JPH0731500A - 核酸の変性検出装置 - Google Patents
核酸の変性検出装置Info
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- JPH0731500A JPH0731500A JP5175730A JP17573093A JPH0731500A JP H0731500 A JPH0731500 A JP H0731500A JP 5175730 A JP5175730 A JP 5175730A JP 17573093 A JP17573093 A JP 17573093A JP H0731500 A JPH0731500 A JP H0731500A
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- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
Abstract
(57)【要約】
【目的】 核酸の変性を迅速かつ精度良く検出できる核
酸の変性検出装置を提供する。 【構成】 初期値の変性条件値に設定された収納器２１
０に投入された測定対象核酸に励起光照射部１００から
励起光が照射される。この励起光の照射により測定対象
核酸で特性蛍光が発生する。この特性蛍光の一部は蛍光
検出部３００に入力した後、光検出器３１０で検出され
る。光検出器３１０の出力信号は処理部４００へ通知さ
れ、変性条件値とともに測定データとして蓄積される。
次に、処理部４００の指示のもとで変性条件制御部２０
０により変性条件を順次変化させながら、発生した特性
蛍光を検出して、処理部４００に各変性条件値とともに
測定データが蓄積される。特性蛍光の測定後、蓄積され
た測定データから、核酸の変性が起こった変性点を求め
る。
酸の変性検出装置を提供する。 【構成】 初期値の変性条件値に設定された収納器２１
０に投入された測定対象核酸に励起光照射部１００から
励起光が照射される。この励起光の照射により測定対象
核酸で特性蛍光が発生する。この特性蛍光の一部は蛍光
検出部３００に入力した後、光検出器３１０で検出され
る。光検出器３１０の出力信号は処理部４００へ通知さ
れ、変性条件値とともに測定データとして蓄積される。
次に、処理部４００の指示のもとで変性条件制御部２０
０により変性条件を順次変化させながら、発生した特性
蛍光を検出して、処理部４００に各変性条件値とともに
測定データが蓄積される。特性蛍光の測定後、蓄積され
た測定データから、核酸の変性が起こった変性点を求め
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、核酸の構造解析に係わ
り、特に核酸の変性の検出装置に関するものである。
り、特に核酸の変性の検出装置に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、あるいはこれら
のハイブリッド）の変性条件の相違を１塩基置換による
変性条件の差という精度で測定する技術が注目されてい
る。
のハイブリッド）の変性条件の相違を１塩基置換による
変性条件の差という精度で測定する技術が注目されてい
る。
【０００３】こうした、相同な２本鎖状の核酸の間にお
ける１塩基置換のようなわずかな相違が検出可能な方法
として、変性勾配ゲル電気泳動法と称される方法が提案
されている（S. G. Fischer and L. S. Lerman : Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.80, pp.1579-1583, March
1983 ）。この方法では、まず、ポリメラーゼ連鎖反応
（以後、ＰＣＲ法と呼ぶ）などの標準的な手法により増
幅した、測定対象の２本鎖核酸を調製する。次に、この
２本鎖核酸をゲル支持体に投入し、ゲル支持体について
空間的に設定した変性条件（温度あるいは水素イオン濃
度（ｐＨ）など）勾配下で電気泳動を施す。なお、この
測定では、測定対象の２本鎖核酸に加えて基準となる２
本鎖核酸を同時に電気泳動を施し、双方の変性条件の相
違を観測することも可能である。
ける１塩基置換のようなわずかな相違が検出可能な方法
として、変性勾配ゲル電気泳動法と称される方法が提案
されている（S. G. Fischer and L. S. Lerman : Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, Vol.80, pp.1579-1583, March
1983 ）。この方法では、まず、ポリメラーゼ連鎖反応
（以後、ＰＣＲ法と呼ぶ）などの標準的な手法により増
幅した、測定対象の２本鎖核酸を調製する。次に、この
２本鎖核酸をゲル支持体に投入し、ゲル支持体について
空間的に設定した変性条件（温度あるいは水素イオン濃
度（ｐＨ）など）勾配下で電気泳動を施す。なお、この
測定では、測定対象の２本鎖核酸に加えて基準となる２
本鎖核酸を同時に電気泳動を施し、双方の変性条件の相
違を観測することも可能である。
【０００４】図９は、従来の核酸の変性検出方法の説明
図である。図９（ａ）は、例えば変性条件として温度を
選択した場合、昇温により核酸が変性する様子を示す。
一般に、周囲温度を高くすると２本鎖核酸は変性する。
この変性温度は２本鎖核酸の塩基組成によって異なる。
また、特定の１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全
に相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸は、前述
の特定１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全ではな
いがほぼ相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸よ
りも変性温度が高い。従来の装置は、この現象を利用し
たものであり、ゲル支持体について空間的に変性条件の
勾配を設定してゲル電気泳動を施す。略相補鎖を含むサ
ンプルの場合、図９（ｂ）の測定結果が示すように、変
性点が２点存在する場合は、より温度の低い変性条件を
示すものが測定対象の２本鎖核酸であり、より温度の高
い変性条件を示すものが基準となる２本鎖核酸である。
図である。図９（ａ）は、例えば変性条件として温度を
選択した場合、昇温により核酸が変性する様子を示す。
一般に、周囲温度を高くすると２本鎖核酸は変性する。
この変性温度は２本鎖核酸の塩基組成によって異なる。
また、特定の１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全
に相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸は、前述
の特定１本鎖核酸とこの１本鎖核酸に対して完全ではな
いがほぼ相補的な１本鎖核酸とが結合した２本鎖核酸よ
りも変性温度が高い。従来の装置は、この現象を利用し
たものであり、ゲル支持体について空間的に変性条件の
勾配を設定してゲル電気泳動を施す。略相補鎖を含むサ
ンプルの場合、図９（ｂ）の測定結果が示すように、変
性点が２点存在する場合は、より温度の低い変性条件を
示すものが測定対象の２本鎖核酸であり、より温度の高
い変性条件を示すものが基準となる２本鎖核酸である。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来の変性勾配ゲル電
気泳動法による核酸の変性検出では、変性条件（温度、
あるいはｐＨ）の変化勾配下のゲル中でサンプル核酸を
電気泳動させる必要があったので、繁雑であり長い時間
（数十分〜数時間；サンプル核酸の分子量に依存する）
を要するという問題点があった。また、変性勾配ゲル電
気泳動法による核酸変性の検出感度は安定性あるいは勾
配量などの変性条件の制御や電気泳動条件の制御の精度
に依存する。しかし、これらの条件の制御の精度を現状
よりも高めることは困難であり、変性の検出感度および
検出精度を向上が望めないという問題点があった。
気泳動法による核酸の変性検出では、変性条件（温度、
あるいはｐＨ）の変化勾配下のゲル中でサンプル核酸を
電気泳動させる必要があったので、繁雑であり長い時間
（数十分〜数時間；サンプル核酸の分子量に依存する）
を要するという問題点があった。また、変性勾配ゲル電
気泳動法による核酸変性の検出感度は安定性あるいは勾
配量などの変性条件の制御や電気泳動条件の制御の精度
に依存する。しかし、これらの条件の制御の精度を現状
よりも高めることは困難であり、変性の検出感度および
検出精度を向上が望めないという問題点があった。
【０００６】本発明は、上記のような状況を鑑みてなさ
れたものであり、核酸の変性を迅速かつ精度良く検出で
きる核酸の変性検出装置を提供することを目的とする。
れたものであり、核酸の変性を迅速かつ精度良く検出で
きる核酸の変性検出装置を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明の核酸の変性検出
装置では、エネルギ供与体が付加された塩基またはヌク
レオチドで構成される１本鎖核酸と、この１本鎖核酸と
相補的な塩基配列を有しエネルギ受容体が付加された塩
基またはヌクレオチドで構成された１本鎖核酸とを結合
して変性条件の測定対象となる２本鎖核酸を調製し、こ
の２本鎖核酸に励起光を照射したときに発生する特定波
