CN106716128A - 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途 - Google Patents

加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN106716128A
CN106716128A CN201580032914.9A CN201580032914A CN106716128A CN 106716128 A CN106716128 A CN 106716128A CN 201580032914 A CN201580032914 A CN 201580032914A CN 106716128 A CN106716128 A CN 106716128A
Authority
CN
China
Prior art keywords
labels
hepadnavirus
seq
nucleic acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201580032914.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106716128B (zh
Inventor
H·郭
D·蔡
A·库科纳蒂
C·季
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Drexel University
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Drexel University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG, Drexel University filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN106716128A publication Critical patent/CN106716128A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106716128B publication Critical patent/CN106716128B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/576—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for hepatitis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/42—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a HA(hemagglutinin)-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/005—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB
    • C12N2830/006—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination repressible enhancer/promoter combination, e.g. KRAB tet repressible
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/02—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明涉及筛选抗嗜肝DNA病毒物质的方法和用途，其中对该物质筛选抑制嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒)共价闭合环状(ccc)DNA的能力。所述方法和用途利用包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，如乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。另外，本发明提供了编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列和因而编码的蛋白质。还提供用于筛选方法中的试剂盒。

Description

加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途
本发明受美国政府支持在美国国家健康研究所资助的合同号R01AI094474下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。
本发明涉及筛选抗嗜肝DNA病毒物质的方法和用途，其中物质是乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制剂，所述抑制剂在本发明中所述的细胞系中优势地为共价闭合环状(ccc)DNA依赖性并且可能充当cccDNA的替代标记，其中对所述替代标记筛选抑制嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒(HBV))ccc DNA的能力。所述方法和用途利用包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，如乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。另外，本发明提供了编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列和因此编码的蛋白质。还提供用于筛选方法中的试剂盒。
慢性乙型肝炎目前是重大公共卫生负担，全球侵袭大约35000万个体并且在美国侵袭至少120万个体。这些患者具有升高的肝硬化、肝细胞癌(HCC)和其他严重临床后遗症风险(1,2,12,14)。每年，全球存在约1百万例因HBV相关肝病所致的死亡。因此，全球健康优先事项是治愈慢性HBV感染并阻止其可怕结果。
乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非细胞病变性、嗜肝DNA病毒。嗜肝DNA病毒是可以在人类和动物中造成肝感染的有包膜双链病毒科。嗜肝DNA病毒共有相似的基因组结构。它们具有部分为双链环状DNA的小基因组。基因组由两条DNA链组成，一条链具有负义方向，另一条链具有正义方向。复制涉及称作前基因组RNA的RNA中间体逆转录(15,19)。编码三个主要可读框(ORF)并且病毒具有五种已知的mRNA(18,19)。
一旦感染，则病毒基因组松弛型环状(rc)DNA运输入细胞核并转化成附加体性共价闭合环状(ccc)DNA，其充当病毒全部mRNA的转录模板，尤其是3.5-3.6kb编码作为HBeAg前体的前核心蛋白的前核心蛋白mRNA；3.5kb编码核心蛋白和病毒聚合酶的前基因组(pg)RNA；2.4kb/2.1kb编码病毒包膜蛋白(大抗原(L)、中等抗原(M)和小(S)抗原)的表面mRNA；和0.7kb编码X蛋白的X mRNA(18,19)。通过移除前核心蛋白N端信号肽和C末端精氨酸丰富序列的两个蛋白酶解性事件产生HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(10,21)。在转录和核输出后，胞质病毒pgRNA随HBV聚合酶和衣壳蛋白一起装配以形成核衣壳，其内部聚合酶催化的逆转录产生负链DNA，后者随后拷贝成正链DNA以形成后代rcDNA基因组。新合成的成熟核衣壳将用病毒包膜蛋白包装并移出作为病毒粒粒子，或返回胞核以通过胞内cccDNA扩增途径放大cccDNA储备(19)。因此，慢性乙型肝炎分子基础是病毒cccDNA在感染的肝细胞的胞核中持续存在。
不存在确定的慢性乙型肝炎治愈。目前批准的HBV治疗药物是干扰素-α(IFN-α)和5种核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定和替诺福韦)。Xu(2010)JVirol(84)9332-9340公开了用小鼠干扰素治疗小鼠肝细胞。在48周标准治疗后IFN-α仅在少量患者组中实现持久的病毒学反应，并且存在明显的不良作用(9)。五种核苷(酸)类似物(NA)均充当病毒聚合酶抑制剂，但是几乎未治愈HBV感染(6)，并且耐药性的出现大幅度限制其长期效力(16,24)。现在熟知，当前疗法的主要局限是无法消除事先存在的cccDNA池和/或阻止cccDNA从痕量水平的野生型或耐药性病毒形成。因此，对于开发直接靶cccDNA形成和维持的新治疗药存在未满足的迫切需求。
Cai(2013)Methods in Mol Biol 1030(151-161)公开了从细胞培养物检出HBVccc(共价闭合环状)DNA的DNA印迹测定法。然而，迄今，抗cccDNA物质的筛选已经因缺少有效体外HBV感染模型受限，并且以高通量至中等通量模式测量cccDNA的实用方案不可得。备选地，可以在组成型或条件性复制HBV基因组的稳定转染的HBV细胞培养物(如HepG2.2.15细胞和HepAD38细胞所代表)中通过胞内扩增途径实现cccDNA形成(7,11,20)。
但是，通过DNA印迹杂交或实时PCR测定法从HBV细胞系直接检出cccDNA将经不住筛选检验，原因分别在于灵敏度问题和特异性问题。在另一方面，HepG2.2.15细胞中不存在合适的cccDNA替代标记，因为绝大部分病毒产物衍生自整合的病毒转基因，其无法与cccDNA的贡献区分。先前已经报告，分泌型HBeAg的产生在HepAD38细胞中优势地为cccDNA依赖性斌并且可能充当cccDNA的替代标记(11,23)。最近，Cai等人将改进形式的唯一依赖cccDNA产生HBeAg的细胞系(命名为HepDE19细胞(7))应用成筛选cccDNA抑制剂的96孔模式测定法并且鉴定到抑制cccDNA形成的两种小分子化合物(3)。这种工作因此提供了以下的坚实“概念验证”展示：可以通过化学分子直接靶向cccDNA生物合成，并且可以从高通量筛选计划鉴定cccDNA抑制剂。然而，现存HepDE19测定体系的某些缺点令筛选较大文库不切实际。例如，目前用于HBeAg的传统ELISA测定法需要多重操作，因氨基酸序列同源性而与病毒核心蛋白显示出某种程度的交叉反应，并且不适于较大模式基于细胞的测定法。
因此，作为本发明基础的技术问题是提供手段和方法以可靠筛选嗜肝DNA病毒cccDNA的抑制剂。
这个技术问题通过提供在权利要求书中表征的实施方案加以解决。
因此，本发明涉及一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒ccc(共价闭合环状)DNA的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选择候选分子。
这些方法总体上适用于与乙型肝炎病毒(HBV)共有相似基因构造和复制策略的其他哺乳动物及鸟类嗜肝DNA病毒，如代表性土拨鼠肝炎病毒(WHV)和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)。本文中就乙型肝炎病毒提供的解释和实验因此同样地适用于其他嗜肝DNA病毒。然而，本文中提供的教导内容在优选的实施方案中涉及“乙型肝炎病毒”/HBV。术语“嗜肝DNA病毒”、“乙型肝炎病毒”、“鸭乙型肝炎病毒”、“土拨鼠肝炎病毒(WHV)”是本领域熟知的并且因此用于本文中。缩写“HBV”、“DHBV”或“WHV”在本文中分别与完整术语“乙型肝炎病毒”、“鸭乙型肝炎病毒”和“土拨鼠肝炎病毒”互换使用。
本文优选的嗜肝DNA病毒优选地是乙型肝炎病毒(HBV)。乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非细胞病变性、嗜肝DNA病毒，即，HBV是一种嗜肝DNA病毒。HBV基因组的示例性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中显示。
本文优选的嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。术语“乙型肝炎病毒e抗原”和“HBeAg”在本文中互换地使用。HBeAg的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:16和18中显示。如本文所用，“嗜肝DNA病毒e抗原”(并且同样地“乙型肝炎病毒e抗原”)主要指蛋白质/多肽，例如具有如SEQ ID NO:18中所显示的氨基酸序列的蛋白质/多肽。
一旦感染，可以如下产生HBeAg：一旦感染，HBV病毒基因组松弛型环状(rc)DNA运输入细胞核并转化成附加体性cccDNA，其充当病毒全部mRNA的转录模板，包括3.5-3.6kb编码作为HBeAg前体的前核心蛋白的前核心蛋白mRNA。术语“ccc DNA”和“共价闭合环状DNA”在本文中互换地使用。
HBV前核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ IDNO:15和17中显示。HBV前核心蛋白具有一个N末端19氨基酸信号肽、一个10-氨基酸接头、一个中央氨基酸段和一个C末端34氨基酸精氨酸丰富结构域。
HBV核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:23和24中显示。核心蛋白对应于前核心蛋白(参见SEQ ID NO:17)，在于它包含前核心蛋白的C末端精氨酸丰富序列；然而，核心蛋白不包含前核心蛋白的N端信号肽和10氨基酸接头序列。
通过移除前核心蛋白N端信号肽和C末端精氨酸丰富序列的两个蛋白酶解性事件产生HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(21)。因此，乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对应于前核心蛋白(参见SEQ ID NO:17)，在于它包含前核心蛋白的N末端10-aa接头肽；然而，HBeAg不包含前核心蛋白的C末端精氨酸丰富序列。
慢性乙型肝炎分子基础是病毒cccDNA在感染的肝细胞的胞核中持续存在。
术语“共价闭合环状DNA”和“cccDNA”在本文中互换地使用。术语“共价闭合环状DNA”/“cccDNA”是本领域熟知的并且因此用于本文中。通常，如本文所用的“共价闭合环状DNA”/“cccDNA”指充当嗜肝DNA病毒mRNA的可靠附加体性转录模板的DNA。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是接受的HBV嗜肝DNA病毒cccDNA替代标记，所述替代标记转而反映慢性嗜肝DNA病毒感染。然而，使用HBeAg的基于细胞的已知测定法具有缺点，如与病毒核心蛋白交叉反应。
为了改善cccDNA报道分子检测法的特异性和灵敏度，本文中建立了这样的细胞系，它们支持具有标签(如N末端嵌入的血凝素(HA)表位标签)的重组HBeAg的cccDNA依赖性产生。另外，开发了检测加(HA-)标签的HBeAg的化学发光ELISA(CLIA)和AlphaLISA测定法。该测定体是适应于高通量筛选模式和完全自动化。
本文提供的方法利用建立的标签(如可以替代HA标签使用或除HA标签之外使用的HA标签、或His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签)的用途。这些标签可以用于纯化和检测加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。通过使用与标签特异性结合的抗体(例如通过ELISA测定法，如化学发光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免与核心蛋白的交叉反应。
本文提供的方法利用包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。该核酸分子可以包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的序列或甚至嗜肝DNA病毒基因组以反映嗜肝DNA病毒的cccDNA形成并且令其成为可能。本领域已知，HBV基因组具有显示重叠ORF和多个顺式元件的高度紧凑型基因构造。因此，认为基因插入/缺失或序列替换将很可能影响病毒DNA复制(13,22)。(Liu等人,J Virol.2004；78(2):642-9)(Wang等人.PLoS One.2013 2；8(4):e60306)。先前的工作已经通过GFP替换HBV序列，如在大多数情况下pol/包膜蛋白编码区，以产生重组HBV基因组，但是需要病毒蛋白的反式互补以支持病毒复制和病毒粒装配(17)(Protzer等人,PNAS(1999),96:10818-23)。另外，这种报告的重组HBV基因组仅可以产生第一轮cccDNA合成，如果用来感染容许性细胞，则cccDNA的胞内扩增被阻断，原因是缺陷型病毒DNA复制。
嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA中的5’茎-环结构(ε)是病毒复制的必需顺式元件。它充当pgRNA包装信号和DNA引发位点。ε与前核心蛋白ORF的5’部分重叠并含有衣壳(核心)蛋白ORF的起始密码子。为了在不改变HBV基因组编码的ε结构的完整性的情况下，在前核心蛋白ORF中的N端信号肽序列下游插入编码标签的核酸序列，将一个三氨基酸接头序列(GTG GAC ATC)在(HA-)标签5'末端引入其中，以替代如HBV基因组编码的ε的底部处右臂的原始病毒序列(ATGGAC ATC)。因而，维持如HBV基因组编码的ε的碱基配对并且将核心蛋白ORF的起始密码子移动到HBV基因组编码的ε下游的位置。此外，原始GGC序列安置在HA标签序列和核心蛋白AUG之间，以保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序(图1)。图1显示HBV基因组的编码ε结构的部分，其中根据本发明插入编码标签的核酸序列。
本文中构思了以上修饰对HBV pgRNA依赖性核心蛋白表达和pgRNA衣壳化造成最小影响，因为保留了ε和核心蛋白表达盒，不过核心蛋白的翻译起始位点在pgRNA模板中进一步向下游移动39-nt。实际上，重组HBV基因组支持几乎野生型水平的病毒DNA复制，并且一旦前核心蛋白ORF在cccDNA分子中重构，则成功产生加HA标签的HBeAg。
插入编码标签的寡聚物的确不影响病毒DNA应用，从而本文提供的方法允许产生cccDNA并且因此允许通过确定替代标记“加标签的嗜肝DNA病毒e抗原”的量，评估物质/候选分子抑制cccDNA形成的能力。本文提供的手段和方法主要可用于筛选及鉴定可以在与嗜肝DNA病毒相关的慢性病如(慢性)肝炎和尤其慢性乙型肝炎感染的疗法中使用的候选分子。
将编码标签(如HA标签)的核酸序列插入嗜肝DNA病毒(如HBV)前核心蛋白ORF中导致嗜肝DNA病毒(如HBV)可用于改善抗原检测特异性的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg)的cccDNA依赖性产生。在支持本发明时，本文中证实，(HA-)标签插入不影响前核心蛋白的表达及其后续翻译后加工(N端信号肽切割和C末端结构域切割)和成熟的HBeAg分泌(图2)。更重要地，本文中显示，嗜肝DNA病毒(如HBV)基因组中的这种修饰不妨碍病毒pgRNA衣壳化和逆转录，这是通过胞内扩增途径形成cccDNA的前提(图4、图6-8、图12)。
本发明涉及筛选药理学物质及评估其对抗嗜肝DNA病毒的活性。特别地，本发明描述了设计和构建用于诱导型表达HBV cccDNA依赖性表位(例如加人流感血凝素(HA)标签的HBV e抗原(HBeAg)的重组乙型肝炎病毒(HBV)基因组和新细胞系。可以定量地测量分泌入培养液的加标签的HBeAg，例如通过化学发光酶免疫测定法(CLIA)和/或AlphaLISA。本发明提供基于细胞的有效HBV报道分子系统以筛选化合物的抗嗜肝DNA病毒活性，尤其抑制cccDNA形成、维持和/或其转录活性的那些化合物。
本发明进一步由图10说明。这里，显示3TC处理消除了HepBHAe13细胞中的HA-HBeAg信号，不过这是一种其中3TC阻断病毒DNA复制并且因此无cccDNA合成的极端情况。另外，作为原理的证据，在HepBHAe13细胞中检验了两种cccDNA形成抑制剂(CCC-0975和CCC-0346)。两种化合物均剂量依赖地降低HA-HBeAg水平；参见图11。
例如，以下非限制性抗嗜肝DNA病毒测定法可以根据本发明进行：
1.使用HepBHAe细胞系筛选调节cccDNA稳定性和/或转录活性的化合物/候选分子。
根据本发明，体外测定方法可以用来筛选/评价化合物/候选分子调节胞核中cccDNA稳定性或转录活性的效力。化合物/候选分子因而改变培养上清液中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的水平。为了进行该测定法，细胞可以首先在含有四环素的培养板中接种，并且在细胞达到汇合后，培养基将更换为无四环素的培养基以诱导嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA复制和cccDNA形成，这在正常情况下耗时6-8天。此后，可以再添加四环素以关闭病毒DNA从整合型HBV基因组从头复制，同时添加3TC(或其他HBV聚合酶抑制剂)以阻断cccDNA的胞内扩增途径。在相同的时间，可以将测试化合物加入培养基持续某个时间段。培养基随后可以用于加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的ELISA测量。来自不含有测试化合物的孔的培养基可以用作对照。降低培养基中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)水平的有效化合物可以具有促进cccDNA翻转(turnover)或沉默cccDNA转录的活性。短语“有效的或有效地”可以在本文中用来显示，化合物在某个检验浓度足以阻止并且优选地减少本发明基于细胞的测定体系中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的产生至少50％、最优选至少90％。通过qPCR或杂交直接测量cccDNA和前核心蛋白mRNA的稳态水平可以用来区分测试化合物/候选化合物/候选分子是否分别减少cccDNA稳定性或转录。
2.使用HepBHAe细胞系筛选抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)cccDNA形成的化合物/候选分子。
根据本发明的另一个方面，体外测定方法可以用来评价抑制cccDNA形成的化合物/候选分子。简而言之，细胞可以接种在培养孔中并且四环素可以在细胞单层变得汇合的当日省略。同时，可以添加测试化合物并且可以在处理结束时通过ELISA测量培养基中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)(大约6天)。导致加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)减少的任何化合物表示它可以有效地阻断cccDNA的形成。作为这种体外测定方法的扩展方面，值得指出的是，在这种测定法中减少加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)还可以显示化合物具有抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA复制的潜力。可以通过DNA印迹和/或qPCR直接测量病毒核心蛋白DNA，研究这种可能性。从上文描述的测定法浮现的“命中”还可以包括影响cccDNA稳定性和/或转录的化合物。在诱导时间段期间，早期产生的cccDNA的稳定性和/或转录活性可以被检验性化合物靶向。
3.HepHA-HBe细胞系起到反筛选系统的作用。
理论上，来自前述测定法的化合物“命中”可以直接抑制加HA标签的前核心蛋白翻译、或翻译后加工、或加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)分泌。为了排除这类非cccDNA抑制剂，“命中”可以在HepHA-HBe细胞中反筛选，所述HepHA-HBe细胞使用转基因作为模板产生加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如加HA标签的HBeAg)。在另一方面，HepHA-HBe细胞还可能用来筛选HBeAg抑制剂。
术语“抑制共价闭合环状DNA”及其语法形式可以指抑制共价闭合环状DNA的稳定性(即指降低的共价闭合环状DNA稳定性)、指抑制共价闭合环状DNA的转录活性(即指使用共价闭合环状DNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少)或指抑制共价闭合环状DNA的形成(即无或更少cccDNA形成)。
术语“抑制共价闭合环状DNA”的这些示例性解释和定义不是互斥的。例如，抑制的共价闭合环状DNA形成可以导致使用共价闭合环状DNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少/与之相关(即抑制共价闭合环状DNA的转录活性)。抑制的共价闭合环状DNA稳定性可以导致使用共价闭合环状DNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少/与之相关。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以在本文中作为嗜肝DNA病毒cccDNA的任何这类抑制作用的替代标记使用。
根据上文，本文提供的方法可以用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA形成的能力。在这种情况下，细胞可以在cccDNA已经形成之前与候选分子接触。
本文提供的方法可以用于评估候选分子降低嗜肝DNA病毒cccDNA的稳定性(例如cccDNA的量或数目)的能力。这里，细胞可以在cccDNA已经形成之后与候选分子接触。
本文提供的方法可以用于评估候选分子降低嗜肝DNA病毒cccDNA转录(活性)的能力。这里，细胞可以在cccDNA已经形成之后与候选分子接触。
根据本发明待评估其水平的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有一个或多个标签。如本文中显示，可以通过使用仅一个标签，例如通过使用与该标签特异性结合的抗体，实现对加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的可靠评估。因此，本文中构思和优选加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
