DE69931646T2 - Multiplex genotypisierung unter verwendung von fluoreszenzmarkierten hybridisierungssonden - Google Patents

Multiplex genotypisierung unter verwendung von fluoreszenzmarkierten hybridisierungssonden Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Analysieren von multiplen Loci von einer oder von mehreren Nucleinsäuresequenzen hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidhybridisierungssonden, um Mutationen und Polymorphismen basierend auf einer Schmelzkurvenanalyse der Hybridisierungssonden zu identifizieren.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Während die Datenbanken für Polymorphismusmarker und für Erkrankungen verursachende Mutationen fortfahren zu wachsen, gibt es einen ansteigenden Bedarf für Verfahren, die Nucleinsäuresequenzen hinsichtlich der Gegenwart von bekannten Polymorphismen und Mutationen screenen. Optimal sollte das Verfahren in der Lage sein, mehrere DNA-Orte gleichzeitig hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen zu screenen (einschließlich Nucleinsäureloci, die physikalisch durch große Distanzen getrennt sind).
  • Gegenwärtige Verfahren zum Bestimmen der genetischen Konstitution von Individuen (Genotypisieren) beinhalten die Oligonucleotidligation, die allelspezifische Oligonucleotidhybridisierung und die PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse. All diese Verfahren erfordern zeitverbrauchende vielfältige Handarbeitsschritte. Ein alternatives Verfahren zum Genotypisieren verwendet die Schmelztemperatur von Fluoreszenzhybridisierungssonden, die mit einer durch PCR amplifizierten Zielregion eines Genoms oder einer Nucleinsäuresequenz hybridisieren, um Mutationen und Polymorphismen zu identifizieren.
  • Die Polymerasekettenreaktion (PCR) ist eine Technik zum Synthetisieren von großen Mengen eines vorher ausgewählten DNA-Segments. Die Technik ist für die Molekularbiologie fundamental, und es ist die erste praktische molekulare Technik für das klinische Labor. Eine PCR wird durch Auftrennen der DNA in seine zwei komplementären Stränge, durch Binden eines Primers an jeden einzelnen Strang am Ende des gegebenen DNA-Segments, wo die Synthese beginnen wird, und durch Hinzufügen einer DNA-Polymerase, um den komplementären Strang zu jedem einzelnen Strang zu synthetisieren, an den ein Primer gebunden ist, erreicht. Das Verfahren wird wiederholt, bis eine ausreichende Anzahl von Kopien des ausgewählten DNA-Segments synthetisiert wurde. Während einer typischen PCR-Reaktion wird doppelsträngige DNA in seine einzelnen Stränge durch Erhöhen der Temperatur der DNA enthaltenden Probe bis auf eine Denaturierungstemperatur, bei der die zwei DNA-Stränge sich trennen (d. h. die "Schmelztemperatur der DNA"), getrennt, und dann wird die Probe auf eine niedrigere Temperatur abgekühlt, die es den spezifischen Primern erlaubt, sich an die einzelnen DNA-Stränge anzuhaften (Annealing), und die es erlaubt, dass die Replikation auftritt (Extension). In bevorzugten Ausführungsformen wird eine thermostabile Polymerase bei der der Polymerasekettenreaktion verwendet. Eine bevorzugte thermostabile DNA-Polymerase für die Verwendung bei der PCR-Reaktion ist die Taq-DNA-Polymerase und Derivate davon, einschließlich des Stoffel-Fragments der Taq-DNA-Polymerase und der Klen-Tag1-Polymase (einer 5'-Exonuclease-defizienten Variante der Taq-Polymerase – siehe US-Patent Nr. 5,436,149).
  • Das Thermocycling kann unter Verwendung von Standardtechniken ausgeführt werden, die Fachleuten bekannt sind, einschließlich der Verwendung der schnellen Cyclierungs-PCR. Schnelle Cyclierungstechniken werden durch die Verwendung von Probenbehältern mit einem hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis ermöglicht, so wie Kapillarröhrchen. Die Verwendung von Probenbehältern mit einem hohen Oberflächen-zu-Volumen-Verhältnis erlaubt eine schnelle Antwort auf Temperaturveränderungen und eine Temperaturhomogenität in der biologischen Probe. Eine verbesserte Temperaturhomogenität erhöht ebenso die Präzision von jeglichem analytischen Verfahren, das verwendet wird, um die PCR während der Amplifikation zu überwachen.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird die Amplifikation einer Nucleinsäuresequenz durch thermisches Cyclieren der Nucleinsäuresequenz in der Gegenwart einer thermostabilen DNA-Polymerase ausgeführt. Das Verfahren umfasst die Schritte des Anordnens einer biologischen Probe, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, in einem Kapillargefäß, des Erhöhens der Temperatur der biologischen Probe von einer ersten Temperatur auf eine zweite Temperatur, wobei die zweite Temperatur wenigstens 15 °C höher ist als die erste Temperatur, des Haltens der biologischen Probe bei der zweiten Temperatur für eine vorbestimmte Zeitdauer, des Absinkens der Temperatur der biologischen Probe von der zweiten Temperatur auf wenigstens die erste Temperatur und des Haltens der biologischen Probe bei einer Temperatur, die wenigstens so niedrig ist wie die erste Temperatur, für eine vorbestimmte Zeitdauer. Die Temperatur der biologischen Probe wird dann zurück auf die zweite Temperatur erhöht, und die biologische Probe durchläuft dann diesen Thermozyklus für eine vorbestimmte Anzahl von Zyklen. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren des Amplifizierens einer DNA-Sequenz einen Zweitemperaturenzyklus, wobei die Proben durch eine Denaturierungstemperatur und durch eine Annealingtemperatur für eine vorbestimmte Anzahl von Wiederholungen cycliert werden. Jedoch kann die PCR-Reaktion auch unter Verwendung eines Dreitemperaturenzyklus ausgeführt werden, wobei die Proben durch eine Denaturierungstemperatur, eine Annealingtemperatur und eine Elongationstemperatur für eine vorbestimmte Anzahl an Wiederholungen cycliert werden.
  • In einer Ausführungsform wird jeder Temperaturzyklus der PCR-Reaktion in ungefähr 60 Sekunden oder weniger abgeschlossen. Schnelle Cyclierungszeiten können unter Verwendung der Vorrichtung und der Techniken erzielt werden, die in US-Patent Nr. 5,455,175 beschrieben sind.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird die PCR-Amplifikation von einem Zielbereich oder von mehreren Zielbereichen in einer DNA-Probe in der Gegenwart von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden ausgeführt, wobei die Sonden so synthetisiert sind, dass sie mit einem spezifischen Locus hybridisieren, der in der amplifizierten Zielregion der DNA vorhanden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die Hybridisierungssonden zwei Oligonucleotidsonden, die mit benachbarten Bereichen in einer DNA-Sequenz hybridisieren, wobei jede Oligonucleotidsonde mit einem entsprechenden Mitglied eines Fluoreszenzenergietransferpaars markiert ist. In dieser Ausführungsform wird die Gegenwart der Zielnucleinsäuresequenz in einer biologischen Probe durch das Messen des Fluoreszenzenergietransfers zwischen den zwei markierten Oligonucleotiden detektiert.
  • Ein Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) tritt zwischen zwei Fluorophoren auf, wenn sie sich in physikalischer Nähe zu einander befinden und das Emissionsspektrum von einem Fluorophor mit dem Anregungsspektrum des anderen überlappt. Die Geschwindigkeit des Resonanzenergietransfers ist (8,785E–5)(t–1)(k2)(n–4)(qD)(R–6)(JDA), wobei:
    • t
    = die Lebenszeit des angeregten Stadiums des Donors in der Abwesenheit des Akzeptors ist;
    k2
    = ein Orientierungsfaktor zwischen dem Donor und dem Akzeptor ist;
    n
    = der Refraktierungsindex des sichtbaren Lichts in dem dazwischen liegenden Medium ist;
    qD
    = die Quantumeffizienz des Donors in der Abwesenheit des Akzeptors ist;
    R
    = der Abstand zwischen dem Donor und dem Akzeptor gemessen in Angström ist;
    JDA
    = das Integral von (FD)(eA)(W4) bezüglich W an allen überlappenden Wellenlängen ist, wobei:
    FD
    = ein Peak des normalisierten Fluoreszenzspektrums des Donors ist;
    dA
    = der molare Absorptionskoeffizient des Akzeptors (M–1 cm–1) ist;
    W4
    = die Wellenlänge (nm) ist.
  • Für jeden gegebenen Donor und Akzeptor kann die Distanz, bei der ein 50%iger Resonanzenergietransfer auftritt, errechnet werden, und diese Distanz wird als R0 abgekürzt. Da die Geschwindigkeit des Resonanzenergietransfers von der 6. Potenz der Distanz zwischen Donor und Akzeptor abhängt, ändert sich der Resonanzenergietransfer schnell, während R von R0 abweicht. Bei 2 R0 tritt nur sehr wenig Resonanzenergietransfer auf, und bei 0,5 R0 ist die Effizienz des Transfers annähernd vollständig, es sei denn, andere Formen der Ent-Anregung liegen vor.
  • Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer kann als Markierungssystem zum Detektieren von spezifischen DNA-Sequenzen verwendet werden. In Kombination mit der Standardschmelzkurvenanalyse können einzelne Punktmutationen in einem Gen von dem normalen Gen unterschieden werden. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform umfasst solch ein Detektionssystem zwei Oligonucleotide, die mit benachbarten Loci auf einer DNA hybridisieren. Die Oligonucleotide sind jeweils mit einem der Fluorophore eines Fluoreszenzresonanzenergietransferpaars markiert, so dass nach der Hybridisierung der zwei markierten Oligonucleotide mit deren komplementären Sequenzen auf der Ziel-DNA eine Resonanzenergie von dem Donorfluorophor auf den Akzeptorfluorophor übertragen wird. Das Auftreten eines solchen Energietransferereignisses ist detektierbar und zeigt die Gegenwart der Zielnucleinsäuresequenz an.
  • Die fluoreszenzmarkierten Oligonucleotide sind so entworfen, dass sie mit demselben Strang einer DNA-Sequenz hybridisieren, was darin resultiert, dass Donor- und Akzeptorfluorophore durch einen Abstand getrennt sind, der sich von etwa 0 bis zu etwa 25 Nucleotiden, mehr bevorzugt von etwa 0 bis zu etwa 5 Nucleotiden und am meisten bevorzugt von etwa 0 bis zu etwa 2 Nucleotiden bewegt. Ein insbesonders bevorzugter Abstand zwischen Donor- und Akzeptorfluorophor ist etwa 1 Nucleotid.
  • Wenn eines der markierten Oligonucleotide ebenso als PCR-Primer ("Sondenprimer") fungiert, hybridisieren die zwei fluoreszenzmarkierten Oligonucleotide mit gegenüberliegenden Strängen einer DNA-Sequenz. Bei dieser Ausführungsform befinden sich die Donor- und Akzeptorfluorophor vorzugsweise innerhalb von etwa 0–15 Nucleotiden und mehr bevorzugt innerhalb von etwa 4–6 Nucleotiden.
  • Wenn beide der fluoreszenzmarkierten Oligonucleotide nicht mit deren Komplementärsequenz auf der Ziel-DNA hybridisiert sind, ist der Abstand zwischen dem Donorfluorophor und dem Akzeptorfluorophor zu groß, als dass ein Resonanzenergietransfer auftreten könnte. Somit befinden sich der Akzeptorfluorophor und der Donorfluorophor nicht in einer Resonanzenergietransferbeziehung, und die Anregung des Donorfluorophors wird keine detektierbar erhöhte Fluoreszenz durch den Akzeptorfluorophor verursachen.
  • Akzeptable Fluorophorenpaare für die Verwendung als Fluoreszenzresonanzenergietransferpaare sind im Stand der Technik gut bekannt und beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, Fluorescein/Rhodamin, Phycocrythrin/Cy7, Fluorescein/Cy5 oder Fluorescein/Cy5.5.
  • Die thermische Stabilität eines DNA-Duplex hängt von der Duplexlänge, dem GC-Gehalt und der Watson-Crick-Basenpaarbildung ab. Veränderungen bei der Watson-Crick-Basenpaarbildung destabilisieren einen Duplex um variierende Grade, abhängig von der Länge des nicht passenden Duplex, der entsprechenden Nichtentsprechung, der Position der Nichtentsprechung und den benachbarten Basenpaaren. Dementsprechend beeinflusst die Identitätsprozentzahl der Hybridisierungssonden zu ihren komplementären Zielsequenzen direkt die Temperatur, bei welcher sich die Hybridisierungssonde von dem komplementären Strang entfernen wird (Schmelzen). Je größer der Unterschied zwischen der Sonde und der komplementären Zielsequenz, desto niedriger die Temperatur, die erforderlich ist, um die hybridisierenden Stränge zu trennen. Dementsprechend wird sich eine Oligonucleotidsonde, die sequenzidentisch mit der komplementären Wildtypsequenz ist, von einem Locus, der eine Mutation enthält, bei einer niedrigeren Temperatur trennen als sie es von dem Wildtyp-Locus tun wird. Die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden ermöglicht das dynamische Aufzeichnen von Fluoreszenz, während die Temperatur der Probe erhöht und die Schmelztemperatur für die Hybridisierungssonde bestimmt wird. Die generierte Schmelzkurve wird dann mit der bekannten Schmelzkurve für die normale, die mutierte oder die polymorphe Sequenz verglichen, um die Sequenz des Zielnucleinsäurelocus zu bestimmen.
  • WO 97/46714 (University of Utah Research Foundation) offenbart ein Verfahren zum Aufzeichnen der Hybridisierung während der Polymerasekettenreaktion. Die offenbarten Verfahren werden durch schnelles thermisches Cyclieren und unter Verwendung von doppelsträngigen DNA-Farbstoffen oder spezifischen Hybridisierungssonden erreicht. Die offenbarten Fluoreszenzresonanzenergietransferpaare umfassen Fluorescein und Cy5 oder Cy5.5. Offenbarte Verfahren zum Quantifizieren von amplifizierter DNA und zum Bestimmen von deren Reinheit werden durch die Analyse der Schmelz- und Reannealingkurven ausgeführt.
  • WO 97/22719 (Washington University) offenbart ein Verfahren zum Detektieren der Gegenwart eines Zielnucleotids oder einer Sequenz von Nucleotiden in einer Nucleinsäure. Das offenbarte Verfahren besteht aus dem Bilden eines Oligonucleotids, markiert mit zwei Fluorophoren auf dem Nucleinsäurezielort. Das dual markierte Oligonucleotid wird durch die Hinzufügung eines einzeln markierten Dideoxynucleosidtriphosphats zu einem einzeln markierten Polynucleotid oder durch Ligation von zwei einzeln markierten Polynucleotiden gebildet. Die Detektion eines Fluoreszenzresonanzenergietransfers nach der Denaturierung zeigt die Gegenwart des Ziels an. WO 97/22719 offenbart ebenso einen Kit. Die Anwendung führt aus, dass das offenbarte Verfahren insbesondere zum Genotypisieren anwendbar ist.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die simultane Detektion von Sequenzveränderungen an zwei oder mehreren Loci einer amplifizierten DNA-Sequenz, bestimmt durch Schmelzpunktanalyse der DNA-Sondenkomplexe, die in den entsprechenden Bereichen der PCR-amplifizierten DNA gebildet werden. Insbesondere werden PCR-Primer so ausgewählt, dass sie ein vorher ausgewähltes DNA-Segment amplifizieren, das Nucleinsäureloci enthält, die in der Hinsicht identifiziert worden sind, dass sie eine bestimmte Mutation oder einen Polymorphismus enthalten. Die Hybridisierungssonden sind so entworfen, dass sie mit der amplifizierten Region hybridisieren und dass sie den Ort, der die Mutation oder den Polymorphismus umfasst, überspannen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die Hybridisierungssonden mit einem Fluoreszenzmarker markiert. Vorzugsweise umfasst jedes FRET-Oligonucleotidpaar ein Paar Oligonucleotidsonden einschließlich einer Donor-Oligonucleotidsonde, markiert mit einem Resonanzenergietransferdonor, und einer Akzeptor-Oligonucleotidsonde, markiert mit einem Resonanzenergietransferakzeptor. Die Donor-Oligonucleotidsonde und die Akzeptor-Oligonucleotidsonde sind so entworfen, dass die zwei Sonden mit benachbarten Bereichen desselben einzelnen DNA-Strangs hybridisieren und dass Resonanzenergie von dem Donorfluorophor auf den Akzeptorfluorophor übertragen wird, wenn beide Sonden an ihre entsprechende komplementäre Sequenz gebunden sind.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet insbesondere ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend eine Nucleinsäuresequenz hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen an multiplen Loci der Nucleinsäuresequenz, wobei das Verfahren in einem einzigen Reaktionsgefäß ausgeführt wird und die folgenden Schritte umfasst: (a) Kombinieren der biologischen Probe mit einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde und PCR-Primern, wobei die ersten und zweiten Donor-Oligonucleotidsonden jeweils mit einem identischen Donorfluorophor markiert sind und die ersten und zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonden jeweils mit einem identischen Akzeptorfluorophor markiert sind; (b) Hinzufügen einer thermostabilen Polymerase und Amplifizieren der Nucleinsäuresequenz mit der Polymerasekettenreaktion, um ein oder mehrere Amplifikationsprodukte zu produzieren; wobei die ersten und zweiten Donor-Oligonucleotidsonden und die ersten und zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonden mit den Amplifikationsprodukten hybridisieren, so dass die Hybridisierung von sowohl der ersten Donor-Oligonucleotidsonde als auch der ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde an einen ersten Locus eines ersten Amplikationsprodukts die erste Donor-Oligonucleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet und die Hybridisierung von sowohl der zweiten Donor-Oligonucleotidsonde als auch der zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde an einen zweiten Locus des ersten oder zweiten Amplifikationsprodukts die zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet; und (c) Bestrahlen der biologischen Probe und Aufzeichnen der Fluoreszenz von den Oligonucleotidsonden als eine Funktion der Temperatur.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet ebenso insbesondere einen Kit zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen an unterschiedlichen Loci der Nucleinsäuresequenz, wobei das Kit umfasst: (a) eine Mischung aus einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, wobei die erste und zweite Donor-Oligonucleotidsonde jeweils mit einem identischen Donorfluorophor markiert sind und die erste und zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde jeweils mit einem identischen Akzeptorfluorphor markiert sind; wobei die erste Donor-Oligonucleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde so entworfen sind, dass sie mit benachbarten Bereichen eines ersten Locus auf der Nucleinsäuresequenz hybridisieren, und die zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde so entworfen sind, dass sie mit benachbarten Bereichen eines zweiten Locus auf der Nucleinsäuresequenz hybridisieren, so dass die Schmelztemperatur des Sets aus der ersten Donor-Oligonucleotidsonde und der ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde unterschiedlich von der Schmelztemperatur des Sets aus der zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und der zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde ist; (b) ein erstes Paar Oligonucleotidprimer, so konfiguriert, dass sie ein Segment der Nucleinsäuresequenz amplizieren, das den ersten Locus enthält; und (c) eine thermostabile DNA-Polymerase, wobei die Sonden, die Primer und die Polymerase für die Verwendung in einem einzigen Reaktionsgefäß zur Verfügung gestellt werden.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnung
  • 1 ist ein exemplarisches Temperatur-vs.-Zeit-Diagramm für ein schnelles Temperaturcycling für die PCR.
  • 2 zeigt die Ergebnisse von vier unterschiedlichen Temperatur/Zeitprofilen (A–D) und deren resultierende Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (Inset)
  • 3A und 3B illustrieren den Mechanismus der Fluoreszenzbildung für das Aufzeichnen der Fluoreszenz der PCR durch die Verwendung von einer Donor- und einer Akzeptor-Oligonucleotidsonde. 3C illustriert den Mechanismus der Fluoreszenzbildung für ein Sondensystem aus drei Oligonucleotiden.