長の蛍光を検出・測定する。２本鎖状態でエネルギ供与
体からエネルギ受容体へのエネルギ移動が起こる場合
と、変性して１本鎖状態となりエネルギ移動が起こらな
い場合とでは、発生する蛍光の波長−強度分布あるいは
発生する蛍光の寿命などの蛍光特性が変化する。本発明
の核酸の変性検出装置は、変性条件を制御しながら発生
蛍光の特性値を計測し、発生蛍光の特性の変化を検出す
ることにより、変性を認識するとともに測定対象の２本
鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
装置では、エネルギ供与体が付加された塩基またはヌク
レオチドで構成される１本鎖核酸と、この１本鎖核酸と
相補的な塩基配列を有しエネルギ受容体が付加された塩
基またはヌクレオチドで構成された１本鎖核酸とを結合
して変性条件の測定対象となる２本鎖核酸を調製し、こ
の２本鎖核酸に励起光を照射したときに発生する特定波
長の蛍光を検出・測定する。２本鎖状態でエネルギ供与
体からエネルギ受容体へのエネルギ移動が起こる場合
と、変性して１本鎖状態となりエネルギ移動が起こらな
い場合とでは、発生する蛍光の波長−強度分布あるいは
発生する蛍光の寿命などの蛍光特性が変化する。本発明
の核酸の変性検出装置は、変性条件を制御しながら発生
蛍光の特性値を計測し、発生蛍光の特性の変化を検出す
ることにより、変性を認識するとともに測定対象の２本
鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴とする。
【０００８】すなわち、本発明の第１の核酸の変性検出
装置は、（ａ）第１の標識分子が付加された塩基からな
る第１の１本鎖核酸と、第１の１本鎖核酸と略相補的な
塩基配列を有し、所定距離内の第１の標識分子とエネル
ギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からな
る第２の１本鎖核酸と、が結合した２本鎖核酸が第１の
１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とに分離する変性の条件
を制御する変性条件制御手段と、（ｂ）所定波長の励起
光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の第１の１本
鎖核酸および第２の１本鎖核酸とに照射する励起光照射
手段と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検
出する蛍光検出手段と、（ｄ）蛍光検出手段の出力する
信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、
変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発
生した蛍光を観測して２本鎖核酸の変性条件の値を測定
することを特徴とする。
装置は、（ａ）第１の標識分子が付加された塩基からな
る第１の１本鎖核酸と、第１の１本鎖核酸と略相補的な
塩基配列を有し、所定距離内の第１の標識分子とエネル
ギ移動を生じる第２の標識分子が付加された塩基からな
る第２の１本鎖核酸と、が結合した２本鎖核酸が第１の
１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸とに分離する変性の条件
を制御する変性条件制御手段と、（ｂ）所定波長の励起
光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の第１の１本
鎖核酸および第２の１本鎖核酸とに照射する励起光照射
手段と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検
出する蛍光検出手段と、（ｄ）蛍光検出手段の出力する
信号を入力し、蓄積し、処理する処理手段と、を備え、
変性条件制御手段により変性条件を変化させながら、発
生した蛍光を観測して２本鎖核酸の変性条件の値を測定
することを特徴とする。
【０００９】また、本発明の第２の核酸の変性検出装置
は、上記の本発明の第１の核酸の変性検出装置に変性測
定対象の２本鎖核酸の調製手段を加えたものであり、
（ａ）測定対象である第１の２本鎖核酸の所定部分を、
第１の標識分子が付加された塩基からなる、第１の１本
鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第３の１本鎖核酸と
第２の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第４の１
本鎖核酸とを多数生成する第１の核酸増幅手段と、
（ｂ）第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準
となる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分
を、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じ
る第２の標識分子が付加された塩基からなる、第５の１
本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖核酸
と第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第８の
１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手段と、
（ｃ）第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とを抽出後
に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第３
の２本鎖核酸を生成する核酸生成手段と、（ｄ）第３の
２本鎖核酸が第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とに
分離する変性の環境を制御する変性条件制御手段と、
（ｄ）所定波長の励起光を発生し、変性前の第３の２本
鎖核酸と変性後の第３の１本鎖核酸および第８の１本鎖
核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｅ）励起光の照
射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
（ｆ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、
処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により
変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、第
３の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴と
する。
は、上記の本発明の第１の核酸の変性検出装置に変性測
定対象の２本鎖核酸の調製手段を加えたものであり、
（ａ）測定対象である第１の２本鎖核酸の所定部分を、
第１の標識分子が付加された塩基からなる、第１の１本
鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第３の１本鎖核酸と
第２の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第４の１
本鎖核酸とを多数生成する第１の核酸増幅手段と、
（ｂ）第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準
となる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分
を、所定距離内の第１の標識分子とエネルギ移動を生じ
る第２の標識分子が付加された塩基からなる、第５の１
本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖核酸
と第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第８の
１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手段と、
（ｃ）第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とを抽出後
に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第３
の２本鎖核酸を生成する核酸生成手段と、（ｄ）第３の
２本鎖核酸が第３の１本鎖核酸と第８の１本鎖核酸とに
分離する変性の環境を制御する変性条件制御手段と、
（ｄ）所定波長の励起光を発生し、変性前の第３の２本
鎖核酸と変性後の第３の１本鎖核酸および第８の１本鎖
核酸とに照射する励起光照射手段と、（ｅ）励起光の照
射によって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段と、
（ｆ）蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、
処理する処理手段と、を備え、変性条件制御手段により
変性条件を変化させながら、発生した蛍光を観測し、第
３の２本鎖核酸の変性条件の値を測定することを特徴と
する。
【００１０】上記の第１および第２の核酸の変性検出装
