CN104059905A - 室温扩增dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种室温扩增DNA的方法，包括：（1）提取模板DNA；（2）将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10～60分钟，得到所需的扩增DNA。本发明实现了在常温下DNA的扩增，在资源有限的情况下，使扩增DNA成为可能，并缩短反应时间，得到特异性扩增产物；简化了DNA引物配对以及DNA聚合酶复合物延伸的过程。
Description
技术领域
本发明涉及一种扩增DNA的方法，特别是涉及一种室温扩增DNA的方法。
背景技术
目前DNA扩增的方法有常规PCR、等温PCR等，这些技术都能在短时间内，迅速使目标DNA得到100万倍甚至更高倍数的放大。自1983年面世以来，常规PCR依赖三温度（解链、退火、延伸）循环，对PCR仪器的稳定性有着非常高的要求。两温循环虽然能缩短反应时间，但是DNA聚合酶活性并不处于最优的温度，所以只能扩增较短的片段，而且耗时没有大幅度降低。等温PCR依赖于高于常温的一个稳定温度（例如60℃），还是需要一个精确的温度控制的仪器。
室温PCR则依赖重组酶和具有链置换的聚合酶扩增比较短的序列，需要ATP再生系统，从而使反应体系更加复杂，容易引发副反应，干扰检测效果。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种室温扩增DNA的方法。该方法通过在常温下，利用原核生物重组酶和真核生物DNA复合物彼此在室温下不同的反应特点，两个系统协同，能实现DNA在室温下快速复制。
为解决上述技术问题，本发明的室温扩增DNA的方法，包括步骤：
（1）以核酸抽提试剂盒或以氯仿苯酚法，提取模板DNA；
（2）将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10～60分钟，得到所需的扩增DNA；
其中，扩增试剂的组分包括：
1）10～30mM pH7.2～7.8Tris-HAc
2）20～80mM醋酸钾（KAc）
3）2～5mM醋酸镁【Mg(Ac)2】
4）1～4mM巯基乙醇
5）质量百分比为1%～3.5%的聚乙二醇（PEG）20000
6）50～100μM dNTPs
7）100～500nM引物（包括：一对上游引物和下游引物）
8）0.5～1mM ATP
9）50～100nM RFC（真核DNA扩增环状复合物）
10）100～200nM PCNA（Proliferating Cell Nuclear Antigen，增殖细胞核抗原）
11）50～100nM polδ复合酶或人polη聚合酶
12）1～2μM RPA（真核DNA复制蛋白A）。
所述步骤（2）中，扩增试剂的组分，还包括：13）0.5～2.5μM T4噬菌体紫外敏感酶1；14）0.5～2.5μM T4噬菌体紫外敏感酶2；
其中，T4噬菌体紫外敏感酶1和T4噬菌体紫外敏感酶2，可根据公开的文献【Farid A.Kadyrov,John W.Drake.Properties of Bacteriophage T4 Proteins Deficient inReplication Repair.The Journal of Biological Chemistry，2003,278:25247–25255】制备得到。
步骤（2）的扩增混合液中，模板DNA的浓度为2×10-8ng/μL～10ng/μL；室温的温度范围为25～42℃。
步骤（2）中，涉及的所有扩增试剂的组分浓度值是在扩增混合液中的终浓度值。
另外，步骤（2）的扩增试剂的组分中，真核DNA扩增环状复合物RFC包括：酵母RFC和人RFC，其中，酵母RFC和人RFC可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryoticleading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separatemechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】和【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；
增殖细胞核抗原（PCNA）包括：酵母PCNA和人PCNA；其中，人PCNA可根据公开的文献【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；酵母PCNA可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryotic leading and lagging strand DNApolymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparableprocessivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到；
polδ复合酶包括：酵母polδ复合酶和人polδ复合酶；其中，人polδ复合酶可根据公开的文献【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme IsDistributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；酵母polδ复合酶可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryotic leading and laggingstrand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but havecomparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到；
人polη聚合酶可根据公开的文献【Hoffman PD,et al.Biochemical evolution of DNApolymerase eta:properties of plant,human,and yeast proteins.Biochemistry，2008，47(16)：4583-4596】制备得到；
真核DNA复制蛋白A（RPA）包括：酵母DNA复制蛋白A和人DNA复制蛋白A（人体和酵母的RPA都是重组的，在大肠杆菌中表达）；其中，酵母DNA复制蛋白A可根据公开的文献【OlgaChilkova,et al.The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loadedonto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in thepresence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到，人DNA复制蛋白A可根据公开的文献【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到。
本发明中，酵母RFC和人RFC，酵母PCNA和人PCNA，酵母RPA和人RPA，人polδ，和T4噬菌体紫外敏感酶1、2是由大肠杆菌体系表达纯化。
另外，所述步骤（2）中，得到所需的扩增DNA包括：人Rad18B基因。
本发明的有益效果如下：
（1）实现了在常温下DNA的扩增，在资源有限（没有PCR仪器或者没有熟练操作人员）的情况下，使扩增DNA成为可能；
（2）由于有DNA链复制环极大改进了DNA复制的速度和效率，克服了常温DNA扩增依赖ATP再生系统，反应体系不稳定，容易引发副反应等弊端，从而缩短反应时间，得到特异性扩增产物；
（3）不需要特别的能量体系，简化了DNA引物配对以及DNA聚合酶复合物延伸的过程。
附图说明
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1是常规PCR与本发明的室温扩增DNA的电泳图；其中，1为分子量标准，
2为模板0.2ng/μL（10000000拷贝数/μL），3为模板0.02ng/μL（1000000拷贝数/μL），4为模板0.002ng/μL（100000拷贝数/μL），5为模板0.00002ng/μL（1000拷贝数/μL），6为模板0.0002ng/μL（10000拷贝数/μL），7为模板0.000002ng/μL（100拷贝数/μL），8为模板0.0000002ng/μL（10拷贝数/μL），9为模板0.00000002ng/μL（1拷贝数/μL），10为模板0.000000002ng/μL（0.1拷贝数/μL），11为模板0（阴性对照），且2-11为常规PCR扩增，12为本发明的室温DNA扩增、模板0.000002ng/μL（100拷贝数/μL）；
图2是本发明的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1为阳性标准，2为30℃、模板0.2ng/μL（10000000拷贝数/μL），3为20℃、模板0.2ng/μL（10000000拷贝数/μL），4为37℃、模板0.2ng/μL（10000000拷贝数/μL），5为37℃、模板0.02ng/μL（1000000拷贝数/μL），6为37℃、0.002ng/μL（100000拷贝数/μL）模板，7为37℃、模板0.0002ng/μL（10000拷贝数/μL），8为37℃、模板0.00002ng/μL（1000拷贝数/μL），9为37℃、模板0.000002ng/μL（100拷贝数/μL），10为37℃、模板0.0000002ng/μL（10拷贝数/μL），11为37℃、模板0.00000002ng/μL（1拷贝数/μL），12为37℃、模板0（阴性对照）；
图3是实施例3中的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1是模板拷贝数为1拷贝数/μL，2是模板拷贝数为10拷贝数/μL，3是模板拷贝数为100/μL，4是模板拷贝数为1000/μL，5为分子量标准，6为阴性对照，7是模板拷贝数为10000/μL，8是模板拷贝数为100000/μL，9是模板拷贝数为1000000/μL；
图4是实施例4的室温DNA扩增的聚丙烯酰胺电泳图，其中，1是模板拷贝数为1拷贝数/μL，2是模板拷贝数为10拷贝数/μL，3是模板拷贝数为100/μL，4是模板拷贝数为1000/μL，5是模板拷贝数为10000/μL，6是模板拷贝数为100000/μL，7为分子量标准。
具体实施方式
以下实施例中涉及的质粒、PCR试剂、化学试剂等，如未特别说明，可采用商业产品，具体操作按照说明书进行。其他未注明的实验操作按照常规分子操作方法进行。
以下实施例中涉及的模板DNA浓度和扩增试剂的组分浓度都为在DNA扩增反应总体系（反应扩增总混合物）中的终浓度值。
以下实施例中涉及的扩增试剂中的蛋白，均可按照如下公开的文献制备：
酵母RFC和人RFC可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryotic leading andlagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanismsbut have comparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】和【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；
人PCNA可根据公开的文献【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；酵母PCNA可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryotic leading andlagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanismsbut have comparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到；
人polδ复合酶可根据公开的文献【Zhenxin Hu,et al.The Human Lagging Strand DNAPolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journal of Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到；酵母polδ复合酶可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.Theeukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-endsvia separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到；
人polη聚合酶可根据公开的文献【Hoffman PD,et al.Biochemical evolution of DNApolymerase eta:properties of plant,human,and yeast proteins.Biochemistry，2008，47(16)：4583-4596】制备得到；
酵母DNA复制蛋白A（RPA）可根据公开的文献【Olga Chilkova,et al.The eukaryoticleading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separatemechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.Nucleic Acids Res，2007，35(19)：6588-6597】制备得到；人DNA复制蛋白A（RPA）可根据公开的文献【ZhenxinHu,et al.The Human Lagging Strand DNA PolymeraseδHoloenzyme Is Distributive.The Journalof Biological Chemistry，2012，287：38442-38448】制备得到。
T4噬菌体紫外敏感酶1和T4噬菌体紫外敏感酶2，可根据公开的文献【Farid A.Kadyrov,John W.Drake.Properties of Bacteriophage T4Proteins Deficient inReplication Repair.The Journal of Biological Chemistry，2003,278:25247–25255】制备得到。
实施例1常规PCR与本发明的对比实验
一、模板DNA的制备
采用商业化的核酸抽提试剂盒（Qiagen公司），按照其说明书进行提取pUC18-Rad18B质粒的DNA。其中，该pUC18质粒上含有人体Rad18B基因。
其中，pUC18-Rad18B质粒的构建如下：
以人cDNA为模板（购自上海天裕生物科技有限公司），并以AAA TCT AGA TAT GAA TCA TTCCAG CTT TG（SEQ ID NO.1所示）和AAA GGT ACC TGT CGA CCC CGG CCC GTA G（SEQ ID NO.2所示）为上下游引物，经PCR扩增，得到人Rad18B基因扩增片段，然后，对该人Rad18B基因扩增片段以XbaI和KpnI双酶切，获得人Rad18B基因的DNA片段，然后，将该DNA片段插入pUC18质粒（购自上海天裕生物科技有限公司）中，用T4连接酶连接，转化成功后，经测序验证，获得pUC18-Rad18B质粒。
二、扩增人Rad18B基因
常规PCR与本发明室温DNA扩增中的条件如下：
1、人Rad18B基因的引物序列
正向引物（上游引物）：5'-CATTCCAGCTTTGTTCAACAATGGCCGAAACTC-3'（SEQ IDNO.3所示）
反向引物（下游引物）：5'-ATG TTT CAT CCA AAT GTG TAT GCT GAT GGT AGC-3'（SEQID NO.4所示）
2、反应体系
常规PCR的反应总体积为10μL，采用商业化的PCR反应试剂盒（购于上海天裕生物科技有限公司）进行制备，具体为：试剂盒中的2×的预混液中，加入正向和反向引物后，加入不同浓度的模板后，以超纯水补足到10μL。其中，DNA模板分别为0.2ng/μL、0.02ng/μL、0.002ng/μL、0.0002ng/μL、0.00002ng/μL、0.000002ng/μL、0.0000002ng/μL、0.00000002ng/μL（PCR反应总体系中的终浓度）；引物浓度为：250nM的上述正向引物、250nM的上述反向引物。
本实施例的室温扩增DNA的方法如下：
室温30℃下的DNA扩增的反应总体积为10μL，其中，DNA模板为0.000002ng/μL，DNA扩增中的扩增试剂是由以下的组分构成：
1）20mM pH7.5Tris-HAc
2）50mM KAc
3）3mM Mg(Ac)2
4）2mM巯基乙醇
5）质量百分比为2%的聚乙二醇（PEG）20000
6）50μM dNTPs（上海天裕生物科技有限公司）
7）250nM的SEQ ID NO.3所示的正向引物、250nM的SEQ ID NO.4所示的反向引物
8）1mM ATP
9）100nM酵母RFC
10）200nM酵母PCNA
11）100nM酵母polδ复合酶
12）2μM酵母RPA。
3、反应条件
常规PCR反应条件为：将模板DNA、引物与PCR反应试剂盒中的反应试剂混合后，在PCR仪（杭州博日PCR扩增仪）上，以95℃300秒，然后95℃60秒，55℃90秒，72℃30秒，扩增循环数为30，总耗时1小时45分钟。
本发明的室温DNA扩增的反应条件为：将模板DNA与上述扩增试剂混合，在室温（30℃）下，进行DNA扩增30分钟。
4、扩增人Rad18B基因的产物电泳检测
人Rad18B基因的扩增产物以1.5%琼脂糖电泳检测，上样量是4μL，结果如图1所示，其中，人Rad18B基因的扩增产物长度为226bp。
由图1可知，常规PCR扩增中，在目标产物前沿，有非常明显的引物二聚体，而且随着模板浓度越低，引物二聚体越明显。同时，在模板浓度低于10000拷贝数/μL时，常规PCR无法有效扩增。图1中，本发明的室温DNA扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体。
因此，本发明与常规PCR相比，具有以下优点：检测所需模板浓度低，不易于形成引物二聚体，耗时更短，可以依赖仪器。
实施例2人体基因Rad18B的室温扩增
一、模板DNA的制备
采用商业化的核酸抽提试剂盒（Qiagen公司），按照其说明书进行提取pUC18-Rad18B质粒的DNA，获得模板DNA。
其中，模板DNA在30℃孵育下，按10倍比例依次稀释，获得稀释的模板DNA。
二、室温DNA扩增
将模板DNA（包括稀释的模板DNA）与扩增试剂混合，在30℃下，进行DNA扩增30分钟（DNA扩增的反应总体积为10μL），获得人Rad18B基因的DNA扩增产物；其中，扩增试剂是由以下的组分构成：
1）20mM pH7.5Tris-HAc
2）50mM KAc
3）3mM Mg(Ac)2
4）2mM巯基乙醇
5）质量百分比为2%的聚乙二醇（PEG）20000
6）50μM dNTPs（上海天裕生物科技有限公司）
7）250nM的SEQ ID NO.3所示的正向引物、250nM的SEQ ID NO.4所示的反向引物
8）1mM ATP
9）100nM酵母RFC
10）200nM酵母PCNA
11）100nM酵母polδ复合酶
12）2μM酵母RPA
13）1μMT4噬菌体紫外敏感酶1
14）1μMT4噬菌体紫外敏感酶2。
将DNA扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶【10%（10g/100mL）非变性】电泳，结果如图2所示。该图中，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度为1拷贝数/μL时，仍然能检测出。
实施例3人体基因Rad18B的室温扩增
按照实施例2的方法进行操作，其中，将扩增试剂修改成由如下的组分所构成：
1）30mM pH7.8Tris-HAc
2）80mM KAc
3）5mM Mg(Ac)2
4）4mM巯基乙醇
5）质量百分比为3.5%的聚乙二醇20000
6）80μM dNTPs
7）500nM的SEQ ID NO.3所示的正向引物、500nM的SEQ ID NO.4所示的反向引物
8）0.8mM ATP
11）80nM人polη聚合酶
12）1.5μM人RPA
13）1μMT4噬菌体紫外敏感酶1
14）1μMT4噬菌体紫外敏感酶2。
本实施例中的DNA扩增产物，经聚丙烯酰胺凝胶（10%非变性）电泳，结果如图3所示，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度为1拷贝数/μL时，仍然能检测出。
实施例4人体基因Rad18B的室温扩增
按照实施例2的方法进行操作，其中，将扩增试剂修改成由如下的组分所构成：
1）10mM pH7.2Tris-HAc
2）20mM KAc
3）2mM Mg(Ac)2
4）1mM巯基乙醇
5）质量百分比为1%的聚乙二醇20000
6）100μM dNTPs
7）100nM的SEQ ID NO.3所示的正向引物、100nM的SEQ ID NO.4所示的反向引物
8）0.5mM ATP
9）50nM人RFC
10）100nM人PCNA
11）50nM酵母polδ复合酶
12）1μM人RPA
13）1μMT4噬菌体紫外敏感酶1
14）1μMT4噬菌体紫外敏感酶2。
本实施例中的DNA扩增产物，经聚丙烯酰胺凝胶（10%非变性）电泳，结果如图4所示，扩增产物只有226bp的产物，没有可以检测的引物二聚体，而且在模板浓度为1拷贝数/μL时，仍然能检测出。
实施例5人体基因Rad18B的室温扩增
按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为25℃，反应60分钟后，电泳检测反应产物，依然能检测出226bp的扩增产物。
实施例6人体基因Rad18B的室温扩增
按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为42℃，反应10分钟后，电泳检测反应产物，依然能检测出226bp的扩增产物。
实施例7人体基因Rad18B的室温扩增
按照实施例1的室温扩增DNA的方法，其他条件保持不变，反应温度改为25℃，反应30分钟后，电泳检测反应产物，检测出226bp的扩增产物。
Claims (8)
1.一种室温扩增DNA的方法，其特征在于，包括步骤：
（1）提取模板DNA；
（2）将模板DNA与扩增试剂混合形成扩增混合液后，进行室温DNA扩增10～60分钟，得到所需的扩增DNA；
其中，扩增试剂的组分包括：
1）10～30mM pH7.2～7.8Tris-HAc
2）20～80mM醋酸钾
3）2～5mM醋酸镁
4）1～4mM巯基乙醇
5）质量百分比为1%～3.5%的聚乙二醇20000
6）50～100μM dNTPs
7）100～500nM引物
8）0.5～1mM ATP
9）50～100nM真核DNA扩增环状复合物RFC
10）100～200nM增殖细胞核抗原PCNA
11）50～100nM polδ复合酶或人polη聚合酶
12）1～2μM真核DNA复制蛋白A。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，扩增试剂的组分，还包括：
13）0.5～2.5μM T4噬菌体紫外敏感酶1；
14）0.5～2.5μM T4噬菌体紫外敏感酶2。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）的扩增混合液中，模板DNA的浓度为2×10-8ng/μL～10ng/μL。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，室温的温度范围为25～42℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，扩增试剂的组分浓度值是在扩增混合液中的终浓度值。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，引物包括：一对上游引物和下游引物。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，真核DNA扩增环状复合物RFC包括：酵母RFC和人RFC；
增殖细胞核抗原PCNA包括：酵母PCNA和人PCNA；
polδ复合酶包括：酵母polδ复合酶和人polδ复合酶；
真核DNA复制蛋白A包括：酵母DNA复制蛋白A和人DNA复制蛋白A。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中，得到所需的扩增DNA包括：人Rad18B基因。
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