabla 9). Los valores de la CE50 se definen como la concentración de anticuerpo necesaria para conseguir un 50 % de la unión máxima al péptido PAR-2.
Tabla 9
Anticuerpo
CE50 (nM)
Péptido A
Péptido E Péptido F N terminal Péptido G
Sin biotina
C terminal N terminal Sin biotina N terminal Sin biotina C terminal N terminal
H4H572P
> 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50
H4H573P
0,093 0,022 0,093 0,355 0,016 0,018 0,014 10,130 0,017
H4H576P
> 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50
H4H578P
0,034 0,040 0,062 2,778 0,090 0,036 0,046 > 50 0,081
H4H579P
0,038 0,076 0,077 0,713 0,540 0,061 0,055 0,044 0,059
H4H580P
0,090 0,202 0,160 2,533 0,932 0,148 0,139 0,100 0,142
H4H581P
0,012 0,028 0,020 0,029 0,032 0,020 0,020 0,013 0,019
H4H583P
0,008 0,018 0,015 0,019 0,014 0,013 0,012 0,630 0,015
H4H584P
0,012 0,015 0,019 2,152 0,511 0,012 0,013 0,015 0,012
Anticuerpo
CE50 (nM)
Péptido A
Péptido E Péptido F N terminal Péptido G
Sin biotina
C terminal N terminal Sin biotina N terminal Sin biotina C terminal N terminal
H4H585P
0,017 0,021 0,026 0,308 0,189 0,017 0,018 0,021 0,017
H4H587P
> 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50
H4H588N
0,010 0,016 0,019 > 50 > 50 0,012 > 50 > 50 > 50
H4H591N
0,010 0,016 0,022 > 50 > 50 0,011 > 50 > 50 > 50
H4H618N
0,009 0,016 0,021 > 50 > 50 0,011 > 50 > 50 > 50
Control
> 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50 > 50
Según indican los experimentos anteriores, todos los anticuerpos H4H581 P, H4H588N, H4H591 N o H4H618N muestran una unión sustancial a los Péptidos humanos A, B y D, que comprenden la secuencia SLIGKVDGT (los aminoácidos 10-18 de la SEQ ID NO: 852), así como al Péptido F de mono, que comprende la secuencia
5 SLIGRVDGT (los aminoácidos 10-18 de la SEQ ID NO: 857). Para los anticuerpos H4H588N, H4H591 N y H4H618N, la secuencia VDGT, ubicada secuencia abajo del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador, parece ser particularmente importante para la unión, dado que los cambios en esta secuencia dieron como resultado una reducción sustancial en la unión o ninguna unión por parte de éstos anticuerpos (véase, por ejemplo, los datos de unión para los Péptidos E (ratón), G (rata), H (conejo), I (perro) y J (cerdo)).
Ejemplo 4. Determinación de la afinidad de unión al antígeno
Las constantes de disociación en equilibrio (valores de la KD) para la unión del antígeno a los anticuerpos purificados PAR-2 seleccionados se determinaron mediante una cinética de superficie mediante el uso de un ensayo 15 en tiempo real con un biosensor de resonancia de plasmón superficial. El anticuerpo fue capturado en la superficie de un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón (GE Healthcare, Piscataway, NJ) o en la superficie de un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG humana (Jackson Immuno Research Lab, West Grove, PA) creados a través del acoplamiento químico directo de la amina con un chip del sensor BIACORE™ CM5 para formar una superficie con un anticuerpo capturado. Se inyectaron varias concentraciones (que varían desde 15,6 hasta 250 nM) de los 20 péptidos PAR-2 humanos monoméricos (los Péptidos A y B) a una velocidad de 100 μl/min en la superficie con el anticuerpo capturado durante 90 segundos. La unión y la disociación entre el antígeno y el anticuerpo fueron monitorizadas en tiempo real a la temperatura ambiente. Se llevó a cabo un análisis cinético para calcular la KD y la semivida de la disociación del complejo antígeno/anticuerpo (Tabla 10). Para aquellos anticuerpos en los que no se muestra el valor de la T1/2, se usó un análisis del estado estacionario para calcular el valor de la KD. NB: no se
25 observó unión en las condiciones experimentales actuales. ND: no determinado.
Tabla 10
Anticuerpo
Péptido A Péptido B
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H4H572P
NB - ND -
H4H573P
749 - ND -
H4H576P
NB - ND -
H4H578P
245 0,17 ND -
H4H579P
15 4 > 500 -
H4H580P
103 0,88 ND -
H4H581P
9,44 1,4 > 500 -
H4H583P
37,1 0,37 NB -
H4H584P
22 0,73 > 500 -
H4H585P
8,78 3,7 > 500 -
H4H587P
NB - ND -
H1M590N
173 - ND -
H1M592N
2100 - ND -
H1M595N
510 - ND -
H1M612N
180 - ND -
H1M613N
2100 - ND -
H1M615N
162 - ND -
H1M616N
144 - ND -
H1M619N
164 - ND -
H2M588N
4,47 60,8 61,7 7,7
H2M589N
3,75 51,3 128 7,3
H2M591N
4,22 42,7 151 8,1
H2M610N
71,3 - 360 0,8
H2M611N
72,8 4,1 1090 1,2
H2M614N
470 - ND -
Anticuerpo
Péptido A Péptido B
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H2M618N
9,62 6,7 126 3,5
Control
NB - 149 0,1
En un experimento similar, se determinaron los valores de la KD para la unión a los péptidos PAR-2 no biotinilado monomérico de ratón (Péptido E) y N terminal biotinilado de mono (Péptido F N terminal) de anticuerpos seleccionados clonados en la IgG4 humana (como se ha descrito anteriormente) (Tabla 11). Los anticuerpos H4H588N, H4H591 N y H4H618N no se unen al Péptido E, mientras que el anticuerpo de control no se une al Péptido E ni al F.
Tabla 11
Anticuerpo
Péptido F N terminal
KD (nM)
T1/2 (min)
H4H588N
7,10 24
H4H591N
8,54 21
H4H618N
13,8 5
10 En otra serie de experimentos se determinaron las constantes de disociación en equilibrio (valores de la KD) para la unión del anticuerpo purificado a formas biotiniladas y no biotiniladas seleccionadas de los péptidos PAR-2 a través de una cinética de superficie mediante el uso de un ensayo en tiempo real con un biosensor de resonancia de plasmón superficial. Se acopló covalentemente neutravidina (Pierce, Rockford, IL) a la superficie de un chip
15 Biacore™ C1 o de un chip CM5 mediante el uso de una química de acoplamiento con amina. Los péptidos PAR-2 biotinilados (en el N terminal o en el C terminal) (los Péptidos A y B) fueron inmovilizados en la superficie a través de una interacción de unión de alta afinidad entre la biotina y la neutravidina acoplada a la amina.
En un primer experimento mediante el uso este formato se inyectaron concentraciones variables (que varían desde 5
20 hasta 100 μg/ml) del anticuerpo purificado a una velocidad de 50 μl/min en la superficie recubierta con el péptido inmovilizado a una baja densidad (< 1 RU) durante 300 segundos. Se monitorizó la unión y la disociación del anticuerpo y el péptido en tiempo real a 25 ºC (Tabla 12).