  • 4 zeigt die chemische Struktur des monovalenten N-Hydroxysuccinimidesters von Cy5TM.
  • 5 zeigt die chemische Struktur des monovalenten N-Hydroxysuccinimidesters von Cy5.5TM.
  • 6 zeigt das Emissionsspektrum von Fluorescein (durchgezogene Linie) und das Anregungsspektrum von Cy5 (gestrichelte Linie).
  • 7 ist eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer schnellen Temperaturcyclierungsvorrichtung mit einer Fluoreszenzdetektion an der Spitze der Probenbehälter.
  • 8 ist eine perspektivische Ansicht des Äußeren der schnellen Temperaturcyclierungsvorrichtung aus 7.
  • 9A und 9B sind perspektivische und Querschnittsansichten eines Probenhandhabungssystems für die Verwendung bei einer einer Schnelltemperaturcyclierungsvorrichtung.
  • 10 ist eine schematische Darstellung einer weiteren Ausführungsform einer Schnelltemperaturcyclierungsvorrichtung, welche mehrere Probenhandhabungstabletts enthält.
  • 11 zeigt den Resonanzenergietransfer, der zwischen Fluorescein- und Cy5-markierten benachbarten Hybridisierungssonden in jedem Zyklus während der PCR auftritt.
  • 12 ist eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegenüber der Zyklusnummer, die zwei Hybridisierungssondendesigns unterscheidet, aufgezeichnet durch den Resonanzenergietransfer: (♢) zwei Hybridisierungssonden, markiert mit Fluorescein bzw. Cy5; und (♦) einen Primer, markiert mit Cy5, und eine Sonde, markiert mit Fluorescein.
  • 13A und 13B zeigen (A) Schmelzkurven und (B) Schmelzpeaks für PCR-Produkte einer Person, die für die Faktor V-Leiden-Mutation heterozygot ist (durchgezogene Linie), die für die Faktor V-Leiden-Mutation homozygot ist (gepunktete Linie), eines homozygoten Wildtyps (unterbrochene Linie) und einer Kontrolle ohne DNA (abwechselnd Punkte und Striche).
  • 14 zeigt eine Auftragung des Fluoreszenzverhältnisses gegenüber der Temperatur beim kontinuierlichen Aufzeichnen während des 40. Zyklus von PCR-Produkten einer Probe, die für die Faktor V-Leiden-Mutation homozygot ist (durchgezogene Linie), die für die Faktor V-Leiden-Mutation heterozygot ist (gepunktete Linie), eines homozygoten Wildtyps (abwechselnd Punkte und Striche).
  • 15 zeigt Schmelzpeaks einer homozygoten Mutante des Methylentetrahydrofolatgens (durchgezogene Linie), eines homozygoten Wildtyps (unterbrochene Linie), einer heterozygoten Mutante (gepunktete Linie) und einer Kontrolle ohne DNA (abwechselnd Punkte und Striche).
  • 16 ist eine schematische Darstellung, die die Primer- und Sondenanordnung für eine Multiplexamplifikation und das Genotypisieren von HFE darstellt. Upstream (U)- und Downstream (D)-Primer sind bezüglich der Exongrenzen illustriert. Die Bereiche von Exon 2 und Exon 4 wurden zur Analyse von H63D (C187G)- bzw. C282Y (G845A)-Mutationen amplifiziert. Die Fluorescein (F)-markierten Sonden befinden sich in einem Fluoreszenzresonanzenergietransfer mit den termisch stabileren Cy5 (Y)-markierten Sonden. Die fluoresceinmarkierten Sonden bilden eine einzelne Misspaarung, wenn sie mit dem einzelsträngigen Wildtypallel hybridisieren. Die Sonde, die innerhalb von Exon 2 hybridisiert, bildet zwei Misspaarungen, wenn sie mit einem Wildtyp (C187)-Allel hybridisiert, das den S65C (193T)-Polymorphismus enthält.
  • 17 zeigt eine Echtzeitamplifikation und das Genotypisieren des C282Y-Orts. Das Inset zeigt die Amplifikation (Cy5-Fluoreszenz gegenüber Zykluszahl) der Genotypen: homozygoter Wildtyp
    Figure 00110001
    , heterozygoter C282Y
    Figure 00110002
    , homozygoter C282Y
    Figure 00110003
    . Eine Kontrolle ohne Template
    Figure 00110004
    ist ebenso beinhaltet. Daten für die Amplifikations- und die Schmelzkurvenanalyse wurden bezüglich einer Basislinie für jede Probe durch Dividieren von jedem Fluoreszenzwert durch das minimale Fluoreszenzsignal für die Probe normalisiert. Die Auftragungen der Schmelzkurven (oben) der Cy5-Fluoreszenz (F) gegenüber der Temperatur (T) werden in Schmelzpeaks (unten) durch Auftragen von –dF/dT gegenüber der Temperatur transformiert. Sowohl die Amplifikations- als auch die Genotypisierungsanalyse ist innerhalb von 45 Minuten abgeschlossen.
  • 18 zeigt eine Echtzeitamplifikation und das Genotypisieren des H63D-Orts. Das Inset zeigt die Amplifikation (Cy5-Fluoreszenz gegenüber Zykluszahl) der 3 Genotypen: homozygoter Wildtyp
    Figure 00110005
    , heterozygoter H63D
    Figure 00110006
    und homozygoter H63D
    Figure 00110007
    . Eine Kontrolle ohne Template
    Figure 00110008
    ist ebenso beinhaltet. Daten für die Amplifikations- und die Schmelzkurvenanalyse wurden bezüglich einer Basislinie für jede Probe durch Dividieren von jedem Fluoreszenzwert durch das minimale Fluoreszenzsignal für die Probe normalisiert. Die Auftragungen der Schmelzkurven (oben) der Cy5-Fluoreszenz (F) gegenüber der Temperatur (T) werden in Schmelzpeaks (unten) durch Auftragen von –dF/dT gegenüber der Temperatur transformiert. Sowohl die Amplifikations- als auch die Genotypisierenanalyse ist innerhalb von 45 Minuten abgeschlossen.
  • 19 zeigt die abgeleiteten Schmelzkurven von 3 heterozygoten Genotypen. Die 3'-fluoresceinmarkierte Probe, die den Bereich überspannt, der innerhalb von Exon 2 amplifiziert wurde (siehe 16), ergibt den heterozygoten C187G-Genotyp
    Figure 00110009
    Figure 00110010
    andem H63D-Ort und den heterozygoten A193T-Genotyp
    Figure 00110011
    an dem S65C-Ort. Die Sonde, die den C282Y-Ort überspannt, identifiziert den heterozygoten G845A-Genotyp
    Figure 00110012
    .
  • 20 zeigt ein homogenes Multiplex-Genotypisieren durch abgeleitete Schmelzkurven für 4 Allele. Gezeigt sind 4 Proben mit unterschiedlichen C282Y/H63D-Genotypen: homozygot C187
    Figure 00120001
    , homozygot G845/homozygot 187G
    Figure 00120002
    , homozygot 845A/homozygot C187
    Figure 00120003
    und heterozygot G845A/heterozygot C1878G
    Figure 00120004
    .
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Beim Beschreiben und Beanspruchen der Erfindung wird die folgende Terminologie in Übereinstimmung mit den hierunter ausgeführten Definitionen verwendet werden.
  • Wie hierin verwendet, beinhalten "Nucleinsäure", "DNA" und ähnliche Ausdrücke ebenso Nucleinsäureanaloga, d. h. Analoga mit etwas anderem als einem Phosphodiesterbackbone. Beispielsweise werden die so genannten "Peptidnucleinsäuren", welche im Stand der Technik bekannt sind und welche Peptidbindungen anstelle von Phosphodiesterbindungen im Backbone haben, als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung angesehen.
  • Wie hierin verwendet, beziehen sich Ausdrücke wie "kontinuierliches Aufzeichnen" und ähnliche Ausdrücke auf das Aufzeichnen mehrerer Zeiten im Laufe eines PCR-Zyklus, vorzugsweise während der Temperaturübergänge, und mehr bevorzugt auf das Erhalten von wenigstens einem Datenpunkt bei jedem Temperaturübergang.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet "Zyklus-nach-Zyklus"-Aufzeichnen das einmalige Aufzeichnen der PCR-Reaktion bei jedem Zyklus, vorzugsweise während der Annealingphase der PCR.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar" ein Paar von Fluorophoren, die einen Donorfluorophor und einen Akzeptorfluorophor umfassen, wobei der Donorfluorophor in der Lage ist, Resonanzenergie auf den Akzeptorfluorophor zu übertragen. In anderen Worten überlappt das Emissionsspektrum des Donorfluorophors mit dem Absorptionspektrum des Akzeptorfluorophors. In bevorzugten Fluoreszenzresonanzenergietransferpaaren überlappt das Absorptionsspektrum des Donorfluorophors nicht im Wesentlichen das Absorptionsspektrum des Akzeptorfluorophors.
  • Wie hierin verwendet, meinen Begriffe wie "Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung" und ähnliche Begriffe einen Donorfluorophor und einen Akzeptorfluorophor, die in ausreichender Nähe und in entsprechender Orientierung zueinander angeordnet sind, so dass der Transfer von Resonanzenergie von dem Donorfluorophor auf den Akzeptorfluorophor ermöglicht wird.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "eine Donor-Oligonucleotidsonde" ein Oligonucleotid, das mit einem Donorfluorophor eines Fluoreszenzresonanzenergietransferpaars markiert ist.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "eine Akzeptor-Oligonucleotidsonde" ein Oligonucleotid, das mit einem Akzeptorfluorophor eines Fluoreszenzresonanzenergietransferpaars markiert ist.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "FRET-Oligonucleotidpaar" das Paar aus Donor-Oligonucleotidsonde und Akzeptor-Oligonucleotidsonde, die eine Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung bilden, wenn die Donor-Oligonucleotidsonde und die Akzeptor-Oligonucleotidsonde beide mit ihren komplementären Zielnucleinsäuresequenzen hybridisiert sind.
  • Wie hierin verwendet, meint der Begriff "Schmelztemperatur des FRET-Oligonucleotidpaars" und "Schmelztemperatur des Sets aus Donor-Oligonucleotidsonde und Akzeptor-Oligonucleotidsonde" die niedrigste Temperatur, die die Hybridisierung von wenigstens einem der Paare der Oligonucleotidsonden auflösen wird (d. h. entweder das Donor- und das Akzeptoroligonucleotid), die sich in einer Resonanzenergietransferbeziehung befinden, wenn beide Sonden an ihre entsprechenden komplementären Sequenzen gebunden sind.
  • Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "wirksame Menge" eine Menge, die ausreicht, um einen ausgewählten Effekt zu produzieren. Beispielsweise ist eine wirksame Menge an PCR-Primern eine Menge, die ausreicht, um ein Segment einer Nucleinsäure durch PCR zu amplifizieren, vorausgesetzt, dass eine DNA-Polymerase, ein Puffer, ein Template und andere Umstände, einschließlich Temperaturbedingungen, von denen im Stand der Technik bekannt ist, dass sie nötig sind, um die PCR auszuführen, ebenso vorhanden sind.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Reagenzien und ein Verfahren zum Screenen von multiplen Loci von Nucleinsäuresequenzen hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen. Insbesondere erlaubt die vorliegende Erfindung ein schnelles Verfahren, das vollständig in einem einzigen Umsetzungsgefäßes ausgeführt werden kann, zur Detektion von Mutationen und Polymorphismen an multiplen Loci einer genomischen DNA-Probe, hergestellt von einem individuellen Organismus. Das Verfahren umfasst die Schritte des Kombinierens einer biologischen Probe, umfassend Nucleinsäuresequenzen mit einem Paar Oligonucleotid-PCR-Primern und zwei oder mehr FRET-Oligonucleotidpaaren, des Hinzufügens einer thermostabilen Polymerase, des Amplifizierens eines ausgewählten Segments aus der Nucleinsäuresequenz durch die Polymerasekettenreaktion und des Bestrahlens der biologischen Probe und des Aufzeichnens der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die PCR-Reaktion unter Verwendung von schnellen Cyclierungstechniken ausgeführt, die in US-Patent Nr. 5,455,175 beschrieben sind. Ein Probentemperaturprofil während eines schnellen PCR-Zyklus ist in 1 gezeigt. Denaturierung und Annealing erscheinen als Temperatur-"Spitzen" in diesen Figuren, im Gegensatz zu den breiten Plateaus beim konventionellen Temperaturcycling für die PCR. Schnelles Temperaturcyclieren befindet sich im Gegensatz zum konventionellem Temperaturcyclieren in 2, wobei gezeigt ist, dass 30 Zyklen einer Amplifikation in 15 Minuten abgeschlossen sein können und die resultierenden PCR-Produkte viel weniger Nebenprodukte enthalten. Somit werden durch das schnelle Zyklieren die erforderlichen Zeiten für die Amplifikation um das etwa 10-fache reduziert, und die Spezifität wird verbessert.
  • Zusätzlich kann ein Echtzeitaufzeichnen einer schnellen PCR-Cyclierungsreaktion durch die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen und fluoreszent markierten Stoffen ausgeführt werden. Schnellcyclierungs-PCR-Reaktionen, ausgeführt in der Gegenwart von fluoreszenzmarkierten Oligonucleotidsonden, ermöglichen die Amplifikation und die Genotypanalyse (durch Fluoreszenzaufzeichnung) in 30 Minuten oder weniger, mehr bevorzugt in 15 Minuten oder weniger und am meisten bevorzugt in 10 Minuten oder weniger. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Echtzeitaufzeichnen einer Schnellcyclierungs-PCR-Reaktion einen oder mehrere vorausgewählte Loci hinsichtlich der Gegenwart einer Mutation oder eines Polymorphismus in etwa 45 Minuten analysieren. Die Verwendung von schnellen Cyclierungstechniken und von Echtzeitfluoreszenzaufzeichnung der PCR-Umsetzung wurden in US-Patent Nr. 5,455,175 vom 3. Oktober 1995 und in den US-Patentanmeldungen Nrn. 08/869,275 und 08/869/276, eingereicht jeweils am 4. Juni 1997, beschrieben.
  • Fluoreszenzsonden für die Verwendung bei der Detektion und beim Überwachen von DNA-Amplifikationen beinhalten DNA-Doppelstrang-spezifische Farbstoffe und sequenzspezifische Sonden. 3A und 3B stellen diagrammartig ein Hybridisierungsschema dar, basierend auf einem Resonanzenergietransfer zwischen Fluorophoren an zwei benachbarten Sonden. Dieses Verfahren ist sequenzspezifisch und erlaubt die Analyse mit Schmelzkurven. Wenn zwei markierte Sonden mit demselben Templatestrang hybridisieren, kann R von viel größer als R0 auf deutlich unter R0 reduziert werden, was den Resonanzenergietransfer dramatisch erhöht.
  • Beispielsweise werden das Fluorescein/Rhodamin-Fluoreszenzenergietransferpaar gewöhnlich für die Nucleinsäuredetektion verwendet. Unglücklicherweise besitzt dieses Fluoreszenzenergietransferpaar eine hohe Rauschfluoreszenz. Sowohl die direkte Akzeptoranregung (eA, ca. 10 % eMAX) als auch die Emission des Donors bei Wellenlängen, die verwendet werden, um die Akzeptoremission zu detektieren (pDA, ca. 20 % Peakemission), sind hoch. Dieses Paar kann verwendet werden, um die Hybridisierung zu überwachen, wenn die Probenkonzentration sich nahe an der Zielkonzentration befindet und ausreichend Zeit für eine vollständige Hybridisierung besteht. Es ist kein nützliches Fluorophorenpaar für das kontinuierliche Überwachen einer PCR, da große Sondenkonzentrationen für das kontinuierliche Überwachen der Reaktionen erforderlich sind und die Templatekonzentration bei der PCR sich kontinuierlich verändert.
  • Das Überwachen der Produktkonzentration während der PCR durch Hybridisierung war in der Vergangenheit nicht möglich, da es an einem akzeptablen Resonanzenergietransferpaar fehlte. Es gab ein paar Versuche, Resonanzenergietransfer für eine direkte "nichtkompetitive" Detektion der Hybridisierung zu verwenden. Beispielsweise führt US-Patent Nr. 5,565,322 aus, dass "die beobachtete Energietransfereffizienz bezüglich der Reemission durch den Akzeptor relativ niedrig war". Bei Sondenkonzentrationen, die hoch genug sind, dass eine signifikante Hybridisierung in Sekunden auftreten kann, ist die Hintergrundfluoreszenz zu hoch.
  • Fluorescein ist wahrscheinlich der am breitesten verwendete Fluorophor. Sein Extinktionskoeffizient und seine Quantumeffizienz sind hoch, und es wird häufig in der Mikroskopie, bei Immunoassays und bei der Flusszytometrie verwendet. Wie oben erwähnt, wurde es als Donor in einem Resonanzenergietransferpaar mit Rhodamin verwendet. Cy5 ist ein beliebter rot emittierender Fluorophor mit einem sehr hohen Extinktionskoeffizienten. Die Struktur des N-Hydroxysuccinimidesters von Cy5 ist in 4 gezeigt und die Struktur des verwandten Farbstoffs Cy5.5 ist in 5 gezeigt. Diese Farbstoffe sind Indodicarbocyaninfarbstoffe, die gewöhnlich bei der Flusszytometrie und bei automatisierten Fluoreszenzsequenzierern verwendet werden, und sie sind erhältlich von Amersham (Pittsburg, PA). Sowohl Fluorescein als auch Cy5 sind kommerziell als Amidite für die direkte automatisierte Miteinbeziehung in Oligonucleotide erhältlich. Jedoch wird Cy5 gewöhnlich nicht als als Resonanzenergietransferpaar mit Fluorescein verwendet. Intuitiv vermutet haben die Fluoreszenzemission und die Cy5-Absorption keine ausreichend große Überlappung, dass ein Resonanzenergietransfer in Erwägung gezogen werden muss. Das Emissionsspektrum von Fluorescein und das Absorptionsspektrum von Cy5, verbunden mit Oligonucleotiden, sind in 6 gezeigt. Wenn die Flächen unter den Kurven normalisiert werden, beträgt der überlappende Bereich von den technischen Spektren 19 %. Die Cy5.5-Anregung ist in den Rotlichtbereich um etwa 25 nm verschoben, was das Überlappen mit der Fluoreszenzemission weiter auf etwa 15 % reduziert. Die Arbeit in dem roten/infraroten Bereich des Spektrums ist vorteilhaft, wenn optische Bestandteile für die Instrumentalisierung ausgewählt werden. Laserdioden können für die Illuminierung verwendet werden, Photodiodendetektoren haben eine exzellente Empfindlichkeit und die meisten Materialien haben eine minimale Autofluoreszenz in dem pertinenten spektralen Bereich.
  • Trotz des niedrigen spektralen Überlappungsbereichs wurde entdeckt, dass Fluorescein und entweder Cy5 oder Cy5.5 ein exzellentes Resonanzenergietransferpaar für das Überwachen der Hybridisierung während der PCRs ergeben. Die unerwartet guten Ergebnisse mit dem Fluorescein/Cy5-Paar können wenigstens teilweise rational begründet werden. Fluorescein hat einen langen Emissions-"Schwanz", der sich bis zu 600 nm, 700 nm und darüber hinaus erstreckt, der verwendet werden kann, um diese Farbstoffe im langwelligen roten und infraroten Bereich anzuregen. Die Geschwindigkeit des Energietransfers ist abhängig von dem Überlappungsintegral, wird aber auch durch die 6. Potenz des Abstandes zwischen den Fluorophoren beeinflusst. Zusätzlich hängt das überlappende Integral JDA nicht nur von dem spektralen Überlappungsbereich ab, sondern ebenso von dem Extinktionskoeffizienten des Akzeptors (Cy5 hat einen Extinktionskoeffizienten von 250.000 M–1cm–11 bei 650 nm) und von der 4. Potenz der Wellenlänge. Beide dieser Faktoren favorisieren einen hohen JDA-Wert für Cy5 sogar unter Berücksichtigung des geringen spektralen Überlappungsbereiches. Kürzlich wurde gezeigt, dass Phycoerythrin und Cy7 ebenso effektive Tandemsonden für die Immunofluoreszenz sind, trotz eines geringen spektralen Überlappungsbereichs.
