KR20010101760A - Ｃ-ｍｙｃ의 안티센스 표적화에 의한 재협착 치료 방법 - Google Patents

Ｃ-ｍｙｃ의 안티센스 표적화에 의한 재협착 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 경동맥 확장술 다음에 재협착의 위험 또는 심각성을 감소시키는 개선된 방법을 제공한다. 방법은 비하전 인-함유 골격 연결 및 사람의 c-myc mRNA 의 개시 코돈을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 표적 혈관 영역에 투여하는것을 포함한다. 또한 새로운 안티센스 화합물 및 조성물, 및 안티센스 송달의 효험 및 표적 혈관 영역에의 흡수 분석 방법이 개시된다.

Description

Ｃ-ＭＹＣ의 안티센스 표적화에 의한 재협착 치료 방법{METHODS OF TREATING RESTENOSIS BY ANTISENSE TARGETING OF C-MYC}
경혈관 관상동맥 확장술은 폐쇄성 관상동맥 질환에 대한 비외과적 치료로서1970 년대 말에 도입되었다. 이 도입 이후로, 장비 및 기술면에서 주요한 진전이 관상동맥 질환 및 협심증 치료 방법에의 광범위한 사용을 유도했다. 전형적으로, 과정은 폐색 위치에 풍선-팁 카테테르를 위치시키는 것, 및 카테테르 풍선을 팽창시킴으로서 폐색성 혈관을 파괴하고 확장하는 것을 포함한다.
장비 및 기술면에서의 개선에도 불구하고, 30 내지 50 % 의 환자에서 발생하는 재협착은 확장술에서 혈관 개방 유지의 제한 인자로 남아있어서, 중요한 이환 및 의료보험비를 설명가능하게 한다(Casterella). 확장술-후 재협착은 절편적으로 혈관벽의 외상에 대한 절편적으로 제한된 상처 치료 반응이다. 동물 모델 및 인간 부검 플라크 조직으로 한 연구는 (a) 내피 및 내피하 구조의 파괴, (b) 내부 탄성층의 파괴를 가지는 내과 부위의 외상, (c) 콜라겐 또는 조직 인자와 같은 혈전형성인자의 해리, (d) 원형-종양유전자(c-fos,c-myc,c-myb)의 연이은 발현으로 평활근 세포의 신장, (e) 혈액, 내피 세포 및 SMC 의 세포로부터 성장 인자의 해리, 및 (f) SMC 트롬빈 수용체의 자동촉매 활성으로 트롬빈의 생산에 의해 촉매되는 이벤트의 케스케이드-유사 과정을 나타낸다 (Bauriedel).
염증 기간의 오버랩으로, 과립화는 확장술 후 3 일 째 시작된다. 플라스민뿐만 아니라 콜라게나제와 같은 프로테인아제는 세포외 매트릭스 구조의 분해에 의해 플라크 형성 조절을 유발하고, 혈관내막 및 중막내의 세포소기관-풍부 SMC 표현형을 유발한다. 과립화 기간과 오버랩으로, 세포외 매트릭스의 서로 다른 성분의 유발은 아마도 TGF-베타(매트릭스 형성의 페이즈)에 의해 매개되어, 확장술 후 1-2 주 후에 발생한다. 평활근 세포는 테나신, 피브로넥틴, 콜라겐 및 프로테오글리칸과 같은 매트릭스 단백질을 생산 및 분비하고, 이에 의해 신(neo)내막 플라크 부피의 눈에 띄는 증가를 유발한다(Bauriedel).
다양한 재혈관화 장치, 항혈소판약, 항혈전제, 및 항-염증제를 사용하는 재협착 예방의 임상 시도는 재협착 발생빈도에서 제한된 향상을 일으켰다. 또한, 혈관 손상 위치에 정맥내 스텐트(Savage,Eisenhower, Rubarteli,Gottman), 방사선 치료법 (Koh), 및 항-증식성 약제에 의해 재협착의 위험 또는 심각성을 개선하려는 시도가 보고되었다. 후자의 접근법은 전형적으로 혈관 폐색 위치에 치료제를 도입 (Dick,Roy, Dev, Kimura, Alfke, Robinson 1997 a, Robinson 1997 b, Barath, Herdeg, Pavlides, Oberhoff, Hodgkin, Hong,Consigny, Meyer, Fernadez-Ortiz, Lambert, and Wilensky),또는 스텐트로부터 약제 해리를 위해(Teomin, Bartonelli, Raman, Gibson) 풍선 카테테르를 사용한다.
이러한 진보에도 불구하고, 재협착 발생빈도, 및 치료에 대한 반응을 예견하는 것의 어려움은 혈관 확장술에서 심각한 위한 인자로 남는다. 그러므로, (i) 혈관 확장술 다음의 재협착의 발생빈도 및 심각성 감소에 효험을 나타내는 치료 방법을 제공하고 ,(ii) 부작용이 거의 없이 환자에게 내용되고, (iii) 다양한 치료적 송달 방법으로 수행될 수 있는 것이 바람직하다.
방법을 수행하는 개선된 치료적 화합물 및 조성물을 제공하는 것이 바람직할 것이고, 혈관 표적 부위에 치료적 화합물 송달의 효험을 모니터하는 간편하고 빠른 임상 분석법을 제공하는 것이 또한 바람직할 것이다.
발명의 개요
한 양태에서, 본 발명은 원단부 팽창성 풍선을 가지는 카테테르를 사용하여 관상동맥 확장술로 치료되거나, 관상동맥 바이패스 수술에서 형성된 혈관 접합부의 환자의 관상동맥 혈관 영역에서 재협착의 위험을 감소시키는 방법을 포함한다. 방법은 (i) c-myc mRNA 의 번역 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 개의 뉴클레오티드, 및 (ii) 환자에서 재협착의 위험 또는 심각성을 감소시키는 유효량으로 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 혈관 또는 손상 부위에 직접 국부 투여함으로서 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
투여는 (a) 안티센스 화합물을 포함하는 저장소를 혈관 영역과 접촉시키는 단계, 및 이온도입법 또는 일렉트로포레이션에 의해 저장소로부터 혈관에 화합물을 도입하는 방식; (b) 카테테르 풍선의 표면상에 포함된, 혈관의 중간막을 침투할 수 있는 주입기를 통해 압력하에서 카테테르로부터 혈관 영역에 직접적으로 화합물을 주입하는 방식; (c) 트랩된 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 미세입자를 혈관 영역에 주입하거나 위치시키는 방식; (d) 혈관의 영역을 카테테르 풍선의 표면상에 포함되고, 확산가능한 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 히드로겔 코팅과 접촉시키는 방식; 또는 (e) 혈관 영역을 확산가능한 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 외표면층을 가지는 스텐트와 접촉시키는 방식에 의해 수행된다.
안티센스 화합물은 바람직하게는 도 2aa-2ee 에서 제시된 구조로 구성되는 군으로부터 선택된 서브유닛간 연결을 가지고, 도 2b-b 에서 제시된 포스포로디아미데이트 연결에 의해 구체적으로 예증되며, 이때 X=NH2, Y=O,그리고 Z=O 이다. 표본적인 서열은 SEQ ID NO:1 으로 확인된 것이다.
투여 방식 (a) 에 사용을 위해서, 안티센스 화합물은 바람직하게는 카테테르내의 2 개의 팽창된 풍선사이의 부피에 포함되고, 부피는 화합물을 혈관의 부위에 이온도입적으로 송달하기에 유효한 펄스 전기장에 놓여진다.
투여 방식 (b) 에 사용을 위해서, 카테테르 풍선은 바람직하게는 원단부-팁 저장소와 연통할 수 있는 다수의 외부-접촉 채널을 가지고, 각각의 채널은 하나 이상의 주입구 또는 핑거를 가지고, 주입 단계는 풍선이 팽창된 위치에 있을 때 주입구를 통해 저장소로부터 안티센스 화합물 용액 또는 현탁액을 밀어넣는 것을 포함한다.