Tabla 12
Anticuerpo
Péptido A C terminal Péptido B C terminal
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H2M588N
0,826 169 1,49 140
H1M590N
1,27 13 NB -
H2M591N
0,545 209 1,82 94
H2M618N
1,8 79 2,32 60
Control
NB - 0,99 19
En otro experimento similar se determinaron los valores de la KD para la unión a una superficie de baja densidad (< 1 RU) de las formas biotiniladas de los Péptidos A, B, C, E, F y G de los anticuerpos seleccionados clonados en la IgG4 humana (como se ha descrito anteriormente). Los resultados de la unión a los péptidos PAR-2 biotinilados en
30 el C terminal y en el N terminal se muestran en las Tablas 13-14, respectivamente. En este experimento, únicamente el anticuerpo H4H581 P mostró afinidad por el Péptido C biotinilado en el N terminal (KD de > 100 nM), mientras que todos los demás anticuerpos probados, incluyendo el de control, no mostró unión a este péptido.
Tabla 13
Anticuerpo
Péptido A C terminal Péptido B C terminal
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H4H579P
0,143 479 0,453 96
H4H581P
0,237 134 0,346 49
H4H583P
0,898 34 NB -
H4H584P
0,688 55 1,66 15
H4H585P
0,151 493 0,376 123
H4H588N
0,517 141 1,03 70
H4H590N
3,56 3 NB -
Anticuerpo
Péptido A C terminal Péptido B C terminal
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
Control
NB - 0,935 14
Tabla 14
Anticuerpo
Péptido A N terminal Péptido B N terminal Péptido E N terminal Péptido F N terminal Péptido G N terminal
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H4H579P
1,61 46 5,44 55 3,40 20 0,796 70 1,16 38
H4H581P
0,498 41 2,72 38 1,13 21 0,272 78 0,354 62
H4H583P
0,412 46 NB - 1,68 11 0,291 73 1,49 13
H4H584P
0,525 43 3,20 30 >100 - 0,565 40 1,39 15
H4H585P
1,69 48 5,41 63 >100 - 0,899 66 1,36 35
H4H588N
1,05 189 0,0272 >1155 NB - 1,81 94 NB -
H4H590N
1,52 3 NB - 1,28 7 1,84 2 2,94 2
Control
NB - 0,279 32 NB - NB - NB -
5 En un experimento similar, se determinaron los valores de la KD para la unión a formas monoméricas biotiniladas y no biotiniladas de los péptidos PAR-2 (los Péptidos A, B, E -M) para los anticuerpos seleccionados clonados en la IgG4 humana (como se ha descrito anteriormente para la superficie con el anticuerpo capturado). Los resultados se muestran en las Tablas 15-16. Ninguno de los anticuerpos probados mostró unión a los Péptidos K, L o M.
10 Tabla 15
Anticuerpo
Péptido A Péptido B Péptido E
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H4H579P
15 4,1 > 500 - > 500 -
H4H581P
9,44 1,4 > 500 - > 500 -
H4H583P
37,1 0,37 NB - > 500 -
H4H584P
22 0,73 NB - NB -
H4H585P
8,78 3,7 > 500 - > 500 -
H4H588N
4,95 25,1 84 9 NB -
H4H590N
> 500 - NB - > 500 -
Control
ND - 149 0,1 ND -
Tabla 16
Anticuerpo
Péptido F N terminal Péptido G Péptido H Péptido I Péptido J
KD (nM)
T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min) KD (nM) T1/2 (min)
H4H579P
49,4 2 134 0,45 NB - 311 0,26 NB -
H4H581P
36,6 0,53 40,2 0,63 NB - 143 0,07 NB -
H4H583P
112 0,47 530 0,07 189 0,17 320 0,16 190 0,16
H4H584P
93,3 0,23 246 0,13 NB - > 500 - NB -
H4H585P
46,2 2 162 0,33 NB - 372 0,19 NB -
H4H588N
10,8 20 NB - NB - NB - NB -
H4H590N
> 500 - > 500 - > 500 - > 500 - > 500 -
Ejemplo 5. Unión del anticuerpo las células modificadas para que expresen el PAR-2
Para caracterizar adicionalmente los anticuerpos anti-PAR-2, se modificaron genéticamente las células de la línea celular humana de riñón embrionario 293 (HEK293) para que sobreexpresaran bien el PAR-2 humano (la SEQ ID 20 NO: 851) o bien el de ratón (la SEQ ID NO: 866) completo.
Las células HEK293 se transfectaron con un plásmido indicador NF-xB-luciferase-IRES-eGFP. La estabilidad de las células transfectadas se demostró mediante la respuesta a la IL-1β, detectada por la expresión de la eGFP a través de una citometría de flujo y la actividad de la luciferasa. Se elaboró una línea celular clonal, denominada D9, que 25 tiene unos bajos niveles de actividad de luciferasa de fondo y unos elevados niveles de eGFP cuando se induce con IL-1β mediante una serie de clasificaciones sucesivas de poblaciones celulares mediante el uso de una citometría de flujo. Después, la línea celular 293/D9 se transfectó por separado con el PAR-2 humano o con el PAR-2 de ratón
para crear las líneas celulares estables 293/D9/hPAR-2rec y 293/D9/mPAR-2rec, respectivamente.
La unión de los anticuerpos anti-PAR-2 a las células 293/D9/hPAR-2rec se determinó mediante un ELISA. Las células 293/D9 y 293/D9/hPAR-2rec se colocaron en placas a una densidad de 5 x 104 células/pocillo en medio y se 5 incubaron durante una noche a 37 ºC y con un 5 % de CO2. Se añadió el anticuerpo purificado a las células a una concentración final de 10 μg/ml y se incubaron a la temperatura ambiente durante una hora. Después las células se fijaron y se lavaron antes de la detección de los anticuerpos unidos con anti-IgG de ratón conjugado con HRP y se desarrollaron mediante una respuesta colorimétrica estándar mediante el uso del sustrato TMB. La absorbancia se leyó a una DO450 durante 0,1 segundos. La proporción de A450 de la unión de los anticuerpos a las células
10 293/D9/hPAR-2rec comparada con la de las células 293/D9 se muestra en la Tabla 17.
Tabla 17
Anticuerpo
Proporción de A450
H2M588N
2,50
H2M589N
2,03
H1M590N
1,81
H2M591N
2,25
H1M592N
1,25
H1M595N
1,80
H2M609N
1,54
H2M610N
1,66
H2M611N
1,76
H1M612N
1,90
H1M613N
1,27
H2M614N
1,17
H1M615N
2,18
H1M616N
2,78
H2M618N
2,44
H1M619N
1,51
H3M620N
1,24
Control
1,49
15 En un experimento similar, se probó la unión de los anticuerpos anti-PAR-2 a células 293/D9, 293/D9/hPAR-2rec y 293/D9/mPAR-2rec mediante el uso de una tecnología de electroquimioluminiscencia (Meso Scale Discovery, MSD, Gaithersburg, MD). Las células se colocaron en placas de alta unión MSD de 96 pocillos a una densidad de 4 x 104 células/pocillo en PBS y se incubaron durante una hora a la temperatura ambiente. Después las células se bloquearon con PBS con un 2 % de BSA y se incubaron a la temperatura ambiente durante una hora. Los
20 anticuerpos anti-PAR-2 (que variaban entre 100 nM y 0,098 nM) se diluyeron sucesivamente dos veces en PBS con un 0,5 % de BSA y se incubaron con las células durante una hora a la temperatura ambiente, seguido de un lavado con PBS con un 0,5 % de BSA. Después se añadió un anticuerpo anti-IgG humana sulfo-marcado (MSD) a una concentración de 0,1 μg/ml a la mezcla de células/anticuerpos, y se incubaron a la temperatura ambiente durante una hora más. Después de otro lavado, se añadió tampón de lectura que contiene 1 X de un no tensioactivo y se
25 leyó la señal electroquimioluminiscente con el MSD Sector Imager. La señal de la unión del anticuerpo a las células 293/D9 se restó de la señal de las células 293/D9/hPAR-2rec o 293/D9/mPAR-2rec. Los datos restados se analizaron mediante el uso de un modelo de dosis respuesta sigmoideo con GraphPad Prism, y se indicaron los valores de la CE50 y de la Bmáx (Tabla 18). Los valores de la CE50 se definen como la concentración de anticuerpo necesaria para conseguir un 50 % de la unión máxima (Bmáx) a las células.
