ES2748868T3 - Acido nucleico antisentido - Google Patents

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Shin'ichi Takeda
Tetsuya Nagata
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Abstract

Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 55º en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos del 14º al 34º o del 15º al 34º, desde el extremo 5' del exón 55º en el gen de la distrofina humana.

Description

DESCRIPCIÓN
Ácido nucleico antisentido
Campo técnico
La presente invención se refiere a un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 55, 45, 50 o 44 en el gen de la distrofina humana, y una composición farmacéutica que comprende el oligómero.
Antecedentes de la técnica
La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es la forma más frecuente de distrofia muscular progresiva hereditaria que afecta a uno de cada 3500 niños recién nacidos. Aunque las funciones motoras rara vez son diferentes de las de los seres humanos sanos en la infancia y la niñez, se observa debilidad muscular en niños de alrededor de 4 a 5 años. Después, la debilidad muscular progresa a la pérdida de la deambulación a los aproximadamente 12 años y la muerte debido a insuficiencia cardíaca o respiratoria en la veintena. La DMD es un trastorno muy grave. En la actualidad, no existe una terapia efectiva para la d Md disponible, y se ha deseado desarrollar un nuevo agente terapéutico.
Se sabe que la DMD es causada por una mutación en el gen de la distrofina. El gen de la distrofina se encuentra en el cromosoma X y es un gen enorme que consta de 2.2 millones de pares de nucleótidos de ADN. El ADN se transcribe en precursores de ARNm, y los intrones se eliminan mediante corte y empalme para sintetizar ARNm en el que se unen 79 exones. Este ARNm se traduce en 3685 aminoácidos para producir la proteína distrofina. La proteína distrofina está asociada con el mantenimiento de la estabilidad de la membrana en las células musculares y es necesaria para que las células musculares sean menos frágiles. El gen de la distrofina de pacientes con DMD contiene una mutación y, por lo tanto, la proteína distrofina, que es funcional en las células musculares, rara vez se expresa. Por lo tanto, la estructura de las células musculares no se puede mantener en el cuerpo de los pacientes con DMD, lo que provoca una gran afluencia de iones de calcio en las células musculares. En consecuencia, se produce una respuesta similar a la inflamación para promover la fibrosis, de modo que las células musculares se pueden regenerar solo con dificultad.
La distrofia muscular de Becker (BMD, por sus siglas en inglés) también es causada por una mutación en el gen de la distrofina. Los síntomas involucran debilidad muscular acompañada de atrofia del músculo, pero generalmente son leves y lentos en el progreso de la debilidad muscular, en comparación con la DMD. En muchos casos, su inicio es en la edad adulta. Se considera que las diferencias en los síntomas clínicos entre DMD y BMD residen en si el marco de lectura para los aminoácidos en la traducción del ARNm de distrofina en la proteína distrofina se ve alterado por la mutación o no (documento distinto de patente 1). Más específicamente, en DMD, la presencia de mutación cambia el marco de lectura de aminoácidos para que se elimine la expresión de la proteína distrofina funcional, mientras que en la BMD la proteína distrofina que funciona, aunque de manera imperfecta, se produce porque el marco de lectura de aminoácidos se conserva, mientras que una parte de los exones son eliminados por la mutación.
Se espera que la omisión del exón sirva como método para tratar la DMD. Este método implica modificar el corte y empalme para restaurar el marco de lectura de aminoácidos del ARNm de distrofina e inducir la expresión de la proteína de distrofina que tiene la función parcialmente restaurada (documento distinto de patente 2). La parte de la secuencia de aminoácidos, que es una diana para la omisión de exones, se perderá. Por esta razón, la proteína distrofina expresada por este tratamiento se vuelve más corta que la normal, pero como se mantiene el marco de lectura de aminoácidos, la función para estabilizar las células musculares se retiene parcialmente. En consecuencia, se espera que la omisión del exón conduzca a la DMD a síntomas similares a los de la BDM, que es más leve. El enfoque de omisión del exón ha pasado las pruebas con animales utilizando ratones o perros y ahora se evalúa actualmente en ensayos clínicos en pacientes con DMD humana.
La omisión de un exón puede ser inducida por unión de ácidos nucleicos antisentido que actúan selectivamente bien sobre un sitio cualquiera de corte y empalme 5' o 3' o ambos, o bien sobre sitios internos del exón. Un exón solo será incluido en el ARNm cuando ambos sitios de corte y empalme del mismo sean reconocidos por el espliceosoma, también llamado complejo de corte y empalme. Por lo tanto, se puede inducir la omisión del exón por acción selectiva de ácidos nucleicos antisentido sobre los sitios de corte y empalme. Además, la unión de una proteína SR a un potenciador de corte y empalme exónico (ESE, por sus siglas en inglés) se considera necesaria para que un exón sea reconocido por el mecanismo de corte y empalme. En consecuencia, la omisión del exón también puede ser inducida por acción selectiva de ESE.
Dado que una mutación del gen de la distrofina puede variar según los pacientes con DMD, los ácidos nucleicos antisentido se deben diseñar en función del sitio o tipo de mutación genética respectiva. En el pasado, Steve Wilton, et al., Universidad de Australia Occidental (documento distinto de patente 3) produjeron ácidos nucleicos antisentido que inducen la omisión del exón para los 79 exones, y los ácidos nucleicos antisentido que inducen la omisión del exón para 39 exones se produjeron por Annemieke Aartsma-Rus, et al., Países Bajos (documento distinto de patente 4).
Se considera que aproximadamente el 20% de todos los pacientes con DMD pueden ser tratados omitiendo los exones 55, 45, 50 y 44 (en adelante denominado "exón 55", "exón 45", "exón 50" y "exón 44", respectivamente). En los últimos años, varias organizaciones de investigación dieron a conocer los estudios en los que el exón 55, 45, 50 o 44 en el gen de la distrofina se seleccionaron para la omisión del exón (documentos de patente 1 a 8). Sin embargo, todavía no se ha establecido una técnica para omitir el exón 55, 45, 50 o 44 con una alta eficacia.
El documento WO 2010/048586 A1 describe una composición para utilizar en la producción de omisión del exón 44, 45, 50 o 55 en el procesamiento de ARNm preprocesado de distrofina humana, que comprende un compuesto antisentido sustancialmente sin carga que contiene 20-35 subunidades de morfolino unidas por fósforo.
El documento WO 2010/123369 A1 describe un oligonucleótido que comprende una inosina y/o un nucleótido que contiene una base que puede formar un par de bases oscilantes o un equivalente funcional del mismo.
A. Aartsma-Rus et al. (Molecular Therapy, vol. 14, n°. 3, 1 de septiembre de 2006, páginas 401-407) describe la omisión terapéutica de exón para la DMD por acción selectiva doble dentro de uno o múltiples exones.
C. Beroud et al. (Human Mutation, vol. 28, n° 2, 1 de febrero de 2007, páginas 196-202) describe que la omisión de multiexones que conduce a una proteína de DMD artificial que carece de aminoácidos de los exones 45 a 55 podría rescatar hasta el 63% de los pacientes con distrofia muscular de Duchenne.
S.D. Wilton et al. (Molecular Therapy, vol. 15, n° 7, 1 de julio de 2007, páginas 1288-1296) describe la omisión del exón inducida por oligonucleótidos antisentido a través de la transcripción del gen de la distrofina humana.
El documento W02010/050801 A1 describe una molécula que se une a un tramo continuo de al menos 21 nucleótidos dentro del exón 45 del pre-ARNm de DMD.
El documento de patente de EE.UU. 2010/168212 A1 describe moléculas que pueden ser capaces de provocar la omisión del exón en el gen de la distrofina.
El documento WO 2009/054725 A2 describe un método para aliviar uno o más síntomas de DMD o BMD en un individuo que utiliza un compuesto complementario para reducir la inflamación del tejido muscular, y/o un compuesto complementario para mejorar la función, integridad y/o supervivencia de la fibra muscular.
El documento WO 2010/050802 A2 describe un método en donde se utiliza una molécula con la intención de inducir y/o promover la omisión de al menos uno de los exones 43, exón 46, exones 50-53 del pre-ARNm de DMD en un paciente.
Moulton H.M. y Moultobn J.D (Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1798, n°. 12, 1 de diciembre de 2010, páginas 2296­ 2303) describe los morfolinos y sus conjugados peptídicos para el tratamiento de DMD.
Qi-Long Lu et al. (Molecular Therapy, vol. 19, no. 1, 1 de enero de 2011, páginas 9-15) describe el estado de la omisión de exones como un enfoque terapéutico para la DMD.
El documento WO 2011/057350 A1 describe una molécula antisentido capaz de unirse a un sitio selectivo seleccionado para inducir la omisión del exón en el gen de la distrofina.
El documento de patente de EE.UU. 7807816 A1 describe un oligonucleótido antisentido aislado de 30 a 50 nucleótidos de longitud que comprende una cierta secuencia de nucleótidos, en donde en la secuencia las bases de uracilo son opcionalmente bases de timina.
El documento EP 1568769 A1 describe productos farmacéuticos de ácido nucleico ENA capaces de modificar el corte y empalme de precursores de ARNm, más específicamente, compuestos oligonucleotídicos antisentido para secuencias potenciadoras de corte y empalme dentro del exón 19, 41, 45, 46, 44, 50, 55, 51 o 53 del gen de la distrofina, así como agentes terapéuticos para la distrofia muscular que comprende los compuestos.
Documento de patente 1: Publicación internacional del documento WO 2006/000057
Documento de patente 2: Publicación internacional del documento WO 2004/048570
Documento de patente 3: Publicación de solicitud de patente no examinada de EE.UU. 2010/0168212 Documento de patente 4: Publicación internacional del documento WO2010/048586
Documento de patente 5: Publicación internacional del documento WO 2004/083446
Documento de patente 6: Publicación internacional del documento WO 2010/050801
Documento de Patente 7: Publicación internacional del documento WO 2009/139630
Documento de Patente 8: Publicación internacional del documento WO 2010/048586 A1
Documento de Patente 9: Publicación internacional de documento WO 2010/123369 A1
Documento de patente 10: Publicación internacional del documento WO2010/050801 A1
Documento de patente 11: Publicación de solicitud de patente no examinada de EE.UU. 2010/168212 A1 Documento de patente 12: Publicación internacional del documento WO 2009/054725 A2
Documento de Patente 13: Publicación internacional del documento WO 2010/050802 A2
Documento de patente 14: Publicación internacional del documento WO 2011/057350 A1
Documento de Patente 15: Publicación de patente de EE.UU. 7807816 A1
Documento de Patente 16: Publicación de solicitud de patente europea EP 1568769 A1
Documento distinto de patente 1: Monaco A.P. et al., Genomics 1988; 2: p.90-95
Documento distinto de patente 2: Matsuo M., Brain Dev 1996; 18: p. 167-172
Documento distinto de patente 3: Wilton S.D., et al., Molecular Therapy 2007: 15: p.1288-96
Documento distinto de patente 4: Annemieke Aartsma-Rus et al. (2002) Neuromuscular Disorders 12: S71-S77 Documento distinto de patente 5: Linda J. Popplewell et al., (2010) Neuromuscular Disorders, vol. 20, n°. 2, p.102-10 Documento distinto de patente 6: A. Aartsma-Rus et al., Molecular Therapy, vol. 14, n° 3, 1 de septiembre de 2006, páginas 401-407
Documento distinto de patente 7: C. Beroud et al., Human Mutation, vol. 28, n°. 2, 1 de febrero de 2007, páginas 196­ 202
Documento distinto de patente 8: S.D. Wilton et al., Molecular Therapy, vol. 15, n°. 7, 1 de julio de 2007, páginas 1288­ 1296
Documento distinto de patente 9: Moulton H.M. y Moultobn J.D, Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1798, n°. 12, 1 de diciembre de 2010, páginas 2296-2303
Documento distinto de patente 10: Qi-Long Lu et al., Molecular Therapy, vol. 19, n°. 1, 1 de enero de 2011, páginas 9­ 15
Descripción de la invención
En las circunstancias anteriores, se han deseado oligómeros antisentido que inducen fuertemente la omisión del exón 55, el exón 45, el exón 50 o el exón 44 en el gen de la distrofina y las terapias de distrofia muscular que comprenden oligómeros de los mismos.
Como resultado de estudios detallados de la estructura del gen de la distrofina, los presentes autores han descubierto que la omisión del exón 55 puede ser inducida con una alta eficacia por oligómeros antisentido que seleccionan la secuencia que consiste de alrededor de los nucleótidos 14° al 34° o del 15° al 34° del extremo 5' del exón 55 en el precursor de ARNm (de aquí en adelante denominado "pre-ARNm") en el gen de la distrofina con oligómeros antisentido.
Los presentes autores también han encontrado que la omisión del exón 45 puede ser inducida con una alta eficacia por oligómeros antisentido que seleccionan la secuencia que consiste de alrededor de los nucleótidos 1° al 25° y del 6° al 30° desde el extremo 5' del exón 45 en el pre-ARNm en el gen de la distrofina con oligómeros antisentido. Además, los presentes autores han encontrado que la omisión del exón 50 puede ser inducida con una alta eficacia por oligómeros antisentido que seleccionan la secuencia que consiste de alrededor de los nucleótidos 107° al 127° desde el extremo 5' del exón 50 en el pre-ARNm en el gen de la distrofina con oligómeros antisentido.
Además, los presentes autores también han encontrado que la omisión del exón 44 puede ser inducida con una alta eficacia por oligómeros antisentido que seleccionan la secuencia que consiste de alrededor de los nucleótidos 11° al 32° y del 26° al 47° desde el extremo 5' del exón 44 en el pre-ARNm en el gen de la distrofina con oligómeros antisentido.
En base a este hallazgo, los presentes autores han logrado la presente invención.
Es decir, la presente invención es como sigue.
[1] Un oligómero antisentido que causa la omisión del exón 55° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 14° al 34° o 15° al 34°, desde el extremo 5' del exón 55° en el gen de la distrofina humana.
[2] El oligómero antisentido del párrafo [1], que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 157° al 177° y 157° al 176° de la SEQ ID NO: 5.
[3] Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 45° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 1° al 21°, desde el extremo 5' del exón 45° en el gen de la distrofina humana.
[4] El oligómero antisentido del párrafo [3], que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 156° al 176° de la SEQ ID NO: 6.
[5] Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 50° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 107° al 127°, desde el extremo 5' del exón 50° en el gen de la distrofina humana.
[6] El oligómero antisentido del párrafo [5], que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 3° al 23° de la SEQ ID NO: 7.
[7] Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 44° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 27° al 47° o 27° al 46°, desde el extremo 5' del exón 44° en el gen de la distrofina humana.
[8] El oligómero antisentido del párrafo [7], que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 102° al 122° y 103° al 122° de la SEQ ID NO: 8.
[9] El oligómero antisentido según uno cualquiera de los párrafos [1] a [8], que es un oligonucleótido.
[10] El oligómero antisentido según el párrafo [9], en donde está modificado el resto de azúcar y/o la región de unión a fosfato de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido.
[11] El oligómero antisentido según el párrafo [10], en donde el resto de azúcar de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido es una ribosa en la que el grupo 2'-OH está reemplazado por uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en OR, R , R'OR, SH, SR, NH2 , n Hr , NR2 , N3 , CN, F, Cl, Br e I (en donde R es un alquilo o un arilo y R' es un alquileno).
[12] El oligómero antisentido según el párrafo [10] u [11], en donde la región de unión a fosfato de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace fosforamidato y un enlace boranofosfato.
[13] El oligómero antisentido según uno cualquiera de los párrafos [1] a [8], que es un oligómero de morfolino.
[14] El oligómero antisentido según el párrafo [13], que es un oligómero de morfolino fosforodiamidato.