以下涉及一种或多种在本文待用的标签。
如本文所用的术语“标签”指可用作标志物的任何化学结构。主要地，术语“标签”指“蛋白质标签”。术语“标签”和“蛋白质标签”是本领域已知的；尤其参见Fritze CE,Anderson TR.“Epitope tagging:general method for tracking recombinantproteins”.Methods Enzymol.2000；327:3-16；Brizzard B,Chubet R.Epitope taggingof recombinant proteins.Curr Protoc Neurosci.2001年5月；第5章：第5.8单元；和/或Terpe K.Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemicalfundamentals to commercial systems.Appl Microbiol Biotechnol.2003Jan；60(5):523-33。
一般，本文待用的标签是与嗜肝DNA病毒e抗原融合的蛋白质标签。例如，编码标签的核酸可以与编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸融合，从而表达包含标签和嗜肝DNA病毒e抗原的融合蛋白。标签可以融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸内部和/或融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的3'末端。因此，所产生的融合蛋白可以在N末端、内部(即在嗜肝DNA病毒e抗原内部/作为内部表位)、和/或在C末端包含标签。如本文中显示，内部表位标签可以用于可靠评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且因此是优选的。
各种标签是本领域已知的并且可以根据本发明使用。通常，本文待用的标签具有约1-3kDa、优选地约1kDa的低分子量。示例性非限制的低分子量标签是HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签。本文中优选使用HA标签。本文待用的Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
低分子量以标签长度(即组成标签的氨基酸残基数)反映。例如，可以在本文中使用His标签(6个氨基酸)、HA标签(9个氨基酸)、FLAG-标签(8个氨基酸)、或3XFLAG标签(22个氨基酸)。这些示例性标签支持接近野生型水平的HBV DNA复制并且因此可用于实施本发明。
因此，本文待用的标签可以由6至22个氨基酸，例如6个氨基酸、7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、或22个氨基酸组成。
编码本文待用标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的编码HA标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的核酸序列、如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的编码V5标签的核酸序列、或如SEQ ID NO:6中所示的编码C9标签的核酸序列。本文中优选使用由SEQ ID NO:1编码或如SEQ ID NO:8中所示氨基酸序列组成的HA标签。
编码本文待用的Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所显示的编码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编码3×Flag标签的核酸序列。
本文待用的标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:13中所示的C9标签的氨基酸序列。
本文待用的Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所显示的1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的3×Flag标签的氨基酸序列。
本文中主要构思使用多种表位标签，如血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。表位标签是因为可以在许多不同物种中可靠产生高亲和力抗体而选择的短肽序列。这些标签经常衍生自病毒基因，这解释了它们的高度免疫反应性。这些标签特别可用于蛋白质印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学、免疫亲和色谱及免疫沉淀实验。它们还用于抗体纯化。这类表位标签特别有用，因为可以根据本发明使用与这些标签特异性结合的已知和市售抗体。
将亲和标签附加至蛋白质，从而使用亲和技术，可以从粗制生物学来源中纯化所述蛋白质。这些包括壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。聚(His)标签是一种广泛使用的蛋白质标签；它与金属基质结合。
色谱标签用来改变蛋白质的色谱特性以提供跨越特定分离技术的不同分离度。经常，这些标签由聚阴离子氨基酸组成，如FLAG-标签。
基本上可以在本文中使用任何标签。如包含于本文待用的核酸分子中的编码标签的核酸应当能够支持嗜肝DNA病毒DNA复制、cccDNA形成和cccDNA依赖性加标签的嗜肝DNA病毒抗原e产生和分泌。可以使用本文中提供的测定法例如实验中所提供的测定法，容易地验证这种能力。例如，已经在本文中展示，HA标签插入导致在稳定细胞系中野生型水平的HBV DNA复制和从cccDNA产生加HA标签的HBeAg。可以对其他标签容易证实和检验这些能力。例如，插入His标签和Flag标签的确在瞬时转染测定法中不影响病毒DNA复制。
其他标签可以在不背离本发明精神的情况下使用。
例如，报道蛋白可以用作本文中的标签，如萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶、海肾萤光素酶、长腹水蚤(Gaussia)萤光素酶、等)、绿色荧光蛋白(GFP)等。这些报道蛋白允许容易评估加标签的嗜肝DNA病毒的水平，例如通过视检、荧光测量等。荧光标签用来给出蛋白质的视觉读出结果。GFP和其变体是最常使用的荧光标签。
可以在本发明筛选方法中使用的示例性报道蛋白尤其是萤光素酶、(绿色/红色)荧光蛋白及其变体、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)、RFP(红色荧光蛋白，如DsRed或DsRed2)、CFP(青色荧光蛋白)、BFP(蓝绿色荧光蛋白)、YFP(黄色荧光蛋白)、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰转移酶。
萤光素酶是熟知的报道分子；参见，例如，Jeffrey(1987)Mol.Cell.Biol.7(2),725-737。本领域技术人员可以容易地从相应的数据库和标准教材/综述推断出在本发明的上下文中待使用的其他萤光素酶核酸序列和氨基酸序列。
报道蛋白可以通过引起可检测信号的信号强度变化，允许检测/评估抑制cccDNA的候选分子。所述可检测信号可以是荧光共振能量转移(FRET)信号、荧光偏振(FP)信号或闪烁临近(SP)信号。可检测信号可以与如上文定义的报道蛋白相关。例如，GFP可以衍生自维多利亚多管发光水母(Aequorea victoria)(US5,491,084)。编码维多利亚多管发光水母GFP的质粒从ATCC登录号87451可获得。这种GFP的其他突变形式，包括但不限于pRSGFP、EGFP、RFP/DsRed、DSRed2、和EYFP、BFP、YFP连同其他，尤其从Clontech Laboratories,Inc.(Palo Alto,California)可商业获得。
可以监测包含核酸分子的培养的细胞/组织，所述核酸分子包含编码与报道基因(如萤光素酶、GFP等)融合的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，用于报道基因转录随培养基中测试化合物/候选分子浓度变化的证据。报道基因的转录水平随测试化合物浓度变化而变动显示了测试化合物/候选分子抑制cccDNA的能力。
报道蛋白通常大于上文所述的低分子量标签，如表位标签。归因于例如包含编码萤光素酶的核酸序列的核酸分子与编码更小(表位)标签(如HA标签)的核酸序列相比插入更长，下游病毒核心蛋白和pol从重组前基因组RNA中的表达可能减少，从而可能需要核心蛋白/pol的反式互补物以恢复病毒复制。例如，在这种情况下尤其可以根据本发明使用组成型表达嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol)的细胞/细胞系。
本文中构思了使用含有两个或更多个标签的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。使用两个或更多个标签可以允许甚至更可靠和因此有利地评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。例如，如果两个或更多个标签是不同的标签(例如一个标签是HA标签，第二个标签是His标签)，则可以使用与两个标签均特异性结合的抗体。这种测定法可以因此使用例如两个表位抗体例如用于ELISA检测，以进一步增加分析特异性。
本文中发现，插入一个22氨基酸的3×FLAG标签插入物支持有效的HBV复制。因此，认为也可以在本文中使用例如串联嵌合表位标签，如HA-接头-FLAG。
根据上文，当使用两个或更多个标签(例如两个或更多个不同标签)时，一个标签可以由6至22个氨基酸组成。本文中特别地构思，本文待用的标签的总长度(即两个或更多个标签的氨基酸残基总和)不超过最大约22个氨基酸，因为下游病毒核心蛋白和pol从重组前基因组RNA中的表达可能降低，如上文报道蛋白(如萤光素酶)的上下文中所述。如果这种下游病毒核心蛋白和pol表达减少出现，例如当两个或更多个标签的总长度超过约22个氨基酸时，可能需要核心蛋白/pol的反式互补物以恢复病毒复制。例如，在这种情况下尤其可以根据本发明使用组成型表达嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol)的细胞/细胞系。
如同编码仅一个标签的核酸、编码两个或更多个标签的核酸可以融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸内部和/或融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的3'末端。标签可以由标签分隔：如果使用两个标签，则标签-接头标签，如果使用三个标签，则标签-接头-标签-接头-标签等。
因此，所产生的融合蛋白可以在N末端、内部(即在嗜肝DNA病毒e抗原内部/作为内部表位)、和/或在C末端包含两个或更多个标签。如本文中显示，内部表位标签可以用于可靠评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且因此是优选的。本文中构思了使用例如在N末端具有一个标签和例如具有第二内部标签和/或例如在C末端具有第三标签的所得融合蛋白。在不背离本发明精神的情况下，其他组合容易地显见和涵盖的。
两个或更多个标签可以是以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
在下文，更详细地描述根据本发明待使用的核酸分子。
核酸分子可以包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白(如HBV前核心蛋白)的核酸序列。编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中显示并且嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
核酸分子可以包含如上文限定和解释的编码一个或多个标签的核酸序列。编码一个或多个标签的序列可以在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游(插入)。
相对于乙型肝炎病毒，N端信号肽和接头构成例如SEQ ID NO:17中所示的前核心蛋白的N末端29个氨基酸。因此，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在构成从编码HBV前核心蛋白的核酸(编码HBV前核心蛋白的核酸例如在SEQID NO:15中显示)的5'末端起87个核酸残基的核酸序列的3’下游(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位置29相对应的氨基酸残基的C末端插入。
相对于HBeAg，接头构成例如SEQ ID NO:18中所示的HBeAg的N末端10个氨基酸。就HBeAg而言，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码HBeAg N端10个氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在构成从编码HBV HBeAg的核酸(编码HBeAg的核酸例如在SEQ ID NO:16中显示)的5'末端起30个核酸残基的核酸序列的3’下游(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示)的位置10相对应的氨基酸残基的C末端插入。
更精确地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBV前核心蛋白的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间(插入)。这些位置在嗜肝DNA病毒的pgRNA的ε结构中或如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε中界定了接头的编码性序列和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子。相对于HBV，位置87是编码接头的序列的最末3’核苷酸并且位置88是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。
在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位置29和30相对应的氨基酸残基之间插入。
同样地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBeAg的核酸序列(编码HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置30和31相对应的核苷酸之间(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示)的位置10和11相对应的氨基酸残基之间插入。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白(如HBV核心蛋白)的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
编码一个或多个标签的核酸序列的上文限定的插入位点也可以由嗜肝DNA病毒基因组中核苷酸的位置限定。相对于HBV基因组，根据上文，包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。这些位置可以根据例如Galibert,F.等人(1979),Nature 281:646-650中所述的命名法确定。
显而易见，如本文中使用的核苷酸(位置)“C1902”和“A1903”分别指前核心蛋白区域编码性序列的最末核苷酸和核心蛋白AUG的第一个核苷酸。它们在不同HBV基因型(A-H)序列(还如本文中提供及在SEQ IDNO:27-34中显示)之间保守。因此，本文待用的HBV基因组的示例性非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中显示。然而，核苷酸“C”，而非核心AUG中的“A”，或它们的位置可以在序列上不同于一些罕见(临床)分离株。这类序列也包含于本发明中。
根据本发明，编码一个或多个标签的核酸序列可以插入除HBV基因组之外的嗜肝DNA病毒基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。可以容易地确定嗜肝DNA病毒基因组中这些相应的位置(即嗜肝DNA病毒基因组中与HBV基因组的位置C1902和位置A1903对应的位置)。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在嗜肝DNA病毒pgRNA的、优选地HBV pgRNA的ε结构或嗜肝DNA病毒基因组(优选地，HBV基因组)编码的ε和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子之间插入。
例如，如果核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列，则编码一个或多个标签的序列可以在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游(插入)。可以以容易地确定编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列。该序列始于(并因此包含)编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子并止于编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子之前(即排除核心蛋白的编码性序列)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与接头(N端信号肽后的接头)C末端最末氨基酸相对应的氨基酸残基的C末端插入。
因此，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码嗜肝DNA病毒e抗原的N端氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。这些N端氨基酸构成嗜肝DNA病毒前核心蛋白中的“接头”。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在接头的最末C端氨基酸残基的C末端插入。
更精确地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBV前核心蛋白的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位置29和30相对应的氨基酸残基之间插入。这些位置在嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构中或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构中界定了接头的编码性序列和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子。相对于HBV，位置87是编码接头的序列的最末3’核苷酸并且位置88是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。可以容易确定嗜肝DNA病毒HBV前核心蛋白中的相应位置(即嗜肝DNA病毒基因组中与编码HBV前核心蛋白的核酸序列的位置87和88对应的位置)。
同样地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列之间(插入)。
例如，该核酸序列可以在与编码HBeAg的核酸序列(编码HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置30和31相对应的核苷酸之间(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示)的位置10和11相对应的氨基酸残基之间插入。这些位置界定了前核心蛋白中嗜肝DNA病毒N末端接头的编码性序列(或嗜肝DNA病毒e抗原中嗜肝DNA病毒N末端接头的编码性序列)和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子。相对于HBV，位置30是编码HBeAg的核酸序列中编码接头的序列的最末3’核苷酸。位置31是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。可以容易确定编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列中的相应位置(即嗜肝DNA病毒e抗原中与编码HBeAg的核酸序列的位置30和31对应的位置)。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白、优选地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在嗜肝DNA病毒pgRNA的、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组(优选地，HBV基因组)编码的ε结构和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白、优选地HBV核心蛋白的核酸序列的ORF起始密码子之间插入。
如上文提到，本文中待使用/提供的核酸分子可以包含编码一个或多个标签的序列，其中所述序列插入嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBVpgRNA的ε结构，或插入如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构。图1中显示HBV基因组编码的示例性ε结构。相对于HBV，如HBV基因组编码的ε结构始于(并且包括)HBV基因组的位置T1849并止于(并且包括)其位置A1909。HBV基因组编码的ε结构的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
如上文所述，包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎中。如HBV基因组编码的ε结构的示例性下部茎在SEQ ID NO:1中显示。例如，编码一个或多个标签的核酸序列可以插入与编码HBV前核心蛋白的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间、或与编码HBeAg的核酸序列(编码HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置30和31相对应的核苷酸之间或与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。全部这些位置均在嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎中或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎中。
本文中构思和优选，核酸分子在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列。认为本文中相对于乙型肝炎病毒/加标签的乙型肝炎病毒e抗原描述和提供的实验和教导内容总体上适用于嗜肝DNA病毒/加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。对于每种具体的嗜肝DNA病毒、优选地HBV，对用于HBV的插入序列的唯一修饰可以涉及修饰编码(表位)标签的核酸序列的5’侧翼序列以维持嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε、或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε的碱基配对。基于本发明的教导内容，本领域技术人员能容易地设计并制备编码标签的核酸序列的5’的核酸序列以维持与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的碱基配对。特别地就鸭乙型肝炎病毒(DHBV)而言，由于其核心蛋白ORF的起始密码子位于ε的下游，因此甚至不需要引入编码(表位)标签的核酸序列的5’侧翼序列以维持DHBV的ε的碱基配对。
如图1中所示，核酸序列插入与HBV基因组的位置C1902和A1903相对应的核苷酸之间，其中所述核酸序列含有9个核苷酸的5’-侧翼区(即编码一个或多个标签的核酸序列的5’)，所述5’侧翼区与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎(例如与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸)形成碱基对。
本发明的一个重要和优选方面是，如本文定义和/或如上文所述待插入的编码一个或多个标签的核酸序列还包含这样的核酸序列，其能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBVpgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构形成碱基对，尤其与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对。通过使用能够与ε结构形成碱基对的核酸序列，目的在于保留嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构。转而，认为ε结构对复制、产生cccDNA和表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗原、优选地HBVe抗原重要。
优选地，能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列能够与优选地对应于位置T1849至A1854或任选地对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对。一般，pgRNA中的碱基对形成在匹配的核糖核苷酸如A-U、G-C和摇摆碱基对G-U之间发生。如果维持ε结构，则复制、产生cccDNA和/或表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗原在本文中待使用/提供的核酸分子中不受阻碍。
