CN101760567A - 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒 - Google Patents

奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN101760567A
CN101760567A CN201010300843A CN201010300843A CN101760567A CN 101760567 A CN101760567 A CN 101760567A CN 201010300843 A CN201010300843 A CN 201010300843A CN 201010300843 A CN201010300843 A CN 201010300843A CN 101760567 A CN101760567 A CN 101760567A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pcr
hepatitis
dairy cow
reagent kit
diagnostic reagent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201010300843A
Other languages
English (en)
Other versions
CN101760567B (zh
Inventor
谭诗文
蔡一鸣
余波
冉懋韬
艾玉萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Original Assignee
GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE filed Critical GUIZHOU FARMING ANIMAL SCIENCE AND VETERINARY RESEARCH INSTITUTE
Priority to CN 201010300843 priority Critical patent/CN101760567B/zh
Publication of CN101760567A publication Critical patent/CN101760567A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN101760567B publication Critical patent/CN101760567B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它包括40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，40μL等体积混合的引物P3、P4，引物P3、P4的浓度均为20μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。本发明采用PCR对样品进行检测，通过检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品中所含有的奶牛乙型肝炎病毒的目的。本发明检测结果准确、特异，检测方式简单，使用效果好。

Description

奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒。
背景技术
乙型肝炎是一种全球性传染性疾病，我国是乙肝病毒感染的高发地区，人类HBsAg阳性率平均为10.1％，HBV是对人类健康危害最严重的病毒之一，长期以来人们普遍认为病毒只感染人和黑猩猩，而不感染其它动物。但近年来兽医学界有关畜禽感染HBV的报道日益增多。国内很多学者在牛、羊、猪和家禽等多种动物血清中检测出人乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原。乙肝病毒属于嗜肝DNA病毒，它的基因组为3.2kb。由双链的环状DNA组成，含有4个开读框分别编码乙肝病毒的表面蛋白S、核蛋白C、反转录酶P和X蛋白。S基因位于核甘酸第155～833位，编码226个蛋白，由于S基因编码的HBsAg可以诱导保护性抗体的产生，是乙型肝炎疫苗的主要成分，也是诊断HBV感染的主要依据之一，所以乙型肝炎病毒S基因及表面抗原与临床的关系的研究一直是国内外关注的热点。ELISA HBV法检测血清免疫学标志物在临床上得到了广泛应用，因此，准确、迅速诊断对乙肝的治疗和预后显得极为重要。目前关于人HBV检测技术的研究报道较多，而奶牛类HBV的PCR诊断方法未见报道，因此急需快速、准确、特异的奶牛乙型肝炎诊断试剂盒。
发明内容
本发明的目的是：提供一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它可以在快速检测到乙型肝炎病毒，并且准确、特异。
本发明是这样实现的：奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它包括40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，40μL等体积混合的引物P3、P4，引物P3、P4的浓度均为20μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。
缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
阴性对照为超纯水。
阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。
PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2以及0.05U的Poymerase/uL。
引物P1、P2的序列分别为P1：5’-GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3’，P2：5’-ACCACTGAACAAATGGCACT-3’。