置においては、変性条件は温度であり、前記変性条件
制御手段は温度調節器である、ことを特徴としてもよい
し、変性条件は水素イオン濃度であり、前記変性条件
制御手段は水素イオン濃度調節器である、ことを特徴と
してもよい。また、蛍光検出手段は第１の標識分子と
第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に
発生する第１の蛍光と第１の標識分子と前記第２の標識
分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生
する第２の蛍光とを含む波長範囲の光を波長を含めて検
出し、処理手段は夫々の変性条件に対する各波長の光の
発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、蛍光
検出手段は蛍光波形測定器であり、処理手段は蛍光波形
測定器が検出した蛍光波形から蛍光寿命を算出する、こ
とを特徴としてもよい。更に、蛍光検出手段は第１の
標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こ
った場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、処理
手段は夫々の変性条件に対する第１の蛍光の発生量を算
出する、ことを特徴としてもよいし、蛍光検出手段は
第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動
が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光を選択的に
検出し、処理手段は夫々の変性条件に応じた第２の蛍光
の発生量を算出する、ことを特徴としてもよい。
置においては、変性条件は温度であり、前記変性条件
制御手段は温度調節器である、ことを特徴としてもよい
し、変性条件は水素イオン濃度であり、前記変性条件
制御手段は水素イオン濃度調節器である、ことを特徴と
してもよい。また、蛍光検出手段は第１の標識分子と
第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった場合に
発生する第１の蛍光と第１の標識分子と前記第２の標識
分子との間でエネルギ移動が起こらなかった場合に発生
する第２の蛍光とを含む波長範囲の光を波長を含めて検
出し、処理手段は夫々の変性条件に対する各波長の光の
発生量を算出する、ことを特徴としてもよいし、蛍光
検出手段は蛍光波形測定器であり、処理手段は蛍光波形
測定器が検出した蛍光波形から蛍光寿命を算出する、こ
とを特徴としてもよい。更に、蛍光検出手段は第１の
標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こ
った場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、処理
手段は夫々の変性条件に対する第１の蛍光の発生量を算
出する、ことを特徴としてもよいし、蛍光検出手段は
第１の標識分子と第２の標識分子との間でエネルギ移動
が起こらなかった場合に発生する第２の蛍光を選択的に
検出し、処理手段は夫々の変性条件に応じた第２の蛍光
の発生量を算出する、ことを特徴としてもよい。
【００１１】
【作用】本発明の第１の核酸の変性検出装置では、あら
かじめ調製された、蛍光エネルギ供与体分子が付加され
た塩基からなる１本鎖核酸とエネルギ受容体分子が付加
された塩基からなる１本鎖核酸とが結合した測定対象の
２本鎖核酸を、変性条件（例えば、温度など）の制御が
可能な測定点に配置する。変性条件の初期値は変性が起
きない値に設定する。この状態で励起光を照射し、発生
した蛍光を測定する。測定対象量は、エネルギ受容体
の特性蛍光の発生量、エネルギ供与体の特性蛍光の発
生量、あるいはエネルギ供与体の蛍光寿命である。以
後、処理部の制御のもとで変性条件を変化させながら測
定対象量を測定して、各変性条件値における測定対象量
を蓄積する。測定後、エネルギ受容体の特性蛍光の発生
量の場合には変性後の消光度を、エネルギ供与体の特性
蛍光の発生量の場合には増光度を、エネルギ供与体の蛍
光寿命の場合には寿命変化に着目して変性点を求める。
かじめ調製された、蛍光エネルギ供与体分子が付加され
た塩基からなる１本鎖核酸とエネルギ受容体分子が付加
された塩基からなる１本鎖核酸とが結合した測定対象の
２本鎖核酸を、変性条件（例えば、温度など）の制御が
可能な測定点に配置する。変性条件の初期値は変性が起
きない値に設定する。この状態で励起光を照射し、発生
した蛍光を測定する。測定対象量は、エネルギ受容体
の特性蛍光の発生量、エネルギ供与体の特性蛍光の発
生量、あるいはエネルギ供与体の蛍光寿命である。以
後、処理部の制御のもとで変性条件を変化させながら測
定対象量を測定して、各変性条件値における測定対象量
を蓄積する。測定後、エネルギ受容体の特性蛍光の発生
量の場合には変性後の消光度を、エネルギ供与体の特性
蛍光の発生量の場合には増光度を、エネルギ供与体の蛍
光寿命の場合には寿命変化に着目して変性点を求める。
【００１２】本発明の第２の核酸の変性検出装置では、
基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプル
を出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本
鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する。
この装置は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルと
を、一方はエネルギ供与体分子が付加した塩基を用いて
ＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ供
与体付加塩基でポリメライズ）し、他方はエネルギ受容
体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、
ＰＣＲ増幅した後にエネルギ受容体付加塩基でポリメラ
イズ）する。これらの増幅された核酸から互いに相補関
係にある１本鎖核酸を夫々個別に抽出し、混合して測定
対象核酸を調製する。以後、この調製された測定対象核
酸に対して、第１の核酸の変性検出装置と同様の測定を
行って変性点を求める。
基準となる核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプル
を出発点として、検査核酸および基準核酸の双方の１本
鎖核酸が結合した測定対象核酸の変性検出を実施する。
この装置は、基準核酸サンプルと検査核酸サンプルと
を、一方はエネルギ供与体分子が付加した塩基を用いて
ＰＣＲ増幅（もしくは、ＰＣＲ増幅した後にエネルギ供
与体付加塩基でポリメライズ）し、他方はエネルギ受容
体分子が付加した塩基を用いてＰＣＲ増幅（もしくは、
ＰＣＲ増幅した後にエネルギ受容体付加塩基でポリメラ
イズ）する。これらの増幅された核酸から互いに相補関
係にある１本鎖核酸を夫々個別に抽出し、混合して測定
対象核酸を調製する。以後、この調製された測定対象核
酸に対して、第１の核酸の変性検出装置と同様の測定を
行って変性点を求める。
【００１３】
【実施例】本発明の実施例の説明に先立って、本発明の
核酸の変性検出装置の測定原理の概要を説明する。図１
は、本発明の装置が核酸の変性検出に利用する現象の説
明図である。核酸を構成する塩基に結び付く蛍光分子に
は、２種の蛍光分子同士の距離が約７ｎｍ以下の場合に
は蛍光エネルギ移動が発生する組み合わせが知られてい
る（L.Stryer : Ann. Rev. Biochem. 1978, vol.47, pp
819-846 ）。また、一方の１本鎖核酸にエネルギ供与体
を付加し、他方の１本鎖核酸にエネルギ受容体を付加し
て２本鎖核酸を構成すれば、図１（ａ）のように、２本
鎖核酸の状態ではエネルギ供与体（Ｄ）とエネルギ受容
体（Ａ）との間の距離は約２ｎｍ程度となる対を形成可
能であり、変性後のばらばらになった１本鎖核酸間の平
均距離は７ｎｍよりも遥かに大きくなる。
核酸の変性検出装置の測定原理の概要を説明する。図１
は、本発明の装置が核酸の変性検出に利用する現象の説
明図である。核酸を構成する塩基に結び付く蛍光分子に
は、２種の蛍光分子同士の距離が約７ｎｍ以下の場合に
は蛍光エネルギ移動が発生する組み合わせが知られてい
る（L.Stryer : Ann. Rev. Biochem. 1978, vol.47, pp
819-846 ）。また、一方の１本鎖核酸にエネルギ供与体
を付加し、他方の１本鎖核酸にエネルギ受容体を付加し
て２本鎖核酸を構成すれば、図１（ａ）のように、２本
鎖核酸の状態ではエネルギ供与体（Ｄ）とエネルギ受容
体（Ａ）との間の距離は約２ｎｍ程度となる対を形成可
能であり、変性後のばらばらになった１本鎖核酸間の平
均距離は７ｎｍよりも遥かに大きくなる。
【００１４】単体のエネルギ供与体が蛍光を発生するよ
うな励起光を照射すると、変性前の２本鎖核酸の状態
では、励起光が照射されたエネルギ供与体からエネルギ
受容体へエネルギ移動が起こり、エネルギ受容体からの
蛍光（波長＝λA ；以後、λA 蛍光と呼ぶ）が発生し、
変性後の１本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体とエネ
ルギ受容体との間の距離が大きいので、エネルギ移動が