투여 방식 (c) 에 사용을 위해서, 카테테르는 바람직하게는 원단부 저장소를 가지고, 미세입자는 저장소에 입자 현탁액으로 포함되고, 주입 단계는 혈관 영역에 접촉하는 카테테르 표면을 통해 카테테르로부터 현탁액을 밀어넣는 것을 포함한다. 표본적인 입자는 초음파 에너지에 놓일 때 트랩된 화합물을 해리시키도록 설계된, 트랩된 안티센스 화합물 또는 미세버블을 가지는 생물학적으로 분해가능한 폴리머 입자 또는 리포좀을 포함한다.
투여 방식 (d) 에 사용을 위해서, 히드로겔 코팅은 바람직하게는 풍선 확장술 다음에 5-60 분의 기간에 걸쳐 코팅내의 대다수의 안티센스 화합물을 해리하도록 설계된다.
투여 방식 (e) 에 사용을 위해서, 스텐트는 생물학적 분해가능하고 바람직하게는 풍선 확장술 다음에 5-60 분의 기간에 걸쳐 코팅내의 대다수의 안티센스 화합물이 해리되도록 설계된다.
관련 양태에서, 본 발명은 원단부 팽창성 풍선을 가지는 카테테르를 사용하여 관상동맥 확장술로 치료된 환자의 관상동맥 혈관 영역에서 재협착의 위험을 감소시키는 방법을 포함한다. 방법은 손상 위치에 직접적 투여에 의해서 (i) SEQ ID NO:1 으로 확인된 염기 서열, 및 (ii) 도 2b-b 에서 보여진 포스포로디아미데이트골격(X=NH2, Y=O, 이고 Z=O )을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 환자에 투여하는 것을 포함한다. 안티센스 화합물은 예를 들어, 5' 말단에서 수성 배지에서 화합물의 용해도를 향상시키는 부분, 및/또는 생리적 pH 에서 화합물에 전하를 부여하는 부분을 갖도록 유도체로 되어 있을 수 있다. 화합물은 바람직하게는 풍선 확장술 다음 즉시, 또는 관상동맥 바이패스 수술동안, 약 0.5 내지 2 mg 사이의 양으로 표적 영역에 투여된 최종 화합물의 양을 얻기 위해 약 1-30 mg 사이의 양으로 표적 혈관 영역에 화합물의 직접적 적용에 의해 송달된다.
다른 양태에서, 본 발명은 (i) 사람의 c-myc mRNA 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 핵산 서열을 포함하는 8 내지 40 개의 뉴클레오티드 및 (ii) 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 포함한다. 서브유닛간 연결은 바람직하게는 도 2a-a-2e-e 에 제시된 구조로 구성되는 군으로부터 선택되고, 도 2b-b 에서 제시된 포스포로디아미데이트 연결에의해 구체적으로 예증되며, 이때 X=NH2, Y=O, 및 Z=O 이다. 예증된 서열은 SEQ ID NO:1 으로 확인된 서열에 의해 나타난다. 안티센스 화합물은 예를 들어, 5' 말단에서 수성 배지에서 화합물의 용해도를 향상시키는 부분, 및/또는 생리적 pH 에서 화합물에 전하를 부여하는 부분을 갖도록 유도체로 되어 있을 수 있다. 화합물은 리포좀 또는 다른 미세 입자 운반체에 포함될 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 재협착의 위험을 감소시키기 위한 안티센스 화합물을 사용하는 치료 방법으로 안티센스 화합물이 혈관 세포에서 c-myc mRNA 에 도달하고 상호작용하는 능력 분석 방법을 포함한다. 방법은 (a) 실질적으로 비하전 골격 및 사람의 c-myc mRNA 의 개시 코돈을 포함하는 서열을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 환자에게 투여하는 단계, (b) 화합물이 투여된 후 선택된 시간에서 대상으로부터 체액 샘플을 취하는 단계, 및 (c) 샘플에서 안티센스 화합물 및 표적 RNA 영역으로 구성되는 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명의 이러한 목적 및 특징은 하기의 발명의 상세한 설명을 수록한 도면과 결합하여 읽을 때 더욱 완전하게 분명해질 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1 은 폴리머 형성에 적합한 5-원자(A), 6-원자(B) 및 7-원자(C-E) 연결기를 가지는 몇개의 바람직한 서브유닛을 보여준다.
도 2a-a 내지 2e-e 는 도 1 의 서브유닛 A-E 를 각각 사용하여 제조된, a-a내지 e-e 로 지정된 표본적인 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 반복 서브유닛 절편을 보여준다.
도 3 은 P450 안티센스 PMO 투여된 래트의 플라즈마내의 PMO 단량체의 소멸 및 RNA:PMO 헤테로다이머의 생성의 속도표이다.
본 발명은 재협착 치료를 위한 조성물 및 방법, 구체적으로는 c-myc 에 특이적인 안티센스 조성물, 및 경피적 경혈관 관상동맥 확장술(PTCA)과 같은 경혈관 확장술에서 재협착의 위험을 감소시키는 조성물 투여 방법에 관한 것이다.
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정의
본원에 사용될 때, 하기의 용어는 다르게 나타내지 않는 한, 하기의 의미를 가진다.
"안티센스"는 안티센스 올리고머가 와슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화하도록 허용하여 표적 서열내에서 전형적으로 mRNA 와 RNA : 올리고머 헤테로듀플렉스를 형성하는 뉴클레오티드 염기 서열 및 서브유닛-대-서브유닛 골격을 가지는 올리고머를 말한다. 올리고머는 표적 서열에 정확한 서열 상동성 또는 근사한 상동성을 가질 수 있다. 안티센스 올리고머는 mRNA 의 번역을 차단 또는 저해할 수 있고/또는 mRNA 의 스플라이스 변이체를 생산하도록 mRNA 의 프로세싱을 변형할 수 있다. 본 발명을 증명하기 위해 수행된 연구는 예를 들어, SEQ ID NO:1 으로 제시된 안티센스 화합물은 c-myc mRNA 프로세싱을 방해하여 정상 개시 코돈 및 인접 영역이 mRNA 로부터 스플라이싱된 절단된 mRNA 를 유발한다는 것을 보여준다.
본원에 사용될 때, 용어 "화합물,", "약제", "올리고머" 및 "올리고뉴클레오티드"는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관하여 상호교환적으로 사용될수 있다. 본원에 사용될 때, "모르폴리노 올리고머"는 전형적 폴리뉴클레오티드에 수소결합할 수 있는 염기를 지지하는 골격을 가지는 폴리머 분자를 말하고, 여기에서 폴리머는 5 탄당 골격 부분, 더욱 구체적으로는 뉴클레오티드 및 뉴클레오사이드에 전형적인 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 리보스 골격이 부족하지만, 대신에 환 질소에 의한 결합을 가지는 환 질소를 포함한다. 바람직한 "모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 도 2b-b 에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, 여기에서, (i) 구조는 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 결합하면서 1 내지 3 원자 길이의 인-함유 결합으로 함께 연결되고, (ii) Pi및 Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티디에서 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 형성 부분이다. 본 발명에 사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 대표적인 구조는 도 2a-a 내지 2e-e 에서 보여진 연결과 함께 도 1 a-e 에서 보여진 모르폴리노 서브유닛을 포함한다.
본원에 사용될 때, "뉴클레아제-내성" 올리고머 분자(올리고머)는 그것의 골격은 포스포디에스테르 결합의 뉴클레아제 절단에 쉽게 놓이지 않는 것이다.
