CN102181530B - 用于cho细胞dna残留检测的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于CHO细胞DNA残留检测的试剂盒及其使用方法。本发明的试剂盒包括：DNA提取液、PCR扩增反应液、CHO细胞基因组DNA定量参考品、阴性质控品、阳性质控品和DNA稀释液。本发明的试剂盒以EvaGreen为荧光染料，通过实时定量PCR技术检测CHO细胞基因组DNA。可以精确定量检测来源于CHO细胞的治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品。

Description

用于CHO细胞DNA残留检测的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及一种定量检测CHO细胞DNA(即中国仓鼠卵巢细胞基因组DNA)残留的试剂盒及其使用。

背景技术

通过哺乳动物细胞培养表达制备治疗性重组蛋白质药物已经成为当今生物制药领域的主流技术，目前已经上市和正在进行临床试验的蛋白质药物中，70％来自于哺乳动物细胞，而这其中CHO细胞是最常用的细胞系。CHO细胞来源于中国仓鼠的卵巢细胞，目前，它是重组蛋白质生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：1)具有准确的转录后修饰功能，表达的药物蛋白能通过CHO细胞进行糖基化修饰，其产物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；2)表达产物分泌于培养液中，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的表达稳定；4)具有贴壁和悬浮生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，能在无血清培养基中高密度培养，且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。目前已有数十种CHO细胞表达和生产的产品投放市场，例如促红细胞生成素(EPO)、白细胞介素(IL)、凝血因子(VII，IX)、治疗性单克隆抗体(如：Avastin、Erbitux、Herceptin、Rituxan)等。

为了确保治疗性重组蛋白质药物的产品质量，欧美食品和药品管理局以及我国国家食品药品监督管理局都对药品中宿主细胞残留DNA量提出了明确的要求。分子杂交分析以及

immunoassay分析具有灵敏度低、耗费时间长、不易定量检测等缺陷。

定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术是一种在PCR反应体系中加入荧光染料，利用荧光信好积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术具有灵敏度高、特异性强、结果准确、自动化程度高和实时性等特点。SYBR Green是一种最为常用的燃料，但因其与DNA亲和力强，故通常对PCR反应有抑制作用；Taqman探针灵敏度较高，特异性强，但其价格昂贵，国外相关试剂盒每个96孔板的检测价格大于3000美元，极大地限制了其使用。

本发明的荧光PCR方法克服上述已有定量PCR检测方法灵敏度低、实施费用高等缺点，提供一种简单、廉价、准确率高的定量荧光PCR检测方法以及用于该方法的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种使用实时荧光PCR技术来定性与定量检测CHO细胞DNA的试剂盒，特别是本试剂盒可用于检测治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品CHO细胞残留DNA，从而对重组蛋白质药物生产过程进行质量监测。

本发明的试剂盒以EvaGreen为荧光染料，基于实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术快速、准确、定量检测重组的治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体中CHO细胞残留DNA含量的试剂盒。

本发明试剂盒的基本原理是利用一对靶多核苷酸的特异性引物，在本试剂盒PCR扩增反应液中，通过荧光定量PCR扩增仪实现靶核苷酸的循环扩增，从而达到快速、定量检测多核苷酸的目的。

本发明所提供的检测重组蛋白样品中CHO细胞残留DNA的试剂盒包括：分别装有PCR扩增反应液、CHO细胞基因组DNA定量参考品、阴性质控品、阳性质控品以及DNA稀释液的多个试剂瓶或管，所述试剂瓶或管加盖密封。

所述PCR扩增反应液含有Taq酶、EvaGreen荧光染料、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺、PCR缓冲液、正向引物和反向引物，所述正向引物和反向引物为Genebank登录号为EF540878.1序列的特异性引物。所述正向引物与反向引物之间相距30-250个碱基。所述PCR扩增反应液能和该对引物的靶序列结合，产生高度灵敏、特异性高的检测信号。

所述DNA稀释液可为常规。优选由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中Tris-HCl浓度为5.0-10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5-1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0-8.5。该DNA稀释液能高效稀释低浓度的DNA样品，而且适合于PCR扩增。

进一步的，所述特异性引物是根据Genebank登录序列(登录号：EF540878.1)，通过引物设计软件设计的，特异性引物包括正向引物CHO-F和反向引物CHO-R：

