CN113234815B - lncRNA分子在GBM中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医学领域，提供了检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂在如下任一方面的应用：1)制备检测或辅助检测GBM的制剂；2)制备预测或辅助预测GBM复发的制剂；3)制备治疗或辅助治疗GBM的制剂；其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示。本发明通过成功筛选到与GBM，尤其是复发性GBM密切相关的lncRNA，从而为GBM、尤其是复发性GBM的诊断、治疗预后判断或靶向治疗，并对于GBM、尤其是复发性GBM的发展机理以及信号通路等研究具有很高的应用前景和理论价值。

Description

lncRNA分子在GBM中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，特别涉及lncRNA分子NONHSAT079852.2在GBM中的应用。

背景技术

脑胶质瘤是神经外科最常见疾病，按照肿瘤恶性程度可分为I～IV级，其中IV级胶质瘤称为多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)，可占所有原发性脑实体瘤的45～50％。胶质母细胞瘤呈浸润性增长，手术很难完全将肿瘤切除，且术后治疗较易出现耐药反应，很容易复发。目前，尚无治疗脑胶质母细胞瘤的理想药物，即使采用外科手术联合术后放化疗方案，患者平均中位生存时间只有15个月，90％的患者5年生存率不足10％。

长链非编码RNA(Long noncoding RNAs，lncRNAs)是非编码蛋白的转录本，长度超过200个核苷酸，并在生物学和病理过程中的表观遗传，转录和转录后水平上调节基因表达。大量证据表明，lncRNA在肿瘤发生和恶性进展中起关键作用。

近年来，许多研究发现lncRNA与神经胶质瘤的发生有关，并且与神经胶质瘤的细胞增殖和凋亡以及GBM患者的预后有关，其中一些lncRNA逐渐被视为潜在的治疗靶点。但是，当前大多数研究都是使用原发性GBM临床样品或细胞进行的，尚未充分探讨 lncRNA在复发性GBM中的生物学作用和功能。

发明内容

本发明通过对复发性GBM和原发性GBM标本进行了全转录组测序(RNA-sequencing， RNA-Seq，RNA-Seq)，并进行了生物信息学分析，以鉴定在GBM中发挥关键作用的 lncRNA。然后，通过一系列体外生物学分析对所选的lncRNA在GBM发病机理中的功能进行了验证。再通过一系列体外生物学实验对所选的lncRNA在GBM发病机理中的功能进行了验证，进而发现lncRNA NONHSAT079852.2和mRNA HSPA1A的异常表达与复发性GBM密切相关，从而获得了本发明。

本发明第一方面提供了一种检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂在如下任一方面的应用：

1)制备检测或辅助检测GBM的制剂；

2)制备预测或辅助预测GBM复发的制剂；

3)制备治疗或辅助治疗GBM的制剂；

其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示。

本发明第二方面提供了用于如下任一方面的制剂：

1)检测或辅助检测GBM；

2)预测或辅助预测GBM复发；

3)治疗或辅助治疗GBM；

其中，所述制剂包括检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂。

本发明第三方面提供了lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂在制备用于治疗或辅助治疗GBM的制剂中的应用。

本发明第四方面提供了另一种用于治疗或辅助治疗GBM的制剂，所述制剂中含有lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂。

本发明第五方面提供了lncRNA分子NONHSAT079852.2作为GBM治疗靶点的应用。

本发明通过成功筛选到与GBM、尤其是复发性GBM密切相关的lncRNA，从而为 GBM、尤其是复发性GBM的诊断、治疗预后判断或靶向治疗，并对于GBM、尤其是复发性GBM的的发展机理以及信号通路等研究具有很高的应用前景和理论价值。采用本发明提供的检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂可以为检测或者辅助检测GBM、尤其是复发性GBM提供了很好的手段，有利于GBM的诊断和治疗，并为GBM的预后评判和治疗靶点的选择提供了很好的基础。

附图说明

图1为本发明实施例1中DEmRNA的功能注释和通过qRT-PCR和IHC对筛选基因表达水平验证的相关图。其中，(A)DEmRNA的GO分类图；(B)DEmRNA的KEGG 功能富集图；(C)mRNAHSPA1A的KEGG功能分类图；(D)DEGS mRNA的PPI图，箭头指示DEGs mRNA，上调的基因以箭头(→)标示(三个)，其他的均为下调的基因； (E)与HSPA1A高度相关的47种DEmRNA的相关性分析；(F)通过qRT-PCR验证所选mRNA的差异表达；(G)GBM样品中HSPA1A表达的IHC图像；(H)GBM标本中 CPS1表达的IHC图像。

图2示出了本发明实施例1中LncRNA NONHSAT079852.2靶向mRNA HSPA1A，在复发性GBM中高度表达，主要位于细胞溶胶中的相关图。其中，(A)lncRNA、miRNA 和HSPA1A的ceRNA网络构建；lncRNA用圆圈表示，mRNA由箭头指示，miRNA用正方形表示；上调的基因用红色表示(图中箭头指示的基因)，而变化不明显的基因用蓝色表示(图中没有用箭头指示的基因)；(B)qRT-PCR和RNA-seq检测复发性GBM和原发性GBM中lncRNA表达水平对比；(C)FISH实验表明，LncRNA NONHSAT079852.2 主要分布在神经胶质瘤细胞的细胞质中。结果表示为平均值±标准差。*p<0.05，**p <0.01，NS，差异不明显。