Tabla 18
Anticuerpo
293/D9/hPAR-2rec 293/D9/mPAR-2rec
CE50 (nM)
Bmáx (unidades MSD) CE50 (nM) Bmáx (unidades MSD)
H4H579P
1,86 25049 NB -
H4H580P
8,69 30177 NB -
H4H581P
0,652 28224 NB -
H4H583P
2,12 13252 9,28 7219
Anticuerpo
293/D9/hPAR-2rec 293/D9/mPAR-2rec
CE50 (nM)
Bmáx (unidades MSD) CE50 (nM) Bmáx (unidades MSD)
H4H584P
1,45 26044 NB -
H4H585P
1,95 22540 NB -
H4H588N
5,95 27549 NB -
H4H590N
9,72 6554 5,76 13255
Ejemplo 6. Bloqueo in vitro de la activación del PAR-2 humano por parte de los anticuerpos anti-PAR-2
El bloqueo de la activación (señalización) del PAR-2 fue determinado mediante la unión de anticuerpos anti-PAR-2
5 purificados seleccionados a las células 293/D9/hPAR-2rec (véase el Ejemplo 5) mediante un ensayo con luciferasa. Las células 293/D9/hPAR-2rec se colocaron en placas a una concentración que variaba desde 5 x 104 hasta 105 células/pocillo en una placa de 96 pocillos en un medio con poco suero, y se incubaron durante una noche a 37 ºC con un 5 % de CO2. Se retiró el medio y se añadieron los anticuerpos anti-PAR-2 purificados a las células a diversas concentraciones (que variaban desde 51 pM hasta 1 μM) y se incubaron durante una hora a 37 ºC con un 5 % de
10 CO2. Después se añadieron varias concentraciones de diferentes proteasas de serina (Tripsina, Tripsina Humana 1, Factor Xa y Triptasa Pulmonar) por separado a la mezcla de células/anticuerpos, y se incubaron durante cinco horas a 37 ºC con un 5 % de CO2. En este ensayo, la escisión proteolítica del PAR-2 da lugar a la expresión del constructo indicador NF-xB-luciferasa, mientras que un nivel reducido o atenuado de la señal de la luciferasa indica una inhibición de la escisión del PAR-2. Los valores de la CI50 se muestran en la Tabla 19. ND: no determinado.
Tabla 19
Anticuerpo
CI50 (nM)
Tripsina
Tripsina 1 humana 10 nM Factor Xa 200 nM Triptasa pulmonar 750 nM
250 nM
75 nM 30 nM 20 nM 10 nM
H2M588N
2,3 5,7 33,0 26,8 10,4 164,9 45,3 1,0
H2M589N
6,3 3,7 ND ND ND ND ND ND
H1M591N
4,5 ND ND 121,8 24,2 149,6 51,5 88,1
H2M618N
6,6 7,8 ND 70 12,4 153,5 54,2 7,0
Según se muestra en la Tabla 20, los anticuerpos H4H581 P, H4H588N, H4H591 N y H4H618N fueron capaces de
20 bloquear significativamente la activación de la proteasa del PAR-2 en las células indicadoras. Por el contrario, los anticuerpos anti-PAR-2 H4H592N, H4H595N, H4H611 N, H4H613N, H4H614N, H4H615N, H4H616N, H4H617N y H4H619N no mostraron ningún bloqueo medible de la escisión/activación del PAR-2 en este ensayo (datos no mostrados).
25 Tabla 20
Anticuerpo
CI50 de la Tripsina a 20 nM (nM)
H4H579P
4,1
H4H580P
3,5
H4H581P
1,1
H4H583P
14
H4H584P
5,6
H4H585P
8,9
H4H588N
16,9
H4H591N
204,1
H4H618N
50,2
En las condiciones experimentales usadas en este Ejemplo, no se observó ningún bloqueo de la señalización del PAR-2 por parte de los anticuerpos H4H572P, H4H573P, H4H576P, H4H578P ni H4H587P, mientras que se 30 observó un bloqueo significativo (en diversos grados) con los anticuerpos H4H579P, H4H580P, H4H581 P, H4H583P, H4H584P, H4H585P, H4H588N, H4H591 N y H4H618N.
En otro experimento similar se determinó el bloqueo por parte del anticuerpo de la señalización del PAR-2 mediada por la Tripsina 1 humana, el Factor Xa y la Triptasa Pulmonar para anticuerpos anti-PAR-2 purificados seleccionados 35 clonados en una IgG4 humana (como se ha descrito anteriormente). Los resultados se muestran en la Tabla 21.

Tabla 21. CI50 (nM)
Anticuerpo
Tripsina 1 humana 10 nM Factor Xa 200 nM Triptasa pulmonar 750 nM
H4H581P
7,4 5,3 1,1
H4H588N
42,7 17,1 1,6
H4H591N
104,7 74,6 62,9
H4H618N
92,2 47,2 8,5
Se trataron las células HEK293/NFxB-luciferasa que expresan el PAR-2 humano, de mono, de ratón o de rata, con varias proteasas después de una incubación previa con cantidades crecientes del anticuerpo anti-PAR-2 H4H581 P, y se determinó la CI50. Los resultados se resumen en la Tabla 22.
Tabla 22
Activador (6 h)
Especie del PAR-2 CE50 (nM) CI50 (nm) del H4H581P
Tripsina pancreática humana
Humano 0,8 1,9
De ratón
1,4 491,0
De mono
2,4 5,4
De rata
6,0 700,0
Calicreína 5 humana
Humano 28,0 0,9
De ratón
ND ND
De mono
16,8 11
Calicreína 14 humana
Humano 5,0 1,2
De ratón
8,0 256,0
De mono
6,3 11,6
Factor Xa bovino
Humano 27,2 2,5
De ratón
46,3 340,4
De mono
58,2 0,9
Factor Xa humano
Humano 46,3 1,1
De ratón
78,7 109
De mono
ND ND
Triptasa
Humano 61,1 3,5
De ratón
ND ND
De mono
ND ND
10 En las condiciones experimentales usadas en particular, el anticuerpo H4H581 P inhibía eficazmente la activación de la proteasa del PAR-2 humano y de mono, pero no la del PAR-2 de ratón ni de rata.
Ejemplo 7. Bloqueo in vitro por parte de los anticuerpos de la movilización de calcio dependiente del PAR-2 15 humano
El bloqueo de la activación (señalización) del PAR-2 estimulada por la tripsina se determinó mediante el tratamiento de las células HEK293 con anticuerpos anti-PAR-2 purificados seleccionados clonados en una IgG4 humana en un ensayo de movilización de calcio FLIPR (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). En este ensayo también se probó un
20 anticuerpo de control no específico para el PAR-2.
En resumen, se colocaron 8 x 104 células HEK293 en placas de Poli-D-Lisina (BD Biosciences, San Jose, CA) en un medio con poco suero (DME con un 0,5 % de FBS) y se incubaron durante una noche a 37 ºC con un 5 % de CO2. Al día siguiente, las células se incubaron con varias concentraciones (que varían desde 0 hasta 1 μM) de los 25 anticuerpos anti-PAR-2 seleccionados, o de un anticuerpo de control, seguido de la adición de la tripsina. La activación mediada por la tripsina del PAR-2 está indicada por la movilización del calcio. La medición intracelular de la señalización del calcio se midió mediante el uso de un kit de ensayo de calcio Fluo-4 NW (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Se midió la concentración de anticuerpo necesaria para provocar la mitad de la inhibición máxima de la señalización de calcio mediada por la tripsina (CI50) para cada
30 anticuerpo experimental y de control. Los resultados se muestran en la Tabla 23 en forma de la CI50 (nM).