[15] El oligómero antisentido según el párrafo [13] o [14], en donde el extremo 5' es cualquiera de los grupos de fórmulas químicas (1) a (3) a continuación:
Figure imgf000005_0001
( 1 ) ( 2 ) (3 )
[16] Una composición farmacéutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligómero antisentido según uno cualquiera de los párrafos [1] a [15], o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
El oligómero antisentido de la presente invención puede inducir la omisión del exón 55, el exón 45, el exón 50 o el exón 44 en el gen de la distrofina humana con altas eficiencias. Además, los síntomas de la distrofia muscular de Duchenne se pueden aliviar eficazmente administrando la composición farmacéutica de la presente invención. Además, dado que el oligómero antisentido de la presente invención selecciona solo a secuencias de exón en pacientes, las secuencias diana se conservan entre los individuos en comparación con los casos con esas secuencias diana en intrones. Por lo tanto, el oligómero antisentido de la presente invención es capaz de lograr eficiencias de omisión excelentes independientemente de las variedades individuales (diferencias personales). Además, el oligómero antisentido de la presente invención tiene una longitud corta de 20 pb o alrededor y tiene menos probabilidad de contener mutaciones originadas de variedades individuales (interpersonalidad), p. ej. SNP, por sus siglas en inglés (polimorfismo de un solo nucleótido) en las secuencias diana en comparación con los oligómeros antisentido convencionales para el tratamiento de DMD que tienen longitudes de aproximadamente 25 pb. Esta característica también ayuda al oligómero antisentido de la presente invención a lograr eficiencias de omisión excelentes independientemente de la variedad individual (diferencias personales). Además, el oligómero antisentido de la presente invención tiene menos efectos secundarios provocados por la inducción de citocinas, etc., ya que los oligómeros antisentido que tienen cadenas más cortas tienen menos tendencia a inducir inmunidad en general.
Además, dado que el oligómero antisentido de la presente invención es bastante corto, el coste de fabricación es relativamente pequeño.
Breve descripción de los dibujos
FIG. 1 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 2 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 3 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 4 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 5 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por PMO en el gen de la distrofina humana en las células donde se induce el gen MyoD humano en fibroblastos de un paciente DMD humano (células GM05017) para inducir la diferenciación en células musculares.
FIG. 6 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 7 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 8 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 9 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 10 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por el oligómero de 2'-OMe-S-ARN en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 11 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 12 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 13 muestra la eficacia de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 14 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 15 muestra la eficacia de omisión del exón 45 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 16 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 17 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 18 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 19 muestra la eficacia de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en la línea celular de rabdomiosarcoma humano (células RD).
FIG. 20 muestra la eficacia de omisión del exón 44 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 21 muestra el efecto (Western Blotting) de omisión del exón 44 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 22 muestra el efecto (RT-PCR) de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 23 muestra la eficacia de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 24 muestra el efecto (RT-PCR) de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 25 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 45 (células GM05112).
FIG. 26 muestra el efecto (RT-PCR) de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de pacientes con DMD humana con duplicación de los exones 8-9 (células 11-0627).
FIG. 27 muestra la eficacia de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con duplicación de los exones 8-9 (células 11-0627).
FIG. 28 muestra el efecto (RT-PCR) de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción de los exones 51-55 (células GM04364).
FIG. 29 muestra la eficacia de omisión del exón 50 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción de los exones 51-55 (células GM04364).
FIG. 30 muestra el efecto (RT-PCR) de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 54 (células 04-035).
FIG. 31 muestra la eficacia de omisión del exón 55 por PMO en el gen de la distrofina humana en los fibroblastos de un paciente con DMD humana con deleción del exón 54 (células 04-035).
Mejor modo para realizar la invención
De aquí en adelante, la presente invención se describe en detalle. Las realizaciones descritas a continuación están destinadas a presentarse a modo de ejemplo simplemente para describir la invención, pero no se limitan solo a las siguientes realizaciones.
De aquí en adelante, la presente invención se describe en detalle. Las realizaciones descritas a continuación están destinadas a presentarse a modo de ejemplo simplemente para describir la invención, pero no se limitan solo a las siguientes realizaciones.
Sin una descripción en particular, la secuencia de aminoácidos representa el amino terminal como izquierdo y el carboxilo terminal como derecho, y la secuencia base representa el extremo 5' como izquierdo y el extremo 3' como derecho.
1. Oligómero antisentido
La presente invención proporciona el oligómero antisentido (de aquí en adelante denominado "oligómero de omisión del exón 55 de la presente invención") que provoca la omisión del exón 55 en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos (de aquí en adelante también denominada "secuencia diana del exón 55") que consiste en los nucleótidos 14° al 34°, o 15° al 34°, del extremo 5' del exón 55 en el gen de la distrofina humana.
La presente invención también proporciona el oligómero antisentido (de aquí en adelante denominado "oligómero de omisión del exón 45 de la presente invención") que provoca la omisión del exón 45 en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos (de aquí en adelante, también denominada "secuencia diana del exón 45") que consiste en los nucleótidos 1° al 21°, desde el extremo 5' del exón 45 en el gen de la distrofina humana.
Además, la presente invención proporciona el oligómero antisentido (de aquí en adelante denominado "oligómero de omisión del exón 50 de la presente invención") que provoca la omisión del exón 50 en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos (de aquí en adelante, también denominadas "secuencia diana del exón 50") que consisten en los nucleótidos 107° al 127°, desde el extremo 5' del exón 50 en el gen de la distrofina humana.
Además, la presente invención proporciona el oligómero antisentido (de aquí en adelante denominado "oligómero de omisión del exón 44 de la presente invención") que provoca la omisión del exón 44 en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos (de aquí en adelante, también denominadas "secuencia diana del exón 44") que consisten en los nucleótidos 27° al 46°, o 27° al 47, desde el extremo 5' del exón 44 en el gen de la distrofina humana.
De aquí en adelante, los oligómeros de omisión del exón 55, 45, 50 y 44 se pueden denominar colectivamente como los "oligómeros de la presente invención".
Exón 55, 45, 50 y 44 en el gen de la distrofina humana
En la presente invención, el término "gen" pretende significar un gen genómico y también incluye ADNc, precursor de ARNm y ARNm. Preferiblemente, el gen es precursor de ARNm, es decir, pre-ARNm.
En el genoma humano, el gen de la distrofina humana se localiza en el locus Xp21.2. El gen de la distrofina humana tiene un tamaño de 3.0 Mbp y es el gen más grande entre los genes humanos conocidos. Sin embargo, las regiones codificantes del gen de la distrofina humana son solo 14 kb, distribuidas como 79 exones en todo el gen de la distrofina humana (Roberts, RG, et al., Genomics, 16: 536-538 (1993)). El pre-ARNm, que es la transcripción del gen de la distrofina humana, se corta y empalma para generar ARNm maduro de 14 kb. Se conoce la secuencia de nucleótidos del gen de la distrofina de tipo salvaje humano (N° de acceso GenBank NM_004006).
La secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 2° al 190°, desde el extremo 5' del exón 55 en el gen de la distrofina humana de tipo salvaje está representada por la SEQ ID NO: 1. La secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 176°, desde el extremo 5' del exón 45 en el gen de la distrofina humana de tipo salvaje está representada por la SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109°, desde el extremo 5' del exón 50 y los nucleótidos 1° al 20°, desde el extremo 5' del intrón 50 en el gen de la distrofina humana de tipo salvaje está representada por la SEQ ID NO : 3.
La secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 148°, desde el extremo 5' del exón 44 en el gen de la distrofina humana de tipo salvaje está representada por la SEQ ID NO: 4.
El oligómero de la presente invención está diseñado para provocar la omisión del exón 55, 45, 50 o 44 en el gen de la distrofina humana, modificando así la proteína codificada por el tipo DMD del gen de la distrofina en el tipo BMD de la proteína de la distrofina. En consecuencia, los exones 55, 45, 50 y 44 en el gen de la distrofina que son las dianas de la omisión del exón por el oligómero de la presente invención incluyen los tipos tanto salvajes como mutantes.
Específicamente, los mutantes del exón 55, 45, 50 y 44 del gen de la distrofina humana son los polinucleótidos definidos en (a) o (b) a continuación.
(a) Un polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1 ), SEQ ID NO: 2 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109° de la SEQ ID NO : 3), o SEQ ID NO: 4;
(b) Un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90% de homología con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 2 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109° de SEQ ID NO: 3), o SEQ ID NO: 4.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido" pretende significar ADN o ARN.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "polinucleótido que se hibrida en condiciones rigurosas" se refiere, por ejemplo, a un polinucleótido obtenido por hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación Southern o similar, utilizando como sonda todo o parte de un polinucleótido que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 2 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2), SEQ ID NO: 3 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109 de la SEQ ID NO: 3), o SEQ ID NO: 4. El método de hibridación que se puede utilizar incluye métodos descritos en, por ejemplo, "Sambrook & Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor, Laboratory Press 2001", "Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997", etc.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia de nucleótidos complementaria" no se limita solo a secuencias de nucleótidos que forman pares de Watson-Crick con secuencias de nucleótidos diana, sino que también pretende incluir secuencias de nucleótidos que forman pares de bases oscilantes (Wobble). Como se utiliza en la presente memoria, el término par de Watson-Crick se refiere a un par de nucleobases en las que se forman enlaces de hidrógeno entre adenina-timina, adenina-uracilo o guanina-citosina, y el término par de bases oscilantes se refiere a un par de nucleobases en las que los enlaces de hidrógeno se forman entre guanina-uracilo, inosina-uracilo, inosinaadenina o inosina-citosina. Como se utiliza en la presente memoria, el término "secuencia de nucleótidos complementaria" no solo se refiere a una secuencia de nucleótidos 100% complementaria a la secuencia de nucleótidos diana sino que también se refiere a una secuencia de nucleótidos complementaria que puede contener, por ejemplo, 1 a 3, 1 a 2, o un nucleótido no complementario a la secuencia de nucleótidos diana.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "condiciones rigurosas" puede ser cualquiera de las condiciones de baja rigurosidad, condiciones de moderada rigurosidad o condiciones de alta rigurosidad. El término "condición de baja rigurosidad" es, por ejemplo, 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 0.5% de SDS, 50% de formamida a una temperatura de 32°C. El término "condición de moderada rigurosidad" es, por ejemplo, 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 0.5% de SDS, 50% de formamida a una temperatura de 42°C, o 5x SSC, 1% de SDS, Tris-HCl (pH 7.5) 50mM, 50% de formamida a una temperatura de 42°C. El término "condición de alta rigurosidad" es, por ejemplo, 5x SSC, 5x solución de Denhardt, 0.5% de SDS, 50% de formamida a una temperatura de 50°C o 0,2x SSC, 0,1% de SDS a una temperatura de 65°C. En estas condiciones, se espera que los polinucleótidos con mayor homología se obtengan eficientemente a temperaturas más altas, aunque están involucrados múltiples factores en la rigurosidad de la hibridación, que incluye la temperatura, la concentración de la sonda, la longitud de la sonda, la fuerza iónica, el tiempo, la concentración de sal y otros, y los expertos en la técnica pueden seleccionar aproximadamente estos factores para lograr una rigurosidad similar.
Cuando se utilizan kits disponibles comercialmente para la hibridación, por ejemplo, se puede utilizar un sistema Alkphos de marcaje y detección directo (GE Healthcare). En este caso, según el protocolo adjunto, después del cultivo con una sonda marcada durante la noche, la membrana se lava con un tampón de lavado primario que contiene 0.1% de SDS (p/v) a una temperatura de 55°C, detectando así los polinucleótidos hibridados. Alternativamente, cuando la sonda se marca con digoxigenina (DIG) utilizando un reactivo disponible comercialmente (p. ej., una mezcla de marcaje de PCR (Roche Diagnostics), etc.) para producir una sonda basada en toda o parte de la secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 2 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2 ), SEQ ID NO: 3 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109° de la SEQ ID NO: 3), o SEQ ID NO: 4, la hibridación se puede detectar con un kit de detección de ácido nucleico DIG (Roche Diagnostics).
Además de los polinucleótidos descritos anteriormente, otros polinucleótidos que se pueden hibridar incluyen polinucleótidos que tienen 90% o superior, 91% o superior, 92% o superior, 93% o superior, 94% o superior, 95% o superior, 96% o superior, 97% o superior, 98% o superior, 99% o superior, 99.1% o superior, 99.2% o superior, 99.3% o superior, 99.4% o superior, 99.5% o superior, 99.6% o superior, 99.7% o superior, 99.8% o superior, 99.9% o superior identidad con el polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 2 (o un secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2), Se Q ID NO: 3 (o una secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109° de la SEQ ID NO: 3), o SEQ ID NO: 4 , según lo calculado por el software de búsqueda de homología BLAST utilizando los parámetros predeterminados.
La identidad entre las secuencias de nucleótidos se puede determinar utilizando el algoritmo BLAST, por sus siglas en inglés (herramienta de búsqueda de alineación local básica) por Karlin y Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 872264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873, 1993). Se han desarrollado programas llamados BLASTN y BLASTX basados en el algoritmo BLAST (Altschul SF, et al.: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). Cuando se secuencia una secuencia de nucleótidos utilizando BLASTN, los parámetros son, por ejemplo, puntaje=100 y longitud de palabra=12. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se emplean los parámetros predeterminados para cada programa.
La secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 2° al 190° desde el extremo 5' del exón 55 está representada por la SEQ ID NO: 5. En la presente memoria, la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 2° al 1°, desde el extremo 5' del exón 55 (la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 2° de la SEQ ID NO: 1) representa la secuencia de nucleótidos que consiste en 2 nucleótidos como máximo en el extremo 3' secuencia abajo del intrón 54 que se encuentra entre el exón 54 y el exón 55. Más específicamente, la secuencia de nucleótidos del exón 55 es una que consiste en los nucleótidos 3° al 192° de la SEQ ID NO: 1 y la secuencia complementaria al exón 55 es una que consiste en los nucleótidos 1° al 190° de la SEQ ID En la presente memoria, la secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 14° al 34°, o del 15° al 34°, desde el extremo 5' del exón 55° en el gen de la distrofina humana es respectivamente idéntica a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 157° al 177°, o del 157° al 176° de la SEQ ID NO: 5.
La secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 176°, desde el extremo 5' del exón 45 está representada por la SEQ ID NO: 6. En la presente memoria, la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 1° , desde el extremo 5' del exón 45 (la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 3° de la SEQ ID NO: 2) representa la secuencia de nucleótidos que consiste en 3 nucleótidos como máximo en el extremo 3' secuencia abajo del intrón 44 que se encuentra entre el exón 44 y el exón 45. Más específicamente, la secuencia de nucleótidos del exón 45 es la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 4° al 179° de la SEQ ID NO: 2 y la secuencia complementaria al exón 45 es la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 176° de la SEQ ID NO: 6.
En la presente memoria, la secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 1° al 21°, desde el extremo 5' del exón 45° en el gen de la distrofina humana es, respectivamente, idéntica a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 156° a 176° de la SEQ ID NO: 6.
La secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109°, desde el extremo 5' del exón 50, y los nucleótidos 1° al 20°, desde el extremo 5' del intrón 50, está representada por la SEQ ID NO: 7. En la presente memoria, la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 20°, desde el extremo 5' del intrón 50 (la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 110° al 129° de la SEQ ID NO: 3) es la secuencia de nucleótidos que consiste en 20 nucleótidos como máximo en el extremo 5' secuencia arriba del intrón 50 que se encuentra entre el exón 50 y el exón 51. Más específicamente, la secuencia de nucleótidos del exón 50 es la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 109° de la SEQ ID NO: 3 y la secuencia complementaria al exón 50 es la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 21° al 129° de la SEQ ID NO: 7.
En la presente memoria, la secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 107° al 127°, desde el extremo 5' del exón 50° en el gen de la distrofina humana es respectivamente idéntica a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 3° al 23° de la SEQ ID NO: 7.
La secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 1° al 148, desde el extremo 5' del exón 44 está representada por la SEQ ID NO: 8.
En la presente memoria, la secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 27° al 46°, o 27° al 47°, desde el extremo 5' del exón 44° en el gen de la distrofina humana es respectivamente idéntica a la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos 103° al 122°, o el 102° al 122° de la SEQ ID NO: 8.