引物P3、P4的序列分别为P3：
5’-ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3’，P4：5’-AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3’。
套式PCR的建立
套式PCR反应在25μL反应体系中最佳反应条件为，退火温度55℃，Taq DNApolymerase1U，引物浓度10μmol/L能有效扩增出了其目的片段，分别为509bp、240bp，引物间无非特异性片段产生(见图1)。结果表明奶牛乙肝套式PCR检测方法建立成功。
敏感性试验
应用TIANamp病毒基因组DNA提取试剂盒从奶牛血清中提取的奶牛类HBV病毒DNA，用蛋白质核酸仪测定浓度后，经5倍系列稀释的病毒核酸用于套式PCR敏感性试验。第一次PCR扩增产物在509bp附近有DNA亮带，奶牛类HBV模板最低检测量为1pg(见图2)。在509bp附近没有DNA亮带，以第一次PCR产物作为模板进行第二次PCR扩增，产物在240bp附近有DNA亮带，结果建立的奶牛类HBV病毒套式PCR能检测到初始模板0.32fg的病毒(见图3)。结果表明建立的PCR敏感性高。
特异性试验
以人HBV、奶牛类HBV、CBPP、TB，BVDV反转录为cDNA为模板，应用引物P-1、P-1、P-2、P-3、P-4分别进行第1次PCR扩增和套式PCR反应。结果，以人HBV、奶牛类HBV DNA均扩增出各病毒的特异性条带，以BVDV、CBPP、TB为模板分别进行套式PCR反应均未扩增出条带(见图4、图5)。结果表明建立的PCR特异性强。
试剂盒的保存期检测
将试剂盒保存在4℃、-20℃分别于1月、3月、6月、1年，对阳性样品进行检测，4℃保存1年条带较淡，-20℃保存1月、3月、6月、1年条带亮度无影响。
根据GenBank中人HBV S基因，设计了2对引物，通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测奶牛类HBV的套式PCR诊断方法。结果表明，该方法第1次PCR扩增的敏感性是1pg，第2次PCR敏感性是0.32fg，扩增产物分别为509bp、240bp，而牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛传染性胸膜肺炎(CBPP)、牛结核杆菌(TB)的扩增结果均为阴性。本试剂盒具有很好的特异性，其敏感性比常规PCR(第1次PCR)提高了56倍，为兽医临床诊断奶牛类HBV提供一种快速、准确的方法，并为开展大规模的奶牛类HBV流行病学调查与疫情监测提供技术依据。同时目前未见奶牛类HBV病毒大量培养的报道，奶牛类HBV难以获得大量病原体。本研究得到HBV-S质粒作为PCR的阳性模板，用于临床检测具有很高的安全性和应用价值。
由于采用了上述技术方案，本发明采用PCR对样品进行检测，通过检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测样品中所含有的奶牛乙型肝炎病毒的目的。本发明检测结果准确、特异，检测方式简单，使用效果好。
附图说明
附图1为HBV套式PCR电泳结果；
M：DL2000分子质量标准；1：人HBV PCR产物；2：奶牛HBV PCR产物；3：人HBV PCR产物；4：奶牛HBV PCR产物；5：空白水对照。
附图2为第1次PCR扩增的敏感试验；
M：DL2000分子质量标准；1：奶牛HBV PCR产物2：空白水对照；3～9∶5-1～5-7稀释的病毒DNA PCR结果。
附图3为第2次PCR扩增的敏感试验；
M：DL2000分子质量标准；1：奶牛HBV PCR产物2：空白水对照；3～9∶5-7～5-12稀释的病毒DNA PCR结果；
附图4为第1次PCR扩增的特异性试验；
M：DL2000分子质量标准；1：人HBV PCR产物；2：奶牛HBV PCR产物；3：BVDV PCR产物；4：CBPP PCR产物；5：TB PCR产物；6：阴性对照；
附图5为第1次PCR扩增的特异性试验；
M：DL2000分子质量标准；1：人HBV PCR产物；2：奶牛HBV PCR产物；3：BVDV PCR产物；4：CBPP PCR产物；5：TB PCR产物；6：阴性对照。
具体实施方式
本发明的实施例：奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，它包括40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的序列分别为P1：5’-GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3’，P2：5’-ACCACTGAACAAATGGCACT-3’，引物P1、P2的浓度均为20μM，40μL等体积混合的引物P3、P4，引物P3、P4的序列分别为P3：5’-ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3’，P4：5’-AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3’，引物P3、P4的浓度均为20μM，采用50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液600μL作为缓冲液，采用20μL超纯水作为阴性对照，250μL天根生化科技(北京)有限公司的PCR MasterMix产品的PCR酶，它组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2、25mM的dNTP Mixture以及0.05U的Poymerase/uL，超纯水170μL；50μL的MarkerDL2000；采用20μL重组pMD18-T-HBV-S质粒作为阳性对照。

Claims (7)