Tabla 23
Anticuerpo
Tripsina 100 nM
H4H581P
54,96
H4H588N
29,47
Control no específico
> 1000
Según se muestra en este Ejemplo, cada uno de los anticuerpos H4H581 P y H4H588N inhibió la señalización de calcio estimulada por la tripsina en una magnitud significativa en comparación con el anticuerpo de control.
Ejemplo 8. Bloqueo in vitro de la escisión mediada por tripsina de los péptidos del PAR-2
5 Se desarrolló un ensayo de desorción/ionización por láser asistida por matriz -tiempo de vuelo (MALDI-TOF) para determinar la capacidad de los anticuerpos anti-PAR-2 purificados seleccionados de bloquear la escisión mediada por tripsina del péptido del PAR-2 humano (el Péptido A, la SEQ ID NO: 852). Se mezclaron versiones biotiniladas del Péptido A (que contienen una biotina en el C terminal o en el N terminal) con un anticuerpo anti-PAR-2 para conseguir una proporción molar de 3:1 entre el anticuerpo y el péptido, y después se añadió tripsina a la mezcla de péptido-anticuerpo. Después, los péptidos biotinilados fueron recuperados mediante una inmunoprecipitación (IP) a través de monoavidina y se analizaron mediante una MALDI-TOF.
En un experimento típico se probó la capacidad de los anticuerpos anti-PAR-2 purificados seleccionados clonados
15 en la IgG4 humana (H4H581 P y H4H588N) de bloquear la escisión mediada por tripsina de los péptidos del PAR-2 biotinilados. Como control negativo se usó un anticuerpo no específico del PAR-2 del mismo isotipo ("Neg Ctrl" en la Fig. 3). Para el H4H581 P y para el anticuerpo de control negativo, se usaron péptidos biotinilados a una concentración final de 4,75 μM, y los anticuerpos se usaron a 14,25 μM. Para el H4H588N, se usaron péptidos biotinilados a una concentración final de 2,45 μM y el anticuerpo a 7,35 μM. El péptido y el anticuerpo se mezclaron en PBS y se dejó que alcanzaran el equilibrio durante 1 h a la temperatura ambiente. Después se añadió la tripsina (96 ng) y la mezcla se incubó a 37 ºC durante 0, 5, 10 y 15 minutos. En cada punto temporal se retiró una alícuota equivalente a 100 ng del péptido biotinilado y se mezcló con 10 μl de resina de avidina monomérica (Pierce) durante 1 minuto. Los péptidos unidos se aclararon 3x con 200 μl de PBS y después se eluyeron con 20 μl de glicina 100 mM a pH 2,5. La sal se retiró de la mezcla del péptido eluído mediante el uso de ZipTips (Millipore). Los pesos
25 moleculares de los principales péptidos del PAR-2 biotinilados producidos después de la escisión con tripsina, según reveló el análisis mediante la MALDI-TOF, se resumen en la Fig. 3.
Los péptidos del PAR-2 usados en estos experimentos contienen dos sitios de escisión de la proteasa. El primer sitio (denominado sitio "(1)" en la Fig. 3) es un sitio de escisión "secuencia arriba" ubicado N terminal con respecto al sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. El sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (denominado sitio "(2)" en la Fig. 3) es el sitio que, cuando es escindido, da como resultado la formación del ligando anclado del PAR-2 en la proteína natural. Los tamaños de los péptidos detectados después de la escisión en los diferentes sitios se muestran en la porción superior de la Fig. 3 (panel A).
35 Según se indica en la Fig. 3 (panel B), cuando se trató la biotina C terminal del péptido del PAR-2 con el anticuerpo de control de un isotipo parejo, seguido de una incubación con tripsina, se produjo un fragmento de escisión de 1558 Da (que contiene los residuos 10-18 de la SEQ ID NO: 852). El fragmento de 1558 Da es el resultado de la escisión en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (2). Este patrón de escisión también se observó en el experimento que utilizaba el anticuerpo anti-PAR-2 H4H588N. Por lo tanto, según este ensayo, ni el anticuerpo de control ni el anticuerpo H4H588N inhiben la escisión de la tripsina en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (2).
Por el contrario, cuando se trató el péptido PAR-2 con la biotina en el C terminal, con el anticuerpo H4H581 P, seguido de una incubación con tripsina, se produjo un fragmento de escisión de 2.073 Da (que contiene los residuos
45 5-18 de la SEQ ID NO: 852). El fragmento de 2.073 Da es un fragmento producido por la escisión únicamente en el sitio de escisión secuencia arriba (1). Por lo tanto, la escisión en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (2) era aparentemente bloqueada por el anticuerpo H4H581 P.
Los experimentos con el péptido PAR-2 con la biotina en el N terminal mostraron una escisión de la tripsina en el sitio de escisión secuencia arriba (1), y por lo tanto se produjo un fragmento de 988 Da N-biotinilado (que contiene los residuos 1-4 de la SEQ ID NO: 852) en presencia de todos los anticuerpos probados. Por lo tanto, ninguno de los anticuerpos probados bloqueaba la escisión en el sitio de escisión secuencia arriba (1) en estas condiciones experimentales.
55 Según se muestra en los anteriores Ejemplos 6 y 7, tanto el H4H581 P como el H4H588N bloquearon la activación del PAR-2 por parte de la tripsina en un ensayo basado en células. En el presente Ejemplo, sin embargo, únicamente el H4H581 P bloqueó la escisión de la tripsina en el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Sin estar ligados a ninguna teoría mecanicista, parece por lo tanto que el H4H588N puede ejercer su(s) efecto(s) inhibidor(es) al interferir con la interacción entre el ligando anclado y uno o más bucles extracelulares (por ejemplo, el bucle 1, el bucle 2 y/o el bucle 3) del PAR-2. Por otro lado, el H4H581 P puede inhibir la actividad del PAR-2 principalmente mediante el bloqueo de la escisión de la proteasa, pero también puede interferir asimismo con las interacciones con el ligando anclado.
Para investigar adicionalmente las propiedades de bloqueo de la escisión de la proteasa de los anticuerpos anti
65 PAR-2, se llevaron a cabo experimentos adicionales de MALDI-TOF mediante el uso de péptidos PAR-2 biotinilados en el C terminal de ratón, de rata y humanos (véase la Fig. 4). Los anticuerpos probados en estos experimentos
fueron el H4H581 P, el H4H588N, un anticuerpo de comparación que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo denominado "1A1" en el documento WO 2009/005726 (indicado en la Fig. 5 como "Comp. Ab") y un anticuerpo de control negativo (indicado en la Fig. 4 como "Neg Ctrl"). En este experimento se usaron también los mismos procedimientos experimentales que se usaron en el experimento previo de MALD-TOF
5 (descrito anteriormente).
Cada uno de los péptidos usados en estos experimentos posee múltiples sitios susceptibles de ser escindidos por la tripsina (indicados como "(1)", "(2)", y "(3)" en la Fig. 5.) El sitio (3) en cada péptido es el sitio de escisión de la proteasa activador. Los tamaños de los péptidos producidos después de la escisión en los diferentes sitios se
10 muestran en la porción superior (panel A) de la Fig. 4.