La relación entre la localización en la secuencia de nucleótidos desde el extremo 5' del exón 55°, 45°, 50° y 44° y la localización en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5-8 se representa en las tablas siguientes
Tabla 1
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Tabla 2
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Tabla 3
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Tabla 4
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Figure imgf000016_0001
Se prefiere que el oligómero de omisión del exón 55 de la presente invención consista en una secuencia complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 14° al 34° o 15° al 34°, desde el extremo 5' del exón 55° en el gen de la distrofina humana (p. ej., una cualquiera de las secuencias que consisten en los 157° al 177° o 157° al 176° de la SEQ ID NO: 5).
Se prefiere que el oligómero de omisión del exón 45 de la presente invención consista en una secuencia complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 1° al 21°, desde el extremo 5' del exón 45° en el gen de la distrofina humana (p. ej., cualquiera de las secuencias que consisten en los nucleótidos 156° al 176° de la SEQ ID NO: 6).
Se prefiere que el oligómero de omisión del exón 50 de la presente invención consista en una secuencia complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 107° al 127°, desde el extremo 5' del exón 50° en el gen de la distrofina humana (p. ej., una cualquiera de las secuencias que consisten en los nucleótidos 3° al 23° de la SEQ ID NO: 7).
Se prefiere que el oligómero de omisión del exón 44 de la presente invención consista en una secuencia complementaria a una cualquiera de las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 27° al 47° o 27° a 46°, desde el extremo 5' del exón 44° en el gen de la distrofina humana (p. ej., una cualquiera de las secuencias que consisten en los nucleótidos 117° al 138°, el 104° al 124°, el 103° al 123°, el 102° al 123° o el 102° al 122° o el 103° al 122° de la SEQ ID NO: 8).
El término "causar omisión del exón 55° en el gen de la distrofina humana" significa que mediante la unión del oligómero de la presente invención al sitio correspondiente al exón 55 del transcrito (p. ej., pre-ARNm) del gen de la distrofina humana , por ejemplo, la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' del exón 56 está ligada al lado 3' de la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 3' del exón 53 en pacientes con DMD con deleción del exón 54 cuando se corta y empalma el transcrito, resultando así en la formación de ARNm maduro que está libre de cambio de marco de codón.
El término "causar omisión del exón 45° en el gen de la distrofina humana" significa que mediante la unión del oligómero de la presente invención al sitio correspondiente al exón 45 del transcrito (p. ej., pre-ARNm) del gen de la distrofina humana , por ejemplo, la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' del exón 46 se liga al lado 3' de la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 3' del exón 43 en pacientes con DMD con deleción del exón 44 cuando se corta y empalma el transcrito, resultando así en la formación de ARNm maduro que está libre de cambio de marco de codón.
El término "causar omisión del exón 50° en el gen de la distrofina humana" significa que mediante la unión del oligómero de la presente invención al sitio correspondiente al exón 50 del transcrito (p. ej., pre-ARNm) del gen de la distrofina humana, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' del exón 52 está ligada al lado 3' de la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 3' del exón 49 en pacientes con DMD con deleción del exón 51 cuando se corta y empalma el transcrito, resultando así en la formación de ARNm maduro que está libre de cambio de marco de codón.
El término "causar omisión del exón 44° en el gen de la distrofina humana" significa que mediante la unión del oligómero de la presente invención al sitio correspondiente al exón 44 del transcrito (p. ej., pre-ARNm) del gen de la distrofina humana, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 5' del exón 46 está ligada al lado 3' de la secuencia de nucleótidos correspondiente al extremo 3' del exón 43 en pacientes con DMD con deleción del exón 45 cuando se corta y empalma el transcrito, resultando así en la formación de ARNm maduro que está libre de cambio de marco de codon.
Por consiguiente, no es necesario que el oligómero de la presente invención tenga una secuencia de nucleótidos 100% complementaria a cada secuencia diana, en la medida en que provoque la omisión del exón 55, 45, 50 o 44 en el gen de la distrofina humana. El oligómero de la presente invención puede incluir, por ejemplo, 1 a 3, 1 o 2, o un nucleótido no complementario a la secuencia diana.
En la presente memoria, el término "unión" descrito anteriormente significa que cuando el oligómero de la presente invención se mezcla con el transcrito del gen de la distrofina humana, ambos se hibridan en condiciones fisiológicas para formar una doble cadena. El término "en condiciones fisiológicas" se refiere a condiciones establecidas para imitar el entorno in vivo en términos de pH, composición salina y temperatura. Las condiciones son, por ejemplo, 25 a 40°C, preferiblemente 37°C, pH 5 a 8, preferiblemente pH 7.4 y concentración de cloruro de sodio 15o mM.
Si la omisión del exón 55, 45, 50 o 44 en el gen de la distrofina humana es causado o no se puede confirmar mediante la introducción del oligómero de la presente invención en una célula que expresa distrofina (p. ej., células de rabdomiosarcoma humano), amplificando la región que rodea al exón 55, 45, 50 o 44 de ARNm del gen de la distrofina humana por RT-PCR a partir del ARN total de la célula que expresa la distrofina y realizando un análisis de secuencia o PCR anidado en el producto amplificado por PCR.
La eficiencia de omisión se puede determinar de la siguiente manera. El ARNm para el gen de la distrofina humana se recolecta de las células de prueba; en el ARNm, se mide el nivel de polinucleótido "A" de la banda donde se omite el exón 55, 45, 50 o 44 y se mide el nivel de polinucleótido "B" de la banda donde no se omite el exón 55, 45, 50 o 44. Utilizando estos valores de medición de "A" y "B", la eficacia se calcula mediante la siguiente ecuación:
Eficacia de omisión (%) = A/(A+B) x100
El oligómero de la presente invención incluye, por ejemplo, un oligonucleótido, oligómero de morfolino o ácido nucleico peptídico (PNA, por sus siglas en inglés), que tiene una longitud de 18 a 28 nucleótidos. La longitud es preferiblemente de 15 a 30 nucleótidos o de 20 a 25 nucleótidos y se prefieren los oligómeros de morfolino.
El oligonucleótido descrito anteriormente (de aquí en adelante denominado "el oligonucleótido de la presente invención") es el oligómero de la presente invención compuesto de nucleótidos como unidades constituyentes. Tales nucleótidos pueden ser cualquiera de los ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados.
El nucleótido modificado se refiere a uno que tiene nucleobases, restos de azúcar y/o regiones de unión a fosfato modificadas total o parcialmente, que constituyen el ribonucleótido o desoxirribonucleótido.
La nucleobase incluye, por ejemplo, adenina, guanina, hipoxantina, citosina, timina, uracilo y bases modificadas de los mismos. Los ejemplos de tales nucleobases modificadas incluyen, pero no se limitan a, pseudouracilo, 3-metiluracilo, dihidrouracilo, 5-alquilcitosinas (p. ej., 5-metilcitosina), 5-alquiluracilos (p. ej., 5-etiluracilo), 5-halouracilos (5-bromouracilo), 6-azapirimidina, 6-alquilpirimidinas (6-metiluracilo), 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil) uracilo, 5'-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, 1-metiladenina, 1-metilhipoxantina, 2,2-dimetilguanina, 3-metilcitosina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5-metilaminometiluracilo, 5-metilcarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, 2-tiocitosina, purina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, isoguanina, indol, imidazol, xantina, etc.
La modificación del resto de azúcar puede incluir, por ejemplo, modificaciones en la posición 2' de ribosa y modificaciones de las otras posiciones del azúcar. La modificación en la posición 2' de ribosa incluye el reemplazo del 2'-OH de ribosa con OR, R, R'OR, SH, SR, NH2, NHR, NR2, N3 , CN, F, Cl, Br o I, en donde R representa un alquilo o un arilo y R' representa un alquileno.
La modificación para las otras posiciones del azúcar incluye, por ejemplo, el reemplazo de O en la posición 4' de ribosa o desoxirribosa con S, con puente entre las posiciones 2' y 4' del azúcar, p. ej., LNA, por sus siglas en inglés (ácido nucleico bloqueado) o ENA (ácidos nucleicos con puentes de 2'-O, 4'-C-etileno), pero no se limita a los mismos.
Una modificación de la región de unión a fosfato incluye, por ejemplo, una modificación de reemplazar el enlace fosfodiéster con enlace fosforotioato, enlace fosforoditioato, enlace fosfonato de alquilo, enlace fosforoamidato o enlace boranofosfato (Enya et al: Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2008, 18, 9154 -9160) (consúltese, p. ej., Re­ publicaciones nacionales japonesas de solicitudes PCT nums. 2006/129594 y 2006/038608).
El alquilo es preferiblemente un alquilo lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, ferc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, ferc-pentilo, n-hexilo e isohexilo. El alquilo puede estar opcionalmente sustituido. Ejemplos de tales sustituyentes son un halógeno, un alcoxi, ciano y nitro. El alquilo puede estar sustituido con 1 a 3 sustituyentes. El cicloalquilo es preferiblemente un cicloalquilo que tiene de 5 a 12 átomos de carbono. Ejemplos específicos incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo, ciclodecilo y ciclododecilo.
El halógeno incluye flúor, cloro, bromo y yodo.
El alcoxi es un alcoxi lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, como metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, isobutoxi, sec-butoxi, ferc-butoxi, n-pentiloxi, isopentiloxi, n-hexiloxi, isohexiloxi, etc. Entre otros, se prefiere un alcoxi que tenga de 1 a 3 átomos de carbono.
El arilo es preferiblemente un arilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono. Ejemplos específicos incluyen fenilo, anaftilo y p-naftilo. Entre otros, se prefiere fenilo. El arilo puede estar opcionalmente sustituido. Ejemplos de tales sustituyentes son un alquilo, un halógeno, un alcoxi, ciano y nitro. El arilo puede estar sustituido con uno a tres de tales sustituyentes.
El alquileno es preferiblemente un alquileno lineal o ramificado que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Los ejemplos específicos incluyen metileno, etileno, trimetileno, tetrametileno, pentametileno, hexametileno, 2-(etil) trimetileno y 1-(metil) tetrametileno.
El acilo incluye un alcanoilo o aroilo lineal o ramificado. Los ejemplos del alcanoilo incluyen formilo, acetilo, 2-metilacetilo, 2,2-dimetilacetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, pentanoilo, 2,2-dimetilpropionilo, hexanoilo, etc. Los ejemplos del aroilo incluyen benzoilo, toluoilo y naftoilo. El aroilo puede estar opcionalmente sustituido en posiciones sustituibles y puede estar sustituido con uno o más alquilos.
Preferiblemente, el oligonucleótido de la presente invención es el oligómero de la presente invención que contiene una unidad constituyente representada por la fórmula general a continuación en donde el grupo -OH en la posición 2' de ribosa está sustituido con metoxi y la región de unión a fosfato es un enlace fosforotioato:
Figure imgf000018_0001
en donde Base representa una nucleobase.
El oligonucleótido de la presente invención se puede sintetizar fácilmente utilizando diversos sintetizadores automáticos (p. ej., AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare)). Alternativamente, la síntesis también puede confiarse a una organización de terceros (p. ej., Promega Inc. o Takara Co.), etc.
El oligómero morfolino de la presente invención es el oligómero de la presente invención que comprende la unidad constituyente representada por la fórmula general a continuación:
Figure imgf000018_0002
en donde Base tiene el mismo significado que el definido anteriormente, y
W representa un grupo mostrado por cualquiera de los siguientes grupos:
Figure imgf000019_0001
en donde X representa -CH2R1, -OCH2R1, -S-CH2R1, -NR2R3 o F;
R1 representa H o un alquilo;
R2 y R3, que pueden ser iguales o diferentes, cada uno representa H, un alquilo, un cicloalquilo o un arilo;
Y1 representa O, S, CH2 o NR1;
Y2 representa O, S o NR1;
Z representa O o S.
Preferiblemente, el oligómero de morfolino es un oligómero que comprende una unidad constituyente representada por la fórmula general a continuación (oligómero de morfolino fosforodiamidato (de aquí en adelante denominado "PMO").
Figure imgf000019_0002
en donde Base, R2 y R3 tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
El oligómero de morfolino se puede producir de acuerdo con, p. ej., el documento WO 1991/009033 o WO 2009/064471. En particular, el PMO se puede producir mediante el procedimiento descrito en el documento WO 2009/064471 o mediante el método que se muestra a continuación.
Método para producir PMO
Una realización de PMO es, por ejemplo, el compuesto representado por la fórmula general (I) a continuación (de aquí en adelante PMO (I)).
Figure imgf000019_0003
en donde Base, R2 y R3 tienen el mismo significado que el definido anteriormente; y, n es un número entero entre 1 a 99, preferiblemente un número entero entre 18 a 28.
El PMO (I) se puede producir de acuerdo con un método conocido, por ejemplo, se puede producir realizando los procedimientos en las siguientes etapas.
Los compuestos y reactivos utilizados en las etapas a continuación no están particularmente limitados siempre que se utilicen comúnmente para preparar PMO.
Además, las siguientes etapas se pueden llevar a cabo mediante el método de fase líquida o el método de fase sólida (utilizando manuales o sintetizadores automáticos de fase sólida disponibles comercialmente). Al producir PMO por el método de fase sólida, se desea utilizar sintetizadores automáticos en vista de procedimientos de operación simples y síntesis precisa.
( I) Etapa A:
El compuesto representado por la fórmula general (II) a continuación (de aquí en adelante denominado Compuesto (II) ) se hace reaccionar con un ácido para preparar el compuesto representado por la fórmula general (III) a continuación (de aquí en adelante denominado Compuesto (III)):
Figure imgf000020_0001
cada BP representa independientemente una nucleobase que se puede proteger opcionalmente;
T representa tritilo, monometoxitritilo o dimetoxitritilo; y,
L representa hidrógeno, un acilo o un grupo representado por la fórmula general (IV) a continuación (de aquí en adelante denominado grupo (IV)).
portador sólido
Figure imgf000020_0002
enlazador
Figure imgf000020_0003
La "nucleobase" para BP incluye la misma "nucleobase" que, en la Base, siempre que el grupo amino o hidroxi en la nucleobase mostrado por BP se pueda proteger.
Tal grupo protector para amino no está particularmente limitado siempre que se utilice como grupo protector para ácidos nucleicos. Los ejemplos específicos incluyen benzoilo, 4-metoxibenzoilo, acetilo, propionilo, butirilo, isobutirilo, fenilacetilo, fenoxiacetilo, 4-terc-butilfenoxiacetilo, 4-isopropilfenoxiacetilo y (dimetilamino)metileno. Los ejemplos específicos del grupo protector para el grupo hidroxi incluyen 2-cianoetilo, 4-nitrofeniletilo, fenilsulfoniletilo, metilsulfoniletilo y trimetilsililetilo y fenilo, que pueden estar sustituidos por 1 a 5 grupos aceptores de electrones en posiciones sustituibles opcionales, difenilcarbamoilo, dimetilcarbamoilo, dietilcarbamoilo, metilfenilcarbamoilo, 1-pirolidinilcarbamoilo, morfolinocarbamoilo, 4-(terc-butilcarboxi) bencilo, 4-[(dimetilamino)carboxi]bencilo y 4­ (fenilcarboxi)bencilo, (consúltese, p. ej., el documento WO 2009/064471).
El "portador sólido" no está particularmente limitado siempre que sea un portador utilizable para la reacción en fase sólida de ácidos nucleicos. Se desea que el portador sólido tenga las siguientes propiedades: p. ej., (i) es escasamente soluble en reactivos que se pueden utilizar para la síntesis de morfolino derivado de ácido nucleico (p. ej., diclorometano, acetonitrilo, tetrazol, N-metilimidazol, piridina, anhídrido acético, lutidina, ácido trifluoroacético); (ii) es químicamente estable a los reactivos utilizables para la síntesis de morfolino derivado de ácido nucleico; (iii) se puede modificar químicamente; (iv) se puede cargar con morfolino derivado de ácido nucleico deseados; (v) tiene una resistencia suficiente para soportar alta presión a través de tratamientos; y (vi) tiene un intervalo y distribución de diámetro de partícula uniforme. Específicamente, poliestireno hinchable (p. ej., resina de aminometil poliestireno 1% dibencilbenceno reticulado (malla 200-400) (2.4-3.0 mmol/g) (fabricado por Tokyo Chemical Industry), resina de poliestireno aminometilado HCl [dibencilbenceno 1%, malla 100-200] (fabricado por Peptide Institute, Inc.)), poliestireno no hinchable (p. ej., Primer Support (fabricado por GE Healthcare)), poliestireno unido a la cadena PEG (p. ej., resina NH2-PEG (fabricado por Watanabe Chemical Co.), resina TentaGel), vidrio de poro controlado (vidrio de poro controlado; CPG) (fabricado por, p. ej., CPG), vidrio de poro controlado por oxalilo (consúltese, p. ej., Alul et al., Nucleic Acids Research, Vol. 19, 1527 (1991)), Soporte TentaGel-soporte obtenido a partir de aminopolietilenglicol (consúltese, p. ej., Wright et al., Tetrahedron Letters, Vol. 34, 3373 (1993)), y un copolímero de Porospoliestireno/divinilbenceno.
Un "enlazador" que se puede utilizar es un enlazador conocido generalmente utilizado para conectar ácidos nucleicos o morfolino derivado de ácido nucleico. Los ejemplos incluyen 3-aminopropilo, succinilo, 2,2'-dietanolsulfonilo y un alquil amino de cadena larga (LCAA, por sus siglas en inglés).
Esta etapa se puede realizar haciendo reaccionar el Compuesto (II) con un ácido.
El "ácido" que se puede utilizar en esta etapa incluye, por ejemplo, ácido trifluoroacético, ácido dicloroacético y ácido tricloroacético. El ácido utilizado está apropiadamente en un intervalo de, por ejemplo, 0.1 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares basados en 1 mol de Compuesto (II), preferiblemente en un intervalo de 1 equivalente molar a 100 equivalentes molares basados en 1 mol de Compuesto (II).
Se puede utilizar una amina orgánica en combinación con el ácido descrito anteriormente. La amina orgánica no está particularmente limitada e incluye, por ejemplo, trietilamina. La cantidad de la amina orgánica utilizada está apropiadamente en un intervalo de, p. ej., 0.01 equivalentes molares a 10 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 0.1 equivalentes molares a 2 equivalentes molares, basado en 1 mol del ácido.
Cuando se utiliza una sal o mezcla del ácido y la amina orgánica en esta etapa, la sal o mezcla incluye, por ejemplo, una sal o mezcla de ácido trifluoroacético y trietilamina, y más específicamente, una mezcla de 1 equivalente de trietilamina y 2 equivalentes de ácido trifluoroacético.
El ácido que se puede utilizar en esta etapa también se puede utilizar en forma de dilución con un disolvente apropiado en una concentración de 0.1% a 30%. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que es inerte a la reacción, e incluye, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, un alcohol (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua o una mezcla de los mismos.
La temperatura de reacción en la reacción descrita anteriormente está preferiblemente en un intervalo de, p. ej., 10°C a 50°C, más preferiblemente, en un intervalo de 20°C a 40°C, y lo más preferiblemente, en un intervalo de 25°C a 35°C.
El tiempo de reacción puede variar dependiendo del tipo de ácido utilizado y la temperatura de reacción, y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 minutos a 24 horas en general, y preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
Después de completar esta etapa, se puede añadir una base, si es necesario, para neutralizar el ácido que permanece en el sistema. La "base" no está particularmente limitada e incluye, por ejemplo, diisopropilamina. La base también se puede utilizar en forma de una dilución con un disolvente apropiado en una concentración de 0.1% (v/v) a 30% (v/v).
El disolvente utilizado en esta etapa no está particularmente limitado siempre que sea inerte a la reacción e incluye diclorometano, acetonitrilo, un alcohol (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua y una mezcla de los mismos. La temperatura de reacción está preferiblemente en un intervalo de, p. ej., 10°C a 50°C, más preferiblemente, en un intervalo de 20°C a 40°C, y lo más preferiblemente, en un intervalo de 25°C a 35°C.
El tiempo de reacción puede variar dependiendo del tipo de base utilizada y la temperatura de reacción, y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 minutos a 24 horas en general, y preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
En el Compuesto (II), el compuesto de fórmula general (IIa) a continuación (de aquí en adelante Compuesto (IIa)), en donde n es 1 y L es un grupo (IV), se puede producir mediante el siguiente procedimiento.
Figure imgf000021_0001
en donde BP, T, enlazador y portador sólido tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Etapa 1:
El compuesto representado por la fórmula general (V) a continuación se hace reaccionar con un agente acilante para preparar el compuesto representado por la fórmula general (VI) a continuación (de aquí en adelante denominado Compuesto (VI)).
Figure imgf000022_0001
en donde BP, T y enlazador tienen el mismo significado que el definido anteriormente; y, R4 representa hidroxi, un halógeno o amino.
Esta etapa se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos para introducir enlazadores, utilizando el Compuesto (V) como material de partida.
En particular, el compuesto representado por la fórmula general (VIa) a continuación se puede producir realizando el método conocido como esterificación, utilizando el Compuesto (V) y anhídrido succínico.
Figure imgf000022_0002
en donde BP y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Etapa 2:
El Compuesto (VI) se hace reaccionar con un portador sólido por un agente de condensación para preparar el Compuesto (IIa).
Figure imgf000022_0003
en donde BP, R4, T, enlazador y portador sólido tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Esta etapa se puede realizar utilizando el Compuesto (VI) y un portador sólido de acuerdo con un método conocido como reacción de condensación.
En el Compuesto (II), el compuesto representado por la fórmula general (IIa2) a continuación en donde n es de 2 a 99 y L es un grupo representado por la fórmula general (IV) se puede producir utilizando el Compuesto (IIa) como el material de partida y repitiendo la etapa A y la etapa B del método de producción de PMO descrito en la especificación durante un número deseado de veces.
Figure imgf000023_0001
en donde BP, R2, R3, T, enlazador y portador sólido tienen el mismo significado que el definido anteriormente; y, n' representa 1 a 98.
En el Compuesto (II), el compuesto de fórmula general (IIb) a continuación en donde n es 1 y L es hidrógeno se puede producir mediante el procedimiento descrito en, p. ej., el documento WO 1991/009033.
Figure imgf000023_0002
en donde BP y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
En el Compuesto (II), el compuesto representado por la fórmula general (IIb2) a continuación en donde n es de 2 a 99 y L es hidrógeno se puede producir utilizando el Compuesto (IIb) como material de partida y repitiendo la etapa A y la etapa B del método de producción de PMO descrito en la especificación para un número deseado de veces.
Figure imgf000023_0003
en donde BP, n', R2, R3 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
En el Compuesto (II), el compuesto representado por la fórmula general (IIc) a continuación en donde n es 1 y L es un acilo se puede producir realizando el procedimiento conocido como reacción de acilación, utilizando el Compuesto (IIb).
Figure imgf000023_0004
en donde BP y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente; y,
R5 representa un acilo.
En el Compuesto (II), el compuesto representado por la fórmula general (IIc2) a continuación en donde n es de 2 a 99 y L es un acilo se puede producir utilizando el Compuesto (IIc) como material de partida y repitiendo las etapas A y B del método de producción de PMO descrito en la especificación para un número deseado de veces.
Figure imgf000024_0001
en donde BP, n', R2, R3, R5 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
(2) Etapa B
El compuesto (III) se hace reaccionar con un compuesto de monómero de morfolino en presencia de una base para preparar el compuesto representado por la fórmula general (VII) a continuación (de aquí en adelante denominado Compuesto (VII)):
Figure imgf000024_0002
Esta etapa se puede realizar haciendo reaccionar el Compuesto (III) con el compuesto de monómero de morfolino en presencia de una base.
El compuesto de monómero de morfolino incluye, por ejemplo, compuestos representados por la fórmula general (VIII) a continuación:
Figure imgf000024_0003
en donde BP, R2, R3 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
La "base" que se puede utilizar en esta etapa incluye, por ejemplo, diisopropilamina, trietilamina y N-etilmorfolina. La cantidad de la base utilizada está apropiadamente en un intervalo de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares basado en 1 mol de Compuesto (III), preferiblemente, 10 equivalentes molares a 100 equivalentes molares basado en 1 mol de Compuesto (III).
El compuesto de monómero de morfolino y la base que se pueden utilizar en esta etapa también se pueden utilizar como una dilución con un disolvente apropiado en una concentración de 0.1% a 30%. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que es inerte para la reacción, e incluye, por ejemplo, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, DMF, diclorometano, acetonitrilo, tetrahidrofurano o una mezcla de los mismos.
La temperatura de reacción está preferiblemente en un intervalo de, p. ej., 0°C a 100°C, y más preferiblemente, en un intervalo de 10°C a 50°C.
El tiempo de reacción puede variar dependiendo del tipo de base utilizada y la temperatura de reacción, y está apropiadamente en un intervalo de 1 minuto a 48 horas en general, y preferiblemente en un intervalo de 30 minutos a 24 horas.
Además, después de completar esta etapa, se puede añadir un agente acilante, si es necesario. El "agente acilante" incluye, por ejemplo, anhídrido acético, cloruro de acetilo y anhídrido fenoxiacético. El agente acilante también se puede utilizar como una dilución con un disolvente apropiado en una concentración de 0.1% a 30%. El disolvente no está particularmente limitado en la medida en que es inerte a la reacción, e incluye, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo, un alcohol o alcoholes (etanol, isopropanol, trifluoroetanol, etc.), agua o una mezcla de los mismos. Si es necesario, una base tal como piridina, lutidina, colidina, trietilamina, diisopropiletilamina, N-etilmorfolina, etc. también se puede utilizar en combinación con el agente acilante. La cantidad del agente acilante está apropiadamente en un intervalo de 0.1 equivalentes molares a 10000 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 1 equivalente molar a 1000 equivalentes molares. La cantidad de la base está apropiadamente en un intervalo de, p. ej., 0.1 equivalentes molares a 100 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 1 equivalente molar a 10 equivalentes molares, basado en 1 mol del agente acilante.
La temperatura de reacción en esta reacción está preferiblemente en un intervalo de 10°C a 50°C, más preferiblemente, en un intervalo de 10°C a 50°C, mucho más preferiblemente, en un intervalo de 20°C a 40°C, y lo más preferiblemente, en un intervalo de 25°C a 35°C. El tiempo de reacción puede variar dependiendo del tipo de agente acilante utilizado y la temperatura de reacción, y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 minutos a 24 horas en general, y preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 5 horas.
(3) Etapa C:
En el Compuesto (VII) producido en la Etapa B, el grupo protector se retira utilizando un agente desprotector para preparar el compuesto representado por la fórmula general (IX).
Figure imgf000025_0001
en donde Base, BP, L, n, R2, R3 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Esta etapa se puede realizar haciendo reaccionar el Compuesto (VII) con un agente desprotector.
El "agente desprotector" incluye, p. ej., agua de amoniaco concentrada y metilamina. El "agente desprotector" utilizado en esta etapa también se puede utilizar como una dilución con, p. ej., agua, metanol, etanol, alcohol isopropílico, acetonitrilo, tetrahidrofurano, DMF, N,N-dimetilimidazolidona, N-metilpiperidona, o una mezcla de estos disolventes. Entre otros, se prefiere el etanol. La cantidad del agente desprotector utilizado está apropiadamente en un intervalo de, p. ej., 1 equivalente molar a 100000 equivalentes molares, y preferiblemente en un intervalo de 10 equivalentes molares a 1000 equivalentes molares, basado en 1 mol del Compuesto (VII).
La temperatura de reacción está apropiadamente en un intervalo de 15°C a 75°C, preferiblemente, en un intervalo de 40°C a 70°C, y más preferiblemente, en un intervalo de 50°C a 60°C. El tiempo de reacción para la desprotección puede variar dependiendo del tipo de Compuesto (VII), temperatura de reacción, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 10 minutos a 30 horas, preferiblemente de 30 minutos a 24 horas, y más preferiblemente en un intervalo de 5 horas a 20 horas.
(4) Etapa D:
El PMO (I) se produce haciendo reaccionar el Compuesto (IX) producido en la etapa C con un ácido:
Figure imgf000026_0001
en donde Base, n, R2, R3 y T tienen el mismo significado que el definido anteriormente.
Esta etapa se puede realizar añadiendo un ácido al Compuesto (IX).
El "ácido" que se puede utilizar en esta etapa incluye, por ejemplo, ácido tricloroacético, ácido dicloroacético, ácido acético, ácido fosfórico, ácido clorhídrico, etc. El ácido utilizado se utiliza apropiadamente para permitir que la solución tenga un intervalo de pH de 0.1 a 4.0, y más preferiblemente, en un intervalo de pH 1.0 a 3.0. El disolvente no está particularmente limitado siempre que sea inerte para la reacción, e incluye, por ejemplo, acetonitrilo, agua o una mezcla de estos disolventes del mismo.
La temperatura de reacción está apropiadamente en un intervalo de 10°C a 50°C, preferiblemente, en un intervalo de 20°C a 40°C, y más preferiblemente, en un intervalo de 25°C a 35°C. El tiempo de reacción para la desprotección puede variar dependiendo del tipo de Compuesto (IX), temperatura de reacción, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 minutos a 5 horas, preferiblemente de 1 minuto a 1 hora, y más preferiblemente en un intervalo de 1 minuto a 30 minutos.
El PMO (I) se puede obtener sometiendo la mezcla de reacción obtenida en este etapa a medios convencionales de separación y purificación tales como extracción, concentración, neutralización, filtración, separación centrífuga, recristalización, cromatografía en columna de fase inversa C8 a C i8, cromatografía en columna de intercambio catiónico, cromatografía en columna de intercambio aniónico, cromatografía en columna de filtración en gel, cromatografía líquida de alto rendimiento, diálisis, ultrafiltración, etc., sola o en combinación. Por lo tanto, el PMO deseado (I) se puede aislar y purificar (consúltese, p. ej., el documento WO 1991/09033).
En la purificación de PMO (I) utilizando cromatografía de fase inversa, p. ej., se puede utilizar una mezcla de solución tampón de trietilamina/acetato 20 mM y acetonitrilo como disolvente de elución.
En la purificación de PMO (I) utilizando cromatografía de intercambio iónico, p. ej., una mezcla de solución de solución salina 1 M y solución acuosa de hidróxido de sodio 10 mM se puede utilizar como disolvente de elución.
Un ácido nucleico peptídico es el oligómero de la presente invención que tiene un grupo representado por la siguiente fórmula general como la unidad constituyente:
Base
Figure imgf000026_0002
en donde Base tiene el mismo significado que el definido anteriormente.
Los ácidos nucleicos peptídicos se pueden preparar haciendo referencia, p. ej., a las siguientes publicaciones. 1) P. E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg, O. Buchardt, Science, 254, 1497 (1991)
2) M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, R. H. Berg, Jacs., 114, 1895 (1992)
3) K. L. Dueholm, M. Egholm, C. Behrens, L. Christensen, H. F. Hansen, T. Vulpius, K. H. Petersen, R. H. Berg, P. E. Nielsen, O. Buchardt, J. Org. Chem., 59, 5767 (1994)
4) L. Christensen, R. Fitzpatrick, B. Gildea, K. H. Petersen, H. F. Hansen, T. Koch, M. Egholm, O. Buchardt, P. E. Nielsen, J. Coull, R. H. Berg, J. Pept. Sci., 1, 175 (1995)
5) T. Koch, H. F. Hansen, P. Andersen, T. Larsen, H. G. Batz, K. Otteson, H. Orum, J. Pept. Res., 49, 80 (1997) En el oligómero de la presente invención, el extremo 5' puede ser cualquiera de las estructuras químicas (1) a (3) a continuación, y preferiblemente es (3)-OH.
Figure imgf000027_0001
De aquí en adelante, los grupos mostrados por (1), (2) y (3) anteriormente denominados como "Grupo (1)", "Grupo (2)" y "Grupo (3)", respectivamente.
2. Composición farmacéutica
El oligómero de la presente invención provoca la omisión del exón 55, 45, 50 y 44 con una mayor eficacia en comparación con los oligómeros antisentido de la técnica anterior. Por lo tanto, se espera que las condiciones de distrofia muscular se puedan aliviar con alta eficiencia administrando la composición farmacéutica que comprende el oligómero de la presente invención a pacientes con DMD. Por ejemplo, cuando se utiliza la composición farmacéutica que comprende el oligómero de la presente invención, se pueden lograr los mismos efectos terapéuticos incluso en una dosis menor que la de los oligómeros de la técnica anterior. En consecuencia, los efectos secundarios se pueden aliviar y eso es económico.
En otra realización, la presente invención proporciona la composición farmacéutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligómero de la presente invención, una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo (de aquí en adelante denominado "la composición de la presente invención"). Ejemplos de la sal farmacéuticamente aceptable del oligómero de la presente invención contenida en la composición de la presente invención son sales de metales alcalinos tales como sales de sodio, potasio y litio; sales de metales alcalinotérreos tales como sales de calcio y magnesio; sales metálicas tales como sales de aluminio, hierro, zinc, cobre, níquel, cobalto, etc.; sales de amonio; sales de aminas orgánicas tales como sales de t-octilamina, dibencilamina, morfolina, glucosamina, éster alquílico de fenilglicina, etilendiamina, N-metilglucamina, guanidina, dietilamina, trietilamina, diciclohexilamina, N,N'-dibenziletilendiamina, cloroprocaína, procaína, dietanolamina, N-bencilfeniletilamina, piperazina, tetrametilamonio, tris(hidroximetil)aminometano; sales de hidrohaluro tales como sales de hidrofluorados, hidrocloruros, hidrobromuros e hidroyoduros; sales de ácido inorgánico tales como nitratos, percloratos, sulfatos, fosfatos, etc.; alcanosulfonatos inferiores tales como metanosulfonatos, trifluorometanosulfonatos y etanosulfonatos; arilsulfonatos tales como bencenosulfonatos y p-toluenosulfonatos; sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, malatos, fumaratos, succinatos, citratos, tartaratos, oxalatos, maleatos, etc.; y sales de aminoácidos tales como sales de glicina, lisina, arginina, ornitina, ácido glutámico y ácido aspártico. Estas sales también pueden ser producidas por métodos conocidos. Alternativamente, el oligómero de la presente invención contenido en la composición de la presente invención puede estar en forma de un hidrato del mismo.
La vía de administración para la composición de la presente invención no está particularmente limitada siempre que sea una vía farmacéuticamente aceptable para la administración, y se puede elegir dependiendo del método de tratamiento. En vista de la facilidad de liberación a los tejidos musculares, se prefieren la administración intravenosa, la administración intraarterial, la administración intramuscular, la administración subcutánea, la administración oral, la administración tisular, la administración transdérmica, etc. Además, las formas farmacéuticas que están disponibles para la composición de la presente invención no están particularmente limitadas e incluyen, por ejemplo, diversas inyecciones, agentes orales, goteos, inhalaciones, ungüentos, lociones, etc.
En la administración del oligómero de la presente invención a pacientes con distrofia muscular, la composición de la presente invención contiene preferiblemente un portador para promover el suministro del oligómero a los tejidos musculares. Tal portador no está particularmente limitado siempre que sea farmacéuticamente aceptable, y los ejemplos incluyen portadores catiónicos tales como liposomas catiónicos, polímeros catiónicos, etc., o portadores que utilizan envoltura viral. Los liposomas catiónicos son, por ejemplo, liposomas compuestos de 2-O-(2-dietilaminoetil) carabamoil-1,3-O-dioleoilglicerol y fosfolípidos como componentes esenciales (de aquí en adelante denominados "liposoma A"), Oligofectamina (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectin (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamine (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), Lipofectamine 2000 (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), DMRIE-C (marca registrada) (fabricado por Invitrogen Corp.), GeneSilencer (marca registrada) (fabricado por Gene Therapy Systems), TransMessenger (marca registrada) (fabricado por Q iAGEN, Inc.), TransIT TKO (marca registrada) (fabricado por Mirus) y Nucleofector II (Lonza). Entre otros, se prefiere el liposoma A. Ejemplos de polímeros catiónicos son JetSI (marca registrada) (fabricado por Qbiogene, Inc.) y Jet-PEI (marca registrada) (polietilenimina, fabricado por Qbiogene, Inc.). Un ejemplo de portadores que utilizan una envoltura viral es GenomeOne (marca registrada) (liposoma HVJ-E, fabricado por Ishihara Sangyo). Alternativamente, también se pueden utilizar los dispositivos médicos descritos en la patente japonesa n° 2924179 y los portadores catiónicos descritos en las re-publicaciones nacionales japonesas de solicitudes PCT nums.
2006/129594 y 2008/096690.
Una concentración del oligómero de la presente invención contenida en la composición de la presente invención puede variar dependiendo del tipo de portador, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 nM a 100 j M, preferiblemente en un intervalo de 1 nM a 10 j M, y más preferiblemente en un intervalo de 10 nM a 1 j M. Una relación en peso del oligómero de la presente invención contenida en la composición de la presente invención y el portador (portador/oligómero de la presente invención) puede variar dependiendo de la propiedad del oligómero, tipo de portador, etc., y es apropiadamente en un intervalo de 0.1 a 100, preferiblemente en un intervalo de 1 a 50, y más preferiblemente en un intervalo de 10 a 20.
Además del oligómero de la presente invención y el portador descrito anteriormente, los aditivos farmacéuticamente aceptables también se pueden formular opcionalmente en la composición de la presente invención. Ejemplos de tales aditivos son ayudas de emulsificación (p. ej., ácidos grasos que tienen de 6 a 22 átomos de carbono y sus sales farmacéuticamente aceptables, albúmina y dextrano), estabilizadores (p. ej., colesterol y ácido fosfatídico), agentes isotonizantes (p. ej., cloruro de sodio, glucosa, maltosa , lactosa, sacarosa, trehalosa) y agentes de control del pH (p. ej., ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido acético, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio y trietanolamina). Se pueden utilizar uno o más de estos aditivos. El contenido del aditivo en la composición de la presente invención es apropiadamente 90% en peso o menos, preferiblemente 70% en peso o menos y más preferiblemente, 50% en peso o menos.
La composición de la presente invención se puede preparar añadiendo el oligómero de la presente invención a una dispersión de portador y agitando adecuadamente la mezcla. Se pueden añadir aditivos en una etapa apropiada antes o después de la adición del oligómero de la presente invención. Un disolvente acuoso que se puede utilizar para añadir el oligómero de la presente invención no está particularmente limitado en la medida en que sea farmacéuticamente aceptable, y los ejemplos son agua inyectable o agua destilada inyectable, fluido electrolítico tal como solución salina fisiológica, etc., y fluido de azúcar tales como fluido de glucosa, fluido de maltosa, etc. Una persona experta en la técnica puede elegir adecuadamente las condiciones de pH y temperatura para dicha materia.
La composición de la presente invención se puede preparar en, p. ej., una forma líquida y su preparación liofilizada. La preparación liofilizada se puede preparar liofilizando la composición de la presente invención en forma líquida de manera convencional. La liofilización se puede realizar, por ejemplo, esterilizando apropiadamente la composición de la presente invención en forma líquida, dispensando una alícuota en un recipiente de vial, realizando una congelación preliminar durante 2 horas en condiciones de aproximadamente -40 a -20°C, realizando un secado primario a una temperatura de 0 a 10°C bajo presión reducida, y después realizando un secado secundario a aproximadamente una temperatura de 15 a 25°C a presión reducida. En general, la preparación liofilizada de la composición de la presente invención se puede obtener reemplazando el contenido del vial sellado con gas nitrógeno.
La preparación liofilizada de la composición de la presente invención se puede utilizar en general tras la reconstitución añadiendo una solución adecuada opcional (líquido de reconstitución) y redisolviendo la preparación. Tal líquido de reconstitución incluye agua inyectable, solución salina fisiológica y otros fluidos de infusión. El volumen del líquido de reconstitución puede variar dependiendo del uso previsto, etc., no está particularmente limitado, y es adecuadamente de 0.5 a 2 veces mayor que el volumen antes de la liofilización o no más de 500 ml.
Se desea controlar una dosis de la composición de la presente invención a administrar, teniendo en cuenta los siguientes factores: el tipo y la forma farmacéutica del oligómero de la presente invención contenido; condiciones del paciente, incluyendo edad, peso corporal, etc. vía de administración; y las características y extensión de la enfermedad. Una dosis diaria calculada como la cantidad del oligómero de la presente invención está generalmente en un intervalo de 0.1 mg a 10 g/humano, y preferiblemente de 1 mg a 1 g/humano. Este intervalo numérico puede variar ocasionalmente dependiendo del tipo de enfermedad diana, vía de administración y molécula diana. Por lo tanto, una dosis más baja que el intervalo puede ser suficiente en alguna ocasión y, por el contrario, una dosis más alta que el intervalo puede ser requerida ocasionalmente. La composición se puede administrar de una vez a varias veces al día o a intervalos de un día a varios días.
En otra realización más de la composición de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un vector capaz de expresar el oligonucleótido de la presente invención y el portador descrito anteriormente. Tal vector de expresión puede ser un vector capaz de expresar una pluralidad de los oligonucleótidos de la presente invención. La composición se puede formular con aditivos farmacéuticamente aceptables como en el caso de la composición de la presente invención que contiene el oligómero de la presente invención. Una concentración del vector de expresión contenido en la composición puede variar dependiendo del tipo de portador, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 nM a 100 j M, preferiblemente en un intervalo de 1 nM a 10 j M, y más preferiblemente en un intervalo de 10 nM a 1 j M. Una relación en peso del vector de expresión contenido en la composición y el portador (portador/vector de expresión) puede variar dependiendo de la propiedad del vector de expresión, tipo de portador, etc., y está apropiadamente en un intervalo de 0.1 a 100, preferiblemente en un intervalo de 1 a 50, y más preferiblemente en un intervalo de 10 a 20. El contenido del portador contenido en la composición es el mismo que en el caso de la composición de la presente invención que contiene el oligómero de la presente invención, y un método para producir el mismo también es el mismo que en el caso con la composición de la presente invención.
Ejemplos
De aquí en adelante, la presente invención se describirá con más detalle con referencia a los ejemplos y los ejemplos de prueba a continuación, pero no se considera que esté limitada a los mismos.
Ejemplo de referencia 1
Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina amínica de poliestireno
Etapa 1: Producción de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico
Bajo atmósfera de argón, 3.44 g de N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida y se suspendieron 1.1 g de 4-dimetilaminopiridina (4-DMAP) en 50 ml de diclorometano, y se añadieron 0.90 g de anhídrido succínico a la suspensión, seguido de agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. A la mezcla de reacción se le añadieron 10 ml de metanol, y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo se extrajo utilizando acetato de etilo y solución acuosa de dihidrógeno fosfato de potasio 0.5 M. La capa orgánica resultante se lavó secuencialmente con solución acuosa de dihidrógeno fosfato de potasio 0.5 M, agua y salmuera en el orden mencionado. La capa orgánica resultante se secó sobre sulfato de sodio y se concentró a presión reducida para dar 4.0 g del producto.
Etapa 2; Producción de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de amino poliestireno
Después de 4.0 g de ácido 4-{[(2S,6R)-6-(4-benzamido-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico se disolvió en 200 ml de piridina (deshidratada), se añadieron a la solución 0.73 g de 4-DMAP y 11.5 g de hidrocloruro de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. Después, se añadieron a la mezcla 25.0 g de resina de amino poliestireno Primer support 200 amino (fabricado por GE Healthcare Japan Co., Ltd., 17-5214-97) y 8.5 mL de trietilamina, seguido de agitación a temperatura ambiente durante 4 días. Una vez completada la reacción, la resina se retiró por filtración. La resina resultante se lavó secuencialmente con piridina, metanol y diclorometano en el orden mencionado, y se secó a presión reducida. A la resina resultante se añadieron 200 ml de tetrahidrofurano (deshidratado), 15 ml de anhídrido acético y 15 ml de 2,6-lutidina, y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La resina se extrajo por filtración, se lavó secuencialmente con piridina , metanol y diclorometano en el orden mencionado y se secó a presión reducida para dar 26.7 g del producto.
La cantidad de carga del producto se determinó a partir de la cantidad molar de tritilo por g de resina midiendo la absorbancia UV a 409 nm utilizando un método conocido. La cantidad de carga de la resina fue de 192.2 pmol/g.
Condiciones de medida UV
Aparato: U-2910 (Hitachi, Ltd.)
Disolvente: ácido metanosulfónico.
Longitud de onda: 265 nm
Longitud de onda: 26
Ejemplo de referencia 2
Ácido 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-[(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado en resina de aminopoliestireno
Etapa 1: Producción de N2-(fenoxiacetil) guanosina
La guanosina, 100 g, se secó a una temperatura de 80°C a presión reducida durante 24 horas. Después de añadir 500 ml de piridina (anhidra) y 500 ml de diclorometano (anhidro), se añadieron gota a gota 401 ml de clorotrimetilsilano a la mezcla bajo una atmósfera de argón a una temperatura de 0°C, seguido de agitación a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla se volvió a enfriar con hielo y se añadieron gota a gota 66.3 g de cloruro de fenoxiacetilo. Enfriando con hielo, la mezcla se agitó durante 3 horas más. A la solución de reacción se le añadieron 500 ml de metanol y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El disolvente se eliminó después por destilación a presión reducida. El residuo se añadió con 500 ml de metanol y se concentró a presión reducida, el proceso se realizó 3 veces. Al residuo se le añadieron 4 litros de agua y la mezcla se agitó durante una hora enfriando con hielo. Los precipitados formados se sacaron por filtración, se lavaron secuencialmente con agua y metanol frío y después se secaron para dar 150.2 g del compuesto objetivo (rendimiento 102%) (consúltese: Org. Lett. (2004), Vol.6, No. 15, 2555-2557).
Etapa 2: p-toluenosulfonato de N9-{[(2R,6S)-6-(hidroximetil)-4-morfolin-2-il]-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2-il}-2-fenoxiacetamida
En 480 ml de metanol se suspendieron 30 g del compuesto obtenido en la Etapa 1, y se añadieron 130 ml de ácido clorhídrico 2N a la suspensión con enfriamiento con hielo. Posteriormente, 56.8 g de tetraborato de amonio tetrahidratado y 16.2 g de peryodato de sodio se añadieron a la mezcla en el orden mencionado y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La mezcla de reacción se enfrió con hielo y las materias insolubles se retiraron por filtración, seguido de lavado con 100 ml de metanol. El filtrado y el líquido de lavado se combinaron y la mezcla se enfrió con hielo. A la mezcla se le añadieron 11.52 g de 2-picolina borano. Después de agitar durante 20 minutos, se añadieron lentamente a la mezcla 54.6 g de monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, seguido de agitación a una temperatura de 4°C durante la noche. Los precipitados formados se sacaron por filtración y se lavaron con 500 ml de metanol frío y se secaron para dar 17.7 g del compuesto objetivo (rendimiento: 43.3%).
1H RMN (ht. Los precipitados se tomaron o35 (1H, s), 7.55 (2H, m), 7.35 (2H, m), 7.10 (2H, d, J=7.82Hz), 7.00 (3H, m), 5.95 (1H, dd, J=10.64, 2.42Hz), 4.85 (2H, s), 4,00 (1H, m), 3.90-3.60 (2H, m), 3.50-3.20 (5H, m), 2.90 (1H, m ), 2.25 (3H, s)
Etapa 3: Producción de N9-{(2R,6S)-6-hidroximetil-4-tritilmolfolin-2-il}-N2-(fenoxiacetil)guanina
En diclorometano (30 ml) se suspendieron 2.0 g del compuesto (2.0 g) obtenido en la Etapa 2, y se añadieron trietilamina (13.9 g) y cloruro de tritilo (18.3 g) a la suspensión con enfriamiento con hielo. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La mezcla de reacción se lavó con solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio y después con agua. La capa orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida. Al residuo se le añadió tampón de citrato de sodio 0.2 M (pH 3)/metanol (1:4 (v/v), 40 ml), y la mezcla se agitó. Posteriormente, se añadió agua (40 ml) y la mezcla de suspensión se agitó durante una hora con enfriamiento con hielo. Los precipitados se retiraron por filtración, se lavaron con metanol frío y se secaron para dar 1.84 g del compuesto objetivo (rendimiento: 82.0%).
Etapa 4: Producción de N9-[(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoxi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoxiacetil) guanina
En diclorometano (300 ml) se disolvió el compuesto (38.3 g) obtenido en la Etapa 3, y se añadieron imidazol (4.64 g) y cloruro de t-butildimetilsililo (9.47 g) a la solución en este orden mencionado bajo enfriamiento con hielo. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La solución de reacción se lavó con tampón de citrato de sodio 0.2 M (pH 3) y después con salmuera. La capa orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida para dar 44.1 g del compuesto diana como producto bruto.
Etapa 5: Producción de N9-[(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoxi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoxiacetil)-O6-triisopropilbencenosulfonil guanina
En diclorometano (300 ml) se disolvió el compuesto (44.1 g) obtenido por la Etapa 4, y 4-dimetilaminopiridina (0.64 g), trietilamina (29.2 ml) y cloruro de triisopropilbencenosulfonilo (19.0 g) se añadieron a la solución con enfriamiento con hielo. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante una hora. La solución de reacción se lavó con solución acuosa 1 M de dihidrógeno fosfato de sodio. La capa orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida para dar 60.5 g del compuesto objetivo como producto bruto.
Etapa 6: Producción de N9-[(2R,6S)-6-{(terc-butildimetilsililoxi)metil}-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoxiacetil)-O6-(2-cianoetil) guanina
En diclorometano (300 ml) se disolvió el compuesto (60.5 g) obtenido en la Etapa 5, y se añadió N-metilpirrolidina (54.5 ml) a la solución con enfriamiento con hielo. La solución de reacción se agitó bajo enfriamiento con hielo durante una hora. Después, se añadieron cianohidrina de etileno (37.2 g) y 1,8-diazabiciclo [5.4.0] undec-7-eno (11.96 g) a la solución, y la solución se agitó bajo enfriamiento con hielo durante 2 horas. La solución de reacción se lavó con solución de dihidrógeno fosfato de sodio 1 M y después con agua. La capa orgánica se recolectó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida para dar 72.4 g del compuesto objetivo como producto bruto.
Etapa 7: Producción de N9-[(2R, 6S)-6-hidroximetil-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoxiacetil)-O6-(2-cianoetil) guanina
En diclorometano (300 ml) se disolvió el compuesto (72.4 g) obtenido en la Etapa 6, y se añadió trihidrofluoruro de trietilamina (21.1 g) a la solución. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 17 horas. La solución de reacción se vertió en una solución acuosa de bicarbonato sódico saturado frío para neutralizar la solución de reacción. Después, la capa de diclorometano se recolectó, se secó sobre sulfato de magnesio y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (PSQ100B (fabricado por FUJI SILYSIA CHEMICAL LTD. Lo mismo se aplicará de aquí en adelante.)) para dar 14.3 g del compuesto objetivo (rendimiento de la etapa 4: 39.2%).
Etapa 8: Producción de ácido 4-[[(2S, 6S)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil) amino]purin-9-il]-4-tritilmorfoMn-2-il] metoxi]-4-oxo-butanoico cargado en resina de amino poliestireno
El compuesto del título se produjo de manera similar al ejemplo de referencia 1, excepto que se utilizó N9-[(2R,6S)-6-hidroximetil-4-tritilmorfolin-2-il]-N2-(fenoxiacetil)-O6-(2-cianoetil) guanina en esta etapa, en lugar de utilizar N-{1-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida en la Etapa 1 del ejemplo de referencia 1.
Ejemplo de referencia 3
Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno
El compuesto del título se produjo de manera similar al ejemplo de referencia 1, excepto que se utilizó 1-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-5-metilpirimidina-2,4(1H, 3H)-diona en esta etapa, en lugar de utilizar N-{1-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il}benzamida en la etapa 1 del ejemplo de referencia 1. Ejemplo de referencia 4
Ácido 4-{[(2S,6R)-6-(6-benzamidapurina-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno
El compuesto del título se produjo de manera similar al ejemplo de referencia 1, excepto que se utilizó N-{9-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]purina-6-il} benzamida en esta etapa, en lugar de utilizar N-{1-[(2R, 6S)-6-(hidroximetil)-4-tritilmorfolin-2-il]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-il} benzamida en la Etapa 1 del ejemplo de referencia 1. Ejemplo de referencia 5
Ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico cargado en resina de aminopoliestireno El compuesto del título se produjo de manera similar al ejemplo de referencia 1, excepto que se utilizó en esta etapa ácido 2-[2-(2-hidroxietoxi)etoxi]etil 4-tritilpiperazin-1 -carboxílico (el compuesto descrito en el documento WO2009 /064471), en lugar de N-{1-[(2R,6S)-6-(hidroximetN)-4-tntNmorfoNn-2-N]-2-oxo-1,2-dihidropirimidin-4-N} benzamida utilizada en la Etapa 1 del ejemplo de referencia 1.
Exon 45
De acuerdo con las descripciones en los ejemplos 1 a 8 y el ejemplo de referencia 1 a continuación, se sintetizaron varios tipos de PMO mostrados por los PMO nums. 1-6 y 8-10 en la tabla 5. El PMO sintetizado se disolvió en agua para inyección (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). PMO n° 7 se compró a Gene Tools, LLC.
Tabla 5
Figure imgf000031_0001
Ejemplo 1
PMO. N° 1
0.2 g de ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(4-benzamida-2-oxopirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}4-oxobutanoico soportado sobre una resina de aminopoliestireno (Ejemplo de referencia 1) (26 |jmol) se rellenó en una columna con un cabezal de filtro. Después, el ciclo sintético que se muestra a continuación se inició utilizando una máquina de síntesis de ácido nucleico (AKTA Oligopilot 10 plus). El compuesto de monómero de morfolino deseado se añadió en cada ciclo de acoplamiento para dar la secuencia de nucleótidos del compuesto del título.
Tabla 6
Figure imgf000032_0001
La solución desbloqueante utilizada fue diclorometano que contenía 3% (p/v) de ácido trifluoroacético. La solución neutralizante y de lavado utilizada fue una solución obtenida disolviendo N,N-diisopropiletilamina para ser 10% (v/v) y tetrahidrofurano para ser 5% (v/v) en diclorometano que contenía acetonitrilo al 35% (v/v). La solución de acoplamiento A utilizada fue una solución obtenida disolviendo el compuesto de monómero de morfolino en tetrahidrofurano para ser 0.10 M. La solución de acoplamiento B utilizada fue una solución obtenida disolviendo N,N-diisopropiletilamina para ser 20% (v/v) y tetrahidrofurano para ser 10% (v/v) en acetonitrilo. La solución de protección utilizada fue una solución obtenida disolviendo 20% (v/v) de anhídrido acético y 30% (v/v) de 2,6-lutidina en acetonitrilo.
La resina de amino poliestireno cargada con el PMO sintetizado anteriormente se recuperó del recipiente de reacción y se secó a temperatura ambiente durante al menos 2 horas a presión reducida. El p Mo seco cargado en resina de amino poliestireno se cargó en un recipiente de reacción, y se añadieron a la misma 5 ml de 28% de agua amoniacaletanol (1/4). La mezcla se agitó a una temperatura de 55°C durante 15 horas. La resina de aminopoliestireno se separó por filtración y se lavó con 1 ml de agua-etanol (1/4). El filtrado resultante se concentró a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en 10 ml de una mezcla de disolventes de 20 mM de ácido acético-tampón de trietilamina (tampón TEAA) y 10 ml de acetonitrilo (4/1) y se filtró a través de un filtro de membrana. El filtrado obtenido se purificó por HPLC de fase inversa. Las condiciones utilizadas son las siguientes.
Tabla 7
Figure imgf000032_0002
Se analizó cada fracción y el producto objetivo se recuperó y se concentró a presión reducida. Al residuo concentrado se añadieron 0.5 ml de solución acuosa de ácido fosfórico 2 M, y la mezcla se agitó durante 15 minutos. Además, se añadieron 2 ml de solución acuosa de hidróxido de sodio 2 M para hacer la mezcla alcalina, seguido de filtración a través de un filtro de membrana (0.45 jm).
La solución acuosa resultante que contiene el producto objetivo se purificó mediante una columna de resina de intercambio aniónico. Las condiciones utilizadas son las siguientes.
Tabla 8
Figure imgf000033_0001
Cada fracción se analizó (en HPLC) y el producto objetivo se obtuvo como una solución acuosa. A la solución acuosa resultante se le añadió tampón fosfato 0.1 M (pH 6.0) para neutralización. A continuación, la mezcla obtenida se desmineralizó por HPLC de fase inversa en las condiciones que se describen a continuación.
Tabla 9
Figure imgf000033_0002
El producto objetivo se recuperó y la mezcla se concentró a presión reducida. El residuo resultante se disolvió en agua. La solución acuosa obtenida se liofilizó para dar 1.5 mg del compuesto objetivo como un sólido blanco similar al algodón.
Figure imgf000033_0003
Ejemplo 2
PMO. N° 3
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000033_0004
Ejemplo 3
PMO. N° 2
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000033_0005
Ejemplo 4
PMO. N° 4
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-[(2-fenoxiacetil)amino]purin-9-il]-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000034_0001
Ejemplo 5
PMO. N° 5
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000034_0002
Ejemplo 6
PMO. N° 8
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000034_0003
Ejemplo 7
PMO. N° 9
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000034_0004
Ejemplo 8
PMO. N° 10
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 5) como material de partida.
Figure imgf000034_0005
Ejemplo comparativo 1
PMO. N° 6
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1.
Figure imgf000034_0006
Ejemplo de prueba 1
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron utilizando los oligómeros antisentido de 2'-O-metoxi-fosforotioatos (2'-OMe-S-RNA) mostrados por la SEQ ID NO: 19 a la SEQ ID NO: 35. Se compraron a Japan Bio Services varios oligómeros antisentido utilizados para el ensayo. Las secuencias de varios oligómeros antisentido se dan a continuación.
Tabla 10
Figure imgf000035_0001
Las células RD (línea celular de rabdomiosarcoma humano) se colocaron en placas a 1x105 en una placa de 12 pocillos y se cultivaron en 1 ml de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM, por sus siglas en inglés) (fabricado por Sigma, Inc., de aquí en adelante el mismo) que contiene 10% de suero fetal bovino (FCS, por sus siglas en inglés) (fabricado por Invitrogen Corp.) en condiciones de 37°C y 5% de CO2 durante la noche. Se prepararon complejos de varios oligómeros antisentido (Japan Bio Services) (0.3 o 1 j M) para omisión del exón 45 y Lipofectamine 2000 (fabricado por Invitrogen Corp.) y se añadieron 100 j L del complejo a las células RD donde se añadieron 0.9 mL del medio intercambiado, para alcanzar la concentración final de 30 o 100 nM.
Después de completar la adición, las células se cultivaron durante la noche. Las células se lavaron dos veces con PBS (fabricado por Nissui, de aquí en adelante el mismo) y después se añadieron a las células 250 j l de ISOGEN (fabricado por Nippon Gene). Después de dejar reposar las células a temperatura ambiente durante unos minutos para la lisis celular, el lisado se recolectó en un tubo Eppendorf. El ARN total se extrajo según el protocolo adjunto a ISOGEN. La concentración del ARN total extraído se determinó utilizando un NanoDrop ND-1000 (fabricado por LMS).
La RT-PCR se realizó con 400 ng del ARN total extraído utilizando un kit QIAGEN OneStep RT-PCR. Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se utilizó un PTC-100 (fabricado por m J Research) como un termociclador. El programa de RT-PCR utilizado es el siguiente.
50°C, 30 minutos: transcripción inversa
94°C, 15 minutos: desnaturalización térmica
[94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 72°C, 1 min] * 35 ciclos: amplificación por PCR
72°C, 10 minutos:
Las secuencias de nucleótidos del cebador directo y el cebador inverso utilizados para RT-PCR se dan a continuación.
Cebador directo: 5'- GCTCAGGTCGGATTGACATT-3' (SEQ ID NO: 36)
Cebador inverso: 5'- GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3' (SEQ ID NO: 37)
El producto de reacción, 1 pL de la PCR anterior se analizó utilizando un Bioanalizador (fabricado por Agilent Technologies, Inc.). Se midieron el nivel de polinucleótido "A" de la banda con omisión del exón 45 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin omisión del exón 45. En base a estos valores de medición de "A" y "B", la eficacia de omisión se determinó mediante la siguiente ecuación:
Eficacia de omisión %=A/(A+B)x100
Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 1 y 2. Estos experimentos revelaron que, cuando los oligómeros antisentido se diseñaron en los nucleótidos 1° al 25°, o del 6° al 30° del extremo 5' del exón 45 en el gen de la distrofina humana, la omisión del exón 45 podría ser causada con una eficacia más alta que la del oligómero antisentido que está diseñado en los nucleótidos 7° al 31° desde el extremo 5' del exón 45.
Ejemplo de prueba 2
Ensayo in vitro
Utilizando un kit Amaxa Cell Line Nucleofector Kit L en Nucleofector II (Lonza), 1 ,3 o 10 pM de los oligómeros PMO n° 1 a 5 y 8 a 10 de la presente invención y los oligómeros antisentido PMO n° 6 y 7 fueron transfectados con 3.5 *105 de células RD (línea celular de rabdomiosarcoma humano). Se utilizó el programa T-030.
Después de la transfección, las células se cultivaron durante 3 días en 2 ml de medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) (fabricado por Sigma, de aquí en adelante el mismo) que contiene 10% de suero fetal bovino (FCS) (fabricado por Invitrogen) en condiciones de 37°C y 5% de CO2. Las células se lavaron dos veces con PBS (fabricado por Nissui, de aquí en adelante el mismo) y se añadieron a las células 500 pl de ISOGEN (fabricado por Nippon Gene). Después de dejar reposar las células a temperatura ambiente durante unos minutos para lisar las células, el lisado se recolectó en un tubo Eppendorf. El ARN total se extrajo de acuerdo con el protocolo adjunto a ISOGEN. La concentración del ARN total extraído se determinó utilizando un NanoDrop ND-1000 (fabricado por LMS).
La RT-PCR se realizó con 400 ng del ARN total extraído utilizando un kit QIAGEN OneStep RT-PCR (fabricado por QIAGEN). Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se utilizó un PTC-100 (fabricado por MJ Research) como un termociclador. El programa de RT-PCR utilizado es el siguiente.
50°C, 30 minutos: transcripción inversa
95°C, 15 minutos: desnaturalización térmica
[94°C, 30 segundos; 60°C, 30 segundos; 72°C, 1 min] * 35 ciclos: amplificación por PCR
72°C, 10 minutos:
Las secuencias de nucleótidos del cebador directo y el cebador inverso utilizados para RT-PCR se dan a continuación. Cebador directo: 5'- GCTCAGGTCGGATTGACATT-3' (SEQ ID NO: 36)
Cebador inverso: 5'- GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3' (SEQ ID NO: 37)
El producto de reacción, 1 pL, de la PCR anterior se analizó utilizando un Bioanalizador (fabricado por Agilent Technologies, Inc.).
Se midieron el nivel de polinucleótido "A" de la banda con omisión del exón 45 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin omisión del exón 45. En base a estos valores de medición de "A" y "B", la eficacia de omisión se determinó mediante la siguiente ecuación:
Eficacia de omisión %=A/(A+B)x100
Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 3, 4, 14 y 15. Estos experimentos revelaron que los oligómeros PMO n° 1 y 3 de la presente invención causaron la omisión del exón 45 con una eficacia equivalente al oligómero antisentido p Mo n° 6 en células RD (FIG. 3, 4). Además, los experimentos revelaron que los oligómeros PMO n° 1, 2 y 3 de la presente invención causaron la omisión del exón 45 con una mayor eficacia que el oligómero antisentido PMO n° 7 (FIG. 14). Además, los experimentos revelaron que el oligómero PMO n° 3 causó la omisión del exón 45 con una eficacia más alta que el oligómero antisentido PMO n° 10 cuya estructura final es diferente de la de PMO N° 3 (FIG. 15).
Ejemplo de prueba 3
Ensayo in vitro utilizando fibroblastos humanos
El gen myoD humano (SEQ ID NO: 38) se introdujo en las células GM05017 (fibroblastos derivados de DMD humano, Instituto Coriell para Investigación Médica) utilizando un vector retroviral de coexpresión ZsGreen1.
Después de la incubación durante 4 a 5 días, los fibroblastos transformados con MyoD positivo para ZsGreen se recolectaron mediante FACS y se colocaron en placas a 5x104/cm2 en una placa de 12 pocillos. Como medio de crecimiento, se utilizó 1 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM ■ F-12) (Invitrogen Corp.) que contiene 10% de FCS y 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) (Sigma- Aldrich, Inc).
El medio fue reemplazado 24 horas después por un medio de diferenciación (DMEM/F-12 que contenía 2% de suero equino (Invitrogen Corp.), 1% de P/S y suplemento de medios líquidos ITS (Sigma, Inc.)). El medio se cambió cada 2 a 3 días y se continuó la incubación durante 12 a 14 días para diferenciarse en miotubos.
Posteriormente, el medio de diferenciación se reemplazó por un medio de diferenciación que contenía Endo-Porter 6 |jM (Gene Tools), y se añadió un oligómero de morfolino al mismo a una concentración final de 10 jM . Después de la incubación durante 48 horas, se extrajo el ARN total de las células utilizando un TRIzol (fabricado por Invitrogen Corp.). La RT-PCR se realizó con 50 ng del ARN total extraído utilizando un kit QIAGEN OneStep RT-Pc R. Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se utilizó un iCycler (fabricado por Bio-Rad) como un termociclador. El programa de RT-PCR utilizado es el siguiente.
50°C, 30 minutos: transcripción inversa
95°C, 15 minutos: desnaturalización térmica
[94°C, 1 minuto; 60°C, 1 min; 72°C, 1 min] * 35 ciclos: amplificación por PCR
72°C, 7 minutos: inactivación térmica de la polimerasa
Los cebadores utilizados fueron hDMD44F y hDMD46R.
hDMD44F: 5'-CCTGAGAATTGGGAACATGC-3' (SEQ ID NO: 39)
hDMD46R: 5'- TTGCTGCTCTTTTCCAGGTT-3' (SEQ ID NO: 40)
El producto de reacción de RT-PCR anterior se separó por electroforesis en gel de agarosa al 2% y las imágenes de gel se capturaron con un GeneFlash (Syngene). El nivel de polinucleótido "A" de la banda con omisión del exón 45 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin omisión del exón 45 se midieron utilizando una imagen J (fabricada por los Institutos Nacionales de Salud). En base a estos valores de medición de "A" y "B", la siguiente ecuación determinó la eficacia de omisión.
Eficacia de omisión %=A/(A+B)x100
Resultados experimentales
Los resultados se muestran en la FIG. 5. Este experimento reveló que el oligómero PMO n° 3 de la presente invención causó la omisión del exón 45 con una alta eficacia en las células GM05017.
Exon 55
De acuerdo con las descripciones en los ejemplos 9 a 19 a continuación, se sintetizaron varios tipos de PMO mostrados por los PMO n° 11-14 y 16-22 en la tabla 11. El PMO sintetizado se disolvió en agua para inyección (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). PMO n° 15 fue adquirido de Gene Tools, LLC.
Tabla 11
Figure imgf000037_0001
Figure imgf000038_0001
Ejemplo 9
PMO. N° 11
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como el material de partida.
Figure imgf000038_0002
Ejemplo 10
PMO. N° 12
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000038_0003
Ejemplo 11
PMO. N° 13
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000038_0004
Ejemplo 12
PMO. N° 14
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S,6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000038_0005
Ejemplo 13
PMO. N° 16
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000039_0001
Ejemplo 14
PMO. N° 17
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-[(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000039_0002
Ejemplo 15
PMO. N° 18
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-[(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000039_0003
Ejemplo 16
PMO. N° 19
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4- (((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000039_0004
Ejemplo 17
PMO. N° 20
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000039_0005
Ejemplo 18
PMO. N° 21
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000040_0001
Ejemplo 19
PMO. N° 22
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico (ejemplo de referencia 5) cargado en resina de aminopoliestireno como material de partida.
Figure imgf000040_0002
Ejemplo de prueba 4
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron utilizando los oligómeros antisentido de 2'-O-metoxi-fosforotioatos (2'-OMe-S-RNA) mostrados por la SEQ ID NO: 49 a la SEQ ID NO: 68. Se compraron varios oligómeros antisentido utilizados para el ensayo de Japan Bio Services. Las secuencias de varios oligómeros antisentido se dan a continuación.
Tabla 12
Figure imgf000040_0003
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del Exón 45 (ejemplo de prueba 1), excepto que la RT-PCR se realizó utilizando los cebadores siguientes.
Cebador directo: 5'- CATGGAAGGAGGGTCCCTAT-3' (SEQ ID NO: 69)
Cebador inverso: 5'- CTGCCGGCTTAATTCATCAT-3' (SEQ ID NO: 70)
Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 6 y 7. Estos experimentos revelaron que, cuando los oligómeros antisentido se diseñaron en los nucleótidos 1° al 21°, o del 11° al 3 l° desde el extremo 5' del exón 55 en el gen de la distrofina humana, la omisión del exón 55 de estos oligómeros antisentido se podría producir con una eficacia mayor que la del oligómero antisentido que está diseñado en los nucleótidos 104° al 123° desde el extremo 5' del exón 55.
Ejemplo de prueba 5
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del exón 45 (ejemplo de prueba 2), excepto que la RT-PCR se realizó utilizando los cebadores a continuación.
Cebador directo: 5'- CATGGAAGGAGGGTCCCTAT-3' (SEQ ID NO: 69)
Cebador inverso: 5'- CTGCCGGCTTAATTCATCAT-3' (SEQ ID NO: 70)
Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 8, 16 y 17. Estos experimentos revelaron que en las células RD, los oligómeros PMO n° 12, 13 y 14 (H55_8-28 (OH), H55_11 -31 (OH) y H55_14-34 (OH)) de la presente invención causaron la omisión del exón 55 con una alta eficacia (FIG. 8). Además, los oligómeros p Mo n° 14, 16, 17, 18 y 19 (H55_14-34 (OH), H55_12-32 (OH), H55_13-33 (OH), H55_15-35 (OH) y H55_16-36 (OH)) de la presente invención se descubrió que causaban una omisión del exón 55 con una eficacia notablemente mayor que la del oligómero antisentido PMO n° 15 (H55_139-156 (GT)) en las células RD (FIG. 16). Se descubrió que el oligómero PMO n°14 de la presente invención y el oligómero PMO n° 21 (H55_15-34 (OH)), que es una base más corta que el oligómero PMO n° 14, causan la omisión del exón 55 con la misma eficiencia (FIG. 17). Además, los experimentos revelaron que el oligómero PMO n° 14 de la presente invención causó la omisión del exón 55 con la misma eficacia que el oligómero PMO n° 22 (H55_14-34 (TEG)), que tiene una estructura final diferente de la del oligómero PMO n° 14 (FIG. 17).
Exon 44
De acuerdo con las descripciones en los ejemplos 20 a 29 a continuación, se sintetizaron varios tipos de PMO mostrados por los PMO n° 23-29 y 31-33 en la tabla siguiente. El PMO sintetizado se disolvió en agua para inyección (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). PMO n° 30 fue adquirido de Gene Tools, LLC.
Tabla 13
Figure imgf000041_0001
Ejemplo 20
PMO. N° 23
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000042_0001
Ejemplo 21
PMO. N° 24
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000042_0002
Ejemplo 22
PMO. N° 25
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il}metoxi]-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000042_0003
Ejemplo 23
PMO. N° 26
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000042_0004
Ejemplo 24
PMO. N° 27
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000042_0005
Ejemplo 25
PMO. N° 28
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000043_0001
Ejemplo 26
PMO. N° 29
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000043_0002
Ejemplo 27
PMO. N° 31
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamida prino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000043_0003
Ejemplo 28
PMO. N° 32
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000043_0004
Ejemplo 29
PMO. N° 33
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 5) como material de partida.
Figure imgf000043_0005
Ejemplo de prueba 6
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron utilizando los oligómeros antisentido de 2'-O-metoxi-fosforotioatos (2'-OMe-S-ARN) mostrados por la SEQ ID NO: 82 a la SEQ ID NO: 95 y la SEQ ID NO: 109 a la SEQ ID NO: 118. Se compraron varios oligómeros antisentido utilizados para el ensayo de Japan Bio Services. Las secuencias de varios oligómeros antisentido se dan a continuación.
Tabla 14
Figure imgf000044_0001
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del exón 45 (ejemplo de prueba 1). Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 9 y 10. Estos experimentos revelaron que, cuando los oligómeros antisentido se diseñaron en los nucleótidos 11° al 32°, o del 26° al 47° del extremo 5' del exón 44 en el gen de la distrofina humana, la omisión del exón 44 de estos oligómeros antisentido se podría producir con la misma eficacia que la del oligómero antisentido que está diseñado en los nucleótidos 62° al 81° desde el extremo 5' del exón 44.
Ejemplo de prueba 7
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del exón 45 (ejemplo de prueba 2). Resultados experimentales
Los resultados se muestran en la FIG. 11, 12 y 18. Este experimento reveló que en las células RD, los oligómeros PMO n° 24 y 26 (H44_25-45 (OH) y H44_27-47 (OH)) de la presente invención causaron la omisión del exón 44 con la misma eficacia que el oligómero antisentido PMO n° 30 (H44_10-39 (OH)) (Figuras 11, 12). Se descubrió que el oligómero PMO n° 26 de la presente invención y el oligómero PMO n° 31 (H44_27-46 (OH)), que es una base más corta que el oligómero PMO n° 26, causan la omisión del exón 44 con la misma eficiencia. (FlG. 18). Además, se descubrió que el oligómero PMO n° 26 de la presente invención causa la omisión del exón 44 con la misma eficacia que el oligómero PMO n° 33 (H44_27-47 (TEG)), que tiene una estructura final diferente del oligómero PMO n° 26 (FIG. 18).
Exon 50
De acuerdo con las descripciones en los ejemplos 30 a 39 a continuación, se sintetizaron varios tipos de PMO mostrados por los PMO n° 34-38 y 41-45 en la tabla 15. El PMO sintetizado se disolvió en agua para inyección (fabricado por Otsuka Pharmaceutical Factory, Inc.). Los PMO n° 39 y 40 fueron adquiridos de Gene Tools, l Lc . Tabla 15
Figure imgf000045_0001
Ejemplo 30
PMO. N° 34
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S,6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000045_0002
Ejemplo 31
PMO. N° 35
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S, 6R)-6-(6-benzamideprino-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado en resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000046_0001
Ejemplo 32
PMO. N° 36
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S,6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmolforin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000046_0002
Ejemplo 33
PMO. N° 37
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmolforin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000046_0003
Ejemplo 34
PMO. N° 38
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmolforin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000046_0004
Ejemplo 35
PMO. N° 41
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmolforin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000046_0005
Ejemplo 36
PMO. N° 42
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-[[(2S, 6R)-6-[6-(2-cianoetoxi)-2-(2-fenoxiacetil)amino]purina-9-il]-4-tritilmolforin-2-il]metoxi]-4-oxo-butanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 2) como material de partida.
Figure imgf000046_0006
Ejemplo 37
PMO. N° 43
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-(((2S, 6R)-6-(5-metil-2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidina-1(2H)-il)-4-tritilmorfolin-2-il)metoxi)-4-oxobutanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 3) como material de partida.
Figure imgf000047_0001
Ejemplo 38
PMO. N° 44
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 4-{[(2S,6R)-6-(6-benzamidapurina-9-il)-4-tritilmorfolin-2-il]metoxi}-4-oxobutanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 4) como material de partida.
Figure imgf000047_0002
Ejemplo 39
PMO. N° 45
El compuesto del título se produjo de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1, excepto que se utilizó ácido 1,12-dioxo-1-(4-tritilpiperazin-1-il)-2,5,8,11-tetraoxa-15-pentadecanoico cargado sobre resina de aminopoliestireno (ejemplo de referencia 5) como material de partida.
Figure imgf000047_0003
Ejemplo de prueba 8
Ensayo in vitro
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del exón 45 (ejemplo de prueba 2), excepto que la RT-PCR se realizó utilizando los cebadores a continuación en las concentraciones de 0.1, 0.3 o 1 pM. Cebador directo: 5'- AACAACCGGATGTGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 103)
Cebador inverso: 5'- TTGGAGATGGCAGTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 104)
Resultados experimentales
Los resultados son visibles en las FIG. 13 y 19. Estos experimentos revelaron que en las células RD los oligómeros PMO n° 38 (H50_107-127 (OH)) de la presente invención causaron la omisión del exón 50 con una mayor eficiencia que el oligómero antisentido p Mo n° 39 o 40 (H50_90- 114 (GT), H50_103-127 (GT)). Además, los experimentos revelaron que el oligómero PMO n° 38 causó la omisión del exón 50 con una mayor eficacia que el oligómero PMO n° 45 (H50_107-127 (TEG)), cuya estructura final es diferente de la del oligómero PMO n° 38 (FIG. 19).
Examen de omisión del exón 44
Ensayo in vitro utilizando fibroblastos humanos
Ejemplo de prueba 9
La actividad de omisión del exón 44 se determinó utilizando células GM05112 (fibroblastos obtenidos a partir de pacientes con DMD humana con deleción del exón 45, Instituto Coriell de Investigación Médica). Como medio de crecimiento, se utilizó medio Eagle modificado de Dulbecco: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) (Invitrogen Corp.) que contiene 10% de FCS y 1% de penicilina/estrepticina (P/S) (Sigma-Aldrich, Inc.) y las células se cultivaron en condiciones de 37°C y 5% de CO2.
Las células se cultivaron en un matraz T225 y se añadieron 2.5 ml de retrovirus (coexpresión ZsGreen1) que expresaba MyoD obtenida a partir de humanos (SEQ ID NO: 38) y una concentración final de 8 pg/ml de polibreno (Sigma-Aldrich, Inc.) a 35 ml del medio de crecimiento. Después de la incubación a una temperatura de 32°C durante 2 días, el medio se cambió por un medio de crecimiento fresco y la incubación continuó a una temperatura de 37°C durante 3 días. Los fibroblastos transformados con MyoD positivo para ZsGreenl se recolectaron mediante un clasificador de células BD FACSAria (BD Bioscience) y se colocaron en placas a 9x104 células/pocillo en una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno. Al día siguiente, el medio fue reemplazado por un medio de diferenciación (DMEM/F-12 que contenía 2% de suero equino (Invitrogen Corp.), 1% de P/S y suplemento de medio líquido ITS (Sigma, Inc.)). El medio se cambió cada 2 a 3 días y se continuó la incubación para diferenciarse en miotubos.
El séptimo día después de cambiar el medio al medio de diferenciación, el medio fue reemplazado por un medio de diferenciación que contenía 6 pM a una concentración final de Endo-Porter (Gene Tools) y 1, 3, 10 pM de los oligómeros PMO n° 26 y 31 se añadieron a la misma a una concentración final. Después de que las células se incubaron durante 7 días, las células se recolectaron para extraer ARN total utilizando RNeasy Mini Kit (QIAGEN). La RT-PCR se realizó con 50 ng del ARN total extraído utilizando un kit QIAGEN OneStep r T-PCR. Se preparó una solución de reacción de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. Se utilizó un iCycler (fabricado por Bio-Rad) como un termociclador. El programa de RT-PCR utilizado es el siguiente.