  • Wenn die zwei fluoreszenzmarkierten Sonden so entworfen werden, dass sich die Resonanzenergietransferfarbstoffe in enger Nachbarschaft befinden, ist die Übertragungsrate groß. Wenigstens mit Fluorescein/Cy5, Fluorescein/Cy5.5 und ähnlichen Paaren scheint der Resonanzenergietransfer das kollisionsbedingte Quenchen und andere Formen von Energieverlust zu dominieren, wenn die Fluorophore eng beieinander angeordnet sind, wie in dem obigen Beispiel, wo die Fluorophore mit benachbarten Sonden ohne dazwischen liegende Basen verbunden sind.
  • Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer kann verwendet werden, um die Hybridisierung von Nucleinsäuren zu überwachen, sogar wenn die interagierenden Farbstoffe eine geringe spektrale Überlappung aufzeigen. Die Verwendung von Fluorescein mit Cy5, Cy5.5 und anderen rot oder infrarot emittierenden Farbstoffen als Resonanzenergietransferpaare zum Überwachen der Hybridisierung wurde bis jetzt nicht erkannt.
  • Eine Vorrichtung, die geeignet ist, um fluoreszenzüberwachte PCR-Reaktionen auszuführen, wurde in der US-Patentanmeldung der Seriennr. 08/869,275 beschrieben. Die Vorrichtung umfasst eine Kammer, eine Erhitzungsvorrichtung und einen Propeller, der in der Vorrichtung angebracht ist und der sich in Luftflusskommunikation der Kammer befindet, und ein Karussell zum Halten einer Vielzahl von Probengefäßen. Die Probengefäße, die in Übereinstimmung mit dieser Vorrichtung verwendet werden, umfassen ein optisch transparentes Material und Wände, die ein Volumen definieren, das wenigstens erste und zweite Dimensionen hat, wobei die erste Dimension geringer als die zweite Dimention ist und wobei das Verhältnis von Volumen zur äußeren Oberfläche des Gefäßes weniger als 1 mm beträgt. Das Karussel wird rotierbar in der Kammer montiert. Die Vorrichtung umfasst weiterhin eine lichtemittierende Quelle, die in der Kammer montiert ist und so angeordnet ist, dass sie wenigstens eines der Probengefäße beleuchtet, und einen Lichtdetektor, der in der Kammer montiert ist und so angeordnet ist, dass er die Fluoreszenz von wenigstens einem der Probengefäße aufzeichnen kann. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die lichtemittierende Quelle und der Lichtdetektor in der Kammer in einer Position montiert, so dass die Probe beleuchtet wird und die Fluoreszenz aus der Probe entlang einer Achse detektiert wird, die im Wesentlichen parallel zu einer Wand entlang der zweiten Dimension des Gefäßes ist. Weiterhin kann die Vorrichtung mit einem Steppermotor zum Rotieren des Karussells ausgerüstet sein, um die entsprechenden Kapillarröhrchen, die durch das Karussell gehalten werden, zur Beleuchtung und zur Fluoreszenzdetektion zu positionieren.
  • 7 stellt eine schematische Darstellung einer Ausführungsform einer PCR-Vorrichtung 400 in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung zur Verfügung. Die Vorrichtung 400 beinhaltet schnelle Temperaturcyclierungsbestandteile, Probenhandhabungsbestandteile und optische Bestandteile, die alle gemeinsam zusammenarbeiten, um eine Fluoreszenzdetektion an der Spitze der Probenkontainer (Epifluoreszenz) zur Verfügung zu stellen. In der Ausführungsform, die in 7 dargestellt ist, wird Luft durch die Öffnung 470 eingeführt und folgt im Allgemeinen dem Flussweg, der durch die Linien 472 angezeigt ist. Die Lufttemperatur und somit die Temperatur des Plastik/Glasprobenbehälters 450 wird vorzugsweise unter Verwendung einer 400-Watt-Heizkassette 474 angepasst, welche vorzugsweise eine ist, die von Reheat, Inc. erhältlich ist. Die Heizkassette 474 ist innerhalb eines zentralen Kanals angeordnet. Ein Propeller 498 wird zur Verfügung gestellt, um die Luft in dem angegebenen Pfad 472 zu bewegen. Der Propeller wird über einen Schaft 496 und einen Motor 494 betrieben. Der Motor 494 ist vorzugsweise ein DC-Seltenerdenbürstenmotor, welcher vorzugsweise von Escap AG erhältlich ist und der eine maximale Umdrehungszahl von 15.000 rpm hat.
  • Beim Erhitzen der Glas/Plastikprobenröhrchen 450 wird die Heizkassette proportional gesteuert und der Propeller wird bei relativ niedriger Geschwindigkeit betrieben (12 V, 0,5 A), um eine Temperaturhomogenität für alle Plastik/Glasprobenbehälter 450 zur Verfügung zu stellen. Beim Abkühlen der Plastik/Glasprobenbehälter 450 wird die Heizkassette 474 abgestellt, und der Motor 494 wird bei hoher Geschwindigkeit laufen gelassen (beispielsweise wird die Maximalgeschwindigkeit mit dem oben erwähnten bevorzugten Motor durch die Anwendung von 27 V, 1,4 A erreicht). Der Propeller 498 zwingt Luft in die Öffnung 470 und aus den Abluftöffnungen 471.
  • In einer Ausführungsform werden 24 Plastik-Glasprobenbehälter 450 (von denen zwei in 7 dargestellt sind) symmetrisch um die Heizkassette 474 und um den zentralen Kanal angeordnet. Die Plastik/Glasprobenbehälter 450 werden durch die Hüllen 451 gehalten, welche (aufgrund deren Offsetstruktur) das präzise Anpassen der Position der individuellen Plastik/Glasprobenbehälter 450 in dem zirkulären Karussell 480 ermöglichen. Die Hüllen 451 werden vorzugsweise aus Messing gefertigt. Die von der Achse entfernte Struktur der Hüllen 451 erlaubt, dass jede Hülle 451 so angeordnet wird, dass die Spitze des Glas/Plastikprobenbehälters 450 präzise so eingerichtet werden kann, dass sie sich an dem optischen Fokuspunkt, der in 7 dargestellt ist, sowohl lateral als auch longitudinal befindet.
  • Das Karussell 480 wird durch einen Träger 482 über einem Gehäuse 490 getragen. Das Karussell 480 wird durch einen Steppermotor 488 positioniert, der mit einer Antriebsschaltung 484 ausgestattet ist, die mit dem Motor 488 über einen Schacht 486 verbunden ist. Der Steppermotor 480 ist mikrogesteppt (unter Verwendung eines Kontrollers von New England Affiliated Technologies), um über 10.000 Schritte pro Umdrehung des Karussells 480 zur Verfügung zu stellen, was ein präzises Positionieren von jedem der Plastik/Glasprobenbehälter 450 ermöglicht. Das Innere des Gehäuses 490 ist mit einem Isolationsmaterial 492 ausgestattet, vorzugsweise in Übereinstimmung mit dem vorher beschriebenen Isolationsmaterial. Ein Fluorimeteraufbau wird direkt durch die Aufbauplatte 468 mit den entsprechenden elektronischen Vorrichtungen gestützt. Eine kollimierende Linse 454, zwei dichroische Filter 456A und 456B, ein Spiegel 458, Interferenzfilter 460A–C und asphärische Fokussierungslinsen 462A–C richten die Strahlung auf die Probe und von der Probe weg.
  • 8 ist eine perspektivische Ansicht des Äußeren der Ausführungsform der vorliegenden Erfindung einschließlich der Bestandteile, die in der schematischen Darstellung von 7 illustriert sind. Besonders vorteilhaft wird das Fluorimeter auf einem verschiebbaren Gehäuse 493 angeordnet, welches durch einen lateralen Steppermotor 491 bewegt wird. Während das Karussell 481 rotiert, werden die Komposit-Plastik/Glasprobenbehälter 450 präzise über dem Fluorimeteraufbau 459 in der Richtung des Karussells positioniert und die Position wird durch den Apparat über den "hall effect"-Positionslokalisator 495 bemerkt, während der laterale Steppermotor 491 die Position des Fluorimeteraufbaus 459 in einer zweiten Dimension und in der bestimmten Position anpasst.
  • In einer alternativen Ausführungsform hat das Karussell für mehrfache Proben, das verwendet wird, eine scheibenartige Struktur mit einer Vielzahl von Probenempfangsports in der oberen Oberfläche der Scheibenstruktur und in Fluidkommunikation mit den korrespondierenden Probengefäßen, die an der Scheibe angebracht sind. Die Proben, die in die Probenempfangsports eingefügt werden, werden zu ihren entsprechenden Probengefäßen durch die Rotation des Karussells befördert. Somit umfasst in einer Ausführungsform die Vorrichtung zum Ausführen von Fluoreszenzüberwachungs-PCR-Reaktionen ein Karussell, wie in 9A und 9B gezeigt. Karussell 1 hat im Allgemeinen die Form einer Scheibe 2 mit einer oberen Oberfläche 3, einer unteren Oberfläche 4 und einer äußeren Kante 5, die sich zwischen den Oberflächen erstreckt. Die Scheibe 2 hat eine Vielzahl von Sätzen von radial angeordneten Probenempfangsports 6A, 6B und 6C in der oberen Oberfläche 3, einen Probengefäßport 7 in der äußeren Kante 5 und eine Probenpassage 8, die mit den Probenempfangsports 6A, 6B und 6C und dem entsprechenden Probengefäßport 7 kommuniziert. Das Karussell 1 ist mit fixierten Probengefäßen gezeigt, von denen einige mit 9 bezeichnet sind. Der Probengefäßport 7 und die Probenpassage 8 werden zum Empfangen und Fixieren von Probengefäß 9 an der Scheibe 2 gebildet. In einer Ausführungsform ist das Probengefäß 9 lösbar an dem Karussell 1 fixiert, um das Entfernen des Probengefäßes und dessen Ersatz mit einem weiteren Probengefäß zu erlauben, um die mehrfache Verwendung des Karussells 1 zu erlauben. In einer alternativen Ausführungsform sind die Probengefäße 9 permanent an der Scheibe 2 befestigt oder bilden einen integralen Bestandteil der Scheibe 2. In einer Ausführungsform ist das Probengefäß 9 an der Scheibe 2 durch einen Reibungskontakt zwischen dem Probengefäß 9 und wenigstens einem Teil der Probenpassage 8 proximal zu dem Probengefäßport 7 befestigt. Andere konventionelle Mittel zum Fixieren des Probengefäßes in Kommunikation mit dem Probengefäß können verwendet werden. Beispielsweise können komplementäre Schraubengewinde auf der Oberfläche der Probenpassage 8 und auf der äußeren Oberfläche des Probengefäßes 9 gebildet werden. Zusätzlich können Adhäsive oder andere Fixierungsmittel, die Fachleuten bekannt sind, in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um das Probengefäß 9 an der Scheibe 2 zu befestigen. Die oberen und unteren Oberflächen des Karussells der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise so gebildet, dass sie es erlauben, dass mehrere Karussells aufeinander gestapelt werden können, so dass ein Stapel von mehreren Karussels lösbar mit dem Motorantriebsschaft verbunden werden kann und simultan als eine Einheit rotiert werden kann, wie in 10 gezeigt.
  • Die Ausführungsform, die in 10 gezeigt ist, beinhaltet einen Steppermotor 504 und einen Antriebsstab 506, welcher die Funktion hat, die Karussells so zu halten und zu rotieren, wie es allgemein mit 1 bezeichnet ist. Ein Kammerpropeller 508 wird verwendet, um den Luftstrom zu bilden, der durch die Pfeile 512 angezeigt ist. Die Erhitzungsvorrichtung 510 funktioniert so, dass sie Luft erhitzt, welche an den Probengefäßen 9 vorbeigeleitet wird. Ein Fluorimeteraufbau 514 beinhaltet eine LED-Quelle 514A, Photodioden 514B, Fokussierungslinsen 514C und einen Filteraufbau 514D. Ein Fluorimetersteppermotor 516 hat die Funktion, den Fluorimeteraufbau 514 in die Richtung des Pfeils 518 zu bewegen.
  • Die PCR-Primer, die verwendet werden, um die Amplifikationsreaktionen in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung auszuführen, werden so ausgewählt, dass sie mit den entsprechenden 3'-Enden der komplementären Stränge der DNA-Sequenz hybridisieren, die das Ziel der Amplifikation ist, so dass nach der Hinzufügung der DNA-Polymerase und bei den entsprechenden Umsetzungsbedingungen (die Fachleuten bekannt sind) das Zielsegment der DNA-Sequenz amplifiziert wird. Die Oligonucleotidprimer für die Amplifikation des ausgewählten Mutationslocus haben vorzugsweise eine Länge von 15 bis zu 30 Resten. Primer, die kürzer sind als der bevorzugte Bereich, können ebenso verwendet werden, aber könnten den Nachteil einer geringeren Spezifität für die Zielsequenz haben. Auf ähnliche Art und Weise können Primer, die länger als der bevorzugte Bereich sind, ebenso verwendet werden, aber sie wären unnötig teuer zu synthetisieren. Somit sind die Grenzen der Größen der PCR-Primer nur durch deren Funktionalität gesetzt.
  • Die FRET-Oligonucleotidpaare sind so ausgewählt, dass sie mit den spezifischen Loci hybridisieren, von denen erwartet wird, dass sie eine Mutation oder einen Polymorphismus enthalten können. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die 3'-Termini der Oligonucleotidsonden, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, unter Verwendung von Techniken, die Fachleuten bekannt sind, modifiziert, um zu vermeiden, dass die Oligonucleotidsonden als PCR-Primer dienen. Die Donor- und Akzeptor-Oligonucleotidsonden, die das FRET-Oligonucleotidpaar darstellen, sind jeweils etwa 15–40 Nucleotidreste lang, jedoch können diese Sonden eine kürzere Länge, bis zu etwa 10 Nucleotidresten, aufweisen. Mögliche Nachteile von solch kürzeren Nucleotiden beinhalten eine niedrige Spezifität, eine niedrige Schmelztemperatur und ein erhöhtes Rauschen. Oligonucleotide, die länger sind als 40 Reste, könnten ebenso verwendet werden, aber wären unnötig teuer zu synthetisieren. Somit ist die Größe der Oligonucleotidsonden lediglich begrenzt durch deren Funktionalität. Jeder Satz Oligonucleotidsonden umfasst eine Donor-Oligonucleotidsonde und eine Akzeptor-Oligonucleotidsonde, wobei die Donor- und Akzeptorfluorophore sich innerhalb von etwa 10 bis zu etwa 150 Angström befinden und mehr bevorzugt innerhalb von etwa 22 bis zu etwa 72 Angström, wenn die Oligonucleotide beide mit ihren komplementären Ziel-DNA-Loci hybridisiert sind.
  • Wenigstens eine der Donor- und Akzeptor-Oligonucleotidsonden, die das FRET-Oligonucleotidpaar darstellen, sollte mit dem Locus hybridisieren, der die Mutation enthält. Wenn die Mutation nur ein paar Nucleotide beinhaltet, wie beispielsweise bei Punktmutationen, sollte wenigstens eine der Sonden den Locus überspannen, der die Mutation enthält. Da es bekannt ist, dass eine fehlende Basenpaarbindung am Ende einen geringeren Effekt auf die Schmelzeigenschaften hat als eine fehlende Basenpaarbindung an internen Orten, wird vorzugsweise die Sonde, die den Locus überspannt, der die Mutation/den Polymorphismus enthält, so entworfen, dass die Position der Mutation/des Polymorphismus einer internen Position der hybridisierenden Oligonucleotidsonde entspricht. Beim Synthetisieren des FRET-Oligonucleotidpaars kann entweder die Donor- oder die Akzeptor-Oligonucleotidsonde ausgewählt werden, den Locus zu überspannen, der die Mutation enthält. Alternativ, wenn die Mutation eine große Anzahl an Nucleotiden beinhaltet (d. h. mehr als 10 Basenpaare), so wie es bei Inversionen, Translokationen, Insertionen und Deletionen gesehen wird, sollte wenigstens eine der Sonden sich in den Bereich der Nucleinsäuresequenzen erstrecken, die die inserierten oder deletierten Sequenzen enthalten (d. h. über den Mittelpunkt der Mutationen hinaus), aber muss nicht notwendigerweise die gesamte Region der Nucleinsäuren überspannen, die die inserierten oder deletierten Sequenzen enthalten.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Oligonucleotidsonde, die mit dem Mutationslocus hybridisiert, so entworfen, dass sie eine niedrigere Schmelztemperatur hat als die andere Oligonucleotidsonde des FRET-Oligonucleotidpaars. Dementsprechend wird der Verlust an Fluoreszenz von dem Akzeptorfluorphor (wenn die Temperatur der Probe erhöht wird) der Schmelztemperatur des Duplex entsprechen, der an am Locus gebildet ist, der die Mutation/den Polymorphismus enthält. In einer Ausführungsform haben sowohl die Donor-Oligonucleotidsonde als auch die Akzeptor-Oligonucleotidsonde höhere Schmelzpunkte als die PCR-Primer, die verwendet werden, um die ausgewählte DNA-Sequenz zu amplifizieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrere Loci einer Zielnucleinsäuresequenz in einem einzigen Gefäß durch das Entwerfen von Sets von FRET-Oligonucleotidpaaren analysiert werden, die mit unterschiedlichen genetischen Loci hybridisieren und die unterschiedliche Schmelztemperaturen für jedes FRET-Oligonucleotidpaar haben. Die Sequenz der Zielloci kann dann basierend auf dem Vergleich der Schmelzpeaks der Probe mit den Schmelzpeaks der DNA-Sequenzen bestimmt werden, die die Wildtyp- und die mutierten Loci enthalten. Vorteilhafterweise können unterschiedliche Sets von FRET-Oligonucleotidpaaren mit dem gleichen Fluoreszenzresonanztransferpaar markiert werden, was es erlaubt, bei einer einzigen Emissionswellenlänge aufzuzeichnen. In einer Ausführungsform ist jedes Set an FRET-Oligonucleotidpaaren mit dem gleichen Fluoreszenzenergietransferpaar markiert, und insbesondere sind die Donor-Oligonucleotidsonden mit Fluorescein markiert, und die Akzeptor-Oligonucleotidsonden sind mit Cy5 markiert.