应当指出，ε结构的左臂是编码嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg)信号肽的核酸序列的组成部分并且因此应当是保持不变。如所述那样在ε的右臂处设计的插入不应当改变下部茎的碱基配对。在图1中显示的例举插入中，唯一核苷酸变化与A1903G相关(即在HBV基因组位置1903处A替换为G)。在位置1903处的点突变从嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε移出核心蛋白ORF、因而允许维持ε结构和在核心蛋白AUG前方插入标签。核心蛋白从前核心蛋白ORF的起始密码子后转录的前基因组RNA翻译，从而标签将不并入核心蛋白。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构(的下部茎)或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构(的下部茎)、嗜肝DNA病毒基因组的ε结构(的下部茎)形成碱基对的表位标签5’侧翼序列由至多3、6或9个核苷酸、一般9个核苷酸组成。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性序列编码如SEQ ID NO:40中所示的多肽。
本文中待使用/提供的核酸分子还可以在编码一个或多个标签的序列的3’包含编码接头的核酸序列。接头可以由一个或多个氨基酸残基组成。优选地，接头仅由一个氨基酸残基如甘氨酸残基组成。
例如，编码接头的核酸序列由序列GGC组成；或核酸序列编码甘氨酸残基。GGC从核心蛋白ORF的AUG前方的原始3个核苷酸拷贝而来、所述3个核苷酸与AUG一起装配成用于最佳翻译起始的常见Kozak基序。因此，可以使用/插入的接头优选地并适当地选择，从而保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序。
例如，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。例如，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含编码如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。如SEQ ID NO:41中所示的示例性核酸序列由能够与ε结构(的下部茎)形成碱基对的核酸序列(GTGGACATC；尤其核苷酸GTGGACAT与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对)、编码HA标签的核酸序列和编码甘氨酸残基作为接头的核酸序列(后一种核酸序列主要用来保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序)组成。
本文中构思了一个或多个标签符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。同样地，本文中构思了，编码一个或多个标签的核酸序列(连同能够与ε结构(的下部茎)形成碱基对的潜在5’侧翼核酸序列和/或连同保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序或编码接头的潜在3’核酸序列)符合可读框地融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列。
本发明中待使用和提供的核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因组、优选地乙型肝炎病毒(HBV)基因组。例如，HBV基因组是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。本文待用的HBV基因组的示例性非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中显示。HBV基因组可以是HBV基因型D的基因组，尤其HBV亚基因型ayw的基因组(如SEQ ID NO:27中所示的HBV基因组)。
根据本发明，仅允许(大量)表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗原的那些核酸分子，如嗜肝DNA病毒基因组才会使用。例如，已知不允许大量表达/产生嗜肝DNA病毒e抗原的一些临床HBV变体。在一些临床HBV变体中，HBeAg阴性归因于基础核心启动子(BCP)双突变(基因型D中A1764T/G1766A)或前核心蛋白(pC)突变(基因型D中G1898A)。在BCP突变通过下调前核心蛋白mRNA转录减少HBeAg的同时，pC突变引入过早终止密码子以阻碍前核心蛋白翻译。这类嗜肝DNA病毒变体较不适用于本文提供的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，加标签的HBeAg包含如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或由其组成。编码加标签的HBeAg的相应核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。这些序列在本发明的背景下特别有用，但是仅为优选实施方案的例子。
编码加HA标签的前核心蛋白(即加标签的HBeAg的前体)的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。因为这种核酸序列编码加标签的HBeAg的前体，它可以视为编码加标签的HBeAg的核酸序列。相应的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
下文更详细地涉及产生加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的用途。
文中待使用/提供的核酸可以转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒RNA、尤其前基因组(pg)HBV RNA。
本文中构思了所述核酸可以设计成阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。例如，核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。相对于HBV，编码前核心蛋白的核酸的起始密码子可以缺失或突变。例如，这种(待缺失/突变的)起始密码子可以对应在(并包括)HBV基因组位置1816至(并包括)位置1818处的核苷酸；参见例如图1。
避免翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可能是有利的，目的是避免其在测定法开始时产生/表达。本发明的目的是使用加标签的嗜肝DNA病毒e抗原作为cccDNA的替代标记。如果加标签的嗜肝DNA病毒e抗原在全部时间均产生，则其表达/产生并必然地与产生cccDNA相关。如图5中所示，起始密码子可以在cccDNA形成时/之后在测定法的后期恢复，从而加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的表达/产生(即水平)真实反映嗜肝DNA病毒cccDNA的产生/水平。因此，为了甚至更可靠地评估候选分子抑制cccDNA的能力，以下情况是有利：在测定法开始时抑制加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的产生/表达，例如通过移除编码该抗原的相应核酸的起始密码子/使其突变，以及允许稍后产生/表达加标签的嗜肝DNA病毒e抗原以反映嗜肝DNA病毒cccDNA的产生/水平。
例如，在如上文限定和描述的编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG可以由核酸TG替换。因此，本文中待使用和提供的核酸分子可以例如通过点突变修饰，以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
根据本发明待使用的方法的步骤(a)还可以包含步骤(aa)，所述骤(aa)包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组(pg)RNA；
(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原；
恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件可以涉及或是恢复如上文定义和解释的起始密码子。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含于载体、尤其表达载体中。
载体可以例如包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在诱导型启动子的控制下。本文待用的示例性非限制诱导型启动子是四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子、或除草剂诱导型启动子。在本文提供的实验中使用的四环素诱导型启动子(从例如Clontech可商业获得)以tet-off方式工作。认为以tet-on方式工作的四环素诱导型启动子可以同样地在本文中使用。tet-on/off系统例如从Clontech和Invitrogen可获得或者在质粒或病毒(逆转录病毒、腺病毒)主链中。除了四环素/强力霉素诱导型启动子外，如上文所述的例如响应于抗生素、铜、醇、类固醇、或除草剂连同其他化合物的其他诱导型启动子也是合适的。例如，诱导型启动子是CMV启动子。诱导型启动子可以是tet-EF-1α启动子。
另外，可以将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的编码区，如一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一种或多种HBV包膜蛋白。一种或多种嗜肝DNA病毒(HBV)包膜蛋白可以是表面大蛋白(L)、表面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。在一个实施方案中，HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。一种或多种HBV包膜蛋白的示例性编码区在SEQ ID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或SEQ ID NO:38(S)中显示。在HBV中，可以将SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突变成例如TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
如果cccDNA的替代标记即加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平与对照相比降低，则确定候选分子能够抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。
应当理解加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的评估(表达)水平与对照比较，如加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的评估(表达)水平的标准或参比值。可以在尚未与候选分子接触的如本文定义的细胞、组织或非人类动物中评估对照(标准/参比值)。备选地，可以在上述接触步骤之前在如本文定义的细胞、组织或非人类动物中评估对照(标准/参比值)。与候选分子接触时加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平下降也可以是与常规使用的参比化合物(如已知不能抑制cccDNA的化合物)诱导的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平下降比较。技术人员容易地处于确定/评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平是否降低的地位。
反之和在不背离本发明精神的情况下，可以使用阳性对照，例如，参比化合物，如已知能够抑制cccDNA的化合物。如果与这种(阳性)对照相比，cccDNA的替代标记即加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平等同或甚至增加，则确定候选分子能够抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。
根据本发明，尤其本文所述的筛选或确定方法，细胞、组织或非人类动物将与包含核酸分子的候选分子接触，其中所述核酸分子包含编码如本文定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。
例如，所述细胞、组织或非人类动物可以能够表达如本文定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。如本文中解释，可以因此通过测量编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的这类基因产物的表达水平、尤其蛋白质表达水平，检测候选分子抑制/拮抗cccDNA的能力。(与对照(标准或参比值)相比的)(较)低(蛋白质)表达水平指示了候选分子充当抑制剂/拮抗剂的能力。
归因于降低的转录物/表达水平，翻译的基因产物(即蛋白质水平)的水平也将降低。上述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白的(蛋白质)水平一般与加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白相关的可检测信号的信号强度相关。示例性加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白包含可以包含如上文所述的报道分子(例如萤光素酶、(绿色/红色)荧光蛋白及其变体、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)等)。
因此，细胞/组织/非人类动物与候选分子接触时报道分子信号下降将显示候选分子的确是cccDNA抑制剂/拮抗剂并且因此能够抑制cccDNA。从测试的候选分子选出降低如上文定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的候选分子，其中优选地选择强烈降低加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的那些分子(例如以报道分子信号下降反映)。
在本发明的上下文(尤其，本文所公开的筛选/鉴定方法)中构思，还可以接触细胞提取物(例如包含核酸分子的细胞提取物，所述核酸分子包含编码如本文中描述和定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列)。例如，这些细胞提取物可以从本文待用、尤其待接触候选分子的(转基因/基因工程化)细胞、组织和/或非人类动物获得。
使用这类细胞提取物是特别有利的，因为它允许在体外评估候选分子的活性。利用这类(细胞)提取物的评估/筛选方法可以例如用于预筛选候选分子，其中，在这种预筛选中选出的分子随后接受后续筛选，例如在本文所公开的基于细胞的方法、尤其在(转基因)细胞、组织和/或非人类动物与候选分子接触的方法中接受后续筛选。在这种情况下，因此优选已经在上文和下文所述的体外预筛选方法中选出候选分子。
因此，如本文所用的术语“细胞”涵盖(转基因/基因工程化)细胞、(转基因/基因工程化)组织和/或(转基因/基因工程化)非人类动物并且还涵盖从中衍生的细胞提取物。
应当理解常规地在高通量筛选中，同时筛选许多(经常数千种)候选分子。因此，在(第一)次筛选中，选出降低加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平的候选分子。
也可以通过添加含有所述候选分子或多种候选分子(即各种不同候选分子)的(生物)样品或组合物至待分析的细胞(包含核酸分子的细胞/组织/非人类动物，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列)，实现本发明筛选方法的步骤(a)，即“接触步骤”。
通常，候选分子或包含/含有候选分子的组合物可以例如添加至包含核酸分子的(转染的)细胞、组织或非人类动物，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。如本文定义和公开、术语“包含了包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子”暗示使用报道分子。还可以在本文中使用包含启动子和/或增强子区域的报道分子构建体。
在本发明中、尤其在筛选/鉴定方法的上下文中待使用或提供的细胞、组织和/或非人类动物可以用包含编码本文公开的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子稳定或瞬时染。
能够抑制cccDNA(如反映为加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平降低)的化合物/分子预计作为本文公开的药物背景下的物质有益并且用于医学目的，尤其用于治疗与嗜肝DNA病毒相关的疾病、尤其与嗜肝DNA病毒相关的慢性病，如慢性肝炎和尤其慢性乙型肝炎。
可以作为嗜肝DNA病毒cccDNA的特异性“拮抗剂”或“抑制剂”发挥作用的候选分子/化合物可以是小结合分子如小分子(有机)化合物。
在药物发现背景下，术语“小分子”是本领域已知的并且指具有小于2,500道尔顿、优选地小于1,000道尔顿、更优选地50和350道尔顿之间分子量的医用化合物。(小)结合分子包含天然化合物以及合成性化合物。术语“化合物”(或同样地“分子”)在本发明的背景下包括单一物质或多种物质。所述化合物/分子可以例如包含于样品(例如来自植物、动物或微生物的细胞提取物)中。另外，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今未知能够(不利)影响嗜肝DNA病毒cccDNA。可以将多种化合物例如在体外添加至样品、添加至培养基或注入细胞。
候选物质还可以包含与蛋白质结构性相互作用必需的官能团、尤其氢键，并且一般包含至少胺、羰基、羟基或羧基，优选地至少两种功能性化学基团。候选物质经常包含经一个或多个上述官能团取代的碳环结构或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。
示例类别的候选物质可以包括杂环、肽、糖、类固醇等。可以修饰化合物以提高效力、稳定性、药物相容性等。物质的结构性鉴定可以用来鉴定、产生或筛选额外的物质。例如，在鉴定到肽物质的情况下，可以将它们按多种方式修饰以增强其稳定性，如使用非天然氨基酸，如D-氨基酸、尤其L-丙氨酸，通过使氨基末端或羧基末端官能化，例如对于氨基，酰化或烷基化、并且对于羧基，酯化或酸化等，进行修饰。其他稳定方法可以包括囊化，例如，在脂质体中囊化等。
如上文提到，候选物质还存在其他生物分子中，所述其他生物分子包括氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、核酸和衍生物、其结构类似物或组合。候选物质从多种来源获得，所述来源包括合成或天然化合物文库。例如，多种手段可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，所述手段包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。可选地，处于细菌提取物、真菌提取物、植物提取物和动物提取物形式的天然化合物文库是可获得的或容易地产生。额外地，通过常规的化学、物理和生物化学手段容易修饰天然或合成产生的文库和化合物，并且它们可以用来产生组合文库。已知的药理学物质可以经历定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酸化等，以便产生结构类似物。
本发明中还构思，可以评估化合物/分子抑制cccDNA的能力，所述化合物/分子尤其包括肽、蛋白质、核酸(包括cDNA表达文库)、小分子有机化合物、配体、PNA等。所述化合物也可以是功能性衍生物或类似物。
用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员熟知的并且在例如Beilstein,"Handbook of Organic Chemistry",Springer Edition New York或在"Organic Synthesis",Wiley,New York中描述。另外，可以根据本发明检验所述衍生物和类似物的作用，即它们对cccDNA的拮抗作用。
另外，可以使用适宜的cccDNA拮抗剂或抑制剂的肽模拟物和/或计算机辅助设计。本领域中描述了用于计算机辅助设计例如蛋白质和肽的适宜计算机系统述，例如，在Berry(1994)Biochem.Soc.Trans.22:1033-1036；Wodak(1987),Ann.N.Y.Acad.Sci.501:1-13；Pabo(1986),Biochemistry 25:5987-5991中描述。从上述计算机分析获得的结果可以与本发明的方法组合用于例如优化已知的化合物、物质或分子。也可以通过连续化学修饰法合成肽模似物组合文库并(例如，根据本文所述的方法)检验所产生的化合物，鉴定适宜的化合物。现有技术中描述了用于生成和使用肽模似物组合文库的方法，例如在Ostresh(1996)Methods in Enzymology 267:220-234和Dorner(1996)Bioorg.Med.Chem.4:709-715中描述。另外，cccDNA拮抗剂的三维和/或结晶学结构可以用于设计cccDNA的(肽模拟物)拮抗剂(Rose(1996)Biochemistry35:12933-12944；Rutenber(1996)Bioorg.Med.Chem.4:1545-1558)。
尤其可以通过用包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子转染适宜的宿主并使所述宿主与候选分子接触，鉴定/评估能够抑制cccDNA的候选分子。
本文待用的细胞/宿主优选地是真核细胞、尤其是肝细胞来源的真核细胞。真核细胞优选地是肝瘤细胞或肝细胞。真核细胞也可以衍生自肝瘤细胞或肝细胞。本文待用的优选细胞是真核细胞HepG2(ATCC#HB-8065)。HepG2细胞已知支持功能性HBV cccDNA形成和转录。本文中构思使用其他细胞，如肝细胞衍生的细胞(例如Huh7)。也可以根据本发明使用非肝细胞/宿主，前提是它们支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或在更广意义下，嗜肝DNA病毒DNA复制)。例如，如果将病毒前基因组RNA引入细胞或通过外源启动子从DNA模板转录，则可以修饰这种非肝细胞/宿主以支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或嗜肝DNA病毒DNA复制)。如果在这类非肝细胞中反式补足肝特异性转录因子，则cccDNA转录可以进行。本发明的核酸分子或包含前者的载体可以稳定整合在细胞的基因组中。
根据本发明待使用的核酸分子(即包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子)或包含前者的载体优选地基本上由DNA组成。
上文就“细胞”方面给出的解释还适用于并涵盖包含或衍生自这些细胞的组织/非人类动物。本文待用的细胞可以包含于样品(例如，生物学样品、医学样品或病理学样品)中。例如，构思了使用包含细胞、组织或细胞培养物的流体。这种流体可以是体液或还可以是分泌物并也可以是培养物样品。体液可以包括但不限于血清、血浆、尿、唾液、滑液、脊液、脑脊液、泪、粪便等。
同样地，候选分子可以包含于(生物)样品或组合物中。(多种)候选分子经常接受第一次筛选。在第一次筛选中测试呈阳性的样品/组合物可以接受后续筛选，以验证此前结果并选出最强力的抑制剂/拮抗剂。依赖于多个筛选和选择轮次，可以选出显示明显的如本文定义和公开的抑制/拮抗cccDNA的能力的那些候选分子。例如，含有多种候选分子的批次(即组合物/样品)将复筛并且无候选分子抑制活性或候选分子抑制活性不足的批次在不复筛的情况下弃去。
例如，如果检验具有有多种候选分子的(生物)样品或组合物并且一个(生物)样品或组合物检验呈阳性，则随后可能在第二次筛选中筛选、优选地在纯化后筛选(生物)样品或组合物的各个分子。也可以是在后续筛选中筛选第一次筛选的(生物)样品或组合物的亚组。筛选具有此前筛选轮次中检验过的那些候选分子亚组的组合物将因此缩小潜在强力cccDNA抑制剂的范围。这可以促进并加速筛选过程，尤其当筛选众多分子时。因此，与第一次(和后续)筛选中检验每种和每个单个候选分子(这当然也还是可能的)相比，筛选轮次的循环次数减少。因此，取决于候选分子的复杂性或数目，本文所述的筛选方法的步骤可以进行几次直至待筛选的(生物)样品或组合物包含有限的数目、优选地仅一种物质，所述物质指示所筛选的分子降低加标签的嗜肝DNA病毒e抗原水平的能力。
本文中构思使用允许在单个细胞水平或某组织的单个细胞水平(例如在亚细胞水平)解析例如荧光的光学测量技术。这些技术可以涉及荧光，例如共聚焦显微术、数字图像记录，如CCD照相机和合适的图像分析软件。例如，通过执行对照在测量标准响应后实验实施步骤(b)。例如，在第一次筛选中在不接触候选分子情况下确定包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的细胞、组织或非人类动物中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。在第二次筛选中，在接触候选分子后，测量/评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。水平的差异显示检验的候选分子是否的确为cccDNA的拮抗剂/抑制剂。
可以通过本文中所述的任何方法、尤其蛋白质测量/检测/评估技术测量例如基因产物的水平(尤其加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白质水平)，定量加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。