1.一种奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：它包括40μL等体积混合的引物P1、P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，40μL等体积混合的引物P3、P4，引物P3、P4的浓度均为20μM，缓冲液600μL，阴性对照20μL，PCR酶250μL，超纯水170μL，50μL的MarkerDL2000以及阳性对照20μL。
2.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：缓冲液为50mM的Tris-HcL及150mM的NaCL的混合溶液。
3.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：阴性对照为超纯水。
4.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：阳性对照为重组pMD18-T-HBV-S质粒。
5.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：PCR酶的组成包括10mM的Tris-HcL、50mM的KCL、1.5mM的MgCL2、25mM的dNTP Mixture以及0.05U的Poymerase/uL。
6.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：引物P1、P2的序列分别为P1：5’-GTGTTACAGGCGGGGTTTTT-3’，P2：5’-ACCACTGAACAAATGGCACT-3’。
7.根据权利要求1所述的奶牛乙型肝炎PCR快速诊断试剂盒，其特征在于：引物P3、P4的序列分别为P3：
5’-ACCAAGGTATGTTGCCCGTT-3’，P4：5’-AAATGGCACTAGTAAACTGAGCCA-3’。
CN 201010300843 2010-01-28 2010-01-28 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒 Expired - Fee Related CN101760567B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010300843 CN101760567B (zh) 2010-01-28 2010-01-28 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 201010300843 CN101760567B (zh) 2010-01-28 2010-01-28 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN101760567A true CN101760567A (zh) 2010-06-30
CN101760567B CN101760567B (zh) 2013-04-10

Family

ID=42491945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 201010300843 Expired - Fee Related CN101760567B (zh) 2010-01-28 2010-01-28 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN101760567B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104867A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104867A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN101760567B (zh) 2013-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mochizuki et al. Genotypes of canine distemper virus determined by analysis of the hemagglutinin genes of recent isolates from dogs in Japan
CN105018489B (zh) 鉴别布鲁氏菌野毒株与疫苗株a19和s2的试剂盒
CN107299155A (zh) 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针
Alvarado et al. Molecular characterization of avian infectious bronchitis virus strains isolated in Colombia during 2003
CN103215379B (zh) 腹泻病毒检测试剂盒及检测方法
CN103160615A (zh) 用于同时检测牛传染性鼻气管炎病毒和赤羽病毒的多重pcr引物及其设计方法
Chobe et al. Investigation of a hepatitis A outbreak from Shimla Himachal Pradesh
Zhang et al. Validation of a loop-mediated isothermal amplification assay for visualised detection of wild-type classical swine fever virus
CN107475456A (zh) 基于等温逆转录重组酶聚合酶扩增法的pedv快速检测方法及其试剂盒
CN104673934A (zh) 锦鲤疱疹病毒的rt-lamp检测引物组、试剂盒及其检测方法
Simon et al. Molecular tracing of classical swine fever viruses isolated from wild boars and pigs in France from 2002 to 2011
Liu et al. First report of border disease virus in Melophagus ovinus (sheep ked) collected in Xinjiang, China
CN106167837A (zh) 牛病毒性腹泻‑粘膜病病毒的实时荧光定量pcr检测试剂盒及其专用引物和探针
Zhang et al. Development of a loop-mediated isothermal amplification for visual detection of the HCLV vaccine against classical swine fever in China
Chen et al. A multiplex reverse transcriptase–PCR assay for the genotyping of avian infectious bronchitis viruses
CN102337342A (zh) 用于诊断和鉴别牛巴贝斯虫种类的试剂盒及制备方法
Fowler et al. Characteristics of a foot-and-mouth disease virus with a partial VP1 GH loop deletion in experimentally infected cattle
CN105648118B (zh) 一种TaqMan荧光定量PCR检测嵌合型猪圆环病毒1-2的方法
Hakhverdyan et al. Evaluation of a single-tube fluorogenic RT-PCR assay for detection of bovine respiratory syncytial virus in clinical samples
CN108315306A (zh) 一株高繁殖能力猪瘟病毒及其构建方法
CN106435007A (zh) 一种荧光定量pcr检测猪丹毒杆菌的引物、探针、试剂盒及方法
CN101760567B (zh) 奶牛乙型肝炎pcr快速诊断试剂盒
CN110511987A (zh) 一种基于特异性基因靶标lmo1341的单增李斯特菌的PCR检测方法
CN103397109A (zh) 猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒多重rt-pcr检测引物及试剂
CN103215389B (zh) 猪繁殖与呼吸综合症和猪乙型脑炎双重一步法rt-pcr诊断试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20130410

Termination date: 20170128

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee