CN114622042B

CN114622042B - 检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组和检测试剂盒

Info

Publication number: CN114622042B
Application number: CN202210531845.8A
Authority: CN
Inventors: 陈德喜; 马迎民; 李家玺; 贲海静; 王阳; 魏飞力; 乔录新
Original assignee: Beijing Institute Of Liver Diseases
Current assignee: Beijing Institute Of Liver Diseases
Priority date: 2022-05-17
Filing date: 2022-05-17
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-05-17
Also published as: CN114622042A

Abstract

本发明公开了一种检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组，包括SEQ ID No.1至SEQ ID No.34所示的引物探针组。本发明提出的11种病毒联合检测试剂盒特异性强，灵敏度高。基于微流控技术实现微量样本，一次采样鉴别新冠病毒和多种呼吸道病毒，并可以根据临床需要，实现高通量检测。

Description

检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体地说是一种用于检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

新型冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2，简称新冠病毒）可引发急性呼吸道传染病。目前反转录聚合酶链反应检测（ReverseTranscription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）是鉴定 SARS-CoV-2 的金标准。

多种呼吸道病毒感染的临床表现、传播途径和季节性流行相似，这增加了 SARS-CoV-2 感染患者的诊断难度。另外，SARS-CoV-2感染患者部分临床症状与甲型流感病毒及其他呼吸道病毒感染引起的临床症状相似，预示着 SARS-CoV-2 与其他呼吸道病毒合并感染时，可能会影响对SARS-CoV-2 的诊断。有研究指出，存在SARS-CoV-2患者上呼吸道和下呼吸道标本中检测到SARS-CoV-2以及其他呼吸道病原体共感染情况。流感高发时期，可能出现与 SARS-CoV-2 的叠加流行状况。另外，大量研究表明，新冠病毒与其他呼吸道合并感染与疾病严重程度、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）甚至死亡相关。在新冠常态化的时代，临床医生无法通过常规的影像学和血清学检查排除其他呼吸道病毒感染来排除SARS-CoV-2感染，太聚焦于新冠病毒可能会忽略其他呼吸道病毒的感染，这些呼吸道病毒感染可能会加重疾病进展。所以，在这种高合并感染的时期，患者进行疾病筛查除了要知道是否存在新冠病毒感染外，还需要在新冠病毒明确未感染的情况下，针对当前流行的呼吸道病毒进行筛查，以便临床医生对症治疗。此外，更需要在新冠病毒确诊的情况下，检测是否存在合并其他呼吸道病毒感染，进而临床医生能够及时根据诊断结果，根据患者的临床表现，给与对症和抗病毒治疗，尽可能地控制病情发展和对症治疗。

然而，目前市场上针对流感病毒与 SARS-CoV-2 联合筛检的试剂盒很少，满足不了临床检测及患者的需求。大多数 RT-PCR 检测试剂盒只针对 SARS-CoV-2 单个病原体。多数患者在发热后，在排除新冠病毒感染后，会再次进行其他病毒的筛查，这就造成了二次甚至三次诊断，不仅增加了诊断成本，同时还增加了医务人员感染和样本泄露的风险，大大浪费了医务工作者和患者治疗时间。

本领域技术人员为了解决上述问题，一般会设计两种或三种病毒的联合检测试剂盒用于同时检测新型冠状病毒、甲型流感病毒（Inf-A）和乙型流感病毒（Inf-B），但这些试剂盒检测病毒种类仍然有限，对常见的呼吸道病毒如人副流感病毒1型（PIV1）、人副流感病毒2型(PIV2)、人副流感病毒3型(PIV3)、人类呼吸道合胞病毒A(RSVA)、人类呼吸道合胞病毒B(RSVB)、人类腺病毒7型（AdV7）及人类博卡病毒（HBoV）、人类偏肺病毒(hMPV)等临床常见呼吸道感染病毒无法实现同时检测，仍需单一检测，给患者增加经济负担，检测效率低。目前未有人提出过多病毒联合检测试剂盒主要因为多病毒联合检测试剂盒的研发存在难点，主要难点在引物设计，每种病毒均存在多种亚型和突变，针对这些突变和亚型要实现检测上的覆盖可能要设计若干引物对和探针，如果11种呼吸道病毒联合检测，需要至少几十组引物对和探针，如此庞大的引物探针组在检测过程中极易发生错配，特异性及灵敏度也较差，因此目前无人提出11种病毒的联合检测试剂盒。第二，联合检测引物的设计既要保证引物特异性，即扩增的阳性片段为该病毒特异性片段，又要保证将该病毒的各种亚型毒株和突变株尽可能检测出来。传统引物设计思路是基于病毒标准序列设计，无法精准覆盖到病毒毒株的突变和各亚型，如果为了解决上述引物探针组过多的问题，只能设计简并引物，简并引物的设计非常有技术难度，简并引物如设计不佳一般会影响检测的稳定性和可重复性。而且，要同时保证11种呼吸道病毒的引物探针不出现非特异性识别，这又是一大难题。第三，在现有呼吸道病毒的检测中，灵敏度一直是一个需要技术人员不断攻克的问题，如何早期检测早期诊断是阻隔病毒传播的关键。第四，目前检测手段如何实现高通量检测也是本领域技术人员研究的热点。

因此，发热门诊亟需一种特异性强、灵敏度高及高通量的新冠病毒和甲乙流等其11种呼吸道病毒快速鉴别诊断联合试剂盒来实现门诊快速分诊。

发明内容

本发明所要解决的首要技术问题在于提供一种检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒等11种病毒的引物探针组。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种含有上述引物探针组的检测试剂盒。

为实现上述技术目的，本发明采用以下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，提供一种检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组，包括：

用于检测人副流感病毒1型PIV1的引物核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

用于检测人副流感病毒2型PIV2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；

用于检测人副流感病毒3型PIV3的引物核苷酸序列如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；

用于检测甲型流感病毒Inf-A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.10和SEQ ID No.11所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.12所示；

用于检测乙型流感病毒Inf-B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.13和SEQ ID No.14所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.15所示；

用于检测人类呼吸道合胞病毒A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.16和SEQ IDNo.17所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；

用于检测人类呼吸道合胞病毒B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ IDNo.20所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；

用于检测人类腺病毒7型AdV7的引物核苷酸序列如SEQ ID No.22和SEQ ID No.23所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.24所示；

用于检测人类博卡病毒HBoV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.25和SEQ ID No.26所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.27所示；

用于检测人类偏肺病毒hMPV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.28和SEQ ID No.29所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.30所示；

