KR102606717B1 - 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 - Google Patents
일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102606717B1 KR102606717B1 KR1020200150413A KR20200150413A KR102606717B1 KR 102606717 B1 KR102606717 B1 KR 102606717B1 KR 1020200150413 A KR1020200150413 A KR 1020200150413A KR 20200150413 A KR20200150413 A KR 20200150413A KR 102606717 B1 KR102606717 B1 KR 102606717B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- encephalitis virus
- virus
- seq
- tick
- west nile
- Prior art date
Links
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 title claims abstract description 68
- 241000710888 St. Louis encephalitis virus Species 0.000 title abstract description 54
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 title abstract description 54
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 title abstract description 50
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 22
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 abstract description 12
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 abstract description 12
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 abstract 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 16
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 16
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 6
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 6
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 3
- 238000003748 differential diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 3
- 241000256054 Culex <genus> Species 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 206010019233 Headaches Diseases 0.000 description 1
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 244000090689 Rumex alpinus Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 208000011312 Vector Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000006449 West Nile encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 206010057293 West Nile viral infection Diseases 0.000 description 1
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 1
- 208000035472 Zoonoses Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091069025 single-strand RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010068698 spleen exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/107—RNA dependent DNA polymerase,(i.e. reverse transcriptase)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
- C12Q2561/113—Real time assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Virology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 뇌염 바이러스 4종 (Japanese encephalitis virus, West Nile virus, Tick-borne encephalitis virus, Saint Louis encephalitis virus)을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트 및 이를 포함하는 키트 및 검출 방법에 관한 것이다. 본 발병은 비구조단백질 (non-structural protein)유전자 중 NS5 gene을 타켓으로 하는 특정 염기서열로 이루어진 프라이머 및 프로브가 각 바이러스를 구분할 수 있으며, 이 프라이머 및 프로브를 포함하여 최적화된 Real-time RT-PCR 시약 조성물을 이용함으로써 신속 정확한 진단이 가능하다.
Description
본 발명은 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스를 동시에 구분하여 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 포함하는 조성물 또는 검출방법에 관한 것이다.
플라비바이러스 (Flavivirus)는 구형의 11Kb RNA 바이러스이다. 분류학상으로 플라비바이러스과 (family Flaviviridae)의 플라비바이러스 속(genus Flavivirus)에 위치한 양성 단일가닥 (positive, single strand)의 RNA를 유전물질로 갖는 구형의 바이러스이다. 플라비바이러스는 70여종의 바이러스가 속하여 있는데 그 중 30여종이 사람에게서 질병을 일으킨다. 대표적인 질병을 야기하는 병원체로는 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 뎅기바이러스, 진드기매개뇌염바이러스, 황열바이러스 등이 대표적이다. 이들 외에 사람에게 중증의 질환을 야기하지만 그 발생빈도가 낮고 활동지역 또한 협소한 바이러스로서 세인트루이스뇌염바이러스, 머레이밸리뇌염바이러스 등이 있다. 플라비바이러스는 종내에서의 높은 염기서열 상동성(84% 이상)을 나타낸다. 이로 인해 서로 간에 교차반응이 있으며 감별 진단시 큰 어려움으로 작용한다.
일본뇌염바이러스 (Japanese encephalitis virus, JEV)는 1940년 이후 국내에 토착화된 질환으로 모기(Culex genus)를 매개로 전파되는 인수공통 감염병으로 바이러스에 감염된 경우 90%이상이 증상이 없지만 발병 시 치사율이 20~30%에 이른다. WHO (세계보건기구)에 따르면 2000년대에도 전 세계적으로 매년 6만 명 이상의 환자가 발생된다고 추산한다. 국내의 경우, 일본뇌염바이러서는 법정감염병 제 2군에 포함되어 있으며 매년 수십 명에 이르게 일본뇌염바이러스 감염 환자가 보고되고 있다. 일본뇌염바이러스는 유전형이 크게 5개로 구분되며 과거 우리나라 모기에서 유전형 1형과 3형이 유행하다가 2010년 이후부터 유전형 5형이 확인되기 시작하면서 2015년 환자에서 유전형 5형이 분리되었다. 따라서, 일본뇌염바이러스의 유전형 5형이 검출됨에 따라 일본뇌염바이러스 감염 여부를 진단하는 방법 또한 기존에서 추가적으로 유전형 5형이 검출 가능하도록 진단 방법 구축이 절실하다.
