CN111542606A - 硫吗啉代寡核苷酸用于治疗肌肉营养不良 - Google Patents

Abstract

通过施用能够与人肌营养不良蛋白基因中的选定靶位点结合以诱导外显子跳跃以产生功能性肌营养不良蛋白的反义硫吗啉代分子来治疗肌肉营养不良的改进的组合物和方法。

Description

硫吗啉代寡核苷酸用于治疗肌肉营养不良

本申请以2017年9月22日提交的美国临时专利申请号62/562,162为优先权，其通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及用于治疗患者的肌营养不良症的改良方法的领域。它还提供了适合于促进人肌营养不良蛋白基因里的外显子跳跃的组合物。

背景技术

为纠正或补偿异常或与疾病相关的基因,反义化合物正在各种适应症中被开发。反义分子特异性地抑制基因表达，因此，许多有关寡核苷酸作为基因表达调节剂的研究工作都集中在抑制靶基因的表达或顺式作用元件的功能上。但是，此类技术将无用于达到上调天然蛋白产生的目标或补偿诱导翻译过早终止的突变，如无义或移码突变。在这些情况下，缺陷基因转录物的降解或空间抑制将无法补偿靶向突变。

外显子剪接过程由复杂的多组分机器引导，使pre-mRNA中的相邻外显子-内含子连接紧密相邻，并在内含子末端进行磷酸二酯键的裂解，随后在要剪接在一起的外显子之间进行重整。这种复杂且高度精确的过程是由pre-mRNA中相对较短且半保守的RNA片段的序列基元来介导，这些相对较短且半保守的RNA片段与随后参与剪接反应的各种核剪接因子结合。通过改变剪接机制读取或识别参与pre-mRNA加工的基序的方式，可以产生差异剪接的mRNA分子。通过这种方式，剪接过程中靶向外显子跳跃的过程可以调节突变对基因最终表达的影响。

当长基因中有许多外显子和内含子，外显子的遗传组成存在冗余，或者蛋白质在没有一个或多个特定外显子的情况下,靶向外显子跳跃的过程能特别起作用。重定向基因处理以治疗与各种基因突变引起的截短相关的遗传疾病的努力集中在反义寡核苷酸的使用上，该反义寡核苷酸可以：(1)与剪接过程中涉及的元件完全或部分重叠；或(2)与pre-mRNA结合，结合的位置足够接近元件，以破坏通常介导在该元件上发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。

杜兴氏肌营养不良症(DMD)是由肌营养不良蛋白的表达缺陷引起的。编码蛋白质的基因包含79个外显子，分布在超过200万个核苷酸的DNA中。任何改变外显子阅读框，或引入终止密码子，或特征在于去除一个或多个整个外框外显子，或一个或多个外显子的重复的外显子突变，都可能破坏功能性肌营养不良蛋白的产生，导致DMD。

DMD是一种严重的肌肉萎缩和致命的遗传疾病，主要影响男孩，导致成年初期死亡。DMD患者缺乏肌营养不良蛋白，其肌营养不良蛋白是增强和保护肌肉所必需的，而导致功能性肌营养不良蛋白的表达被消融是由于肌营养不良蛋白(DMD)基因的一个或多个外显子中出现的无义或移码突变。两种治疗性AO，如具有2'-O-硫代磷酸二甲酯(2'-OMePS)化学物质的Drisapersen(来自Biomarin Inc)，以及具有磷酸二氨基甲酸酯磷(PMO)化学方法的Eteplersen(来自Sarepta Therapeutics的EXONDYS 51^TM)，旨在靶向DMD中的外显子-51，已进入临床试验的第三阶段。Drispersen因疗效差和毒性问题而被美国FDA拒绝，而Eteplersen于2016年9月获得了加速有条件的临床使用批准。

尽管一种常规的基于PMO的AO目前正在临床中使用，但是与该化学方法相关有一些重大局限性。例如，当前的PMO与标准的亚磷酰胺化学方法不兼容，无法与其他公认的核苷酸类似物合成混合器AO。另外，目前的PMO AOs在体内给药后通过尿液迅速排泄，因此需要高剂量(30mg/kg/周；对于40kg患者为1.2g/周)，这最终使该药物非常昂贵。当前的PMOAO的另一个显著局限性是，由于它们的中性电荷，它们不能与目前可用的转染试剂复合，用于体外快速细胞研究。

因此，对于治疗患者的肌营养不良症的改进的组合物和方法仍有需求。

发明内容

发明人已经开发出新颖的吗啉代化学物质以克服与当前的PMO AO相关的限制。

本公开提供了反义寡核苷酸(ODN)，其包括对需要这种治疗的哺乳动物中，能有效治疗或预防肌营养不良症的进展的硫吗啉代核苷酸。在RNA加工过程中，这些含硫吗啉代核苷酸(TMO)可能会导致肌营养不良蛋白基因的转录本外显子(包括外显子51)的外显子跳跃，类似于反义寡核苷酸eteplirsen，但血清半衰期更长，生产方法的复杂度大大降低，并最终提供较便宜的治疗组合物和给药方案。

本公开内容特别有用的TMO包括反义ODN 1147、1148、1153和1154(图1C和1D中所示的碱基序列和核苷酸间键合)：

相应地，本发明还提供了通过施用与人肌营养不良蛋白的外显子的靶区域互补的有效量的本发明的TMO组合物来治疗患者的肌营养不良症，特别是杜兴氏肌营养不良症(DMD)的方法，其TMO组合物特异性地与靶区域杂交，诱导外显子跳跃，从而治疗肌肉营养不良。相对于没有遭受肌营养不良症的健康受试者，这种TMO的施用将足以增加受试者中肌营养不良蛋白阳性纤维的数量，以稳定、维持或改善患者的步行距离。

在这些方法中，可以以一定剂量和一定时间段施用本公开内容的TMO，从而将受试者的肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加至存在于不患有肌营养不良症的健康受试者的肌营养不良蛋白阳性纤维的至少20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或约95％。

在这些方法中，本公开内容的TMO可以通过施用全身输注，例如每周一次或每两个月一次。

这些方法可以包括通过施用包括本公开内容的反义TMO的组合物来治疗患者的肌营养不良的方法，其TMO组合物长度为20至50个核苷酸，其包括与人肌营养不良蛋白基因的外显子的靶区域互补的至少10个连续核苷酸，其中以反义寡核苷酸与靶区域特异性杂交诱来诱导外显子跳跃，从而治疗受试者的肌营养不良。

在这些方法中，反义TMO可以与人肌营养不良蛋白基因的外显子中的靶区域互补，所述人肌营养不良蛋白基因的外显子选自外显子23，外显子51，外显子50，外显子53，外显子45，外显子46，外显子44，外显子52，外显子55和外显子8。

在这些方法中，反义寡核苷酸的长度为15至20、20至50、30至50或20至30个核苷酸。

在这些方法中，反义TMO可以化学连接至增强反义寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取的一个或多个部分或缀合物，例如富含精氨酸的肽。

因此，本公开内容还提供了包括至少一个硫吗啉代核苷酸的独特的反义寡核苷酸，以及包括此类TMO和一种或多种药物赋形剂的药物组合物。

本发明内容既无意也不应解释为代表本公开的全部范围和范围。此外，本文中对“本公开”或其各个方面的引用应被理解为表示本公开的某些实施例，并且不必理解为将所有实施例限制为特定的描述。在该概述以及附图和实施方式的描述中以各种详细程度阐述了本公开，并且通过包括或不包括要素，组件等以对本公开的范围没有限制。根据实施例的描述，特别是与附图一起使用时，本公开的其他方面将变得更加显而易见。

附图说明

图1A示出了用于制备图1B所示的合成循环的底物的合成方案。在合成方案中：试剂(i)NaIO₄(1.1当量)，(NH₄)2B₄O₇(1.1当量)，MeOH；(ii)NaCNBH₃(2.0当量)，AcOH(2.0当量)，MeOH；(iii)P(OCH₂CH₂CN)(NiPr₂)₂(1.2当量)，4,5-二氰基咪唑(4,5-dicyanoimidazole)(0.5当量)和CH₂Cl₂。

图1B显示了用于制备本公开内容的硫吗啉代寡核苷酸的合成循环，以及可以使用这些合成程序形成的示例性寡核苷酸链(左上方的方框)。

图1C示出了在小鼠模型中的H2K mdx细胞里，用于研究跳跃的外显子23的硫吗啉代ODN(TMO)的设计。该设计描绘了用于诱导H-2Kb-tsA58 mdx小鼠肌管Dmd转录本中外显子23跳跃的硫吗啉代和硫吗啉代/DNA嵌合体。在所示的示例性ODN序列中，硫吗啉代和硫代磷酸酯核苷酸间键由星号(*)表示；吗啉代和2'脱氧核糖核苷分别用大写字母和小写字母表示；2'-O-甲基尿苷核苷酸用“u-2'-OMe”表示。每个ODN都有相同的碱基序列[ggccaaacctcggcttaccn；SEQ ID NO：2，其中末端“n”是经修饰的碱基2'-O-甲基尿苷(um)]，而2'-Ome PS对照是例外，该2'-Ome PS具有相同的碱基序列，但将胸腺嘧啶碱基替换为尿苷碱[ggccaaaccucggcuuaccn；SEQ ID NO：3，其中末端“n”是修饰的碱基2'-O-甲基尿苷(um)]。

图1D显示了在图1C所示的ODN中形成的核苷酸间键的化学结构。在左图中，描绘了ODN1147、1148、1153和1154中存在的核苷酸间键的化学结构：在中间，描绘了PMO对照化合物中存在的核苷酸间键。在右图中，描述了2'-Ome PS对照化合物中存在的核苷酸间键。

图2A至图2C示出了杜兴氏肌营养不良症中诱导外显子跳跃的模型。图2A描绘了内源性肌营养不良蛋白mRNA的图谱，包括外显子和内含子。图2B显示了用于诱导外显子23的外显子跳跃的方法，导致活性肌营养不良蛋白的产生。图2C显示了特定的ODN序列(SEQ IDNO：2)以及其如何与肌营养不良蛋白mRNA外显子23(SEQ ID NO：1)中的外显子/内含子边界重叠。

图3显示了当用lipofectin进行一天的转染时，外显子23的外显子跳跃结果的总结。

图4显示了当用lipofectamine进行一天的转染时，外显子23的外显子跳跃结果的总结。

图5显示了当在没有lipofectin或lipofecamine的情况下进行一天转染时，外显子23的外显子跳跃结果的总结。

图6示出了使用光密度分析法检查图4和5所示结果的总结。

图7显示了当在没有任何脂质的情况下进行5天的转染时外显子23的外显子跳过的结果的总结。

具体实施方式

本公开提供了通过施用为诱导人肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃特别设计的反义寡核苷酸化合物来治疗诸如杜兴氏肌营养不良症(DMD)的肌营养不良症的改进方法。肌营养不良蛋白在肌肉功能中起着至关重要的作用，各种与肌肉相关的疾病的特征是该基因的突变形式。因此，在某些实施方案中，本文所述的改进方法可用于诱导人肌营养不良蛋白基因的突变形式(例如在DMD中发现的突变肌营养不良蛋白基因)中的外显子跳跃。

由于突变引起的异常mRNA剪接事件，突变的人肌营养不良蛋白基因要么表达缺陷性肌营养不良蛋白，要么根本不表达可测量的肌营养不良蛋白，这种情况导致各种形式的肌营养不良。为了纠正这种情况，本发明的反义化合物与突变的人肌营养不良蛋白基因的预处理RNA的选定区域杂交，并在否则异常剪接的mRNA中诱导外显子跳跃和差异剪接，从而使肌肉细胞产生编码功能性肌营养不良蛋白的mRNA转录物。在某些实施方案中，所得的肌营养不良蛋白不一定是肌营养不良蛋白的“野生型”形式，而是截短的但功能性或半功能性形式的肌营养不良蛋白。

通过增加肌肉细胞中功能性肌营养不良蛋白的水平，这些方法可用于预防和治疗肌营养不良症，特别是那些肌营养不良症的形式，例如DMD，其特征是由于异常的mRNA剪接而导致的缺陷性肌营养不良蛋白的表达。本文所述的方法进一步为患有肌营养不良症的患者提供了改进的治疗选择，并且相对于治疗相关形式的肌营养不良症的替代方法提供了明显的和实际的优势。例如，本公开内容的改进方法涉及用于诱导人肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃的硫吗啉代反义化合物的施用，其方法可能比现有方法需要更低的剂量和/或更不频繁的给药方案。

因此，本发明涉及通过在患者体内诱导外显子跳跃来治疗肌肉萎缩症，例如DMD，的改良方法。在这些方法中，通过施用包括硫吗啉代寡聚物(TMO)的有效量的组合物来诱导外显子跳跃，该组合物选择性地结合肌营养不良蛋白pre-mRNA中外显子中的靶序列。在这些治疗DMD的方法中，施用有效量的组合物可包括几种量之一，例如约2mg/kg，约5mg/kg，约10mg/kg或15mg/kg至50mg/kg的剂量，其包括本文所述的反义硫吗啉代，并在足够的时间内给药以治疗疾病。

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，但是优选的方法和材料将被描述。为了本发明的目的，以下术语定义如下。

定义

“大约”是指数量，水平，值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度相对于参考数量，水平，数值，数量，频率，百分比，尺寸，大小，数量，重量或长度相差多达30，25，20，15，10，9，8，7，6，5，4，3，2或1％。

术语“互补的”和“互补性”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“T-G-A(5'-3')”与序列“T-C-A(5'-3')”互补。互补性可以是“部分的”，其中仅某些核酸的碱基根据碱基配对规则匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“全部”互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。尽管通常需要完美的互补性，但是一些实施方案可以包括相对于靶RNA的一个或多个但优选6、5、4、3、2或1个错配。低聚物内任何位置的变化均被包括。在某些实施方案中，寡聚物末端附近的序列变化通常优于内部变化，并且如果存在，通常在5'和/或3'末端的约6、5、4、3、2或1个核苷酸内。

术语“细胞穿透肽”和“CPP”可互换使用，是指阳离子细胞穿透肽，也称为“转运肽”，“载体肽”或“肽转导域”。如本文所示，这些肽具有在一定细胞培养物群体的100％细胞内诱导细胞渗透的能力，并且在全身性施用后允许体内多个组织内的大分子移位。优选的CPP实施方案是如下文进一步描述的富含精氨酸的肽。

术语“反义寡聚物”和“反义化合物”和“反义寡核苷酸”可互换使用，该术语指的是环状核苷酸的序列，各自带有碱基配对部分，并且是通过核苷酸间键连接的，其通过Watson-Crick碱基配对，允许碱基配对部分与核酸(通常是RNA)中的靶序列杂交，由此在靶序列内形成核酸：寡聚物异源双链体。环状亚基基于核糖或另一种戊糖，或在一个优选的实施方案中，基于硫吗啉代基团(参见下面的吗啉代低聚物的描述)。该寡聚物可以与靶序列具有精确的或接近的序列互补性，在低聚物末端附近的序列变化通常优于内部变化。

在这些方法中，可以将反义寡聚物设计为阻碍或抑制mRNA的翻译或抑制天然的pre-mRNA剪接过程，并且可以被称为“定向”或“靶向”与其杂交的靶序列。靶序列通常是包含mRNA的AUG起始密码子，翻译抑制寡聚物或预处理的mRNA的剪接位点，剪接抑制寡聚物(SSO)的区域。剪接位点的靶序列可以包括mRNA序列，该mRNA序列在预处理的mRNA中的正常剪接受体联结处下游具有5'端1至约25个碱基对。优选的靶序列是预处理的mRNA的任何区域，其包括剪接位点或完全包含在外显子编码序列内或跨越剪接受体或供体位点。当寡聚体以上述方式靶向靶标的核酸时，该寡聚体更普遍地被认为是“靶向”生物学相关的靶标，例如蛋白质，病毒或细菌。

术语“吗啉代低聚物”或“硫吗啉代低聚物”或“TMO”是指由吗啉代亚基结构(包括硫吗啉代)组成的寡核苷酸类似物，其中(i)所述结构通过含硫代磷酸酯的键连接在一起，所述键长为1-3个原子，优选两个原子长，可以不带电荷或阳离子，将一个亚基的吗啉代氮与相邻亚基的5'环外碳连接，并且(ii)每个吗啉代环带有一个嘌呤或嘧啶碱基配对部分，该部分可通过碱基特异性氢键有效地与多核苷酸中的碱基结合。参见例如图1A，1B和1C所示的结构。只要不影响结合或活性，就可以对此连接进行改变。5'氧可以被氨基或低级烷基取代的氨基取代。连接于磷上的的侧氮可以是非取代的，单取代的或被(任选取代的)低级烷基双取代。嘌呤或嘧啶碱基配对部分通常是腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，尿嘧啶，胸腺嘧啶或肌苷。吗啉代低聚物的合成，结构和结合特性在共同待决的2017年9月15日提交的PCT专利申请PCT/US17/51839中进行了详细描述，其全部内容通过引用合并于此。

“氨基酸亚基”或“氨基酸残基”可以指α-氨基酸残基(--CO—CHR--NH-)或β-或其他氨基酸残基(例如—CO--(CH₂)nCHR-NH-)，其中R为侧链(可包含氢)，且n为1至6，优选1至4。

术语“天然存在的氨基酸”是指存在于自然界中的蛋白质中的氨基酸。术语“非天然氨基酸”是指天然存在的蛋白质中不存在的那些氨基酸。实例包括β-丙氨酸(β-Ala)，6-氨基己酸(Ahx)和6-氨基戊酸。

“外显子”是指编码蛋白质的核酸的定义部分，或者是在预先处理的(或前体)RNA的一部分被剪接去除后，以RNA分子的成熟形式代表的核酸序列。成熟的RNA分子可以是信使RNA(mRNA)或功能形式的非编码RNA，例如rRNA或tRNA。人肌营养不良蛋白基因有79个外显子。

“内含子”是指不被翻译成蛋白质的核酸区域(基因内)。内含子是转录成前体mRNA(pre-mRNA)之后在形成成熟RNA过程中通过剪接去除的非编码部分。

“有效量”或“治疗有效量”是指以单剂量或一系列剂量的一部分施用于人受试者的治疗化合物，例如反义寡核苷酸，该剂量有效产生理想的治疗效果。对于反义寡核苷酸，通常通过抑制所选靶序列的翻译或天然剪接加工来产生这种效果。有效量在治疗受试者的期间内可以是可变的有效量，例如包含硫吗啉代反义寡核苷酸的5mg/kg的组合物。在一个实施方案中，为将受试者体内肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加至常态的至少20％，有效量可以是包含反义寡核苷酸的5mg/kg的组合物。在另一个实施方案中，有效量可以是包含反义寡核苷酸的5mg/kg的组合物，以相对于健康同龄人而来稳定、维持或改善患者的步行距离。在另一方面，有效量可以是5mg/kg，施用至少24周，至少36周或至少48周，从而将受试者的肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加至常态的至少20％，至大约30％，大约40％，大约50％，大约60％，大约70％，大约80％，大约90％或至大约95％，并且以相对于健康同龄人来稳定或改善患者的步行距离。

“外显子跳跃”通常是指从给定的预处理RNA中去除整个外显子或其一部分，从而排除其存在于成熟RNA中的过程，例如翻译成蛋白质的成熟mRNA。因此，部分不被排除反由被跳过的外显子编码的蛋白质即不会以该蛋白质的表达形式存在，且通常能形成虽有改变但仍具有功能的蛋白质形式。在某些实施方案中，被跳过的外显子是来自人肌营养不良蛋白基因的异常外显子，其可能在其序列中包含如若不被跳过将引起异常剪接的突变或其他改变。在某些实施方案中，被跳过的外显子是人肌营养不良蛋白基因的外显子1-79中的任何一个或多个，例如3-8、10-16、19-40、42-47和50-55，但优选是人肌营养不良蛋白基因中的外显子24、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56和8。

“肌营养不良蛋白(Dystrophin)”是杆状胞质蛋白，是蛋白质复合物的重要组成部分，其通过细胞膜将肌肉纤维的细胞骨架连接到周围的细胞外基质。肌营养不良蛋白包含多个功能域。例如，肌营养不良蛋白在约氨基酸14-240处含有肌动蛋白结合结构域，在约氨基酸253-3040处含有中央杆结构域。这个大中央结构域是由约109个氨基酸的24种血影蛋白样三螺旋元件形成的，它们与α-肌动蛋白和血影蛋白具有同源性。重复序列通常被四个富含脯氨酸的非重复片段(也称为铰链区)打断。重复序列15和16被18个似乎为肌营养不良蛋白的蛋白水解裂解提供了一个主要位点的氨基酸延伸分隔。大多数重复序列之间的序列同一性范围为10％至25％。一个重复序列包含三个α-螺旋：1、2和3。α-螺旋1和3分别由7个螺旋圈形成，并通过疏水界面作为螺旋线圈相互作用。α-螺旋2具有更复杂的结构，由四个和三个螺旋匝的段形成，并由甘氨酸或脯氨酸残基分隔。每个重复序列由两个外显子编码，通常由在α-螺旋2的第一部分中的氨基酸47和48之间的内含子中断。另一个内含子位于重复序列的不同位置，通常散布在helix-3上。肌营养不良蛋白在大约氨基酸3080-3360处还含有一个富含半胱氨酸的结构域，其中包括一个富含半胱氨酸的区段(即在氨基酸280中的15个半胱氨酸)，与粘液霉菌(Dictyostelium discoideum)的肌动蛋白的C端结构域具有同源性。羧基末端结构域在约氨基酸3361-3685处。

在肌膜炎上,肌营养不良蛋白的氨基末端与F-肌动蛋白结合，而羧基末端则与肌营养不良蛋白相关的蛋白质复合物(DAPC)结合。DAPC包括肌营养不良蛋白聚糖，肌糖蛋白聚糖，整联蛋白和小窝蛋白，这些任何一种成分中的突变都会导致自身遗传性肌营养不良。当缺乏肌营养不良蛋白，DAPC会不稳定，并会导致成员蛋白水平降低，进而导致进行性纤维损伤和膜渗漏。在各种形式的肌营养不良症中，例如杜兴氏肌营养不良症(DMD)和贝克尔肌营养不良症(BMD)，这主要是由于基因序列突变导致错误的拼接，使得肌肉细胞产生改变和功能缺陷的肌营养不良蛋白，或无肌营养不良蛋白。如上所述，缺陷性肌营养不良蛋白的主要表达，或者类似的肌营养不良蛋白或肌营养不良蛋白样蛋白的完全缺乏，可导致肌肉退化的快速发展。就这一点而言，如本领域已知，“缺陷性”的肌营养不良蛋白蛋白的特征在于某些患有DMD或BMD的受试者中产生的肌营养不良蛋白的形式，或不存在可检测的肌营养不良蛋白。

如本文所用，术语“功能”和“功能性”等是指生物学的，酶的或治疗的功能。“功能性”肌营养不良蛋白通常是指具有足够的生物学活性以减少肌肉组织的进行性降解的肌营养不良蛋白，反之其是肌营养不良症的特性，而这通常是相比于某些患有DMD或BMD的受试者的肌营养不良蛋白中改变或“有缺陷”形式的肌营养不良蛋白。在某些实施方案中，功能性肌营养不良蛋白可以具有约10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％(包括它们之间的所有整数)的野生型肌营养不良蛋白的体外或体内生物活性，该数值根据本领域常规技术测定。作为一个实例，可以根据肌管大小，肌原纤维的组织(或解组织)，收缩活性和乙酰胆碱受体的自发聚集来测量体外肌肉培养物中与肌营养不良蛋白相关的活性(参见，例如，Brown等，Journal of CellScience112：209-16，1999)。动物模型也是研究疾病发病机理的宝贵资源，并提供了检测肌营养不良蛋白相关活性的手段。用于DMD研究的两种最广泛使用的动物模型是mdx小鼠和金毛寻回犬肌肉营养不良(GRMD)狗，该动物模型都是肌营养不良蛋白阴性(参见，例如，Collins&Morgan，Int J Exp Pathol 84：165-172，2003)。这些和其他动物模型可用于测量各种肌营养不良蛋白的功能活性。这包括肌营养不良蛋白的截短形式，例如由本发明的某些跳过外显子的反义化合物产生的形式。

肌营养不良蛋白合成或产生的术语“恢复”通常是指在用本文所述的反义寡核苷酸治疗后，在肌营养不良患者中产生肌营养不良蛋白，包括截短形式的肌营养不良蛋白。在一些实施方案中，治疗导致患者的新型肌营养不良蛋白产生增加1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％(包括介于两者之间的所有整数)。在一些实施方案中，治疗使肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加到受试者正常值的至少20％，约30％，约40％，约50％，约60％，约70％，约80％，约90％或约95％至100％。在其他实施方案中，治疗使受试者的肌营养不良蛋白阳性纤维的数目增加至正常的约20％至约60％，或约30％至约50％。可以使用已知技术通过肌肉活检来确定患者治疗后肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比。例如，可以从患者的合适肌肉中，诸如肱二头肌，进行肌肉活检。

肌营养不良蛋白阳性纤维百分比的分析可以在治疗前和/或后进行，也可以在整个治疗过程中的某些时间点内进行。例如，治疗后活检取自治疗前活检的对侧肌肉。治疗前和治疗后肌营养不良蛋白表达的研究可以使用肌营养不良蛋白的任何合适的测定方法进行。使用作为肌营养不良蛋白的标志物的抗体，例如单克隆或多克隆抗体，对来自肌肉活检的组织切片进行免疫组织化学检测。例如，可以使用MANDYS106抗体，其是肌营养不良蛋白的高度敏感的标记。可以使用任何合适的二抗。

肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比可以通过将阳性纤维的数量除以计数的总纤维来计算。正常肌肉样本具有100％的肌营养不良蛋白阳性纤维。因此，肌营养不良蛋白阳性纤维的百分数可以表示为正常百分数。为了控制治疗前的肌肉和回复纤维中痕量的肌营养不良蛋白的存在，可以在对治疗后的肌肉中的肌营养不良蛋白阳性纤维计数时，使用每位患者的治疗前肌肉切片来设置基线。这可以用作计算该患者治疗后肌肉部分中的肌营养不良蛋白阳性纤维的阈值。使用Bioquant图像分析软件(Bioquant Image AnalysisCorporation，田纳西州，纳什维尔)的抗体染色的组织切片也可来用于肌营养不良蛋白的定量。肌营养不良蛋白荧光信号的总强度可以报告为正常百分比。此外，使用单克隆或多克隆抗肌营养不良蛋白抗体的免疫印迹分析可用于确定肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比。例如，可以使用来自Novacastra的抗肌营养不良蛋白抗体NCL-Dys1。肌营养不良蛋白阳性纤维的百分比也可以通过确定肌糖蛋白复合物(β，γ)和/或神经元NOS的成分表达来分析。

“分离的”是指实质上或本质上不含在天然状态下通常伴随的组分的材料。例如，本文所用的“分离的多核苷酸”可以指已经从天然存在的侧翼序列中纯化或去除的多核苷酸，例如已经从通常与片段相邻的序列中去除的DNA片段。

如本文所用，“足够的长度”是指与靶肌营养不良蛋白前mRNA中的至少8个，更典型地8-30个，连续的核碱基互补的反义寡核苷酸。在一些实施方案中，足够长度的反义寡核苷酸在靶肌营养不良蛋白前mRNA中包含至少8、9、10、11、12、13、14或15个连续的核碱基。在其他实施方案中，足够长度的反义序列在靶肌营养不良蛋白前mRNA中包含至少16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个连续的核碱基。具有足够长度的反义寡核苷酸具有至少最小数目的核苷酸，其能够与肌营养不良蛋白基因的外显子1-79中的一个或多个特异性杂交。优选地，本发明的反义寡核苷酸具有最少数目的核苷酸，其能够与人肌营养不良蛋白基因的外显子24、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或8中的任何一个或多个特异性杂交。优选地，足够长度的寡核苷酸的长度为约8至约50个核苷酸，包括8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22，23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39和40个或更多核苷酸。因此，足够长度的寡核苷酸在长度上可以是10至约30个核苷酸，或15至约25个核苷酸，或20至30或20至50个核苷酸，或25至28个核苷酸。

通过“增强”或“增强性”，“增加”或“增加性”或“刺激”或“刺激性”，通常是指本公开内容的一种或多种反义化合物或组合物在细胞或受试者中产生或引起更大生理学反应(即下游作用)的能力，相对于没有反义化合物或对照化合物引起的反应。可测量的生理反应可以包括肌营养不良蛋白的功能形式的表达增加，或者肌组织中肌营养不良蛋白相关的生物学活性的增强，以及根据本领域的理解和本文的描述显而易见的其他响应。肌肉功能的增强也可以被测量，其包括约1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的肌肉功能的增强或改善。能表达功能性肌营养不良蛋白的肌肉纤维的百分比也能够被测量，其包括在约1％，2％，％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的肌纤维中增加的肌营养不良蛋白表达。例如，若25-30％的纤维能表达肌营养不良蛋白，那约40％的肌肉功能的改善已被表明是可以发生的(参见，例如，DelloRusso等人，Proc Natl Acad Sci USA 99：12979-12984，2002)。“增加”或“增强”的数量通常是“统计上显著”的数量，并且可以包括为1.1、1.2、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多倍(例如500、1000倍)的增加(包括介于1和大于1的所有整数和小数点，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)，其相对于没有反义化合物(不含药剂)或对照化合物。

术语“减少”或“抑制”通常可以涉及根据诊断技术中的常规技术测量一种或多种本发明的反义化合物“降低”相关生理或细胞反应的能力，例如本文所述的疾病或病症的症状。相关的生理或细胞反应(体内或体外)对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且可以包括肌肉营养不良的症状或病理的减轻，或肌营养不良蛋白的缺陷形式的表达的减少，例如在患有肌营养不良症的人(例如DMD或BMD)中表达的肌营养不良蛋白的改变形式。与没有反义化合物或对照组合物产生的反应相比，反应中的“减少”在统计上可能是显著的，并且可以包括1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的减少，包括介于两者之间的所有整数。

也包括能够表达本发明的寡聚，靶向性肌营养不良蛋白的序列的载体递送系统，例如表达包含表3和4中所示的任何一个或多个序列的多核苷酸序列的载体，及其变体，如本文所述。“载体”或“核酸构建体”是指多核苷酸分子，优选地是例如衍生自质粒，噬菌体，酵母或病毒的DNA分子，可将多核苷酸插入或克隆至其中。载体优选包含一个或多个独特的限制性位点，并且能够在包括靶细胞或组织或其祖细胞或组织的限定宿主细胞中自主复制，或与限定宿主的基因组整合，从而克隆可重复的序列。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如，线性或封闭的环状质粒，染色体外元件，微型染色体或人工染色体。载体可以包含确保自我复制的任何手段。或者，该载体可以是一种载体，当引入宿主细胞时，该载体被整合到基因组中，并与已经整合到其中的染色体一起复制。

个体(例如，哺乳动物，比如人)或细胞的“治疗”是试图改变个体或细胞的自然进程的任何类型的干预。治疗包括但不限于药物组合物的施用，并且可以预防性地进行或在病理事件的开始或与病原体接触之后进行治疗。治疗包括对与肌营养不良蛋白相关的疾病或病症的症状或病理学，例如某些形式的肌肉营养不良，的任何理想影响，并且可能包括，例如，所治疗的疾病或病症的一种或多种可测量标志物的最小变化或改善。也包括“预防性”治疗，其可以旨在降低所治疗疾病或病症的进展速度，延迟该疾病或病症的发作或降低其发作的严重性。“治疗”或“预防”不一定表示完全根除，治愈或预防该疾病或病症或其相关症状。

在一个实施方案中，用本发明的反义寡核苷酸进行的治疗增加了新型肌营养不良蛋白的产生，并且减慢或减少了不进行治疗所预期的移动损失。例如，治疗可以稳定，维持，改善或增加受试者的步行能力(例如，步行的稳定)。在一些实施例中，治疗可维持或增加患者的稳定步行距离，其可通过测量，例如McDonald等人所描述的6分钟步行测试(6MWT)，(Muscle Nerve，2010；42：966-74，通过引用并入本文)。6分钟步行距离(6MWD)的变化可以绝对值，百分比变化或百分比预测值的变化为表示。在一些实施方案中，相对于健康的同龄人，治疗维持或改善了从有20％赤字的受试者的6MWT中的稳定的步行距离。相对于健康同龄人的典型表现，DMD患者的表现在6MWT中可以通过计算百分比预测值来确定。例如，对于男性，可以使用以下公式计算出6MWD的百分比预测值：

196.72+(39.81X年龄)-(1.36X年龄²)+(132.28X以米为单位的高度)。

对于女性，可以使用以下公式计算6MWD百分比预测值：

188.61+(51.50X年龄)-(1.86X年龄²)+(86.10x以米为单位的高度)

(Henricson et al.PLoS Curr.，2012，version 2)。在一些实施方案中，用反义寡核苷酸治疗将患者稳定步行距离从基线增加到大于3、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30或50米(包括在两者之间的所有整数)。

DMD患者的肌肉功能丧失可能发生在儿童时期正常生长发育的背景下。的确，尽管有进行性肌肉损伤，在约1年的时间内，年龄较小的DMD儿童可能在6MWT期间显示行走距离的增加。在一些实施方案中，将来自患有DMD的患者的6MWD与典型发展的对照受试者以及来自年龄和性别匹配的受试者的现有规范数据进行比较。在其他实施例中，可以使用适合于规范数据的基于年龄和身高的方程来说明正常的生长和发育。这样的方程式可用于将6MWD转换为DMD患者的百分比预测值(％预测值)。以百分比预测的6MWD数据的分析代表一种解释正常生长和发育的方法，并且可能表明，早期年龄段(例如，小于或等于7岁)的功能增强代表了DMD患者的能力稳定而不是提高(Henricson等PLoS Curr.，2012，第2版，通过引用并入本文)。

如本文所用，“受试者”包括可以用本发明的反义化合物治疗的表现出症状或有表现出症状的风险的任何动物，例如患有或有患肌营养不良症的风险的受试者，例如DMD或BMD，或与这些疾病相关的任何症状(例如，肌肉纤维丢失)。合适的受试者(患者)包括实验动物(例如小鼠，大鼠，兔子或豚鼠)，农场动物和家畜或宠物(例如猫或狗)。包括非人类灵长类动物，优选人类患者。

以区分不同的反义分子的反义分子命名系统已经被提出并公开了(参见Mann等人，(2002)J Gen Med 4，644-654)。这种命名法可能在测试几个稍微不同并且全都指向相同靶区域的反义分子时便特别相关。

使用名称：H#A/D(x：y)，第一个字母表示物种(例如H：人类，M：鼠科动物，C：犬科动物)。“#”表示靶肌营养不良蛋白外显子数。“A/D”分别表示在外显子的开始和末端的受体或供体剪接位点。(xy)代表退火坐标，其中“-”或“+”分别指示内含子或外显子序列。例如，A(-6+18)将指示内含子在目标外显子之前的最后6个碱基和目标外显子的首18个碱基。最接近的剪接位点是受体，因此这些坐标前面将带有“A”。描述在供体剪接位点的退火坐标可以是D(+2-18)，其中最后2个外显子碱基和首18个内含子碱基对应于反义分子的退火位点。整个外显子退火坐标将由A(+65+85)表示，即从该外显子开始的第65和85个核苷酸之间的位点。

II.构建反义寡核苷酸

本发明的示例性实施方案涉及具有含硫吗啉代核苷酸间键的吗啉代寡核苷酸，如图1D所示。制备此类硫吗啉代寡核苷酸(包括反义寡核苷酸)的有效方法例如在2017年9月15日提交的共同拥有的PCT专利申请号PCT/US17/51839中进行了详细说明，该专利明确地通过引用并入本文。

基于硫吗啉代的亚基的重要特性包括：1)以寡聚形式与2'-脱氧核糖核苷连接的能力；2)支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤，胞嘧啶，鸟嘌呤，胸苷，尿嘧啶和肌苷)的能力，以使形成的聚合物可以与互补碱基的靶核酸杂交，包括靶RNA，Tm值在相对较短的寡核苷酸中(例如8-15个碱基)高于约50℃；3)寡核苷酸主动或被动转运进哺乳动物细胞的能力；和4)比PMO更长的半衰期(即排泄速度更慢)；6)带电荷的骨架，可增加其与当前可用的转染剂复合的能力，以快速地进行体外细胞摄取。

本公开内容的反义硫吗啉代寡核苷酸的示例性主链结构包括图1A和1B所示的吗啉代亚基类型，通过含硫代磷酸酯的核苷酸间键连接。

在某些实施方案中，可以采用2017年9月15日提交的PCT专利申请号PCT/US17/51839和下文中详述的关于具有不带电荷和阳离子主键链的混合物的寡核苷酸的合成方法，通过逐步固相合成来制备反义化合物。在某些情况下，可能需要向反义化合物中添加其他化学部分，例如以增强药代动力学或促进化合物的捕获或检测。根据标准合成方法，该部分可以共价连接。例如，添加部分以增强细胞摄取(例如TAT)或结合Fc的免疫球蛋白亚基，或糖类(例如二糖，例如乳糖)，或聚乙二醇部分或其他亲水性聚合物，例如，一种具有1-100个单体亚基的化合物，其可用于提高溶解度，增加细胞摄取或延长血清半衰期等。

为了检测的目的，可以连接报道分子部分，例如荧光素或放射性标记的基团。或者，与寡聚物连接的报道分子标记可以是能够结合标记的抗体或链霉亲和素的配体，例如抗原或生物素。在选择用于连接或修饰反义化合物的部分时，期望选择具有生物相容性并且可能被受试者耐受而没有不良副作用的基团的化合物。

可用于本公开内容的反义应用的寡聚体的长度通常为约8至约50个核苷酸残基，更优选约8至30个核苷酸，并且通常为10-25个碱基。

每个硫吗啉代(TMO)环结构均支持一个碱基配对部分，以形成一个碱基配对部分的序列，该序列通常设计为与细胞或正在治疗的受试者中的所选反义靶标杂交。碱基配对部分可以是天然DNA或RNA中的嘌呤或嘧啶(例如，碱基腺嘌呤(A)，鸟嘌呤(G)，胞嘧啶(C)，胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或类似物，如次黄嘌呤(核苷肌苷的基本成分)或5-甲基胞嘧啶(5-methyl cytosine)。

如上所述，实施方案包括包含新型核苷酸间键的寡聚物，包括TMO-X寡聚物和具有修饰的末端基团的寡聚物。与具有其他核苷酸间键合的寡聚物相比，这些寡聚物对DNA和RNA的亲和力可能高于相应的未修饰的寡聚物，并表现出改善的细胞递送，效能和/或组织分布特性。在以下讨论中更详细地描述了各种连接类型和低聚物的结构特征和性质。这些和相关低聚物的合成描述于2017年9月15日提交的共同拥有的PCT专利申请号PCT/US17/51839中，其全部内容通过引用合并在此。

当每个分子中足够数量的相应位置被可以彼此氢键结合的核苷酸占据时，寡核苷酸和DNA或RNA彼此互补。因此，“可特异性杂交的”和“互补的”是用来表示足够程度的互补性或精确配对的术语，从而在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定和特异性的结合。本领域中应理解，反义分子的序列不必与其靶序列100％互补即可特异性杂交。当化合物与靶标DNA或RNA分子的结合干扰靶标DNA或RNA的正常功能而导致效用丧失时，反义分子可特异性杂交，并且存在足够程度的互补性以避免反义化合物与非靶序列在需要特异性结合的条件下进行非特异性结合，即在体内测定或治疗方法的生理条件下，以及当在体外测定的情况中进行测定的条件下。

虽然上述方法可用于从能够被缩短而不影响其生物学功能的蛋白质中选择能够删除任何外显子的反义分子，但是外显子的缺失不应导致缩短的转录的mRNA中的阅读框移位。因此，如果在三个外显子的线性序列中，第一个外显子的末端编码密码子中三个核苷酸中的两个，而下一个外显子被删除，则线性序列中的第三个外显子必须以完成密码子中核苷酸三联体的单个核苷酸开始。如果第三个外显子不是以单个核苷酸开始，则将发生阅读框移位，这将导致截短或无功能的蛋白质生成。

应当理解，结构蛋白中外显子末端的密码子排列可能并不总是在密码子末端断裂，因此可能需要从pre-mRNA中删除一个以上的外显子以确保框内阅读mRNA。在这种情况下，可能需要通过本发明的方法选择多个反义寡核苷酸，其中每个反义寡核苷酸都被引导至负责在待删除的外显子中诱导剪接的不同区域。

反义分子的长度可以变化，只要它能够选择性地结合pre-mRNA分子内的预期位置即可。此类序列的长度可以根据本文所述的选择程序确定。通常，反义分子的长度为约10个核苷酸至最高为约50个核苷酸。然而，应当理解，该方法中可以使用该范围内的任何长度的核苷酸。优选地，反义分子的长度在8-30个核苷酸之间。

产生反义分子的最常用方法是2'羟基核糖位置的甲基化，硫代磷酸酯主链的掺入产生表面上类似于RNA但对核酸酶降解更具抵抗力的分子。

为避免与反义分子形成双链体时pre-mRNA的降解，可将这些方法中使用的反义分子调整为最小化或防止其被内源性RNase H裂解。当在含有会导致pre-mRNA反义寡核苷酸双链体的降解的RNase H的细胞内或粗提物中使用非甲基化寡核苷酸来处理RNA时，此特性是高度优选的。能够绕过或不引起这种降解的任何形式的修饰的反义分子都可以用于本方法中。2'-O-甲基(2'-O-methyl)衍生物是反义分子的一个例子，当与RNA结合时，不会被细胞的RNase H裂解。2'-O-甲基-寡核糖核苷酸在细胞环境和动物组织中非常稳定，它们与RNA的双链体的Tm值高于其核糖或脱氧核糖的对应物。

尽管反义寡核苷酸是反义分子的优选形式，但是本公开内容包括其他寡聚反义分子，包括但不限于寡核苷酸模拟物。

可用于本发明的优选的反义化合物的具体实例包括含有修饰的主链或非天然核苷间键的寡核苷酸。如本说明书中所定义，具有修饰的主链的寡核苷酸包括那些在主链中保留硫代磷酸酯和那些在主链中不具有硫代磷酸酯的寡核苷酸。为了本说明书的目的，并且如本领域中有时提及的，在其核苷间主链中不具有硫代磷酸酯的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。

修饰的寡核苷酸还可包含一个或多个取代的糖部分。寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)的修饰或取代。某些核碱基对于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤(2-aminopropyladenine)，5-丙炔基尿嘧啶(5-propynyluracil)和5-丙炔基胞嘧啶(5-propynylcytosine)。5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine)取代已经被显示可将核酸双链体稳定性提高0.6-1.2℃，并且是目前优选的碱基取代，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基(2'-O-methoxyethyl)糖修饰结合时。

本公开内容的寡核苷酸的另一种修饰涉及以增强寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取而将一个或多个部分或缀合物与寡核苷酸化学连接。这样的部分包括但不限于脂质部分，例如糖，该糖如二糖乳糖，胆固醇部分，胆酸，硫醚，该硫醚如己基-5-三苯硫醇(hexyl-5-tritylthiol)，硫代胆固醇，脂族链，该脂族链如，十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如二十六烷基-外消旋甘油(di-hexadecyl-rac-glycerol)或1,2,-二-O-十六烷基外消旋-甘油-3-H-膦酸酯(triethylammonium1,2-di-O-hexadecyl-rac-glycero-3-H-phosphonate)，多胺或聚乙二醇链，或金刚烷乙酸，棕榈基部分，或十八烷基胺或己氨基-羰基-氧胆固醇(hexylamino-carbonyl-oxycholesterol)部分。

不必对化合物中的所有位置均一地进行修饰，并且实际上，可以将多个上述修饰中的一个以上并入单个化合物中，或者甚至在寡核苷酸内的单个核苷中。本公开内容还包括为嵌合化合物的反义化合物。“嵌合”反义化合物或“嵌合体”是反义分子，特别是寡核苷酸，其含有两个或多个化学上不同的区域，每个区域由至少一个单体单元，即在寡核苷酸化合物的情况下，由核苷酸组成。这些寡核苷酸通常包含至少一个区域，其中该寡核苷酸被修饰以赋予对核酸酶降解的增加的抗性，增加的细胞摄取，和/或另外的区域，以增加对靶核酸的结合亲和力。

III肽转运蛋白

本公开内容的反义寡核苷酸可包括缀合至CPP的寡核苷酸部分，所述CPP优选地含有效增强化合物向细胞内转运的富含精氨酸的肽转运部分。所述运输部分优选连接至所述低聚物的末端。肽具有诱导细胞渗透能力的能力，该渗透在给定细胞培养群体内的30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或100％的细胞，包括介于两者之间的所有整数，以及在全身给药后，可在体内多个组织内进行大分子移位。在一个实施方案中，穿透细胞的肽可以是富含精氨酸的肽转运蛋白。在另一个实施方案中，穿透细胞的肽可以是渗透肽或TAT肽。这些肽在本领域中是众所周知的，并且公开于例如美国专利公开号2010/0016215中，其通过引用整体并入本文。肽与反义寡核苷酸缀合的特别优选的方法可以在PCT公开号WO2012/150960中找到，其通过引用整体并入本文。本公开的肽缀合的寡核苷酸的优选实施方案利用甘氨酸作为CPP和反义寡核苷酸之间的接头。例如，优选的肽缀合的PMO由Re-G-TMO组成。相对于不存在附着的运输部分的寡聚物的摄取，这些转运部已被显示出能极大地增强附着的寡聚物的细胞进入。相对于未结合的化合物，吸收优选提高至少十倍，更优选是二十倍。

富含精氨酸的肽转运蛋白(即，细胞穿透肽)的使用在本发明的组合物和方法中特别有用。某些肽转运蛋白已经被显示在反义化合物递送到包括肌肉细胞的原代细胞中是高度有效的(Marshall，Oda等，2007；Jearawiriyapaisarn，Moulton等，2008；Wu，Moulton等，2008)。此外，与其他已知的肽转运蛋白如Penetratin和TAT肽相比，本文所述的肽转运蛋白与反义TMO缀合时，表现出增强的改变几种基因转录物剪接的能力(Marshall，Oda等，2007)。

IV制剂和治疗

本公开内容还提供了适合于将反义寡聚物治疗性递送至受试者的制剂或组合物。这些组合物可以是药学上可接受的组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂一起配制的治疗有效量的本文所述的一种或多种低聚物。虽然本公开内容的低聚物可以单独给药，但是优选以药物制剂(组合物)的形式给药该化合物。

本公开的组合物可以单独施用或与另一种治疗剂组合施用。可以在施用本发明的组合物之前，同时或之后施用另外的治疗剂。例如，组合物可以与类固醇和/或抗生素组合施用。类固醇可以是糖皮质激素或泼尼松。可以施用的其他药物包括瑞丹定受体的拮抗剂，例如丹特罗，其已被证明可以增强患者细胞以及DMD的小鼠模型(G.Kendall等，Sci TranlMed 4 164ra160(2012))中反义介导的外显子跳跃。

递送核酸分子的方法描述于例如Akhtar等，1992，Trends Cell Bio.，2：139，和Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics，编辑Akhta；Sullivan等，PCT WO 94/02595中。这些和其他方案可用于递送几乎任何核酸分子，包括本发明的分离的寡聚物。

如下详述，本公开的药物组合物可以被特别地配制为以固体或液体形式给药，包括适于以下用途的那些：(1)口服给药，例如，滴剂(水性或非水性溶液或悬浮液)，片剂，例如针对颊，舌下和全身吸收的片剂，用于舌头的大丸剂，散剂，颗粒剂，糊剂；(2)肠胃外给药，例如通过皮下，肌肉内，静脉内或硬膜外注射，例如无菌溶液或混悬液或缓释制剂；(3)局部应用，例如以霜剂，软膏或控释贴剂或喷雾剂形式应用到皮肤上；(4)阴道内或直肠内，例如子宫托，乳膏或泡沫；(5)舌下；(6)目光；(7)透皮的；或(8)经鼻。

本文所用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内，适合于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性，刺激性，过敏反应或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的那些化合物，材料，组合物和/或剂型。

本文所用的短语“药学上可接受的载体”是指药学上可接受的材料，组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，制造助剂(例如润滑剂，滑石粉，钙或锌，或硬脂酸)或溶剂包封材料，涉及将主题化合物从一个器官或身体的一部分携带或运输到另一器官或身体的一部分。每个载体在与制剂的其他成分相容且对患者无害的意义上必须是“可接受的”。

可以用作药学上可接受的载体的材料的实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖，葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)黄芪粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石粉；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(九)油，例如花生油，棉籽油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油，大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格试液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯，聚碳酸酯和/或聚酐；(22)药物制剂中使用的其他无毒相容性物质。

适用于与本发明的反义寡聚物一起配制的试剂的其他非限制性实例包括：PEG缀合的核酸，磷脂缀合的核酸，含有亲脂性部分的核酸，硫代磷酸酯，P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)，它们可以促进药物进入各种组织；可生物降解的聚合物，例如在植入后用于持续释放递送的聚(DL-丙交酯-乙交酯)微球(Emerich，DF等人，1999，Cell Transplant，8，47-58，Alkermes，Inc.，剑桥，马萨诸塞州)；以及负载的纳米颗粒，例如由中孔二氧化硅或聚氰基丙烯酸丁酯制成的纳米颗粒，可以通过血液脑屏障传递药物并改变神经元摄取机制(Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，23，941-949，1999)。

这些组合物还可包含脂质体或脂质复合物，包括含有糖和/或聚(乙二醇)脂质(PEG修饰的，支链的和直链的或其组合，或长循环脂质体或隐形脂质体)的表面修饰的脂质体/脂质复合物。本发明的低聚物也可以包含各种分子量的共价连接的PEG分子。这些制剂提供了一种增加药物在靶组织中积累的方法。这类药物载体可抵抗单核吞噬系统(MPS或RES)的调理作用和消除作用，从而使血液循环时间更长和被封装药物的组织暴露能力增强。已经显示这种脂质体/脂质复合物在肿瘤中选择性积聚。长循环脂质体/脂质复合物可以增强DNA和RNA的药代动力学和药效学，特别是与常规阳离子脂质体相比。与阳离子脂质体相比，基于循环脂质体避免在代谢性侵袭性MPS组织(例如肝脏和脾脏)中积累的能力，长循环脂质体还可能在更大程度上保护药物免受核酸酶降解。

该公开内容包括如美国专利号6,692,911、7,163,695和7,070,807所述制备的用于递送的低聚物组合物。因此，本公开内容提供了包含赖氨酸和组氨酸(HK)的共聚物(如美国专利号7,163,695；7,070,807；和6,692,911中所述)的组合物的本发明的低聚物，所述共聚物单独或与PEG(例如，支链的或无支链的PEG或两者的混合物)结合，与PEG和靶向部分结合使用，或上述任何一种与交联剂结合使用。本公开内容还提供了包含葡糖酸修饰的聚组氨酸或葡糖基化聚组氨酸/转铁蛋白-聚赖氨酸的组合物中的反义寡聚物。具有类似于His和Lys的性质的氨基酸可以在组合物中被取代。

本文所述的低聚物可包含碱性官能团，例如氨基或烷基氨基，并且因此能够与药学上可接受的酸形成药学上可接受的盐。在这方面，术语“药学上可接受的盐”是指相对无毒的无机和有机酸加成盐的本发明化合物。这些盐可以在给药媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使本发明的纯化的游离碱形式的化合物与合适的有机或无机酸单独反应，并在随后的纯化过程中分离由此形成的盐来制备。代表性的盐包括氢溴酸盐，盐酸盐，硫酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，硝酸盐，乙酸盐，戊酸盐，油酸盐，棕榈酸盐，硬脂酸盐，月桂酸盐，苯甲酸盐，乳酸盐，磷酸盐，甲苯磺酸盐，柠檬酸盐，马来酸盐，富马酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，萘酸盐，甲磺酸盐，葡庚糖酸盐，乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。

本发明的主题低聚物的药学上可接受的盐包括化合物的常规无毒盐或季铵盐，例如，来自无毒有机或无机酸的盐。例如，常规的无毒盐包括衍生自无机酸的盐，例如盐酸盐，氢溴酸盐，硫酸盐，氨基磺酸盐，磷酸盐，硝酸盐等；由有机酸制备的盐，例如乙酸，丙酸，琥珀酸，乙醇酸，硬脂酸，乳酸，苹果酸，酒石酸，柠檬酸，抗坏血酸，棕榈酸，马来酸，羟基马来酸，苯乙酸，谷氨酸，苯甲酸，水杨酸，磺胺酸，2-乙酰氧基苯甲酸，富马酸，甲苯磺酸，甲磺酸，乙烷二磺酸，草酸，等离子等。

本公开内容的低聚物可以包含一个或多个酸性官能团，因此能够与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在这些情况下，术语“药学上可接受的盐”是指本公开内容的TMO化合物的相对无毒的无机和有机碱加成盐。这些盐同样可以在给药媒介物或剂型制造过程中原位制备，或通过使游离酸形式的纯化化合物与合适的碱，例如药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物，碳酸盐或碳酸氢盐，与氨或可药用有机伯，仲或叔胺分别反应来制备。代表性的碱金属或碱土金属盐包括锂盐，钠盐，钾盐，钙盐，镁盐和铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性有机胺包括乙胺，二乙胺，乙二胺，乙醇胺，二乙醇胺，哌嗪等。(参见，例如，Berge等，同上)。

这些组合物中还可以存在润湿剂，乳化剂和润滑剂，例如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，包衣剂，甜味剂，调味剂和增香剂，防腐剂和抗氧化剂。

药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，半胱氨酸盐酸盐，硫酸氢钠，偏亚硫酸氢钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基茴香醚(BHA)，丁基化羟基甲苯(BHT)，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；(3)柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸等金属螯合剂。

本公开的有用的制剂包括适合于口服，鼻腔，局部(包括颊和舌下)，直肠，阴道和/或肠胃外施用的那些。所述制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量将根据所治疗的宿主和给药方式而变化。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量通常将是产生治疗作用的化合物的量。通常，在百分之一百中，该量将为活性成分的约百分之0.1至约百分之九十九，优选为约百分之5至约百分之70，最优选为约百分之10至约百分之30。

本公开内容的制剂可包含选自环糊精，纤维素，脂质体，胶束形成剂(例如胆汁酸)和聚合物载体(例如聚酯和聚酸酐)的赋形剂；以及本发明的低聚物，其可以使本公开的低聚物具有口服生物利用度。

制备这些制剂或组合物的方法包括使本发明的低聚物与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，通过将本公开内容的化合物与液体载体或细分的固体载体或两者均匀且紧密地结合，然后，如果需要，将产品成型来制备制剂。

适于口服的制剂可以是胶囊剂，扁囊剂，丸剂，片剂，锭剂(使用调味剂，通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)，粉剂，颗粒剂，或在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液形式，或水包油或油包水液体乳液，或酏剂或糖浆，或锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口水等，其各自包含预定量的本发明化合物作为活性成分。本公开的低聚物也可以大丸剂，药膏剂或糊剂形式施用。

在用于口服的这些固体剂型(胶囊，片剂，丸剂，糖衣丸，散剂，颗粒剂，小丸剂等)中，可将活性TMO治疗成分与一种或多种药学上可接受的载体混合，例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下任何一种：(1)填充剂或增量剂，例如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂，例如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠；(5)缓溶剂，如石蜡；(6)吸收促进剂，例如季铵化合物和表面活性剂，例如泊洛沙姆和月桂基硫酸钠；(7)润湿剂，例如鲸蜡醇，单硬脂酸甘油酯和非离子表面活性剂；8)高岭土，膨润土等吸收剂；(9)润滑剂，例如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂基硫酸钠，硬脂酸锌，硬脂酸钠，硬脂酸及其混合物；(10)着色剂；(11)控释剂，如交聚维酮或乙基纤维素。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，药物组合物还可包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以用作软和硬壳明胶胶囊中的填充剂，其使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。

片剂可以任选地与一种或多种辅助成分一起通过压制或模制来制备。可以使用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)，润滑剂，惰性稀释剂，防腐剂，崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联的羧甲基纤维素钠)，表面活性剂或分散剂来制备压制的片剂。模制片剂可以通过在合适的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。

本发明的药物组合物的片剂和其他固体剂型，例如糖衣丸，胶囊，丸剂和颗粒剂，可以任选地用包衣和衣壳(例如肠溶衣和药物制备工艺中众所周知的其他包衣)刻痕或制备。它们也可以被配制为使用例如以提供所需的释放特性的可变比例的羟丙基甲基纤维素，其他聚合物基质，脂质体和/或微球体来提供活性成分在其中的缓慢或受控释放。它们可能被配制为快速释放，例如被冻干。它们可以通过例如通过保留细菌的过滤器过滤，或者通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂进行灭菌，所述灭菌固体组合物可以在使用前立即溶于无菌水或一些其他无菌注射介质中。这些组合物还可以任选地包含遮光剂，并且可以是仅或优选在胃肠道的某些部分中任选地以延迟的方式释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以与一种或多种上述赋形剂呈微囊形式。

用于口服施用本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂，微乳剂，溶液，混悬剂，糖浆和酏剂。除活性成分外，液体剂型还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇，1,3-丁二醇，油类(特别是棉籽，花生，玉米，胚芽，橄榄油，蓖麻和芝麻油)，甘油，四氢呋喃醇，聚乙二醇和脂肪酸酯脱水山梨糖醇及其混合物。

除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，例如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂，着色剂，加香剂和防腐剂。

除了活性化合物之外，悬浮液可以包含悬浮剂，例如乙氧基化的异硬脂醇，聚氧乙烯山梨糖醇和山梨糖醇酯，微晶纤维素，偏氢氧化铝，膨润土，琼脂和黄芪胶及其混合物。

直肠或阴道给药的制剂可以栓剂形式存在，可以通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体混合来制备，所述赋形剂或载体包括例如可可脂，聚乙二醇，栓剂蜡或水杨酸盐，其在室温下为固体，但在体温下为液体，因此将在直肠或阴道腔内融化并释放出活性化合物。

本文提供的用于寡聚体的局部或透皮给药的制剂或剂型包括散剂，喷雾剂，软膏剂，糊剂，乳膏剂，洗剂，凝胶剂，溶液剂，贴剂和吸入剂。活性低聚物可以在无菌条件下与药学上可接受的载体以及可能需要的任何防腐剂，缓冲剂或推进剂混合。除了本发明的活性化合物外，软膏，糊剂，乳膏和凝胶剂还可包含赋形剂，例如动植物脂肪，油，蜡，石蜡，淀粉，黄芪胶，纤维素衍生物，聚乙二醇，硅酮，膨润土，硅酸，滑石粉和氧化锌或其混合物。

除本发明的低聚物外，粉末和喷雾剂还可包含赋形剂，例如乳糖，滑石粉，硅酸，氢氧化铝，硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂还可包含常规推进剂，例如氯氟烃和挥发性未取代的烃，例如丁烷和丙烷。

透皮贴剂具有提供以受控递送到体内的本公开的寡聚物的附加优点。这样的剂型可以通过将低聚物溶解或分散在适当的介质中来制备。吸收促进剂也可用于增加药剂穿过皮肤的流量。可以通过提供速率控制膜或将试剂分散在聚合物基质或凝胶中，以及本领域已知的其他方法来控制这种通量的速率。

适用于肠胃外给药的药物组合物可以包含一种或多种本发明的低聚物，以及一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性或非水性溶液，分散液，悬浮液或乳剂，或在使用前可以重新制成无菌注射液或分散液的无菌粉末，可能含有糖，醇，抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，溶质，其会使制剂与预期接受者的血液或悬浮剂或增稠剂等渗。可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)及其合适的混合物，植物油，例如橄榄油和可注射的有机酯，例如油酸乙酯。例如，可以通过使用包衣材料，例如卵磷脂，通过在分散液的情况下保持所需的粒度以及通过使用表面活性剂保持适当的流动性。

这些组合物还可包含佐剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。可以通过包含各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚山梨酸等来确保防止微生物对本发明的低聚物起作用。还可能需要在组合物中包括等渗剂，例如糖，氯化钠等。另外，可以通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来延长可注射药物形式的吸收。

在某些情况下，为了延长药物的作用，需要减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可以通过使用水溶性差的结晶或无定形材料的液体悬浮液以及本领域已知的其他方法来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体尺寸和晶体形式。或者，通过将药物溶解或悬浮在油载体中来实现肠胃外给药药物形式的延迟吸收。

可通过在可生物降解的聚合物例如聚丙交酯-聚乙交酯中形成主题低聚物的微囊化基质来制备可注射的储库形式。取决于低聚物与聚合物的比例以及所用特定聚合物的性质，可以控制低聚物的释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。也可以通过将药物截留在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备可注射储库的制剂。

当将本公开的低聚物作为药物施用给人和动物时，它们本身可以或作为包含例如0.1至99％(更优选10至30％)活性成分的药物组合物给结合药学上可接受的载体。

如上所述，本公开的制剂或制剂可以口服，胃肠外，全身，局部，直肠或肌内给药。它们通常以适合每种给药途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊剂形式通过注射，吸入，眼药水，软膏，栓剂等给药。通过注射，输注或吸入给药；通过洗剂或药膏来外用；以及以栓剂至直肠。

本文所用的短语“肠胃外施用”和“肠胃外施用”是指除肠内和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括但不限于静脉内，肌肉内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，气管内，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下腔，脊柱内和胸骨内注射和输注。

本文所用的短语“全身给药”，“全身性给药”，“外周给药”和“外周性给药”是指化合物，药物或其他物质以不是直接进入中枢神经系统给药，使其进入患者的系统内，并且易受新陈代谢和其他类似过程的影响，例如皮下给药。

无论选择何种给药途径，都可以通过本领域技术人员已知的常规方法将可以合适的水合形式使用的本发明的低聚物，和/或本发明的药物组合物配制成药学上可接受的剂型。可以改变本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得有效达到特定患者，组合物和给药方式所需的治疗反应的活性成分的量，而无对患者有不可接受的毒性。

选择的剂量水平将取决于多种因素，包括所使用的本公开内容的特定低聚物或其酯，盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，使用的特定低聚物的排泄速率或代谢速率，吸收的速率和程度，治疗的持续时间，与使用的特定低聚物组合使用的其他药物，化合物和/或材料，年龄，性别，体重，状况，总体健康状况和接受治疗的患者的既往病史以及医学领域众所周知的因素。

具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定和规定所需药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以在药物组合物中使用的本发明化合物的起始剂量低于实现所需治疗效果所需的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果。通常，本发明化合物的合适日剂量应为有效产生治疗效果的最低剂量的化合物量。这样的有效剂量通常将取决于上述因素。通常，当用于指示的效果时，本发明化合物对患者的口服，静脉内，脑室内，肌内和皮下剂量为每天每公斤体重约0.0001至约100mg。

本公开内容的硫吗啉代低聚物的优选剂量通常以约5-100mg/kg施用。在某些情况下，可能需要大于100mg/kg的剂量。对于i.v.给药时，优选剂量为约0.1mg至100mg/kg。在一些实施方案中，硫吗啉代低聚物以约2mg/kg至约100mg/kg的剂量施用，包括其间的所有整数。

如果需要，活性化合物的有效日剂量可以整天以适当的间隔分别以单位剂型的形式分别以两个，三个，四个，五个，六个或更多个子剂量给药。在某些情况下，每天给药一次。给药频率是每2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14天或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月一次或多次给药，以在受试者中维持功能性肌营养不良蛋白的所需表达。

在一些实施方案中，通常以规则的间隔(例如每天，每周，每两周，每月，每两月一次)施用本公开的低聚物。可以定期施用低聚物，例如每天一次；每两天一次；每三天一次；每3至7天一次；每3至10天一次；每7至10天一次；每周一次；每两周一次；每月一次。例如，可以每周一次通过静脉内输注给予低聚物。寡聚物可以在更长的时期内间歇地施用，例如数周，数月或数年。例如，寡聚体可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月一次施用。另外，低聚物可以每一年，两年，三年，四年或五年一次施用。可以在施用抗生素，类固醇或其他治疗剂之后或同时施用。可以根据免疫分析的结果，其他生化检查和接受治疗的受试者的生理检查结果，来如上所示调整治疗方案(剂量，频率，途径等)。

可以通过本领域技术人员已知的多种方法将核酸分子施用于细胞，包括但不限于通过离子电渗疗法在脂质体或脂质复合体中包裹，或通过掺入其他媒介物，例如本文所述和本领域已知的水凝胶，环糊精，生物可降解的纳米胶囊和生物粘附性微球。在某些实施方案中，微乳化技术可用于改善亲脂性(水不溶性)药剂的生物利用度。除其他好处外，微乳化可通过优先将吸收引导至淋巴系统而非循环系统来提供更高的生物利用度，从而绕过肝脏，防止化合物破坏肝胆循环。

尽管考虑了所有合适的两亲载体，但是目前优选的载体通常是具有一般公认安全(GRAS)状态的载体，并且既可以溶解本公开内容的化合物，又可以在以后的阶段当溶液与复杂的水相(例如在人体胃肠道中发现的)接触时将其微乳化。通常，满足这些要求的两亲性成分的HLB(亲水性至亲脂性平衡)值为2-20，并且其结构包含C-6至C-20范围内的直链脂族基团。实例是聚乙二醇化的脂肪甘油酯和聚乙二醇。

两亲性载体的实例包括饱和和单不饱和的聚乙烯-糖基化的脂肪酸甘油酯，例如从完全或部分氢化的各种植物油中获得的那些。这样的油可以有利地由相应脂肪酸的三，二和单脂肪酸甘油酯和二和单聚乙二醇酯组成，特别优选的脂肪酸组合物包括癸酸4-10，癸酸3-9，月桂酸40-50，肉豆蔻酸14-24，棕榈酸4-14和硬脂酸5-15％。另一类有用的两亲载体包括部分酯化的脱水山梨糖醇和/或山梨糖醇，以及饱和或单不饱和脂肪酸(SPAN系列)或相应的乙氧基化类似物(TWEEN系列)。

可以通过使用脂质体，脂质复合物，纳米胶囊，微粒，微球，脂质颗粒，囊泡等进行递送，以将本公开的组合物引入合适的宿主细胞中。特别地，本公开内容的组合物可被配制用于递送，其被包封在脂质颗粒，脂质体，脂质复合物，囊泡，纳米球，纳米颗粒等中。此类递送载体的配制和使用可以使用已知和常规技术进行。

可能适用于本公开的亲水性聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮，聚甲基恶唑啉，聚乙基恶唑啉，聚羟丙基甲基丙烯酰胺，聚甲基丙烯酰胺，聚二甲基丙烯酰胺和衍生化的纤维素，例如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。

本公开内容的制剂可包含选自包含聚酰胺，聚碳酸酯，聚亚烷基，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的聚合物，聚乙烯基聚合物，聚乙交酯，聚硅氧烷，聚氨酯及其共聚物的组，纤维素，聚丙烯，聚乙烯，聚苯乙烯，乳酸和乙醇酸的聚合物，聚酸酐，聚原酸酯，聚丁酸，聚戊酸，聚丙交酯-己内酯，多糖，蛋白质，聚透明质酸，聚氰基丙烯酸酯及其混合物，混合物或其共聚物的生物相容性聚合物。

环糊精是环状寡糖，由6、7或8个葡萄糖单元组成，分别由希腊字母alpha，beta或gamma表示。葡萄糖单元通过α-1，4-葡糖苷键连接。由于糖单元的椅形构象，所有仲羟基(在C-2，C-3处)均位于环的一侧，而所有在C-6处的伯羟基均位于环的另一侧。结果，外表面是亲水的，使环糊精可溶于水。相反，环糊精的空腔是疏水的，因为它们被原子C-3和C-5的氢以及类似醚的氧所衬。这些基质允许与多种相对疏水的化合物络合。络合通过范德华相互作用和氢键形成而发生。环糊精衍生物的物理化学性质在很大程度上取决于取代的种类和程度。例如，它们在水中的溶解度从不溶的(例如三乙酰基-β-环糊精)到147％的可溶的(w/v)(G-2-β-环糊精)。另外，它们可溶于许多有机溶剂。环糊精的性质使得可以通过增加或减少其溶解度来控制各种制剂组分的溶解度。

脂质体由至少一个脂质双层膜组成，该脂质双层膜包围水性内部隔室。脂质体可以通过膜类型和大小来表征。小型单层囊泡(SUVs)具有单个膜，直径通常在0.02到0.05微米之间。大单层囊泡(LUVS)通常大于0.05微米。单层大囊泡和多层囊泡具有多个通常同心的膜层，通常大于0.1微米。具有几个非同心膜的脂质体，即包含在较大囊泡中的几个较小囊泡，被称为多囊泡囊泡。因此，包含脂质体的制剂包含本发明的硫代吗啉代寡聚物，其中脂质体膜被配制为提供具有增加的载量的脂质体。替代地或另外地，本公开的化合物可以包含在脂质体的脂质体双层中或吸附在脂质体的脂质双层上。本公开内容的低聚物可以与脂质表面活性剂聚集并携带在脂质体的内部空间中；在这些情况下，配制脂质体膜以抵抗活性剂-表面活性剂聚集体的破坏作用。这些脂质体的脂质双层可以包含被糖衍生的脂质，所述糖包括二糖例如乳糖，聚乙二醇(PEG)，使得PEG链从脂质双层的内表面延伸到脂质体包裹的内部空间中，并从脂质双层的外部延伸到周围环境。

本公开的脂质体中包含的活性剂为增溶形式。表面活性剂和活性剂的聚集体(例如含有目标活性剂的乳液或胶束)可被包埋在根据本发明的脂质体的内部空间中。表面活性剂起到分散和增溶活性剂的作用，并且可以选自任何合适的脂族，脂环族或芳族表面活性剂，包括但不限于具有不同链长(例如，约C14至约C20)的生物相容性的溶血磷脂酰胆碱(LPGs)。聚合物衍生的脂质(例如PEG-脂质)也可用于胶束形成，因为它们将起到抑制胶束/膜融合的作用，并且由于将聚合物添加到表面活性剂分子中会降低表面活性剂的CMC并有助于胶束形成。优选的是CMO在微摩尔范围内的表面活性剂，较高级的CMC表面活性剂可用于制备包裹在本发明脂质体内的胶束。

可以通过本领域已知的多种技术中的任一种来制备根据本公开的脂质体。参见，例如，美国专利号4,235,871；公布的PCT申请WO 96/14057；New RRC,Liposomes:Apractical approach,IRL Press,Oxford(1990),第33-104页；Lasic D D,Liposomes fromphysics to applications,Elsevier Science Publishers BV,Amsterdam,1993，。例如，本公开的脂质体可以通过将用亲水性聚合物衍生的脂质扩散到预制的脂质体中来制备，通过将预制的脂质体暴露于由脂质接枝的聚合物组成的胶束中，脂质浓度对应于脂质体中所需的衍生脂质的最终摩尔百分比。如本领域中已知的，还可以通过均质化，脂质场水合或挤出技术来形成包含亲水性聚合物的脂质体。

在另一个示例性的配制过程中，首先通过超声处理将活性剂分散在容易溶解疏水分子的溶血磷脂酰胆碱或其他低CMC表面活性剂(包括聚合物接枝的脂质)中。然后将所得的活性剂胶束悬浮液再水化干燥的脂质样品，该样品包含合适摩尔百分比的聚合物接枝脂质或胆固醇。然后使用本领域已知的挤出技术将脂质和活性剂悬浮液形成脂质体，并通过标准柱分离从未包囊的溶液中分离出所得脂质体。

在本发明的一方面，脂质体被制备成在选定的尺寸范围内具有基本均匀的尺寸。一种有效的施胶方法是将脂质体的水悬浮液通过一系列具有选定的均匀孔径的聚碳酸酯膜挤出。膜的孔径将大致对应于通过该膜挤出产生的最大尺寸的脂质体。参见，例如，美国专利号4,737,323(1988年4月12日)。在某些实施方案中，可以使用诸如DharmaFECT TM和Lipofectamine TM的试剂将多核苷酸或蛋白质引入细胞。

本公开内容的制剂的释放特征取决于包囊材料，包囊药物的浓度和释放调节剂的存在。例如，可控制释放为PH依赖性，如使用仅在低pH值，如在胃中，或较高pH值，如在肠中，释放的pH敏感涂层。肠溶衣可用于防止释放，直到通过胃之后。可以使用包裹在不同材料中的氰胺的多种涂层或混合物来获得在胃中的初始释放，然后在肠中释放。释放也可以通过包含盐或成孔剂来控制，这些盐或成孔剂可以增加水的吸收或通过从胶囊中扩散而释放药物。改变药物溶解度的赋形剂也可用于控制释放速率。也可以掺入增强基质降解或从基质释放的试剂。它们可以添加到药物中，作为单独的相(即作为颗粒)添加，或者可以根据化合物共溶解在聚合物相中。在大多数情况下，该含量应在0.1％至30％(w/w聚合物)之间。降解促进剂的类型包括无机盐，例如硫酸铵和氯化铵；有机酸，例如柠檬酸，苯甲酸和抗坏血酸；无机碱，例如碳酸钠，碳酸钾，碳酸钙，碳酸锌和氢氧化锌；和有机碱，例如硫酸鱼精蛋白，精胺，胆碱，乙醇胺，二乙醇胺和三乙醇胺，以及表面活性剂，例如Tween^TM和Pluronic^TM。将增加基质微结构的成孔剂(即水溶性化合物，例如无机盐和糖)作为颗粒加入。该范围通常在百分之一和百分之三十之间(w/w聚合物)。

也可以通过改变颗粒在肠中的停留时间来控制摄取。这可以例如通过用粘膜粘合剂聚合物涂覆颗粒或选择其作为包囊材料来实现。实例包括大多数具有游离羧基的聚合物，例如壳聚糖，纤维素，尤其是聚丙烯酸酯(如本文所用，聚丙烯酸酯是指包括丙烯酸酯基团和改性丙烯酸酯基团的聚合物，例如氰基丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯)。

除了本文提供的方法外，可以通过与其他药物类似的方式，将根据本发明使用的寡聚物配制成用于以任何方便的方式用于人或兽药的给药。反义寡聚体及其相应的制剂可以单独施用或与其他治疗策略一起用于肌肉营养不良的治疗，例如成肌细胞移植，干细胞疗法，氨基糖苷类抗生素的给药，蛋白酶体抑制剂和上调疗法(例如，促卵磷脂的上调，肌营养不良蛋白的常染色体旁系同源物)。

实施例

实施例1

硫吗啉代反义寡核苷酸(AOs)的设计与合成

除非另有说明，否则所有化学药品均购自Sigma-Aldrich。自动化DNA合成中使用的标准试剂以及5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脱氧核糖3'-[(氰乙基)-(N，N-二异丙基氨基)]-亚磷酰胺(9、10、11或12)购自Glen Research。核苷和2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基-亚磷酰胺购自ChemGenes Corporation。氘化溶剂购自Cambridge Isotopes。

NMR实验是在Bruker Avance-III 400(11-1＝400.13MHz)上进行的。化学位移以ppm给出，下场为正位移。相对于来自锁定溶剂的内部残留质子，参考了所有1H和13C化学位移。根据标准IUPAC方法，在1H NMR光谱中将31P化学位移定为0.0ppm。将5'二甲氧基三苯甲基保护的核苷溶解在甲醇中，然后添加1.2当量的高碘酸钠和四水合硼酸铵(1.2当量)。当TLC表明原料已完全消耗时，将混合物在室温搅拌3小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并加入活化粉末状的4A⁰分子筛(0.4g/mmol)，然后加入2.0当量的氰基硼氢化钠和冰醋酸(2.0当量)。然后当中间体二醇完全还原时，将该反应混合物再搅拌4-5小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并蒸发至干。将残余物溶于氯仿中，并用饱和NaHCO₃和盐水洗涤。收集有机层，经Na₂SO₄干燥并在减压下除去。通过在硅胶柱上的快速色谱法纯化产物。在所有情况下，硅胶浆都是用含有额外的5％三乙胺的起始洗脱液混合物制备的。倒入浆液后，用两倍柱体积的不含三乙胺的起始溶剂混合物洗涤柱。使用氯仿至19：1氯仿-甲醇的梯度洗脱化合物1、2、3和4。以下各节中描述的所有产率代表了从5'-二甲氧基三苯甲基-N-保护的核苷开始分两步获得的产率。

用于硫吗啉代合成的亚磷酰胺基单体的合成：在图1A的合成方案中描述了用于合成单体(化合物5、6、7或8)的一般程序。简而言之，将5'-O-DMT保护的吗啉代核苷(1、2、3或4)真空干燥过夜，并溶于无水CH₂Cl₂中，然后添加1.2当量的氩气下的2-氰乙基-N,N,N',N'-四异丙基-亚磷酰胺。加入0.5当量的4,5-二氰基咪唑后，当TLC表明原料已完全转化时，将反应在室温下在氩气气氛下搅拌30分钟。将反应混合物蒸发至干。如上所述，用含有另外的5％三乙胺的起始洗脱液混合物制备硅胶浆。倒入浆液后，用两倍柱体积的不含三乙胺的起始溶剂混合物洗涤柱。使用50％乙酸乙酯-己烷纯化化合物5、6、7和8。

5'-二甲氧基三苯甲基-吗啉基吡啶-3'-N-氰乙基-N,N二异丙基亚磷酰胺(5'-dimethoxytrityl-morpholinothymidine-3'-N-cyanoethyl-N,Ndiisopropylphosphoradiamidite)(5):产率：76％。³¹PNMR(CD₃CN)δ：127.90，127.89。¹HNMR(CD₂Cl₂,400MHz)δ：9.51(1H，bs)，7.50-7.47(2H，m)，7.38-7.25(8H，m)，6.89-6.86(4H，m)，5.78-5.75(0.5H，dd)，5.65-5.62(0.5H，dd)，4.08-4.02(1H，m)，3.99-3.86(3H，m)，3.82(6H，s)，3.65-3.52(2H，m)，3.48-3.34(1H，m)，3.31-3.27(1H，m)，3.13-3.09(1H，m)，2.75-2.68(2H，m)，2.53-2.47(2H，m)，1.96(3H，m)，1.25-1.18(12H，m)。¹³CNMR(CD₂Cl₂)δ：164.02，163.96，158.66，150.13，144.95，135.92，135.90，135.79，135.68，135.52，129.99，128.07，127.77，126.77，117.89，117.74，113.05，110.48，110.39，86.05，80.54，80.49，80.20，77.36，77.21，64.37，60.09，59.84，55.20，49.05，48.83，47.58，47.06，46.83，45.87，45.78，43.91，43.74，24.36，24.29，24.22，24.20，20.77，20.33，20.66，12.29。ESI-MS(m/z)：727.4047(M+H)⁺。

N²-苯甲酰基-5'-二甲氧基三苯甲基-吗啉代胞苷-3'-N-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(N²-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-morpholinocytidine-3'-N-cyanoethyl-N,N-diisopropyl phosphoradiamidite)(6)：产率：60％。³¹PNMR(CD₃CN)δ：127.35，127.25。¹HNMR(CD₂Cl₂,400MHz)δ：7.99-7.96(3H，m)，7.67-7.64(1H，m)，7.56-7.49(5H，m)，7.39-7.26(7H，m)，6.89-6.87(4H，m)，5.83-5.67(1H，m)，4.11-4.07(1H，m)，4.09-3.87(2H，m)，3.83(6H，s)，3.81-3.77(1H，m)，3.65-3.48(3H，m)，3.37-3.25(2H，m)，3.19-3.15(1H，m)，2.78-2.75(1H，m)，2.72-2.68(1H，m)，2.56-2.53(1H，m))，2.39-2.33(1H，m)，1.25-1.18(12H，m)。¹³CNMR(CD₂Cl₂)δ：162.22，158.65，144.94，135.92，135.78，133.01，130.05，130.00，128.89，128.06，127.80，127.64，126.79，117.91，117.77，113.05，86.04，82.17，81.93，77.36，64.40，60.22，60.11，59.87，49.85，49.62，48.22，48.17，47.05，46.81，45.70，45.63，43.94，43.88，43.82，43.77，24.38，24.30，24.24，24.16，20.34，20.30，20.22。ESI-MS(m/z)：833.3801(M+H)⁺。

N²-苯甲酰基-5'-二甲氧基三苯甲基-吗啉代腺苷-3'-N-氰乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺(N²-benzoyl-5'-dimethoxytrityl-morpholinoadenosine-3'-N-cyanoethyl-N,N-diisopropyl phosphoradiamidite)(7)：产率：62％。³¹PNMR(CD₃CN)δ：128.27，126.42。¹HNMR(CD₂Cl₂,400MHz)δ：9.15(1H，s)，8.78(1H，s)，8.25-8.24(1H，d)，8.03-8.01(2H，m)，7.67-7.63(1H，m)，7.58-7.54(2H，m)，7.51-7.47(2H，m)，7.38-7.24(7H，m)，6.04-5.90(1H，m)，4.18-4.11(1H，m)，4.09-4.05(1H，m)，4.00-3.89(2H，m)，3.86(1H，bs)，3.83(6H，s)，3.70-3.54(3H，m)，3.42-3.31(2H，m)，3.19-3.15(1H，m)，2.99-2.89(1H，m)，2.77-2.74(1H，m)，2.72-2.62(2H，m)，1.27-1.21(12H，m)。¹³CNMR(CD₂Cl₂)δ：158.64，152.41，152.32，149.56，144.92，140.71，135.86，135.74，134.02，132.60，130.00，128.79，128.04，127.78，126.77，123.19，123.11，117.81，117.74，113.04，86.08，80.81，80.60，77.15，64.27，60.14，59.80，50.27，50.04，48.66，47.29，47.06，45.97，43.92，43.72，24.24，24.19，20.29。ESI-MS(m/z)：857.3911(M+H)⁺。

N²-异丁酰基-5'-二甲氧基三苯甲基-吗啉代鸟苷-3'-N-氰乙基-N，N-二异丙基亚磷酰胺(N²-isobutyryl-5'-dimethoxytrityl-morpholinoguanosine-3'-N-cyanoethyl-N,N-diisopropyl phosphoradiamidite)(8)：产率：33％。³¹PNMR(CD₃CN)δ：129.43，124.17。¹HNMR(CD₂Cl₂,400MHz)δ：12.02(1H，s)，7.89-7.86(1H，m)，7.52-7.47(2H，m)，7.40-7.27(7H，m)，6.90-6.86(4H，m)，5.67-5.66(1H，m)，4.14-4.09(1H，m)，4.06-4.02(1H，m)，4.00-3.85(2H，m)，3.83(6H，s)，3.74-3.68(1H，m)，3.52-3.27(3H，m)，3.21-3.17(1H，m)，2.88-2.60(5H，m)，1.27-1.22(12H，m)，1.19-1.15(6H，m)。¹³CNMR(CD₂Cl₂)δδ：179.29，178.97，158.67，147.82，144.93，136.17，135.74，130.04，128.04，127.79，126.79，121.16，121.06，118.49，118.07，113.06，86.12，81.61，81.46，77.15，77.03，76.77，64.31，64.24，60.23，59.51，59.27，50.39，50.20，48.20，47.53，47.19，46.67，46.64，45.54，45.48，43.81，43.69，43.53，43.42，36.22，35.97，24.55，24.47，24.43，24.35，24.24，24.17，24.03，20.79，20.71，20.62，20.56，20.48，18.76，18.63，18.58。ESI-ESI-MS(m/z)：839.4019(M+H)⁺。

固相合成：用于合成TMO和TMO-DNA嵌合体的程序在图1B所示的合成方案中描述1B：在合成之前，用二氯甲烷中的3％三氯乙酸除去在2'-OMe-核糖核苷上与受控孔玻璃载体连接的5'-O-DMTr基团。然后使5'-未保护的2'-OMe-利丁啶(A)与化合物5、6、7或8在无水乙腈中反应(5分钟)，该乙腈含有0.12摩尔的4,5-二氰基咪唑(4,5-dicyanoimidazole)(DCI)溶液，如图1B所示，或5-(乙硫基)-1H-四唑(5-(ethylthio)-1H-tetazole)(5-(乙硫基)-1H-四唑也可在此步骤中用作活化剂)以生成具有亚磷酰胺-二酯-核苷酸间键的二聚体(B)。通过用3-((N，N-二甲基氨基亚甲基)氨基)-3H-1,2,4-二噻唑-5-硫酮(3-((N,N-dimethylaminomethylidene)amino)-3H-1,2,4-dithiazole-5-thione)(DDTT)处理将该中间体转化为(D)以进行硫化，然后将载体用乙酸酐溶液处理，以封端所有未反应的5'-羟基。对于制备硫代氨基磷酸吗啉代DNA嵌合体(TMO/DNA)，合成周期相似，除了用0.12M 5-(乙硫基)-1H-四唑作为活化剂与5'-O-二甲氧基三苯甲基-2'脱氧核糖核苷-3'-亚磷酰胺(5’-O-dimethoxytrityl-2’-deoxyribonucleoside-3’-phosphoramidite)合成子(9、10、11或12)而获得(C)。然后通过用DDTT氧化将该亚磷酸三酯转化为(E)，以产生硫代磷酸酯核苷酸间键。然后将这些缩合产物(E)用乙酸酐封端。用二氯甲烷中的3％三氯乙酸处理后，(F)或(G)便已备重复适当的循环以生成TMO或TMO-DNA嵌合体。

将DMT-ON寡核苷酸在55℃的氢氧化铵(1.0mL)中脱保护18小时，并使用RP-HPLC纯化。在室温下用5分钟在50分钟内用50％乙酸水溶液除去DMT部分，然后用TEA淬灭至pH7.0，然后减压蒸发。使用RP-HPLC分离得到的寡核苷酸。

这些TMO和TMO-DNA嵌合体通过LCMS表征。

自动化的TMO合成：合成是在ABI 394合成器上进行的。使用通过琥珀酸酯键连接到CPG固体支持物上的5'-DMTr-2'-OMe-核糖核苷以1.0μmol规模进行所有合成。也可以使用与受控孔玻璃连接的2'-脱氧核苷。为了合成硫吗啉代寡核苷酸，将亚磷酰胺(5、6、7或8；0.1M)溶解在无水CH₃CN中。使用标准的1.0μmol合成周期，偶联时间增加至300s。氧化和封端后，使用3％的三氯乙酸的二氯甲烷溶液进行去三苯甲基化反应。合成周期的逐步说明在表1中进行了描述。所有合成均在DMT ON的条件下进行。合成后，将树脂转移到1.5mL螺旋盖小瓶中，并在55℃下用1.0mLNH₄OH(37％)处理18h。

表1用于制备硫吗啉代寡核苷酸的化学步骤

RP-HPLC纯化方案：在30分钟内以1.0mL/min的流速进行0至40％B的线性梯度洗脱；缓冲液A：50mM TEAB，pH 8.5；缓冲液B：乙腈，室温。色谱柱规格：XBridge寡核苷酸BEHC18制备色谱柱，

2.5μm，10mm X 50mm。由于存在多个手性磷中心，此纯化步骤产生的产物为宽峰。

LC-MS分析是在Agilent 6530系列Q-TOF LC/MS光谱仪上进行的。使用WatersACQUITYUPLC BEH C18，1.7μm，2.1X 100nm色谱柱，在50分钟内流速为0.2mL/min与梯度为0-100％的缓冲液B(缓冲液A为1：380：10：10.4的三乙胺：水：甲醇：六氟-2-丙醇的混合物和缓冲液B为1：370：20：10.4的三乙胺：甲醇：水：六氟-2-丙醇的混合物。

实施例2

反义寡核苷酸的解链温度研究

六种反义寡核苷酸(序列和核苷酸间连接如图1C和1D所示)：对照2'-O-MePS，ODN1147、1148、1153、1154和完全修饰的PMO在浓度为2μM的熔解缓冲液中制备，用10mM磷酸钠缓冲液将10mM NaCl，0.01mM EDTA调节至pH 7.0。然后将AOs与等量的合成互补RNA序列(2μM)混合，并在95℃下变性10分钟，冷却至室温，并加载到1mm光程的石英比色皿中。用温度控制器Shimadzu UV-1800在20-90℃范围内以1.0℃/min的升温速率监控熔融过程。通过一阶导数法计算Tm值。研究的ODN和对照寡核苷酸的解链温度为：

因此，所有四个ODN在可用于反义研究的范围内具有相当的解链温度。

实施例3

用硫吗啉代ODN体外转染ODN

培养并分化H-2Kb-tsA58 mdx成肌细胞(“H2K mdx细胞”)。简而言之，当融合度达到60-80％时，用胰蛋白酶处理成肌细胞培养物，并将其接种在先后用50μg/ml聚D-赖氨酸和100μg/ml Matrigel(体外技术)预处理的24孔板上，接种密度为2×10⁴个细胞/孔。然后通过在37℃，5％CO₂下孵育24小时，在含有5％马血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中将细胞分化为肌管。然后将反义寡核苷酸与Lipofectin以2：1(w：w)(Lipofectin：AO)或Lipofectamine 3000(1.5uL)的比例复合，并按照制造商的说明在24孔板中以500μl/孔的最终转染体积使用，不同之处在于3小时后未除去溶液。发明人还裸露地转染了AO(不使用任何转染剂)。

转染后二十四小时，细胞被收集并按照制造商的说明使用Direct-zol^TMRNAMiniPrep Plus和TRI试剂(Zymo Research)提取RNA。然后通过使用SuperScript^TMIII逆转录酶III和AmpliTaq Gold 360DNA聚合酶横过外显子20-26的巢式RT-PCR来分析肌营养不良蛋白的转录物。在Tris-醋酸盐-EDTA缓冲液中的2％琼脂糖凝胶上分离PCR产物，并在Fusion Fx凝胶记录系统(Vilber Lourmat)上捕获图像。

通过凝胶图像的光密度分析对外显子跳跃效率进行定量。使用捕获的凝胶图像通过Image J2软件进行光密度测定。使用软件的“扣除背景”功能从图像中扣除背景，并将其设置为50％(默认值)。通过表达检测到的外显子23跳过的RT-PCR产物的量(外显子23跳过的条带的准确值)占肌营养不良蛋白转录产物总值(每道中所有条带的总值)的百分比来确定外显子的跳过效率。然后在Microsoft Excel中使用100％堆积列格式绘制百分比值。

杜兴氏肌营养不良外显子23小鼠模型的结果：图2A-2C描绘了用于研究H2K mdx细胞中外显子跳跃的方法。图2A显示了内源性mRNA，包括外显子和内含子。图2B概述了用于诱导外显子23外显子跳跃的一般方法，外显子23包含导致非功能性肌营养不良蛋白产生的致命突变。该方法涉及引入寡核苷酸(由实黑线表示)，该寡核苷酸的序列跨越与该外显子相邻的外显子/内含子连接。该寡核苷酸在该连接处阻断了剪接，因此剪接复合物跳过了外显子23并产生了截短的成熟mRNA，该mRNA通过翻译产生了活性肌营养不良蛋白。图2C显示了特定的ODN序列及其如何与外显子/内含子边界重叠。ODN 1147、1148、1153和1154都包含相同的序列元素，但硫吗啉代核苷酸的数目和位置可变，如图1C和1D所示。将这些ODNs转染到H2K mdx小鼠肌管细胞系中。

当将这些ODN用lipofectin转染到小鼠细胞系中后，发现所有四个含有硫吗啉代核苷酸的ODN(ODN 1147、1148、1153和1154)均呈剂量依赖方式外显子跳跃(图3)。Lipofectin有助于ODN的细胞吸收，并且在外显子跳跃分析中没有生物学活性。在研究的最低浓度(5/10nM)下可以很容易看出ODN 1148的活性最高。相比之下，2'-OMe PS对照(在发明者研究之前，研究最活跃的ODN)在该分析中的活性要低得多。此外，PMO寡核苷酸(经FDA有条件地批准用于杜兴氏肌营养不良症的治疗)在该试验中无效。

当将ODNs用lipofectamine转染到小鼠细胞系中时，含有硫吗啉代核苷酸的所有四个ODNs(ODNs 1147、1148、1153和1154)都观察到外显子跳跃(图4)。在研究的最低浓度(5/10nM)中，ODN 1148仍然是最活跃的。相比之下，2'-OMe PS对照(在发明人的研究结果之前，研究最活跃的ODN)在该试验中的活性要低得多。而且，PMO寡核苷酸在该测定中也没有活性。但是，使用lipofectamine协助转染会降低所有测试的ODN的活性。毫无疑问，这是由于lipofectamine无法诱导与lipofectin一样多的ODNs细胞摄取。该结论得到图5，7所示结果的支持，图5，7在不存在lipofectin或lipofectamine的情况下转染细胞。在此，即使在研究的最高浓度(100nM)下，任何ODN都未观察到外显子跳跃。

当将图4,5中所示的结果进行光密度分析，并将结果绘制在图6所示的图上，由图6可见，具有硫吗啉代核苷酸的所有四个ODN均优于对照。在研究的最低浓度(5和10nM)下，这一点尤其明显。如光密度法分析所示，硫吗啉代(1148)和硫吗啉代/DNA嵌合体(1153和1154)以剂量依赖的方式诱导有效的外显子23跳跃。值得注意的是，在较低浓度(5和10nM)下，1148、1153和1154表现出色，与对照组2'OMePS ODN(25和38％)相比，分别产生了外显子23跳跃产物(23和22-23)的56和68％，41和60％，41和46％。PMO对照没有引起任何跳过。

这些结果表明，含硫吗啉代寡核苷酸可用于诱导肌营养不良蛋白mRNA中的外显子跳跃，以产生功能性肌营养不良蛋白。

上述的各种特征和过程可以彼此独立地使用，或者可以以各种方式组合。所有可能的组合和子组合旨在落入本公开的范围内。另外，在某些实施方式中，可以省略某些方法或过程框。本文所述的方法和过程也不限于任何特定的顺序，并且可以以适当的其他顺序执行与之相关的框或状态。例如，可以以不同于具体公开的顺序来执行所描述的框或状态，或者可以在单个框或状态中组合多个框或状态。示例框或状态可以串行，并行或以其他方式执行。框或状态可以被添加到所公开的示例实施例或从所公开的示例实施例中去除。本文描述的示例系统和组件可以与所描述的不同地配置。例如，与所公开的示例实施例相比，可以将元素添加到，从其中移除或重新布置。

除非另外具体说明或在所使用的上下文中以其他方式理解，否则本文中使用的条件语言，例如“可以”，“可能”，“可能”，“可能”，“例如”等，通常旨在传达某些实施例包括而其他实施例不包括某些特征，元件和/或步骤。因此，这种条件语言通常不旨在暗示特征，要素和/或步骤以任何方式对于一个或多个实施例是必需的，或者一个或多个实施例必然包括有或无作者输入或提示时用于确定这些特征，元素和/或步骤是否在任何特定实施例中被包括或将被执行的逻辑。术语“包括”，“包含”，“具有”等是同义词，以开放式方式包含在内，并且不排除其他元素，特征，动作，操作等。同样，术语“或”以其包含的含义使用(而不是以其排他的含义使用)，因此，例如，当用于连接元素列表时，术语“或”表示列表中的一个或多个或全部元素。

尽管已经描述了某些示例实施例，但是这些实施例仅是通过示例的方式给出的，并且无意于限制本文公开的发明的范围。因此，以上描述中的任何内容都不旨在暗示任何特定的特征，特性，步骤，模块或块是必要的或必不可少的。实际上，本文描述的新颖的方法和系统可以以多种其他形式来体现。此外，在不脱离本文公开的本发明的精神的情况下，可以对本文所述的方法和系统的形式进行各种省略，替换和改变。所附权利要求书及其等效物旨在覆盖将落入本文所公开的某些发明的范围和精神内的形式或修改。

序列表

<110> 科罗拉多州立大学董事会法人团体

默多克大学

卡鲁瑟斯，马文

保罗，西巴斯

韦杜，拉凯什 N.

克里希纳，希拉

贾斯特泽布斯卡，卡塔尔兹纳

<120> 硫吗啉代寡核苷酸用于治疗肌肉营养不良

<130> 2848B-273-PCT

<140> 尚未分配

<141> 2018-09-20

<150> 62/562,162

<151> 2017-09-22

<160> 3

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 50

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

auaaacuucg aaaauuucag guaagccgag guuuggccuu uaaacuauau 50

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> 修改_基数

<222> (20)..(20)

<223> um

<220>

<221> 杂项_功能

<222> (20)..(20)

<223> n is um

<400> 2

ggccaaacct cggcttaccn 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> 修改_基数

<222> (20)..(20)

<223> um

<220>

<221> 杂项_功能

<222> (20)..(20)

<223> n is um

<400> 3

ggccaaaccu cggcuuaccn 20

Claims (21)

1.一种治疗人类受试者的肌营养不良症的方法，包括施用包含长度为20至50个核苷酸的反义寡核苷酸，包含至少1个硫吗啉代核苷酸并且包含与人肌营养不良蛋白基因的外显子中的靶标区域互补的至少10个连续核苷酸的组合物，其中反义寡核苷酸与诱导外显子跳跃的靶区域特异性杂交，从而治疗受试者的肌营养不良症。

2.根据权利要求1所述的方法，其中治疗将受试者肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加到正常的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或95％。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述人类受试者中肌营养不良蛋白阳性纤维的数量增加至正常的20-60％。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述肌营养不良症是杜兴氏肌营养不良症。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含吗啉代亚基，所述吗啉代亚基通过含硫代磷酸酯的核苷酸间键连接，所述核苷酸间键将一个残基的吗啉代氮连接至相邻残基的5＇环外碳。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含至少8个吗啉代亚基，所述至少8个吗啉代亚基通过含硫代吗啉代的核苷酸间键连接，所述核苷酸间键将一个残基的吗啉代氮与相邻残基的5＇环外碳相连。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸包含硫吗啉代亚基以及二氨基磷酸酯和硫代磷酸酯核苷酸间键中的至少一个。

8.根据权利要求1的方法，其中所述反义寡核苷酸化学连接至一个或多个增强所述反义寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。

9.根据权利要求8所述的方法，其中将反义寡核苷酸缀合至富含精氨酸的肽。

10.根据权利要求1所述的方法，其中反义寡核苷酸的长度为15至20个核苷酸。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸的长度为20至30个核苷酸。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述人肌营养不良蛋白基因中的外显子选自外显子23，外显子51，外显子50，外显子53，外显子45，外显子46，外显子44，外显子52，外显子55，和外显子8。

13.根据权利要求1所述的方法，其中反义寡核苷酸选自包括ODN化合物的组，

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*a_*c_*c_*t_*c_*g_*g_*c_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*A_*C_*C_*T_*C_*G_*G_*C_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*g_*C_*c_*A_*a_*a_*C_*c_*T_*c_*g_*G_*c_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′-OMe

5′-g_*G_*c_*C_*a_*A_*a_*C_*c_*T_*c_*G_*g_*C_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′OMe

其中：

(*)表示硫吗啉代核苷酸间键；大写残基为吗啉代残基；小写的残基是2＇-脱氧核糖核苷；而且，u2′-Ome是2′-Ome尿苷核苷酸。

14.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是：

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*A_*C_*C_*T_*C_*G_*G_*C_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

其中：

(*)表示硫代吗啉代核苷酸间键；大写残基为吗啉代残基；小写的残基是2＇-脱氧核糖核苷；而且，u2’-Ome是2’-Ome尿苷核苷酸。

15.根据权利要求1所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是ODN化合物的任何一种或组合，

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*a_*c_*c_*t_*c_*g_*g_*c_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*A_*C_*C_*T_*C_*G_*G_*C_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*g_*C_*c_*A_*a_*a_*C_*c_*T_*c_*g_*G_*c_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′-OMe

5′-g_*G_*c_*C_*a_*A_*a_*C_*c_*T_*c_*G_*g_*C_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′OMe

其中：

(*)表示硫代吗啉代核苷酸间键；大写残基为吗啉代残基；小写的残基是2＇-脱氧核糖核苷；而且，u2′-Ome是2′-Ome尿苷核苷酸。

16.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物还包含磷酸盐缓冲盐水。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物通过全身给药来施用。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物每周通过输注施用一次。

19.一种反义寡核苷酸，其选自的组包括：

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*a_*c_*c_*t_*c_*g_*g_*c_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*G_*C_*C_*A_*A_*A_*C_*C_*T_*C_*G_*G_*C_*T_*T_*A_*C_*C_*u_2′-OMe

5′-G_*g_*C_*c_*A_*a_*a_*C_*c_*T_*c_*g_*G_*c_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′-OMe

5′-g_*G_*c_*C_*a_*A_*a_*C_*c_*T_*c_*G_*g_*C_*t_*T_*a_*C_*c_*u_2′OMe

其中：

(*)表示硫吗啉代核苷酸间键；大写残基为吗啉代残基；小写的残基是2＇-脱氧核糖核苷；而且，u2′-Ome是2′-Ome尿苷核苷酸。

20.根据权利要求19所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸化学连接至一个或多个增强所述反义寡核苷酸的活性，细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。

21.根据权利要求20所述的反义寡核苷酸，其中所述反义寡核苷酸缀合至富含精氨酸的肽。

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