例如，可以通过利用免疫凝集、免疫沉淀法(例如免疫扩散、免疫电泳、免疫固定)、蛋白质印迹技术(例如(原位)免疫组织化学、(原位)免疫细胞化学、亲和色谱、酶免疫测定法)等在蛋白质水平确定表达。可以通过物理方法例如光度法确定溶液中已纯化多肽的量。定量混合物中特定多肽的方法依赖于(例如抗体的)特异性结合作用。利用抗体特异性的特异性检测和定量方法包含例如免疫组织化学(原位)。例如，可以通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)确定细胞、组织或非人类动物中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白水平的浓度/量。
本文中构思了根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
本文提供的方法利用建立的标签(如可以替代HA标签使用或除HA标签之外使用的HA标签、或His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签)的用途。这些标签可以用于纯化和检测加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。通过使用与标签特异性结合的抗体(例如通过ELISA测定法，如化学发光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免与核心蛋白的交叉反应。
根据本文所提供方法的步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗体、优选地乙型肝炎病毒e抗原(如，但不限于抗HBe：克隆29，批号20110305，Autobio Diagnostics)的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种抗体(如，但不限于抗HA：目录号A01244-100，Genscript)。
以下抗体特异性识别乙型肝炎病毒e抗原并且可以根据本发明使用：
Imai等人,Demonstration of two distinct antigenic determinants onhepatitis B e antigen by monoclonal antibodies.J Immunol.1982Jan；128(1):69-72。
Ferns和Tedder.Monoclonal antibodies to hepatitis B antigen(HBeAg)derived from hepatitis B core antigen(HBcAg):their use in characterizationand detection of HBeAg.J Gen Virol.1984May；65(Pt5):899-908。
Mondelli等人,Differential distribution of hepatitis B core and Eantigens in hepatocytes:analysis by monoclonal antibodies.Hepatology.1986 6(2):199-204。
Stuckmann和Mushahwar.Re-examination and further characterization of amonoclonal antibody to hepatitis B e antigen(anti-HBe).J VirolMethods.1986Jul；13(4):351-62。
Korec等人,Monoclonal antibodies against hepatitis B e antigen:production,characterization,and use for diagnosis.J Virol Methods.1990May；28(2):165-9。
Usuda等人,A monoclonal antibody against a hepatitis B e antigenepitope borne by six amino acids encoded by the precore region.J VirolMethods.1997Nov；68(2):207-15。
Sogut等人,Monoclonal antibodies specific for hepatitis B e antigenand hepatitis B core antigen.Hybridoma(Larchmt).2011Oct；30(5):475-9。
备选地，可以进行蛋白质印迹分析或免疫组织化学染色。蛋白质印迹法组合了通过电泳法分离蛋白质混合物和用抗体特异性检测。电泳可以是多维的如2D电泳。通常，多肽在2D电泳中依照其表观分子量沿一个维度分离并且依照其等电点沿另一个方向分离。
技术人员能够通过利用检测信号强度和待确定的例如多肽/蛋白质的量之间的相关性、优选地线性相关性，确定上文所述的多肽/蛋白质、尤其基因产物的量。因此，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以基于加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白质水平定量。技术人员是知晓待用于确定样品中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白表达产物水平的量/浓度的标准方法或可以从标准教材(例如Sambrook，2001)推导出相应方法。
如果加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(或相应报道分子信号)的水平强烈地降低、优选地很低或不可检出，则选出候选分子。例如，与(对照)标准值相比，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(或相应报道分子信号)的水平可以降低至少50％、60％、70％、80％、更优选地至少90％。
用于转染细胞或组织的方法是本领域已知的。因此，磷酸钙处理或电穿孔法可以用于转染细胞或组织以表达所述报道分子构建体(参见Sambrook(2001)，见上述引文)。另外，表达所述报道分子构建体的核酸分子可以重构入脂质体以递送至靶细胞。作为又一种备选，可以使用基因工程病毒载体转导细胞以表达特定报道分子构建体。
在另一个实施方案中，包含用于检测cccDNA抑制作用的所述报道分子构建体的非人类动物是转基因非人类动物。所描述的筛选分析法中待使用的非人类生物可以选自秀丽隐杆线虫(C.elegans)、酵母、果蝇、斑马鱼、豚鼠、大鼠和小鼠。产生这种转基因动物处于技术人员的技能范围内。相应的技术尤其在“Current Protocols in Neuroscience”(2001),John Wiley&Sons,第3.16章中描述。
因此，本发明还涉及一种用于产生非人类转基因动物的方法，所述方法包括步骤：将包含编码如本文中公开的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子引入ES-细胞或生殖细胞中。本文提供和描述的非人类转基因动物特别可用于上文所述的筛选方法和药理学试验中。本文所述的非人类转基因动物可以用于药物筛选分析法中以及用于其中追踪、选择和/或分离治疗嗜肝DNA病毒相关疾病的cccDNA拮抗剂/抑制剂的科学研究和医学研究中。
在本发明背景、尤其筛选/鉴定方法下待使用的转基因/基因工程细胞、组织和/或非人类动物包含本文描述和定义的包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。
本发明涉及使用细胞、组织或非人类动物筛选和/或验证疑似作为嗜肝DNA病毒cccDNA的抑制剂的化合物。
如本文所用的术语“转基因非人类动物”、“转基因细胞”或“转基因组织”，指不是人类的包含相应野生型动物、组织或细胞的不同遗传物质的非人类动物、组织或细胞。术语“遗传物质”在这种背景下可以是任何种类的核酸分子或其类似物，例如如本文定义的核酸分子或其类似物。术语“不同”意指与野生型动物或动物细胞的基因组相比附加或较少的遗传物质。待用于产生转基因细胞/动物的不同表达系统的概述例如参见Methods inEnzymology 153(1987),385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trendsin Biotechnology 12(1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in MolecularBiology 75(1997),427-440)。
本发明涉及如上文定义的核酸分子，即包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。上文给出的解释和定义在已作必要修正的情况下适用于此处。嗜肝DNA病毒e抗原优选地是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有仅一个标签。标签可以由6至22个氨基酸组成。常见的和本文中优选的(表位)标签由8、9、10或11个氨基酸组成。6xHis是可以在本文中使用的最小表位标签。可能的是，少于6个氨基酸的插入可以与毗邻的HBeAg氨基酸一起装配成新表位，从而这种插入还产生加标签的嗜肝DNA病毒。标签可以是血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有两个或更多个标签。两个或更多个标签优选地是不同的标签。所述两个或更多个标签的整个长度可以是约12个至约31个氨基酸。例如，两个或更多个标签的整个长度可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31个氨基酸。两个或更多个标签可以是以下两者或更多者：HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
编码标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的编码HA标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的核酸序列；如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的编码V5标签的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的编码C9标签的核酸序列。
编码Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所显示的编码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编码3×Flag标签的核酸序列。
标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA标签的氨基酸序列、如SEQID NO:9中所示的His标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5标签的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9标签的氨基酸序列。
Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所显示的1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的3×Flag标签的氨基酸序列。
编码HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:16中显示。HBeAg的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:18中显示。
核酸分子可以包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
核酸分子可以包含编码一个或多个标签的核酸序列，其中所述序列在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游(插入)。
编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。
核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因组。优选地，嗜肝DNA病毒基因组是乙型肝炎病毒(HBV)基因组。HBV基因组可以是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。HBV基因组可以是HBV基因型D的基因组。优选地，HBV基因组是HBV基因型D亚基因型ayw的基因组。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白、优选地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:23中显示。核心蛋白可以是HBV核心蛋白。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入如本文定义的嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构中。如HBV基因组编码的ε结构的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎中。
将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和A1903相对应的核苷酸之间。
核酸分子可以在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列。优选地，能够与嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV(编码)的ε结构的下部茎形成碱基对的序列主要能够与优选地对应于位置T1849至A1854或任选地对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对。能够与嗜肝DNA病毒基因组的ε结构的下部茎形成碱基对的序列可以由(至多)9个核苷酸组成。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性序列编码如SEQ ID NO:40中所示的多肽。
核酸分子可以在编码一个或多个标签的序列的3’包含编码接头的序列。接头可以由一个或多个氨基酸残基组成。优选地，接头仅由一个氨基酸残基如甘氨酸残基组成。编码接头的序列可以由序列GGC组成。编码接头的序列可以编码甘氨酸残基。编码序列可以用于并适当地经选择以保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序。
核酸分子可以包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述核酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。核酸分子可以包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述核酸序列包含编码如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
一个或多个标签优选符合可读框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原(或融合入嗜肝DNA病毒e前核心蛋白)、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)(或融合入乙型肝炎病毒前核心蛋白)中。
编码加标签的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。加标签的HBeAg的优选氨基酸序列在SEQ ID NO:22中显示。
编码加标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性核酸序在SEQ ID NO:19中显示。加标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
HBV基因组的示例性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中显示。
核酸可以转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒RNA。嗜肝DNA病毒RNA优选地是HBVRNA。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含于载体如表达载体中。优选地，嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
核酸通常允许加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的翻译。核酸可以包含于包含如SEQ ID NO:39中所显示的序列的载体中。
在某些实施方案中，核酸设计成阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。例如，核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。例如，在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG可以由核酸TG替换。可以通过点突变修饰核酸以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。载体可以包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在诱导型启动子的控制下。
诱导型启动子可以是四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子或除草剂诱导型启动子。
诱导型启动子可以优选地是CMV启动子。诱导型启动子可以是tet-EF-1α启动子。
另外，可以将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的、优选地一种或多种HBV包膜蛋白的编码区。
一种或多种HBV包膜蛋白可以如下一者或多者：L、M和/或S。HBV包膜蛋白可以是S。
一种或多种HBV包膜蛋白的示例性编码区(或编码所述包膜蛋白的示例性核酸序列)在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中显示。SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)可以突变成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
本发明涉及如上文定义和提供的核酸分子编码的蛋白质。
该蛋白质包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地加标签的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)可以包含如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。优选地，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
标签可以由6至22个氨基酸组成。标签可以是血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有两个或更多个标签。优选地，两个或更多个标签是不同的标签。所述两个或更多个标签的整个长度是约14个至约31个氨基酸。两个或更多个标签可以是以下两者或更多者：HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
编码标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的编码HA标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的核酸序列；如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如SEQ ID NO:5中所示的编码V5标签的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的编码C9标签的核酸序列。
编码Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所显示的编码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编码3×Flag标签的核酸序列。
标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA标签的氨基酸序列、如SEQID NO:9中所示的His标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所示的V5标签的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9标签的氨基酸序列。
Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所显示的1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的3×Flag标签的氨基酸序列。
蛋白质可以包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ IDNO:17中显示。
该蛋白质可以包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信号肽和接头的氨基酸序列的C末端。该蛋白质可以在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的氨基酸序列的C末端包含一个或多个标签的氨基酸序列。
该蛋白质可以包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序列的N末端、优选地HBV核心蛋白的氨基酸序列的N末端。编码HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ IDNO:24中显示。
一个或多个标签的氨基酸序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构编码的氨基酸序列中。如HBV基因组编码的ε结构的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。一个或多个标签的氨基酸序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎编码的氨基酸序列；优选插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎编码的氨基酸序列。
可以将一个或多个标签的氨基酸序列插入与HBV前核心蛋白(如SEQ ID NO:17中所显示的一种)的位置G29和位置M30相对应的氨基酸残基之间。
该蛋白质还可以在一个或多个标签的氨基酸序列的N末端包含(至多)3个氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3个氨基酸的氨基酸序列由能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的核酸序列编码。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的核酸序列主要能够与优选地对应于位置T1849至T1855或任选地对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。(至多)3个氨基酸的示例性氨基酸序列在SEQID NO:40中显示。
该蛋白质还可以在一个或多个标签的氨基酸序列的C末端包含接头。接头可以由一个或多个氨基酸残基组成。优选地，接头仅由一个氨基酸残基如甘氨酸残基组成。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:41中所显示的核酸序列编码的氨基酸序列。其中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:42中所显示的氨基酸序列。
一个或多个标签优选符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
编码加标签的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。优选地，加标签的HBeAg具有如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。
编码加标签的HBV前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。加标签的HBV前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
本发明涉及包含如本文定义和提供的核酸分子的宿主细胞和/或涉及包含如本文定义和提供的蛋白质的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞。真核细胞可以是肝细胞来源的。真核细胞可以是肝瘤细胞或可以衍生自肝瘤细胞。在一个优选实施方案中，真核细胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。
本发明涉及用于产生如上文定义的蛋白质的方法，所述方法包括在允许蛋白质表达的条件下培养如上文定义的宿主并且从培养物回收产生的蛋白质。
本发明涉及用于本发明方法中的试剂盒。同样地，本发明涉及筛选疑似能够抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子的试剂盒的用途。本文相对于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的方法所提供的解释在已作必要修正的情况下适用于此处。
试剂盒可以包含特异性识别如本文定义的嗜肝DNA病毒抗原e的抗体和特异性识别如本文定义的一个或多个标签的一种或多种抗体。
本发明(在本发明背景下待制备)的试剂盒或本发明的方法和用途还可以包括或配有使用手册。例如，所述使用手册可以指导技术人员(如何)评估候选分子抑制cccDNA的能力和/或如何评估本发明加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。特别地，所述使用手册可以包含使用或应用本文提供的方法或用途的指导。