웨스트나일바이러스 (West Nile Virus, WNV)는 모기를 매개체 하는 질환으로 아프리카, 동유럽, 서아시아, 중동, 미국 등 남극 대륙을 제외한 모든 지역에서 지속 발생 중이며 1999년 미국 동부지역에서 첫 감염사례가 발생한 이 이후 미국 전 지역과 캐나다로 확산되었다. 웨스트나일바이러스에 감염된 사람의 70~80%는 무증상 감염이며 감염 시 신경계 비침습 질환 및 신경계 침습 질환으로 구분되며 신경계 침습으로 감염을 일으키는 경우 약 10%가 사망할 수 있다. 우리나라와 교류가 빈번한 미국에서 웨스트나일열이 발생하고 있으며, 웨스트나일바이러스 매개 모기가 국내에 서식하는 것으로 확인됨에 따라 국내에서 발생할 가능성이 있다. 일본뇌염바이러스의 웨스트나일바이러스간에 혈청학적 유사성이 매우 높으므로 일본뇌염바이러스와 웨스트나일바이러가 교차반응이 주로 나타나고 있다. 이에 정확한 진단의 중요성이 강조되고 있어, 특이 유전자 검출을 통해 감염 유무를 판단하는 분자 진단 검사법이 그 대안으로 주목받고 있는 실정이다.
진드기매개뇌염바이러스 (Tick-borne encephalitis virus, TBEV)는 자연계 존재하는 참진드기 및 피참진드기 등에 의해 전파되어 발생하는 질병으로 주로 홍반이 대부분의 환자(70~80%)에서 관찰된다. 일반적으로 치사율이 10~30% (유럽형 <2%, 극동형 20~40%, 시베리아형 2~3%)이다. 유럽, 러시아, 아시아 등에서 중요한 감염성 질환이며, 특히 유럽에서는 연간 수천 명이 발생하고 있고, 진드기의 활동이 활발해지는 4~11월 사이에 호발한다. 국내의 경우 현재까지 진드기매개뇌염 환자가 보고된 적이 없으나, 국내에 진드기매개뇌염바이러스 매개체 서식 확인 및 매개체에서의 진드기매개뇌염바이러스가 분리되었다. 또한 지리적으로 인접한 국가들에서의 바이러스 분리보고 및 지속적인 환자발생 사례가 보고되고 있으며 기후변화 및 해외여행 증가 등으로 국내 발생 가능성이 점점 높아지고 있는 실정에서 유전자 검출 방법 구축이 절실하다.
세인트루이스뇌염바이러스 (Saint Louis encephalitis virus, SLEV)는 모기 (Culex 속)를 매개로 전파되는 감염으로 대부분의 무증상 감염이나 열이나 두통 등 가벼운 증상과 수막염, 뇌염 같은 중증 증상을 나타내기도 한다. 신경계를 침범하는 감염일 경우 어린이와 젊은 성인은 회복되는 경우가 40%이나 노인에서는 90%에서 뇌염이 발생한다. 미국, 캐나다, 아르헨티나, 브라질, 페루 등에서 유행하고 있으며 미국에서는 늦여름과 초가을경 가장 많은 환자 발생을 나타낸다. 국내에서의 세인트루이스뇌염바이러스 환자는 보고된 적 없으나, 대한감염학회와 질병관리본부 공동으로 진행한 ‘해외유입 가능 주요 감염병의 진단 및 관리 내용체계 구축’ 사업에서 우선적으로 대비해야 할 해외유입이 가능한 감염증 16개 질환이 선정되었고, 여기에 세인트루이스 뇌염바이러스가 포함되어 있다. 따라서 세인트루이스뇌염바이러스의 진단능력과 감시능력 향상을 위해 유전자 검출 시약 및진단법 구축이 필수적이다.