起こらずエネルギ供与体からの蛍光（波長＝λD ；以
後、λD 蛍光と呼ぶ）のみが発生する。図１（ｂ）は、
変性前の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に
発生する蛍光の強度−波長分布、および変性後の２本鎖
核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の
強度−波長分布を示す。図１（ｂ）から明らかなよう
に、変性前から変性後への変化では、λA 蛍光の強度は
減少し、λD 蛍光の強度は増大する。また、図示はして
いないが、λD 蛍光の蛍光寿命は、変性前と変性後とで
変化する。
うな励起光を照射すると、変性前の２本鎖核酸の状態
では、励起光が照射されたエネルギ供与体からエネルギ
受容体へエネルギ移動が起こり、エネルギ受容体からの
蛍光（波長＝λA ；以後、λA 蛍光と呼ぶ）が発生し、
変性後の１本鎖核酸の状態ではエネルギ供与体とエネ
ルギ受容体との間の距離が大きいので、エネルギ移動が
起こらずエネルギ供与体からの蛍光（波長＝λD ；以
後、λD 蛍光と呼ぶ）のみが発生する。図１（ｂ）は、
変性前の２本鎖核酸の状態での励起光を照射した場合に
発生する蛍光の強度−波長分布、および変性後の２本鎖
核酸の状態での励起光を照射した場合に発生する蛍光の
強度−波長分布を示す。図１（ｂ）から明らかなよう
に、変性前から変性後への変化では、λA 蛍光の強度は
減少し、λD 蛍光の強度は増大する。また、図示はして
いないが、λD 蛍光の蛍光寿命は、変性前と変性後とで
変化する。
【００１５】本発明の核酸の変性検出装置は、上記の変
性前と変性後の発生蛍光の特性の相違を測定して核酸の
変性を検出する。
性前と変性後の発生蛍光の特性の相違を測定して核酸の
変性を検出する。
【００１６】以下、添付図面を参照して、本発明の実施
例を説明する。なお、図面の説明において同一要素には
同一符号を付し、重複する説明は省略する。
例を説明する。なお、図面の説明において同一要素には
同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００１７】（第１実施例）図２は、本発明の第１実施
例に係る核酸の変性検出装置の構成図であり、エネルギ
供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体と
してローダミン分子を使用し、ローダミンの特性蛍光
（λA 蛍光；波長＝５８０ｎｍ）の強度（あるいは発生
頻度）を測定するものである。この装置は、（ａ）所定
波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の
１本鎖核酸と（以後、総称して測定対象核酸と呼ぶ）に
照射する励起光照射部１００と、（ｂ）変性条件である
測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２
００と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検
出する蛍光検出部３００と、（ｄ）変性条件制御部に設
定温度の指示を発行する蛍光検出手段の出力する信号を
入力し、蓄積し、処理する処理部４００と、を備える。
例に係る核酸の変性検出装置の構成図であり、エネルギ
供与体としてフルオレセイン分子を、エネルギ受容体と
してローダミン分子を使用し、ローダミンの特性蛍光
（λA 蛍光；波長＝５８０ｎｍ）の強度（あるいは発生
頻度）を測定するものである。この装置は、（ａ）所定
波長の励起光を発生し、変性前の２本鎖核酸と変性後の
１本鎖核酸と（以後、総称して測定対象核酸と呼ぶ）に
照射する励起光照射部１００と、（ｂ）変性条件である
測定対象の核酸の環境温度を制御する変性条件制御部２
００と、（ｃ）励起光の照射によって発生する蛍光を検
出する蛍光検出部３００と、（ｄ）変性条件制御部に設
定温度の指示を発行する蛍光検出手段の出力する信号を
入力し、蓄積し、処理する処理部４００と、を備える。
【００１８】ここで、励起光照射部１００は、励起光
の波長を含む波長領域の光を発生する光源１１０と、
光源１１０の発生した光を集光する集光レンズ１２０
と、励起光付近の波長域の光のみを透過するフィルタ
１３０と、から構成される。
の波長を含む波長領域の光を発生する光源１１０と、
光源１１０の発生した光を集光する集光レンズ１２０
と、励起光付近の波長域の光のみを透過するフィルタ
１３０と、から構成される。
【００１９】また、変性条件制御部は、測定対象核酸
の収納器２１０と、収納器２１０を囲む熱伝導材２２
０と、外部からの指示により熱伝導材２２０の温度を
指示温度に設定する可変熱源２３０と、から構成され
る。なお、熱伝導材２２０には励起光が測定対象核酸に
照射され、且つ、特定方向へ進行する発生蛍光が出射す
るように一部が光透過性（含、空洞）に構成される。ま
た、可変熱源２３０にはヒータなどが利用される。
の収納器２１０と、収納器２１０を囲む熱伝導材２２
０と、外部からの指示により熱伝導材２２０の温度を
指示温度に設定する可変熱源２３０と、から構成され
る。なお、熱伝導材２２０には励起光が測定対象核酸に
照射され、且つ、特定方向へ進行する発生蛍光が出射す
るように一部が光透過性（含、空洞）に構成される。ま
た、可変熱源２３０にはヒータなどが利用される。
【００２０】また、蛍光検出部３００は、λA 蛍光の
波長付近の光を選択的に透過するフィルタ３３０と、
フィルタ３３０を透過した光を集光する集光レンズ３２
０と、集光レンズ３２０を介した光を受光して電気信
号に変換する光検出器３１０と、から構成される。
波長付近の光を選択的に透過するフィルタ３３０と、
フィルタ３３０を透過した光を集光する集光レンズ３２
０と、集光レンズ３２０を介した光を受光して電気信
号に変換する光検出器３１０と、から構成される。
【００２１】この装置では、以下のようにして核酸の変
性の検出が実施される。
性の検出が実施される。
【００２２】まず、測定対象核酸を調製して収納器２１
０に入れる。このとき、処理部４００が変性条件制御部
２００に対して指示する設定温度は、収納器２１０内の
温度が測定対象核酸が変性を起こさない温度とする。こ
の状態で励起光照射部１００を駆動して、測定対象核酸
に励起光を照射する。励起光の照射を受けた測定対象核
酸に付与されたフルオレセイン分子は励起状態へ遷移す
る。
０に入れる。このとき、処理部４００が変性条件制御部
２００に対して指示する設定温度は、収納器２１０内の
温度が測定対象核酸が変性を起こさない温度とする。こ
の状態で励起光照射部１００を駆動して、測定対象核酸
に励起光を照射する。励起光の照射を受けた測定対象核
酸に付与されたフルオレセイン分子は励起状態へ遷移す
る。
【００２３】励起状態になったフルオレセイン分子の７
ｎｍ以内にローダミン分子が存在しない場合には、フル
オレセイン分子は特性蛍光（λD 蛍光；波長＝５２０ｎ
ｍ）を発生して基底状態へ遷移する。また、励起状態に
なったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分
子が存在する場合には、フルオレセイン分子がエネルギ
供与体となり、ローダミン分子がエネルギ受容体となっ
て、エネルギ移動が起こる。このエネルギ移動が起こる
と、フルオレセイン分子はλD 蛍光を発生せずに基底状
態に遷移し、ローダミン分子は励起状態へ遷移後、λA
蛍光を発生して基底状態へ遷移する。
ｎｍ以内にローダミン分子が存在しない場合には、フル
オレセイン分子は特性蛍光（λD 蛍光；波長＝５２０ｎ
ｍ）を発生して基底状態へ遷移する。また、励起状態に
なったフルオレセイン分子の７ｎｍ以内にローダミン分
子が存在する場合には、フルオレセイン分子がエネルギ
供与体となり、ローダミン分子がエネルギ受容体となっ
て、エネルギ移動が起こる。このエネルギ移動が起こる
と、フルオレセイン分子はλD 蛍光を発生せずに基底状
態に遷移し、ローダミン分子は励起状態へ遷移後、λA
蛍光を発生して基底状態へ遷移する。
【００２４】発生したλA 蛍光は、フィルタ３３０を透
過後、集光レンズ３２０を介して光検出器３１０に入力
する。光検出器３１０は、受光した光を検出し電気信号
に変換して処理部４００へ出力する。処理部４００は、
光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、設定温度
とともに蓄積する。
過後、集光レンズ３２０を介して光検出器３１０に入力
する。光検出器３１０は、受光した光を検出し電気信号
に変換して処理部４００へ出力する。処理部４００は、
光検出器３１０が出力する受光信号を入力し、設定温度
とともに蓄積する。
【００２５】次に、処理部４００が変性条件制御部２０
０に対して設定温度の変更（前回の測定時よりも高い温
度）を指示する。この状態で、励起光照射部１００が駆
動されて、測定対象核酸に励起光が照射され、上記と同
様にして発生するλA 蛍光が測定される。このとき、処
理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入
力し、新たな設定温度とともに蓄積する。
０に対して設定温度の変更（前回の測定時よりも高い温
度）を指示する。この状態で、励起光照射部１００が駆
動されて、測定対象核酸に励起光が照射され、上記と同
様にして発生するλA 蛍光が測定される。このとき、処
理部４００は、光検出器３１０が出力する受光信号を入
力し、新たな設定温度とともに蓄積する。
【００２６】引き続き、処理部４００の指示により変性
条件制御部２００の設定温度を順次昇温しながら、各設
定温度で発生するλA 蛍光が測定される。各設定温度の
状態で光検出器３１０が出力する受光信号は、処理部４
００に入力され、設定温度とともに蓄積される。
条件制御部２００の設定温度を順次昇温しながら、各設
定温度で発生するλA 蛍光が測定される。各設定温度の
状態で光検出器３１０が出力する受光信号は、処理部４
００に入力され、設定温度とともに蓄積される。
【００２７】図３は上記の測定動作で得られた測定結果
を示す図である。図３（ａ）は、処理部４００に蓄積さ
れた内容を、温度を横軸に、λA 蛍光強度（λA 蛍光の
検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図３
（ｂ）は、図３（ａ）を基にして温度を横軸に、λA 蛍
光強度の温度に関する微分値を縦軸にプロットしたグラ
フである。図３（ａ）に示す通り、変性前のλA 蛍光強
度は変性後のλA 蛍光強度よりも大きく、かつ特定の温
度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点と
して検出する。また、蓄積したデータを基にしてλA 蛍
光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図３（ｂ）
に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大とな
る温度を変性点として求めることができる。
を示す図である。図３（ａ）は、処理部４００に蓄積さ
れた内容を、温度を横軸に、λA 蛍光強度（λA 蛍光の
検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフである。図３
（ｂ）は、図３（ａ）を基にして温度を横軸に、λA 蛍
光強度の温度に関する微分値を縦軸にプロットしたグラ
フである。図３（ａ）に示す通り、変性前のλA 蛍光強
度は変性後のλA 蛍光強度よりも大きく、かつ特定の温
度を境に急激に変化する。この変化点の温度を変性点と
して検出する。また、蓄積したデータを基にしてλA 蛍
光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図３（ｂ）
に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が最大とな
る温度を変性点として求めることができる。
【００２８】本実施例において、測定量をλD 蛍光強度
としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透
過波長帯をλD 蛍光の波長付近のものを使用して、上記
と同様の測定を実施する。図４はこの測定動作で得られ
た測定結果を示す図である。図４（ａ）は、処理部４０
０に蓄積された内容を、温度を横軸に、λD 蛍光強度
（λD 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフで
ある。図４（ｂ）は、図４（ａ）を基にして温度を横軸
に、λD 蛍光強度の温度に関する微分を縦軸にプロット
したグラフである。図４（ａ）に示す通り、変性前のλ
D 蛍光強度は変性後のλD 蛍光強度よりも小さく、かつ
特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を
変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にし
てλA 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図
４（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が
最大となる温度を変性点として求めることができる。
としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として透
過波長帯をλD 蛍光の波長付近のものを使用して、上記
と同様の測定を実施する。図４はこの測定動作で得られ
た測定結果を示す図である。図４（ａ）は、処理部４０
０に蓄積された内容を、温度を横軸に、λD 蛍光強度
（λD 蛍光の検出頻度）を縦軸にプロットしたグラフで
ある。図４（ｂ）は、図４（ａ）を基にして温度を横軸
に、λD 蛍光強度の温度に関する微分を縦軸にプロット
したグラフである。図４（ａ）に示す通り、変性前のλ
D 蛍光強度は変性後のλD 蛍光強度よりも小さく、かつ
特定の温度を境に急激に変化する。この変化点の温度を
変性点として検出する。また、蓄積したデータを基にし
てλA 蛍光強度の温度に関する微分値を算出すれば、図
４（ｂ）に示す形のグラフとなるので微分値の絶対値が
最大となる温度を変性点として求めることができる。
【００２９】また、本実施例において、測定量を蛍光寿
命としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として
透過波長帯がλD 蛍光の波長付近を含むものを使用し
て、光検出器３１０としてストリークカメラのような光
波形計測器を用いる。そして、上記と同様の測定を実施
し、処理部４００は設定温度とともに蛍光寿命値を蓄積
する。図５はこの測定動作で得られた測定結果を示す図
である。図５（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容
を、温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命を縦軸に
プロットしたグラフである。図５（ｂ）は、図５（ａ）
を基にして温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命の
温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。
図５（ａ）に示す通り、変性前の平均蛍光寿命は変性後
の平均蛍光寿命よりも大きく、かつ特定の温度を境に急
激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出す
る。また、蓄積したデータを基にして蛍光寿命の温度に
関する微分値を算出すれば、図５（ｂ）に示す形のグラ
フとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点
として求めることができる。
命としてもよい。この場合には、フィルタ３１０として
透過波長帯がλD 蛍光の波長付近を含むものを使用し
て、光検出器３１０としてストリークカメラのような光
波形計測器を用いる。そして、上記と同様の測定を実施
し、処理部４００は設定温度とともに蛍光寿命値を蓄積
する。図５はこの測定動作で得られた測定結果を示す図
である。図５（ａ）は、処理部４００に蓄積された内容
を、温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命を縦軸に
プロットしたグラフである。図５（ｂ）は、図５（ａ）
を基にして温度を横軸に、エネルギ供与体の蛍光寿命の
温度に関する微分を縦軸にプロットしたグラフである。
図５（ａ）に示す通り、変性前の平均蛍光寿命は変性後
の平均蛍光寿命よりも大きく、かつ特定の温度を境に急
激に変化する。この変化点の温度を変性点として検出す
る。また、蓄積したデータを基にして蛍光寿命の温度に
関する微分値を算出すれば、図５（ｂ）に示す形のグラ
フとなるので微分値の絶対値が最大となる温度を変性点
として求めることができる。
【００３０】（第２実施例）図６は、本発明の第２実施
例に係る核酸の変性検出装置の構成図である。上記の第
１実施例では測定対象核酸はあらかじめ調製されたもの
を使用することとしているが、本実施例では基準となる
核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点と
して、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結
合した測定対象核酸の変性検出を実施する装置である。
なお、第１実施例と同様に、エネルギ供与体としてフル
オレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分
子を使用する。
例に係る核酸の変性検出装置の構成図である。上記の第
１実施例では測定対象核酸はあらかじめ調製されたもの
を使用することとしているが、本実施例では基準となる
核酸サンプルと検査対象となる核酸サンプルを出発点と
して、検査核酸および基準核酸の双方の１本鎖核酸が結
合した測定対象核酸の変性検出を実施する装置である。
なお、第１実施例と同様に、エネルギ供与体としてフル
オレセイン分子を、エネルギ受容体としてローダミン分
子を使用する。
【００３１】すなわち、本実施例の装置は、（ａ）基準
となる２本鎖核酸と検査対象２本鎖核酸との夫々対応す
る部分を含むサンプルを調製後に、一方の２本鎖核酸に
対してはフルオレセイン分子が付加された塩基またはヌ
クレオチドを用いてＰＣＲ増幅し、他方の２本鎖核酸に
対してはローダミン分子が付加された塩基を用いてＰＣ
Ｒ増幅する核酸増幅部と、（ｂ）核酸増幅部で増幅され
た２種類の２本鎖核酸に関して、一方の２本鎖核酸を形
成している１本鎖核酸を抽出するとともに、この１本鎖