用于检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.31和SEQ IDNo.32所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示。

其中较优地，所述检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针SEQ ID No.33的5’端标记FAM 荧光发生基团，3’端标记MGB；所述探针SEQ ID No.34的5’端标记VIC荧光发生基团，3’端标记MGB。

其中较优地，所述探针SEQ ID No.3、探针SEQ ID No.6、探针SEQ ID No.9、探针SEQ ID No.12、探针SEQ ID No.15、探针SEQ ID No.18、探针SEQ ID No.21、探针SEQ IDNo.24、探针SEQ ID No.27和探针SEQ ID No.30的5’端标记FAM 荧光发生基团，3’端标记MGB。

上述引物探针组为发明人设计的简并引物，可以实现同时对十一种呼吸道病毒的联合检测，特异性强，灵敏度高，可以体现本发明的创造性特点。为了进一步提高检测灵敏度，本发明还可以包括预扩增引物组，预扩增步骤可使检测样本Ct值减少15左右，这意味着经预扩增，灵敏度在原有基础上可提高5个数量级。

上述预扩增引物组序列如下所述：

用于预扩增人副流感病毒1型PIV1的引物核苷酸序列如SEQ ID No.35和SEQ IDNo.36所示；

用于预扩增人副流感病毒2型PIV2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.37和SEQ IDNo.38所示；

用于预扩增人副流感病毒3型PIV3的引物核苷酸序列如SEQ ID No.39和SEQ IDNo.40所示；

用于预扩增甲型流感病毒Inf-A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.41和SEQ IDNo.42所示；

用于预扩增乙型流感病毒Inf-B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.43和SEQ IDNo.44所示；

用于预扩增人类呼吸道合胞病毒A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.45和SEQ IDNo.46所示；

用于预扩增人类呼吸道合胞病毒B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.47和SEQ IDNo.48所示；

用于预扩增人类腺病毒7型AdV7的引物核苷酸序列如SEQ ID No.49和SEQ IDNo.50所示；

用于预扩增人类博卡病毒HBoV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.51和SEQ IDNo.52所示；

用于预扩增人类偏肺病毒hMPV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.53和SEQ IDNo.54所示；

用于预扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.55和SEQID No.56所示。

根据本发明实施例的第二方面，提供上述的引物探针组在制备用于检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的检测试剂盒中的用途。

其中较优地，所述呼吸道病毒包括甲型流感病毒Inf-A、乙型流感病毒Inf-B、人副流感病毒1型PIV1、人副流感病毒2型PIV2、人副流感病毒3型PIV3、人类呼吸道合胞病毒A、人类呼吸道合胞病毒B、人类腺病毒7型AdV7、人类博卡病毒HBoV和人类偏肺病毒hMPV中的一种或多种。

根据本发明实施例的第三方面，提供一种用于检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的检测试剂盒，包括上述的引物探针组。

其中较优地，所述试剂盒还包括带有人副流感病毒1型PIV1、人副流感病毒2型PIV2、人副流感病毒3型PIV3、甲型流感病毒Inf-A、乙型流感病毒Inf-B、人类呼吸道合胞病毒A、人类呼吸道合胞病毒B、人类腺病毒7型AdV7、人类博卡病毒HBoV、人类偏肺病毒hMPV和新型冠状病毒核酸片段的重组质粒。

其中较优地，所述重组质粒中病毒的核酸序列为：

人副流感病毒1型PIV1 病毒核酸片段序列如SEQ ID No.57所示；

人副流感病毒2型PIV2 病毒核酸片段序列如SEQ ID No.58所示；

人副流感病毒3型PIV3病毒核酸片段序列如SEQ ID No.59所示；

甲型流感病毒Inf-A病毒核酸片段序列如SEQ ID No.60所示；

乙型流感病毒Inf-B病毒核酸片段序列如SEQ ID No.61所示；

人类呼吸道合胞病毒A病毒核酸片段序列如SEQ ID No.62所示；

人类呼吸道合胞病毒B病毒核酸片段序列如SEQ ID No.63所示；

人类腺病毒7型AdV7病毒核酸片段序列如SEQ ID No.64所示；

人类博卡病毒HBoV病毒核酸片段序列如SEQ ID No.65所示；

人类偏肺病毒hMPV病毒核酸片段序列如SEQ ID No.66所示；

新新冠状病毒核酸片段序列如SEQ ID No.67所示。

本发明具有以下技术效果：

（1）本发明提出的11种病毒联合检测引物组和探针，引物组均为简并引物，利用一对引物即可覆盖目标病毒的各种亚型及突变，特异性强，灵敏度高。基于微流控技术实现微量样本，一次采样，鉴别新冠病毒和多种呼吸道病毒，根据临床需要。

（2）本发明提供的检测引物组和探针可结合微流控高通量PCR技术，利用微流控芯片，可以实现高通量检测。

（3）本发明克服了现有技术中由于病毒存在多种突变和亚型，引物设计难度大，无法设计出可以精准覆盖所有亚型的简并引物的技术问题。本发明涉及的每种病毒的简并引物可以覆盖病毒的所有亚型，实现精准检测。

（4）本发明通过预扩增，检测样本Ct值减少15左右（图1A为预扩增前，图1B为预扩增后），这意味着经预扩增，灵敏度在原有基础上可提高5个数量级。

附图说明

图1A为本发明在预扩增前的qPCR扩增曲线；

图1B为本发明在预扩增后的qPCR扩增曲线；

图2为本发明实施例中，PIV1的核酸序列保守性分析图；

图3A为本发明实施例中，10种非新冠呼吸道病毒热图

图3B为本发明实施例中，10中非新冠呼吸道病毒扩增曲线；

图4A为本发明实施例中，新冠呼吸道病毒热图；

图4B为本发明实施例中，新冠呼吸道病毒扩增曲线；

图5A为本发明实施例中，的呼吸道病毒培养物检测热图；

图5B为本发明实施例中，的呼吸道病毒培养物扩增曲线；

图6A为本发明实施例中，的新冠阳性和阴性病人检测热图；

图6B为本发明实施例中，的新冠阳性和阴性病人扩增曲线；

图7为本发明提供的芯片示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术内容进行详细具体的说明。

本发明提供的试剂盒主要涉及一种微流控高通量PCR技术-Flexsix IFC以及自主设计的新冠病毒和十种常见呼吸道病毒检测体系，一共包含11种带有呼吸道病毒核酸的重组质粒（pGEM3Z-PIV1，pGEM3Z-PIV2，pGEM3Z-PIV3，pGEM3Z-Inf-A，pGEM3Z-Inf-B，pGEM3Z-RSVA，pGEM3Z-RSVB，pGEM3Z-Adv7，pGEM3Z-HBoV，pGEM3Z-hMPV，pGEM3Z-SARS-CoV-2）；试剂盒里设计的11种重组质粒，将其稀释混合用于质控。