현행 진단 방법으로서 혈청학적 검사와 유전자 검사가 모두 이용되기는 하나, 혈청학적 검사법에는 다소 많은 시간이 소비되며 급성기 및 회복기 혈청 간의 항체 역가 상승을 확인 하여야 하기 때문에 조기의 적절한 검체를 채취하는 것과 항체 역가 상승을 확인하기 위한 추가 검체 확보가 필요하다. 뇌염바이러스 4종 (JEV, WNV, TBEV, SLEV)의 매개체인 모기 및 진드기에서 국내외에서 지속적이 바이러스 검출 및 분리가 이루어 지고 있다. 따라서 국내에서도 뇌염바이러스 4종에 관한 정확한 바이러스 유전자 검출이 이루어 질 수 있도록 진단 시스템 구축이 필요하다.
현재 대부분 분자진단에 있어 유전자 진단에는 민감도가 높은 Real-time RT-PCR 방법을 권고하고 있다. 하지만 현재 일부의 진단 검사 기관의 경우 민감도 낮은 conventional RT-PCR법을 사용하여 유전자 검사를 진행하고 있다. 이러한 conventional RT-PCR의 경우 진단 검사 시간이 Real-time RT-PCR보다 많이 소요되며, 전기영동과 같은 과정에서 오염 및 실험자의 주관적 견해가 포함될 수 있다. 현재 일본뇌염바이러스 유전자 진단검사만이 질병관리본부와 각 지자체의 보건환경연구원에서 수행하고 있으며, 일본 뇌염을 제외한 3종의 바이러스의 경우에는 질병관리본부에서만 진단을 수행하고 있다.
한국등록특허 제890885호는 일본 뇌염 바이러스 혈청군의 구성원을 포함하는 특정플라비바이러스 검출용 조성물 및 방법에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제942388호는 일본뇌염바이러스 검출을 위한 프라이머 세트, 내부컨트롤 리보핵산, 이를 포함하는 역전사 중합효소 연쇄반응 키트 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 방법에 관해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1236197호는 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단에 관해 개시하고 있고, 한국등록특허 제1758609호는 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물에 관해 개시하고 있다.
하지만, 본 발명의 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스의 동시 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 검출 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
상기 프로브는 TaqMan 프로브인 것을 특징으로 하고, 서열번호 3, 4, 9, 10, 15, 16 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유발 질환 진단용 조성물
상기 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유발 질환은 뇌염에 관한 것이다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 사용하여 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유전자를 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응으로 증폭하는 단계; 및 실시간 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유전자 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스의 검출용 프라이머 세트와 이를 이용한 검출방법은 기존의 상기 바이러스들을 단일 검출할 수 있는 시스템에 비하여 한 번의 반응으로 다수의 목표물을 동시에 확인할 수 있으므로 신속하고 효율성이 높다. 또한 동일한 검출 원리를 이용하여 공지된 방법들과의 비교 시험을 통하여 본 발명의 임상적 유용성이 높다는 것을 확인하였다. 본 발명을 통하여 유사 증상을 보이는 종들과의 정확한 감별 진단으로 불필요한 치료 및 조사 활동을 사전에 방지함으로써 효과적인 방역 대책 마련에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
도 1은 본 발명의 일 구현 예에 따른 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스에 대한 대표적인 실시간 정량 PCR 증폭 곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시검출 증폭곡선을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 구현 예에 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시검출 증폭곡선을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 구현예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정 사항들이 도시되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 동시 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트에 관한 것이다.
NCBI 데이터베이스로부터 뇌염바이러스 4종 (JEV, WNV, TBEV, SLEV)의 염기서열을 수집하고 Alignment 결과로부터 각각의 공통 보존 염기서열을 찾아내어 타켓 부위 (NS5 gene) 를 선정하였으며 GC 염기의 % 비율 및 각 프라이머 및 프로브에 대한 melting temperature (Tm값)를 고려하여 프라이머 및 프로브를 디자인하였다. 추가적으로 기디자인된 프라이머나 프로브들이 유사한 바이러스 및 기타 핵산들과 교차 반응이 일어날 수도 있다고 가정하여 유사도가 가장 높은 기타 플라비바이러스의 염기서열을 확인하여 이들을 특이적으로 구분하여 검출이 가능하도록 설계하였다.
실시간 중합효소연쇄반응(real-time PCR)은 기존의 PCR과는 달리 유전자의 증폭산물에 결합된 형광물질로부터 방출되는 형광량을 실시간으로 측정하는 원리이다. 이는 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 결과를 해석할 수 있으며, 검출 특이도와 민감도가 매우 높고 교차 오염의 위험성이 적어 질병의 진단검사법으로 유용하게 사용될 수 있다.
뇌염바이러스 4종 (JEV, WNV, TBEV, SLEV) 프로브는 이 분야에 알려진 모든 프로브를 포함하고, 바람직하게는 5‘ 및 3’ 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 및 소광자가 결합되어 있는 프로프를 사용한다. 일반적으로 5‘ 및 3’ 말단에는 검출이 가능한 형광 표지인자 (Reporter) 및 소광자 (Quencher)가 결합되어 있으므로, 사용가능한 모든 형광 표지인자 및 소광자를 사용할 수 있다. 형광 표지 인자의 예로는 FAM, VIC, TAMRA, JOE, ROX, HEX, Cy3, Cy5, Texas Red 등이 있으며 종류에 따라 emission 및 exitation 파장이 다르므로 각각의 파장 간 중첩을 최소로 하는 형광표지자를 선택하여 한 번의 반응에서 다양한 병원체의 특이 유전자 검출을 가능케 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
형광검출법으로는 인터킬레이팅(interchelating) 방법, TaqMan™ 프로브법 및 분자비콘(Molecular becon) 방법 등이 있다. 이들은 각각 다른 원리를 이용하여 형광의 증가를 검출하는데, 바람직하게는 TaqMan™ 프로브법을 사용할 수 있다. TaqMan™ 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA, Blacke hole chencher 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqManTM probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM probe가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 quencher에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→ 3'엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리되므로서 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 되며, 더욱 바람직하게는 서열번호 3, 4, 9, 10, 15, 16 및 20으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 실시하는 단계는 30 내지 50 사이클, 30 내지 46 사이클, 30 내지 44 사이클, 33 내지 50 사이클, 33 내지 46 사이클, 33 내지 44 사이클, 36 내지 50 사이클, 36 내지 46 사이클, 36 내지 44 사이클, 38 내지 50 사이클 또는 38 내지 46 사이클, 예를 들어, 38 내지 44 사이클 조건으로 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
다른 예로서, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 동시 검출용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바이러스 검출용 프라이머 세트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. PCR 종료시, 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현한다. 이때, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다. 분석된 결과는 Ct (Threshold cycle)로 나타나 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
상기 조성물에서 사용하는 시료는 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유발질환 진단용 조성물을 제공한다.
상기 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유발질환은 중추신경계 질환을 포함하는 각종 감염성 질환에 관한 것이고, 구체적으로는 뇌염에 관한 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
추가적으로, 본 발명은 분리된 DNA 시료를 준비하는 단계; 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 5 또는 6을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 7 또는 8을 포함하는 웨스트 나일 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 11 또는 12를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 서열번호 13 또는 14를 포함하는 진드기 매개 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 서열번호 17 또는 18을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 정방향 프라이머; 및 서열번호 19을 포함하는 세인트 루이스 뇌염 바이러스 역방향 프라이머를 사용하여 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유전자를 증폭하는 단계; 및 증폭 결과를 형광으로 획득하는 단계;를 포함하는 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스 및 세인트 루이스 뇌염 바이러스 유전자 동시 검출방법을 제공한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다
<실시예 1> 뇌염바이러스 4종 (JEV, WNV, TBEV, SLEV)의 검출용 프라이머 및 프로브 제작
타겟 유전자 (NS5 gene)의 염기서열을 미국국립생물정보센터 (NCBI, https://www.hcbi.nlm.nih.gov/) BLASTsearch를 이용하여 수집한 후, 데이터베이스 내 염기서열과의 상동성(homoly)을 분석하여 가장 특이적인 부위에 프라이머 및 프로브를 설계하였다(표 1). 멀티플렉스를 위한 프로브의 리포터는 일본뇌염바이러스 및 진드기매개뇌염바이러스의 경우 Cal 560, 웨스트나일바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스는 FAM를 이용하였고, 소광자는 Black hole quencher(BHQ)를 이용하였다. 프라이머 및 프로브의 Tm (melting temperature) 값은 50~60℃ 범위에 해당되도록 디자인하였다.