核酸と相補関係にある１本鎖核酸を他方の２本鎖核酸か
ら抽出する抽出部と、（ｃ）抽出部で抽出された２種の
１本鎖核酸を入力し、混合して、測定対象核酸を生成す
るとともにゲル支持体とも混合する混合部と、（ｄ）混
合部で生成された測定対象核酸を測定点に導くゲル電気
泳動部と、（ｅ）所定波長の励起光を発生し、変性前の
２本鎖核酸あるいは変性後の１本鎖核酸に照射する励起
光照射部１００と、（ｆ）変性条件である測定対象の核
酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、
（ｇ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍
光検出部３００と、（ｈ）変性条件制御部に設定温度の
指示を発行し、装置全体の動作制御を行うとともに、蛍
光検出部３００の出力する信号を入力し、蓄積し、処理
する処理部４５０と、を備える。
となる２本鎖核酸と検査対象２本鎖核酸との夫々対応す
る部分を含むサンプルを調製後に、一方の２本鎖核酸に
対してはフルオレセイン分子が付加された塩基またはヌ
クレオチドを用いてＰＣＲ増幅し、他方の２本鎖核酸に
対してはローダミン分子が付加された塩基を用いてＰＣ
Ｒ増幅する核酸増幅部と、（ｂ）核酸増幅部で増幅され
た２種類の２本鎖核酸に関して、一方の２本鎖核酸を形
成している１本鎖核酸を抽出するとともに、この１本鎖
核酸と相補関係にある１本鎖核酸を他方の２本鎖核酸か
ら抽出する抽出部と、（ｃ）抽出部で抽出された２種の
１本鎖核酸を入力し、混合して、測定対象核酸を生成す
るとともにゲル支持体とも混合する混合部と、（ｄ）混
合部で生成された測定対象核酸を測定点に導くゲル電気
泳動部と、（ｅ）所定波長の励起光を発生し、変性前の
２本鎖核酸あるいは変性後の１本鎖核酸に照射する励起
光照射部１００と、（ｆ）変性条件である測定対象の核
酸の環境温度を制御する変性条件制御部２００と、
（ｇ）励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍
光検出部３００と、（ｈ）変性条件制御部に設定温度の
指示を発行し、装置全体の動作制御を行うとともに、蛍
光検出部３００の出力する信号を入力し、蓄積し、処理
する処理部４５０と、を備える。
【００３２】ここで、核酸増幅部は、基準となる核酸
サンプルとフルオレセイン分子が付加された塩基とを収
納する収納器５１１と、検査対象となる核酸サンプル
とローダミン分子が付加された塩基とを収納する収納器
５１２と、収納器５１１、５１２を囲む熱伝導材５２
０と、外部からの指示により熱伝導材５２０の温度を
指示温度に設定する可変熱源５３０と、から構成され
る。
サンプルとフルオレセイン分子が付加された塩基とを収
納する収納器５１１と、検査対象となる核酸サンプル
とローダミン分子が付加された塩基とを収納する収納器
５１２と、収納器５１１、５１２を囲む熱伝導材５２
０と、外部からの指示により熱伝導材５２０の温度を
指示温度に設定する可変熱源５３０と、から構成され
る。
【００３３】また、抽出部は、収納器５１１とバルブ
を介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリク
ス材を収納した収納器６１１と、収納器５１２とバル
ブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリ
クス材を収納した収納器６１２と、収納器６１１およ
び収納器６１２にバルブを介して連結され、抽出用溶液
である変性剤の機能を有するホルムアミド（８０％）を
収納する収納器６２０と、から構成される。
を介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリク
ス材を収納した収納器６１１と、収納器５１２とバル
ブを介して連結され、表面にアビジンが付着したマトリ
クス材を収納した収納器６１２と、収納器６１１およ
び収納器６１２にバルブを介して連結され、抽出用溶液
である変性剤の機能を有するホルムアミド（８０％）を
収納する収納器６２０と、から構成される。
【００３４】また、混合部は、収納器６１１および収
納器６１２とバルブを介して連結され、抽出された２種
の１本鎖核酸を混合する混合容器７１０と、混合容器
７１０とバルブを介して連結され、混合容器７１０内の
溶液を排出するポンプ７２１と、ポンプ７２１が排出
した溶液を収納する収納器７２２と、から構成される。
納器６１２とバルブを介して連結され、抽出された２種
の１本鎖核酸を混合する混合容器７１０と、混合容器
７１０とバルブを介して連結され、混合容器７１０内の
溶液を排出するポンプ７２１と、ポンプ７２１が排出
した溶液を収納する収納器７２２と、から構成される。
【００３５】また、ゲル電気泳動部は、印加電圧を供
給する電源８１０と、電源８１０に接続された負側電
極８１１と、電源８１０に接続された正側電極８１２
と、混合容器７１０にバルブを介して連結され、ゲル
支持体を収納する収納器８２０と、混合容器７１０と
一方の端がバルブを介して連結された細管状のカラム８
３０と、カラム８３０の他方の端側に配設された、ゲ
ル支持体を収納する収納器８４０と、から構成される。
給する電源８１０と、電源８１０に接続された負側電
極８１１と、電源８１０に接続された正側電極８１２
と、混合容器７１０にバルブを介して連結され、ゲル
支持体を収納する収納器８２０と、混合容器７１０と
一方の端がバルブを介して連結された細管状のカラム８
３０と、カラム８３０の他方の端側に配設された、ゲ
ル支持体を収納する収納器８４０と、から構成される。
【００３６】励起光照射部１００、変性条件制御部２０
０、および蛍光検出部３００は第１実施例と同様に構成
される。処理部４５０は、第１実施例の処理部４００に
加えて、核酸増幅部に対して設定温度を指示する増幅制
御機能および装置内のバルブ制御機能を有し、これらに
対して制御信号を出力する。
０、および蛍光検出部３００は第１実施例と同様に構成
される。処理部４５０は、第１実施例の処理部４００に
加えて、核酸増幅部に対して設定温度を指示する増幅制
御機能および装置内のバルブ制御機能を有し、これらに
対して制御信号を出力する。
【００３７】この装置では、まず、測定対象核酸を調製
する。図７および図８は、基準核酸サンプルと検査核酸
サンプルとから測定対象核酸を調製する手順を示した図
である。これらの図を参照しながら測定対象核酸の調製
動作を説明する。
する。図７および図８は、基準核酸サンプルと検査核酸
サンプルとから測定対象核酸を調製する手順を示した図
である。これらの図を参照しながら測定対象核酸の調製
動作を説明する。
【００３８】基準核酸および検査核酸に夫々２種のプラ
イマを投与し、所定の部位を含む基準核酸サンプルと検
査核酸サンプルとを生成する。このとき、基準核酸に投
与する一方のプライマにビオチンを付加し、検査核酸に
投与する他方のプライマにビオチンを付加しておく（図
７（ａ））。
イマを投与し、所定の部位を含む基準核酸サンプルと検
査核酸サンプルとを生成する。このとき、基準核酸に投
与する一方のプライマにビオチンを付加し、検査核酸に
投与する他方のプライマにビオチンを付加しておく（図
７（ａ））。
【００３９】生成された各サンプルに関して、基準核酸
サンプルはフルオレセイン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納
器５１１内で、検査核酸サンプルはローダミン−ｄＵＴ
Ｐを含む溶液を収納器５１２内で、処理部４５０による
可変熱源５３０および熱伝導材５２０を介した温度制御
によってＰＣＲ増幅される。この結果、フルオレセイン
が付加された塩基からなる基準核酸とローダミンが付加
された塩基からなる検査核酸とが多量に生成される（図
７（ｂ））。
サンプルはフルオレセイン−ｄＵＴＰを含む溶液を収納
器５１１内で、検査核酸サンプルはローダミン−ｄＵＴ
Ｐを含む溶液を収納器５１２内で、処理部４５０による
可変熱源５３０および熱伝導材５２０を介した温度制御
によってＰＣＲ増幅される。この結果、フルオレセイン
が付加された塩基からなる基準核酸とローダミンが付加
された塩基からなる検査核酸とが多量に生成される（図
７（ｂ））。
【００４０】増幅された夫々の核酸は、処理部４５０の
バルブ制御によって、収納器６１１あるいは収納器６１
２に導かれる。ここで、ビオチンの付加した所定部位
は、収納器６１１、６１２にあらかじめ収納されたマト
リクス剤に付着したアビジンと結びついて、収納器６１
１、６１２の内部に留まるが、他のものは収納器６１
１、６１２を通り抜ける（図７（ｃ）および図８
（ａ））。この通り抜けた溶液は、混合器７１０に蓄え
られた後、処理部４５０の指示により、ポンプ７２１に
よって収納器７２２へ排出される。
バルブ制御によって、収納器６１１あるいは収納器６１
２に導かれる。ここで、ビオチンの付加した所定部位
は、収納器６１１、６１２にあらかじめ収納されたマト
リクス剤に付着したアビジンと結びついて、収納器６１
１、６１２の内部に留まるが、他のものは収納器６１
１、６１２を通り抜ける（図７（ｃ）および図８
（ａ））。この通り抜けた溶液は、混合器７１０に蓄え
られた後、処理部４５０の指示により、ポンプ７２１に
よって収納器７２２へ排出される。
【００４１】次に、収納器６１１、６１２に収納器６２
０からホルムアミド（８０％）が導入され、ビオチンが
付加していないプライマ側の１本鎖核酸が溶出される
（図８（ｂ））。溶出された１本鎖核酸は、処理部４５
０のバルブ制御によって、混合器７１０に導入され、混
合後にアニール処理を受けて測定対象核酸となる（図８
（ｃ）。このとき、混合器７１０およびカラム８３０に
はゲル支持体が導入されている。
０からホルムアミド（８０％）が導入され、ビオチンが
付加していないプライマ側の１本鎖核酸が溶出される
（図８（ｂ））。溶出された１本鎖核酸は、処理部４５
０のバルブ制御によって、混合器７１０に導入され、混
合後にアニール処理を受けて測定対象核酸となる（図８
（ｃ）。このとき、混合器７１０およびカラム８３０に
はゲル支持体が導入されている。
【００４２】電源８１０からの電圧供給により、測定対
象核酸は混合器７１０、カラム８３０を移動して、変性
条件制御部２００の配設された測定点へ至る。以後、第
１実施例と同様にして、特性蛍光が計測されて、変性が
検出される。
象核酸は混合器７１０、カラム８３０を移動して、変性
条件制御部２００の配設された測定点へ至る。以後、第
１実施例と同様にして、特性蛍光が計測されて、変性が
検出される。
【００４３】本発明は、上記の実施例に限定されるもの
ではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施
例では変性条件として温度を使用したが、ホルムアミド
のような変性剤をもちいて、濃度を徐々に変化するよう
にしてもよい。また、エネルギ供与体とエネルギ受容体
とは、フルオレセインとローダミンの組み合わせに限ら
れず、他のエネルギ移動を生じる組み合わせで、特性蛍
光波長の異なるものを使用してもよい。また、第２実施
例における測定対象核酸の調製方法は一例であり、既存
の他の方法を用いてもよい。
ではなく、様々な変形が可能である。例えば、上記実施
例では変性条件として温度を使用したが、ホルムアミド
のような変性剤をもちいて、濃度を徐々に変化するよう
にしてもよい。また、エネルギ供与体とエネルギ受容体
とは、フルオレセインとローダミンの組み合わせに限ら
れず、他のエネルギ移動を生じる組み合わせで、特性蛍
光波長の異なるものを使用してもよい。また、第２実施
例における測定対象核酸の調製方法は一例であり、既存
の他の方法を用いてもよい。
【００４４】
【発明の効果】以上、詳細に説明した通り、本発明の第
１の核酸の変性検出装置によれば、準静的に測定点の変
性条件を制御しながら核酸に付加した蛍光分子の特性蛍
光を測定することにしたので、変性条件の勾配を持たせ
たゲル支持体中を電気泳動させる必要がないので、従来
よりも迅速かつ精度良く変性検出が可能である。
１の核酸の変性検出装置によれば、準静的に測定点の変
性条件を制御しながら核酸に付加した蛍光分子の特性蛍
光を測定することにしたので、変性条件の勾配を持たせ
たゲル支持体中を電気泳動させる必要がないので、従来
よりも迅速かつ精度良く変性検出が可能である。
【００４５】また、本発明の第２の核酸の変性検出装置
によれば、基準核酸サンプルと検査対象核酸サンプルと
を出発点として、測定対象核酸を調製後、第１の核酸の
変性検出装置と同様の蛍光測定を行うので、更に、効率
的な一貫測定が可能となる。
によれば、基準核酸サンプルと検査対象核酸サンプルと
を出発点として、測定対象核酸を調製後、第１の核酸の
変性検出装置と同様の蛍光測定を行うので、更に、効率
的な一貫測定が可能となる。
【図１】本発明の核酸の検出装置で利用するエネルギ移
動現象の説明図である。
動現象の説明図である。
【図２】本発明の核酸の検出装置の第１実施例の構成図
である。
である。
【図３】λA 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図
である。
である。
【図４】λD 蛍光強度の計測による変性点検出の説明図
である。
である。
【図５】蛍光寿命の計測による変性点検出の説明図であ
る。
る。
【図６】本発明の核酸の検出装置の第２実施例の構成図
である。
である。
【図７】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（前半）の説
明図である。
明図である。
【図８】測定対象の２本鎖核酸の調製方法（後半）の説
明図である。
明図である。
【図９】従来の核酸の変性検出の方法の説明図である。
１００…励起光照射部、１１０…光源、１２０…集光レ
ンズ、１３０…フィルタ、２００…変性条件制御部、２
１０…測定対象核酸用収納器、２２０…熱伝導材、２３
０…可変熱源、３００…蛍光検出部、３１０…光検出
器、３２０…集光レンズ、３３０…フィルタ、４００，
４５０…処理部、５１１，５１２…ＰＣＲ増幅用収納
器、５２０…熱伝導材、５３０…可変熱源、６１１，６
１２…吸着材用収納器、６２０…溶出変性剤用収納器、
７１０…混合器、７２０…ポンプ、７３０…排出液用収
納器、８１０…電源、８１１，８１２…電極、８２０，
８４０…ゲル支持体用収納器、８３０…カラム
ンズ、１３０…フィルタ、２００…変性条件制御部、２
１０…測定対象核酸用収納器、２２０…熱伝導材、２３
０…可変熱源、３００…蛍光検出部、３１０…光検出
器、３２０…集光レンズ、３３０…フィルタ、４００，
４５０…処理部、５１１，５１２…ＰＣＲ増幅用収納
器、５２０…熱伝導材、５３０…可変熱源、６１１，６
１２…吸着材用収納器、６２０…溶出変性剤用収納器、
７１０…混合器、７２０…ポンプ、７３０…排出液用収
納器、８１０…電源、８１１，８１２…電極、８２０，
８４０…ゲル支持体用収納器、８３０…カラム
Claims (7)
- 【請求項１】 第１の標識分子が付加された塩基からな
る第１の１本鎖核酸と、前記第１の１本鎖核酸と相補的
あるいは略相補的な塩基配列を有し、所定距離内の前記
第１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子
が付加された塩基からなる第２の１本鎖核酸と、が結合
した前記２本鎖核酸が前記第１の１本鎖核酸と前記第２
の１本鎖核酸とに分離する変性の条件を制御する変性条
件制御手段と、 所定波長の励起光を発生し、変性前の前記２本鎖核酸と
変性後の前記第１の１本鎖核酸および前記第２の１本鎖
核酸とに照射する励起光照射手段と、 前記励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光
検出手段と、 前記蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処
理する処理手段と、 を備え、前記変性条件制御手段により変性条件を変化さ
せながら、発生した蛍光を観測し、前記２本鎖核酸の変
性条件を計測することを特徴とする核酸の変性検出装
置。 - 【請求項２】 検査対象である第１の２本鎖核酸の所定
部分を第１の１本鎖核酸と第２の１本鎖核酸に分離し、
第１の標識分子が付加された塩基またはヌクレオチドか
らなる、前記第１の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有
する第３の１本鎖核酸と前記第２の１本鎖核酸と相補的
な塩基配列を有する第４の１本鎖核酸とを多数生成する
第１の核酸増幅手段と、 前記第１の２本鎖核酸と同一あるいは略同一な、基準と
なる第２の２本鎖核酸の前記所定部分に対応する部分
を、前記第１の１本鎖核酸と同一あるいは略同一の第５
の１本鎖核酸と前記第２の１本鎖核酸と同一あるいは略
同一の第６の１本鎖核酸に分離し、所定距離内の前記第
１の標識分子とエネルギ移動を生じる第２の標識分子が
付加された塩基またはヌクレオチドからなる、前記第５
の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有する第７の１本鎖
核酸と前記第６の１本鎖核酸と相補的な塩基配列を有す
る第８の１本鎖核酸とを多数生成する第２の核酸増幅手
段と、 前記第３の１本鎖核酸と前記第８の１本鎖核酸とを抽出
後に混合し、完全２本鎖あるいは部分的２本鎖である第
３の２本鎖核酸を生成する核酸調製手段と、 前記第３の２本鎖核酸が前記第３の１本鎖核酸と前記第
８の１本鎖核酸とに分離する変性の環境を制御する変性
条件制御手段と、 所定波長の励起光を発生し、変性前の前記第３の２本鎖
核酸と変性後の前記第３の１本鎖核酸および前記第８の
１本鎖核酸とに照射する励起光照射手段と、 前記励起光の照射によって発生する蛍光を検出する蛍光
検出手段と、 前記蛍光検出手段の出力する信号を入力し、蓄積し、処
理する処理手段と、 を備え、前記変性条件制御手段により変性条件を変化さ
せながら、発生した蛍光を観測し、前記第３の２本鎖核
酸の変性条件を計測することを特徴とする核酸の変性検
出装置。 - 【請求項３】 前記変性条件は温度であり、前記変性条
件制御手段は温度調節器である、ことを特徴とする請求
項１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。 - 【請求項４】 前記変性条件は水素イオン濃度であり、
前記変性条件制御手段は水素イオン濃度調節器である、
ことを特徴とする請求項１または請求項２記載の核酸の
変性検出装置。 - 【請求項５】 前記蛍光検出手段は前記第１の標識分子
と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こった
場合に発生する第１の蛍光を選択的に検出し、前記処理
手段は夫々の変性条件に対する前記第１の蛍光の発生量
を算出する、ことを特徴とする請求項１または請求項２
記載の核酸の変性検出装置。 - 【請求項６】 前記蛍光検出手段は前記第１の標識分子
と前記第２の標識分子との間でエネルギ移動が起こらな
かった場合に発生する第２の蛍光を選択的に検出し、前
記処理手段は夫々の変性条件に応じた前記第２の蛍光の
発生量を算出する、ことを特徴とする請求項１または請
求項２記載の核酸の変性検出装置。 - 【請求項７】 前記蛍光検出手段は蛍光波形測定器であ
り、前記処理手段は前記蛍光波形測定器が検出した蛍光
波形から蛍光寿命を算出する、ことを特徴とする請求項
１または請求項２記載の核酸の変性検出装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17573093A JP3598123B2 (ja) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | 核酸の変性検出装置 |
| US08/275,910 US5599504A (en) | 1993-07-15 | 1994-07-15 | Apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
| US08/296,893 US5861124A (en) | 1993-07-15 | 1994-08-29 | Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17573093A JP3598123B2 (ja) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | 核酸の変性検出装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0731500A true JPH0731500A (ja) | 1995-02-03 |
| JP3598123B2 JP3598123B2 (ja) | 2004-12-08 |
Family
ID=16001238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17573093A Expired - Fee Related JP3598123B2 (ja) | 1993-07-15 | 1993-07-15 | 核酸の変性検出装置 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5599504A (ja) |
| JP (1) | JP3598123B2 (ja) |
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| US5935522A (en) * | 1990-06-04 | 1999-08-10 | University Of Utah Research Foundation | On-line DNA analysis system with rapid thermal cycling |
| US6106777A (en) * | 1994-11-09 | 2000-08-22 | Hitachi, Ltd. | DNA analyzing method and device therefor |
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| US7273749B1 (en) * | 1990-06-04 | 2007-09-25 | University Of Utah Research Foundation | Container for carrying out and monitoring biological processes |
| US5861124A (en) * | 1993-07-15 | 1999-01-19 | Hamamatsu Photonics Kk | Method and apparatus for detecting denaturation of nucleic acid |
| US5631734A (en) * | 1994-02-10 | 1997-05-20 | Affymetrix, Inc. | Method and apparatus for detection of fluorescently labeled materials |
| JPH10504834A (ja) * | 1994-08-29 | 1998-05-12 | アクゾ・ノベル・エヌ・ベー | 核酸などの生物材料の単離に使用する装置 |
| US6766183B2 (en) | 1995-11-22 | 2004-07-20 | Medtronic Minimed, Inc. | Long wave fluorophore sensor compounds and other fluorescent sensor compounds in polymers |
| US6114122A (en) | 1996-03-26 | 2000-09-05 | Affymetrix, Inc. | Fluidics station with a mounting system and method of using |
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| PT912766E (pt) | 1996-06-04 | 2009-07-16 | Univ Utah Res Found | Monitorização da hibridização durante a pcr |
| DK1030678T3 (da) | 1997-11-12 | 2006-12-11 | Johnson & Johnson Pharm Res | Fremgangsmåde med höj kapacitet til funktionel klassificering af proteiner der identificeres under anvendelse af en genomikfremgangsmåde |
| US6569631B1 (en) * | 1998-11-12 | 2003-05-27 | 3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc. | Microplate thermal shift assay for ligand development using 5-(4″dimethylaminophenyl)-2-(4′-phenyl)oxazole derivative fluorescent dyes |
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| US6422249B1 (en) | 2000-08-10 | 2002-07-23 | Affymetrix Inc. | Cartridge washing system and methods |
| AU2002251944A1 (en) * | 2001-02-15 | 2002-09-04 | Medtronic Minimed, Inc. | Polymers functionalized with fluorescent boronate motifs |
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| US7317415B2 (en) | 2003-08-08 | 2008-01-08 | Affymetrix, Inc. | System, method, and product for scanning of biological materials employing dual analog integrators |
| EP2701194B1 (en) | 2004-06-07 | 2018-08-29 | Fluidigm Corporation | Method and apparatus for imaging a microfluidic device under temperature control |
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| US9767342B2 (en) | 2009-05-22 | 2017-09-19 | Affymetrix, Inc. | Methods and devices for reading microarrays |
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-
1993
- 1993-07-15 JP JP17573093A patent/JP3598123B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-15 US US08/275,910 patent/US5599504A/en not_active Expired - Fee Related
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3598123B2 (ja) | 2004-12-08 |
| US5599504A (en) | 1997-02-04 |
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