본원에 사용될 때, 올리고머가 37℃ 보다 상당히 높은 Tm 으로, 바람직하게는 적어도 50 ℃, 및 전형적으로 60 ℃-80 ℃ 또는 그 이상의 생리적 상태하에서 표적에 혼성화한다면, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 올리고머는 표적 폴리뉴클레오티드에 "특이적으로 혼성화"한다. 이러한 혼성화는 바람직하게는 규정된 이온 강도 및 pH 에서 특이적 서열에 대한 융점(T[m])보다 약 10 ℃, 및 바람직하게는 약 50 ℃ 낮게 선택된 엄격한 혼성화 조건에 해당한다. 허여된 이온 강도 및 pH 에서, T[m] 은 50 % 의 표적 서열이 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화하는 온도이다.
폴리뉴클레오티드는 혼성화가 2 개의 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 사이의 역평행 구조에서 발생할 때 서로 "상보적인" 것으로 나타난다. 혼성화가 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 제 2 의 폴리뉴클레오티드의 하나의 가닥 사이에서 발생한다면, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 서로 폴리뉴클레오티드에 "상보적" 일 수 있다. 상보성(하나의 폴리뉴클레오티드가 서로 상보적인 정도)은 일반적으로 허용되는 염기-쌍 형성 규칙에 따라, 서로 수소결합을 형성하는 것으로 기대되는 반대 가닥의 염기 비율의 관점에서 정량화될 수 있다.
본 원에서 사용될 때, "c-myc 안티센스 화합물" 은 c-myc 핵산 서열, 예를 들어, 정상 AUG 개시 위치를 포함하는 서열에 상보적 또는 거의-상보적으로 높은 친화성(즉, "특이적으로 혼성화" )을 가지는 뉴클레아제-내성 안티센스 모르폴리노화합물을 말한다.
본원에 사용될 때, 올리고머에 관한 "유사체"는 기준 올리고머의 그것과 유사한 구조 및 화학적 성질 모두를 포함하는 물질을 의미한다.
본원에 사용될 때, 안티센스 올리고머에 관한 "유효량"은 풍선 확장술 다음의 재협착의 위험(발생비율) 또는 심각성(폐색양) 감소에 효과적인, 1 회 투여량 또는 일련의 투여량의 일부로서 포유동물 대상에 투여된 안티센스 올리고머의 양을 말한다.
본원에 사용될 때, "체액" 은 소변, 타액, 플라즈마, 혈액, 척수액, 및 생물학적원의 다른 액체 샘플을 포함하는 대상으로부터 얻은 다양한 샘플 형태를 포함하고, 그안에 현탁된 세포 또는 세포 단편, 또는 액체 배지 및 그것의 융출액을 포함한다.
II.화합물 및 조성물
A.c-myc 안티센스 화합물
c-myc 는 세포 성장 및 분화를 조절하는 원형-종양유전자이며, 혈관 재형성, 평활근 세포 증식 및 세포외 매트릭스 합성 조절 과정 뿐만 아니라 아포토시스에서의 역할에 관련된다. c-myc 의 이상 발현이 종종 사람의 암에서도 발견된다. c-myc 의 이상, 구성적 또는 과발현은 폐암, 결장암, 유방암, 방광암, 백혈병, 폐암등을 포함하는 많은 사람의 암과 관련되었다.
몇 개의 시험관내 연구는 평활근 세포 증식에 관련된 유전자에 대해 표적화된 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오티드가 증식 및 이주 모두를 저해한다는 것을 증명했다. 한 연구에서, 돼지의 관상동맥 모델(Shi)에서 다공성 풍선 카테테르를 사용하여 c-myc 에 대해 표적화된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 생체내 투여, 및 다른 연구에서 c-myc, c-myc, cdc2 키나제, cdk2 키나제 및 증식 세포 핵 항원(PCNA)에 대해 루멘내로 송달되고 표적화된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 래트의 경동맥 및 돼지의 관상동맥 모델(Lee)에서 모두 풍선 손상 후에 신내막 형성을 저해했다.
그러나, 유사한 연구에서 다공성 풍선 카테테르를 사용하여 세포 주기 조절단백질에 대해 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 단일 루멘내 트랜스카테테르 송달은 신내막 형성 또는 혈관 크기에 형향을 미치지 않았다 (Robinson). c-myb 및 c-myc 에 대해 특이적인 포스포로티오에이트를 사용한 더 이상의 연구 결과는 평활근 세포 증식의 저해를 나타냈다. 그러나, 관찰된 저해는 분명히 안티센스 메카니즘에 의해서는 아니었지만, 시험관내 평활근 세포의 제 1 의 배양물 및 생체외 동맥내 올리고뉴클레오티드 서열의 4 개의 인접한 구아노신 잔기의 존재와 관련된다 (Burgess).
본 발명에 따라서, (i) c-myc mRNA 의 번역 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 개의 뉴클레오티드 및 (ii) 재협착의 발생비율 및 심각성의 중요한 감소를 일으키는 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 발견했다. 본 발명을 증명하기 위해 수행된 시험관 내 및 동물-모델 연구는 안티센스 화합물이 (i) 안티센스 화합물에 노출된 혈관 루멘에서 세포에 의해 효과적으로 흡수되고, (ii) 세포내적으로 작용하여 올바른 프로세싱(mRNA 스플라이싱) 및 프로세싱된 c-myc mRNA 의 번역을 방해하고, (iii) 예를 들어, 포스포로티오에이트 c-myc 안티센스 화합물과 같은 다른 형태의 c-myc 안티센스 화합물보다 재협착의 발생비율 및 심각성 감소에 더욱 더 효과적임을 나타낸다.
모르폴리노 올리고머의 합성, 구조, 및 결합 특징은 상기 언급된 U.S. 특허번호 5,698,685, 5,217,866, 5,142,047, 5,034,506, 5,166,315, 5,521,063, 및 5,506,337 에 상세하게 개시되고, 모든 문헌은 본 명세서에 참고문헌으로 수록된다. 본 발명의 안티센스 올리고머(화합물)는 상기 언급된 특허에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛으로 구성되고, 여기에서 (i) 모르폴리노기는 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 인접 서브유닛의 5' 환외 탄소에 연결하면서 1 내지 3 원자의 길이로 비하전 인-함유 연결로 함께 연결되고, (ii) 모르폴리노기에 부착된 염기는 염기-특이적 수소 결합으로 폴리뉴클레오티드의 염기에 결합하기에 효과적인 퓨린-피리미딘 염기-쌍 형성 부분이다. 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 형성 부분은 전형적으로 아데닌, 시토신, 구아닌, 우라실 또는 티민이다. 이러한 올리고머의 제조는 U.S. 특허번호 5,185,444(Summerton and Weller,1993)에 상세하게 개시되고, 그것의 전체가 참고문헌으로 본원에 수록된다. 참고문헌에서 보여진대로, 몇 개 형태의 비이온 결합이 모르폴리노 골격 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대한 대표적인 골격 구조는 도 1a-e 에서 보여진 β-모르폴리노 서브유닛 형태를 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 하나 이상의 연결형태를 포함할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
도 1 의 서브유닛 A 는 도 2 의 a-a 에서 제시된 5-원자 반복 단위 골격을 형성하는 1-원자 인-함유 연결을 포함하고, 여기에서 모르폴리노 환은 1-원자 포스포아미드 연결로 연결된다.
도 1 의 서브유닛 B 는 도 2 의 b-b 에서 제시된 6-원자 반복-단위 골격으로 설계된다. 구조 B 에서 , 인산기와 5' 모르폴리노 탄소를 연결하는 원자 Y 는 황, 질소, 탄소 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 인으로부터 돌출된 X 부분은 플루오르; 알킬 또는 치환 알킬; 알콕시 또는 치환 알콕시; 티오알콕시 또는 치환 티오알콕시; 또는, 환형 구조를 포함하는 비치환, 단일치환, 또는 이중치환 질소의 어느 것일 수 있다.