Según se resume en la Fig. 4, el péptido PAR-2 humano biotinilado, después de ser tratado con el H4H581 P y después de la incubación con tripsina, produjo un péptido de 2.074 kDa que se corresponde únicamente con una escisión en el sitio (1). Por lo tanto, el H4H581 P bloquea la escisión tanto en el sitio (2) como en el sitio (3). Por el 15 contrario, el péptido PAR-2 humano, después de ser tratado con el anticuerpo de comparación y después de la incubación con tripsina, permaneció con 2.502 kDa, lo que significa que no hubo escisión. Por lo tanto, el anticuerpo de comparación bloquea los tres sitios de escisión de la proteasa en este ensayo, incluyendo el sitio más N terminal (1). Cuando se trató previamente con el anticuerpo H4H588N, el péptido PAR-2 humano produjo tanto un fragmento de 1.772 kDa como uno de 1.558 kDa después de la escisión con tripsina. Este patrón de escisión sugiere que el
20 péptido H4H588N bloquea parcialmente la escisión en el sitio activador (3) pero bloquea completamente el sitio intermedio (2).
Este experimento también se llevó a cabo mediante el uso de un anticuerpo de comparación que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo indicado como Sam-11 (Molino et al., Arterioscler. Thromb.
25 Vasc. Biol. 18: 825-832 (1998)). Según se esperaba, este anticuerpo de comparación en particular no bloqueó la escisión en ninguno de los sitios de escisión de la proteasa (datos no mostrados).
Ejemplo 9. Cartografiado de epítopos mediante una mutagénesis de cribado con alanina del péptido PAR-2
30 Con objeto de identificar más particularmente los aminoácidos del PAR-2 con los que interactúan los anticuerpos PAR-2, se llevó a cabo un estudio de cribado con alanina mediante el uso de péptidos que comprenden el sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador. Para estos experimentos se sintetizaron 11 péptidos diferentes biotinilados en el C terminal, en los que cada aminoácido desde la posición 35 hasta la 45 del PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851) estaba sustituido individualmente por una alanina (SEQ ID NOs: 871-882). También se usó un conjunto
35 adicional de péptidos biotinilados en el C terminal que comprenden los 14 aminoácidos ubicados inmediatamente C terminales al sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador, con el cambio de la Val-42 y/o de la Asp-43 por alanina (SEQ ID NOs: 884-887).
Se midió la capacidad de cada péptido mutante para unirse a los anticuerpos PAR-2 mediante el uso de una
40 interferometría en biocapa (Octet Red; ForteBio). Cada péptido (2,5 μg/ml) se capturó en puntas biosensoras recubiertas con estreptavidina (Octet SA sensor) durante 10 segundos. Para medir la unión y la disociación entre cada péptido y el anticuerpo PAR-2, los biosensores recubiertos con el péptido se pusieron en contacto con soluciones 200 nM de los anticuerpos PAR-2 durante 5 minutos (unión) seguido de la trasferencia a un tampón sin anticuerpo durante 10 min (disociación). La unión del anticuerpo PAR-2 a cada péptido se expresó en forma del
45 porcentaje de la señal nativa, después de dividir la señal de unión del anticuerpo individual por la señal de carga del péptido original observada para ese péptido, para corregir las ligeras variaciones en la carga de péptido en los biosensores individuales. Las semividas de disociación (T1/2) se calcularon a partir de las curvas de disociación mediante el uso del programa de ajuste de curvas Scrubber versión 2.0a, y las semividas relativas se calcularon mediante la división de las semividas observadas para un péptido individual por la semivida del péptido nativo. Los
50 resultados están expresados como el porcentaje de unión y el porcentaje de T1/2 con respecto al péptido WT (Tablas 24-28) [de comparación 1 = un anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo indicado como "1A1" en el documento WO 2009/005726; de comparación 2 = un anticuerpo que tiene las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo indicado como Sam-11 (Molino et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18: 825-832 (1998)); y de comparación 3 = un anticuerpo que tiene las regiones variables de la
55 cadena pesada y ligera del anticuerpo indicado como "PAR-B" en el documento US 2010/0119506]. En algunos casos se repitieron los experimentos de unión (lo que se indica en los encabezamientos de columna Exp1 y Exp2). NB = no se observó unión.

Tabla 24: H4H581P
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
871
100 100 100 100
872
78 97 118 117
873
87 105 122 90
874
45 56 7 3
875
9 19 0.4 0
876
8 14 0.2 0
877
101 92 33 15
878
113 109 63 49
879
36 46 1 1
880
18 5 36 4
881
67 102 117 124
882
65 91 129 94
884
-- 100 -- 100
885
-- 19 -- 0
886
--- NB --- NB
887
--- NB --- NB
Tabla 25: H4H588N
SEQ ID
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
NO:
Exp1 Exp2 Exp1 Exp2
871
100 100 100 100
872
122 99 100 253
873
208 115 100 180
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
874
119 93 100 70
875
127 105 100 42
876
92 85 36 8
877
30 30 1 0
878
217 121 108 60
879
74 52 1 0
880
35 8 4 5
881
81 67 1 1
882
125 121 94 33
884
- 100 - 100
885
- 83 - 0
886
- NB - NB
887
- NB - NB

Tabla 26: de comparación 1
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
871
100 100 100 100
872
111 111 29 27
873
135 87 0.2 0
874
126 102 223 148
875
147 105 2 1
876
156 108 47 41
877
139 108 31 24
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
878
118 84 3 2
879
148 104 173 100
880
124 102 192 111
881
119 97 130 121
882
132 119 154 116
884
--- NB --- NB
885
--- NB --- NB
886
--- NB --- NB
887
--- NB --- NB

Tabla 27: de comparación 2
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
871
--- NB --- NB
872
--- NB --- NB
873
--- NB --- NB
874
--- NB --- NB
875
--- NB --- NB
876
--- NB --- NB
877
--- NB --- NB
878
--- NB --- NB
879
--- NB --- NB
880
--- NB --- NB
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
881
--- NB --- NB
882
--- NB --- NB
884
-- 100 -- 100
885
-- 120 -- 159
886
-- 88 -- 27
887
-- 87 -- 27

Tabla 28: de comparación 3
SEQ ID NO:
SECUENCIA % de unión relativa % de T½ relativa
Exp1
Exp2 Exp1 Exp2
871
-- 100 -- 100
872
-- 101 -- 109
873
-- 98 -- 7
874
-- 106 -- 21
875
-- 115 -- 79
876
-- 92 -- 7
877
-- 101 -- 8
878
-- 109 -- 95
879
-- 96 -- 98
880
-- 99 -- 120
881
-- 93 -- 128
882
-- 117 -- 118
884
--- NB --- NB
885
--- NB --- NB
886
--- NB --- NB
887
--- NB --- NB
Los resultados del experimento de cribado con alanina se resumen en la Fig. 5, en la que los círculos negros indican los aminoácidos del PAR-2 que, cuando son cambiados por alanina, reducen sustancialmente la unión por parte del anticuerpo correspondiente (es decir, la T½ de la unión del anticuerpo al péptido mutado es menor del 30 % de la T½ de la unión del anticuerpo al péptido natural) (los triángulos blancos de la Fig. 5 indican los sitios de escisión de la 5 proteasa no activadores secuencia arriba, y el triángulo negro indica el sitio de escisión de la proteasa activador). Según se ilustra en la Fig. 5, los de comparación 1 y 3 eran sensibles a las mutaciones en los residuos en ambos lados del sitio de escisión de la proteasa activador. Por el contrario, los anticuerpos H4H581 P y H4H588N sólo son sensibles a las mutaciones en los residuos que se encuentran en C terminales al sitio de escisión de la proteasa activador. Por lo tanto, el sitio de unión del H4H581 P en el PAR-2 parece estar desplazado aproximadamente 2-4 10 aminoácidos en la dirección C terminal con respecto a sitio de unión de los anticuerpos de comparación 1 y 3, y el sitio de unión del H4H588N está desplazado aproximadamente 2-4 aminoácidos en la dirección C terminal del sitio de unión del H4H581 P. El anticuerpo de comparación 2 únicamente se unió a los péptidos que comprenden los 14 aminoácidos secuencia abajo del sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador, es decir, SLIGKVDGTSHVTG (los residuos 1-14 de la SEQ ID NO: 884) y era sensible a las mutaciones en el resido de ácido aspártico (el Asp-43
15 de la SEQ ID NO: 851), pero no a las mutaciones en el resido de valina (la Val-42 de la SEQ ID NO: 851).
De forma significativa, este experimento indica que ambos anticuerpos H4H581 P y H4H588N interactúan con los primeros residuos de V y de D ubicados en C terminales al sitio de escisión de la proteasa del PAR-2 activador (es decir, la Val-42 y el Asp-43 de la SEQ ID NO: 851), mientras que los anticuerpos de comparación 1 y 3 no
20 interactúan con ninguno de estos residuos, y el anticuerpo de comparación 2 interactúa con el Asp-43 pero no con la Val-42. El desplazamiento en la unión del H4H581 P al PAR-2 con respecto a los anticuerpos de comparación puede explicar la superioridad funcional del H4H581 P sobre los de comparación, según se muestra en los siguientes ejemplos in vivo.
25 Ejemplo 10. Respuesta a la dosis del anticuerpo anti-PAR-2 en modelos de prurito
En este Ejemplo se evalúa la capacidad del anticuerpo anti-PAR-2 H4H581 P para atenuar el picor en dos modelos diferentes de prurito inducido por proteasa. Se usaron ratones transgénicos que expresan el PAR-2 humano (hPAR2+/+) en todos los grupos de estos experimentos. Los grupos de ratones recibieron por separado 150 mg/kg 30 (s.c.) de un AcMc de control de isotipo o 10, 25, 50, 75, 100 y 150 mg/kg (s.c.) del H4H581 P. Veinticuatro horas después de la dosis del anticuerpo, todos los grupos recibieron 150 μg de tripsina porcina o 10 μg de triptasa beta humana recombinante (s.c., interescapular), que produjo unos brotes de comportamiento de rascado durante entre 30 y 60 minutos. Se observó una relación entre la respuesta y la dosis en los ratones que recibieron el H4H581 P antes de la inyección de tripsina, con una DE50 estimada de 25 mg/kg. Los resultados de estos experimentos,
35 expresados en términos del porcentaje de cambio en el número total de brotes de rascado registrados durante un periodo de 30 minutos después de la administración de la tripsina, o durante un periodo de 60 minutos después de la administración de la triptasa, se muestran en la Tabla 29 (todo los datos se presentan como la media ± EEM; ND = no determinado; * = p < 0,05 en comparación con el grupo de control de isotipo).
40 Tabla 29
Dosis del AcMc H4H581 P
Porcentaje de cambio en los brotes de rascado con respecto al control
(mg/kg)
Tripsina Triptasa
10
9,9 ± 23,1 -40,7 ± 23,4
25
-26,6 ± 11,3 -38,5 ± 11,1
50
-31,3 ± 13,5 -47,7 ± 8,0 *
75
-34,9 ± 4,7 * ND
100
-55,2 ± 8,0 * -39,6 ± 6,9 *
150
-42,9 ± 9,7 * ND
Según se muestra en este Ejemplo, el AcMc H4H581 P fue capaz de bloquear los comportamientos de prurito inducidos por la proteasa de una forma dependiente de la dosis mediante el uso de dos modelos diferentes de picor
45 inducido por proteasa.
Ejemplo 11. Reducción en los comportamientos de prurito mediante la administración del anticuerpo anti-PAR-2 en un modelo de dermatitis crónica inducida por un hapteno
50 Para evaluar adicionalmente la capacidad del anticuerpo anti-PAR-2 H4H581 P para reducir los comportamientos de prurito en un estado patológico fisiológicamente pertinente, se usó un modelo de ratón de dermatitis crónica. En este modelo, los ratones recibieron repetidas aplicaciones cutáneas del agente haptenizante oxazolona. Se ha demostrado que este modelo de dermatitis crónica inducida por oxazolona recapitula muchas de las características clínicas, histológicas e inmunológicas de la dermatitis atópica en los seres humanos (Man et al., 2008, J. Invest.
Dermatol. 128 (1): 79-86).
Se sensibilizaron ratones con una única aplicación cutánea de oxazolona al 1 % en la oreja izquierda, o de vehículo (100 mg/kg, s.c.). Después los ratones recibieron nueve aplicaciones cutáneas en total (exposiciones) de oxazolona 5 al 0,6 % entre las escápulas comenzando siete días después de la aplicación de sensibilización. Las dosis semanales (3 en total) del anticuerpo H4H581 P anti-PAR2 se iniciaron 24 horas antes de la primera exposición a la oxazolona (100 mg/kg, s.c.). Este paradigma de dosificación redujo significativamente los comportamientos de prurito medidos mediante el reducido número de brotes de picor desencadenados por la exposición final a la oxazolona. Todos los datos están representados como el número medio de brotes de picor ± EEM para n = 6
10 ratones/grupo; * = p < 0,05 mediante la prueba de Tukey post-hoc en comparación con el grupo con oxazolona + control con IgG; # = p < 0,05 mediante la prueba de Tukey post-hoc en comparación con el grupo con vehículo + control con IgG).
Tabla 30
Tratamiento
Tiempo (minutos) Total
0-10
10-20 20-30 30-40 40-50 50-60
Vehículo + IgG de control
0,0 ± 0,0 0,8 ± 0,6 2,2 ± 1,4 3,4 ± 1,3 4,8 ± 2,0 2,4 ± 1,0 13,6 ± 4,2
Oxazolona + IgG de control
0,5 ± 0,5 11,3 ± 3,9 24,8 ± 9,7 28,0 ± 7,3 21,0 ± 7,9 21,3 ± 7,3 #106,8 ± 33,2
Oxazolona + H4H581 P
0,2 ± 0,2 1,6 ± 1,2 *6,0 ± 2,4 16,6 ± 5,1 18,2 ± 4,8 18,0 ± 5,5 60,6 ± 11,6
El análisis histológico mostró un aumento significativo en la hiperplasia de la epidermis y un infiltrado de células inmunitarias en los animales expuestos a la oxazolona (datos no mostrados). No se observaron diferencias significativas en ninguno de estos parámetros entre el anticuerpo anti-PAR2 H4H581 P y el control de isotipo.
Ejemplo 12. Comparación de las actividades inhibidoras del prurito del AcMc H4H581P
En este Ejemplo, se comparó la capacidad del AcMc H4H581P para atenuar los brotes de picor en un modelo de prurito de ratón con la de un AcMc de comparación anti-PAR-2 (el de comparación "1A1" se describe en el
25 documento WO 2009/005726.
Los ratones transgénicos que expresan el PAR-2 humano (hPAR2+/+) se dividieron en 3 grupos. El grupo A recibió 50 mg/kg (s.c.) de un AcMc de control de isotipo, el grupo B recibió 50 mg/kg (s.c.) del H4H581 P, y el grupo C recibió 50 mg/kg (s.c.) del anticuerpo de comparación anti-PAR-2. Veinticuatro horas después de la dosis del
30 anticuerpo, todos los grupos recibieron 150 μg de tripsina (s.c., interescapular), que produjo unos brotes de comportamiento de rascado durante 30 minutos. El porcentaje de cambio en el número de brotes de rascado observado para los ratones tratados en comparación con los ratones tratados con un control se muestra en la Tabla 29 (todos los datos están representados como la media ± EEM).