本发明(在本发明背景下待制备)的试剂盒还可以包含适于实施本发明方法和用途/本发明方法和用途所要求的物质/化学品和/或设备。例如，这类物质/化学品和/或设备是用于稳定和/或储存化合物的溶剂、稀释剂和/或缓冲液，所述化合物是特异性确定如本文定义的所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(蛋白质(表达))水平所需的。
本发明涉及如本文定义和提供的核酸分子、如本文定义和提供的蛋白质和/或如本文定义和提供的宿主细胞用于筛选疑似能够抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子的用途。本文相对于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的方法所提供的解释在已作必要修正的情况下适用于此处。
如本文所用，术语“包含”和“包括”或其语法变体将视为规定所述的特征、整数、步骤或组分，但是不排除增加一个或多个附加特征、整数、步骤、组分或其群组。这个术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由……组成”。因此，术语“包含”/“包括”/”具有”意指任何其他组分(或同样意指任何其他特征、整数、步骤等)可以存在。
术语“由……组成”意指无其他组分(或同样意指无其他特征、整数、步骤等)可以存在。
在本文中使用时，术语“基本上由……组成”或其语法变体将视为规定所述的特征、整数、步骤或组分，但是不排除增加一个或多个附加特征、整数、步骤、组分或其群组，但条件是上述附加特征、整数、步骤、组分或其群组不实质地改变要求保护的组合物、装置或方法的基本特征和新特征。
因此，术语“基本上由……组成”意指特定其他组分(或同样地特定其他特征、整数、步骤等)可以存在，即这些不实质地影响组合物、装置或方法的必需特征。换而言之，术语“基本上由……组成”(其可以在本文中与术语“基本上包含”互换使用)允许除强制性组分(或同样地强制性特征、整数、步骤等)之外的其他组分在组合物、装置或方法中存在，前提是装置或方法的必需特征并未实质地受其他组分的存在影响。
术语“方法”指用于实现给出任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、生物学和生物物理技术人员已知或从已知方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“分离”指已经从其体内位置取出的组合物。优选地，本发明的分离的组合物或化合物基本上不含在其体内位置存在的其他物质(例如，其他蛋白质或其他化合物)(即纯化或半纯化的组合物或化合物)。
如本文所用术语“约”指±10％。
本发明参考以下非限制性图和实施例进一步描述。
除非另外说明，否则既定的重组基因技术方法如通过引用方式完整并入本文的例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold Spring HarborLaboratory,N.Y.(2001)中所述那样使用。
以下实施例说明本发明：
这些图显示：
图1.HA标签序列插入HBV前核心蛋白ORF中。
描述了HBV前核心蛋白(基因型D，亚型ayw，nt 1816-2454)的ORF，5’部分(nt1816-1941)以核苷酸序列显示。在nt 1941和前核心蛋白ORF的终止密码子之间的序列省略。加框表示前核心蛋白ORF的起始密码子、同向重复序列1(DR1)和核心蛋白ORF的符合可读框的起始密码子。在质粒pTREHBV-HAe中突变前核心蛋白ORF的5'末端起始密码子。可靠的pgRNA转录启动位点(nt 1820)以箭头标记。HBV核苷酸位置依据Galibert命名法确定(5)。以预测的内部结构(下部茎、凸起、上部茎、环)说明充当HBV pgRNA中后续DNA复制的必需顺式元件的关键茎-环结构(ε,ε)。为了将符合可读框地融合的HA标签序列在不改变ε的碱基配对情况下置入前核心蛋白ORF，将含有HA标签的DNA序列(gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc；SEQ ID NO:41)符合可读框地插入与核心蛋白ORF的起始密码子毗邻的上游位置(参见插入物框)。这个序列修饰导致HA标签加接头序列符合可读框地融合入前核心蛋白，并且核心蛋白的完整ORF在ε的下游维持。
图2.加HA标签的HBeAg的表达和分泌
(A)野生型和加HA标签的前核心蛋白的胞内表达。将HepG2细胞用质粒pcHBe或pcHA-HBe转染，5天后，通过使用抗HBc(顶部小图)和抗HA(中部小图)抗体，令全细胞裂解物接受蛋白质印迹分析。β-肌动蛋白充当内参对照。标记野生型前核心蛋白和加HA标签的前核心蛋白(HA-前核心蛋白)。
(B)检测培养液中加HA标签的HBeAg。将HepG2细胞模拟转染或用质粒pcHBe或pcHA-HBe转染，在指示的时间点收集上清液样品并且在转染后第5天收获细胞。使用抗HA抗体，对上清液样品进行免疫沉淀(IP)并且通过蛋白质印迹法采用针对HA的抗体检测加HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)。显示抗体的轻链(LC)。通过HA蛋白质印迹法揭示HA-前核心蛋白的胞内表达。
图3.HA-HBeAg在HepHA-HBe细胞系中的分泌。
将建立的加HA标签的HBeAg稳定表达细胞系，尤其HepHA-HBe4和HepHA-HBe47细胞，在汇合条件下接种在胶原蛋白涂覆的12孔板中。接种细胞的当日设为第0天，并且每隔1天补充培养基。在指示的时间点收集上清液样品并且通过如“材料和方法”中所述的AlphaLISA分析法检测HA-HBeAg。在直方图中AlphaLISA信号(相对光单位)(Y-轴)对应于时间点(X-轴)作图
图4.HA-重组HBV基因组在瞬时染的细胞中的复制。
将HepG2细胞用pTREHBVDES或pTREHBV-HAe和质粒pTet-off共转染。转染后5天收获细胞，并且分别通过RNA印迹法、蛋白质印迹法和DNA印迹杂交法分析基于质粒的HBVRNA、核心蛋白、衣壳化pgRNA的产生和病毒DNA复制。pgRNA：前基因组RNA；sRNA：表面RNA；RC：松弛型环状DNA；SS：单链DNA。
图5.HepBHAe稳定细胞系中HBV cccDNA依赖性加HA标签的HBeAg表达的合理设计的示意图。
在pTREHBV-HAe和pTet-off稳定转染的细胞中，转基因含有tet-CMV启动子控制下的1.1倍超长HBV基因组。前核心蛋白的起始密码子(ATG)在HBV DNA的5'末端突变，第二起始密码子在3’多余处未改变。将含有HA标签的片段(以灰色显示)如材料和方法中所述插入前核心蛋白ORF。转基因还在表面小蛋白(S)ORF中含有两个串联终止密码子以阻止病毒包膜蛋白表达。(B)一旦移除Tet，则pgRNA转录并且产生核心蛋白和聚合酶，导致pgRNA包装和(C)pgRNA逆转录成rcDNA。DNA修复机制将(D)rcDNA转化成(E)环状cccDNA模板，其中HA-前核心蛋白ORF得到恢复，产生HA-前核心蛋白mRNA、及(F)用于从头病毒复制的pgRNA。(G)HA-前核心蛋白从HA-前核心蛋白mRNA翻译并加工成可以通过ELISA检测到的分泌型HA-HBeAg。preC、C、pol、L、M、S和X分别代表前核心蛋白、核心蛋白、聚合酶、表面大抗原、中等抗原和小抗原和X蛋白的ORF起始密码子。DR代表同向重复序列。CTD代表C末端结构域。
图6.HepBHAe13细胞中病毒DNA复制、cccDNA积累和加HA标签的HBeAg生产的动力学。
将HepBHAe13细胞在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞单层变得汇合时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。在指示的时间点收获细胞样品和上清液样品。提取并通过DNA印迹杂交法分析胞内核心蛋白DNA(上半小图)和cccDNA(底部小图)。DP-rc代表去蛋白化(无蛋白质)的RC DNA。通过如上文所述的HA IP-蛋白质印迹法检测分泌型加HA标签的HBeAg。
图7.支持HA-重组HBV DNA复制的额外诱导型HepBHAe细胞系。
将HepDES19细胞和新建立的克隆编号不同的HepBHAe细胞按相同的密度在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞达到汇合时，将一组细胞在四环素存在下培养，并且将另一组细胞在四环素不存在下培养。6天后，收获细胞并通过DNA印迹分析病毒核心蛋白DNA。
图8.HepBHAe细胞系中cccDNA的真实性。
通过Hirt提取法提取HepDES19细胞和所示的HepBHAe细胞中产生的cccDNA并对其进行凝胶电泳和DNA印迹杂交(泳道1、5、8、11、14)。为了进一步验证HBV cccDNA的真实性，将Hirt DNA样品在装载凝胶前加热到85℃持续5分钟，一种使DP-rcDNA变性成SS DNA，同时cccDNA保持非变性并且其电泳迁移率保持不变的条件(泳道2、6、9、12、15)。将热变性的DNA样品进一步用EcoRI消化，在所述条件下cccDNA线性化成基因组长度的双链DNA(泳道3、7、10、13、16)。
图9.AlphaLISA检测HepBHAe细胞系中的HA-HBeAg。
将HepBHAe细胞在四环素存在下接种于平板中。当细胞变得汇合时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。在指示的时间点收获上清液样品并对其进行AlphaLISA以检测HA-HBeAg。AlphaLISA读数(相对光单位，RLU)表述为每秒的计数(CPS)。
图10.HBV复制抑制剂(3TC)阻断HepBHAe13细胞中的HA-HBeAg表达。
将HepBHAe13细胞在6孔板中在四环素存在下培养直至汇合。一组细胞在四环素存在下持续维持。第二组细胞随后转换成无四环素的培养基。第三组细胞随后在含有10μM3TC的无四环素培养基中培养。每隔1天补充培养基，并且对指示的时间点上收获的上清液样品进行化学发光免疫测定(CLIA)以检测加HA标签的HBeAg。
图11.HBV cccDNA形成抑制剂降低HepBHAe13细胞中的HA-HBeAg水平。将细胞接种于96孔板中并且当细胞变得汇合时，从培养基移除四环素以诱导病毒复制。同时，将细胞不处理或用化合物在所示的浓度处理，在处理组和未处理组中将DMSO浓度归一化为0.5％。每4天重复处理。在处理后第12天，对培养液进行HA-HBeAg CLIA并且将读数作为百分数(均值±SD)相对于对照作图。
图12.额外的HepBHAe细胞克隆中病毒RNA转录、DNA复制和cccDNA积累的动力学。
将所示的HepBHAe细胞在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞单层变得汇合时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。细胞在指示的时间点收获。提取总病毒RNA(上半小图)、胞质核心蛋白DNA(中部小图)并分别通过RNA印迹和DNA印迹杂交分析。将提取的cccDNA在85℃热变性5分钟并且随后用EcoR I线性化，随后进行DNA印迹分析(底部小图)。
图13.HA-HBeAg在额外的HepBHAe细胞克隆中的cccDNA依赖性表达。
选出的HepBHAe细胞在96孔板中在四环素存在下培养直至汇合。一组细胞在四环素存在下持续维持。第二组细胞随后转换成无四环素的培养基。第三组细胞随后在含有10μM 3TC的无四环素培养基中培养。每隔1天补充培养基，并且在处理后第9天收获的上清液样品进行化学发光免疫测定法(CLIA)以检测加HA标签的HBeAg。
实施例说明本发明。
实施例1：诱导型表达乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA依赖性加表位标签的e抗原 的培养细胞系及其筛选抗病毒物质的用途
材料和方法
质粒
为了构建含有敲除其起始密码子的融合人流感血凝素(HA)的前核心蛋白可读框的四环素诱导型HBV复制载体，将通过Genscript Inc化学合成下述DNA片段，所述DNA片段含有CMV-IE启动子TATA框基序和下游HBV片段(基因型D，亚型ayw，nt 1805-2335)，同时缺失nt 1816(A)及在前核心蛋白ORF中插入HA标签序列。在这个DNA片段内部，SacI限制性酶位点在5'末端存在并且真实BspEI限制性位点在3'末端存在。通过将合成的DNA片段插入质粒pTREHBVDES中的SacI/BspEI限制性位点，构建载体pTREHBV-HAe。pTREHBV-HAe的完整序列在SEQ ID NO:35显示。
为了产生融合HA的前核心蛋白表达载体，通过使用引物5’-ATTGGATCCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’和5’-ACAGTAGTTTCCGGAAGTGTTGATAGGATAGGGG-3’从pTREHBV-HAe扩增含有HBV nt 1816-2335连同HA序列插入物的PCR片段。将该PCR片段用BamHI和BspEI限制性酶处理并插入前核心蛋白表达载体(pcHBe)中的相同限制性位点以产生质粒pcHA-HBe。pcHA-HBe的完整序列在SEQ ID NO:39显示。
细胞培养物
支持HBV复制的肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞(HB-8065TM)从ATCC获得。先前已经描述了诱导型表达HBV DNA和cccDNA的HepG2衍生的HepDES19细胞系(7)。将细胞系在补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)-F12培养基(Cellgro)中维持。
为了建立HepBHAe细胞系，将HepG2细胞用表达Tet应答性转录激活物的质粒pTet-off(Clontech)和其中修饰的HBV pgRNA的转录受CMV-IE启动子连同四环素应答元件控制的质粒pTREHBV-HAe转染。在1μg/ml四环素存在下用500μg/ml G418选择转染的HepG2细胞。挑取G418耐药性集落并扩充成细胞系。通过在无四环素的培养基中培养细胞诱导HBV复制，并且通过DNA印迹杂交测定病毒DNA复制中间体的水平。选择HBV高水平复制的细胞系并命名为具有不同克隆编号的HepBHAe。
通过用pcHA-HBe质粒转染HepG2细胞产生加HA标签的HBeAg稳定表达细胞系HepHA-HBe，用500μg/ml G418选择集落并且通过抗HA蛋白质印迹分析法鉴定阳性集落。
按照与HepG2相同的方式培养HepBHAe稳定细胞系和HepHA-HBe稳定细胞系，除了添加500μg/ml的G418。对于HepBHAe细胞，在维持期间按1μg/ml常规添加四环素以抑制HBVpgRNA转录。
细胞转染
将细胞(约1.0×106个)接种在胶原蛋白涂覆的35mm直径培养皿的无抗生素DMEM/F12培养基中。在温育过夜后，通过遵循制造商的说明，每个孔用总计4μg质粒以脂质转染胺2000(Life Technologies)转染。在指示的时间点收获转染的细胞样品或上清液样品。
病毒核酸分析
通过遵循制造商的操作方案，用TRIzol试剂(Life Technologies)提取细胞总RNA。将衣壳化的病毒pgRNA如下纯化：在250μl含有10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、1％NP-40和50mM NaCl裂解缓冲液中在37℃充分裂解来自一个12孔平板的细胞10分钟，并通过离心移除胞核。将样品与6U微球菌核酸酶和15μl 100mM CaCl2在37℃温育15分钟以消化游离的核酸。根据制造商的操作方案，通过添加750μlTRIzol LS试剂(Invitrogen)提取衣壳化的病毒pgRNA。将RNA样品通过1.5％含有2.2M甲醛的琼脂糖凝胶电泳并转移到20×SSC缓冲液(1×SSC是0.15M NaCl加0.015M柠檬酸钠)中的Hybond-XL膜(GEHealthcare)上。
将胞质病毒核心蛋白DNA如下提取：在0.5ml含有10mMTris-HCl，pH 8.0、10mMEDTA、1％NP40和2％蔗糖的裂解缓冲液中在37℃裂解来自一个35mm直径培养皿的细胞10分钟。通过离心移除细胞残片和胞核，并且将上清液在37℃与3μl 1M Mg(OAc)2和5μl 10mg/mlDNA酶I(Calbiochem)温育30分钟。上清液随后与15μl 0.5M EDTA和130μl含有1.5M NaCl的35％聚乙二醇(PEG)8000混合以沉淀核衣壳。在冰上温育1小时后，将病毒核衣壳通过在4℃按10,000转/分钟离心5分钟沉淀，随后在37℃在400μl含有0.5mg/ml链霉蛋白酶(Calbiochem)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、100mM NaCl、25mMTris-HCl(pH 7.4)和10mMEDTA的消化缓冲液中消化1小时。消化混合物苯酚提取，并且DNA用乙醇沉淀并溶解于TE(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)缓冲液中。来自每块平板的三分之一核心蛋白DNA样品由电泳法分离进入1.2％琼脂糖凝胶。凝胶随后在含有0.2N HCl的缓冲液中进行脱嘌呤，在含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的溶液中变性，并在含有1M Tris-HCl(pH 7.4)和1.5M NaCl的缓冲液内中和。DNA随后印迹到20×SSC缓冲液中的Hybond-XL膜上。
通过使用改良的Hirt提取程序实施无蛋白质的病毒DNA(cccDNA和无蛋白质的rcDNA)的提取(4,8)。简而言之，在3ml 10mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM EDTA和0.7％SDS中裂解来自一个35mm直径培养皿的细胞。在室温温育30分钟后，将裂解物转移至15ml管中，并且这个步骤后是添加0.8ml 5M NaCl及在4℃温育过夜。裂解物随后通过在4℃按10,000转/分钟离心30分钟澄清并用苯酚提取2次及用酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)提取一次。将DNA在室温在乙醇中沉淀过夜并溶解于TE缓冲液中。随后将三分之一的无蛋白质的DNA样品在1.2％琼脂糖凝胶中分离并转移到Hybond-XL膜上。
为了检测HBV RNA和DNA，用[α-32P]UTP(800Ci/mmol；PerkinElmer)标记的正链或负链特异性全长HBV Riboprobe探测膜。杂交在5ml EKONO杂交缓冲液(Genotech)中实施，在65℃预杂交1小时并在65℃杂交过夜，随后在65℃于0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤1小时。将膜对磷光成像仪屏曝光，并通过Typhoon FLA-7000系统(GEHealthcare)检测杂交信号。
蛋白质印迹分析
将35mm培养皿中的细胞用PBS缓冲液洗涤1次并在500μl 1×Laemmli缓冲液中裂解。将总计50μl细胞裂解物在SDS-12％聚丙烯酰胺凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜膜(Millipore)上。将膜用蛋白质印迹Breeze封闭缓冲液(Life Technologies)封闭并用针对HBcAg(aa170-183)、HA标签(Sigma-Aldrich，克隆M2)、β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)的抗体探测。通过IRDye第二抗体揭示结合的抗体。将免疫印迹信号用Li-COR Odyssey系统可视化和定量。
免疫沉淀
在0.5ml含有10mM Tris-HCl，pH 8.0、10mM EDTA、1％NP40、2％蔗糖和1×蛋白酶抑制剂混合物(G-biosciences)的裂解缓冲液中裂解来自一个35mm直径培养皿的细胞。在离心以除去细胞残片后，将澄清的细胞裂解物与50μl Ezview Red抗HA(Sigma-Aldrich)在4℃温育过夜伴以温和转动。来自一个35mm直径培养皿的0.5ml培养基样品(总计1ml)直接进行免疫沉淀。将珠在4℃用TBS缓冲液(0.15M NaCl、0.05M Tris-HCl[pH 7.4])洗涤3次。沉淀的珠用Laemmli缓冲液进行蛋白质样品制备。使用针对HA标签的抗体(Sigma-Aldrich)通过蛋白质印迹法检测免疫沉淀的加HA标签的蛋白质。
检测加HA标签的HBeAg的ELISA
对于化学发光酶免疫测定法(CLIA)检测加HA标签的HBeAg，将链霉亲和素涂布的高灵敏平板(黑色，目录号：15525，Thermo Scientific)用PBST(PBS外加0.05％Tween20)洗涤3次，并且随后在室温与50μl抗HA-生物素(目录号：A00203，Genscript；PBS中5μg/ml)温育30分钟，随后用200μlPBST洗涤3次。在移除洗涤缓冲液后，将50μl培养上清液样品添加于ELISA孔中并在室温温育30分钟，随后用200μlPBST洗涤3次。随后，将50μl辣根过氧化物酶(HRP缀合的抗HBe抗体(来自HBeAg CLIA试剂盒，目录号：CL0312-2，Autobio Diagnostics)添加于孔中并在室温温育30分钟。用200μlPBST洗涤5次后，添加来自CLIA试剂盒的25μl每种底物A和B并且将平板温和地振摇10秒。在光度计上读取平板。
对于AlphaLISA检测加HA标签的HBeAg，将抗HA-生物素(目录号：A00203，Genscript)在1×分析缓冲液(25mM HEPES、0.1M NaCl、0.1％BSA，pH 7.4)中稀释至2μg/ml并分配5μl至Proxiplate-384HS(目录号：6008279，Perkin Elmer)的每个孔中。随后将5μl培养液样品添加于各孔中并温和地混合，随后在室温温育30分钟。随后、添加5μl 0.2μg/ml抗HBe(克隆29，批号20110305，Autobio Diagnostics)并温和地混合，随后在室温温育30分钟。随后，将分析溶液与5μl稀释的抗小鼠IgG AlphaLISA接纳体珠(目录号：AL105C，PerkinElmer)(125μg/ml)混合并在室温温育30分钟，随后在室温与5μl AlphaScreen链霉亲和素供体珠(目录号：6760002S，Perkin Elmer)(125μg/ml)温育1小时。在温育后，在Envision2104多标记读数仪(Perkin Elmer)上读取平板。
结果
本文提供两种类型的分别从转基因和HBV cccDNA表达加HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)的新细胞系及通过化学发光免疫测定法和AlphaLISA测定法检测重组HBeAg的方法。细胞系和测定法适于高通量筛选减少HBV cccDNA水平和/或沉默cccDNA转录的化合物。
紧凑的HBV DNA基因组小尺寸和重叠基因组构造在转染的细胞中不影响病毒DNA复制和后续cccDNA形成的情况下限制了报道基因的插入。
前核心蛋白/HBeAg可以在HepDE19细胞中工程化成cccDNA依赖性(3)。本领域已知，HBV基因组具有显示重叠ORF和多个顺式元件的高度紧凑型基因构造。因此，认为基因插入/缺失或序列替换将很可能影响病毒DNA复制。先前的工作已经通过GFP替换HBV序列，如在大多数情况下的包膜蛋白编码区，以产生重组HBV基因组，但是需要病毒蛋白的反式互补以支持病毒复制和病毒粒装配(Protzer等人,PNAS(1999),96:10818-23)。另外，那些报告的重组HBV基因组如果用来感染容许性细胞则仅可以产生第一轮cccDNA合成，cccDNA的胞内扩增被阻断，原因是缺陷型病毒DNA复制。
即便有以上的现有技术知识，在本文中尝试以下情况并且其是合理的：在前核心蛋白可读框(ORF)中符合可读框地融合外源短表位标签可以由HBV基因组耐受并且从cccDNA模板表达，因此一对标签特异性抗体和HBeAg抗体将显著地改善ELISA检测的特异性。
为了构建具有人流感血凝素(HA)融合的前核心蛋白可读框的四环素诱导型HBV复制载体，将含有HA标签的DNA序列(gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc；SED IDNO.：41)插入与HBV表达载体pTREHBVDES中核心蛋白ORF的起始密码子毗邻的符合可读框的上游位置，其中HBV pgRNA表达以Tet-off方式受四环素(tet)调节的CMV-IE启动子控制。HA标签(大写)的侧翼序列(小写)设计成维持HBV基因组茎环结构(ε)的碱基配对和核心蛋白ORF起始密码子的Kozak基序(图1)。获得的重组质粒命名为pTREHBV-HAe(SEQ ID NO:35)。除了HA标签插入外，质粒pTREHBV-HAe还在前核心蛋白ORF的5'末端起始密码子中含有点缺失(ATG至TG)，藉此阻止前核心蛋白从质粒模板中的HBV基因组表达。此外，将两个串联终止密码子引入小(S)包膜蛋白氨基端的编码区中(217TTGTTG222 to 217TAGTAG222；突变加下划线)以阻断HBV感染性粒子的产生。
为了检验加表位标签的HBV前核心蛋白表达和HBeAg分泌的可行性，如上文所述，将含有HA标签的DNA序列插入前核心蛋白表达质粒pcHBe中的相同病毒DNA位置，并且构建体命名为pcHA-HBe(SEQID NO:39)。pcHA-HBe在HepG2细胞中的转染导致加HA标签的前核心蛋白的胞内表达和加HA标签的HBeAg的胞外积累(图2)，因此证实HA标签插入前核心蛋白不影响前核心蛋白表达、翻译后加工和HBeAg分泌。也已经建立用于检测加HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)的化学发光ELISA和AlphaLISA，如材料和方法章节中所述。
根据上文，通过将pcHA-HBe稳定转染入HepG2细胞，建立以组成型方式表达加HA标签的HBeAg的细胞系。通过AlphaLISA测定法选出高水平表达加HA标签的HBeAg的两个克隆，并且将它们分别命名为HepHA-HBe4和HepHA-HBe47(图3)。
在瞬时转染测定法中，重组HBV质粒pTREHBV-HAe能够复制HBV DNA到与pTREHBVDES所实现水平可比较的水平(图4)，提示HA标签插入由HBV基因组复制耐受。随后，将pTREHBV-HAe随pTET-off(Clontech)一起稳定共转染入HepG2细胞以产生四环素诱导型HBV细胞系。理论上，在这种细胞系中，一旦诱导，前核心蛋白和其衍生物HBeAg将不从转基因产生，原因在于前核心蛋白ORF起始密码子沉默。转录的pgRNA将表达病毒核心蛋白和聚合酶并启动逆转录以产生rcDNA，从而通过胞内扩增途径导致cccDNA形成。前核心蛋白不完整ORF在pgRNA的3’多余处的起始密码子将拷贝入病毒DNA序列，并且加HA标签的前核心蛋白的完整ORF将在rcDNA转变成cccDNA期间重构。因此，HA-前核心蛋白mRNA仅可以从cccDNA转录，产生核内cccDNA的分泌型加HA标签的HBeAg替代标记(图5)。
我们已经获得5个以四环素依赖性方式支持高水平HBV DNA复制的细胞系(HepBHAe1、HepBHAe13、HepBHAe34、HepBHAe45、HepBHAe82)(图6和图7)。
在代表性株系HepBHAe13细胞中，当撤除四环素时观察到病毒产物(包括复制型DNA中间体和cccDNA)合成和积累的时间依赖性动力学。在HepBHAe13细胞的培养液中，移除四环素后第6天还通过蛋白质印迹法检测到加HA标签的HBeAg，并且此后抗原水平逐渐增加。加HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)的水平与病毒核心蛋白DNA和cccDNA的胞内水平成正比(图6)。已经通过热变性和进一步限制性酶消化证实从HepBHAe细胞系产生的cccDNA的真实性(图8)。因此，已经建立了支持前核心蛋白中插入含有HA标签的重组HBV的DNA复制和cccDNA形成的诱导型细胞系。
在16天时间过程研究中，来自培养的HepBHAe细胞的上清液样品上的AlphaLISA测定法展示加HA标签的HBeAg的水平增加(图9)。选择HepHBAe13细胞以进一步验证。细胞在三种条件下培养：1)在四环素存在下以抑制转基因表达；2)在四环素不存在下以诱导病毒DNA复制；3)在四环素不存在下但是给予3TC处理以阻断病毒DNA复制及后续cccDNA形成。化学发光免疫测定法(CLIA)显示，作为cccDNA建立和基因表达的结果，培养基中加HA标签的HBeAg信号在撤除四环素后的第6天出现并且此后逐渐增加。如预测，在四环素存在下或在3TC处理(tet-)下的任何时间点在培养液中均未检出HA-HBeAg(图10)。另外，两种先前鉴定的cccDNA形成抑制剂，具体为CCC-0975和CCC-0346(3)、显示剂量依赖地抑制HA-HBeAg从HepBHAe13细胞产生(图11)。因此，HepBHAe13细胞中加HA标签的HBeAg的产生是cccDNA依赖的。
此外，对其他HepBHAe细胞系(包括HepBHAe1、HepBHAe45和HepBHAe82)的时间过程研究展示了撤除四环素时HBVmRNA、胞质核心蛋白DNA和核cccDNA的时间依赖性积累(图12)。如图13中所示，在这些三个额外的HepBHAe细胞系中验证了cccDNA依赖的加HA标签的HBeAg产生。
总之，本文中已经建立了新的诱导性型细胞系，所述细胞系以HBVcccDNA依赖方式表达加HA标签的HBeAg，后者可以在用本文所述的HA-HBeAg检测方法筛选抗病毒化合物中充当HBV cccDNA的替代标记。
本发明参考以下核苷酸序列和氨基酸序列。
本文中提供的序列在NCBI数据库中可获得并且可以在ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene从万维网取回；这些序列还涉及注释的和修饰的序列。本发明还提供其中使用本文所提供之简洁序列的同源序列和变体的技术和方法。优选地，这类“变体”是遗传变体。
SEQ ID NO：1：
编码血凝素(HA)标签的核苷酸序列
TACCCATACGACGTTCCAGATTACGCT
SEQ ID NO：2：
编码His标签的核苷酸序列
CATCATCATCATCATCAC
SEQ ID NO：3：
编码Flag标签的核苷酸序列
GACTACAAGCACGACGACGACAAG
SEQ ID NO：4：
编码c-myc标签的核苷酸序列
ATG GCA TCA ATG CAG AAG CTG ATC TCA GAG GAG GAC CTG
SEQ ID NO：5：
编码V5标签的核苷酸序列
GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG
SEQ ID NO：6：
编码C9标签的核苷酸序列
ACTGAAACATCTCAAGTAGCTCCAGCT
SEQ ID NO：7∶
编码3×Flag标签的核苷酸序列
GACTACAAAGACCACGACGGTGACTACAAAGACCACGACATCGACTACAAGGACGACGACGACAAG
SEQ ID NO：8：
HA标签的氨基酸序列
YPYDVPDYA
SEQ ID NO：9：
His标签的氨基酸序列
HHHHHH
SEQ ID NO：10：
Flag标签的氨基酸序列
DYKDDDDK
SEQ ID NO：11：
c-myc标签的氨基酸序列
EQKLISEEDL
SEQ ID NO：12：
V5标签的氨基酸序列
GKPIPNPLLGLDST
SEQ ID NO：13：
C9标签的氨基酸序列
TETSQVAPA
SEQ ID NO：14：
3×Flag标签的氨基酸序列
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
SEQ ID NO：15：
编码乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列
前核心蛋白ORF序列：
ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG
SEQ ID NO：16：
编码乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列
HBeAg DNA序列：
TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT
SEQ ID NO：17：
乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列
前核心蛋白的氨基酸序列：
MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC
SEQ ID NO：18：
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列
HBeAg氨基酸序列(从前核心蛋白除去N端信号肽(19aa)和C末端精氨酸丰富结构域(34aa))：
SKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
SEQ ID NO：19：
编码加HA标签乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列。
加HA标签的前核心蛋白DNA序列：
ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACCACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG
SEQ ID NO：20：
编码加HA标签的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列
加HA标签的HBeAg DNA序列：
TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT
SEQ ID NO：21：
加HA标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列。HA标签加下划线。
加HA标签的前核心蛋白的氨基酸序列：
MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDlDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC
SEQ ID NO：22：
加HA标签的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列。HA标签加下划线。
加HA标签的HBeAg氨基酸序列：
SKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
SEQ ID NO：23：
编码HBV核心蛋白的核苷酸序列ATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG
SEQ ID NO：24：
HBV核心蛋白的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC
SEQ ID NO：25：
如HBV基因组编码的ε结构的核苷酸序列
TGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACA
SEQ ID NO：26：
能够与嗜肝DNA病毒基因组的ε结构的下部茎形成碱基对的核苷酸序列
GTGGACATC
SEQ ID NO：27：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型D，亚型ayw。Genbank登录号U95551(C1902和A1903为粗体。前核心蛋白的ORF加下划线)AATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTGAATTTTATGGGTTATGTCATTGGAAGTTATGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAACTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCATTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTAATGCCCTTGTATGCATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCGTGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCCTCTCCCGCAAATATACATCGTATCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCGAATGTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGATTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGG GTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTG ACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCAT TGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGG TGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGC AACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTG TGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAG ACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGAT CTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGGAACTTTACTGGTCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGGAAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGAACAGTTTGTAGGCCCACTTACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGCCTGCTAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAACCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACACACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：28：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型A(Genbank登录号AP007263)
AATTCCACTGCCTTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACCCTGTGGCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTGGATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAGTACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCGTCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAAACCCTAACAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCCTAAACTTCATGGGTTACATAATTGGAAGTTGGGGAACTTTGCCACAGGATCATATTGTACAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAAACTTCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCTCCATTTACACAATGTGGATATCCTGCCTTAATGCCTTTGTATGCATGTATACAAGCTAAACAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATCGGAACTGACAATTCTGTCGTCCTCTCGCGGAAATATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTTCGCGGAACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCTCGGGGCCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGTCCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCATCAGATCCTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCCCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTACATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAGATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGTACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACAATTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGGACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCCTCTACAGTACCTATCTTTAATCCTGAATGGCAAACTCCTTCCTTTCCTAAGATTCATTTACAAGAGGACATTATTAATAGGTGTCAACAATTTGTGGGCCCTCTCACTGTAAATGAAAAGAGAAGATTGAAATTAATTATGCCTGCTAGATTCTATCCTACCCACACTAAATATTTGCCCTTAGACAAAGGAATTAAACCTTATTATCCAGATCAGGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGACATTATTTACATACTCTTTGGAAGGCTGGTATTCTATATAAGAGGGAAACCACACGTAGCGCATCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCATCAAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCCTCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGCCAACAGCCAACCAGGTAGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGGGGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：29：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型B(Genbank登录号AB602818)
AACTCCACCACTTTTCACCAAACTCTTCAAGATCCCAGAGTCCGGGCTCTGTACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAGCCCTGCTCAGAATACTGTCTCTGCCATATCGTCAATCTTATCGAAGACTGGGGACCCTGTGCCGAACATGGAGAACATCGCATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCACTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTCACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGGAGTTGGGGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAACTATGTTTTAGGAAACTTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTAAGTAAACAGTATCTAGCCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATCGGGACTGACAATTCTGTCGTGCTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCGTCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAAACCACCGTGAACGCCCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCACAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTCATGAGTGGGAGGAGCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAGTCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCGTCGGTACGAGACCTCCTAGATACCGCTGCTGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAATCTCCTGAACATTGCTCACCTCACCACACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGCTGGGGGGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTAGAAGATCCAGCGTCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAAGATCAGGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCGGCCTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCACCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTCTATTCTTCTACAGTACCTGTCTTTAATCCTGAATGGCAAACTCCTTCTTTTCCAGACATTCATTTGCAGGAGGATATTGTTGATAGATGTAAGCAATTTGTGGGACCCCTTACAGTAAATGAAAACAGGAGACTAAAATTAATAATGCCTGCTAGATTTTATCCTAATGTTACCAAATATTTGCCCTTAGATAAAGGGATCAAACCTTATTATCCAGAGCATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACAAGACATTATTTGCATACTCTTTGGAAGGCGGGTATCTTATATAAGAGAGAGTCAACACATAGCGCCTCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGAGGTTGGTCTTCCAAACCTCGAAAAGGCATGGGGACAAATCTTTCTGTCCCCAATCCCCTGGGATTCTTCCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCAAAGCCAACTCAGAAAATCCAGATTGGGACCTCAACCCACACAAGGACAACTGGCCGGACGCCCACAAGGTGGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCACGGGGGACTGTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTTACATCTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCTTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：30：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型C(Genbank登录号AB540584)
AACTCCACAACTTTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATACTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCATATCGTCAATCTTCACGAGGACTGGGGACCCTGTACCGAACATGGAGAACACAACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACAAGCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAMCTCTATGTTTCCCTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTAATAAAACCAAGCGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTTATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTACCACAGGAACATATTGTTCTAAAAATCAAACAATGTTTTCGGAAACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTCTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGGTATCCTGCCTTGATGCCTTTGTATGCATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAAGTATTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCAATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCTTAGCAGCCTGCTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCRAATCTTATTGGAACCGACAACTCCGTTGTCCTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGGTGTGCTGCAAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCAGCGGACGACCCGTCTCGGGGCCGTTTGGGACTCTACCGTCCCCTTCTTCGTCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCGGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCCATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGCCTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTCTGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGACCCAGCATCTAGGGAATTAGTAGTCAGTTATGTTAATGTTAATATGGGCCTAAAGATCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTCTTGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATACGCACTCCTCCCGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAATTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTCAATCCTGAGTGGCAAACTCCCTCCTTTCCTCACATTCATTTGCAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAATATGTGGGCCCTCTTACAGTTAATGAAAAAAGGAGATTAAAATTAATTATGCCTGCCAGGTTTTATCCTAACCGTACCAAATATTTGCCCCTAGATAAAGGCATTAAACCTTATTATCCTGAATATACAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGGCATTATTTACATACTCTGTGGAAGGCTGGCATTCTATATAAGAGAGAAACTACACGCAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGTCCTCCAAACCTCGAAAGGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGCTTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCGGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGATCACTGGCCAGCAGCAAACCAGGTAGGAGCGGGAGCCTTCGGGCCAGGGTTCACCCCACCGCACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCGTATTGACAACAGTGCCAGCAGCGCCTCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGCAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：31：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型E(Genbank登录号AP007262)
AATTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTAAGAGGCCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTGAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCACTCATCTCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAAGGCATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCTCCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGTACGGGACCCTGCCGAACCTGCACGACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCATGTTGTTGTTTAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCATGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCCGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATACCTCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAATCCCAACAAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTAAATTTCATGGGTTATGTAATTGGTAGTTGGGGGTCATTACCACAAGAACACATCAGACTGAAAATCAAAGACTGTTTTAGAAAGCTCCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTCTATATGCGTGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGTAAACAATATATGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGATGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATAGGGACAGATAATTCTGTCGTTCTCTCCCGGAAATATACATCATTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGAGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCCTCTCGGGGCCGCTTGGGGGTCTATCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAGATCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGACTAGATTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTAAGAGATCTTCTAGATACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGATGCCTTAGAATCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTTTGCTGGGGAGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTAAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAATACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTCATAGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGAATACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAGGTGGGAAATTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTAACTGGAAAACTCCATCTTTTCCTGATATTCATTTGCACCAGGACATTATTAACAAATGTGAACAATTTGTAGGTCCTYTAACAGTAAATGAAAAACGAAGATTAAACTTAGTCATGCCTGCTAGATTTTTTCCCATCTCCACGAAATATTTGCCCCTAGAGAAAGGTATAAAACCTTATTATCCAGATAATGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGACACTATTTACATACCCTATGGAAGGCGGGCATCTTATATAAAAGAGAAACTACCCGTAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCTTATTCTTGGGAACACGAGCTACATCATGGGGCTTTCTTGGACGGTCCCTCTCGAATGGGGGAAGAATCATTCCACCACCAATCCTCTGGGATTTTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCATTCAGAGCAAACACCAGAAATCCAGATTGGGACCACAATCCCAACAAAGACCACTGGACAGAAGCCAACAAGGTAGGAGTGGGAGCATTTGGGCCGGGGTTCACTCCCCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAAGGCATGCTAAAAACATTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCAATCACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：32：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型F(Genbank登录号HE974366)
AACTCAACCCAGTTCCATCAGGCTCTGTTGGATCCCAGGGTAAGGGCTCTGTATCTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACACAAAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTCTCACATCCTCAATCTTCTCGACGACTGGGGGCCCTGCTATGAACATGGACAACATTACATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGACTACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTACCAGGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGATCCACGACCACCAGCACGGGACCCTGCAAAACCTGCACAACTCTTGCACAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCCTGTTGCTGTTCAAAACCCTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTAGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCATGGCTCAGTTTACTAGTGCAATTTGTTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTAGTTATATTGATGATCTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCACCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTGTTATCTGTGGGTATCCATTTAAATACTTCTAAAACTAAGAGATGGGGTTACACCCTACATTTTATGGGTTATGTCATTGGTAGTTGGGGATCATTACCTCAAGATCATATTGTACACAAAATCAAAGAATGTTTTCGGAAACTGCCTGTAAATCGTCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCTGCCCCTTTCACACAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCTCTGTATGCTTGTATTACTGCTAAACAGGCTTTTGTTTTTTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGTAAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCCAGGCAACGGCCGGGCCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATTGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTTGCAGCTTGTTTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGACTCTCATCGGCACGGACAACTCTGTTGTCCTCTCTAGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTCGGGTGTGCTGCAAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTGTACCGCCCTCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCGACAACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTTCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCCTTGGAGTTTGCCAACAGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGGAGGGTCAATGACCCGGATTGCAGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGACTAGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGCGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGATTTCTTTCCATCGGTTCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTTTACCGGGATGCTTTAGAGTCACCTGAACATTGCACTCCCCATCACACTGCCCTCAGGCAAGTTATTTTGTGCTGGGGTGAGTTAATGACTTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAACTTGGAAGACCCTGCTGCCAGGGATTTAGTAGTTAACTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAAAATTAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGCCTTACTTTTGGAAGAGATATAGTTCTTGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCACAAAATGCCCCTATCCTATCCACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCCGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAATTTTACGGGGCTTTACTCTTCTACTGTGCCTGCTTTTAATCCTGACTGGTTAACTCCTTCTTTTCCTAATATTCATTTACATCAAGACCTAATTTCTAAATGTGAACAATTTGTAGGCCCACTCACTAAAAATGAATTAAGGAGGTTAAAATTGGTTATGCCAGCTAGATTTTATCCTAAGGTTACCAAATATTTTCCTATGGAGAAAGGAATCAAGCCTTATTATCCTGAGCATGCAGTTAATCATTACTTTAAAACAAGACATTATTTGCATACTTTATGGAAGGCGGGAATTTTATATAAGAGAGAATCCACACGTAGCGCATCATTTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTCTCAACGACAAGAAGAGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCAGACCATCAGCTGGATCCGCTATTCAAAGCAAATTCCAGCAGTCCCGACTGGGACTTCAACACAAACAAGGACAGTTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTGGGAGCATACGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTGCTGGGGTGGAGCCCTCAGGCACAAGGTATGTTAACAACCTTGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCTTCCACCAATCGGCGGTCCGGGAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGAGACACTCATCCACAGGCAATGCAGTGG
SEQ ID NO：33：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型G(Genbank登录号AP007264)
AACTCTACAGCATTCCACCAAGCTCTACAAAATCCCAAAGTCAGGGGCCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGGATAGTGAACCCTGTTCCGACTATTGCCTCTCACATCTCGTCAATCTTCTCCAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGTGCCCGTGTGTCCTGGCCTAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAATCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTGATTCCAGGATCCTCGACCACCAGTACGGGACCCTGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTATCCCTCATGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTACAACATCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATCTAAACCCTAACAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCTTAAATTTTATGGGATATGTAATTGGAAGTTGGGGTACTTTGCCACAAGAACACATCACACAGAAAATTAAGCAATGTTTTCGGAAACTCCCTGTTAACAGGCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTGGTCTGTTGGGTTTCGCTGCTCCTTTTACCCAATGTGGTTACCCTGCCTTAATGCCTTTATATGCATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTCTGTAAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTAGGCAACGGCCCGGTCTGTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATCGGCCATCAGCGCATGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCTGCTTGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAACTCATTGGGACTGACAATTCTGTCGTCCTTTCTCGGAAATATACATCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTTCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCAGCGGACGACCCCTCCCGGGGCCGTTTGGGGCTCTGTCGCCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCTGCCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTACATGGAAACCGCCATGAACACCTCTCATCATCTGCCAAGGCAGTTATATAAGAGGACTCTTGGACTGTTTGTTATGTCAACAACCGGGGTGGAGAAATACTTCAAGGACTGTGTTTTTGCTGAGTGGGAAGAATTAGGCAATGAGTCCAGGTTAATGACCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGTAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTAGGGCATGGATAGAACAACTTTGCCATATGGCCTTTTTGGCTTAGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTGCTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTTTTCCCGTCTGTTCGTGATCTTCTCGACACCGCTTCAGCTTTGTACCGGGAATCCTTAGAGTCCTCTGATCATTGTTCGCCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCAATCCTGTGCTGGGGTGAGTTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGAGATTTGGTGGTCAATTATGTTAATACTAATATGGGTTTAAAAATCAGGCAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACCGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTCGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTGCATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTGTATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTGATTGGCAAACTCCTTCTTTTCCAAATATCCATTTGCATCAAGACATTATAACTAAATGTGAACAATTTGTGGGCCCTCTCACAGTAAATGAGAAACGAAGATTAAAACTAGTTATGCCTGCCAGATTTTTCCCAAACTCTACTAAATATTTACCATTAGACAAAGGTATCAAACCGTATTATCCAGAAAATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACCAGACATTATTTACATACCCTTTGGAAGGCGGGTATTCTATATAAGAGAGAAACGTCCCGTAGCGCTTCATTTTGTGGGTCACCATATACTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCTTTCTTGGACGGTCCCTCTCGAGTGGGGAAAGAACCTTTCCACCAGCAATCCTCTAGGATTCCTTCCCGATCACCAGTTGGACCCAGCATTCAGAGCAAATACCAACAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAAAAAGGACCCTTGGCCAGAGGCCAACAAAGTAGGAGTTGGAGCCTATGGACCCGGGTTCACCCCTCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGTCTCAGGGCACACTAACAACTTTGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGTCAGTCAGGGAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCACTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：34：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型H(Genbank登录号AB516393)