  • Alternativ können die mehreren FRET-Oligonucleotidpaare mit unterschiedlichen Fluoreszenzresonanzenergietransferpaaren markiert sein, so dass die Sets an FRET-Oligonucleotidpaaren basierend auf unterscheidbaren Emissionsspektren voneinander unterscheidbar sind. Jedoch ist das bloße Verlassen auf die Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzmarkern durch die limitierte Anzahl an erhältlichen Fluorophoren und die überlappenden Emissionsspektren der erhältlichen Fluorophore kompliziert.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform verwendet das Verfahren zum Analysieren von mehreren Loci eine Mischung aus FRET-Oligonucleotidpaaren, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzresonanzenergietransferpaaren markiert sind, die unterscheidbare Emissionsspektren haben und FRET-Oligonucleotidpaare; die mit Fluoreszenzresonanzenergietransferpaaren markiert sind, die überlappende Emissionsspektren haben, die aber basierend auf unterschiedlichen Schmelztemperaturen der entsprechenden FRET-Oligonucleotidpaare unterscheidbar sind. Jedoch kompliziert die Verwendung von mehreren Sets von Fluoreszenzmarkern mit unterscheidbaren Emissionsspektren die Detektion und Analyse der Emissionen aus der Probe. Dementsprechend ist das Design von FRET-Oligonucleotidpaaren mit unterschiedlichen Schmelztemperaturen für jedes der FRET-Oligonucleotidpaare bevorzugt.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform wird eine Gesamtheit von drei Oligonucleotiden verwendet, um die Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen an zwei unterschiedlichen Loci auf demselben DNA-Strang zu detektieren (siehe 3C). In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform hybridisieren die drei Oligonucleotide nebeneinander an demselben DNA-Strang. Das erste markierte Oligonucleotid 70 hybridisiert mit dem Locus, der die erste Mutation enthält, und das dritte markierte Oligonucleotid 72 hybridisiert mit dem Locus, der die zweite Mutation enthält. Das zweite markierte Oligonucleotid 74 hybridisiert mit den DNA-Sequenzen, die zwischen den Loci angeordnet sind, die die ersten und zweiten Mutationen enthalten. Das zweite markierte Oligonucleotid 74 ist sowohl an dessen 3'- als auch an dessen 5'-Ende mit einem ersten Mitglied eines Fluoreszenzresonanzenergietransferpaares markiert. Die ersten und dritten Oligonucleotide sind jeweils mit den entsprechenden zweiten Mitgliedern des Fluoreszenzresonanzenergietransferpaares markiert, so dass nach der Hybridisierung aller drei Oligonucleotide mit deren entsprechenden komplementäre Sequenzen die Fluoreszenzresonanzenergietransferpaare in einer Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung angeordnet sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schmelztemperatur des zweiten markierten Oligonucleotids größer als die Schmelztemperatur des ersten und des dritten markierten Oligonucleotids.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform des Drei-Oligonucleotid-Sondensystems ist das zweite markierte Oligonucleotid 74 an sowohl seinem 3'- als auch an seinem 5'-Ende mit einem Donorfluorophor markiert, und das erste markierte Oligonucleotid 70 und das dritte markierte Oligonucleotid 72 sind jeweils an ihrem entsprechenden 5'- und 3'-Ende mit einem Akzeptorfluorophor markiert (siehe 3C). Alternativ kann das zweite markierte Oligonucleotid an sowohl seinem 3'- als auch an seinem 5'-Ende mit einem Akzeptorfluorophor markiert sein, und jedes der ersten und dritten markierten Oligonucleotide kann mit einem Donorfluorophor markiert sein. Schließlich kann das zweite markierte Oligonucleotid an einem Ende mit einem Akzeptorfluorophor markiert sein und das andere Ende kann mit einem Donorfluorophor markiert sein, und die ersten und dritten Oligonucleotide sind jeweils mit dem entsprechenden Mitglied des Fluoreszenzresonanzenergietransferpaares markiert, so dass nach der Hybridisierung von allen drei Nucleotiden mit ihren entsprechenden komplementären Sequenzen die Fluoreszenzresonanzenergietransferpaare in einer Fluoreszenzresonanzenergietransferbeziehung angeordnet sind.
  • In Übereinstimmung mit einer einer Ausführungsform ist das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar, das an dem 3'-Ende des ersten markierten Oligonucleotids und dem 5'-Ende des zweiten markierten Oligonucleotids angeordnet ist, das Gleiche wie das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar, das an dem 5'-Ende des dritten markierten Oligonucleotids und dem 3'-Ende des zweiten markierten Oligonucleotids angeordnet ist. In Übereinstimmung mit dieser Ausführungsform ist die Schmelztemperatur des ersten markierten Oligonucleotids unterschiedlich zu der Schmelztemperatur des dritten markierten Oligonucleotids. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Donorfluorphor Fluorescein und das Akzeptorfluorophor ist Cy5 oder Cy5.5. Alternativ kann das Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar, das an dem 3'-Ende des ersten markierten Oligonucleotids und dem 5'-Ende des zweiten markierten Oligonucleotids angeordnet ist, unterschiedlich von dem Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar sein, das an dem 5'-Ende des ersten markierten Oligonucleotids und dem 3'-Ende des zweiten markierten Oligonucleotids angeordnet ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe, umfassend eine Nucleinsäuresequenz, hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen an verschiedenen Loci der Nucleinsäuresequenz zur Verfügung gestellt, ausgeführt durch Bestimmen der Schmelztemperatur einer Hybridisierungssonde, die komplementär zu dem Locus ist, der die Mutation oder den Polymorphismus enthält. Das Verfahren wird in einem einzigen Reaktionsgefäß ausgeführt und umfasst die Schritte des Kombinierens der biologischen Probe mit einem Paar Oligonucleotid-PCR-Primern, einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, des Amplifizierens des ausgewählten Segments aus der DNA und des Bestimmens der Schmelztemperatur von jedem Set aus Donor- und Akzeptor-Oligonucleotidsonde.
  • Gemäß diesem Verfahren werden die Oligonucleotid-PCR-Primerpaare so konfiguriert, dass sie ein ausgewähltes Segment der Nucleinsäuresequenz amplifizieren. Die erste und zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die erste und zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde werden so entworfen, dass sie mit dem ausgewählten Segment hybridisieren, so dass die Hybridisierung von sowohl der ersten Donor-Oligonucleotidsonde als auch der ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde an das ausgewählte Segment die erste Donor-Oligonucleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet und die Hybridisierung von sowohl der zweiten Donor-Oligonucleotidsonde als auch der zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde an das ausgewählte Segment die zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet.
  • Um die Schmelzkurve für jeden Satz aus Donor-Oligonucleotidsonde und Akzeptor-Oligonucleotidsonde zu bestimmen, wird die biologische Probe mit Licht bestrahlt, das durch den Donorfluorophor der ersten und der zweiten Oligonucleotidsonde absorbiert wird, und die Fluoreszenz der Probe wird als Funktion der Temperatur aufgezeichnet. Insbesondere wird die Fluoreszenz des ersten und des zweiten Akzeptorfluorophors gemessen, während die Temperatur der Probe erhöht wird, bis ein basales Niveau an Akzeptorfluorophorfluoreszenz erreicht wird. In einer Ausführungsform wird die temperaturabhängige Fluoreszenz nach Abschluss der PCR-Umsetzung aufgezeichnet. In einer alternativen Ausführungsform wird die temperaturabhängige Fluoreszenz in Echtzeit während der PCR-Reaktion aufgezeichnet.
  • Das Verfahren des Ausführens einer PCR-Amplifikationsumsetzung während simultan die Fluoreszenzveränderung als eine Funktion der Temperatur bestimmt wird, erlaubt ein schnelleres Genotypisieren der Zielloci. In der Vergangenheit war nur eine Endpunktdetektion aufgrund instrumenteller Limitierungen möglich. Jedoch wurde kürzlich eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Ausführen einer Echtzeitüberwachung einer PCR-Reaktion in US-Patent Nr. 5,455,175 vom 03. Oktober 1995 und in US-Patentanmeldung Nrn. 08/869,275 und 08/869,276, jeweils angemeldet am 04. Juni 1997, offenbart. Im Allgemeinen wird eine Diode, die mit hoher Intensität Licht emittiert, für die Probenbeleuchtung verwendet, und Photodioden werden zur Detektion verwendet. Die Proben werden in Glaskapillarprobenröhrchen eingeführt oder alternativ in Kompositglas/Plastikprobenröhrchen in einem 96-well-Format eingeführt, die keine Hitzeversiegelung erfordern. Beim Ausführen einer kontinuierlichen Überwachung wird eine Probe an der Kreuzung eines temperaturkontrollierten Luftstroms und eines linearen optischen Pfades angeordnet. Eine Seite der Kapillare wird mit einer lichtemittierenden Diode beleuchtet und die andere Seite wird mit einer Photodiode beobachtet. In einer Ausführungsform wird die Probe beleuchtet, und die emittierte Probenfluoreszenz wird durch das Ende des Kapillargefäßes detektiert. Luft wird konstant über die Probe geleitet und die Temperatur wird durch ein Heizelement kontrolliert, so wie eine Heizspule oder eine Glühbirne.
  • Um die Schmelzpunktpeaks der zwei Sondensätze zu unterscheiden, werden die Sonden so entworfen, dass die Schmelztemperatur von jedem Sondensatz verschieden von der Schmelztemperatur des anderen Sondensatzes ist. In bevorzugten Ausführungsformen sind die mehreren Sätze an FRET-Oligonucleotidpaaren jeweils mit dem gleichen Resonanzenergietransferpaar markiert und jedes FRET-Oligonucleotidpaar hat einen unterschiedlichen Schmelztemperaturbereich.
  • Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um jegliche bekannte Mutation zu detektieren, wo eine Hybridisierungssonde entworfen werden kann, wobei Standardtechniken verwendet werden, die Fachleuten bekannt sind, so dass die Sonden bezüglich der Schmelztemperatur differieren, wenn sie mit Mutanten und mit dem Wildtyp hybridisiert werden. Die Hybridisierungssonde wird typischerweise so entworfen werden, dass sie eine Einzelbasenpaarmutation (Punktmutation) detektiert, jedoch können auch andere Mutationen, so wie Insertionen, Deletionen, Inversionen, Transversionen und multiple Punktmutationen in einem einzelnen Locus ebenso unter Verwendung der Techniken der vorliegenden Erfindung detektiert werden. Wenn die Hybridisierungssonden verwendet werden, um Inversionen, Transversionen, Insertionen oder Deletionen zu detektieren, wird sich wenigstens eine der Donor- oder Akzeptor-Oligonucleotidsonden in den Bereich der Nucleinsäuresequenzen erstrecken, die die inserierten oder deletierten Sequenzen enthalten, aber wird nicht notwendigerweise die gesamte Region der Nucleinsäuresequenzen überspannen, die die inserierten oder deletierten Sequenzen enthalten.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine Sonde in jedem Satz an FRET-Oligonucleotidpaaren an ihrem 5'-Ende mit einem Fluoreszenzenergietransferakzeptor markiert, der ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Cy5, Cy5.5 und anderen rot oder infrarot emittierenden Farbstoffen, und die andere Sonde jedes Satzes ist an ihrem 3'-Ende mit Fluorescein markiert, einem Fluoreszenzenergietransferdonor. Da beide Fluoreszenzsonden, die bei diesem Verfahren hergestellt werden, direkt aus den Amiditen synthetisiert werden können, ist eine manuelle Synthese nicht erforderlich, so wie es bei doppelmarkierten Sonden oder bei Primer/Sondenhydrolysesystemen erforderlich ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist wenigstens eine der Sonden in jedem Satz so entworfen, dass der Mutationslocus einer komplementären Sequenz entspricht, die in der Nähe des Zentrums der Sonde angeordnet ist. Weiterhin wurden die Donor- und Akzeptorsonden in jedem Satz so modifiziert, dass vermieden wird, dass sie als PCR-Primer fungieren, und sie sind so entworfen, dass sie an angrenzende Bereiche der Ziel-DNA hybridisieren. Vorzugsweise befinden sich die Donor- und Akzeptorfluorophore innerhalb von 0–25 Nucleotiden, mehr bevorzugt innerhalb von 0–5 Nucleotiden, am meisten bevorzugt innerhalb von 0–2 Nucleotiden nach der Hybridisierung der Donor- und Akzeptorsonden mit deren komplementären Sequenzen. Ein besonders bevorzugter Abstand ist ein Nucleotid. Da der Hintergrund des Fluoresceins größere Probleme verursacht als der Hintergrund des Cy5, sollte die Konzentration der Cy5-markierten Sonde vorzugsweise das 2- bis 5-fache der Konzentration der fluoresceinmarkierten Sonde betragen.
  • Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Echtzeitfluoreszenzüberwachung einer PCR-Reaktion verwendet, um Produktschmelzkurven während der PCR-Reaktion zu erhalten. Die Temperaturzyklen der PCR, die die Amplifikation antreiben, denaturieren alternierend das akkumulierende Produkt und die fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden bei einer hohen Temperatur und annealen die Primer und die Hybridisierungssonden an das Produkt bei einer niedrigeren Temperatur. Die Übergangstemperaturen der fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden hängen in erster Linie vom GC-Gehalt und von ihrer Länge ab. Wenn eine Sonde so entworfen ist, dass sie intern mit dem PCR-Produkt hybridisiert, hängt die Schmelztemperatur der Sonde ebenso vom GC-Gehalt, von der Länge und von dem Grad der Komplementarität zu dem Ziel ab. Das Auftragen der Fluoreszenz als eine Funktion der Temperatur ergibt eine PCR-Produktschmelzkurve, da die Probe über die Dissoziationstemperatur des Produkts hinaus erhitzt wird. Die Form und Position dieser DNA-Schmelzkurve ist eine Funktion des GC/AT-Verhältnisses, der Länge und der Sequenz und kann verwendet werden, um Amplifikationsprodukte zu unterscheiden, die durch weniger als 2 °C in der Schmelztemperatur getrennt sind. Ein solches kontinuierliches Überwachen der Fluoreszenz während der PCR-Umsetzung stellt ein System zum Detektieren von Sequenzveränderungen im Bereich der PCR-Primer durch Resonanzenergietransfer und Sondenschmelzkurven dar.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Coamplifizieren von zwei oder mehr separaten Nucleinsäurebereichen unter Verwendung von wenigstens zwei PCR-Primersätzen und von wenigstens zwei FRET-Oligonucleotidpaarsets als Sonden, um simultan separate Bereiche durch Analysieren der Schmelztemperatur der Sets von FRET-Oligonucleotidpaaren einem Genotypisieren zu unterziehen. Auf diese Weise können mehrere unterschiedliche Gene simultan in einem einzigen Reaktionsgefäß hinsichtlich der Gegenwart von bekannten Mutationen oder Polymorphismen gescreent werden.
  • Das Verfahren zum Analysieren einer biologischen Probe hinsichtlich der Gegenwart von Mutationen oder Polymorphismen an mehreren Orten von Nucleinsäuresequenzen kann in einem einzelnen Reaktionsgefäß ausgeführt werden. In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte des Kombinierens einer biologischen Probe mit einem ersten und zweiten Paar Oligonucleotid-PCR-Primern, einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde. Eine thermostabile Polymerase wird dann hinzugefügt, und die ersten und zweiten ausgewählten Segmente werden durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert, und die biologische Probe wird beleuchtet und die Fluoreszenz der Probe wird als eine Funktion der Temperatur gemessen.
  • Bei dieser Ausführungsform ist das erste Oligonucleotidprimer-Paar so konfiguriert, dass es ein erstes ausgewähltes Segment der Nucleinsäuresequenzen amplifiziert, und das zweite Paar Oligonucleotidprimer ist so konfiguriert, dass sie ein zweites ausgewähltes Segment der Nucleinsäuresequenzen amplifizieren. Die ersten und zweiten ausgewählten Segmente können in großem Abstand voneinander angeordnet sein und können auf unterschiedlichen DNA-Sequenzen angeordnet sein.
  • Die Oligonucleotidsonden werden so entworfen, dass die erste Donor-Oligonucleotid- und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde mit einem ersten ausgewählten Segment auf eine Art und Weise hybridisieren, die die erste Donor-Oligonucleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet. Zusätzlich werden die zweite Donor-Oligonucleotid- und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde so entworfen, dass sie mit dem zweiten ausgewählten Segment auf eine Art und Weise hybridisieren, die die zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde in einer Resonanzenergietransferbeziehung anordnet. In einer Ausführungsform ist das erste FRET-Oligonucleotidpaar mit demselben Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar markiert wie das zweite FRET-Oligonucleotidpaar, aber die Schmelztemperatur des ersten FRET-Oligonucleotidpaars ist verschieden von der Schmelztemperatur des zweiten FRET-Oligonucleotidpaars. In einer Ausführungsform ist der Donor Fluorescein und der Akzeptorfluorophor ist Cy5 oder Cy5.5.
  • Es sollte ebenso anerkannt werden, dass, auch wenn die Erfindung bezüglich der Detektion von Mutationen in genomischer DNA beschrieben worden ist, dieselben Prinzipien auf die Detektion von Mutationen in cDNA angewendet werden können. Die Präparation von cDNa erfordert zusätzliche Verfahrensschritte und Zeit, wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, und daher ist es bevorzugt, genomische DNA zu verwenden, da sie Vorteile in Bezug auf Geschwindigkeit und niedrigere Kosten bietet. Jedoch kann die Verwendung der vorliegenden Verfahren zur Analyse von cDNA verwendet werden, um Defekte zu identifizieren, die in genomischen DNA-Sequenzen nicht vorhanden sind. Beispielsweise können die vorliegenden Verfahren mit cDNA-Sequenzen verwendet werden, um Fehler zu identifizieren, die während der Präparation der cDNA eingeführt worden sind, ebenso wie zum Identifizieren von Fehlern, die von in vivo-Defekten beim Spleißen oder von anderen transkriptionalen oder posttranskriptionalen Defekten herrühren. Weiterhin kann dieselbe Technik verwendet werden, um Insertion und Deletionen in Nucleinsäuresequenzen zu detektieren durch das Entwerfen von Hybridisierungssonden, die eine veränderte Schmelztemperatur haben, wenn sie mit einem Locus hybridisieren, der die Mutation oder den Polymorphismus enthält.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zum Genotypisieren einer biologischen Probe hinsichtlich einer Mutation oder eines Polymorphismus. Der Kit beinhaltet wenigstens zwei Paare Fluoreszenzoligonucleotidsonden (d. h. ein erstes FRET- Oligonucleotidpaar und ein zweites FRET-Oligonucleotidpaar), wobei die Oligonucleotide jedes Paars (eine Donor- und eine Akzeptor-Oligonucleotidsonde) so entworfen sind, dass sie mit benachbarten Bereichen von Nucleinsäuresequenzen hybridisieren.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Kit eine Mischung aus einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde, wobei die erste und die zweite Donor-Oligonucleotidsonde mit demselben Donorfluorophor markiert sind und die erste und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde mit demselben Akzeptorfluorophor markiert sind. Die erste Donor-Oligonucleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonucleotidsonde sind so entworfen, dass sie mit benachbarten Bereichen von einem ersten Locus einer Nucleinsäuresequenz hybridisieren, wobei der hybridisierte Satz aus erstem Donor- und erstem Akzeptor-Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine erste Schmelztemperatur aufweist. Die zweite Donor-Oligonucleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonucleotidsonde sind so entworfen, dass sie mit benachbarten Bereichen von einem zweiten Locus der Nucleinsäuresequenz hybridisieren, wobei der hybridisierte Satz aus zweitem Donor- und zweitem Akzeptor-Oligonucleotid dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine zweite Schmelztemperatur aufweist. Weiterhin sind die Oligonucleotidsonden so entworfen, dass die erste Schmelztemperatur des Satzes aus einer ersten Donor-Oligonucleotidsonde und einer ersten Akzeptor-Oligonucleotidsonde verschieden ist von der zweiten Schmelztemperatur des Satzes aus einer zweiten Donor-Oligonucleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonucleotidsonde.
  • In einer Ausführungsform umfasst der Kit zusätzliche Sätze an FRET-Oligonucleotidpaaren, wobei die zusätzlichen Sätze an FRET-Oligonucleotidpaaren Schmelztemperaturen haben, die von den ersten und zweiten FRET-Oligonucleotidpaaren verschieden sind. Alternativ sind in einer Ausführungsform die zusätzlichen Sätze an FRET-Oligonucleotidpaaren mit einem Fluoreszenzresonanzenergietransferpaar markiert, dessen Emission des Akzeptorfluorophors nicht mit der Emission des Akzeptorfluorophors der ersten und zweiten FRET-Oligonucleotidpaare überlappt. In einer Ausführungsform beinhalten die zusätzlichen Sätze an FRET-Oligonucleotidpaaren eine Mischung aus FRET-Oligonucleotidpaaren, die Schmelztemperaturen haben, die von den ersten und zweiten FRET-Oligonucleotidpaaren verschieden sind, ebenso wie FRET- Oligonucleotidpaare, die mit Fluoreszenzresonanzenergietransferpaaren markiert sind, deren Emission des Akzeptorfluorophors nicht mit der Emission des Akzeptorfluorophors der ersten und der zweiten FRET-Oligonucleotidpaare überlappt.
  • Zusätzlich zu den Sonden kann der Kit einen oder mehrere Oligonucleotidprimer enthalten, die so entworfen sind, dass sie ein oder mehrere ausgewählte Segmente aus einer Nucleinsäure amplifizieren. Alternativ kann der Kit alle Reagenzien enthalten, die erforderlich sind, um die PCR-Amplifikationsreaktion und die Fluoreszenzdetektion von Mutationen und Polymorphismen zu beginnen.
  • In Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Multiplex-PCR-Amplifikation und das Genotypisieren durch die Fluoreszenzsonde Tm verwendet, um simultan mehrere Varianten in dem vererbbaren Hämochromatosegen zu detektieren. Vererbbare Hämochromatose ist die häufigste genetische Erkrankung, die in der nördlichen Hemisphäre bekannt ist, wobei von mehr als 1 Million Amerikanern vermutet wird, dass sie ein Risiko für diese Erkrankung tragen. Dieser autosomale rezessive Zustand des Eisenmetabolismus tritt in einer Häufigkeit von ungefähr 0,5 % in kaukasischen Populationen auf. Die Fehlregulation von intestinaler Eisenabsorption kann letzlich zu einem Parenchymzellschaden und zu einer Endorgandysfunktion führen. Langzeitkomplikationen mit einer Eisenüberbelastung beinhalten Arthritis, Kardiomyopathie, Diabetes, Zirrhose und hepatozellulären Krebs. Die Sterblichkeit, die mit einer Eisenüberbelastung verbunden ist, ist durch eine frühe Diagnose und durch die Behandlung mit Phlebotomie vermeidbar.
  • Eine Cystein-nach-Tyrosin-Aminosäuresubstitution, verursacht durch einen G845A-Übergang bei Codon 282 (C282Y), wird bei 85–100 % der Krankheitschromosomen von Patienten mit nordeuropäischer Verwandschaft gefunden, die die gut definierten klinischen Kriterien für eine Eisenüberbelastung erfüllen. Eine weitere Mutation (H63D) wird durch eine C187G-Transversion gebildet. Diese Substitution hat einen geschätzten Durchsatz zwischen 0,44–1,5 % des homozygoten C282Y-Genotyps.
  • Die gegenwärtigen Verfahren zum Genotypisieren der C282Y- und H63D-Hämochromatose verursachenden Mutationen beinhalten Oligonucleotidligation, allelspezifische Oligonucleotidhybridisierung und PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse. Alle diese Verfahren erfordern viele Handarbeitsschritte und sind zeitaufwendig. Die Verwendung von PCR-basierter Technologie in Kombination mit einer Echtzeitanalyse durch Fluoreszenzschmelzkurven stellt eine homogene Amplifikation und ein Genotypisieren in etwa 45 min zur Verfügung. In einer Ausführungsform wird die Anlyse der Loci, die die Hämochromatosemutationen tragen, unter Verwendung einer 3'-Fluorescein-markierten Sonde und einer 5'-Cy5-markierten Sonde, die sich in einem Fluoreszenzenergietransfer befinden, wenn sie mit demselben Strang hybridisieren, ausgeführt (siehe Beispiel 8).
  • 117 Patienten, die den klinischen Kriterien für eine Eisenüberbelastung entsprechen, und 56 normale Kontrollen wurden zur Analyse der C282Y- und H63D-Mutationen in dem HFE-Gen ausgewählt. Beide Gruppen waren kaukasische Amerikaner aus Utah und aus Nachbarstaaten. Vier unterschiedliche Allele konnten simultan während der Schmelzkurvenanalyse identifiziert werden. Die Resultate dieser Studie sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Tabelle 3. Analyse der C282Y- und H63D-Mutationen innerhalb der Population von Utah
    Figure 00330001
    • * hh bezeichnet Homozygotie für die Mutation.
    • Hh bezeichnet Heterozygotie.
    • HH bezeichnet den homozygoten Wildtyp.
  • Achtundneunzig (83,8 %) der Patienten und keine der Kontrollen waren hinsichtlich der C282Y-Mutation homozygot. Die C282Y-Mutation wurde in 87 % der Chromosomen der Patienten und in 6,3 % der Chromosomen der normalen Kontrollen gefunden. Die H63D-Mutation wurde in 11 % der Kontrollchromosomen gefunden und in nur 4,3 % der Patientenchromosomen. Es gab 8 Patienten und 7 normale Kontrollen, die bezüglich der C282Y-Mutation heterozygot waren. Eine Hälfte der C282Y-heterozygoten Patienten trug die H63D-Mutation, wohingegen es keine heterozygoten Genotypen unter den Kontrollen gab. Zusätzlich identifizierte eine einzelne Sonde drei Allele einschließlich eines unerwarteten Polymorphismus (A193T), was das Potential von aneinander angrenzenden Fluoreszenzhybridisierungssonden zum Scannen für bekannte ebenso wie für unbekannte Mutationen demonstriert.
  • Beispiel 1
  • 2 zeigt die Ergebnisse von vier unterschiedlichen Temperatur/Zeitprofilen (A–D) und deren resultierende Amplifikationsprodukte nach dreißig Zyklen (A–D). Die Profile A und B in 2 wurden unter Verwendung einer Heizblockvorrichtung des Standes der Technik und eines Mikrozentrifugenröhrchens ebenfalls des Standes der Technik erhalten. Wie aus 2 ersehen werden kann, sind die Übergänge zwischen den Temperaturen langsam und viele nichtspezifische Banden sind in den Profilen A und B vorhanden. Profil B zeigt eine Verbesserung beim Eliminieren von einigen der nichtspezifischen Banden (im Gegensatz zu Profil A) durch Limitieren der Zeit, die jede Probe bei einer Temperatur verbleibt, was somit anzeigt, dass kürzere Zeiten mehr wünschenswerte Ergebnisse produzieren.
  • Die Profile C und D wurden unter Verwendung eines schnellen Temperaturcyclers erhalten. Wie in 2 gesehen werden kann, ist die Amplifikation spezifisch, und auch wenn die Ausbeute mit 60 Sekunden langen Elongationszeiten maximal ist (C), ist sie immer noch mit 10 Sekunden langen Elongationszeiten (D) vollständig adäquat.
  • Die optimalen Zeiten und Temperaturen für die Amplifikation eines 536 bp-Fragments aus beta-Globin aus humaner genomischer DNA wurden ebenso bestimmt. Die Amplifikationsausbeuten und die Produktspezifität waren optimal, wenn die Denaturierung (93 °C) und das Annealing (55 °C) weniger als 1 Sekunde betrugen. Kein Vorteil wurde beobachtet, wenn die Denaturierung oder die Annealingzeiten ausgedehnt wurden. Die Ausbeute stieg mit längeren Elongationszeiten bei 77 °C an, aber es gab wenig Veränderungen mit Elongationszeiten, die länger waren als 10–20 Sekunden. Weitere Informationen können von C.T. Wittwer et al. Rapid Cycle Allele-Specific Amplification with Cystic Fibrosis delta F(508) Locus, 39 Clinical Chemistry 804 (1993) und C.T. Wittwer et al., Rapid DNA Amplification, THE POLYMERASE CHAIN REACTION 174 (1994) erhalten werden.
  • Beispiel 2
  • Ein 110 bp beta-Globinfragment wurde aus 50 ng humaner gonomischer DNA unter Verwendung von humanem beta-Globinprimern PC03/PC04 (110 Basenpaare) amplifiziert. Diese Primer sind in C.T. Wittwer et al., Automated polymerase chain reaction in capillary tubes with hot air, 17 Nucl. Acids. Res. 4353–4357 (1989) beschrieben. Die DNA-Amplifikation wurde in 50 mM Tris, pH 8,5 (25 °C), 3 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin mit den internen Sonden CAAACAGACA CCATGGTGCA CCTGACTCCT GAGGA-Fluorescein (SEQ ID NO:1) und Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAA G-p (SEQ ID NO:2) in einer Menge von jeweils 0,2 μM und 0,8 U KlenTaq1-Polymerase (eine 5'-Exonuclease-defiziente Variante von Taq-Polymerase-US-Patent Nr. 5,436,149) in einer 10 μl-Reaktion ausgeführt. Die Sonden hybridisierten intern mit den Primern auf demselben Strang und waren sofort ohne dazwischen liegende Basen benachbart.
  • Sonden und Primer wurden mit Hilfe der Standardphosphoramiditchemie synthetisiert, die im Stand der Technik bekannt ist, unter Verwendung eines Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus (Piscataway, New Jersey). Die 3'-Fluorescein-markierte Sonde wurde auf einer fluoresceinmarkierten CPG-Kassette (Glen Research, Sterlin, VA) mit dem finalen Trityl-ON synthetisiert, um bei der C18-Umkehrphasen-HPLC-Aufreinigung zu helfen. Der späte Elutionspeak wurde gesammelt und die Tritylgruppe wurde auf PolyPack (Glen Research) entfernt. Das fluoresceinmarkierte Oligo wurde mit 50 % Acetonitril eluiert und nochmals durch C18-Umkehrphasen-HPLC aufgereinigt. Die 5'-Cy5-markierte Sonde wurde mit einem chemischen Phosphorylierungsmittel an dem 3'-Ende (Glen Research) und durch Hinzufügen eines Cy5-Amidits (Pharmacia) an das 5'-Ende während der Trityl-OFF-Synthese synthetisiert. Fehlsequenzen wurden durch C18-Umkehrphasen-HPLC entfernt. Die Probenreinheit wurde durch Polyacrylamidgelelektrophorese und durch die Absorption des Farbstoffs und des Oligo überprüft.
  • HPLC wurde auf einer 4 × 250 mm Hypersil ODS-Säule (Hewlett Packard) mit einer mobilen Phase aus 0,1 M Triethanolamin:Acetat und einem Acetonitrilgradienten bei 1 ml/min ausgeführt. Das Eluat wurde hinsichtlich sowohl der Absorption (A260) als auch der Fluoreszenz (490 nm Anregung, 520 nm Emission für Fluorescein und 650 nm Anregung, 670 nm Emission für Cy5) überwacht. Tritylierte und fluoresceinmarkierte Oligonucleotide wurden mit einem 10–20%igen Acetonitrilgradienten eluiert, und Cy5-markierte Oligonucleotide eluierten über einen 10–40%igen Acetonitrilgradienten.
  • Das Temperaturcyclieren wurde bei 94 °C für 0 s mit einer programmierten Herangehensgeschwindigkeit von 20 °C/s, 60 °C für 20 s mit einer Herangehensgeschwindigkeit von 20 °C/s und 75 °C für 0 s mit einer Gerangehensgeschwindigkeit von 1 °C/s in einem kapillaren Fluoreszenzschnelltemperaturcycler ausgeführt. Während des Temperaturcyclierens wurde die Fluorescein- und Cy5-Fluoreszenz nach jedem Zyklus am Ende des Annealing/Extensionssegments gemessen. Der Resonanzenergietransfer wurde sowohl als Absinken der Fluoresceinfluoreszenz als auch als Anstieg der Cy5-Fluoreszenz gemessen, beginnend um den Zyklus 26 der Amplifikation (11A–11C). Im Allgemeinen ist das Beobachten des Fluoreszenzverhältnisses von der Cy5- zur Fluoresceinfluoreszenz bevorzugt.
  • Beispiel 3
  • Die Wirkung des Verhältnisses, der Konzentration und des Abstandes von Fluorescein und Cy5-markierten angrenzenden Hybridisierungssonden während der PCR wurde studiert. Die Amplifikation des beta-Globinlocus und das Sondenpaar aus Beispiel 2 wurde verwendet, und die maximale Veränderung des Fluoreszenzverhältnisses von Cy5 zu Fluorescein wurde beobachtet. Das maximal Signal trat auf, wenn das Verhältnis von Cy5 zu fluoresceinmarkierten Sonden 2:1 betrug. Bei diesem 2:1-Verhältnis trat das beste Signal bei einer Fluoresceinsondenkonzentration von 0,2 μM und einer Cy5-markierten Sondenkonzentration von 0,4 μM auf. Die optimale Anzahl der dazwischen liegenden Basen zwischen den benachbarten Hybridisierungssonden während der PCR wurde ebenso bestimmt. Verschiedene Sonden der gleichen Länge, aber leicht verschoben bezüglich ihrer Hybridisierungsposition, wurden gemäß Beispiel 2 synthetisiert, so dass, wenn sie mit dem beta-Globinziel hybridisierten, 0, 1, 2, 3, 4 oder 6 Basen zwischen den Sonden verblieben. Das stärkste Signal während der PCR trat mit einer dazwischen liegenden Base auf. Auch wenn etwas Resonanzenergietransfer bei einem Abstand von 15 und sogar von 25 Basen detektiert wurde, trat ein viel besserer Transfer bei etwa 0–5 Basen auf.
  • Beispiel 4
  • Das Zyklus-nach-Zyklus-Überwachen der PCR wurde durch Resonanzenergietransfer zwischen einem Cy5-markierten Primer und einer fluoresceinmarkierten Hybridisierungssonde ausgeführt. Dies wurde verglichen mit dem Überwachen mit aneinander angrenzenden Cy5/Fluorescein-Hybridisierungssonden. Der Cy5-markierte Primer war CAACTTCATC CACGT*TCACC (SEQ ID NO:3), wobei T* eine modifizierte T-Base ist, an die Cy5 gebunden ist, und die entsprechende Sonde war GTCTGCCGTT ACTGCCCTGT GGGGCAA-Fluorescein (SEC ID NO:4). Die benachbarten Hybridisierungssonden waren CCTCAAACAG ACACCATGGT GCACCTGACT CC-Fluorescein (SEQ ID NO:5) und Cy5-GAAGTCTGCC GTTACTGCCC TGTGGGGCAAp (SEQ ID NO:6). Die Hybridisierungssonden wurden gemäß Beispiel 2 synthetisiert und in einer Konzentration von 0,2 μM verwendet. Die Cy5-markierten Primer wurden in zwei Schritten synthetisiert. Eine automatisierte Synthese wurde verwendet, um einen Aminomodifikator C6dT (Glen Research) an der gewünschten T-Position mit einzubeziehen. Dann wurde der monovalente N-Hydroxysuccinimidester von Cy5 (4) manuell mit dem Aminolinker gemäß den Anweisungen des Herstellers konjugiert (Amersham). Die HPLC-Aufreinigung wurde ausgeführt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
  • Der Cy5-markierte Primer (0,5 μM) wurde anstelle von PCO4 verwendet, um das 110 Basenpaar lange beta-Globinfragment aus humaner genomischer DNA wie in Beispiel 2 zu amplifizieren, außer dass 0,4 U Taq-Polymerase pro 10 μl verwendet wurden. Die benachbarten Hybridisierungssonden überwachten ebenso die Amplifikation desselben beta-Globinfragments. Das Temperaturcycling wurde bei 94 °C für 0 s und bei 60 °C für 20 s ausgeführt. Die Fluoreszenz wurde einmal in jedem Zyklus am Ende des Annealing/Extensionssegments aufgezeichnet. In beiden Verfahren erhöht sich der Fluoreszenzenergietransfer zu Cy5 mit der Hybridisierung und wird als Verhältnis von der Cy5- zur Fluoresceinfluoreszenz aufgetragen (12).
  • Beispiel 5
  • Während das Fluoreszenzüberwachen während der PCR einmal in jedem Zyklus bei einer konstanten Temperatur ausgeführt werden kann, stellt die vorliegende Erfindung den wichtigen Vorteil des Zur-Verfügung-Stellens einer kontinuierlichen Überwachung im gesamten PCR-Zyklus zur Verfügung und erlaubt so das dynamische Überwachen der Fluoreszenz, während sich die Temperatur verändert. Auf diese Weise können Mutationen und Polymorphismen durch Bestimmen der Schmelztemperatur von hinzugefügten fluoreszenzmarkierten Hybridisierungssonden detektiert werden.
  • Die Faktor V-Leiden-Mutation ist eine Einzelbasenänderung (G nach A), die einen Glutaminrest für einen Argininrest bei Aminosäurerest 506 substituiert (R506Q). Für weitere Informationen siehe R.M. Bertina et al., Mutation in Blood Coagulation Factor V Associated with Resistance to Activated Protein C, 369 Nature 64–67 (1994) und J. Voorberg et al., Association of Idiopathic Venous Thromboembolism with a Single Point-Mutation at Arg506 of Factor V, 343 Lancet 1535-36 (1994). Wie hierin verwendet, bedeutet der "Faktor V-Leiden-Mutationslocus" die Nucleotidposition im Faktor V-Gen, bei welchem eine Guaninbase in dem Wildtyp durch eine Adeninbase in der Faktor V-Leiden-Mutante ersetzt ist. SEQ ID NO:7 zeigt einen Teil des Wildtyp-FaktorV-Gens und SEQ ID NO:8 zeigt den entsprechenden Teil des Faktor V-Leiden-Gens mit dem entsprechenden Nucleotid an Position 31 in jedem Fall. Die vollständige Nucleinsäuresequenz des Faktor V-Gens ist bei R.J. Jenny et al., Complete cDNA and Derived Amino Acid Sequence of Human Factor V, 84 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4846–50 (1987) beschrieben, und die Sequenzen können ebenso aus der Genbank, Locus HUMF10, erhalten werden. Die Aminosäureveränderung in dem mutierten Faktor V-Protein macht diesen Blutgerinnungsfaktor resistent gegen den Abbau und erhöht die Tendenz zum Clotting und zur Thrombose. Als der häufigste Grund für die vererbte Thrombophilie ist diese Mutation das Ziel eines gewöhnlichen Labortests, der in klinischen Molekulargenetiklaboratorien ausgeführt wird.
  • Das Standdardanalyseverfahren für die Faktor V-Leiden-Mutation ist es, das Gensegment durch PCR zu amplifizieren, die resultierenden amplifizierten Produkte mit einer Restriktionsendonuclease zu verdauen, die die Wildtypsequenz schneidet, aber nicht die Mutante, und die verdauten Wildtypprodukte und die nichtverdauten Mutantenprodukte durch Gelelektrophorese zu unterscheiden. Dies ist ein Verfahren, das im Stand der Technik für die Analyse von definierten Mutationen gut bekannt ist. Solch ein Test erfordert normalerweise etwa 4 Stunden, einschließlich der PCR-Amplifikation (2 Stunden), dem Enzymverdau (1 Stunde) und der Elektrophorese (1 Stunde). Die Schritte nach der Amplifikation beinhalten das Öffnen des Probenröhrchens, das Hinzufügen des Enzyms und das Übertragen der verdauten Probe in den Elektrophoreseapparat. Die Weiterbearbeitung nach der Amplifikation erhöht das Risiko einer Endproduktkontamination und die manuelle Handhabung erfordert Vorsicht, um das falsche Markieren von Proben zu vermeiden. Ein Verfahren, das gleichzeitig amplifiziert und nach Punktmutationen analysiert, würde diese Probleme eliminieren.