CHO-F：5’-CTGGCAGACATCTAAATATC-3’(SEQ ID NO：1)，

CHO-R：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：2)。

PCR扩增反应液中，引物、Taq酶、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺及PCR缓冲液均为常见组分，其含量亦为常规。一般而言，Taq酶用量为50000-200000U/L，dNTP含量为0.1-0.5mM/L，Mg²⁺浓度为3.0-6.0mM/L，引物总浓度为0.4-2.0μmol/L，PCR缓冲液则稀释为1X。

Rox染料及EvaGreen染料均可经市售途径购买获得，市售染料会有不同的浓缩倍数(如20X，50X)，在配置PCR扩增反应液时，一般使染料在PCR扩增反应液中的终浓度为1X左右即可。

优选的，所述PCR扩增反应液中，正向引物浓度为0.2-1.0μmol/L，反向引物浓度为0.2-1.0μmol/L。

PCR扩增反应液可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物及染料配置获得。

本发明的试剂盒可与常规市购DNA提取试剂盒组合使用，也可进一步包括DNA提取液，所述DNA提取液可采用常规市购的DNA提取试剂盒中所含试剂。

CHO细胞基因组DNA定量参考品含有已知浓度的CHO细胞基因组DNA，较佳的，CHO细胞基因组DNA的浓度为1.0×10⁷-5.0×10⁷fg/μl。

所述阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，较佳的，CHO细胞基因组DNA浓度大于3.0×10²fg/μl。

所述阴性对照品为不含CHO细胞基因组DNA的溶液，如纯水。

本发明进一步公开了上述试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1)对待检样本提取DNA，并将提取的DNA溶解于DNA稀释液或纯水中获得待检样本DNA溶液；提取样品DNA时，同时提取阳性质控品及阴性质控品DNA，阴性质控品用于判断提取过程中有无污染，阳性质控品用于测定提取收率；

2)将CHO细胞基因组DNA定量参考品采用DNA稀释液梯度稀释；

3)将待检样本DNA溶液、CHO细胞基因组DNA定量参考品梯度稀释液分别加入PCR扩增反应液在荧光定量PCR仪上进行PCR反应；

4)根据定量参考品的荧光信号获得标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

所述待检样本包括但不限于CHO细胞表达或生产的治疗蛋白质药物、重组疫苗及单克隆抗体等产品。

所述步骤3)PCR反应体系可为：总体积25μl，其中PCR扩增反应液15.5μl，待检样品DNA溶液9.5μl。

所述步骤3)PCR反应条件可为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃40s，40个循环。

本发明提供的实施荧光定量PCR试剂盒可以监测出CHO细胞DNA最低浓度为3.0fg/ul，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对CHO细胞基因组DNA保守区设计的特异引物，可以检测出CHO细胞基因组DNA，但不能检测出非CHO细胞基因组DNA，表明本试剂盒具有较高的特异性。

本发明提供的实时荧光定量PCR检测试剂盒可以检测重组蛋白药物产程中间样品、半成品、成品等样品中的CHO细胞残留DNA；可以为重组蛋白药物的生产提供可靠的质控证据，为重组蛋白药物研发和安全生产提供重要支持。

附图说明

图1参考品扩增曲线。扩增曲线有明显的指数增长期，呈S型，每个浓度的扩增曲线均匀叠和在一起，表明试剂盒重复性好。

图2参考品溶解曲线。溶解曲线为单一峰，无引物二聚体。

图3显示线性与灵敏度参考品扩增结果的标准曲线。由图可知，当样品浓度为3.0×10⁵fg/μl，3.0×10⁴fg/μl，3.0×10³fg/μl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，3.0fg/μl时，样品的Ct值为15-32之间，检测下线低于3.0fg/ul。绘制得到的标准曲线斜率为-3.38，相关系数(R²)＝0.997，在Y轴截距为34.452，扩增效率为97.457％。

图4显示检测方法特异性的扩增曲线。

图5显示样品定量分析标准曲线。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步说明，所列实例旨在举例说明而不是限制本发明。

实施例1：

荧光定量PCR法检测CHO细胞DNA残留的引物设计及参考品制备

1、材料

DNTPs、Taq DNA聚合酶、荧光染料及PCR缓冲液购自美国BioRad公司，7500Fast荧光定量PCR仪为美国应用生物系统公司产品，DNA稀释液采用分析纯试剂配制，基因组DNA提取试剂盒为美国Bio-Tek公司产品。