<염기서열>
<실시예 2> 뇌염바이러스 4종 (JEV, WNV, TBEV, SLEV)을 동시 검출하기 위한 프라이머 및 프로브 농도 조건 최적화
본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 Real-time RT-PCR을 수행하였을 때, 뇌염바이러스 4종(JEV, WNV, TBEV, SLEV)를 검출할 때의 민감도를 확인하기 위하여, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 각각 바이러스 RNA를 이용하여 PCR을 수행하였다.
세인트루이스뇌염바이러스는 상용화된 표준품 RNA (Vircell, Spain)사용하였으며, 그 외 바이러스의 경우는 한국 질병관리본부로부터 비활성화 된 바이러스를 분양 받아 사용하였다.
각각의 RNA를 10배씩 단계적으로 희석한 후, 표 3에 기재된 반응액 조성 및 표 4에 기재된 반응 조건에 따라서 실시간 PCR 기기(Applied Biosystems 7500 Fast Real-time PCR system, Life technologies, USA)를 이용하여 PCR을 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트로 실시간 RT-PCR을 수행하였을 때, 모든 RNA에서 약 10 copies/reaction 까지 검출이 가능하여 본 발명의 프라이머 및 프로브 세트의 민감도가 우수함을 확인하였다(도 2). 상기 멀티플렉스 최적 농도조건과 각 프라이머 및 프로브가 단독으로 포함되어 있는 싱글플렉스 조건을 비교하였을 때, 유사한 성능을 나타냄을 확인하였다.
<프라이머 및 프로브의 최적 농도 조건>
<시약 조성물>
<시약 조성물>
<110> KDCA
<120> Primer sets for simultaneous detection of Japanese encephalitis
virus, West Nile virus, Tick-borne encephalitis virus and Saint
Louis encephalitis virus
<130> M20-0000
<160> 20
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JEV F
<400> 1
ggaggactgg gttaacaaat ct 22
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JEV R
<400> 2
acgttggtct ttcaacttcc 20
<210> 3
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JEV P1
<400> 3
aaagccctca gaaccgtctc gg 22
<210> 4
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> JEV P2
<400> 4
aaagccctca aaaccgtctc gg 22
<210> 5
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF F1
<400> 5
gaaagtcata gagaagatgg agctg 25
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF F2
<400> 6
ccctaggagc gatgtttga 19
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF R1
<400> 7
acattgcctg aagctcgact c 21
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF R2
<400> 8
atgcaggtgt tgcattctc 19
<210> 9
<211> 23
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF P1
<400> 9
tggtcagaaa cccactctca cgg 23
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> WNF P2
<400> 10
aagttttggg agatggtgga t 21
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV F1
<400> 11
agaaggttga caccaaggc 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV F2
<400> 12
ataaagttga cacaaaggc 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV R1
<400> 13
gctgcacatt cgtggtttg 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV R2
<400> 14
gctgcacatg cgcggtttg 19
<210> 15
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV P1
<400> 15
agcctggcac aaaggtcatc atga 24
<210> 16
<211> 24
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TBEV P2
<400> 16
agcccggtac aagagtcatc atga 24
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLEV F1
<400> 17
tggaaagctc acagagaagc 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLEV F2
<400> 18
cggaaagctc acagagaagc 20
<210> 19
<211> 25
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLEV R
<400> 19
cagttggttt cacttcataa cttcc 25
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SLEV P
<400> 20
cagacctccg gaaagttggg 20
Claims (10)
- 서열번호 1을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 정방향 프라이머;
서열번호 2를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 역방향 프라이머; 그리고
서열번호 3을 포함하는 일본 뇌염 바이러스 프로브를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 검출용 프라이머 세트 - 제1항의 프라이머 세트를 포함하는 일본 뇌염 바이러스 검출용 조성물
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200150413A KR102606717B1 (ko) | 2020-11-11 | 2020-11-11 | 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020200150413A KR102606717B1 (ko) | 2020-11-11 | 2020-11-11 | 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220064185A KR20220064185A (ko) | 2022-05-18 |
| KR102606717B1 true KR102606717B1 (ko) | 2023-11-27 |
Family