35 Tabla 31
Tratamiento con el anticuerpo (50 mg/kg)
(% de cambio en los brotes de rascado con respecto al control)
AcMc H4H581 P
-41,1 ± 13,5
AcMc de comparación
-13,9 ± 9,9
Según se muestra en este Ejemplo, el AcMc H4H581 P era sustancialmente más eficaz que el AcMc de comparación en la reducción de los comportamientos de prurito en el modelo de picor inducido por tripsina usado en
40 el presente documento.
La presente invención no debe estar limitada en su ámbito por las realizaciones específicas descritas en el presente documento. De hecho, para los expertos en la materia serán evidentes diversas modificaciones de la invención, además de las descritas en el presente documento, a partir de la anterior descripción y de las figuras anexas.
45 LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Regeneron Parmaceuticals, Inc. 50 <120> Anticuerpos humanos de alta afinidad contra el receptor activado por proteasa 2 humano
<130> 6110A-WO
<140> A asignar
<141> Presentado con la presente
5
<150> 61/240.783 <151> <150> 61/242.821 <151>
10
<150> 61/317.839 <151>
<160> 887
15 20
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 348 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
25
<400> 1
<210> 2
<211> 116 30 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 35
<400> 2
40 <210> 3
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 3
10
<210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Secuencia artificial
15
<220> <223> Sintética
<400> 4
20 25
<210> 5 <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
<210> 6
<211> 8
<212> PRT 35 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
40 <400> 6
<210> 7 45 <211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 50 <223> Sintética
<400> 7
55 <210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
60 <220>
<223> Sintética
<400> 8
5 <210> 9
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
10 <220>
<223> Sintética
<400> 9
<210> 10
<211> 112
<212> PRT 20 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
25 <400> 10
<210> 11 30 <211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 35 <223> Sintética
<400> 11
40 <210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 12
<210> 13
<211> 9 10 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 15
<400> 13
<210> 14 20 <211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Sintética
30 <210> 15
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
35 <220>
<223> Sintética
45
<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Sintética
50
<400> 16
55
<210> 17 <211> 348 <212> ADN <213> Secuencia artificial
60
<220> <223> Sintética <400> 17
<210> 18
<211> 116 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 18
15 <210> 19
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<400> 19
<210> 20
<211> 112
<212> PRT 30 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
35 <400> 20
<210> 21
<211> 348 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 21
15 <210> 22
<211> 116
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<400> 22
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25
<220>
<223> Sintética
<400> 139
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 140
<210> 141
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<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
15 <400> 141
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 25 <223> Sintética
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<223> Sintética
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<223> Sintética
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<223> Sintética
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<223> Sintética
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<220>
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<220>
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<220>
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20 <220>
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<400> 500
<210> 501
<211> 354
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 501
10
<210> 502
<211> 118
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Sintética
<400> 502
20
<210> 503
<211> 322 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 30
<400> 503 <212> ADN
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<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
5
<220>
<223> Sintética
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10
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<220>
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<212> ADN
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30
<220>
<223> Sintética
<400> 609
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<220>
<223> Sintética 45
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintética
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintética
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintética
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintética
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<212> ADN
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<220>
<223> Sintética
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<223> Sintética
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<211> 357
<212> ADN
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<220>
<223> Sintética
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<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintética
<400> 622
20 <210> 623
<211> 334
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25 <220>
<223> Sintética
<400> 623
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<211> 111
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
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<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Sintética
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20
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 30
<400> 746
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<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
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<220>
<223> Sintética
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<223> Sintética
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<212> ADN 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
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<220>
<223> Sintética 20
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<223> Sintética
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<223> Sintética
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<212> ADN
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> Sintética
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<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 775
<210> 776 15 <211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintética
<400> 776
25
<210> 777
<211> 336
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintética
<400> 777
35
<210> 778
<211> 112 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 45
<400> 778
<210> 779
<211> 33
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 779
<210> 780
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 780
<210> 781
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
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<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 782
<210> 783
<211> 24 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<210> 784 15 <211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintética
<400> 784
25
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<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintética
<400> 785
35
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<211> 119 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 45
<400> 786 <210> 787
<211> 333 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 787
15 <210> 788
<211> 111
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<400> 788
<210> 789
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 789
10
<210> 790
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15
<220>
<223> Sintética
<400> 790
20
<210> 791
<211> 334 25 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 30
<400> 791
<210> 792
<211> 111
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 792
<210> 793 10 <211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintética
<400> 793
20
<210> 794
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Sintética
<400> 794
30
<210> 795
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 796
<210> 797
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 798
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 798
<210> 799
<211> 36 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 799
<210> 800 15 <211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintética
<400> 800
25
<210> 801
<211> 321
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintética
<400> 801
35
<210> 802
<211> 107 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 45
<400> 802
<210> 803
<211> 18
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 804
<211> 6
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 804
<210> 805
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 806
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 806
<210> 807
<211> 27
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 808
<211> 9
<212> PRT 15 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
20 <400> 808
<210> 809 25 <211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 30 <223> Sintética
<400> 809 <210> 811
35
<210> 810
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
40
<220>
<223> Sintética
<400> 810
45
<211> 321 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 811
15 <210> 812
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<400> 812
<210> 813
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 813
10 <210> 814
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
15 <220>
<223> Sintética
<400> 814
<210> 815
<211> 322
<212> ADN 25 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
30 <400> 815
<210> 816
<211> 107
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 816
<210> 817 10 <211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintética
<400> 817
20
<210> 818
<211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Sintética
<400> 818
30
<210> 819
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 820
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 820
<210> 821
<211> 24
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 821
<210> 822
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 822
<210> 823
<211> 36 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 823
<210> 824 15 <211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintética
<400> 824
25
<210> 825
<211> 327
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintética
<400> 825
35
<210> 826
<211> 109 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 45
<400> 826
<210> 827
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 828
<211> 7
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 828
<210> 829
<211> 9
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<210> 830
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 830
<210> 831
<211> 27 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<210> 832 15 <211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Sintética
<400> 832
25
<210> 833
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
30
<220>
<223> Sintética
<400> 833
35
<210> 834
<211> 119 40 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 45
<400> 834 <210> 835
<211> 324 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 835
15 <210> 836
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
20 <220>
<223> Sintética
<400> 836
<210> 837
<211> 357
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 837
<210> 838 10 <211> 119
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> 15 <223> Sintética
<400> 838
20
<210> 839
<211> 325