实施例1本发明所述试剂盒涉及的试剂：

2X 检测加载试剂(Fluidigm，PN 85000736)；

TaqMan® 快速通用PCR母液混合物, no AmpErase™ UNG（Fluidigm，PN4366073）；

20X GE 样品加载试剂 (Fluidigm，PN 85000735，85000746)；

预扩增母液混合物 (Fluidigm, PN 100-5580, 100-5581)；

FlEXsixTM GE 微流控芯片；

11种带有呼吸道病毒核酸的重组质粒为pGEM3Z-PIV1，pGEM3Z-PIV2，pGEM3Z-PIV3，pGEM3Z-Inf-A，pGEM3Z-Inf-B，pGEM3Z-RSVA，pGEM3Z-RSVB，pGEM3Z-Adv7，pGEM3Z-HBoV，pGEM3Z-hMPV，pGEM3Z-SARS-CoV-2。上述质粒的病毒核酸序列见SEQ ID No.57-SEQID No.67所示。

11种呼吸道病毒对应的探针和引物(生工®Sangon Biotech合成)；

对应的呼吸道病毒核酸序列及设计序列如下表：

表1

检测呼吸道病毒对应的探针和引物序列如下表：

表2

用于预扩增的呼吸道病毒的引物如下表：

表3

实施例2 本发明中的重组质粒的制备

采用质粒pGEM3Z，运用EcoR I/Sal I双酶切克隆将PIV1的核酸序列导入以构建重组质粒。制备PIV2、PIV3、Inf-A、Inf-B、RSVA、RSVB、AdV7、HBoV、hMPV、SARS-CoV-2的重组质粒与上述方法相同。

实施例3 本发明中的引物和探针的设计

本发明与现有技术在引物设计上有很大区别，本发明在设计开始就考虑到临床病毒株突变和亚型的问题，各种不同病毒的检测引物的设计都是基于目前NCBI核酸数据库上所有公开的病毒序列的总体分析，而不是现有技术针对病毒单一标准株序列分析。本发明在设计某一病毒特异性检测引物的时候，将NCBI核酸数据库（截止2021年11月）的该病毒的所有序列进行保守性分析，从中选择能代表该病毒的保守性区域设计检测引物，同时考虑到病毒亚型和临床株的突变，设计简并引物尽可能覆盖该病毒的各种临床突变，力求检测引物不光能检测出标准毒株，还尽最大可能检测出该病毒的各种亚型毒株和突变毒株。

本发明中的呼吸道病毒的设计序列思路及方法以PIV-1为例，其他病毒引物设计思路及方法与PIV-1一致，在此不做赘述。PIV-1设计思路如下表所示：

表4

上表结合图2可知，图2为对PIV-1的所有已知序列进行核酸片段的保守性分析，其中，值越高表示其保守性越强，本发明针对保守区域进行引物和探针的设计。如图，第125位点，U的概率为80%，C的概率为20%；第156位点，A的概率为10%，U的概率为40%,C的概率为50%。

实施例4 十一种病毒检测实验

本发明根据自主设计的十一种探针引物，利用对应的质粒，在FlEXsixTM GE IFC微流控芯片高通量PCR技术下，对包含新冠在内的十一种呼吸道病毒进行了双通道PCR检测，其中新冠病毒为VIC通道，十种常见呼吸道病毒为FAM通道，实验结果可靠。芯片如图7所示。

实验过程如下：

1.引物探针特异性检测

1.1 质粒稀释

用TE Buffer(PH 8.0)将质粒进行稀释，稀释至3.0*10^3copies/μL，用于配制sample。

1.2 探针引物稀释

将探针引物以18000g，30min离心；在生物安全柜里按照上面参数用MQ（ddH2O）配制浓度为100uM的探针引物，进而稀释成20uM的用于配制10X Assays。

1.3 prime the Flexsix IFC

若是IFC已被激活，跳过以下步骤。使用内含的注射器，分别沿一角向每个储池里加入150μL的控制油（注射器里有）。事先检查储池的弹簧是否工作。在加载IFC前不要移去阻碍插头（Barrier plug）；取下并丢弃芯片底部的蓝色保护膜；将IFC放到机器上，根据机器不同运行Juno：Prime Flex Six GE or HX：Prime(153X)程序。

1.4 制备10X Assays

在一个生物安全柜里，用Table1的体积制备10X assays的等分试样，见下表：

表5

1.5 准备含样品的预混合液

按照下表的成分制成样品预混合液和最终的样品混合液

表6

1.6 芯片中加样

在生物安全柜中，将TaqMan 快速通用PCR母液混合液和GE样品加载试剂混合在一个1.5mL无菌管中--足够的体积来填充整个芯片。然后为每个样品等取3.3μL的样品预混合液，再分别加入2.7μL的cDNA（不同的质粒稀释液），使每个等份的总体积为6μL。

1.7 加载芯片

注意事项：在移液到芯片入口之前，彻底旋涡并离心所有分析和样品溶液。否则可能导致数据质量下降；重要的是，对于未使用的sample入口，每个入口使用3.0µL pre-mix和MQ的混合液对于未使用的assay入口，使用3.0µL 10x Assay混合液；小心移液时，不要超过移液管上的第一个止点。防止将气泡引入进气口。

1.7.1 当Prime Flex Six GE脚本完成后（首次使用），从Juno中取出芯片，并用移液管将每个Assay和每个Sample的3µL移到芯片上各自的入口。

1.7.2 将芯片重放回IFC控制器Juno中；根据机器类型选择相应程序：Juno：LoadMix Flex Six GE or HX：Load Mix(153x)；脚本完成后，从IFC控制器Juno中取出加载的芯片；清除芯片表面的任何灰尘颗粒或碎屑。

1.7.2 使用数据采集软件

双击桌面上的数据采集软件以启动软件，单击 Start a New Run，检查指示灯和摄像头是否准备就绪。继续下一步之前，确保两个都是绿色的

将芯片放入读卡器，单击 Load，验证芯片条形码和芯片类型，选择项目设置（如果适用），单击 Next，芯片运行文件，选择 New 或 Predefined，浏览到用于数据存储的文件位置，单击 Next；选择Application,Reference,Probes：1.选择应用程序类型-GeneExpression；2.选择被动参考（ROX）；3.选择分析-Single Probe，Two probes 或 Morethan two probes后单击 Next；单击Browse以查找热协议文件-GE 96x96 Standardv1.pcl.确保 Auto Exposure 已选择，单击 Next，验证芯片运行信息，单击 Start Run.