도 1 의 구조 C-E 는 도 2 의 c-c 내지 e-e 에 제시된 7-원자 단위-길이 골격으로 설계된다. 구조 C 에서 , X 부분은 구조 B 에서와 같고, 부분 Y 는 메틸렌, 황, 또는 바람직하게는 산소일 수 있다. 구조 D 에서, X 및 Y 부분은 구조 B 에서와 같다. 구조 E 에서, X 는 구조 B 에서와 같고, Y 는 O, S, 또는 NR 이다. 도 1 a- e 에서 제시된 모든 서브유닛에서, Z 는 O 또는 S 이고, Pi또는 Pj는 아데닌, 시토신, 구아닌 또는 우라실이다.
바람직한 "모르폴리노" 올리고뉴클레오티드는 도 2 b-b 에서 보여진 형태의 모르폴리노 서브유닛 구조로 구성되고, 여기에서 (i) 구조는 인접한 서브유닛의 5'환외 탄소에 하나의 서브유닛의 모르폴리노 질소를 연결하는 1 내지 3 원자 길이의 포스포로디아미데이트-함유 결합으로 함께 연결되고, (ii) Pi및 Pj는 염기-특이적 수소 결합에 의해 폴리뉴클레오티드의 염기와의 결합에 효과적인 퓨린 또는 피리미딘 염기-쌍 형성 부분이고, X=NH2 ,Y=O, 및 Z=O 이다.
상기에 언급된 대로, 화합물은 c-myc mRNA 의 개시코돈을 포함하는 서열을 가지므로 AUG mRNA 개시 부위 및 인접한 5' 및 3' 염기를 포함하는 c-myc RNA 의 영역에 상보적인 서열을 포함하는 것을 의미한다. 특정화된 화합물에 대한 mRNA 의 영역은 또한 본원에서 표적 서열이라 한다. 안티센스가 결합하는 c-myc mRNA 는 예비프로세싱(예비스플라이싱)된 mRNA 일 수 있고, 이 경우에 안티센스 화합물은 올바른 스플라이싱을 방해하도록 작용할 수 있어서 번역된 단백질의 절단된 형태를 유발하거나, 프로세싱된 mRNA 에 결합할 수 있어서 번역의 저해를 유발한다.
화합물은 37℃ 보다 상당히 높은 Tm , 적어도 50 ℃, 및 바람직하게는 60 ℃-80 ℃ 로, 생리적 상태하에서 c-myc mRNA 에 혼성화하도록 유전적으로 설계된다. 화합물이 반드시 표적 서열에 상보적일 필요는 없지만, 표적 서열에 안정적이고 특이적으로 결합하여 표적 서열의 발현이 조절되는 것이 바람직하다. 양호한 특이성으로 결합되는 안정하고, 효과적인 결합을 허용하는 올리고머의 적당한 길이는 약 8 내지 40 개의 뉴클레오티드 염기 단위이고, 바람직하게는 약 12-25 염기 단위이다. 미스매치가 존재한다면, 가운데보다 하이브리드 듀플렉스의 말단부위에 대해 덜 불안정하다. 표적 염기와 축중 염기쌍 형성을 허용하는 올리고머가 또한 기대되고, 표적과 염기쌍 형성 특이성이 유지됨을 나타낸다. 화합물은 바람직하게는 AUG 위치에 상보적인 내부 3-염기 트리플렛, 및 개시 위치에 대한 하나 이상의 5' 및 3' 염기에 상보적인 염기를 포함한다. 하나의 바람직한 화합물 서열은 SEQ ID NO:1 으로 확인된 20 mer 이고 염기 서열: 5'-ACG TTG AGG GGC ATC GTC GC-3' 를 가지고 여기에서 서열의 CAT 트리플렛은 AUG 개시 부위에 결합하고, CAT 서열에 대한 3' 의 6 개의 염기는 표적의 업스트림(5') 방향으로 확장되고, CAT 서열에 대한 5' 의 11 개의 염기는 표적의 다운스트림으로 확장된다. 이 화합물은 자가-어닐 영역을 가지지 않는다는 점에서 용해도를 개선했다. 안티센스 화합물의 용해도, 및 화합물의 용액내 저장상의 침전에 대한 내성 능력은 올리고머를 친수성 올리고머와 같은 용해도 부분, 또는 하전 아미노산 또는 유기산과 같은 하전 부분을 갖도록 유도체를 형성함으로 더 향상될 수 있다. 부분은 잘 알려진 유도체 형성 방법에 의해서 예를 들어, 5'-말단에 안티센스 화합물 화학적으로 부착될 수 있다. 하나의 바람직한 부분은 트리에틸글리콜과 같은 한정된 길이 올리고 에틸렌 글리콜 부분으로, 트리에틸렌글리콜과 카르바메이트 결합을 형성하는 피페라진 결합기에 의해 카르보네이트 결합을 통해 안티센스 화합물의 5' 말단에 공유결합되고, 여기에서 제 2 의 피페라진 질소는 안티센스의 5' 말단 포스포로디아미데이트 연결에 결합된다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 화합물은 바람직하게는 화합물 말단 근처에 포스포로디에스테르 연결과 같은 소수의 하전된 골격 결합을 포함하도록 설계될 수 있다. 첨가된 부분은 바람직하게는 수성 배지에서 화합물의 용해도를 적어도 약 30 mg/ml , 바람직하게는 적어도 50 mg/ml 로 향상시키는 것이 효과적이다.
구체적인 c-myc 안티센스 서열의 효험은 공지된 스크리닝 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 올리고머는 표적 RNA 를 발현하는 세포 배양물과 함께 인큐베이션되고, 헤테로듀플렉스의 존재 또는 부재는 하기에 제시된 것과 같은 기법에 의해, 또는 ELISA 또는 웨스턴 블럿과 같은 표준 기법으로 결정될 때 암호화, 전-길이 단백질의 존재 또는 부재를 모니터하여 결정된다.
다른 구체예에서, 안티센스 화합물은 재협착 치료에 사용하기 위한 입자 조성물 부분을 형성한다. 하나의 이러한 입자는 트랩된 안티센스 화합물을 포함하는 생분해성 입자, 예를 들어, 폴리락테이트 또는 폴리글리콜산 입자이다. 입자는 바람직하게는 1-5 마이크로 범위이고, 하기에 개시된 대로, 혈관벽에 대한 풍선으로부터의 압력에 의해서 혈관 벽에 압력이 가해지도록 하거나, 스텐트와 같은 입자담체로부터 해리되도록 함으로서 확장술 혈관 위치에 직접적 입자 송달에 의한 송달에 유용한다.
대안적으로, 입자는 트랩된 형태로 화합물을 포함하는 미세버블일 수 있다. 안티센스 담체로서 적당한 미세버블의 제조는 예를 들어, 상기에 언급된 Porter 등에 의해 개시된다. 입자는 혈관 부위가 초음파 에너지에 노출될 때 입자로부터 해리된 화합물과 함께 혈관벽을 입자의 현탁액과 직접적으로 접촉시킴으로서 혈관위치에 직접적으로 송달 될 수 있다.
또 다른 구체예에서, 입자는 트랩된 안티센스 화합물을 포함하는 리포좀이다. 리포좀 입자가 혈관 위치에 직접 적용되기 때문에, 리포좀은 장기간 순환시간을 얻기위해 필요한 표면의 변형이 없는 종래의 리포좀일 수 있다.
III.재협착의 치료 방법
재협착은 스텐트 삽입이 있거나 없는 관상동맥 혈관확장술과 같은 혈관 치료 다음에 혈관 루멘이 다시축소되는 것을 말한다. 임상학적으로 과정 다음에 초기의 루멘 직경의 50 % 이상의 손실로 정의된다. 재협착은 혈관확장술에 의해 치료되는 외상의 약 30 % 내지 60 % 및 과정 다음의 3 내지 6 월 내에 스텐트로 치료된 외상의 약 20 % 에서 발생하는 것으로 여겨진다.