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
25
<220>
<223> Sintética
<400> 839
30
<210> 840
<211> 108
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 840 <222> (8)...(8)
<210> 841
<211> 8
10
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
15
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Gly
20
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Phe
25
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Thr
30
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Phe
35
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Ser o Arg
40
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Ser o Arg
45
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Tyr
50
<220>
<221> VARIANTE
<223> Xaa = Gly, Ala o Thr
<400> 841
<210> 842
<211> 8
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ile
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Ser, Gly o Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Tyr, Gly o Asp
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asp, Gly o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gly o Arg
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Ile, Gly o Ala
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Asn, Ser, Arg o Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Lys, Ala o Thr
<400> 842
<210> 843
<211> 12
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220> <223> Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Ala o Val
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Gly o Glu
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Asp o Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Phe o Asp
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Trp o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Ser o Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Gly o Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Tyr o Asp
<220>
<221> VARIANTE
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = Phe o Leu
<220>
<221> VARIANTE
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = Asp o Ala
<220>
<221> VARIANTE
<222> (12)...(12)
<223> Xaa = Tyr
<400> 843 <210> 844
<211> 11
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Gln
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Ser o Gly
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Leu o Ile
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Val o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = His, Asn o Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (6)...(6)
<223> Xaa = Ser, Asn o Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Asp o ausente
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Gly o ausente
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Asn o ausente
<220>
<221> VARIANTE
<222> (10)...(10)
<223> Xaa = Thr o ausente
<220>
<221> VARIANTE
<222> (11)...(11)
<223> Xaa = Tyr o ausente
<400> 844 <210> 845
<211> 3
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Lys o Ala
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Ile, Ala o Thr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Ser
<400> 845
<210> 846
<211> 9
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<220>
<221> VARIANTE
<222> (1)...(1)
<223> Xaa = Met o Gln
<220>
<221> VARIANTE
<222> (2)...(2)
<223> Xaa = Gln
<220>
<221> VARIANTE
<222> (3)...(3)
<223> Xaa = Ala o Tyr
<220>
<221> VARIANTE
<222> (4)...(4)
<223> Xaa = Thr o Lys
<220>
<221> VARIANTE
<222> (5)...(5)
<223> Xaa = Gln, Ser o Ile
<220>
<221> VARIANTE <222> (6)...(6)
<223> Xaa = Phe o Ser
<220>
<221> VARIANTE
<222> (7)...(7)
<223> Xaa = Pro
<220>
<221> VARIANTE
<222> (8)...(8)
<223> Xaa = Thr o Leu
<220>
<221> VARIANTE
<222> (9)...(9)
<223> Xaa = Thr o ausente
<400> 846
<210> 847
<211> 330
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 847 <210> 848
<211> 327
<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
10 <400> 848 <210> 849
<211> 327 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 849 <210> 850
<211> 1194 5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 850 <210> 851
<211> 397 5 <212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética 10
<400> 851
<210> 852
<211> 18
<212> PRT
<213> Humano
<400> 852
<210> 853
<211> 14
<212> PRT
<213> Humano
<400> 853
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<211> 6
<212> PRT
<213> Humano
<400> 854
<210> 855
<211> 276
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 855
<210> 856
<211> 20
<212> PRT
<213> Ratón
<400> 856
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<212> PRT
<213> Mono
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20
<210> 858
<211> 16
<212> PRT
<213> Rata
25
<400> 858
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<212> PRT
<213> Conejo
<400> 859
5
<210> 860
<211> 18
<212> PRT
<213> Perro
10
<400> 860
15 <210> 861
<211> 18
<212> PRT
<213> Cerdo
20 <400> 861
<210> 862 25 <211> 18
<212> PRT
<213> Humano
<400> 862 30
<210> 863
<211> 18
<212> PRT
<213> Humano
<400> 863
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<211> 19
<212> PRT
<213> Humano
<400> 864
<210> 865
<211> 2772
<212> ADN
<213> Ratón
<400> 865
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<211> 399
<212> PRT
<213> Ratón
<400> 866
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<212> ADN
<213> Rata
<400>
867
<400>
868
5
<210> 868
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<212> PRT
<213> Rata
10
5
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<211> 22
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Sintética
<400> 869
<210> 870
<211> 23
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 870
<210> 871
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 871
<210> 872
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 872
<210> 873
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 873 <210> 874
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 874
<210> 875
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 875
<210> 876
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 876
<210> 877
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 877
<210> 878
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 878
<210> 879
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 879
<210> 880
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 880
<210> 881
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 881
<210> 882
<211> 24
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 882
<210> 883
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 883
<210> 884
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 884
<210> 885
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 885
<210> 886
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Sintética
<400> 886
5
<210> 887
<211> 20
<212> PRT
<213> Secuencia artificial
10
<220>
<223> Sintética
<400> 887
15

Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente al PAR-2 humano (SEQ ID NO: 851) y que interactúa con la Val-42 y el Asp-43 del PAR-2 humano, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que comprenden las secuencias de aminoácidos de las HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2-LCDR3 seleccionadas entre el grupo que consisten en: (a) las SEQ ID NOs: 100-102-104 / 108-110-112; y (b) las SEQ ID NOs: 700-702-704 / 708-710-712.
  2. 2.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno también interactúa con uno o más residuos seleccionados entre el grupo que consiste en la Ser-37, la Leu-38, la Ile-39, la Gly-40 y la Gly-44 del PAR-2 humano.
  3. 3.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1 o 2, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno no interactúa con la Lys-41 del PAR-2 humano.
  4. 4.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno interactúa con la Ser-37, la Leu-38, la Ile-39, la Gly-40, la Val-42 y el Asp-43 del PAR-2 humano, pero no interactúa con la Lys-41 del PAR-2 humano.
  5. 5.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno bloquea la escisión de la tripsina del PAR-2 humano en el sitio de escisión activador ubicado en la unión de los residuos de la Arg-36 y de la Ser-37 del PAR-2 humano.
  6. 6.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 5, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno no bloquea la escisión de la tripsina del PAR-2 humano en uno o más sitios de escisión no activadores seleccionados entre el sitio de escisión no activador ubicado en la unión de los residuos de la Arg-31 y de la Ser-32 del PAR-2 humano y el sitio de escisión no activador ubicado en la unión de los residuos de la Lys-34 y de la Gly-35 del PAR-2 humano.
  7. 7.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno se selecciona entre el grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 714 y una región variable de la cadena ligera (LCVR) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 692; y (b) un anticuerpo que comprende una HCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 98 y una LCVR que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 106.
  8. 8.
    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, y un portador o un diluyente farmacéuticamente aceptable.
  9. 9.
    El anticuerpo humano aislado o un fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7
    o la composición farmacéutica de la reivindicación 8 para su uso en un método para el tratamiento de un paciente, en el que el paciente muestra uno o más síntomas o indicios de una enfermedad o de un trastorno causado por la actividad del PAR-2, en el que la enfermedad o el trastorno causado por la actividad del PAR-2 es una enfermedad o un trastorno seleccionado entre el grupo que consiste en dolor, prurito, asma, artritis reumatoide, fibrosis, dermatitis atópica, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, pancreatitis, úlcera, enfermedad de Crohn, cáncer y enfermedad de Netherton.
  10. 10.
    El anticuerpo aislado, el fragmento de unión al antígeno o la composición de la reivindicación 9, para su uso según la reivindicación 9, en los que el método comprende adicionalmente la administración al paciente de al menos un componente terapéuticamente activo adicional seleccionado entre el grupo que consiste en un inhibidor de la IL1, un inhibidor de la IL-18, un inhibidor de la IL-4, un inhibidor del receptor de la IL-4, un inhibidor de la IL-6, un inhibidor del receptor de la IL-6, un inhibidor del factor de crecimiento nervioso (NGF), un inhibidor del factor de necrosis tumoral (TNF), un inhibidor del receptor del TNF, un inhibidor de la síntesis de ácido úrico y un corticosteroide.
  11. 11.
    Uso del anticuerpo aislado o del fragmento de unión al antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
    o de la composición farmacéutica de la reivindicación 8, en la preparación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente que muestra uno o más síntomas o indicios de una enfermedad o de un trastorno causado por la actividad del PAR-2, en el que la enfermedad o el trastorno causado por la actividad del PAR-2 es una enfermedad o un trastorno seleccionado entre el grupo que consiste en dolor, prurito, asma, artritis reumatoide, fibrosis, dermatitis atópica, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis ulcerosa, pancreatitis, úlcera, enfermedad de Crohn, cáncer y enfermedad de Netherton.
  12. 12.
    Una molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o para un fragmento de unión al antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, un vector de expresión recombinante portador de la
    molécula de ácido nucleico, o una célula hospedadora en la que se ha introducido el vector.
  13. 13.
    Un método para la producción de un anticuerpo o de un fragmento de unión al antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, método que comprende el cultivo de una célula hospedadora según la reivindicación 12 en unas condiciones que permitan la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.
    304 305
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