  • Ein Verfahren für die vollständige Amplifikation und Analyse der Faktor V-Leiden-Mutation innerhalb von 30 min in dem gleichen Instrument umfasst die asymmetrische Amplifikation eines Teils einer humanen genomischen DNA-Probe, enthaltend den Locus der Mutation, gefolgt durch Erhalten und Analysieren einer Schmelzkurve für die amplifizierte DNA. Genomische DNA wird gemäß Verfahren hergestellt, die im Stand der Technik gut bekannt sind, und vorzugsweise wird die Schmelzkurve durch eine Resonanzenergietransfermethodologie erhalten, wobei eine fluorogene Hybridisierungssonde verwendet wird. Solch ein Assay unterscheidet leicht zwischen dem homozygoten Wildtyp, homozygoten Mutanten und heterozygoten Genotypen. In einer Ausführungsform ist die Oligonucleotidsonde am 3'-Ende mit Fluorescein markiert und so entworfen, dass sie mit der amplifizierten DNA in der Nähe eines Cy5-markierten Primers für einen Resonanzenergietransfer hybridisiert. Dieses Verfahren kann mit jeder definierten Mutation angewendet werden.
  • Die PCR-Amplifikation wurde in 10 μl Umsetzungsmischungen ausgeführt, umfassend 50 mM Tris, pH 8,3, 8 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 200 μM von jedem dNTP, 0,5 μM Cy5-markierten Primer (SEQ ID NO:9), 0,2 μM unmarkierten gegenüberliegenden Primer (SEQ ID NO: 10), 0,1 μM fluoresceinmarkierte Sonde (SEQ ID NO:11), 0,4 U Taq-Polymerase und 50 ng humane genomische DNA. Vier unterschiedliche DNA-Proben wurden getestet: humane genomische DNA von einem Individuum, das homozygot für die Faktor V-Leiden-Mutation war; humane genomische DNA von einem heterozygoten Individuum; humane genomische DNA von einem Individuum, das homozygot für das Wildtyp-Faktor V-Allel war, und eine negative Kontrolle ohne DNA. Die Orientierung der Cy5-markierten Primer, die fluoresceinmarkierte Sonde und der Mutationsort (identifiziert durch ein Sternchen) sind hierunter gezeigt:
    Figure 00400001
  • Die Sequenz des unmarkierten gegenüberliegenden Primers war TGTTATCACACTGGTGCTAA (SEQ ID NO:10) und das amplifizierte Produkt hatte eine Länge von 186 Basenpaaren. Der Cy5-markierte Primer wurde erhalten wie in Beispiel 4 beschrieben. Die Cyclingbedingungen waren 94 °C für 0 s (Steigung j = 20), 50 °C für 10 s (Steigung = 20) und 72 °C für 0 s (Steigung = 1) für 50 Zyklen, gefolgt durch Abkühlen auf 45 °C und kontinuierliches Fluoreszenzaufzeichnen bei einer Steigung von 0,2 °C/s auf 94 °C für die Schmelzkurve. Je näher der Cy5-Marker an dem 3'-Ende des Primers liegt, desto größer ist das Resonanzenergietransfersignal. Jedoch muss das 3'-Ende eine freie 3'-Hydroxylgruppe für die Polymeraseextension haben, und das Anordnen des Cy5 zu nahe an dem 3'-Ende (entweder an dem 3' Ende oder an der vorletzten Base) könnte das Anhaften der Polymerase inhibieren und somit die Extension inhibieren. Die 3'-Fluoresceinsonde sollte so nahe wie möglich an dem Primer hybridisieren (eine geringe Überlappung von 1–3 Basen kann toleriert werden) und der Mutationsort sollte in der Nähe der Mitte der Sonde sein. Ein 5-Basenabstand zwischen den hybridisierten Fluorophoren und einer Mutation an Base 8 einer 23-mer Sonde ergab eine Schmelzkurvenveränderung von 8 °C zwischen mutierten und Wildtypsequenzen (13A und 13B).
  • Die Schmelzkurven mit der höchsten Qualität wurden am Ende der Amplifikation mit einer langsamen Temperaturübergangsgeschwindigkeit (0,2 °C/s) erhalten, siehe 13A, auch wenn das Aufzeichnen während jedes Zyklus bei 1 °C/s zwischen 50 °C und 94 °C ebenso eine klare Genotypidentifizierung zur Verfügung stellte (14). Die Schmelzkurven sind am einfachsten durch Auftragen der negativen Ableitung der Fluoreszenz bezüglich der Temperatur gegenüber der Temperatur (–dF/dT vs T) zu visualisieren, siehe 13B). Solch eine Auftragung erlaubt eine einfache visuelle Identifizierung von allen möglichen Genotypen aus den rohen Fluoreszenzdaten.
  • Es wird anerkannt werden, dass die bestimmten Sonden und Primer, die hierin für die Detektion der Faktor V-Leidenmutation offenbart sind, lediglich illustrativ sind und dass ein Durchschnittsfachmann in der Lage sein wird, andere Sonden und Primer für die Detektion von Mutationen ohne unangemessenes Herumexperimentieren durch Befolgen der Prinzipien und Richtlinien, die hierin ausgeführt, sind zu entwerfen. Auch wenn Fluorescein und Cy5 als Resonanzenergietransfermarker bei dem obigen Beispiel verwendet wurden, können andere Akzeptoren wie Cy5.5 ebenso mit Fluorescein verwendet werden.
  • Beispiel 6
  • Der Faktor V-Locus von Beispiel 5 wurde amplifiziert wie vorher, außer dass der Primer mit Cy5.5 anstelle von Cy5 markiert wurde. Die Cy5.5-Emission wurde durch einen 683 nm dichroischen Langpassfilter und durch einen 683–703 nm Bandpassinterferenzfilter beobachtet. Das Cy5.5-zu-Fluorescein-Verhältnis stieg über den Hintergrund etwa bei Zyklus 30 an und das Verhältnis verdoppelte sich etwa nach 50 Zyklen asymmetrischer Amplifikation. Bei der Amplifikation mit Wildtyp-DNA war der Sonden-Tm 65–66 °C, wie aus den Schmelzpeaks ermittelt werden konnte.
  • Beispiel 7
  • Es gibt eine gewöhnliche Punktmutation in dem Methylentetrahydrofolatreductase (MTHFR)-Gen (C677T), die ein Alanin in einen Valinrest umwandelt, was in einem thermolabilen Enzym resultiert. Diese Mutation kann die MTHFR-Aktivität reduzieren und führt zu erhöhten Homocysteinplasmaspiegeln, was als ein unabhängiger Risikofaktor für eine frühe vaskuläre Erkrankung und für Thrombose impliziert wurde, wie im Stand der Technik gut bekannt ist. Einer der Primer wurde mit Cy5 markiert (TGAAGGAGAAGGTGTCT*GCGGGA) (SEQ ID NO:12), wobei T* einen modifizierten T-Rest darstellt, der mit Cy5 verbunden ist. Die Sondensequenz war Fluorescein-CCTCGGCTAAATAGTAGTGCGTCGA (SEQ ID NO:13) und der andere Primer war AGGACGGTGCGGTGAGAGTG (SEQ ID NO:14). Ein 198-Basenpaarfragment des MTHFR-Gens wurde aus 50 ng humaner genomischer DNA in 50 mM Tris, pH 8,3, 2 mM MgCl2, 500 μg/ml Rinderserumalbumin, 0,2 mM von jedem dNTP, 0,5 μM des Cy5-markierten Primers, 0,1 μM des gegenüberliegenden Primers, 0,1 μM der fluoresceinmarkierten Sonde und 0,4 U Taq DNA-Polymerase pro 10 μl amplifiziert. Jeder Zyklus war 30 s lang und bestand aus einer Denaturierung bei 94 °C, gefolgt durch einen 20 s-Schritt bei 60 °C für den kombinierten Annealing/Extensions-Schritt. Die Temperaturübergangsgeschwindigkeit zwischen den Schritten betrug 20 °C/s. Nach 60 Zyklen wurde eine Schmelzkurve wie folgt erhalten: Erhitzen von 50–65 °C bei 0,5 °C/s, von 65–75 °C bei 0,1 °C/s und von 75–94 °C bei 0,5 °C/s. Nach der Basisliniensubstraktion und der Umwandlung zu Schmelzpeaks waren alle möglichen Genotypen leicht zu unterscheiden (15).
  • Beispiel 8
  • Multiplexanalyse des Hämochromatosegens
  • Proben
  • Genomische DNA von kaukasischen Individuen wurde über eine 10-jährige Periode zum Studieren der Hämochromatosestammbäume in Utah und in den benachbarten Staaten gesammelt. Die Sammelverfahren wurden durch das institutionale Kontrollgremium der University of Utah positiv beurteilt. Zwei klinisch definierte Subjektgruppen bestehend aus 117 Patienten und 56 Kontrollen wurden aus 250 genotypisierten Proben ausgewählt, um die Verbreitung der C282Y und der H63D Mutation in dem HFE-Gen zu bestimmen. Familienbasierte Kontrollen hatten entweder in einen Stammbaum eingeheiratet oder hatten keine HLA-Identität mit dem Probanden. Genotypisierte Patienten mit zweifelhaften klinischen Geschichten wurden aus der Subjektgruppe ausgeschlossen. Die Patienten wurden durch einen Labornachweis einer Eisenüberlastung ausgewählt (Transferrinabsättigung > 55% und Serumferritin > 600 μg/Liter) und die Leberbiopsien wurden bei den meisten dieser Patienten ausgeführt, um den Grad der Lebersiderose zu bestimmen. Alle Kontrollen hatten normale Werte für Serumseritin und für prozentige Transferrinabsättigung.
  • Genotypisieren
  • Alle Proben wurden an den C282Y und H63D Orten mit benachbarten Fluoreszenzhybridisierungssonden genotypisiert. Das Genotypisieren wurde gleichzeitig an beiden Orten simultan durch Multiplexen mit 70 Proben ausgeführt. Die Reagenzkonzentrationen für das Multiplexen und für die Einzelortanalyse waren diesselben. Jedoch enthielten die Multiplexreaktionen 2 Primersets und 2 fluoreszenzmarkierte Sondensets. Jede 10 μL Reaktion enthielt 50 mM Tris, pH 8,3 (25 °C), 500 μg/ml bovines Serum Albumin, 0,2 mM von jedem Deoxyribonucleositriphosphat, 4 mM MgCl2, 0,5 μM jedes Primers, 0,1 μM ortsspezifische 3'-fluoresceinmarkierte Sonde, 0,2 μM ortsspezifische 5'-Cy5-markierte Sonde, 50 ng genomische DNA und 0,4 U native Taq DNA Polymerase. Die Proben wurden in separate Plastik-/Glaskompositküvetten eingeführt, zentrifugiert und gecappt. Für die homogene PCR und für die Schmelzkurvenaufnahme wurde ein schneller Fluoreszenzthermalcycler mit 24 Proben verwendet (LightCycler LC24, Idaho Technology, Idaho Falls, ID).
  • Vierzig Wiederholungen eines 2-Temperaturenzyklus wurden ausgeführt (94 °C für 0 s und 62 °C für 20 s mit programmierten Übergängen von 20 °/s). Die Fluoreszenz wurde einmal für jeden Zyklus für 50 msec pro Probe am Ende des kombinierten Annealing/Extensionsschrittes bestimmt. Ein anghängter analytischer Zyklus nach der Amplifikation erlaubte das augenblickliche Genotypisieren durch abgeleitete Schmelzkurven. Das Genotypisierungsprotokoll beinhaltete die Denaturierung bei 94 °C bei 20 s; das Annealing für 20 s, jeweils bei 65 °C, 55 °C und 45 °C (C282Y, S65C und Multiplexing) oder 75 °C, 65 °C und 55 °C (H63D) und einen Schmelzübergang auf 75 °C mit hoher Auflösung bei einer Geschwindigkeit von 0,1 °C/s. Cy5 (655–695 nm) und die Fluorescein (520–560 nm) – Fluoreszenz wurden für 50 msec pro Probe bei jedem 0,1 °C Temperaturinkrement aufgezeichnet.
  • Die während der Schmelzphase gesammelten Daten wurden verwendet, um jede Probe zu genotypisieren. Die Schmelzkurven wurden durch Auftragen der Cy5 Fluoreszenz (F) gegenüber der Temperatur (t) generiert. Leicht unterscheidbare Schmelzpeaks wurden durch Auftragen der gleichen Daten als –dF/dT gegenüber der Temperatur erhalten.
  • Das auf dem LightCyclerTM ausgeführte Genotypisieren (Idaho Technology, Idaho Falls, ID) wurde mit einer konventionellen PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse verglichen. Die PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse wurde mit allen Proben für die C282Y-Mutation und mit 40 zufälligen Proben für die H63D-Mutation ausgeführt. Die Amplifikation für das PCR-Restriktionsfragmentlängenverfahren wurde in einem luftbasierendem Thermozykler (RapidCyclerTM, Idaho Technology, Idaho Falls, ID) unter Verwendung derselben Primer, MgCl2 Konzentration und Temperaturparameter ausgeführt, wie diejenigen, die mit dem LightCyclerTM verwendt wurden. Die Sonden wurden für die PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse nicht hinzugefügt. Die Proben wurden bei C282Y oder H63D durch Hinzufügen von 1 μL von entweder SnaB1 (4 U/μl, New England Biolabs, Beverly, MA) oder Bcl 1 (10 U/μgl, New England Biolabs), zu 1 μL des empfohlenen Verdaupuffers und 8 μL Amplikon restriktionsverdaut. Die Proben wurden 2 Stunden bei entweder 37 °C (SnaB1) oder 50 °C (Bcl 1) inkubiert, und die Produkte wurden durch Ethidiumbromidfärben nach der Trennung auf einem 1,5%igen Agarosegel bei 5V/cm für 60 min sichtbar gemacht.
  • Sequenzieren
  • Vier Proben wurden zur Identifikation des A193T-Polymorphismus sequenziert. Die PCR-Produkte wurden (Model 377, Perkin-Elmver, Foster, CA) aus TOPO TA Plasmidvektoren (TOPO TA Cloning®, Invitrogen, CA) sequenziert.
  • Primer-/Sondensynthese
  • Primer für das C282Y-Codon und das H63D-Codon wurden durch Standardphosphoramiditchemie (Pharmacia Biotech Gene Assembler Plus, Piscataway, NJ) synthetisiert. Die 3'-fluoresceinmarkierten Sonden wurden auf fluoresceinkontrollierten Porenglaskassetten (BioGenics, San Ramon, CA) synthetisiert. Eine 5'-Tritylgruppe wurde auf den fluoresceinmarkierten Sonden zur Aufreinigung der Gesamtlängensequenzen beibehalten. Eine Detritylierung wurde auf einer Polypacksäule ausgeführt (Glen Research, Sterling, VA) und das markierte Oligo eluierte mit 50% Azetonitril. Die 5'-Cy5 Sonden wurden unter Verwendung eines Cy5-Phosphoramidits (Pharmacia Biotech) und eines chemischen Phosphorylierungsmittels (Glen Research) synthetisiert, um eine Extension von dem 3'-Ende der Sonde zu vermeiden.
  • Die Reinheit der Sondensynthese wurde durch Errechnen des Verhältnisses der Fluorophorkonzentration zur Oligonucleotidkonzentration bestimmt. Sonden mit Verhältnissen außerhalb von 0,8–1,2 wurden weiter durch Umkehrphasen-C18-Hochdruckflüssigchromatographie aufgereinigt. Die markierten Oligonucleotide wurden durch eine 4 × 250-mm Hypersil ODS Säule (Hewlett Packard, Fullerton, CA) unter Verwendung von 0,1 M Triethylammoniumacetat, pH 7,0 und einem 20–60% (Fluoresceinsonde) oder 40–80% (Cy5 Sonde) Azetonitril (1 ml/min) – Gradienten hindurchgeführt. Das Eluat wurde durch Tandemabsorption und Fluoreszenzdetektoren überwacht (Waters 486 und 474, Milford, MA). Fraktionen mit sowohl einem A260 Peak als auch mit einem Fluoreszenzpeak wurden gesammelt.
  • Primer-/Sondendesign
  • Die HFE cDNA Sequenz wurde zur Selektion von Primern und Sonden verwendet (Genbankzugang M31944). Die Primer und Sonden wurden ausgewählt unter Verwendung des Primerdesigners für WindowsTM (Scientific and Educational Software, State Line, PA, USA). Primer für beide Mutationsorte wurden mit ähnlichen Tms und ähnlichem GC Gehalt ausgewählt, um das Multiplexen zu erlauben. Die längeren 5'-Cy5 markierten Sonden wurden mit einem mindestens 15 °C höherem Tm entworfen als die 3'fluoresceinmarkierten Sonden, die den Zielbereich für die Mutationsdetektion überspannen. Auf diese Weise agiert eine Cy5-markierte Sonde als ein "Anker" und verbleibt in einem annealten Zustand an dem einzelsträngigen Amplikon, während die fluoreszinmarkierte Sonde über den charakteristischen Tm für das Allel erhitzt wird. Die fluoreszinmarkierten Sonden wurden so entworfen, daß sie Tms haben, die eine Differenzierung von allen 4 Allelen durch Schmelzpeakanalyse erlauben würden. Die Primer- und die Sondensequenzen sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Primer- und Sondensequenzen, die für das Genotypisieren des HFE-Gens verwendet werden
    Figure 00460001
    • * Nucleotidbasen, die an der Fehlpaarbildung teilnehmen, sind unterstrichen.
    • ** P zeigt die Hinzufügung einer Phosphatgruppe an.
  • Die empirischen Schmelztemperaturen für die 3'-Fluorenzenzsonde/Allelduplexe sind in Tabelle 2 gezeigt.
  • Tabelle 2. Empirische Schmelztemperaturen für die Fluoreszenzsonde/Allelduplexe
    Figure 00460002
  • Resultate
  • Genotypisieren mit aneinander angrenzenden Fluoreszenzhybridisierungssonden
  • Eine schematische Darstellung der aneinander angrenzenden Fluoreszenzhybridierungssonden, die für das Genotypisieren des HFE-Locus verwendet wurden, ist in 16 gezeigt. Die 3'-fluoresceinmarkierten Sonden, die die C282Y- und H63D-Orte überspannen, waren 21 und 27 Basenpaare lang. Diese Sonden wurden so entworfen, daß während der Hybridisierung jede Sonde eine Fehlpaarung mit dem Wildtyp-Allel bilden würde, das durch den Downstreamprimer ausgedehnt wird.
  • Tabelle 1 zeigt die Positionen der potentiellen Sondenfehlpaarungen.
  • Die Amplifikation und das Genotypisieren des C282Y-Orts ist in 17 illustriert.
  • Die 21-mer Fluoresceinsonde bildete eine A:C Fehlpaarung mit der Wildtypsequenz, was den Tm der Sonde um 7 °C verglichen mit dem vollständig komplimentären Duplex absenkte. Das Wildtyp-Allel zeigte keinen Anstieg der Fluoreszenz gegenüber dem Hintergrund während der Amplifizierung, da die Annealingtemperatur des A:C fehlgepaarten Duplexes unterhalb der Temperatur lag, bei welcher die Fluoreszenz für jeden Zyklus aufgenommen wurde.
  • Die Amplifikation und die Genotypanalyse für den H63D-Ort ist in 18 gezeigt. Die G:G Fehlpaarung bildete sich im Zentrum der 27-mer Fluorescinsonde, was einen ΔTm von 5,5 °C verursachte, verglichen mit dem vollständig Watson-Crick gepaarten Duplex. Während der Amplifizierung wurden sowohl das Wildtyp-Allel auch das Allel mit der H63D-Mutation an die Sonde bei der Fluoreszenzaufnahmetemperatur von 62 °C annealt.