ID=81800990
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020200150413A KR102606717B1 (ko) | 2020-11-11 | 2020-11-11 | 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102606717B1 (ko) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117802274A (zh) * | 2024-02-27 | 2024-04-02 | 吉林大学 | 一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0408967B8 (pt) | 2003-03-31 | 2021-07-27 | Hoffmann La Roche | kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas |
| KR100942388B1 (ko) | 2009-05-11 | 2010-02-17 | 대한민국 | 일본뇌염바이러스 검출을 위한 프라이머 세트, 내부컨트롤 리보핵산, 이를 포함하는 역전사 중합효소 연쇄반응 키트 및 이를 이용한 중합효소 연쇄반응 방법 |
| KR101236197B1 (ko) | 2011-01-25 | 2013-02-26 | 대한민국 | 웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단 |
| KR101758609B1 (ko) | 2015-09-08 | 2017-07-17 | 대한민국 | 일본뇌염바이러스 검출 및 유전자형 판별용 조성물 |
-
2020
- 2020-11-11 KR KR1020200150413A patent/KR102606717B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Chao 등, J. CLIN. MICROBIOL., Vol. 45, No. 2, 페이지 584-589 (2006.11.15.)* |
| Schwaiger 등, Journal of Clinical Virology, Vol. 27, No. 2, 페이지 136-145 (2002.12.21.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220064185A (ko) | 2022-05-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10072309B1 (en) | Methods for real-time multiplex isothermal detection and identification of bacterial, viral, and protozoan nucleic acids | |
| Bronzoni et al. | Duplex reverse transcription-PCR followed by nested PCR assays for detection and identification of Brazilian alphaviruses and flaviviruses | |
| KR20190002894A (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄 반응을 이용한 모기 매개 바이러스 검출세트 및 검출방법 | |
| CN113881812B (zh) | 检测SARS-CoV-2突变株的组合物、试剂盒、方法及其用途 | |
| CN103025893A (zh) | 用于登革热检测的探针和引物 | |
| CN113930547B (zh) | 猪流行性腹泻病毒n基因的rt-raa荧光法检测引物对、试剂盒及检测方法 | |
| CN107619885A (zh) | 一种用于检测登革病毒的荧光rt‑raa引物、探针及检测方法 | |
| KR102128651B1 (ko) | 다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 뎅기 바이러스 혈청형 검출세트 및 검출방법 | |
| KR102606717B1 (ko) | 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 진드기매개뇌염바이러스 및 세인트루이스뇌염바이러스 동시 검출용 프라이머 세트 | |
| JP5754100B2 (ja) | エンテロウイルス７１ｒｎａの検出方法および検出試薬 | |
| KR20190041237A (ko) | 뎅기 바이러스 검출용 올리고뉴클레오티드 세트 및 이의 용도 | |
| KR20170117012A (ko) | 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 급성위장관염 유발 칼리시비리데 바이러스 검사 키트 및 방법 | |
| US20190264294A1 (en) | Detection of zika virus nucleic acid | |
| Kowada et al. | Development of a multiplex real‐time PCR assay for detection of human enteric viruses other than norovirus using samples collected from gastroenteritis patients in Fukui Prefecture, Japan | |
| KR20210103109A (ko) | 열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법 | |
| KR102278402B1 (ko) | 홍역 바이러스 및 백신주의 검출용 프라이머 및 프로브와 이를 이용한 검출 방법 | |
| KR102181996B1 (ko) | 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| EP4281589A1 (en) | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences | |
| KR102293563B1 (ko) | 돼지 장염 코로나바이러스 동시 검출용 조성물 및 이의 용도 | |
| EP3885455A1 (en) | Method and kit for the detection of sars-cov-2 virus in a sample based on reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (rt-lamp) | |
| KR102496413B1 (ko) | 인간 리노바이러스 및 엔테로바이러스 d68 동시 검출용 프라이머 세트 | |
| CN110878380A (zh) | 一种检测水泡性口炎病毒印第安那型和新泽西型的引物组合物、试剂盒及方法 | |
| US7427674B2 (en) | System and method for detecting West Nile Virus | |
| KR102516022B1 (ko) | 아프리카돼지열병 및 돼지열병 동시감별 실시간유전자 진단법 | |
| Muraoka et al. | Direct detection of Dengue viruses without extraction of RNA on the mobile real-time PCR device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| AMND | Amendment | ||
| AMND | Amendment | ||
| E90F | Notification of reason for final refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |