JP5206047B2 - 核酸解析方法 - Google Patents
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Kae Sato,Akira Inoue,Kazuo Hosokawa,Mizuo Maeda,Electrophoresis,26,3076−3080(2005)
(実施の形態1)
(サンプル核酸作製ステップ)
まず、本発明で用いるサンプル核酸を作製するサンプル核酸作製ステップについて説明する。本実施の形態で解析するサンプル核酸は植物、動物、または人の細胞や血液等から入手した核酸を用いる。
次に、コンジュゲート核酸作製ステップについて説明する。コンジュゲート核酸は前記サンプル核酸作製ステップで得られた1本鎖核酸と電気非泳動物質からなる。電気非泳動物質は、この一本鎖核酸の電気泳動速度を遅らせるためのものであり、好ましくは電荷を持たず、また高分子化合物であれば良い。例えば、一般的に使用されるリニアポリマーであるアクリルアミドやポリエチレングリコールが適応可能である。また、マイクロビーズであるガラスビーズや磁気ビーズ等も適応可能である。これらの電気非泳動物質を1本鎖核酸の化学種と結合させることでコンジュゲート核酸を作製する。
次に、プローブ核酸作製ステップについて説明する。まず、それぞれのプローブ核酸について説明する。第1のプローブ核酸の配列は、野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し、第2のプローブ核酸の配列は、変異型の一部と相補的な塩基配列を有するように設定される。
最後に、電気泳動ステップについて説明する。図4は、本実施の形態で用いる電気泳動装置の構成について示している。
サンプル核酸作製ステップにおいて、次の実施例1から実施例3に挙げる方法を用いて測定に用いる試料を調製した。本実施例では、検出モデルとして癌遺伝子の1つであるヒトc−Ki−ras遺伝子の野生型及び変異型の検出を行った。
これらの目的核酸及びSNPs核酸をそれぞれ終濃度1mMになるように緩衝液(Tris−Borate、pH7.4)で混合し、調製した。
上記目的核酸のみを1mMになるように緩衝液で調製した。
上記SNPs核酸のみを1mMになるように緩衝液で調製した。
分子量20,000のPEG−NHS(日本油脂)にDMSOを445μL加え、攪拌した。溶かしたPEG−NHSに実施例1から実施例3で得られた1本鎖核酸溶液をそれぞれ50μLと1Mの炭酸水素ナトリウムを5μL加え、20℃で3時間振とう後、分子量10,000を分画する透析膜を用いて1晩透析した後、乾燥させた。このようにして得られた実施例1から実施例3のコンジュゲート核酸を100μMになるように緩衝液で調製した。
第1のプローブ核酸には、目的核酸と相補な配列を有し5’末端に蛍光物質であるFITCを修飾した30塩基の5’− TCTTGCCTAC GCCACCAGCT CCAACTACCA −3’の配列を有するオリゴデオキシヌクレオチド(配列番号1)を使用した。
次に、図4で示した電気泳動装置によって核酸解析を行った。白色光源(MAX302、朝日分光)から励起された白色光はスリット、コリメートレンズを通過し、可変励起フィルターを通過する。可変励起フィルター、ダイクロイックミラー、蛍光フィルターは市販のフィルターセット(GFP/DsRed−2X−A、Semrock)を用いた。また、可変励起フィルターを制御用PCで切り替えることで2つの蛍光物質を同時に測定した。ビームスプリッタで分岐された励起光はモニタ用検出器(S1226−44BQ、浜松ホトニクス)でモニタし、照射パワーが一定になるように白色光源の励起光量の調整を行った。ダイクロイックミラーで反射した励起光はキャピラリー管の検出部に照射された。
101 目的核酸
102 SNPs核酸
103 コンジュゲート核酸
201 白色光源
202 スリット
203 コリメートレンズ
204 可変励起フィルター
205 ビームスプリッタ
206 モニタ用レンズ
207 モニタ用検出器
208 投光レンズ
209 ダイクロイックミラー
210 蛍光フィルター
211 集光レンズ
212 検出素子
213 対物レンズ
214、300 密閉流路
215 可変電源
216 正電極
217 負電極
218 第1容器
219 第2容器
220 プリアンプ
221 A/Dコンバータ
222 制御部
223 検出部
301 第1のプローブ核酸
302 第2のプローブ核酸
303 野生型の配列を有するコンジュゲート核酸
304 変異型の配列を有するコンジュゲート核酸
Claims (7)
- 目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び/又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む1本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記特定配列領域を含む野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第1の標識剤により修飾された第1のプローブ核酸と前記第1のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記特定配列領域を含む変異型の一部と相補的な塩基配列を有し第2の標識剤により修飾された第2のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第1のプローブ核酸及び前記第2のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第1のプローブ核酸及び前記第2のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第1の標識剤及び前記第2の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。 - 目的試料中の特定配列領域に含まれる野生型及び/又は変異型を検出する核酸解析方法において、
前記特定配列領域を含む1本鎖核酸を作製するサンプル核酸作製ステップと、
前記1本鎖核酸に電気非泳動物質を結合させたコンジュゲート核酸を作製するコンジュゲート核酸作製ステップと、
前記特定配列領域を含む野生型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第1の標識剤により修飾された第1のプローブ核酸と前記第1のプローブ核酸と同じ塩基長であり前記特定配列領域を含む変異型の配列の一部と相補的な塩基配列を有し第2の標識剤により修飾された第2のプローブ核酸とを作製するプローブ核酸作製ステップと、
前記コンジュゲート核酸を流路に充填した後、前記第1のプローブ核酸及び前記第2のプローブ核酸を前記流路の中に注入し、前記流路の両端に電圧を印加して前記第1のプローブ核酸及び前記第2のプローブ核酸を電気泳動させ、前記第1の標識剤及び前記第2の標識剤を検出する電気泳動ステップと、を含む核酸解析方法。 - 前記1本鎖核酸は、前記特定配列領域を増幅させることで得られる請求項1又は請求項2記載の核酸解析方法。
- 前記増幅はPCR反応を用いて行う請求項3記載の核酸解析方法。
- 前記野生型の配列と前記第1のプローブ核酸の配列との相補的な部分をa塩基、前記変異型の配列と前記第2のプローブ核酸の配列との相補的な部分をb塩基とすると、前記a及びbは以下の式を満たす請求項1又は請求項2記載の核酸解析方法。
a=b
6≦a≦30 - 前記電気非泳動物質は、アクリルアミド、もしくはエチレングリコールのいずれかで作製されたリニアポリマーである請求項1又は請求項2記載の核酸解析方法。
- 前記第1の標識剤及び前記第2の標識剤は、互いに蛍光波長の異なる蛍光物質である請求項1又は請求項2記載の核酸解析方法。
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