  • Das Genotypisieren der meisten Proben für die H63D-Mutation wurde mit einem Schmelzprotokoll ausgeführt, das bei 55 °C begann, um die Schmelzübergänge bei 63 °C und bei 68,5 °C zu beobachten. Jedoch wurden 50 Proben hinsichtlich der H63C-Mutation mit Schmelzkurven untersucht, die 10 °C niedriger bei 45 °C begannen. Unter Verwendung dieses Schmelzprotokolls wurden 4 Proben identifiziert, die einen Schmelzpeak bei 58,5 °C hatten, 4,5 °C niedriger als der Schmelzpeak für das Wildtyp-Allel. Das Sequenzieren aller 4 Proben ergab einen A nach T Übergang bei Nucleotid 193 des offenen Leserahmens. Dieser Übergang ist ein Polymorphismus, von dem kürzlich berichtetet wurde, der in einer Serin nach Cystein Aminosäuresubstitution bei Codon 65 resultiert (S65C). Der S65C-Polymorphismus kreiert eine A:A Fehlpaarung, angeordnet 8 Basenpaare nach dem 3'-Ende der 27-mer Sonde (sh. 16 und Tabelle 1). Wenn die Sonde mit einem Allel hybridisiert, das einen Wildtyp an dem H63D-Ort aufweist, aber das den S65C-Polymorphismus enthält, so sind zwei Fehlpaarungen vorhanden. Dies destabilisiert die Sonde um 10 °C verglichen mit dem vollständig komplementären Duplex. Proben, die an den C282Y-, H63D- und S65C-Orten heterozygot waren, sind in 19 gezeigt.
  • Vergleich der Genotypisierungsverfahren
  • Alle Fälle, die durch benachbarte Fluoreszenzhybridisierungssonden genotypisiert wurden, stimmten mit der PCR-Restriktionsfragmentlängenanalyse überein. Primer, die für die Analyse des C282Y-Ortes verwendet wurden, produzierten ein 289-Basenpaaramplikon, das durch SnaB1 in Fragmente mit einer Länge von 276 und 130 Basenpaaren in der Gegenwart der C282Y-Mutation gespalten wurde. Das PCR-Produkt für den H63D-Ort war 241 Basenpaare lang. Die H63D-Mutation zerstörte einen Bcl1 Restriktionsort, der nach einem Restriktionsverdau des Wildtyp-Allels Fragmente mit einer Länge von 138 und 103 Basenpaaren ergab. Die Laufzeit allein, die für die PCR- und für die Genotypisierungsanalyse durch Restriktionsverdau und durch Gelelektrophorese erforderlich war, betrug ungefähr 3 Stunden und 30 Minuten.
  • Vergleichsweise war das Genotypisieren mit benachbarten Fluoreszenzhybridierungssonden schneller und einfacher. Die Amplifikation und die Analyse von 24 Proben unabhängig an beiden Orten erforderte 45 Minuten. Keine manuelle Manipulation war zwischen der Amplifikation und dem Genotypisieren erforderlich. Die Analyse durch Multiplexing erlaubte es, dass doppelt soviel Proben an beiden Genorten in der gleichen Zeit genotypisiert werden konnten. Die Genotypanalyse durch Multiplexing mit benachbarten Fluoreszenzhybridisierungssonden ist in 20 gezeigt.
  • Studie der C282Y und H63D Mutationen
  • Einhundertsiebzehn Patienten, die den klinischen Kritierien für eine Eisenübersättigung entsprachen und 56 normale Kontrollen wurden für die Analyse der C282Y- und H63D-Mutationen in dem HFE Gen ausgewählt. Beide Gruppen waren kaukasische Amerikaner aus Utah und aus Nachbarstaaten. Die Resultate dieser Studie sind in Tabelle 3 zusammengefaßt. Tabelle 3. Analyse von C282Y- und H63D-Mutationen innerhalb der Population von Utah
    Figure 00490001
    • * hh bezeichnet Homozygotie für die Mutation.
    • Hh bezeichnet Heterozygotie
    • HH bezeichnet den homozygoten Wildtyp
  • Achtundneunzig (83,8%) der Patienten und keine der Kontrollen waren hinsichtlich der C282Y-Mutation homozygot. Die 282Y-Mutation wurde in 87% der Patientenchromosomen und in 6,3% der Chromosomen von normalen Kontrollen gefunden. Die H63D-Mutation wurde in 11 % der Kontrollchromosomen und nur in 4,3% der Patientenchromosomen gefunden. Es gab 8 Patienten und 7 normale Kontrollen, die für die C282Y-Mutation heterozygot waren. Eine Hälfte der C282Y-heterozygoten Patienten trug die H63D-Mutation, wohingegen es keine heterozygoten Genotypen unter den Kontrollen gab.
  • Der S65C-Polymorphismus wurde in 4 von 50 Proben gefunden. Drei dieser Proben kamen aus der normalen Kontrollgruppe. Die allelische Häufigkeit für die S65C-Variante betrug 5,5% unter den Kontrollchromosomen und 2,8% unter den Patientenchromosomen.
  • Die Multiplextechnologie verhilft somit sowohl der Forschung als auch der routinemäßigen Diagnostik weiterhin zum Fortschritt. Die empfindlichen Verfahren der Multiplexanalyse kombiniert mit verbesserten Verfahren der DNA Präparation erhöht die Informationsdichte, die aus kleinen Mengen Gesamtblut erhalten wird. Dies reduziert die Kosten und die Invasivität der Probensammlung und ist nützlich bei der Analyse von seltenen Proben. Das Screenen von Bevölkerungen für eine präsymptomatische Diagnose von vererbter Hämochromatose durch DNA Analyse wurde seit dem ersten Bericht über das Hämochromatosegen vorgeschlagen. Ab November 1997 hat die American Medical Association sich entschlossen, Richtlinien zum Screenen für diese genetische Erkrankung zu etablieren. Nimmt man an, daß das DANN-Testen invariant ist, und daß es eine diverse Etiologie für erhöhte Bluteisenspiegel gibt, erscheint es vernünftig, daß genetisches Testen in die Algorithmen für die Diagnose zur Hämochromatose miteinbezogen werden sollten. Solche diagnostischen Test im großen Maßstab werden durch Multiplexing zeiteffizienter und kosteneffektiver werden.
  • Hybridisierungssonden können verwendet werden, um in Echtzeit zu genotpyisieren, wie durch die Amplilfikation des C282Y-Orts gezeigt. Wenn die Fluoreszenz über dem Tm für den fehlgepaarten Sonden-/Allelduplex aufgenommen wird, zeigt nur das Allel, das vollständig komplementär zu der Sonde ist, eine Veränderung in der Fluoreszenz während der Amplifikation. Heterozygoten ergeben die Hälfte der maximalen Fluoreszenz verglichen mit der homogzygoten perfekten Übereinstimmung.
  • Vorteilhafterweise sind mehrere Farben für das homogene Genotypisieren mit Schmelzkurven nicht erforderlich, da mehrere Allele mit einer einzelnen Sonde unterschieden werden können. Darüber hinaus beugen Schmelzkurven falschen negativen Resultaten vor, da alle Allele präsentiert und gleichermaßen durch Inhibitoren innerhalb der Umsetzung beeinflußt werden.
  • Das Multiplexen mit Fluoreszenzhybridierungssonden stellt eine schnelle und empfindliche Analyse von mehreren Allelen zur Verfügung. Die Amplifikation und das Genotypisieren der HFE-Genmutationen wurde in ungefähr 45 min ausgeführt. Der HFE-Assay, der hier demonstriert wurde, zeigte vier unterschiedliche Allele, die innerhalb einem Temperaturbereich von 15 °C differenziert waren.
  • Benachbarte Fluoreszenzhybridierungssonden sind vielseitig verwendbar und für das Multiplexing brauchbar. Die C282Y- und H63D-Mutationsorte wurden mit unterschiedlichen Primersets coamplifiziert und gleichzeitig durch die Schmelztemperaturen der gemultiplexten Fluoeszenzsonden genotypisiert. Darüber hinaus konnte die Sonde, die die C187G (H63D)-Mutation überspannte, ebenso verwendet werden, um den A193T (S65C)-Polymorphismus zu genotypisieren, nachdem die Variante durch eine abweichende Schmelzkurve detektiert wurde und durch Sequenzieren bestätigt wurde. Die Identifizierung dieses Polymorphismus demonstriert das Genotypisieren von mehreren Allelen durch eine einzelne Sonde und suggeriert ein Potential für Fluoreszenzhybridisierungssonden beim Scannen nach unbekannten Varianten.
  • Zusammenfassung
  • Aus der vorangegangenen Diskussion wird anerkannt werden, daß das kontinuierliche Fluoreszenzüberwachen während der DNA Amplifizierung, um die Hybridisierung zu überwachen, ein außerordentlich mächtiges analytisches Verfahren ist, das verwendet werden kann, um gleichzeitig Mutationen an unterschiedlichen Loci zu detektieren. Unter Verwendung der Verfahren, die hierin beschrieben sind, und abhängig von der Anzahl der Kopien des initialen Templates, die vorhanden sind, kann das Screenen für eine bestimmte bekannte Mutation oder einen bestimmten bekannten Polymorphismus in fünf bis zu zwanzig Minuten erreicht werden, mehr bevorzugt zehn bis vierzig Minuten nachdem das Temperaturcycling begonnen hat.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00520001
  • Figure 00530001
  • Figure 00540001
  • Figure 00550001
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • Figure 00580001

Claims (10)

  1. Verfahren zum Analysieren einer eine Nukleinsäuresequenz umfassenden biologischen Probe auf das Vorhandensein von Mutationen oder Polymorphismen an multiplen Loci der Nukleinsäuresequenz, wobei das Verfahren in einem einzigen Reaktionsgefäß durchgeführt wird und die Schritte umfasst: (a) Vereinigen der biologischen Probe mit einer ersten Donor-Oligonukleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonukleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonukleotidsonde, einer zweiten Akzeptor-Oligonukleotidsonde und PCR-Primern, wobei die erste und zweite Donor-Oligonukleotidsonde jeweils mit einem gleichen Donorfluorophor markiert sind und die erste und zweite Akzeptor-Oligonukleotidsonde jeweils mit einem gleichen Akzeptortluorophor markiert sind; (b) Hinzugeben einer thermostabilen Polymerase und Amplifizieren der Nukleinsäuresequenz durch Polymerasekettenreaktion zur Bildung ein oder mehrerer Amplifikationsprodukte; wobei die erste und zweite Donor-Oligonukleotidsonde und die erste und zweite Akzeptor-Oligonukleotidsonde so an die Amplifikationsprodukte hybridisieren, dass eine Hybridisierung der ersten Donor-Oligonukleotidsonde und der ersten Akzeptor-Oligonukleotidsonde an einen ersten Locus eines ersten Amplifikationsprodukts die erste Donor-Oligonukleotidsonde mit der ersten Akzeptor-Oligonukleotidsonde in Wechselbeziehung für einen Resonanzenergietransfer bringt, und die Hybridisierung der zweiten Donor-Oligonukleotidsonde und der zweiten Akzeptor-Oligonukleotidsonde an einen zweiten Locus des ersten oder eines zweiten Amplifikationsprodukts die zweite Donor-Oligonukleotidsonde mit der zweiten Akzeptor-Oligonukleotidsonde in Wechselbeziehung für einen Resonanzenergietransfer bringt; und (c) Beleuchten der biologischen Probe und Monitoring der Fluoreszenz der Oligonukleotidsonden als Funktion der Temperatur.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste und zweite Locus mit dem ersten Paar PCR-Primer amplifiziert werden.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der erste Locus mit dem ersten Paar PCR-Primer und der zweite Locus mit einem zweiten Paar PCR-Primer amplifiziert wird.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Donor-Sonde und die erste Akzeptor-Sonde so ausgelegt sind, dass sich mehr als eine Mutation oder mehr als ein Polymorphismus auf dem ersten Locus nachweisen lässt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt des Bestimmens der Temperatur für das Maximum von –dF/dT für die erste Akzeptor-Oligonukleotidsonde und anschließend des Bestimmens der Temperatur für das Maximum von –dF/dT für die zweite Akzeptor-Oligonukleotidsonde.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fluoreszenz der Oligonukleotidsonden als Funktion der Zeit während der Polymerasekettenreaktion bestimmt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste und zweite Donor-Oligonukleotidsonde mit Fluoreszein markiert sind und die erste und zweite Akzeptor-Oligonukleotidsonde mit Cy5 markiert sind.
  8. Kit zum Analysieren einer eine Nukleinsäuresequenz umfassenden biologischen Probe auf das Vorhandensein von Mutationen oder Polymorphismen an multiplen Loci der Nukleinsäuresequenz, wobei der Kit umfasst: (a) eine Mischung aus einer ersten Donor-Oligonukleotidsonde, einer ersten Akzeptor-Oligonukleotidsonde, einer zweiten Donor-Oligonukleotidsonde und einer zweiten Akzeptor-Oligonukleotidsonde, wobei die erste und zweite Donor-Oligonukleotidsonde jeweils mit einem gleichen Donorfluorophor markiert sind und das erste und zweite Akzeptor-Oligonukleotid jeweils mit einem gleichen Akzeptorfluorophor markiert sind, wobei die erste Donor-Oligonukleotidsonde und die erste Akzeptor-Oligonukleotidsonde so aufgebaut sind, dass sie an nebeneinanderliegende Regionen eines ersten Locus der Nukleinsäuresequenz hybridisieren, und die zweite Donor-Oligonukleotidsonde und die zweite Akzeptor-Oligonukleotidsonde so aufgebaut sind, dass sie an nebeneinanderliegende Regionen eines zweiten Locus der Nukleinsäuresequenz hybridisieren, so dass sich die Schmelztemperatur der Kombination aus erster Donor-Oligonukleotidsonde und erster Akzeptor-Oligonukleotidsonde von der Schmelztemperatur der Kombination aus zweiter Donor-Oligonukleotidsonde und zweiter Akzeptor-Oligonukleotidsonde unterscheidet; (b) ein erstes Paar Oligonukleotidprimer, das zur Amplifikation eines Segments der Nukleinsäuresequenz, das den ersten Locus enthält, ausgelegt ist; und (c) eine thermostabile DNA-Polymerase, wobei die Sonden, die Primer und die Polymerase zur Verwendung in einem einzigen Reaktionsgefäß bereitgestellt werden.
  9. Kit nach Anspruch 8, wobei das erste Paar Oligonukleotidprimer auch zur Amplifikation eines Segments der Nukleinsäuresequenz ausgelegt ist, das den zweiten Locus enthält.
  10. Kit nach Anspruch 8, ferner umfassend ein zweites Paar Oligonukleotidprimer, wobei das zweite Paar Oligonukleotidprimer zur Amplifikation eines Segments der Nukleinsäuresequenz ausgelegt ist, das den zweiten Locus enthält.
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Families Citing this family (177)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
US7068830B2 (en) * 1997-07-25 2006-06-27 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
ATE264523T1 (de) * 1997-07-25 2004-04-15 Affymetrix Inc A Delaware Corp Verfahren zur herstellung einer bio-informatik- datenbank
GB9803382D0 (en) * 1998-02-19 1998-04-15 Secr Defence Detection system
US6369893B1 (en) 1998-05-19 2002-04-09 Cepheid Multi-channel optical detection system
US6185561B1 (en) 1998-09-17 2001-02-06 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for providing and expression data mining database
US20040199544A1 (en) * 2000-11-02 2004-10-07 Affymetrix, Inc. Method and apparatus for providing an expression data mining database
EP1046717B1 (de) * 1999-04-20 2010-10-06 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Verfahren und Sonden zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäure-Molekülen und Verfahren zur Analyse der gewonnenen Daten
US6331393B1 (en) 1999-05-14 2001-12-18 University Of Southern California Process for high-throughput DNA methylation analysis
US6472156B1 (en) * 1999-08-30 2002-10-29 The University Of Utah Homogeneous multiplex hybridization analysis by color and Tm
AU2001234608A1 (en) * 2000-01-28 2001-08-07 Genetrace Systems, Inc. Methods for analysis of gene expression
CA2403556A1 (en) * 2000-03-17 2001-09-27 Althea Technologies, Inc. A systematic approach to the analysis of gene function
JP2004507226A (ja) * 2000-05-30 2004-03-11 ピーイー　コーポレイション　（エヌワイ） ライゲーションおよび増幅の組み合わせを用いて標的核酸を検出するための方法
WO2002008414A1 (fr) * 2000-06-27 2002-01-31 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Nouvelles sondes d'acides nucléiques et procédés d'essai d'acide nucléique par utilisation des mêmes
GB0021286D0 (en) * 2000-08-30 2000-10-18 Gemini Genomics Ab Identification of drug metabolic capacity
US6849407B2 (en) * 2000-08-31 2005-02-01 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of varicella-zoster virus
EP1197565A1 (de) * 2000-10-12 2002-04-17 Roche Diagnostics GmbH Neue Punktmutation im 3' Bereich des Prothrombingens, das mit gesteigerter Thrombosegefahr assoziiert ist
JP3844996B2 (ja) * 2000-11-15 2006-11-15 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 反復性ｐｃｒ産物の融解曲線解析方法
EP1207210B1 (de) * 2000-11-15 2005-10-12 Roche Diagnostics GmbH Verfahren zur Analyse von Wiederkehrenden PCR-Podukten, das auf der Analyse von DNS-Schmelzkurven basiert
US8900811B2 (en) 2000-11-16 2014-12-02 Caliper Life Sciences, Inc. Method and apparatus for generating thermal melting curves in a microfluidic device
WO2002061390A2 (en) * 2001-01-31 2002-08-08 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of herpes simplex virus
US20020168641A1 (en) * 2001-03-09 2002-11-14 Bruce Mortensen Fluorescein-cyanine 5 as a fluorescence resonance energy transfer pair
US20020197630A1 (en) * 2001-04-12 2002-12-26 Knapp Michael R. Systems and methods for high throughput genetic analysis
WO2002095057A2 (en) * 2001-05-24 2002-11-28 Genospectra, Inc. Pairs of nucleic acid probes with interactive signaling moieties and nucleic acid probes with enhanced hybridization efficiency and specificity
WO2003002959A1 (en) * 2001-06-15 2003-01-09 Mj Research, Inc. Controller for a fluorometer
US6979541B1 (en) 2001-07-26 2005-12-27 University Of Utah Research Foundation Methods for identifying chromosomal aneuploidy
WO2003018837A2 (de) * 2001-08-24 2003-03-06 Adnagen Ag Verfahren und diagnosekit zur molekularen diagnostik pharmakologisch relevanter gene
US6593091B2 (en) 2001-09-24 2003-07-15 Beckman Coulter, Inc. Oligonucleotide probes for detecting nucleic acids through changes in flourescence resonance energy transfer
EP1308524B1 (de) * 2001-11-02 2006-05-31 Roche Diagnostics GmbH Nachweis von Variola Virus
EP1992706B1 (de) * 2002-02-21 2014-11-19 Alere San Diego, Inc. Rekombinase-Polymerase-Verstärkung
US8030000B2 (en) 2002-02-21 2011-10-04 Alere San Diego, Inc. Recombinase polymerase amplification
US7399590B2 (en) 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
AU2003217774A1 (en) * 2002-02-28 2003-09-16 Georgetown University Method and composition for detection and treatment of breast cancer
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
DE10215238C1 (de) * 2002-04-06 2003-08-14 Cytonet Gmbh & Co Kg Nachweis von Mykobakterien in klinischem Material
WO2003093502A2 (de) * 2002-04-30 2003-11-13 Gnothis Holding Sa Multiplex-nachweis von nukleinsäure-polymorphismen
US7442506B2 (en) 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7785776B2 (en) 2002-05-13 2010-08-31 Idaho Technology, Inc. Genotyping by amplicon melting curve analysis
US20030215814A1 (en) * 2002-05-17 2003-11-20 Cockerill Franklin R. Detection of Shiga toxin- or Shiga-like toxin-producing organisms
US20060234228A1 (en) * 2002-05-21 2006-10-19 Joji Oshima Method of identifying nucleic acid
US20030219754A1 (en) * 2002-05-23 2003-11-27 Oleksy Jerome E. Fluorescence polarization detection of nucleic acids
US20030220844A1 (en) * 2002-05-24 2003-11-27 Marnellos Georgios E. Method and system for purchasing genetic data
JP4457001B2 (ja) * 2002-05-31 2010-04-28 セクレタリー・デパートメント・オブ・アトミック・エナジー ドナー／アクセプター部分が相補鎖上となる標的核酸検出のｍｅｔ／ｆｒｅｔに基づく方法
WO2004001307A1 (ja) * 2002-06-21 2003-12-31 Hinode Co,. Ltd. 傘のしずく取り装置及びこの装置の設置促進システム
JP2004024035A (ja) * 2002-06-21 2004-01-29 Tosoh Corp 核酸の検出方法
EP1389638A1 (de) * 2002-08-06 2004-02-18 Roche Diagnostics GmbH Verbesserte Proben für FRET
US7074598B2 (en) * 2002-09-25 2006-07-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of vancomycin-resistant enterococcus spp.
US20040235005A1 (en) * 2002-10-23 2004-11-25 Ernest Friedlander Methods and composition for detecting targets
CN1720333A (zh) * 2002-11-01 2006-01-11 美格贝斯科研制品公司 Dna高速扩增的气体喷射式方法及装置
ES2306900T3 (es) * 2002-11-07 2008-11-16 Erasmus Universiteit Rotterdam Sondas fret y metodos para detectar moleculas de interaccion.
EP2112229A3 (de) 2002-11-25 2009-12-02 Sequenom, Inc. Verfahren zum Identifizieren des Brustkrebsrisikos und zugehörige Behandlungen
JP2006508662A (ja) 2002-12-04 2006-03-16 アプレラ コーポレイション ポリヌクレオチドの多重増幅
US20040152118A1 (en) * 2003-01-29 2004-08-05 Van Atta Reuel B. Methods and compositions for detecting nucleic acid sequences
GB0303497D0 (en) * 2003-02-15 2003-03-19 Univ Liverpool Immuno PCR method
CA2516299A1 (en) * 2003-02-18 2004-09-02 Applera Corporation Compositions and methods for multiplex analysis of polynucleotides
US20060192960A1 (en) * 2003-03-24 2006-08-31 Rencs Erik V Polarization detection
US8137616B2 (en) 2003-04-04 2012-03-20 Roche Molecular Systems, Inc. System for multi color real time PCR
JP4336877B2 (ja) * 2003-04-18 2009-09-30 アークレイ株式会社 β３アドレナリン受容体変異遺伝子の検出法ならびにそのための核酸プローブおよびキット
US7148043B2 (en) * 2003-05-08 2006-12-12 Bio-Rad Laboratories, Inc. Systems and methods for fluorescence detection with a movable detection module
US20040229211A1 (en) * 2003-05-13 2004-11-18 Yeung Wah Hin Alex Sensitive diagnostic testing methodology using multiplex real time PCR with one dye (MOD) and its use as in severe acute respiratory syndrome (SARS)
US20050239089A1 (en) * 2003-06-06 2005-10-27 Johnson Martin D Mobility cassettes
JP4571786B2 (ja) * 2003-06-10 2010-10-27 則夫 清水 標的核酸の検出法
EP1493822A1 (de) * 2003-07-02 2005-01-05 Labor Becker, Olgemoeller & Kollegen GbR Detektionsverfahren für Nucleinsäuren mit interner Amplifikationskontrolle
US20060024690A1 (en) * 2003-09-19 2006-02-02 Kao H P Normalization of data using controls
US20050112634A1 (en) * 2003-09-19 2005-05-26 Woudenberg Timothy M. High density sequence detection methods and apparatus
US7427475B2 (en) * 2003-11-18 2008-09-23 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of group B streptococcus
WO2005077125A2 (en) * 2004-02-11 2005-08-25 Applera Corporation Methods and compositions for detecting nucleic acids
FR2866349B1 (fr) * 2004-02-12 2008-05-16 Biomerieux Sa Procede de diagnostic/pronostic d'une thrombose
WO2005089524A2 (en) * 2004-03-19 2005-09-29 U.S. Genomics, Inc. Compositions and methods for detection of single molecules
US7473529B1 (en) * 2004-03-31 2009-01-06 Iowa State University Research Foundation, Inc. System and method for detecting cells or components thereof
WO2005113741A1 (en) * 2004-05-12 2005-12-01 Board Of Regents Of University Of Nebraska Vortex tube thermocycler
US20050255485A1 (en) * 2004-05-14 2005-11-17 Livak Kenneth J Detection of gene duplications
EP2290074B1 (de) 2004-05-28 2014-12-17 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen mit MicroRNA
US20060003337A1 (en) * 2004-06-30 2006-01-05 John Brandis Detection of small RNAS
CA2574610A1 (en) * 2004-07-22 2006-03-02 Sequenom, Inc. Methods for identifying risk of type ii diabetes and treatments thereof
WO2006026807A1 (en) 2004-09-07 2006-03-16 Telethon Institute For Child Health Research Agents for treatment or prevention of an allergic disorder
CA2584569C (en) * 2004-10-18 2014-09-30 Brandeis University Primers, probes and methods for nucleic acid amplification
US20060194222A1 (en) * 2004-10-20 2006-08-31 Stratagene California Triplex probe compositions and methods for polynucleotide detection
EP2287303B1 (de) 2004-11-12 2014-07-02 Asuragen, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen, die miRNAs und miRNA-inhibitorischen Molekülen verbunden sind
US20060188871A1 (en) * 2005-02-24 2006-08-24 Jackwood Daral J Detection of very virulent infectious bursal disease virus
WO2006095941A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
WO2006095981A1 (en) 2005-03-05 2006-09-14 Seegene, Inc. Processes using dual specificity oligonucleotide and dual specificity oligonucleotide
US7964413B2 (en) 2005-03-10 2011-06-21 Gen-Probe Incorporated Method for continuous mode processing of multiple reaction receptacles in a real-time amplification assay
US20070072211A1 (en) * 2005-06-30 2007-03-29 Roche Molecular Systems, Inc. Asymmetric PCR coupled with post-PCR characterization for the identification of nucleic acids
WO2007096702A2 (en) 2005-07-25 2007-08-30 Asm Scientific, Inc. Methods for multiplexing recombinase polymerase amplification
US7785786B2 (en) * 2006-01-23 2010-08-31 Quest Diagnostics Investments Incorporated Methods for detecting nucleic acids using multiple signals
US8778637B2 (en) * 2006-03-28 2014-07-15 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Method and apparatus for applying continuous flow and uniform temperature to generate thermal melting curves in a microfluidic device
FR2899689B1 (fr) * 2006-04-10 2016-05-20 Cis Bio Int Procede de suppression d'un signal fret, agents suppresseurs d'un signal de fret et utilisation dans un procede de multiplexage biologiques
US20070238093A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-11 Espy Mark J Detection of influenza A virus
US20070238095A1 (en) * 2006-04-11 2007-10-11 Mayo Foundation For Medical Education And Research , A Minnesota Corporation Detection of Influenza A Virus
EP1845166A1 (de) * 2006-04-13 2007-10-17 BioSpring GmbH Neue Nukleinsäuresonden mit kovalent gebundenen, interkalierenden Fluoreszenzfarbstoffen zur Hybridisierung an Nukleinsäureproben
EP2426221B1 (de) 2006-05-04 2016-06-22 Alere San Diego, Inc. Rekombinase-Polymerase-Amplifikation
EP2602321B1 (de) 2006-05-31 2017-08-23 Sequenom, Inc. Verfahren und Zusammensetzungen zur Nukleinsäureextraktion und -verstärkung aus einer Probe
US8153369B2 (en) 2006-06-05 2012-04-10 Cancer Care Ontario Assessment of risk for colorectal cancer
MX2009004870A (es) * 2006-11-02 2009-10-08 Veridex Llc Formacion de imagenes de endotelio vascular activado usando agentes de contraste inmunomagneticos, para la formacion de imagenes de resonancia magnetica.
US9114398B2 (en) 2006-11-29 2015-08-25 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Device and method for digital multiplex PCR assays
US20080131878A1 (en) * 2006-12-05 2008-06-05 Asuragen, Inc. Compositions and Methods for the Detection of Small RNA
US7902345B2 (en) 2006-12-05 2011-03-08 Sequenom, Inc. Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry
WO2008073919A2 (en) * 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Mir-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
EP2099930B1 (de) 2006-12-13 2015-02-18 Luminex Corporation Systeme und verfahren für pcr-multiplexanalyse in echtzeit
WO2008098142A2 (en) 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
EP2079839A4 (de) 2007-03-05 2009-11-18 Cancer Care Ontario Abschätzung des kolorektalkarzinomrisikos
CN101641452B (zh) 2007-03-26 2013-10-23 塞昆纳姆股份有限公司 限制性核酸内切酶增强的多态序列检测
WO2008128198A2 (en) 2007-04-12 2008-10-23 Usc Stevens - University Of Southern California Dna methylation analysis by digital bisulfite genomic sequencing and digital methylight
US20080274458A1 (en) * 2007-05-01 2008-11-06 Latham Gary J Nucleic acid quantitation methods
US9512470B2 (en) 2007-07-11 2016-12-06 Pathofinder Holding B.V. Method for the simultaneous detection of multiple nucleic acid sequences in a sample
EP2014774A1 (de) * 2007-07-11 2009-01-14 Pathofinder B.V. Assay für den gleichzeitigen Nachweis mehrerer Nukleinsäuresequenzen in einer Probe
WO2009032781A2 (en) 2007-08-29 2009-03-12 Sequenom, Inc. Methods and compositions for universal size-specific polymerase chain reaction
EP2198050A1 (de) 2007-09-14 2010-06-23 Asuragen, INC. Mikrornas mit unterschiedlicher expression bei zervikalkarzinom und verwendungen davon
US8071562B2 (en) 2007-12-01 2011-12-06 Mirna Therapeutics, Inc. MiR-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
WO2009100215A2 (en) * 2008-02-08 2009-08-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of clostridium difficile
WO2009103003A2 (en) * 2008-02-15 2009-08-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Scanning fluorescent reader with diffuser system
JP2009201444A (ja) * 2008-02-29 2009-09-10 Hitachi High-Technologies Corp 核酸分析装置
AU2009223671B2 (en) 2008-03-11 2014-11-27 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
US8206926B2 (en) 2008-03-26 2012-06-26 Sequenom, Inc. Restriction endonuclease enhanced polymorphic sequence detection
US8258111B2 (en) 2008-05-08 2012-09-04 The Johns Hopkins University Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis
CN102171366B (zh) 2008-07-31 2014-11-26 奥西泰克有限公司 多重扩增与检测
GB0909333D0 (en) 2009-06-01 2009-07-15 Fu Guoliang Multiplex amplification and detection
US8962247B2 (en) 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US9540686B2 (en) * 2008-09-18 2017-01-10 Canon U.S. Life Sciences, Inc. Systems and methods for the amplification of DNA
CN102301007A (zh) * 2008-12-10 2011-12-28 史密斯探测公司 使用随温度而变的杂交对核酸序列进行鉴定与区分
JP5279481B2 (ja) 2008-12-25 2013-09-04 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸分析装置
EP3301446B1 (de) 2009-02-11 2020-04-15 Caris MPI, Inc. Molekulare profilierung von tumoren
US8039215B2 (en) * 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
EP3211095B1 (de) 2009-04-03 2019-01-02 Sequenom, Inc. Zusammensetzungen und verfahren für die herstellung von nukleinsäuren
AU2010236424B2 (en) * 2009-04-15 2016-03-10 Relia Biotechnologies (Shenzhen) Ltd. Diagnostic devices and related methods
US9469867B2 (en) 2009-05-20 2016-10-18 Alere San Diego, Inc. DNA glycosylase/lyase and AP endonuclease substrates
US8597892B2 (en) 2009-05-22 2013-12-03 Asuragen, Inc. MiRNA biomarkers of prostate disease
WO2010135917A1 (zh) 2009-05-26 2010-12-02 厦门大学 一种检测核酸序列变异的方法
WO2011022589A2 (en) * 2009-08-20 2011-02-24 Mayo Foundation For Medical Education And Research Detection of enterovirus
EP2775300A3 (de) 2009-08-28 2015-04-01 Asuragen, INC. miRNA-Biomarker für Lungenerkrankungen
WO2011027966A2 (en) 2009-09-03 2011-03-10 Seegene, Inc. Td probe and its uses
US9353407B2 (en) 2009-10-21 2016-05-31 Brandeis University Methods, kits and reaction mixtures for analyzing single-stranded nucleic acid sequences
US20160186266A1 (en) 2009-10-27 2016-06-30 Carislife Sciences, Inc. Molecular profiling for personalized medicine
BR112012018629A2 (pt) * 2009-12-21 2019-09-24 Becton Dickinson Co métodos para determinar a presença de mycobacterium e a presença de região não mutacionada do núcleo do gene rpob mycobacterium, kit e sistemas automotizados
EP3660165B1 (de) 2009-12-22 2023-01-04 Sequenom, Inc. Verfahren und kits zur identifizierung von aneuploidie
US20120034638A1 (en) 2010-05-21 2012-02-09 Michael Ahrens Electrochemical assay for the detection of enzymatically active PSA
US9046507B2 (en) 2010-07-29 2015-06-02 Gen-Probe Incorporated Method, system and apparatus for incorporating capacitive proximity sensing in an automated fluid transfer procedure
US9803236B2 (en) 2010-08-06 2017-10-31 Tsinghua University Microarray-based assay integrated with particles for analyzing molecular interactions
GB201017978D0 (en) 2010-10-25 2010-12-08 Oxitec Ltd Multiplex amplification and detection
JP5872569B2 (ja) 2010-10-27 2016-03-01 キャピタルバイオ コーポレーションＣａｐｉｔａｌＢｉｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ マイクロアレイに基づくアッセイのための粒子と結合させた発光団で標識された分子
WO2012058633A1 (en) 2010-10-29 2012-05-03 Latham Gary J mPCR METHODS FOR ANALYZING REPEAT SEQUENCES
US8718948B2 (en) 2011-02-24 2014-05-06 Gen-Probe Incorporated Systems and methods for distinguishing optical signals of different modulation frequencies in an optical signal detector
US8460872B2 (en) 2011-04-29 2013-06-11 Sequenom, Inc. Quantification of a minority nucleic acid species
US9644241B2 (en) 2011-09-13 2017-05-09 Interpace Diagnostics, Llc Methods and compositions involving miR-135B for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
ES2660228T3 (es) 2011-10-14 2018-03-21 Becton Dickinson & Company Ciclado térmico de onda cuadrada
CN104040238B (zh) 2011-11-04 2017-06-27 汉迪拉布公司 多核苷酸样品制备装置
US9605313B2 (en) 2012-03-02 2017-03-28 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US20140093873A1 (en) 2012-07-13 2014-04-03 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
CA2887302C (en) 2012-10-09 2021-11-09 University Of Utah Research Foundation Monitoring temperature with fluorescence
US9896728B2 (en) 2013-01-29 2018-02-20 Arcticrx Ltd. Method for determining a therapeutic approach for the treatment of age-related macular degeneration (AMD)
EP3597774A1 (de) 2013-03-13 2020-01-22 Sequenom, Inc. Primer zur analyse der dna-methylierung
WO2015042493A2 (en) 2013-09-20 2015-03-26 Ohmx Corporation Psa enzymatic activity: a new biomarker for assessing prostate cancer aggressiveness
EP3090059B1 (de) 2014-01-05 2018-06-06 Biomirna Holdings Ltd. Micro-rna quotienten zur bestimmung von lungenkrebs
WO2015120382A1 (en) 2014-02-07 2015-08-13 The Johns Hopkins University Predicting response to epigenetic drug therapy
EP3117011B1 (de) 2014-03-13 2020-05-06 Sequenom, Inc. Verfahren und prozesse zur nicht-invasiven beurteilung genetischer variationen
WO2016027162A2 (en) 2014-08-19 2016-02-25 Tataa Biocenter Ab Methods and compositions for nucleic acid detection
US20160097082A1 (en) 2014-09-23 2016-04-07 Ohmx Corporation Prostate specific antigen proteolytic activity for clinical use
WO2016094330A2 (en) 2014-12-08 2016-06-16 20/20 Genesystems, Inc Methods and machine learning systems for predicting the liklihood or risk of having cancer
CN107532213B (zh) * 2015-04-23 2021-05-11 病理取景器控股有限责任公司 用于同时检测样品中多个核酸序列的方法
WO2016177774A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Academisch Medisch Centrum Method of quantifying mirnas using normalization
US11214829B2 (en) 2015-07-23 2022-01-04 Asuragen, Inc. Methods, compositions, kits, and uses for analysis of nucleic acids comprising repeating A/T-rich segments
WO2018045162A1 (en) 2016-09-01 2018-03-08 Biogen Ma Inc. Biomarkers predictive of primary progressive multiple sclerosis and uses thereof
DE112016007245T5 (de) * 2016-10-17 2019-08-14 Olympus Corporation Verfahren zum Nachweisen von Ziel-Nukleinsäuremolekülen
CN107058478B (zh) * 2016-12-08 2022-02-11 广东药科大学 一种检测MTHFR基因rs1801131多态位点基因型的方法及试剂盒
GB201704401D0 (en) * 2017-03-20 2017-05-03 Epistem Ltd Use of anticoagulants
RU2644262C1 (ru) * 2017-04-17 2018-02-08 Александр Юрьевич Криворучко Способ детекции множества последовательностей нуклеотидов в одном образце методом кодирования ампликонов при проведении полимеразной цепной реакции
GB201812192D0 (en) 2018-07-26 2018-09-12 Ttp Plc Variable temperature reactor, heater and control circuit for the same
CA3121170A1 (en) 2018-11-30 2020-06-04 Caris Mpi, Inc. Next-generation molecular profiling
EP3719144A1 (de) 2019-04-05 2020-10-07 Fundación para la Investigación Biomédica del Hospital Universitario de la Paz (FIBHULP) Mir-151a-3p als universelle endogene steuerung zur exosomenladungsnormalisierung
WO2021013592A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Universitario La Paz (Fibhulp) Method for determining the response to treatment of a patient affected by non-small cell lung carcinoma (nsclc)
WO2021112918A1 (en) 2019-12-02 2021-06-10 Caris Mpi, Inc. Pan-cancer platinum response predictor
CN115414703B (zh) * 2022-11-03 2023-01-17 百力格生物科技(上海)股份有限公司 染料修饰后的核酸探针纯化方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4234086A1 (de) * 1992-02-05 1993-08-12 Diagen Inst Molekularbio Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen
US5403707A (en) * 1993-05-14 1995-04-04 Eastman Kodak Company Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures
US5591578A (en) * 1993-12-10 1997-01-07 California Institute Of Technology Nucleic acid mediated electron transfer
US5475098A (en) * 1994-06-14 1995-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Distinctive DNA sequence of E. coli 0157:H7 and its use for the rapid, sensitive and specific detection of 0157:H7 and other enterohemorrhagic E. coli
US5945283A (en) * 1995-12-18 1999-08-31 Washington University Methods and kits for nucleic acid analysis using fluorescence resonance energy transfer
CA2257109C (en) * 1996-06-04 2009-10-06 University Of Utah Research Foundation Monitoring hybridization during pcr
DE69735563T2 (de) * 1996-06-04 2007-05-16 University Of Utah Research Foundation, Salt Lake City Vorrichtung und Verfahren zur Durchführung und Überprüfung von biologischen Prozessen
US5691145A (en) * 1996-08-27 1997-11-25 Becton, Dickinson And Company Detection of nucleic acids using G-quartets
DE19782089T1 (de) * 1996-10-29 1999-12-23 Univ Nebraska At Lincoln Linco Verfahren zum Nachweisen von Punktmutationen in DNA unter Verwendung von Fluoreszenzenergieübergang
GB9707996D0 (en) * 1997-04-21 1997-06-11 Univ Cambridge Tech Screening

Also Published As

Publication number Publication date
US6140054A (en) 2000-10-31
JP3670967B2 (ja) 2005-07-13
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ATE328115T1 (de) 2006-06-15
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