50°C, 30 minutos: transcripción inversa
95°C, 15 minutos: desnaturalización térmica
[94°C, 1 minuto; 60°C, 1 minutos; 72°C, 1mins]*35 ciclos: amplificación por PCR
72°C, 7 minutos: reacción de extensión final
Las secuencias de nucleótidos del cebador directo y el cebador inverso utilizados para RT-PCR se dan a continuación.
Cebador directo: 5'- GCTCAGGTCGGATTGACATT-3' (SEQ ID NO: 36)
Cebador inverso: 5'- GGGCAACTCTTCCACCAGTA-3' (SEQ ID NO: 37)
El producto de reacción de RT-PCR anterior se separó por electroforesis en gel de agarosa al 2% y las imágenes en gel se capturaron con un analizador de imágenes ImageQuant LAS 4000 mini (fabricado por FUJI Film). Utilizando el software adjunto, se midió el nivel de polinucleótido "A" de la banda con omisión del exón 44 y el nivel de polinucleótido "B" de la banda sin omisión del exón 44. En base a estos valores de medición de "A" y "B", la eficacia de omisión se determinó mediante la siguiente ecuación:
Eficiencia de omisión %=A/(A+B)x100
Resultados experimentales
El resultado se muestra en la FIG. 20. Estos experimentos revelaron que en las células GM05112 los oligómeros PMO n° 26 y 31 de la presente invención causaron la omisión del exón 44 con una alta eficacia.
Ejemplo de prueba 10
Se prepararon fibroblastos transformados con MyoD utilizando células GM05112 de acuerdo con el procedimiento del ejemplo de prueba 9, y las células se diferenciaron en miotubos. Posteriormente, el medio de diferenciación fue reemplazado por un medio de diferenciación que contenía 6 pM a una concentración final de Endo-Porter (Gene Tools), y los oligómeros PMO N° 26 y 31 se añadieron a las células a una concentración final de 10 pM en el 6° día después de que el medio fue cambiado al medio de diferenciación. Después de la incubación durante 14 días, las células se recolectaron mediante un raspador utilizando un tampón de lisis celular RIPA (fabricado por Pierce) que contiene un cóctel inhibidor de la proteasa Complete Mini (fabricado por Roche). El lisado celular se extrajo de las células alterando las células mediante una trituradora ultrasónica Bioruptor UCD-250 (Tosho Denki) y recolectando el sobrenadante después de la centrifugación. Las concentraciones de proteína se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteína BCA Pierce (Pierce). La absorbancia de 544 nm de longitud de onda se detectó utilizando un lector de placas Thermo Appliskan Type2001 (Thermo Electron).
Los 3 pg de lisados celulares se sometieron a electroforesis en gel de acrilamida NuPAGE Novex Tris-Acetate Gel 3-8% (fabricado por Invitrogen) y se transfirieron a una membrana Immobilon-P (fabricada por Millipore) utilizando un papel secante semiseco. La membrana transferida se lavó con PBS (PBST) que contenía 0.1% de Tween20 y se bloqueó con PBST que contenía 5% de agente de bloqueo Amersham ECL Prime (GE Healthcare) en el refrigerador durante la noche. Después de lavar la membrana con PBST, la membrana se incubó en una solución de anticuerpo anti-distrofina (fabricado por NCL-Dys1, Novocastra) diluido 50 veces con Can Get Signal1 (fabricado por TOYOBO) a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar con PBST, la membrana se incubó en una solución de anticuerpo anti-IgG de ratón producido en cabra conjugado con peroxidasa (170-6516, Bio-Rad) diluido 2500 veces con Can Get Signal1 (fabricado por TOYOBO) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de lavar con PBST, la membrana se tiñó con un sistema de detección de transferencia Western ECL Plus (GE Healthcare). La quimioluminiscencia de la proteína distrofina eliminada del exón 44-45 se detectó mediante el analizador de imagen lumino ImageQuant LAS 4000 mini (película FUJI).
Resultados experimentales
Los resultados de la transferencia Western se muestran en la FIG. 21. En la FIG. 21, la punta de flecha representa una banda de proteína distrofina de la cual se confirmó la expresión. Este experimento revela que los oligómeros PMO n° 26 y 31 de la presente invención indujeron la expresión de proteínas de distrofina en células GM05112.
Estudio de la omisión del exón 50
Ensayo in vitro utilizando fibroblastos humanos
Ejemplo de prueba 11
Los fibroblastos transformados con MyoD se prepararon utilizando células GM05112 para diferenciarse en miotubos de acuerdo con el procedimiento del ejemplo de prueba 9.
Posteriormente, el medio de diferenciación se reemplazó por un medio de diferenciación que contenía 6 pM de Endo-Porter (Gene Tools), y se añadió un oligómero PMO n° 38 al mismo a una concentración final de 0.1, 0.3, 1, 3, 10 pM en el día 12 después de que el medio fue cambiado al medio de diferenciación. Después de la incubación durante 2 días, se recolectaron las células. El ARN total se extrajo de las células, se realizó RT-PCR y se determinó la eficacia de omisión de acuerdo con el procedimiento del ejemplo de prueba 9, excepto que las secuencias de nucleótidos del cebador directo y el cebador inverso que se proporcionan a continuación se utilizaron para RT-PCR.
Cebador directo: 5'- AACAACCGGATGTGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 103)
Cebador inverso: 5'- TTGGAGATGGCAGTTTCCTT-3' (SEQ ID NO: 104)
Resultados experimentales
El resultado de RT-PCR se muestra en la FIG. 22 y el resultado de la eficiencia de omisión se muestra en la FIG. 23. Estos experimentos revelaron que en las células GM05112 el oligómero PMO n° 38 de la presente invención causó la omisión del exón 50 con una alta eficiencia y el valor de EC50 fue de 1.3 pM.
Ejemplo de prueba 12
Los experimentos para la omisión se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del ejemplo de prueba 11, excepto que 11-0627 células (fibroblastos obtenidos a partir de pacientes con DMD humana con duplicación de exones 8-9, depósito de recursos de investigación del trastorno neuromuscular del Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría) se utilizaron y se añadió el oligómero PMO n° 38 a una concentración final de 0.1, 1, 10 pM.
Resultados experimentales
El resultado de RT-PCR se muestra en la FIG. 26 y la eficacia de emisión se muestra en la FIG. 27. Estos experimentos revelaron que en las células 11-0627 el oligómero PMO n° 38 de la presente invención causó la omisión del exón 50 con una alta eficacia.
Ejemplo de prueba 13
Preparación del lentivirus pLVX-MyoD-ZsGreen1
El pLVZ-puro (8120 pb, Clontech) se linearizó eliminando 1164 pb de nucleótidos que se encuentran del sitio XhoI, en el sitio multiclonado (en 2816), al sitio (en 3890) adyacente al extremo 3' de la región codificante del gen resistente a Puromicina para preparar un vector linearizado. Posteriormente, las secuencias de nucleótidos (2272 pb) que codifican el gen MyoD humano, la secuencia IRES, el gen ZsGreen1 se integraron a su vez en el vector linearizado y después se preparó el vector de expresión de lentivirus pLVX-MyoD-ZsGreen1 (9210 pb).
Las células Lenti-X 293T se sembraron en placas recubiertas con colágeno de 10 cm de acuerdo con el protocolo adjunto al sistema de envasado Lenti-X HTX (Clontech). El vector de expresión de lentivirus y el vector de empaquetamiento se transfectaron en fibroblastos tres días antes de la infección. Después de cuatro horas, se intercambió el medio y las células se incubaron durante tres días sin intercambiar medio. El día de la infección, el sobrenadante del cultivo se recolectó como una solución de virus (aproximadamente 9 ml para una placa de 10 cm). El sobrenadante de cultivo se filtró mediante un cellstrain (40 pm) y después se centrifugó por 500 * g, 10 min. Este sobrenadante se concentró de acuerdo con el protocolo adjunto al Concentrador Lenti-X (Clontech) y después se disolvió en medio DMEM/F12 hasta diez veces la concentración del sobrenadante de cultivo recolectado. Esta solución se utilizó como una solución de virus.
Infección por virus en fibroblastos
Las células GM04364 (fibroblastos obtenidos a partir de pacientes con DMD humana con deleción de los exones 51­ 55, Instituto Coriell de Investigación Médica) se colocaron en placas en una placa de 24 pocillos recubierta de colágeno por 3 x 104/pocillo el día de la infección. El día de la infección, se añadieron 400 pl del medio de diferenciación, 100 pl de la solución de virus y 8 pg/ml de polibreno a una concentración final por pocillo. El día después de la infección, el medio que contenía el virus se intercambió por 500 pl del medio de diferenciación. El medio de diferenciación se intercambió cada 2 o 3 días y las células se incubaron durante 12 días para inducir la diferenciación en miotubos. En el día 12 después de que el medio se intercambió en el medio de diferenciación, el medio se reemplazó por un medio de diferenciación que contenía 6 pM Endo-Porter (Gene Tools) a una concentración final y se añadieron 0.1, 0.3, 1, 3, 10 pM del oligómero PMO n°38 al mismo a una concentración final. Después de la incubación durante 2 días, se recolectaron las células. La eficacia de omisión se determinó de acuerdo con el procedimiento del ejemplo de prueba 11, excepto que las secuencias de nucleótidos del cebador directo y el cebador inverso dados a continuación se utilizaron para RT-PCR.
Cebador directo: 5'- AACAACCGGATGTGGAAGAG-3' (SEQ ID NO: 103)
Cebador inverso: 5'- CTGCCGGCTTAATTCATCAT-3' (SEQ ID NO: 70)
Resultados experimentales
El resultado de RT-PCR se muestra en la FIG. 28 y la eficacia de omisión se muestra en la FIG. 29. Estos experimentos revelaron que en las células GM04364 el oligómero PMO n°38 de la presente invención causó la omisión del exón 50 con una alta eficacia.
Estudio de la omisión del exón 55
Ensayo in vitro utilizando fibroblastos humanos
Ejemplo de prueba 14
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del ejemplo de prueba 11, excepto que se utilizaron los oligómeros PMO n° 14 y 21 y la RT-PCR se realizó utilizando los cebadores siguientes.
Cebador directo: 5'- CATGGAAGGAGGGTCCCTAT-3' (SEQ ID NO: 69)
Cebador inverso: 5'- CTGCCGGCTTAATTCATCAT-3' (SEQ ID NO: 70)
Resultados experimentales
El resultado de RT-PCR se muestra en la FIG. 24 y la eficacia de omisión se muestra en la FIG. 25. Estos experimentos revelaron que en las células GM05112 los oligómeros PMO n° 14 y 21 de la presente invención causaron la omisión del exón 55 con una alta eficacia y el valor de EC50 fue de 3.5 pM y 7.5 pM, respectivamente.
Ejemplo de prueba 15
Los experimentos se realizaron de acuerdo con la condición y el procedimiento del ejemplo de prueba 13, excepto que se utilizaron las células 04-035 (células obtenidas a partir de pacientes con DMD humana con deleción única del exón 54, depósito de recursos de investigación del trastorno neuromuscular del Centro Nacional de Neurología y Psiquiatría) y se añadieron 1, 3, 10 pM de los oligómeros PMO n° 14 y 21 a una concentración final y la RT-PCR utilizando los cebadores siguientes.
Cebador directo: 5'- CATGGAAGGAGGGTCCCTAT-3' (SEQ ID NO: 69)
Cebador inverso: 5'- CTGCCGGCTTAATTCATCAT-3' (SEQ ID NO: 70)
Resultados experimentales
El resultado de RT-PCR se muestra en la FIG. 30 y la eficacia de omisión se muestra en la FIG. 31. Estos experimentos revelaron que en células obtenidas a partir de pacientes con DMD humana con deleción única del exón 54, los oligómeros PMO n° 14 y 21 de la presente invención causaron la omisión del exón 55 con una alta eficacia.
Aplicabilidad industrial
Los resultados experimentales en los ejemplos de prueba demuestran que los oligómeros de la presente invención causaron la omisión del exón con una eficacia notablemente alta tanto en células RD como en células obtenidas a partir de pacientes con DMD.
Por lo tanto, los oligómeros de la presente invención son extremadamente útiles para el tratamiento de DMD.
Listado de secuencias de texto libre
SEQ ID NO: 9: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 10: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 11: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 12: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 13: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 14: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 15: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 16: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 17: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 18: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 19: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 20: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 21: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 22: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 23: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 24: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 25: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 26: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 27: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 28: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 29: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 30: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 31: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 32: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 33: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 34: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 35: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 36: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 37: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 38: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 39: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 40: ácido nucleico sintético
SEQ ID NO: 41: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 42: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 43: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 45: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 46: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 47: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 48: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 49: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 50: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 51: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 52: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 53: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 54: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 55: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 56: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 57: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 58: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 59: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 60: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 61: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 62: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 63: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 64: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 65: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 66: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 67: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 68: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 69: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 70: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 71: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 72: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 73: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 74: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 75: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 76: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 77: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 78: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 79: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 80: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 81: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 82: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 83: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 84: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 85: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 86: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 87: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 88: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 89: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 90: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 91: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 92: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 93: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 94: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 95: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 96: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 97: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 98: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 99: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 100: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 101: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 102: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 103: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 104: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 105: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 106: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 107: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 108: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 109: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 110: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 111: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 112: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 113: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 114: ácido nucleico sintético SEQ ID NO 115: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 116: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 117: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 118: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 119: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 120: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 121: ácido nucleico sintético SEQ ID NO: 122: ácido nucleico sintético

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 55° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos del 14° al 34° o del 15° al 34°, desde el extremo 5' del exón 55° en el gen de la distrofina humana.
2. El oligómero antisentido de la reivindicación 1, que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos del 157° al 177° y del 157° al 176° de la SEQ ID NO: 5.
3. Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 45° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 1° al 21°, desde el extremo 5' del exón 45° en el gen de la distrofina humana.
4. El oligómero antisentido de la reivindicación 3, que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 156° al 176° de la SEQ ID NO: 6.
5. Un oligómero antisentido que provoca la omisión del exón 50° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 107° al 127°, desde el extremo 5' del exón 50° en el gen de la distrofina humana.
6. El oligómero antisentido de la reivindicación 5, que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 3° al 23° de la SEQ ID NO: 7.
7. Un oligómero antisentido que causa la omisión del exón 44° en el gen de la distrofina humana, que consiste en una secuencia complementaria a las secuencias de nucleótidos que consisten en los nucleótidos 27° al 47° o 27° al 46°, desde el extremo 5' del exón 44° en el gen de la distrofina humana.
8. El oligómero antisentido de la reivindicación 7, que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada por una cualquiera seleccionada del grupo que consiste en los nucleótidos 102° al 122° y 103° al 122° de la SEQ ID NO: 8.
9. El oligómero antisentido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es un oligonucleótido.
10. El oligómero antisentido según la reivindicación 9, en donde el resto de azúcar y/o la región de unión a fosfato de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido está modificada.
11. El oligómero antisentido según la reivindicación 10, en donde el resto de azúcar de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido es una ribosa en la que el grupo 2'-OH está reemplazado por uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en OR, R, R'OR, SH, SR, NH2 , NHR, NR2 , N3 , CN, F, Cl, Br e I en donde R es un alquilo o un arilo y R' es un alquileno.
12. El oligómero antisentido según la reivindicación 10 u 11, en donde la región de unión a fosfato de al menos un nucleótido que constituye el oligonucleótido es uno cualquiera seleccionado del grupo que consiste en un enlace fosforotioato, un enlace fosforoditioato, un enlace alquilfosfonato, un enlace fosforamidato y un enlace de boranofosfato.
13. El oligómero antisentido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que es un oligómero de morfolino.
14. El oligómero antisentido según la reivindicación 13, que es un oligómero de morfolino fosforodiamidato.
15. El oligómero antisentido de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, en donde el extremo 5' es cualquiera de los grupos de fórmulas químicas (1) a (3) a continuación:
Figure imgf000077_0001
( 1 ) ( 2 ) (3 )
16. Una composición farmacéutica para el tratamiento de la distrofia muscular, que comprende como ingrediente activo el oligómero antisentido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, o una sal o hidrato farmacéuticamente aceptable del mismo.
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