2、引物及探针的设计与合成

以Genebank登录序列(Genebank登录号EF540878.1)为模板，使用Primer Primer 5.0软件(美国PremierBiosoft公司)设计PCR引物，通过预实验，从中选择最佳组合：

CHO-F：5’-CTGGCAGACATCTAAATATC-3’(SEQ ID NO：1)，

CHO-R：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’(SEQ ID NO：2)。

引物由上海生工生物工程有限公司合成。

3、检测参考品制备及检测

培养CHO细胞，离心收集细胞，用PBS无菌洗涤2次，按基因组DNA提取试剂盒说明书提取CHO细胞基因组DNA，分光光度法测定其在260nm(A-260)测定其浓度并稀释成30ng/μl(3.0×10⁷fg/μl)，-20℃分装储存，作为参考品使用。

取7支新的1.5ml低吸附离心管，分别标记为SD0、SD1、SD2、SD3、SD4、SD5、SD6，向每管中各加入45μl DNA稀释缓冲液(Tris-HCl 10mM/L，EDTA 1mM/L，pH为8)。SD0管中加入5μl CHO DNA Control，涡旋混匀器充分混匀，之后每一管依次加入5μl上一浓度梯度稀释液，各管加入DNA后均用涡旋混匀器充分混匀，再进行下一个梯度稀释。

参考品制备后，在ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。

PCR体系：

PCR缓冲液(10X)2.5μl；dNTP(2mM/L)2.0μl；MgCl₂(50mM/L)2μl；EvaGreen染料(20X)1.25μl；Rox染料(50X)0.5μl；正向引物(10μmol/L)1μl；反向引物(10μmol/L)1μl；Tap酶(50U/μl)0.1μl；模板9.5μl；纯水5.15μl。

PCR条件：95℃预变性10min；95℃15s，60℃40s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。分析标准曲线和溶解曲线。实验结果如图1，图2所示。

实施例2：荧光定量PCR法检测CHO细胞残留DNA的应用及其特异性分析

1、制备包括以下组成成分的试剂盒：

DNA稀释液(1ml/管)1管、PCR扩增反应液(1ml/管)1管、阴性质控品(150μl/管)2管、阳性质控品(150μl/管)2管、定量参考品(50μl/管)1管。

阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，浓度为3.0×10⁵fg/ul。

所述阴性对照品为纯水。

定量参考品为CHO细胞基因组DNA，浓度为3.0×10⁷fg/ul。

DNA稀释液(选自以下任一)：

配方一：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为5.0mM/L，EDTA的浓度为1.0mM/L，用NaOH溶液调节pH为8.5。

配方二：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为8mM/L，EDTA的浓度为0.7mM/L，用NaOH溶液调节pH为8。

配方三：以去离子水为溶剂，Tris-HCl浓度为10.0mM/L，EDTA的浓度为0.5mM/L，用NaOH溶液调节pH为6.0。

PCR扩增反应液：Taq酶100000U/L，dNTP含量为0.5mM/L，Mg²⁺浓度为5mM/L，Rox染料(50X)20ml/L，EvaGreen染料(50X)20ml/L，PCR缓冲液(10X)100ml/L，正向引物浓度为0.5μmol/L，反向引物浓度为0.5μmol/L，混合配置。

2、样品采集、运送和保存

样品采集：包括各种用CHO细胞做为宿主细胞生产的重组蛋白药物半成品、成品等，按照国家生物制品检定所取样要求进行操作，密封送检。用作分析本方法特异性所用细胞株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)、质粒为本实验室自制。

样品保存和运送：样品可立即用于检测，也可保存于-20℃待检，保存期为6个月。样品运送时应保存于0℃-8℃。

3、检测步骤

a)样品处理与DNA提取

本例测定样品包括293细胞基因组DNA(30pg/μl)，Wil2-S细胞基因组DNA(30pg/μl)，正常人血清基因组DNA(批号：CP18)，pHLX101质粒(107拷贝/μl)，利妥昔单克隆抗体成品(Roche公司，批号：B6029)，HLX-01单克隆抗体半成品(本公司生产，批号：RS20110102)，CHO细胞基因组DNA样品(100pg/μl)。采用磁珠富集法提取DNA。提取样品时，同时提取阳性质控品及阴性质控品，阴性质控品用于判断提取过程中有无污染，阳性质控品用于测定提取收率。