재협착은 또한 관상동맥 바이패스 수술 다음에 발생할 수 있고, 여기에서 심장 외과의사는 막힌 동맥 주위의 혈관을 재루트, 또는 "바이패스" 하도록 하고 심장에 혈액 및 산소의 공급을 향상시킨다. 이러한 경우에, 협착증은 조직이식된 혈관 단편, 구체적으로는 대체된 혈관의 접합부에서 발생할 수 있다.
본 발명은 구체적으로는 풍선확장술 후, 또는 관상동맥 바이패스 수술 다음과 같은 다른 혈관 외상에 반응하여 위험(발생빈도) 또는 심각성(협착증의 정도)을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 방법은 손상된 혈관 위치에 화합물의 직접적 국부 투여에 의해서 재협착의 위험 및/또는 심각성을 감소시키기 위해 환자에게 상기-개시된 안티센스 화합물 또는 조성물의 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 실질적으로 완전한 조직 흡수를 고려하면, 혈관 위치에 송달된 화합물의 양은 약 0.5-2 mg 안티센스 화합물이 바람직하다. 그러므로, 혈관 조직에 흡수되는 경우는 송달된 양의 10 % 이고, 송달된 양은 바람직하게는 5 내지 20 mg 이고, 바람직하게는 총부피의 약 0.2 내지 1 ml 이다.
발명의 한 양태에 따르면, 하기에 논의된 투여의 방법은 (i) 높은 비율의 세포 흡수를 가지는 안티센스 화합물의 사용, (ii) 안티센스 화합물의 c-myc mRAN 프로세싱 및 mRNA 번역 방해 능력, 및 (iii) 혈관 손상 위치에서 화합물의 높은 국부화된 농도를 얻기에 유효한 투여방식으로 화합물의 국부적 송달과 같은 하나 이상의 주요한 특징을 개발한다. 첫 번째 2 가지 특징은 하기에 논의되었다. 3 번째 특징을 얻기에 유효한 투여의 방식은 지금 개시될 것이다.
A.이온도입(전리요법)
하나의 구체예에서, 발명은 안티센스 화합물을 포함하는 저장소와 치료된 부위를 접촉시키고 이온도입법에 의해 저장소로부터 혈관에 화합물을 도입하는 안티센스 화합물의 송달을 제공한다.
본원에 개시된 안티센스 화합물은 비하전이다. 최적의 이온도입법은 투여된약제가 전체적인 망 전하를 가지는 것을 필요로 한다. 안티센스 화합물은 상기에 개시된 대로, 적어도 생리적 또는 생리적-근처의 pH 에서 하전된기를 부여하기 위해 변형될 수 있다. 대안적으로, 펄스 전기장은 일렉트로포레이션 결과를 통해 세포내로 비하전 안티센스 화합물의 도입을 용이하게 하는데 효과적일 수 있다. 혈관 위치에 예를 들어, 풍선 카테테르 장치에 의해서 이온도입 약제 송달을 수행용 장치가 개시되었다. 일반적으로, 이러한 장치는 카테테르 말단-팁 풍선의 외부 쉘에 포함된 화합물 용액에 대한 저장소, 저장소로부터 혈관벽으로 화합물의 전이를 허용하는 풍선 외-막, 및 내부 저장소와 연통하는 전극을 포함한다. 제 2 의 계수-전극이 체내에 놓여지고, 펄스 전압이 2 개의 전극을 통과하여 하전된 화합물을 혈관 위치로 유도하도록 작동하는 필드를 생성한다. 장치, 및 전기 펄스 전압 및 시간은 예를 들어, Fernandex-Ortiz, Dev, Robinson, 및 U.S. 특허번호 5,593,974, 5,628,730, 및 5,425,703 과 같은 당업계에서 개시된 것을 따른다.
대안적으로, 펄스-필드 유발 일렉트로포레이션으로 용이화된 세포 흡수와 함께 비하전 화합물의 위치에의 확산 또는 주입을 위해 설계된 펄스-필드 장치가 또한 기대된다.
양 방법은 혈관 조직에 화합물 도입에 있어서 높은 유체압력을 필요로 하지 않고, 안티센스 화합물을 혈관벽 세포로 고-효율 송달하는 잇점을 제공한다. 혈관 위치에 송달되는 바람직한 투여량이 1 mg 이라고 하면, 조직흡수의 효험은 25-80 % , 송달용 저장소에 포함된 화합물의 총량은 약 1.25 및 4 mg 사이이고, 바람직하게는 약 25-50 mg/ml 의 농도이다.
B.유두 풍선 카테테르 또는 침윤자
제 2 의 일반적 화합물-송달 접근법에서, 개시된 것과 같이 (예를 들어, Roy, Pavlides, and Barath) 화합물은 혈관, 즉, 혈관 표면 아래에 주입 풍선 카테테르 수단에 의해 주입된다. "침윤자 확장술 풍선 카테테르" 또는 "IABC" 로서 상업적으로 알려진 카테테르는 풍선 확장용 루멘, 가이드와이어용 루멘 중심부, 및 약제 송달용 루멘의 3 개의 루멘을 가지는 풍선 카테테르이다. 풍선 표면상에, 몇개의 세로 스트립 또는 채널이 있고, 각각은 채널 표면상에 팽창 스탠드 프로젝트인 예를 들어, 6 개의 니들과 같은 다수의 주입 니들을 가지고, 약제-송달 루멘에 연결된다. 풍선이 팽창할 때, 니들은 외상에 침투하여 혈관 벽의 중간막에 약의 송달을 허용한다.
본 발명에서, 저장소는 바람직하게는 약 25-50 mg/ml 의 화합물 농도를 포함하는 안티센스 조성물로 채워진다. 약 15-50 % 의 조직에의 흡수를 가정하면, 주입된 물질의 양은 약 0.04 ml 내지 0.25 ml 의 범위이다. 손상 위치에 압력하에서 투여되는 상대적으로 작은 부피의 화합물이 액체 주입에 의한 더 이상의 손상된 위험을 감소시켰다.
투여의 방식은 혈관 조직으로의 높은 화합물 흡수의 높은 효율성의 잇점을 제공한다(20 % 또는 그 이상).
C.히드로겔 코팅
제 3 의 송달 접근법에서, 화합물은 예를 들어, 확장술용 풍선 카테테르와 같은 풍선의 외피를 코팅하는 확산가능한 배지, 전형적으로 히드록겔에 삽입되거나용해된다. 카테테르 풍선에 이러한 히드로겔 코팅을 만들고 사용하는 방법이 개시되었다 (예를 들어, Imanishi, Dick).
히드로겔 코팅은 바람직한 농도, 약 25-50 mg/ml 로 안티센스 화합물을 포함하고, 약 5-60 분동안 화합물의 선택 투여량을 해리하도록 조제된다. 히드로겔의 총량은 약 5-40 % 의 조직 흡수의 효험에 적합하도록 약 2.5 내지 25 mg 의 총송달을 허용하는 약 0.1 내지 0.5 ml 가 바람직하다.
히드로겔 확산 방법은 상기에 개시된 대로 이온전도법 또는 전기천동과 결합되어, 겔로부터 조직으로의 화합물의 흡수를 향상시킬 수 있다. 이러한 경우에, 개선된 흡수 효율성의 관점에서, 겔 내의 물질의 양은 실질적으로 감소될 수 있다. 될 수 있다.
본 발명의 방법은 화합물 송달 기간동안 화합물 저장소 및 혈관벽 사이의 밀접한 접촉을 유지하는 잇점을 가지면서, 상대적으로 낮은 속도의 약제 해리 및 세포에 의한 흡수를 허용하고, 증가된 주입 압력을 피한다.
D.스텐트
이 접근법은 화합물이 혈관내 스텐트상에 함유된 코팅에서 확산가능한 형태로 포함된다는 것을 제외하고는 상기 히드로겔 방법에 유사하다. 스텐트는 혈관 확장술시 혈관 위치에 놓이거나, 관상동맥 바이패스 수술동안 수술 위치에 놓일 수 있다. 생분해성 화합물을 해리하거나, 확산가능한 형태로 화합물을 포함하는 코팅을 포함하는 생분해성 스텐트를 포함하는 스텐트 설계 및 물질이 공지된다 (로마 및 U.S. 특허번호: 5,997,478 및 5,871,535).
상기에 개시된 대로, 5-20 % 사이의 조직에의 흡수 효율성을 기대하면서, 스텐트 또는 코팅 스텐트는 5-60 분동안 대략 0.5 - 2 mg 투여량 송달에 충분한 약제양을 포함한다.
조직이식된 스텐트는 본 발명의 실행에서 2 가지 잇점을 제공한다. 첫번째로, 다른 방법과 마찬가지로 단기간 투여를 허용하고, 또한 재협착의 초기 이벤트를 차단하기 위해 예로서, 1-14 일의 연장된 기간에 걸쳐 낮은 수준에서 투여를 지속할 수 있었다. 2 번째로, 스텐트 그 자체는 보고된 바와 같이, 재협착의 위험 감소에 효과적일 수 있다.
E.미세입자
폴리스티렌 미세입자(Seradyn,Indianapolis, Ind), 생분해성 입자, 안티센스 화합물을 포함하는 리포좀 또는 미세버블과 같은 미세입자가 혈관 조직에로의 화합물의 직접 송달에 사용될 수 있다.
입자는 조직 흡수의 효율성에 따라 총 투여량으로, 바람직하게는 0.5-2 mg 의 총투여량을 포함하도록 준비된다. 입자가 조직에 주입되는 경우에, 이 흡수는 예를 들어, 30-70 % 또는 그 이상일 수 있다. 입자가 단지 혈관벽과 접촉하도록 놓여지는 경우에, 화합물의 흡수는 더 낮을 것이다.
입자의 송달 방법은 입자 현탁액의 주입, 또는 예를 들어, 히드로겔 배지에서의 입자의 외부 코팅을 포함하는 풍선에서 풍선 압력 또는 스텐트내의 해리가능한 형태에서 입자를 포획하는 것에 의하는 것과 같은 혈관벽에 대해 입자를 물리적으로 압력하는 것을 포함한다. 입자가 미세버블인 경우에, 방법은 추가적으로 투여된 입자를 초음파 에너지에 노출시켜서 버블을 파괴하고 입자 위치에서 버블을 해리시키는 것을 포함한다. 화합물의 입자 송달은 입자가 주입되는 특정의 장소에서 높은 흡수의 잇점, 및 예를 들어, 생분해성 입자와 같은 데포-해리 입자로부터 높은, 단기간 약제 해리 및 연장된 해리 모두에 대한 가능성을 가진다. 입자는 또한 결합제와 코팅될 수 있는 데, 예를 들어, 성장 인자 또는 초기 세포 이벤트 동안 내피 세포에 의해 활성적으로 합성된 다른 단백질에 특이적인 항체는 재협착을 유발하여(Bauriedel) 화합물 흡수의 효험을 향상시킨다. 최종적으로, 미세버블에 대한 경우와 같이 안티센스 화합물은 바람직한 시간에서 입자로부터 선택적으로 해리될 수 있다.
IV.재협착 방법
관련 측면에서, 본 발명은 환자의 관상동맥 혈관 영역에서 재협착의 위험을 치료하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법은 (i) SEQ ID NO: 1 으로 확인된 염기 서열, (ii) 도 2b-b 에 제시된 포스포로디아미데이트 골격( 여기에서, X=NH2,Y=O, 및 Z=O 이다) (iii) 화합물의 용해도, 바람직하게는 25-50 mg/ml 또는 그 이상의 수성 배지에 대한 용해도를 향상시키는 부분을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 손상 영역에 직접적인 국부 송달에 의해 환자에게 투여함으로서 수행된다. 투여는 상기에 개시된 방법 또는 액제(drug-solution)를 가지는 윌린스키(Wilinsky)형 풍선 카테테르를 통한 물질의 직접적 주입과 같은 대안적 방법을 사용하여, 혈관과의 직접적 접촉, 및 혈관벽에 대한 풍선의 기공을 통한 용제 주입 수단에 의한다. 주입된 물질의 양은 바람직하게는 조직에 의해 흡수된 물질의 투여량이 0. 5 내지 2 mg 안티센스 화합물로 제공되도록 설정된다.
화합물 용해도를 향상시키는 부분은 안티센스 화합물에 결합될 수 있는 어느 생물학적양립가능한 친수성 또는 하전 부분일 수 있고, 이것은 표적 서열과 화합물의 결합을 방해하지 않는다. 하나의 바람직한 부분은 상기에 개시된대로 카르바메이트-피페리진 연결을 통해 안티센스 화합물로 유도된 트리에틸렌글리콜 부분이다.
V.안티센스 송달 및 흡수의 효험 분석 방법
PTCA 성공의 표준 지시자는 감염된 혈관의 최소한의 루멘 직경, 즉 재폐색의 범위를 결정하기 위한 하나 이상의 추적검사 혈관조영상이다. 본 발명의 방법의 성공 결정에서, 추적검사 혈관조영상은 c-myc 안티센스-함유 카테테르의 조직이식 다음에 1 번 이상으로 기대될 수 있다. 성공적인 치료적 개입의 지표는 낮은 비율의 재-폐색 및/또는 재협착 발생 및 재-폐색 및/또는 재협착 발생을 위한 지연된 시간을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 혈관 위치에 안티센스 화합물을 투여한 다음, 표적 세포에서 c-myc 안티센스 화합물의 존재를 확증하고, 효과적인 재협착 치료를 위한 상태 및 투여량을 최적화하기 위해 다양한 화합물 투여의 방법에 의해 획득된 화합물의 흡수 수준을 비교하는 빠르고, 쉬운 수행 방법이 제공된다.
본 발명은 "RNA 를 검출하는 비-침투적 방법" 에 대해 상기-언급된 U.S. 가출원 60/117,846 에 개시된 발견에 기초하는 데, 이는 생체내 투여된 경우에 본원에 개시된 형태의 모르폴리노 안티센스 화합물은 안티센스 화합물 및 그것의 RNA보체로 구성되는 헤테로듀플렉스 형태로 수용 대상의 소변에서 검출될 수 있다는 것을 개시한다. 데이타는 (i) 대상에서 세포에 의한 안티센스 화합물의 흡수, (ii) 세포내 표적 mRNA 와 화합물의 결합, (iii) 안티센스 및 그것의 mRNA 보체로 구성되는 헤테로듀플렉스는 남겨두고, 안티센스/표적 복합체의 단일가닥 부분의 세포내 뉴클레아제 절단, (iv) 아마도 세포에 의해 외래 분자로 인식된 헤테로듀플렉스의 방출, 및 (v) 혈액 및 궁극적으로는 소변에서 헤테로듀플렉스의 출현을 포함하는 이벤트의 서열을 나타낸다.
본 발명에서, 이벤트의 서열은 상기에 개시된 어느 방법에 따라서 c-myc 안티센스를 투여하도록 허용하고, 그 다음 표적 세포로 화합물이 흡수되고, 소변 또는 예로서, 혈액 또는 혈청과 같은 다른 체액에서 c-myc 안티센스/mRNA 의 존재 및/또는 양이 모니터된다.
방법의 실행에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 상기에 언급된 어느 하나의 송달 방식을 포함하는 선택된 송달 방식에 의해서, 선택된 투여량으로 환자 또는 동물 모델에게 투여된다. 그 다음에, 그리고 투여 후의 선택된 시간, 예를 들어, 투여 후 4, 12, 및 24 시간에서, 소변을 선택된 투여량 및 투여 방법에서 화합물 흡수의 효험을 결정하기 위해 헤테로듀플렉스의 출현 및/또는 양을 모니터한다.
소변 검출에 사용하는 표본적인 분석 포맷에서, 안티센스/:RNA 헤테로듀플렉스를 포함하는 샘플은 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스 (예를 들어, 특정 헤테로듀플렉스에 대해 특이적인 단일클론 항체(mAb)) 에 특이적으로 결합하거나 변형시키는 화합물과 반응하여 변형 또는 결합 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스가 검출된다.
다른 표본적인 분석 포맷에서, 안티센스 올리고머는 대상에 투여전에 리포터 분자와 함께 결합시켜서 변형되고 그 다음, 비결합 리포터 표지 안티센스 올리고머로부터 헤테로듀플렉스를 분리하고, 헤테로듀플렉스-관련 리포터 분자를 검출한다. 어떤 경우에, 이러한 분리는 크로마토그래피 또는 전기영동을 통해 수행될 수 있다.
표본적인 검출 방법은 분광광도계 검출(예를 들어, 형광 검출기로), 또는 항체를 사용한 검출(예를 들어, FACS 분석)을 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어, 동시 형광 검출과 함께 크로마토그래프 분리 또는 겔의 염색, 형광 또는 자동방사선 검출에 의한 검출과 함께 전기영동분리와 같이 분석을 개발하기 위해 분리 방법과 결합될 수 있다. 이러한 기법은 당업자에게 공지되고, 허여된 안티센스 올리고머 및 표적 RNA 에 쉽게 적용가능하다.
핵산을 표지화하기 위해 당업계에서 알려진 어느 형광 분자, 예를 들어, 플루오레신 및 카르복시 플루오레신, 5-(4,6-디클로로트리아진-2-일) 아미노 플루오레신(5-DTAF)와 같은 플루오레신 유도체; 에오신; Texas Red 및 테트라메틸로드아민과 같은 로드아민; U.S 특허번호 4,957,870 및 4,888,867 에 개시된 티아졸 오렌지, 옥사졸 옐로우 및 관련 염료와 같은 시아닌 염료; 피렌; La JollaBlue 와 같은 포르피린 염료가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 형광 표지는 형광 수명이 측정된 관련 시간에 대다수 양립가능하도록 텀블링 시간에 영향을 주는 온도, 점도, 및 형광 염료가 결합되는 올리고뉴클레오티드를 고려하여 선택되어야 한다. 형광표지는 표지로부터 형광물질의 방출 또는 표적 서열에 프로브의 혼성화를 방해하지 않도록 신호 프라이머에 공유결합으로 연결 또는 결합된다 [U.S. 특허번호 5,614,617 및 5,652,099 참조].
다른 경우에, Smith, L.M.,et al.Nuc.Acids Res. 13 (7) :2399 (1985) 에 개시된 대로, 반응성 아미노기에 부착된 서열의 5' 말단을 가지고 허여된 표지에 서열 상보성을 가지는 안티센스 올리고머가 합성될 수 있다. 이러한 경우에, 비오틴, 펩티드, 또는 알칼리 포스파타제와 같은 효소가 5' 아미노기에 부착될 수 있다 [U.S. 특허번호 5,783,391 참조]
또 다른 구체예에서, 헤테로듀플렉스는 예를 들어, 질량 분광계로 체액으로부터 분리후에 검출될 수 있다. 본 발명을 증명하기 위해 수행된 연구에서, 헤테로듀플렉스 RNA: 모르폴리노 올리고머는 질량 분광계에 의해 2 개의 다른-MW 분획(2개의 헤테로듀플렉스 가닥)으로 쉽게 분해된다. 그러므로 이 방법은 2 개의 부분 가닥의 관점에서 헤테로듀플렉스의 양성 확인을 제공한다.
상기에서 예견될 수 있는 대로, 방법은 우리가 효험있는 투여의 다양한 방식, 및 최적의 투여량, 전형적으로 소변에서 헤테로듀플렉스의 최대 또는 최대-근처 수준에 쉽게 접근하도록 하여한다. 이것은 내과의사가 치료 방법의 효험을 모니터하고 안티센스 화합물이 혈관 조직에 의해 흡수되는 것을 보장한다. 예를 들어, 시험이 24 시간 후에 헤테로듀플렉스의 낮은 수준을 보인다면, 내과의사는 부위를 재치료할 필요가 있다.
하기의 실시예는 분석 방법의 기초적 특징을 예증한다.
(실시예 1)
안티센스 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스로 생체내 연구
플루어레신 결합 올리고머를 검출할 수 있는 도구(Applied Biosystems Model 672 GeneScanner)를 사용하여 수행된 표준화 연구는 다양한 길이; 15-mer, 20-mer, 24-mer 및 38-mer 리보자임의 플루어레신-결합 올리고머의 이동 속도 결정에 사용되었다. 농도를 GeneScanner 겔상에서 평가했다.
래트에 래트 시토크롬 P-4503A2 에 대한 안티센스인 카르복시플루어레신-결합 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)를 주입했다.
PMO-투여 후 다양한 시간에서 래트로부터 채취한 혈액으로부터 제조된 플라즈마 샘플의 크로마토그램은 하기의 결과를 보였다. 주입 후 1 시간 경과된 래트로부터 제조된 플라즈마 샘플은 270 및 340 분에서 이동하는 형광 성분을 포함했다 ( 서로 다르게 이동하는 2 개의 가능한 카르복시플루어레신 결합때문에 2 개의 피크). 주입 후 24 시간 경과된 래트로부터 제조된 플라즈마 샘플은 대략 75 및 80 분에서 이동한 형광 성분을 포함했다. 질량 분광계 데이타(제시되지 않음)는 더 짧은 이동시간은 PMO 의 분해 때문이 아니라는 것을 확증하고 PMO:RNA 헤테로듀플렉스가 그 시간동안 형성되었다는 것을 나타낸다.
도 3 은 P450 안티센스 PMO 의 투여후 다양한 시간(분)에서 취한 샘플을 나타내고, 이러한 투여 다음에 래트 플라즈마에서 PMO 단량체의 소멸(빈 사각형) 및 해당하는 RNA:PMO 헤테로다이머(검게 칠해진 원)의 존재를 나타낸다. 플라즈마에서 상당한 양의 듀플렉스 출현은 대다수의 비-듀플렉스 PMO 가 일반적으로 "분배 페이즈" 로 명명되는 것처럼 플라즈마를 이탈하기 전에는 발생하지 않는다. PMO 헤테로듀플렉스는 PMO 단량체가 상보적인 mRNA 전사체가 위치한 대상의 조직으로 분배된 후에야 플라즈마내에 축적된다. 하전된 RNA:PMO 듀플렉스는 아마도 이러한 조직에서 형성되고 세포밖으로 유출되고 플라즈마로 반환된다. 전체적인 과정은 몇 시간을 요구한다.
p450 안티센스 PMO 의 투여후에, 플루어레신을 신장 및 간 모두에서 검출했다. 신장 조직 샘플의 크로마토그램은 350 분에서 비-듀플렉스 PMO 와 일치하는 밴드, 80 분에서 듀플렉스 및 모 PMO 가 모두 간질성 공간 또는 신장 세포내에 존재할 수 있다는 것을 나타내면서, PMO:RNA 헤테로듀플렉스와 일치하는 추가적인 밴드를 보여준다. 간 조직 샘플은 필수적으로 모두 듀플렉스 PMO 이고 훨씬 더 PMO:RNA 헤테로듀플렉스임을 나타낸다. 이러한 결과는 P450 mRNA 전사체의 수준이 간 보다 신장에서 훨씬 낮다는 관찰과 일치한다.
소변에서 비-듀플렉스 안티센스 PMO 올리고머 및 안티센스 PMO 올리고머:RNA 헤테로듀플렉스 소멸의 시간 코스를 반영하는 연구는 조직에서 플라즈마로 PMO:RNA 헤테로듀플렉스의 형성 및 유출, 그 후에 소변에서 그것의 궁극적인 출현은 몇 시간을 요구한다는 것을 나타낸다.
본 발명은 구체적인 방법 및 구체예와 관련되어 개시되었지만, 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 취지에서 벗어나지 않고 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

Claims (25)

  1. 원단부 팽창성 풍선을 가지는 카테테르를 사용하여 관상동맥 확장술로 치료된 환자의 관상동맥 혈관 영역, 또는 관상동맥 바이패스 수술에서 형성된 접합부에서 재협착의 위험을 감소시키는 방법으로서, 환자에게 (i) 사람의 c-myc mRNA 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 염기 서열을 포함하는 8 내지 40 개의 뉴클레오티드, 및 (ii) 환자에서 재협착의 위험을 감소시키는 유효량으로 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물을 손상 혈관 부위에 직접적인 국부 투여를 함으로서 투여하는 것을 포함하는 방법이며, 상기 투여는
    (a) 혈관 영역을 안티센스 화합물을 포함하는 저장소와 접촉시키고, 이온도입법 또는 일렉트로포레이션에 의해 저장소로부터 혈관에 화합물을 도입하는 방식;
    (b) 카테테르 풍선의 표면상에 포함된, 혈관의 중간막을 침투할 수 있는 주입기를 통해 압력하에서, 카테테르로부터 혈관 영역에 화합물을 직접 주입하는 방식;
    (c) 트랩된 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 미세입자를 혈관 영역에 주입하거나 접촉시키는 방식;
    (d) 혈관 영역을 카테테르 풍선의 표면상에 포함되고, 확산가능한 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 히드로겔 코팅과 접촉시키는 방식; 및
    (e) 혈관 영역을 확산가능한 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 외표면층을가지는 스텐트와 접촉하는 방식으로 구성되는 군으로부터 선택되는 투여의 방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 재협착 위험을 감소시키는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 서브유닛간 연결은 도 2aa-2ee 에 제시된 구조로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 연결은 도 2b-b 에서 제시된 포스포로디아미데이트 연결이며, 이때 X=NH2, Y=O, 및 Z=O 인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 안티센스 화합물은 SEQ ID NO:1 으로 확인된 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 투여된 안티센스 화합물의 양은 0.5 내지 20 mg 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (a) 에 사용을 위해서, 안티센스 화합물은 카테테르 내의 2 개의 팽창된 풍선사이의 부피로 함유되고, 화합물은 순 전하를 포함하고, 부피는 혈관 영역에 화합물을 이온도입적으로 송달하기에 효과적인 펄스 전기장에 놓이는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (a) 에 사용을 위해서, 안티센스 화합물은 카테테르 내의 2 개의 팽창된 풍선 사이의 부피로 함유되고, 부피는 일렉트로포레이션에 의해서 혈관-영역 세포로의 화합물 흡수를 용이하게 하기에 효과적인 펄스 전기 필드에 놓이는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (b) 에 사용을 위해서, 카테테르 풍선은 말단-팁 저장소와 연통하는 다수의 외부-접촉 채널을 가지고, 각 채널은 하나이상의 주입구를 가지고, 이 주입은 풍선이 팽창된 위치일 때, 상기 주입구를 통해 상기 저장소로부터 안티센스 화합물의 용액 또는 현탁액을 밀어넣는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (c) 에 사용을 위해서, 카테테르는 원단부 저장소를 가지고, 미세입자는 저장소에 입자 현탁액으로 포함되고, 상기 주입은 혈관 영역과 접촉하여 카테테르 표면을 통해 카테테르로부터 현탁액을 밀어넣는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 입자는 트립된 형태로 안티센스 화합물을 포함하는 미세버블이고, 방법은 입자 주입 다음에 초음파 에너지에 혈관 영역을 노출시키는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (d) 에 사용을 위해서, 코팅은 풍선확장술 다음 5-60 분의 기간에 걸쳐 코팅 내의 대다수의 안티센스 화합물을 해리시키도록 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 투여 방식 (e) 에 사용을 위해서, 스텐트는 생물학적분해가능하고, 풍선확장술 다음 5-60 분의 기간에 걸쳐 코팅 내의 대다수의 안티센스 화합물을 해리시키도록 설계되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 환자에게 (i) SEQ ID NO:1 으로 확인된 염기 서열, 및 (ii) 도 2b-b 에서 보여진 포스포로디아미데이트 골격(여기에서 X=NH2, Y=O , 및 Z=O) 을 포함하는 모르폴리노 안티센스 화합물을 손상 영역에 직접적으로 국부 송달함으로서 투여하며 여기에서, 상기 투여는 조직-혈관 영역에 0.5 내지 2 mg 의 안티센스 화합물 송달에 유효한 양으로 혈관 영역과 직접적 접촉으로 화합물을 위치시켜서 투여하는 것을 포함하는, 환자의 관상동맥 혈관 영역에서 재협착의 위험을 치료하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 화합물은 수성 배지에서 화합물의 용해도를 향상시키는 부분을 갖도록 유도체로 되어 있고, 화합물은 적어도 약 30 mg/ml 의 안티센스 화합물을 포함하는 용액으로부터 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 부분은 화합물의 5' 말단에 부착된 트리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. (i) 사람의 c-myc mRNA 유전자의 개시 코돈을 포함하는 영역에 상보적인 표적화 핵산 서열을 포함하는 8 내지 40 개의 뉴클레오티드, 및 (ii) 비하전, 인-함유 서브유닛간 연결을 포함하는 것을 특징으로 하는 모르폴리노 안티센스 화합물.
  17. 제 16 항에 있어서, 서브유닛간 연결은 도 2a-a-2e-e 에 제시된 구조로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제 17 항에 있어서, 연결은 도 2 b-b 에서 제시된 포스포로디아미데이트이며, 이때 X=NH2, Y=O, 및 Z=O 인 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 16 항에 있어서, 안티센스 화합물은 SEQ ID NO:1 으로 확인되는 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제 19 항에 있어서, 화합물은 적어도 약 30 mg/ml 의 안티센스 화합물 수준으로 수성 배지에서 화합물의 용해도를 향상시키는 부분을 갖도록 유도체로 되어 있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 부분은 화합물의 5' 말단에 부착된 트리에틸렌글리콜인 것을 특징으로 하는 화합물.
  22. 제 16 항에 있어서, 리포좀 또는 생분해성 미세입자에 트랩된 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 사람의 표적 c-myc mRNA 서열에 대해 특이적인 안티센스 화합물을 혈관 영역에 투여함으로써 원단부 팽창성 풍선을 가진 카테테르를 사용하여 관상동맥 확장술로 치료된 환자의 관상동맥 혈관 영역에서 재협착의 위험을 감소시키도록 의도된 방법에서,
    안티센스 화합물이 혈관 세포의 c-myc mRNA 서열에 도달하고 상호작용하는 능력을 분석하는 방법은
    환자에게 실질적으로 비하전 골격을 가지는 모르폴리노 안티센스 화합물, 및 사람의 c-myc 유전자의 개시코돈을 포함하는 서열을 투여하는 단계
    상기 투여후에 선택된 시간에서 대상으로부터 체액의 샘플을 취하는 단계, 및
    상기 샘플에서 안티센스 화합물 및 표적 RNA 영역으로 구성되는 뉴클레아제-내성 헤테로듀플렉스의 존재를 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 체액은 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 검출은 상기 헤테로듀플렉스에 대해 특이적인 항체와 샘플을 반응시키고, 항체-헤테로듀플렉스 결합체의 존재를 검출하여 달성되는 것을 특징으로 하는 방법.
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