图3为本发明实施例1中LncRNAs NONHSAT079852.2可以促进神经胶质瘤细胞的增殖，侵袭和迁移的相关图。其中，(A)转染48小时后，U251(A1)或GBM-W(A2) 细胞中HSPA1A的qRT-PCR分析；(B)转染48小时后，U251或GBM-W细胞中HSPA1A 的蛋白质印迹分析；(C)转染48小时后，U251或GBM-W细胞中HSPA1A的IHC分析； (D)通过CCK8测定转染48小时后U251(D1)或GBM-W(D2)细胞的生长曲线；(E) 通过集落形成测定法确定，转染两周后U251或GBM-W细胞的增殖(图中，Ctrl为对照)； (F)转染48小时后U251或GBM-W细胞的迁移和侵袭能力；(G)通过伤口愈合测定法检测，转染48小时后U251(G1)或GBM-W(G2)细胞的迁移。结果表示为平均值±标准差。*p<0.05，**p<0.01，NS，差异不明显。

图4为本发明实施例1中LncRNA NONHSAT079852.2可以调节神经胶质瘤细胞的细胞周期和凋亡的相关图。其中，(A)转染48小时后U251或GBM-W细胞的细胞周期的流式细胞术分析结果；(B)转染48小时后U251或GBM-W细胞凋亡率的流式细胞仪分析。结果表示为平均值±SD。*p<0.05，**p<0.01，NS，差异不明显。

图5为本发明实施例1中LncRNAs NONHSAT079852.2作为has-mir-10401-3p的ceRNA，以促进HSPA1A表达的相关图。其中，(A)分别靶向HSPA1A和lncRNA NONHSAT079852.2的miRNA；(B)HSPA1A-1ncRNA NONHSAT079852.2的共同靶向 miRNA；LncRNA用圆圈表示，miRNA用菱形表示，mRNA用箭头表示，表达上调的基因用箭头标示，其余为没有明显变化的基因；(C)lncRNA NONHSAT079852.2报告质粒和候选miRNA共转染的U251和GBM-W细胞中的荧光素酶相对活性；(D)野生型lncRNA NONHSAT079852.2载体，突变型载体或空载体转染的神经胶质瘤细胞中的荧光素酶相对活性。(E)mir-10401-3p和lncRNA NONHSAT079852.2结合序列及lncRNA NONHSAT079852.2突变序列(突变部位用下划线标示)。

图6为本发明实施例1中lncRNAs NONHSAT079852.2表达水平与GBM患者预后的关系相关图。其中，(A)qRT-PCR分析GBM组织中lncRNA MSTRG224498.5的表达水平；(B)高表达lncRNA NONHSAT079852.2与GBM患者预后不良有关。结果表示为平均值军事±标准差。**p<0.01。

图7为本发明实施例2中，样本21中lncRNA分子NONHSAT079852.2的表达量与对照样本23的结果对比图。

具体实施方式

为使本发明的技术方案、目的和优点更加清楚，下面通过具体的实施例子对本发明做进一步的详细描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明第一方面提供了检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂在如下任一方面的应用：

1)制备检测或辅助检测GBM的制剂；

2)制备预测或辅助预测GBM复发的制剂；

3)制备治疗或辅助治疗GBM的制剂。

其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示(序列1示出了NONHSAT079852.2的cDNA序列)。

其中，所述GBM可以为复发性GBM。

根据本发明的第一方面，所述检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂可以包括选自如下中的任意一种：

1)特异性扩增NONHSAT079852.2的引物；

2)特异性识别NONHSAT079852.2的探针；

3)特异性识别NONHSAT079852.2的基因芯片。

其中，所述特异性扩增NONHSAT079852.2的引物为：

F：5′-TGCGCCTTACGTAATTT-3′(序列表中的序列3)；

R：5′-ATGACGCCTACTCACTCACC-3′(序列表中的序列4)。

所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列组成可以为与序列表中序列1所示的NONHSAT079852.2的核苷酸序列互补的片段，长度不小于15nt，优选长度为20-28nt。

本发明第二方面提供了一种用于如下任一方面的制剂：

1)检测或辅助检测GBM；

2)预测或辅助预测GBM复发；

3)治疗或辅助治疗GBM；

其中，所述制剂包括检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂。

根据本发明的第二方面，所述检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂包括选自如下中的任意一种：

1)特异性扩增NONHSAT079852.2的引物；

2)特异性识别NONHSAT079852.2的探针；

3)特异性识别NONHSAT079852.2的基因芯片；

优选地，所述特异性扩增NONHSAT079852.2的引物为：

F：5′-CACGTGCGCCTTACGTAATTT-3′，即序列表中的序列3；

R：5′-ATGACGCCTACTCACTCACC-3′，即序列表中的序列4。

其中，所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列组成为与序列表中序列1所示的NONHSAT079852.2的核苷酸序列互补的片段，长度不小于15nt，优选为20-28nt。

优选地，所述制剂中还包括检测样本中HSPA1A含量的试剂。

其中，所述HSPA1A为70kDa热休克蛋白1A(Heat Shock 70kDa Protein 1A)的编码mRNA，其序列组成如序列表中的序列2所示(序列2示出了HSPA1A的cDNA序列)。

所述检测样本中HSPA1A含量的试剂，可以为采用任何本领域中检测HSPA1A含量的方法中所包含的试剂，例如采用qRT-PCR的方式中所采用的试剂，本发明对此没有任何限制。

本发明第三方面提供了lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂在制备用于治疗或辅助治疗GBM的制剂中的应用。

其中，所述NONHSAT079852.2的抑制剂包括可以敲低NONHSAT079852.2表达的shRNA或siRNA，其靶点序列组成可以为如下中的任何一个：

1)RNAi-652：5′-AGGGTTGCATGTTTGGCCCTT-3′(序列表中的序列5)；

2)RNAi-1319：5′-GACCATGTGTACTCAATGTTT-3′(序列表中的序列6)；

3)RNAi-1078：5′-GCCCTTGTAAGATGAAACAAG-3′(序列表中的序列7)。

其中，所述GBM可以为复发性GBM。

本发明第四方面提供了另一种用于治疗或辅助治疗GBM的制剂，所述制剂中含有lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂。

本发明第五方面提供了lncRNA分子NONHSAT079852.2作为GBM治疗靶点的应用。

下面以具体的实施例子为例对本发明进行详细说明。

下述实施例中所使用的各种试剂、材料等，若无特别说明，均为可以从商业渠道获得的产品；下述实施例中所使用的各种测试、检测方法若无特别说明，均为本领域中的常规测试、检测方法，均可以从教科书、工具书或学术期刊中获得。

实施例1

本实施例用来说明本发明提供的用于检测复发性GBM的制剂的获得过程和方法。

样品准备：

三例原发性GBM(两名女性和一名男性，样品编号：04、05和06)和三例复发性 GBM(两名女性和一名男性，样品编号：01、02和03)共六份新鲜肿瘤标本取自空军医科大学唐都医院神经外科。所有患者术前未接受过治疗。使用苏木精和伊红(H&E)染色对切除的标本进行组织学检查。患者和/或其家庭成员了解本研究的过程，并且每个患者都签署了知情同意书。这项研究已得到唐都医院医学伦理委员会的批准 (TDLL-2017-172)。

RNA提取，文库构建和RNA-Seq：

使用TRIzol试剂提取总RNA，操作步骤严格按照说明书，然后使用NanoDrop ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies，威尔明顿，美国)测量RNA的浓度和纯度。根据mRNA-Seq样品制备试剂盒(Illumina，San Diego，USA)的步骤，使用去除rRNA 的总RNA构建cDNA文库。产生的文库在Illumina Hiseq2500平台(Illumina San Diego CA， USA)上测序。共生成了超过2亿个配对末端数据。本发明获得了三个生物学重复，以最大程度地减少实验错误和假阳性的数量。

差异表达分析(Differential Expression Analysis，DEA)：

使用R软件DEG seq分析两组差异表达基因(Differentially Expressed Gene，DEG)，将差异倍数(Fold Change,FC)≥2且错误发现率(False Discovery Rate，FDR)<0.05作为筛选DEG的标准。依据DEGs结果，使用R软件中ggplot绘制火山图(Volcano Plot,VP)，pheatmap绘制DEGs聚类图。

基因功能分析：

使用R语言版本3.4.4群集分析器对差异表达的mRNA(DEmRNAs)进行本体论分析(Gene Ontology，GO)、京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes，KEGG)功能注释。以P<0.05作为阈值。

蛋白互作网络(Protein－Protein Interaction，PPI)分析：

依据DEG结果与STRING数据库收录的蛋白互作关系，构建DEGs的PPI，使用Cytoscape(3.7.2版本)将PPI可视化。

lncRNA靶基因分析：

对于已知gene symbol的lncRNA，通过软件数据库(starBase, http://starbase.sysu.edu.cn/index.php；ChIPBase,http://rna.sysu.edu.cn/chipbase/；andnonecode, http://www.noncode.org/)利用gene symbol搜索其靶基因相关信息；新发现的lncRNA靶基因分为顺式(cis)和反式(trans)两种调控模式，cis调控作用lncRNA与附近mRNA 的表达一致，其失活会影响周围及附近同一位点基因的表达，通过Perl脚本将lncRNA邻近基因(上下游100kb范围内)定义为lncRNA的顺式靶基因，tans调控作用lncRNA与其靶基因的位置没有关系，而与靶基因表达量存在正相关或负相关，通过Pearson相关系数法对样本间lncRNA与mRNA的相关性进行分析，以相关性绝对值>0.9且P<0.01的基因定义为lncRNA的反式靶基因。

miRNA靶基因预测：

根据测序所得miRNA与人基因序列信息，使用miRanda (http://www.mirbase.orgmiRBase)和targetscan(http://www.targetscan.org/)进行miRNA靶基因预测及调控网络可能结合的位点。

NONHSAT079852.2调控网络分析：

将lncRNA-miRNA，miRNA-mRNA放入同一个excel中，然后导入cytoscape构建内源竞争RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)网络，其中lncRNA用圆形表示，miRNA 用菱形表示，mRNA用箭头表示，上调用红色表示，下调用绿色表示。

苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，H&E)：

取新鲜GBM肿瘤组织，使用生理盐水清洗其表面血迹；4％多聚甲醛固定24h；包埋蜡块，制作石蜡切片；将石蜡切片脱蜡、水化，使用苏木精染色7min；流水冲洗3min× 3次，盐酸酒精分化切片，流水终止分化，氨水反蓝；流水冲洗，使用伊红染色3min；流水清洗3min×3次；脱水，二甲苯透明10min；使用中性树胶封切片，晾干后，显微镜下观察。

细胞系和试剂：

人U251(STR分析鉴定证书)细胞系购自武汉普诺赛生命科技有限公司。GBM-W 是从临床GBM标本中提取的原代GBM细胞系，并通过STR分析确定，该样本由唐都医院提供。细胞培养基为10％胎牛血清和1％青霉素的DMEM(武汉普诺赛生命技术有限公司)。用于敲低lncRNA NONHSAT079852.2表达的shRNA质粒购自上海吉凯基因有限公司。

细胞转染：

复苏胶质瘤细胞，待细胞生长状态良好时，以5×10⁵个细胞铺于6孔板的每个孔，细胞生长至80％左右时开始转染。使用250μL Opti-MEM将1.0μg质粒DNA(上海吉凯生物技术公司提供)稀释并轻轻吹吸混匀；使用250μL Opti-MEM将8.0μL LipofectamineTM2000稀释并轻轻吹吸混匀，室温下静置5min；将稀释后的质粒与 LipofectamineTM2000混匀，室温下静置20min；将转染复合物加入6孔板，每孔500uL；转染6h后，更换新鲜培养基。

qRT-PCR：

提取肿瘤组织或细胞RNA，将RNA反转录成cDNA，采用qRT-PCR两步法进行定量检测，试剂盒购自宝生物工程大连有限公司。引物设计：将要定量的基因片段在NCBI 中blast并选择特异性区域；使用primer5在特异序列设计引物；将设计好的引物再次放入NCBI进行blast以预测引物扩增的特异性；合成引物序列(上海生工生物工程有限公司)。反应体系20μL:SYBR Premix Ex Taq 10μL，PCR Forward Primer(10μM)1μL，PCR Reverse Primer(10μM)1μL,cDNA模板1μL，ddH₂O 7μL。反应条件为：第一阶段，预变性94℃30s，1cycle；第二阶段PCR反应94℃5s，60℃30s，40cycles；第三阶段，溶解曲线分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

NONHSAT079852.2的荧光原位杂交(RNA FISH)：

根据制造商的说明，使用RNA荧光原位杂交试剂盒(Shanghai GenePharma Co.，Ltd.) 确定NONHSAT079852.2的亚细胞位置。GBM-W细胞用PBS洗涤并在4％多聚甲醛中固定15分钟。使用生物素标记的探针与CY3荧光染料偶联，并将细胞在37℃孵育37分钟。 37℃杂交16小时，洗涤玻片，并用DAPI将细胞核染色15分钟。通过共焦显微镜检查图像，原始放大倍率为1200倍(Leica TCS SP5；Leica Microsystems GmbH，韦茨拉尔，德国)。探针序列在补充表S2中列出。

CCK8检测细胞增殖：

细胞接种于96孔板，分别在转染前、转染后24h、48h、72h，使用CCK8检测细胞增殖情况，每个样品6个复孔。

Transwell：

提前将基质胶从-20℃拿出放入4℃冰箱融化，基质胶与基础培养基按照1：4配置，每个上小室加入50μL；3h后，在上室加入50μL含1％血清的培养基水化基底膜，加入含 1×10⁵个细胞的细胞悬液100μL；在下室加入400μL含10％血清的培养基；24h后，弃去培养基，擦掉上室内内基质胶，4％多聚甲醛固定；PBS清洗后，0.2％结晶紫染色。

Western blot：

配置实验所需液体；制备蛋白，测定蛋白浓度；准备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)；将样品按顺序加入凝胶系统，开始电泳；采用300mA横流模式下转膜120min；使用5％脱脂奶粉封闭非特异性抗体2h，按照抗体浓度要求4℃条件下孵育一抗过夜；使用TBST将多余一抗洗净，室温下孵育二抗2h；使用TBST清洗多余的二抗，将聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenefluoride,PVDF)浸泡于TBST液体中，开始显影。

划痕实验：

6孔板中的细胞被转染24h后，使用200μL枪头划痕，PBS清洗，采集0h图像；细胞生长24h、48h后再次采集图像。

流式细胞仪分析细胞周期和凋亡：

细胞转染48小时后，从流管中收集细胞，并通过流式细胞仪检测细胞周期 (BD-Pharmingen Annexin V PE)和凋亡(BD Pharmingen^TM7-AAD)(BD Biosciences，美国)。

萤光素酶报告基因检测：

使用miRanda数据库预测NONHSAT079852.2和hsa-miR-10401-3p的结合位点，构建包含结合位点的野生型NONHSAT079852.2-WT和含有结合位点突变的NONHSAT079852.2-MUT荧光素酶质粒。萤光素酶质粒NONHSAT079852.2-WT和 NONHSAT079852.2-MUT与hsa-miR-10401-3p(序列组成为 ACCUCGCCGUCCCGCCCGCCG)模拟物共转染到U251和GBM-W细胞中。48小时后，通过Promega GloMax 20/20Luminescence Detector(USA)使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega E1910)检测神经胶质瘤细胞的荧光素酶活性。

统计学分析：

使用SPSS20.0软件进行统计分析，使用Peason相关性分析做分子表达量之间的相关性，采用散点图做分子表达量线性分析，采用Kaplan-Meier curves对GBM患者预后进行分析。RT-qPCR、CCK8检测数值采用(±s)表示，每个实验结果至少重复3次，组间比较采用独立样本t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结果如下：

筛选复发性GBM与原发性GBM的DEG

通过比较3例复发性GBM和3例原发性GBM的RNA-seq数据，共鉴定出1025个 DEG，其中lncRNA 718个(上调378个，下调340个)，mRNA 293个(上调204个，下调89个)，11个是circRNA(全部上调)，三个是miRNA(2个上调，1个下调)。

HSPA1A具有重要的生物学功能，在复发性GBM中上调

GO富集分析显示DEmRNA功能主要为：抗氧化活性，受体调节活性，趋化活性和形态发生子活性(图1A)。DEmRNA在许多KEGG信号通路中显著富集，包括肿瘤信号通路，免疫应答以及细胞因子和受体功能(图1B)。HSPA1A作为复发性GBM中上调最高的DEmRNA(是原发性GBM的9倍)，是Hsp70蛋白家族(Hsp70-1)的成员，主要与抗原呈递和MAPK信号通路调控有关(图1C)。PPI分析结果表明，氨基甲酰基磷酸合酶1(CPS1)和Hsp家族成员13(DNAJB3；Happ40家族的陪伴分子和成员)是与HSPA1A 相互作用的蛋白(图1D)。HSPA1A和其他蛋白质之间发现了显着的相关关系，包括CPS1 (r＝0.996，P＝0.002)，CCL18(r＝0.927，P＝0.008)，CCL8(r＝0.993，P<0.001)和 CCL5(r＝0.919，P＝0.010)(图1E)。此外，通过qRT-PCR确定的HSPA1A表达水平与通过RNA-seq获得的表达水平一致(图1F)。IHC显示，复发性GBM中HSPA1A和CPS1 的表达水平显着高于原发性GBM(图1G、1H)。因此，选择HSPA1A作为筛选关键lncRNA的靶mRNA。

NONHSAT079852.2靶向mRNA HSPA1A，并在复发性GBM中高表达。

根据lncRNA、miRNA靶基因分析结果，以mRNA HSPA1A为靶基因的差异lncRNA 有54个，其中16个lncRNA与HSPA1A具有ceRNA网络竞争关系，以mRNAmRNA HSPA1A为靶基因的miRNA有37个，与mRNA HSPA1A形成ceRNA网络竞争关系的 16个，lncRNA靶向miRNA有3761个，16个lncRNA、HSPA1A及它们靶向的miRNA 形成ceRNA网络竞争关系(图2A)。通过qRT-PCR验证了16个lncRNA的差异表达水平，其中，3个lncRNA(MSTRG.224498.5，MSTRG.65777.2和MSTRG.150858.14)结果与RNA-seq一致(图2B)。lncRNA MSTRG224498.5也称为lncRNANONHSAT079852.2，属于基因间lncRNA。它位于20号染色体上，长度为1657bp。Lnclocator显示lncRNA NONHSAT079852.2位于细胞质(0.113725065505)，细胞核(0.0499335493761)，核糖体 (0.338593997721)，胞质溶胶(0.449439437366)和外泌体(0.0483079500317)(16)中。 FISH实验表明，NONHSAT079852.2的亚细胞位置是胞质溶胶(图2C)。因此，我们选择了NONHSAT079852.2作为后续分析的关键lcnRNA。

NONHSAT079852.2可以促进神经胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

当使用shRNA敲低lncRNA NONHSAT079852.2时，HSPA1A的mRNA和蛋白表达水平降低(图3A1、A2、B、C)。CCK-8分析(图3D1、3D2)，集落形成分析(图3E)，细胞迁移和侵袭分析(图3F)和伤口愈合分析(图3G)显示细胞增殖、侵袭和迁移受到抑制。

NONHSAT079852.2可以调节神经胶质瘤细胞的周期和凋亡

当用shRNA敲除NONHSAT079852.2时，流式细胞仪检测显示G1/G0期的神经胶质瘤细胞数量增加，而G2/S期的神经胶质瘤细胞数量减少(图4A)。另外，神经胶质瘤癌细胞的凋亡率增加(图4B)。

NONHSAT079852.2充当has-mir-10401-3p的ceRNA来促进HSPA1A表达

ceRNA网络分析表明，共同靶向lncRNA NONHSAT079852.2和HSPA1A的miRNA 有5个，其中两个是已知的miRNA(图5A、5B)。RegRNA2.0数据库 (http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw/)显示NONHSAT079852.2可以与miR_571(novel)，hsa-miR-7110-5p，miR_299(novel)，miR_956(novel)和hsa-miR-10401-3p(通过互补碱基配对)。因此，推测NONHSAT079852.2通过充当这些miRNA的ceRNA来调节神经胶质瘤细胞的功能。通过免疫荧光报告试验进一步证实了胶体瘤细胞中 NONHSAT079852.2对两种已知miRNA(hsa-miR-7110-5p和hsa-miR-10401-3p)的结合能力，结果表明，与has-mir-10401-3p和NONHSAT079852.2共转染的神经胶质瘤细胞中荧光素酶活性降低，而在含hsa-miR-7110-5p的细胞中荧光素酶活性并未降低。 hsa-miR-10401-3p被用作候选miRNA(图5C)。我们构建了荧光报告酶质粒 NONHSAT079852.2-WT和NONHSAT079852.2-MUT，它们包含has-mir-10401-3p结合位点。has-mir-10401-3p的上调显著降低了与NONHSAT079852.2-WT共转染的神经胶质瘤细胞中的萤光素酶活性，当将细胞与NONHSAT079852.2-MUT共转染时，has-mir-10401-3p 的上调对荧光素酶活性没有影响。这些结果表明，NONHSAT079852.2直接与 has-mir-10401-3p结合(图5D)。使用MiRanda和TargetsCAN预测了miRNA靶基因和调控网络的可能结合位点，结果显示，lncRNA NONHSAT079852.2和mRNA HSPA1A共同靶向了has-mir-10401-3p的结合位点(图5E)。

NONHSAT079852.2高表达与GBM患者的预后不良相关

使用qRT-PCR对44例GBM患者肿瘤组织lncRNA NONHSAT079852.2表达水平进行检测，以表达水平中位数为界限将患者分为高表达组和低表达组(图6A)，使用 Kaplan-Meiercurves对GBM患者预后进行分析(图6B)，高表达lncRNA NONHSAT079852.2GBM患者预后不良。

本发明为了探索lncRNA在复发性GBM中的作用，使用RNA-Seq检测了复发性GBM 中的差异表达RNA。在进行了lncRNA-mRNA-miRNA ceRNA网络分析后，我们选择了NONHSAT079852.2，其在复发性GBM中上调并且与GBM患者的预后不良相关。通过全面的生物信息学分析和体外功能测定，发现NONHSAT079852.2充当has-mir-10401-3p的海绵体来调节HSPA1A表达，从而促进神经胶质瘤细胞的增殖，迁移和侵袭。因此，它可能与GBM的发展和复发有关。

通过DEG鉴定和基因功能富集分析，发现目标mRNA是肿瘤发生的重要影响因素。通过mRNA-lncRNA网络分析，选择了在复发性GBM中起关键作用的lncRNA。使用这种策略，选择了HSPA1A作为目标mRNA。主要的压力诱导蛋白HSPA1A是热休克蛋白 70(Hsp70)家族的高度保守蛋白，在蛋白折叠、信号转导和对压力因子的一般反应中起重要作用。有力的证据表明，HSPA1A在各种肿瘤(例如肺癌，胃癌和GBM)中过表达，并促进肿瘤增殖，转移和耐药性。Hsp70表达水平增加与肿瘤发展和进展之间的相关性促使科学家将Hsp70视为癌症治疗的靶标。最近，已经发现用磁性纳米颗粒靶向神经胶质瘤细胞中的Hsp70可增加纳米颗粒在肿瘤细胞内的保留。在本发明中，我们发现HSPA1A 与CPS1和DNAJB13相互作用，并且其表达与CPS1、CCL18、CCL8和CCL5的表达水平高度相关。CPS1是尿素循环中的关键酶，在不同类型的癌症中高表达，并促进细胞增殖和转移。DNAJB13、HSP40亚家族成员之一，与HSPA1A负相关。Hsp40是HSP70的辅助因子，并参与各种生物学过程。DNAJB1-Hsp70复合物是潜在的有价值的肿瘤治疗靶标。趋化因子、CCL8和CCL5参与肿瘤细胞的增殖和转移。基于以上描述，选择HSPA1A 作为目标基因，用于鉴定与GBM复发相关的lncRNA。

本发明是第一次对NONHSAT079852.2在复发性GBM中的作用研究。GBM临床标本用于RNA序列分析。这些标本的异质性很强，这为探索GBM复发和耐药性提供了可靠的基础。本发明通过建立GBM原代细胞系，该系保留了肿瘤细胞的异质性，从而确保了研究结果的可靠性。

总之，本发明表明，NONHSAT079852.2可以提高胶质瘤细胞的复发率，并促进其增殖、侵袭和迁移，这些特征与GBM患者的预后不良有关。NONHSAT079852.2的促肿瘤作用可能与它与hsa-mir-10401-3p的竞争性结合，并且调了HSPA1A的表达有关。因此，NONHSAT079852.2/has-mir-10401-3p-HSPA1A轴可能是促进GBM复发的潜在机制之一，并且是控制和治疗GBM的潜在治疗靶标。

实施例2

本实施例用来说明lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂在复发性GBM 预测中的应用。

取两例未知类型的GBM新鲜肿瘤标本(来自空军医科大学唐都医院神经外科，命名为样本21和样本22)，和一例已知为原发性GBM的新鲜肿瘤标本(样本23)，使用TRIzol 试剂按照说明书提取总RNA，将RNA反转录成cDNA，并以cDNA为模板，分别采用 qRT-PCR两步法进行NONHSAT079852.2表达水平定量检测，每个样本都做三组重复。

qRT-PCR反应体系如下(20μL)：

SYBR Premix Ex Taq 10μL，PCR正向引物(Forward Primer)(10μM)1μL，PCR反向引物(Reverse Primer)(10μM)1μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 7μL。

其中，PCR Forward Primer的序列组成为序列表中的序列3所示，PCR ReversePrimer 的序列组成为序列表中的序列4所示。

qRT-PCR反应条件如下：

第一阶段，预变性94℃30s，1个循环；第二阶段PCR反应94℃5s，60℃30s，40 个循环；第三阶段，溶解曲线分析95℃15s，60℃1min，95℃15s。

结果发现，与对照样本23相比，样本21中lncRNA分子NONHSAT079852.2的表达量远远高于对照样本23(结果如图7所示，样本21大约是对照样本23的5倍)，与临床结果对比发现，样本21确实来自复发性GBM患者。

与对照样本23相比，样本22中lncRNA分子NONHSAT079852.2的表达量与对照样本23并无显著差别(未图示)，与临床结果对比发现，样本22确实来自复发性GBM患者。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北大学

<120> lncRNA分子NONHSAT079852.2在GBM中的应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1657

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

gcggcggccg cgcctctcca acgccccgca cccgcccccc tcagaagcac gtgcgcctta 60

cgtaatttcc tgttattctt cggtttgcct cctcccagtg gcgtggattt gctcccgacc 120

cgcttttggg gcgtgcctgc ttcctcctct ctgttaggtg agtgagtagg cgtcattctt 180

cacagtagtc ctctgcctcc accgccccgg gatctccttg cgctcggtcc tctacgtgga 240

gtcacctatg cagaggaatt ccacggggcg ggggcgagga cagggtgcgg gggtctttat 300

ggcagacaat ccccggctga gcgcttggcc agagtttctg tgatgctaga atctggactg 360

cctgcgacct ctccgggact cggacaccag ccctcgcctc ctggtgatct tttaggtcct 420

gcagagaagt gaagaggtat tggacgtggc caggatgagc cccagagagg cgaagccact 480

tgagctcgtg agtgacagtc agatgtcaag ccctgctctt tctaaagcgt gctgccttca 540

gaaaagaaga gccagaagga tggaaattac ttcagaaaga tgaataccag ctttgaagga 600

ataaaagctg acgaggaatt gaaggagttg aggcacgagc ttgaacaggg ttgcatgttt 660

ggcccttgat tgtaaatgcc cattgctgca cctgttcctg ttacttgggg agttgcagca 720

gaaggaacag cggcctggga ctccagagaa ctgggttccc tctcatccct ccagggccac 780

cacttcttgt gggcccttgg gcaagtcact gtactttctg agtctcagtt tccccatttg 840

cagaatggaa ataactaccc cggtctacca acttagaaga attgctttga ggatctgata 900

aggtggtgtg gatgatgctg ccttgggggc tttacagtct ggagctcaag ggacccctta 960

agttgggctt acttagtaac tccaggggtg ggcagaacag gactccaatg agggtttttt 1020

tctttttccc ttttttttct tttcctatct cttaactttt atctttatta ttttacaatg 1080

cccttgtaag atgaaacaag tgatgctgaa atatcttttt cttttttaac ctttatttta 1140

gaattggggt acatgtgcag gtttgttaca taggtacagt gtgggctgct gaggtttggg 1200

agtacgaatg aattagtcac cccagtggtg agcatagtgc ccgataagtg gttttttcaa 1260

cccttactcc catccctctc cattcttgtg ttccccagtg tctgctgttc ccatttttat 1320

gaccatgtgt actcaatgtt tagctcccac ttagaagtaa gaacatgccc agcactttgg 1380

gaggccgagg tgggtggatc atgaggtcaa gagatcgaga ccatcttggc taacaaagtg 1440

aaaccctgtc tctactaaaa acataaaaaa ttggccgggt gtggtggtgg gcacctgtag 1500

tcctagctac tcgggaggct gagacaggag aatcgcctga accggggagg tggaggttgc 1560

agtgagctga gattgtacca ctgcactcca gcctgggtga cagagtgaga ctccatctca 1620

aaaaaataaa aataaaaaaa taaaaagaat gtggtgt 1657

<210> 2

<211> 2400

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

aacggctagc ctgaggagct gctgcgacag tccactacct ttttcgagag tgactcccgt 60

tgtcccaagg cttcccagag cgaacctgtg cggctgcagg caccggcgcg tcgagtttcc 120

ggcgtccgga aggaccgagc tcttctcgcg gatccagtgt tccgtttcca gcccccaatc 180

tcagagcgga gccgacagag agcagggaac cggcatggcc aaagccgcgg cgatcggcat 240

cgacctgggc accacctact cctgcgtggg ggtgttccaa cacggcaagg tggagatcat 300

cgccaacgac cagggcaacc gcaccacccc cagctacgtg gccttcacgg acaccgagcg 360

gctcatcggg gatgcggcca agaaccaggt ggcgctgaac ccgcagaaca ccgtgtttga 420

cgcgaagcgg ctgattggcc gcaagttcgg cgacccggtg gtgcagtcgg acatgaagca 480

ctggcctttc caggtgatca acgacggaga caagcccaag gtgcaggtga gctacaaggg 540

ggagaccaag gcattctacc ccgaggagat ctcgtccatg gtgctgacca agatgaagga 600

gatcgccgag gcgtacctgg gctacccggt gaccaacgcg gtgatcaccg tgccggccta 660

cttcaacgac tcgcagcgcc aggccaccaa ggatgcgggt gtgatcgcgg ggctcaacgt 720

gctgcggatc atcaacgagc ccacggccgc cgccatcgcc tacggcctgg acagaacggg 780

caagggggag cgcaacgtgc tcatctttga cctgggcggg ggcaccttcg acgtgtccat 840

cctgacgatc gacgacggca tcttcgaggt gaaggccacg gccggggaca cccacctggg 900

tggggaggac tttgacaaca ggctggtgaa ccacttcgtg gaggagttca agagaaaaca 960

caagaaggac atcagccaga acaagcgagc cgtgaggcgg ctgcgcaccg cctgcgagag 1020

ggccaagagg accctgtcgt ccagcaccca ggccagcctg gagatcgact ccctgtttga 1080

gggcatcgac ttctacacgt ccatcaccag ggcgaggttc gaggagctgt gctccgacct 1140

gttccgaagc accctggagc ccgtggagaa ggctctgcgc gacgccaagc tggacaaggc 1200

ccagattcac gacctggtcc tggtcggggg ctccacccgc atccccaagg tgcagaagct 1260

gctgcaggac ttcttcaacg ggcgcgacct gaacaagagc atcaaccccg acgaggctgt 1320

ggcctacggg gcggcggtgc aggcggccat cctgatgggg gacaagtccg agaacgtgca 1380

ggacctgctg ctgctggacg tggctcccct gtcgctgggg ctggagacgg ccggaggcgt 1440

gatgactgcc ctgatcaagc gcaactccac catccccacc aagcagacgc agatcttcac 1500

cacctactcc gacaaccaac ccggggtgct gatccaggtg tacgagggcg agagggccat 1560

gacgaaagac aacaatctgt tggggcgctt cgagctgagc ggcatccctc cggcccccag 1620

gggcgtgccc cagatcgagg tgaccttcga catcgatgcc aacggcatcc tgaacgtcac 1680

ggccacggac aagagcaccg gcaaggccaa caagatcacc atcaccaacg acaagggccg 1740

cctgagcaag gaggagatcg agcgcatggt gcaggaggcg gagaagtaca aagcggagga 1800

cgaggtgcag cgcgagaggg tgtcagccaa gaacgccctg gagtcctacg ccttcaacat 1860

gaagagcgcc gtggaggatg aggggctcaa gggcaagatc agcgaggcgg acaagaagaa 1920

ggtgctggac aagtgtcaag aggtcatctc gtggctggac gccaacacct tggccgagaa 1980

ggacgagttt gagcacaaga ggaaggagct ggagcaggtg tgtaacccca tcatcagcgg 2040

actgtaccag ggtgccggtg gtcccgggcc tgggggcttc ggggctcagg gtcccaaggg 2100

agggtctggg tcaggcccca ccattgagga ggtagattag gggcctttcc aagattgctg 2160

tttttgtttt ggagcttcaa gactttgcat ttcctagtat ttctgtttgt cagttctcaa 2220

tttcctgtgt ttgcaatgtt gaaatttttt ggtgaagtac tgaacttgct ttttttccgg 2280

tttctacatg cagagatgaa tttatactgc catcttacga ctatttcttc tttttaatac 2340

acttaactca ggccattttt taagttggtt acttcaaagt aaataaactt taaaattcaa 2400

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacgtgcgcc ttacgtaatt t 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgacgccta ctcactcacc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agggttgcat gtttggccct t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaccatgtgt actcaatgtt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcccttgtaa gatgaaacaa g 21

Claims (12)

1.检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂在如下任一方面的应用：

1)制备检测或辅助检测GBM的制剂；

2)制备预测或辅助预测GBM复发的制剂；

其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示；

所述检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂包括选自如下中的任意一种：

1)特异性扩增NONHSAT079852.2的引物；

2)特异性识别NONHSAT079852.2的探针；

3)特异性识别NONHSAT079852.2的基因芯片。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述特异性扩增NONHSAT079852.2的引物为：

F：5′-CACGTGCGCCTTACGTAATTT-3′，即序列表中的序列3；

R：5′-ATGACGCCTACTCACTCACC-3′，即序列表中的序列4。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列组成为与序列表中序列1所示的NONHSAT079852.2的核苷酸序列互补的片段，长度不小于15nt。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列长度为20-28nt。

5.一种用于如下任一方面的制剂：

1)检测或辅助检测GBM；

2)预测或辅助预测GBM复发；

其中，所述制剂包括检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂；

所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示；

所述检测样本中lncRNA分子NONHSAT079852.2表达水平的试剂包括选自如下中的任意一种：

1)特异性扩增NONHSAT079852.2的引物；

2)特异性识别NONHSAT079852.2的探针；

3)特异性识别NONHSAT079852.2的基因芯片。

6.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于：

所述制剂中还包括检测样本中HSPA1A含量的试剂；

所述HSPA1A为70kDa热休克蛋白1A的编码mRNA，其序列组成如序列表中的序列2所示。

7.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于：

所述特异性扩增NONHSAT079852.2的引物为：

F：5′-CACGTGCGCCTTACGTAATTT-3′，即序列表中的序列3；

R：5′-ATGACGCCTACTCACTCACC-3′，即序列表中的序列4。

8.根据权利要求5所述的制剂，其特征在于：

所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列组成为与序列表中序列1所示的NONHSAT079852.2的核苷酸序列互补的片段，长度不小于15nt。

9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于：

所述特异性识别NONHSAT079852.2的探针的序列长度为20-28nt。

10.lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂在制备用于治疗或辅助治疗GBM的制剂中的应用；

其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：

所述NONHSAT079852.2的抑制剂包括敲低NONHSAT079852.2表达的shRNA或siRNA，其靶点序列组成为如下中的任何一个：

1)RNAi-652：5′-AGGGTTGCATGTTTGGCCCTT-3′；

2)RNAi-1319：5′-GACCATGTGTACTCAATGTTT-3′；

3)RNAi-1078：5′-GCCCTTGTAAGATGAAACAAG-3′。

12.一种用于治疗或辅助治疗GBM的制剂，所述制剂中含有lncRNA分子NONHSAT079852.2的抑制剂；

其中，所述lncRNA分子NONHSAT079852.2的核苷酸序列组成如序列表中的序列1所示；

所述NONHSAT079852.2的抑制剂包括敲低NONHSAT079852.2表达的shRNA或siRNA，其靶点序列组成为如下中的任何一个：

1)RNAi-652：5′-AGGGTTGCATGTTTGGCCCTT-3′；

2)RNAi-1319：5′-GACCATGTGTACTCAATGTTT-3′；

3)RNAi-1078：5′-GCCCTTGTAAGATGAAACAAG-3′。

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