所有待检样品均需通过提取后溶解于试剂盒所带DNA稀释液或纯水中。

b)PCR扩增与结果分析

每次检测均应设立参考品，阴性质控品和阳性质控品。参考品使用时用DNA稀释液(配方二)稀释成7个浓度梯度，分别为3.0×10⁵fg/μl，3.0×10⁴fg/μl，3.0×10³fg/μl，3.0×10²fg/μl，3.0×10¹fg/μl，3.0fg/μl及0.3fg/μl。

参考品制备后，将参考品和PCR扩增反应液加入到96孔PCR反应板中，总体积25μl，其中PCR扩增反应液15.5μl，待检样品DNA溶液9.5μl。在ABI 7500Fast型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，条件为95℃预变性10min；95℃15s，60℃40s，40个循环。同时加参考品检测作标准曲线。

反应结束后保存检测数据文件。根据PCR扩增结果所得到的曲线图调节分析参数，使标准曲线窗口下的标准曲线达到最佳(即相关系数大于0.97，扩增效率介于95％-105％之间)。测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测样品中CHO细胞DNA残留量，样品检测结果如附图4、图5所示，其中293细胞基因组DNA，Wil2-S细胞基因组DNA，正常人血清基因组DNA，pHLX101质粒，利妥昔单克隆抗体成品，HLX-01单克隆抗体原液，检测结果Ct值均低于检测下限，可以判定为阴性；CHO细胞基因组DNA样品的Ct值为16.95，参照同一次实验中线性定量参考品的标准曲线图，可以判定样品中CHO细胞残留DNA的浓度为104.4pg/μl。

本发明是结合实施例进行描述的，根据本发明的内容，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种检测CHO细胞残留DNA含量的试剂盒，包括：PCR扩增反应液、CHO细胞基因组DNA定量参考品、阴性质控品、阳性质控品和DNA稀释液；所述PCR扩增反应液含有Taq酶、EvaGreen荧光染料、dNTPs、Rox染料、Mg²⁺、PCR缓冲液、正向引物CHO-F和反向引物CHO-R，：

CHO-F的核苷酸序列为：5’-CTGGCAGACATCTAAATATC-3’，

CHO-R的核苷酸序列为：5’-TAGCAGACACTGTTGTAGAG-3’；

所述CHO细胞基因组DNA定量参考品含有浓度为1.0×10⁷-5.0×10⁷fg/μl的CHO细胞基因组DNA；

所述阳性质控品为CHO细胞基因组DNA，且CHO细胞基因组DNA浓度为3.0×10⁵fg/ul；

所述阴性质控品为纯水。

2.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述DNA稀释液由EDTA、NaOH和Tris-HCl溶液配制而成，其中EDTA为0.5-1.0mM/l,Tris-HCl为5.0-10.0mM/l，pH为6.0-8.5。

3.如权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增反应液中，正向引物浓度为0.2-1μmol/l，反向引物浓度为0.2-1μmol/l。

4.如权利要求1-3任一所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括DNA提取液。

5.如权利要求1-4任一权利要求所述的试剂盒的使用方法，包括下列步骤：

1）对待检样本提取DNA,并将提取的DNA溶解于DNA稀释液或纯水中获得待检样本DNA溶液；提取样品DNA时，同时提取阳性质控品及阴性质控品DNA，阴性质控品用于判断提取过程中有无污染，阳性质控品用于测定提取收率；

2）将CHO细胞基因组DNA定量参考品采用DNA稀释液梯度稀释；

3）将待检样本DNA溶液、CHO细胞基因组DNA定量参考品梯度稀释液分别加入PCR扩增反应液在荧光定量PCR仪上进行PCR反应，PCR反应条件为：95℃预变性10min；95℃15s，60℃40s，40个循环；

4）根据定量参考品的荧光信号获得标准曲线，计算得到待检样本中CHO细胞DNA的量。

6.如权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述待检样本为CHO细胞表达或生产的重组疫苗或单克隆抗体产品。

7.如权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤3）中，PCR反应体系为：总体积25μl，其中PCR扩增反应液15.5μl，待检样本DNA溶液9.5μl。

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