1.8 Post run 芯片

芯片在BioMark^TMHD上运行后，立刻将芯片返回到Juno或者HX上，运行相应的脚本以放松阀门。Juno：Post Run Flex Six GE or HX：Post Run（153X）；将阻碍塞子放回使用过的区域，并用信号笔示意已经使用后，不要再打开；室温保存IFC。

1.9 实验结果

FlEXsix^TMGE 微流控芯片，如图7所示，图7中芯片分为六个工作区，每个工作区又化为Assay和Sample区。芯片上方和下方中央都各有一个储存槽，里面要提前灌注控制油。Assay区加入探针和引物，Sample区加入待测样品或者质粒标准，都分别有12个孔。在机器作用下，Sample区每个孔里的样品会均分为12份，和同样均分为12份的Aassy里一个孔里的液体在芯片中央（反应区）相遇进行反应。每个工作区会经过12X12次反应，此芯片的六个工作区可同时且任意组合工作。高通量PCR技术能够诊断两种不同颜色的探针，所以为了避免新冠病毒与其他呼吸道病毒发生非特异性反应，造成诊断的假阳性。本发明自主设计了新冠病毒和十种常见呼吸道病毒的探针和引物，其中新冠病毒为VIC通道，十种常见呼吸道病毒为FAM通道。并设计了相应的质粒对探针和引物的特异性进行检测。

对包含新冠在内的十一种呼吸道病毒质粒进行了双通道PCR检测，结果显示十种呼吸道病毒探针引物工作时特异性强，无交叉反应，扩增曲线良好，如图3所示，图3A为10种呼吸道病毒（除新冠）质粒及11种质粒混合物和探针引物反应热图，图中可见：mix质粒全都有荧光信号，而且各个病毒的探针引物与相应的病毒质粒单一反应，与其他质粒没有反应。各呼吸道病毒对应的探针引物特异性良好，ct值基本在30以内。图3B为10种呼吸道病毒（除新冠）质粒和探针引物反应扩增曲线，曲线良好。且在检测新冠病毒的VIC通道时，其探针引物特异性强，能够实现新冠病毒的检出，如图4所示，图4A为本发明设计的新冠探针引物与合成的新冠野生质粒反应热图，新冠探针引物工作良好。图4B为设计的新冠探针引物与合成的新冠野生质粒反应扩增曲线，曲线良好。

如下表所示，结合上述实验表明本发明的稳定性好，可重复，三次实验统计学结果显示变异系数几乎都在5%以下，结果可靠。

表7

本发明实现了微流控技术在呼吸道病毒感染诊断的应用，充分发挥了高通量的优势，快速高效地诊断发热病人呼吸道病毒感染类型。但是本技术应用不仅限于这11种呼吸道病毒检测，在人力物力允许情况下，可以实现其他病原微生物的检测，而且根据实际需要，选用不同的FLUGM芯片，目前最高可实现192个样品多达24个目标的检测。

实施例5 非新型冠状病毒培养物检测实验

1. AdV7病毒培养物核酸提取

使用试剂盒：QIAGEN DNA Mini Kit (cat.no.51304)，所有离心步骤均在室温下进行。

取20μL呼吸道病原体培养物稀释液（4μL原液）于1.5mL离心管中，加入180μLBuffer ATL；在85°C下孵育10min。瞬时离心以去除盖子内的液滴；加入20μL蛋白酶K原液。通过涡旋混合，并在56°C下孵育1小时。瞬时离心以去除盖子内的液滴；向样品中添加200μL的Buffer AL。通过涡旋彻底混合，并在70°C下孵育10min。瞬时离心以去除盖子内的液滴；向样品中加入200μL乙醇（96-100%），并通过涡旋彻底混合。瞬时离心以去除盖子内的液滴；小心地将上面混合物加入到 QIAamp Mini spin column(在2ml收集管中)，而不湿润边缘。关闭盖子，以6000xg(8000rpm)的速度离心1min。将QIAampMini旋转柱置于一个干净的2ml收集管（提供的）中，并丢弃含有滤液的收集管；小心地打开 QIAamp Mini spin column，加入500μL Buffer AW1，而不湿润边缘。关闭盖子，以6000g(8000rpm)离心1min。将 QIAampMini spin column置于干净的2ml收集管（提供的）中，并丢弃含有滤液的收集管；小心地打开QIAamp Mini spin column，加入500μL Buffer AW2，而不湿润边缘。关闭盖子，然后以全速离心，3min；将QIAamp Mini spin column放入新的2ml收集管,全速离心1min。，随滤液丢弃旧收集管；将QIAamp Mini spin column置入干净的1.5mL离心管中，并丢弃含有滤液的收集管。小心地打开QIAamp Mini spin column，加入20μL Buffer AE或DDW(MQ)。室温孵育1min，然后以6000g(8000rpm)离心1min以收集提取的DNA；提取的DNA放于-20℃保存。

2.Inf-A、PIV2、RSVB病毒培养物核酸提取

使用试剂盒：QIAamp Viral RNA Mini Kit(cat. no. 52904)

吸取560uL准备好的buffer AVL到1.5ml离心管中;将140uL病毒培养物稀释液（30uL病毒培养物原液用PBS稀释到140uL）加入到装有buffer AVL的离心管中。涡旋15s，混匀，室温放置10min。瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；样品中加入560uL无水乙醇，斡旋15s充分混匀。然后瞬时离心，将盖子上的液滴甩回管底；吸取630uL上步中的溶液小心的加入吸附柱（已装入到2ml离心管中）中，注意不要碰到柱子的边缘。盖上盖子，6000×g（8000rpm）离心1min；将吸附柱放入新的2mL离心管中，弃去旧的收集管。小心的打开吸附柱的盖子，重复操作，直至完全转移；小心的打开吸附柱盖子，加入500uL buffer AW1。盖上盖子，8000rpm离心，1min。将吸附柱放入新的2mL收集管（Kit提供）中，弃去旧的收集管；小心的打开吸附柱盖子，加入500uL buffer AW2。盖上盖子，全速离心（14000rpm），3min。将吸附柱放入新的2ml收集管（Kit中未提供）中，弃去旧的收集管，全速离心1min。将吸附柱放在1.5mL离心管（kit中未提供）中。弃去旧的收集管。小心的打开吸附柱，加入60ul ddW。盖上盖子，室温放置1min,之后8000rpm离心1min。

3.逆转录实验

使用试剂盒 SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR

3.1按下表将成分混合在八连排中：

表8

65℃孵育5min，然后立即放置在冰上2min；

3.2按下表准备以下cDNA合成混合物，按顺序每个成分并混合。

表9

3.3 在每个RNA/引物混合物中加入10μL的cDNA合成混合物，轻轻地混合，并通过短暂的离心收集。孵育如下。

步骤1: 25℃，10min；

步骤2:50℃，50min，60℃；

步骤3：85℃，5min

PCR后立即放于冰上。

通过短暂的离心，每试管中加入1μLRNaseH，在37°C下孵育20min；cDNA合成反应物存储-20℃。

3.4 逆转录产物预扩增

3.4.1 制备引物池

各取1uL 浓度为20uM的每种病毒的引物（F/R），最后加入18uL的DNA 稀释缓冲液（10mM Tris，pH 8.0，0.1mM EDTA）

表10

3.4.2 按照下表制备预扩增体系

表11

3.4.3 PCR

步骤1：95℃，30s

步骤2：94℃，15s；60℃，15s；72℃，30s（20X）

步骤3：4℃，∞

3.4.4 稀释预扩增产物

最后用20uL TE 缓冲液（10mM Tris-HCl，1.0mM EDTA）也就是1：5稀释，得到25uL的cDNA。

3.5 FLexsix 芯片上机实验

重复1.3-1.8操作，样品孔1-7分别为预扩增后的甲型H1N1（2009）、甲型H1N1、AdV7、PIV2、RSVB的cDNA、11种呼吸道病毒质粒的混合物、ddW阴性。

3.6实验结果

本次实验采用的是中国食品药品检定研究院生产的体外诊断试剂参考品，原料为呼吸道病原体培养物，经冻干而成。样本孔的1-5分别来源于PC05:甲型H1N1(2009)、PC06:甲型H1N1、NC08：呼吸道腺病毒（7型）、NC09：呼吸道合胞病毒B型、NC10：副流感病毒2型。其中，NC08（DNA病毒）经核酸提取后预扩增用于上机，PC05、PC06、NC09、NC10（RNA病毒）经核酸提取后逆转录，再预扩增用于上机。结果显示，图5A呼吸道病毒探针引物工作时特异性强，且全部检出，无交叉反应，图5B扩增曲线良好，其中甲流探针引物组同时检出甲型H1N1(2009)和甲型H1N1，表明病毒探针引物可以同时检出不同亚型的呼吸道病毒。图中可见：呼吸道病毒的探针引物检出对应的病毒，且特异性良好，能够实现对呼吸道病毒的精准检出。如下表所示，结合上述，实验表明本发明检出率高，稳定性好，可重复，三次实验统计学结果显示变异系数均在5.3%以下，结果可靠。

表12

实施例6 新型冠状阳性病人的RNA检测实验

1逆转录实验

同实施例5。

2.逆转录产物预扩增

同实施例5。

3.FLexsix 芯片上机实验

同实施例5，其中检测体系按下表双探针体系配制

表13

4.4实验结果

本次实验采用的是新冠阳性病人和阴性病人的RNA，经逆转录，预扩增后用于上机。为了防止临床检测污染，以新型冠状病毒的S蛋白的保守序列设计了新冠的10个探针引物组:D614G、N501Y、E484K、P681H、T719I、A570D、T478K、S982A、L452R、S477N，为了防止检测出现假阳性，选用其中FAM没有信号，VIC信号良好的探针引物组。其中S477N探针引物组工作特异性强，并且全部检出阳性和阴性样本（图6A），扩增曲线良好（图6B），如下表所示。实验表明本发明的检出率高，结果可靠。

表14

。

序列表

<110> 北京肝病研究所

<120> 检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组和检测试剂盒

<160> 71

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agtgccaaaa caatcaaaga gac 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatcccgctt tgtactgaac tt 22

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacagaatta atcagac 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctcttccaa atacaacagg gc 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggataaaa tagcgtgagg ac 22

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgggccacaa tc 12

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

catccaataa atgagaatgc aatc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cataccttca attttggaac tgag 24

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaaaacacag agagact 17

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctaaccgag gtcgaaacgt at 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggtcttgtct ttagccattc ca 22

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctctctatcg ttccatca 18

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gtgggaaaga atttgaccta gact 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tctttcctgg tctttgggtt t 21

<210> 15

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctaattggtg cctctat 17

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

catagtccaa atggagcctg a 21

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acttgacttt gctaagagcc att 23

<210> 18

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tgtatttgcc ccatct 16

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cccaattatg atgtgcaaaa ac 22

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gctttaacat gatatccagc a 21

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

actatgtggt atgctatta 19

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgggaggaca atacatactc ttac 24

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaatgtgctg gccatgtca 19

<210> 24

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

cactctgttg tcgcc 15

<210> 25

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

aaaagggagt ccagaaagag g 21

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taggtggctg attgggtgtt 20

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agacaactca tcacagga 18

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

agcttcagtc aattcaacag aag 23

<210> 29

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cgtagacccc tatcaggatt c 21

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tctaaatgtt gtgcggca 18

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caaacctttt gagagagata tttca 25

<210> 32

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ggaaaccata tgattgtaaa ggaa 24

<210> 33

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccggtaacac acctt 15

<210> 34

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccggtagcac acct 14

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tagttcatat tggtctacaa ccc 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tgagatctct gctttgcttg ttt 23

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gttgtgtctt gtattgctat gtag 24

<210> 38

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

accggcacag gttatgttgg ga 22

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

catatgcggc attataccca tct 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gtctcataga tatcgtccat acc 23

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tagatattga aagatgagcc ttcta 25

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

agtgcaccag cagaataact gag 23

<210> 43

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

acaattgcct acctgctttc act 23

<210> 44

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tcatgaaagc ttacacatct tctc 24

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

atgcataact acactccata gtc 23

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gcacatcata attaggagta tcaa 24

<210> 47

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

atcagctgct gtcatccagc aa 22

<210> 48

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

tattgacttg tatttctgat gtcaa 25

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

tgcaacagac acctacttca gt 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cacgccgcga atgtcaaaga at 22

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

tgagctcagg gaatatgaaa ga 22

<210> 52

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ttcgaagcag tgcaagacga ta 22

<210> 53

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

caactgcagt gagagagctg aa 22

<210> 54

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

acagttgacc ctgcattctg aca 23

<210> 55

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

atcttgattc taaggttggt ggta 24

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

aaacagttgc tggtgcatgt aga 23

<210> 57

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

agggttaaag acaatccagc caacctacaa ggcaacaaca tctgactata caaacgatgg 60

ctgaaaaagg gaaaacaatt agttcatatt ggtctacaac ccgaaatgat aactccacgg 120

taaatacaca cattaacaca ccagcaggaa ggacacacat ctggctactg attgcaacaa 180

caatgcatgc agtattgtcc ctcattatca tgatactatg cattgaccta attataaaac 240

aagacacttg tatgaagaca aacatcatga cagtatcctc catgaacgaa agtgccaaaa 300

caatcaaaga gacaatcaca gaattaatca gacaagaagt gatatcaagg actataaaca 360

tacaaagttc agtacaaagc gggatcccaa tattgttaaa caagcaaagc agagatctca 420

<210> 58

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

tacactcaca atgtaatact tggagattgc ctcgatttca cgacatctaa tcagtattta 60

gcaatgggga taatacaaca atctgctgca gcatttccaa tcttcaggac tatgaaaacc 120

atttacctaa gtgatggaat caatcgcaaa agctgttcag tcactgctat accaggaggt 180

tgtgtcttgt attgctatgt agctacaaga tctgagaaag aagattatgc cacaactgat 240

ctagctgaac tgagacttgc tttctattat tataatgata cctttattga aagagtcata 300

tctcttccaa atacaacagg gcaatgggcc acaatcaaac ctgcagttgg aagcgggatc 360

tatcatctag gctttatttt atttcctgta tatggtggtc tcataaaggg gactccttcc 420

tacaacaagc agtcctcacg ctattttatc ccaaaacatc ccaacataac ctgtgccggt 480

<210> 59

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

gatggctcaa tctcaacaac aagatttaag aataataata taagttttga tcaaccatat 60

gcggcattat acccatctgt tggaccaggg atatactaca aaggcaaaat aatatttctc 120

gggtatggag gtcttgaaca tccaataaat gagaatgcaa tctgcaacac aactgggtgt 180

cctgggaaaa cacagagaga ctgcaatcag gcatctcata gtccatggtt ttcagataga 240

aggatggtca actctataat tgttgttgac aagggtttaa actcagttcc aaaattgaag 300

gtatggacga tatctatgag acaaaattac tgggggtcag aaggaagatt acttctacta 360

ggtaacaaga tctacatata cacaagatct acaagttggc acagcaagtt acaattagga 420

ataattgaca ttactgacta cagtgatata aggataaaat ggacatggca taatgtgcta 480

<210> 60

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

tagatattga aagatgagcc ttctaaccga ggtcgaaacg tatgttctct ctatcgttcc 60

atcaggcccc ctcaaagccg agatcgcgca gagacttgaa gatgtctttg ctgggaagaa 120

cacagatctt gaggctctca tggaatggct aaagacaaga ccaattctgt cacctctgac 180

taaggggatt ttggggtttg tgttcacgct caccgtgccc agtgagcgag ggctgcagcg 240

tagacgcttt gtccaaaatg ccctcaatgg gaatggagat ccaaataaca tggacaaagc 300

agttaaactg tataggaaac ttaagaggga gataacgttc catggggcca aagaaatagc 360

tctcagttat tctgctggtg cacttgccag ttgcatgggc ctcatataca ataggatggg 420

<210> 61

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

atgtcgctgt ttggagacac aattgcctac ctgctttcac taatagaaga tggagaaggc 60

aaagcagaac tagctgaaaa attacactgt tggttcggtg ggaaagaatt tgacctagac 120

tctgctttgg aatggataaa aaacaaaagg tgcctaactg atatacaaaa agcactaatt 180

ggtgcctcta tatgcttttt aaaacccaaa gaccaagaaa gaaaaaggag attcatcaca 240

gagcccctgt caggaatggg aacaacagca acaaagaaga aaggcctaat tctagctgag 300

agaaaaatga gaagatgtgt aagctttcat gaagcatttg aaatagcaga aggccacgaa 360

agctcagcat tactatattg tcttatggtc atgtacctaa accctgaaaa ctattcaatg 420

caagtaaaac taggaacgct ctgtgcttta tgcgagaaac aagcatcgca ctcgcataga 480

gcccatagca gagcagcaag gtcttcggta cctggagtaa gacgagaaat gcagatggtt 540

tcagctatga acacagcaaa gacaatgaat ggaatgggaa agggagaaga cgtccaaaaa 600

ctagcagaag agctgcaaaa caacattgga gtgttgagat ctctaggagc aagtcaaaag 660

aatggagaag gaattgccaa agatgtaatg gaagtgctaa aacagagctc tatgggaaat 720

tcagctcttg tgaggaaata cttataa 747

<210> 62

<211> 480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

atgcataact acactccata gtccaaatgg agcctgaaaa ttatagtaat ttaaaattaa 60

ggagagacat aagatgaaag atggggcaaa tacaaaaatg gctcttagca aagtcaagtt 120

gaacgataca ctcaacaaag atcaacttct gtcatccagc aaatacacca tccaacggag 180

cacaggagat agtattgata ctcctaatta tgatgtgcag aaacacatca acaagttatg 240

tggcatgtta ttaatcacag aagatgctaa tcataaattc actggggtaa taggtatgtt 300

atatgctatg tctagattag gaagagaaga caccataaaa atactcagag atgcgggata 360

tcatgtaaaa gcaaatggag tggatataac aacacatcgt caagacatta atggaaaaga 420

aatgaaattt gaagtgttaa cattggcaag cttaacaact gaaattcaaa tcaacattga 480

<210> 63

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

aaagtcaagt tgaatgatac attaaataag gatcagctgc tgtcatccag caaatacact 60

attcaacgta gtacaggaga taatattgac actcccaatt atgatgtgca aaaacaccta 120

aacaaactat gtggtatgct attaatcact gaagatgcaa atcataaatt tacaggatta 180

ataggtatgc tatatgctat gtccaggtta ggaagggaag acactataaa gatacttaaa 240

gatgctggat atcatgttaa agctaatgga gtagatataa caacatatcg tcaagatata 300

aatggaaagg aaatgaaatt cgaagtatta acattatcaa gcttgacatc agaaatacaa 360

gtcaatattg agatagaatc cagaaagtcc tacaaaaaaa tgctaaaaga gatgggagaa 420

<210> 64

<211> 301

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

tgccccagtg gtcttacatg cacatcgccg gacaggatgc ttcggagtac ctgagtccgg 60

gtctggtgca gttcgcccgt gcaacagaca cctacttcag tatggggaac aagtttagaa 120

accccacagt ggcgcccacc cacgatgtga ctaccgaccg tagccagcga ctgatgctgc 180

gcttcgtgcc cgttgaccgg gaggacaata catactctta caaagtgcgg tacaccctcg 240

ccgtgggcga caacagagtg cttgacatgg ccagcacatt ctttgacatt cgcggcgtgc 300

t 301

<210> 65

<211> 299

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

atgagctcag ggaatatgaa agacaagcat cgctcctaca aaagaaaagg gagtccagaa 60

agaggggaga ggaagagaca ctggcagaca actcatcaca ggagcaggag ccgcagcccg 120

atccgacaca gtggggagag aggctcgggc tcatatcatc aggaacaccc aatcagccac 180

ctatcgtctt gcactgcttc gaagacctca gaccaagtga tgaagacgag ggagagtaca 240

tcggggaaaa aagacaatag aacaaatcca tacactgtat tcagtcaaca cagagcttc 299

<210> 66

<211> 1620

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

atgtcttgga aagtggtgat cattttttca ttgttaataa cacctcaaca cggtcttaaa 60

gagagctact tagaagagtc atgtagcact ataactgaag gatatctcag tgttctgagg 120

acaggttggt ataccaacgt ttttacactg gaggtaggtg atgtagagaa ccttacatgt 180

gctgatggac ctagcttaat aaaaacggaa ttagacctga ccaaaagtgc actaagagag 240

ctcagaacag tttctgctga tcaactggca agagaggagc aaattgagaa tcccagacaa 300

tctagattcg ttctaggagc aatagcactc ggtgttgcaa cagcagctgc agttacagca 360

ggtgttgcaa ttgccaaaac catccggctt gaaagtgaag taacagcaat caagaatgct 420

ctcaaaaaga ccaatgaagc agtatctaca ttagggaatg gcgttcgagt gttggcaact 480

gcagtgagag agctgaaaga ttttgtgagc aagaatctaa cacgtgcaat caacaaaaac 540

aagtgcgaca ttgctgacct gaaaatggcc gttagcttca gtcaattcaa cagaaggttt 600

cttaatgttg tgcggcaatt ttcagacaat gctggaataa caccagcaat atccttggac 660

ttaatgacag atgctgaact agccagagct gtttccaaca tgccaacatc tgcaggacaa 720

ataaaactga tgttggagaa ccgtgcaatg gtaagaagaa aggggttcgg aatcctgata 780

ggagtttacg gaagctccgt aatttacatg gtgcaactgc caatctttgg ggttatagac 840

actccttgct ggatagtaaa agcagcccct tcttgctcag aaaaaaaggg aaactatgct 900

tgcctcttaa gagaagatca aggatggtat tgtcagaatg cagggtcaac tgtttactac 960

ccaaatgaaa aagactgtga aacaagagga gaccatgtct tttgcgacac agcagcagga 1020

atcaatgtcg ctgagcagtc aaaggagtgc aacatcaaca tatccactac taattaccca 1080

tgcaaagtca gcacaggaag acatcctatc agtatggttg cactgtctcc tcttggggct 1140

ttagttgctt gctacaaggg agtgagctgt tccattggca gcaacagagt agggatcatc 1200

aagcaactga acaaaggctg ctcttatata accaaccaag acgcagacac agtgacaata 1260

gacaacactg tgtaccagct aagcaaagtt gagggcgaac agcatgttat aaaaggaagg 1320

ccagtgtcaa gcagctttga tccagtcaag tttcctgaag atcaattcaa tgttgcactt 1380

gaccaagttt tcgagagcat tgagaacagt caggccttgg tggatcaatc aaacagaatc 1440

ctaagcagtg cagagaaagg aaacactggc ttcatcattg taataattct aattgctgtc 1500

cttggctcta ccatgatcct agtgagtgtt ttcatcataa taaagaaaac aaagaaaccc 1560

acaggagcac ctccagagct gagtggtgtc acaaacaatg gcttcatacc acacaattag 1620

<210> 67

<211> 641

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

atttgcatct gtttatgctt ggaacaggaa gagaatcagc aactgtgttg ctgattattc 60

tgtcctatat aattccgcat cattttccac ttttaagtgt tatggagtgt ctcctactaa 120

attaaatgat ctctgcttta ctaatgtcta tgcagattca tttgtaatta gaggtgatga 180

agtcagacaa atcgctccag ggcaaactgg aaagattgct gattataatt ataaattacc 240

agatgatttt acaggctgcg ttatagcttg gaattctaac aatcttgatt ctaaggttgg 300

tggtaattat aattacctgt atagattgtt taggaagtct aatctcaaac cttttgagag 360

agatatttca actgaaatct atcaggccgg tagcacacct tgtaatggtg ttgaaggttt 420

taattgttac tttcctttac aatcatatgg tttccaaccc actaatggtg ttggttacca 480

accatacaga gtagtagtac tttcttttga acttctacat gcaccagcaa ctgtttgtgg 540

acctaaaaag tctactaatt tggttaaaaa caaatgtgtc aatttcaact tcaatggttt 600

aacaggcaca ggtgttctta ctgagtctaa caaaaagttt c 641

<210> 68

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

agggttaaag acaatccary caaccyayaa ggyaacarca tcygaytata caaacgatgg 60

ctgaaaargg gaaaacaawt agttcatatt ggtctacaac ccgaaatgay aactccacgg 120

taaayacaca cattaayaca ccagcaggaa ggacahacat ctggctactg attgcaacar 180

caatgcatrc aryaytgtcc ytcattatca tgatactatg cattgaccta attatraarc 240

aagacacttg tatgaaraca aacaycatga cagtatcctc yrtgaacgar agtgccaaaa 300

caatcaaaga gacaatcaca gaattaatca gacaagaagt ratatcaagg actataaaca 360

tacaaagttc agtacaaagc gggatcccaa tattgttaaa caagcaaagc agagatctca 420

<210> 69

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

agggttaaag acaatccagc caacccacaa ggyaacaaca tctgactata caaacgatgg 60

ctgaaaaagg gaaaacaatt agttcatatt ggtctacaac ccgaaatgat aactccacgg 120

taaatacaca cattaacaca ccagcaggaa ggacayacat ctggctactg attgcaacar 180

caatgcatgc arcactgtcc ctcattatca tgatactatg cattgaccta attataaarc 240

aagacacttg tatgaaraca aacaycatga cagtatcctc cgtgaacgar agtgccaaaa 300

caatcaaaga gacaatcaca gaattaatca gacaagaagt gatatcaagg actataaaca 360

tacaaagttc agtacaaagc gggatcccaa tattgttaaa caagcaaagc agagatctca 420

<210> 70

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 70

agggttaaag acaatccary caacyyayaa ggyaacarca tcygaytata caaaygatgg 60

ytgraaargg gaaaayaawt agttcatatt ggtctacaac ccgaaatgay aactccacrg 120

taaayacaca cattaayaca ccagcaggaa ggacahacat ctggmtactg attgcaacar 180

caatgcatrc aryaytgtcc ytcattatca tgatmytatg cattgaccta attatraarc 240

aagacacttg tatgaaraca aacaycatga cagtatcctc yrtraaygar agtgccaaaa 300

caatcaaaga gacaatcaca gaattaatca gacaagaagt ratatcaagg actataaaca 360

tacaaagttc agtacaaagc gggatcccaa tattgttaaa caagcaaagc agagatctca 420

<210> 71

<211> 420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 71

arrrbtwamr rhamycyary yaayyyryar rrharyrrca ycyrayyayr yrarhratrr 60

ytrrvarrrr raaaahaahy arttcatayt rrtcyacaac ycraaayray aayycyayrr 120

ywaayacaya catyrryrya ycrryarrra rrryrhamat ytrrmyaytr attryaayar 180

yadtrcatrc wryaytrtch ytyrttatya tratmytatr yatyrayytr atyatraarc 240

aarayacytr tatrarracr aayayyatra yartrtcyty yrtraayrar arbrccaara 300

yaatcaarra racaatcaca raattaatsa racaaraart ratatcaarr acyataaaya 360

tacaaarytc rrtacaaary rrratyccra taytrttaaa yaagcarary aradatctya 420

Claims

1.一种检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的引物探针组，其特征在于包括：

用于检测人类呼吸道合胞病毒A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.16和SEQ ID No.17所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.18所示；

用于检测人类呼吸道合胞病毒B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.19和SEQ ID No.20所示，探针核苷酸序列如SEQ ID No.21所示；

2.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：

所述检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的探针SEQ ID No.33的5’端标记FAM 荧光发生基团，3’端标记MGB；所述探针SEQ ID No.34的5’端标记VIC荧光发生基团，3’端标记MGB。

3.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于：

所述探针SEQ ID No.3、探针SEQ ID No.6、探针SEQ ID No.9、探针SEQ ID No.12、探针SEQ ID No.15、探针SEQ ID No.18、探针SEQ ID No.21、探针SEQ ID No.24、探针SEQ IDNo.27和探针SEQ ID No.30的5’端标记FAM 荧光发生基团，3’端标记MGB。

4.如权利要求1所述的引物探针组，其特征在于还包括预扩增引物组，序列如下所述：

用于预扩增人副流感病毒1型PIV1的引物核苷酸序列如SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示；

用于预扩增人副流感病毒2型PIV2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.37和SEQ ID No.38所示；

用于预扩增人副流感病毒3型PIV3的引物核苷酸序列如SEQ ID No.39和SEQ ID No.40所示；

用于预扩增甲型流感病毒Inf-A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.41和SEQ ID No.42所示；

用于预扩增乙型流感病毒Inf-B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.43和SEQ ID No.44所示；

用于预扩增人类呼吸道合胞病毒A的引物核苷酸序列如SEQ ID No.45和SEQ ID No.46所示；

用于预扩增人类呼吸道合胞病毒B的引物核苷酸序列如SEQ ID No.47和SEQ ID No.48所示；

用于预扩增人类腺病毒7型AdV7的引物核苷酸序列如SEQ ID No.49和SEQ ID No.50所示；

用于预扩增人类博卡病毒HBoV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.51和SEQ ID No.52所示；

用于预扩增人类偏肺病毒hMPV的引物核苷酸序列如SEQ ID No.53和SEQ ID No.54所示；

用于预扩增新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物核苷酸序列如SEQ ID No.55和SEQ IDNo.56所示。

5.权利要求1至4中任意一项所述的引物探针组在制备用于检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的检测试剂盒中的用途。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述呼吸道病毒包括甲型流感病毒Inf-A、乙型流感病毒Inf-B、人副流感病毒1型PIV1、人副流感病毒2型PIV2、人副流感病毒3型PIV3、人类呼吸道合胞病毒A、人类呼吸道合胞病毒B、人类腺病毒7型AdV7、人类博卡病毒HBoV和人类偏肺病毒hMPV中的一种或多种。

7.一种用于检测新型冠状病毒联合呼吸道病毒的检测试剂盒，其特征在于包括权利要求1至4中任意一项所述的引物探针组。

8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于还包括带有人副流感病毒1型PIV1、人副流感病毒2型PIV2、人副流感病毒3型PIV3、甲型流感病毒Inf-A、乙型流感病毒Inf-B、人类呼吸道合胞病毒A、人类呼吸道合胞病毒B、人类腺病毒7型AdV7、人类博卡病毒HBoV、人类偏肺病毒hMPV和新型冠状病毒核酸片段的重组质粒。

9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述重组质粒中病毒的核酸序列为：

人副流感病毒1型PIV1 病毒核酸片段序列如SEQ ID No.57所示；

人副流感病毒2型PIV2 病毒核酸片段序列如SEQ ID No.58所示；

人副流感病毒3型PIV3病毒核酸片段序列如SEQ ID No.59所示；

甲型流感病毒Inf-A病毒核酸片段序列如SEQ ID No.60所示；

乙型流感病毒Inf-B病毒核酸片段序列如SEQ ID No.61所示；

人类呼吸道合胞病毒A病毒核酸片段序列如SEQ ID No.62所示；

人类呼吸道合胞病毒B病毒核酸片段序列如SEQ ID No.63所示；

人类腺病毒7型AdV7病毒核酸片段序列如SEQ ID No.64所示；

人类博卡病毒HBoV病毒核酸片段序列如SEQ ID No.65所示；

人类偏肺病毒hMPV病毒核酸片段序列如SEQ ID No.66所示；

新型冠状病毒核酸片段序列如SEQ ID No.67所示。