AACTCAACACAGTTCCACCAAGCACTGTTGGATTCGAGAGTAAGGGGTCTGTATTTTCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGAAACACAGAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTCTCACATCATCAATCTTCTCGAAGACTGGGGACCCTGCTATGAACATGGAGAACATCACATCAGGACTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGACAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGTACCACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCACTTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTGTGTCCTCTACTTCCAGGATCTACAACCACCAGCACGGGACCCTGCAAAACCTGCACCACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTCCTGCTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCTTGGGCTTTCGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCTTGGCTCAGTTTACTAGTGCAATTTGCTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTTTAGTTATATGGATGATTTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCATCTTGAGTCCCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTTTGTTATCTGTGGGCATCCATTTGAACACAGCTAAAACAAAATGGTGGGGTTATTCCTTACACTTTATGGGTTATATAATTGGGAGTTGGGGGACCTTGCCTCAGGAACATATTGTGCATAAAATCAAAGATTGCTTTCGCAAACTTCCCGTGAATAGACCCATTGATTGGAAGGTTTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTGGGCTTTGCAGCCCCTTTTACTCAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCCTTGTATGCCTGTATTACCGCTAAGCAGGCTTTTGTTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGTCAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCAGGCCTTTGCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCGATTGGCCATCAGCGCATGCGCGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCCTGTTTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGGACGTTATCGGCACTGACAACTCCGTTGTCCTTTCTCGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCCTCTCGTGGTCGCTTGGGGCTCTGCCGCCCTCTTCTCCGCCTACCGTTCCGGCCGACGACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGCCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGCCCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCCTTGGAACTTGCCAACAACCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCGCCCCGGTCAACGACCTGGATTGAGGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGTCGGGGGAGGAGTTGAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCATTTTTGCCTTCTGACTTCTTCCCGTCTGTCCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTCTACCGAGATGCCTTAGAATCACCCGAACATTGCACCCCCAACCACACTGCTCTCAGGCAAGCTATTTTGTGCTGGGGTGAGTTGATGACCTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAATTTAGAGGATCCTGCAGCAAGAGATCTAGTAGTTAATTATGTCAATACTAACATGGGTCTAAAAATTAGACAATTATTATGGTTTCACATTTCCTGCCTTACATTTGGAAGAGAAACTGTGCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATCCGCACTCCACCTGCTTACAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACAACGAGGCAGGGCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCACCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAGGTGGGAAACTTTACCGGTCTTTACTCCTCTACTGTACCTGTTTTCAATCCTGACTGGTTAACTCCTTCTTTTCCTGACATTCACTTGCATCAAGATCTGATACAAAAATGTGAACAATTTGTAGGCCCACTCACTACAAATGAAAGGAGACGATTGAAACTAATTATGCCAGCTAGGTTTTATCCCAAAGTTACTAAATACTTCCCTTTGGATAAAGGTATTAAGCCTTACTATCCAGAGAATGTGGTTAATCATTACTTTAAAACTAGACATTATTTACATACTTTGTGGAAGGCAGGAATTCTATATAAGAGAGAATCCACACATAGCGCCTCATTTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTCTCAACGGCGAGAAGGGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGATTCTTTCCAGACCACCAGTTGGATVCACTATTCAGAGCAAATTCCAGCAGTCCCGATTGGGACTTCAACACAAACAAGGACAATTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTGGGAGGCTTCGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTTCTGGGGTGGAGCCCTCAGGCACAGGGCATTCTGACAACCTCGCCACCAGATCCACCTCCTGCTTCCACCAATCGGAGGTCAGGAAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGGGACACACATCCACAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：35：
载体pTREHBV-HAe的核苷酸序列(5，980nt)
载体：pTRE2(Clontech)
nt 356-452：HBV nt 1805-1902，具有A1816缺失
nt 453-491：HA标签插入，含侧翼序列
nt 462-488：HA标签序列
nt 492-3761：HBV nt 1903-3182/1-1990
SEQ ID NO:36：
编码HBV包膜蛋白表面大蛋白(L)的核苷酸序列
ATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA
SEQ ID NO：37：
编码HBV包膜蛋白表面中等蛋白(M)的核苷酸序列
ATGCAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTITGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA
SEQ ID NO：38：
编码HBV包膜蛋白表面小蛋白(S)的核苷酸序列
ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA
SEQ ID NO：39：
表达载体pcHA-HBe的核苷酸序列(6，682nt)
载体：pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)
nt 929-1015：HBVnt 1816-1902
nt 1016-1054：插入
nt 1025-1051：HA标签序列
nt 1055-21 12：HBV1903-2605/1573-1926
SEQ ID NO:40：
标签N末端的氨基酸序列
VDI
SEQ ID NO:41：
包含5’和3’额外核苷酸的编码HA标签核苷酸序列。加下划线的核苷酸显示编码HA标签的序列。
GTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGC
SEQ ID NO:42：
包含N末端和C末端额外氨基酸的HA标签的氨基酸序列。加下划线的氨基酸残基显示HA标签的序列。
VDIYPYDVPDYAG
如本文中讨论的额外参考文献
1.Arzumanyan,A.,H.M.Reis和M.A.Feitelson.2013.Pathogenic mechanisms inHBV-and HCV-associated hepatocellular carcinoma.Nature reviews.Cancer 13:123-135.
2.Block,T.M.,H.Guo和J.T.Guo.2007.Molecular virology of hepatitis Bvirus for clinicians.Clin Liver Dis 11:685-706,vii.
3.Cai,D.,C.Mills,W.Yu,R.Yan,C.E.Aldrich,J.R.Saputelli,W.S.Mason,X.Xu,J.T.Guo,T.M.Block,A.Cuconati和H.Guo.2012.Identification of disubstitutedsulfonamide compounds as specific inhibitors of hepatitis B virus covalentlyclosed circular DNA formation.Antimicrob Agents Chemother 56:4277-4288.
4.Cai,D.,H.Nie,R.Yan,J.T.Guo,T.M.Block和H.Guo.2013.A southern blotassay for detection of hepatitis B virus covalently closed circular DNA fromcell cultures.Methods Mol Biol 1030:151-161.
5.Galibert,F.,E.Mandart,F.Fitoussi和P.Charnay.1979.Nucleotidesequence of the hepatitis B virus genome(subtype ayw)cloned in E.coli.Nature281:646-650.
6.Gish,R.G.,A.S.Lok,T.T.Chang,R.A.de Man,A.Gadano,J.Sollano,K.H.Han,Y.C.Chao,S.D.Lee,M.Harris,J.Yang,R.Colonno和H.Brett-Smith.2007.Entecavirtherapy for up to 96weeks in patients with HBeAg-positive chronic hepatitisB.Gastroenterology133:1437-1444.
7.Guo,H.,D.Jiang,T.Zhou,A.Cuconati,T.M.Block和J.T.Guo.2007.Characterization of the intracellular deproteinized relaxedcircular DNA of hepatitis B virus:an intermediate of covalently closedcircular DNA formation.J Virol 81:12472-12484.
8.Hirt,B.1967.Selective extraction of polyoma DNA from infected mousecell cultures.J Mol Biol 26:365-369.
9.Hoofnagle,J.H.,E.Doo,T.J.Liang,R.Fleischer和A.S.Lok.2007.Managementof hepatitis B:summary of a clinical research workshop.Hepatology 45:1056-1075.
10.Ito,K.,K.H.Kim,A.S.Lok和S.Tong.2009.Characterization of genotype-specific carboxyl-terminal cleavage sites of hepatitis B virus e antigenprecursor and identification of furin as the candidate enzyme.J Virol 83:3507-3517.
11.Ladner,S.K.,M.J.Otto,C.S.Barker,K.Zaifert,G.H.Wang,J.T.Guo,C.Seeger和R.W.King.1997.Inducible expression of human hepatitis B virus(HBV)in stably transfected hepatoblastoma cells:a novel system for screeningpotential inhibitors of HBV replication.Antimicrob Agents Chemother 41:1715-1720.
12.Liang,T.J.2009.Hepatitis B:the virus and disease.Hepatology 49:S13-21.
13.Liu,N.,L.Ji,M.L.Maguire和D.D.Loeb.2004.cis-Acting sequences thatcontribute to the synthesis of relaxed-circular DNA of human hepatitis Bvirus.J Virol 78:642-649.
14.McMahon,B.J.2014.Chronic hepatitis B virus infection.The Medicalclinics of North America 98:39-54.
15.Nassal,M.2008.Hepatitis B viruses:reverse transcription adifferent way.Virus Res 134:235-249.
16.Pawlotsky,J.M.,G.Dusheiko,A.Hatzakis,D.Lau,G.Lau,T.J.Liang,S.Locarnini,P.Martin,D.D.Richman和F.Zoulim.2008.Virologic monitoring ofhepatitis B virus therapy in clinical trials and practice:recommendations fora standardized approach.Gastroenterology 134:405-415.
17.Protzer,U.,M.Nassal,P.W.Chiang,M.Kirschfink和H.Schaller.1999.Interferon gene transfer by a hepatitis B virus vectorefficiently suppresses wild-type virus infection.Proc Natl Acad Sci U S A96:10818-10823.
18.Quasdorff,M.和U.Protzer.2010.Control of hepatitis B virus at thelevel of transcription.J Viral Hepat 17:527-536.
19.Seeger,C.和W.S.Mason.2000.Hepatitis B virus biology.Microbiol MolBiol Rev 64:51-68.
20.Sells,M.A.,M.Chen和G.Acs.1987.Production of hepatitis B virusparticles in hepG2cells transfected with cloned hepatitis B virusDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:1005-1009.
21.Wang,J.,A.S.Lee和J.H.Ou.1991.Proteolytic conversion of hepatitis Bvirus e antigen precursor to end product occurs in a postendoplasmicreticulum compartment.J Virol 65:5080-5083.
22.Wang,Z.,L.Wu,X.Cheng,S.Liu,B.Li,H.Li,F.Kang,J.Wang,H.Xia,C.Ping,M.Nassal和D.Sun.2013.Replication-competent infectious hepatitis B virusvectors carrying substantially sized transgenes by redesigned viralpolymerase translation.PLoS One8:e60306.
23.Zhou,T.,H.Guo,J.T.Guo,A.Cuconati,A.Mehta和T.M.Block.2006.HepatitisB virus e antigen production is dependent upon covalently closed circular(ccc)DNA in HepAD38cell cultures and may serve as a cccDNA surrogate inantiviral screening assays.Antiviral Res72:116-124.
24.Zoulim,F.和S.Locarnini.2009.Hepatitis B virus resistance tonucleos(t)ide analogues.Gastroenterology 137:1593-1608e1591-1592.
本文中提到的全部参考文献通过引用的方式完整并入。现在已经充分描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以在宽大和等同的条件、参数等范围内实施本发明而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。
根据上文并且还如所附权利要求中所阐述，本发明尤其涉及以下项：
1.一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状(ccc)DNA的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选择候选分子。
2.项1的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV))并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
3.项1或2的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
4.项3的方法，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
5.项3或4的方法，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
6.项5的方法，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
7.项1或2的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个或更多个标签。
8.项7的方法，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
9.项7或8的方法，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
10.根据项7至9中任一项的方法，其中所述两个或更多个标签是以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。
11.项10的方法，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
12.项5或10的方法，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ ID NO:6中显示。
13.项6或11的方法，其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；或其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
14.项5或10的方法，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
15.项6或11的方法，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
16.根据项2至15中任一项的方法，其中编码HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:16中显示。
17.根据项2至15中任一项的方法，其中HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中显示。
18.根据项1至17中任一项的方法，其中核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。
19.项18的方法，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。
20.项18的方法，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
21.根据项1至17中任一项的方法，其中核酸分子包含编码一个或多个标签的核酸序列，其中所述序列在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游。
22.项21的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游。
23.根据项1至22中任一项的方法，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因组。
24.项23的方法，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是乙型肝炎病毒(HBV)基因组。
25.项24的方法，其中所述HBV基因组是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。
26.项24的方法，其中所述HBV基因组是HBV基因型D的基因组。
27.项26的方法，其中所述HBV基因型D的基因组是HBV亚基因型ayw的基因组。
28.根据项中任一项的方法1至27，其中编码一个或多个标签的核酸在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。
29.项28的方法，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。
30.项29的方法，其中编码HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO:23中显示。
31.项29的方法，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
32.根据项1至31中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构。
33.项32的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
34.项33的方法，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
35.根据1至34项中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎。
36.项35的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
37.根据项1至36中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。
38.根据项1至37中任一项的方法，其中核酸分子在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列。
39.项38的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列能够与对应于HBV基因组位置T1849至A1854的核苷酸形成碱基对。
40.项38或39的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由至多9个核苷酸组成。
41.项40的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成，或其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
42.根据项1至41中任一项的方法，其中核酸分子在编码一个或多个标签的序列的3’包含编码接头的序列。
43.项42的方法，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。
44.项42的方法，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
45.项44的方法，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
46.根据项42至44中任一项的方法，其中所述编码接头的序列由序列GGC组成；或其中所述序列编码甘氨酸残基。
47.根据项1至46中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含编码如SEQID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
48.根据项1至47中任一项的方法，其中所述一个或多个标签符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。
49.项48的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
50.根据项2至49中任一项的方法，其中编码加标签的HBeAg的核酸序列在SEQ IDNO:20中显示。
51.根据项2至50中任一项的方法，其中加标签的HBeAg的氨基酸序列在SEQ IDNO:22中显示。
52.根据项2至51中任一项的方法，其中编码加标签的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
53.根据项2至52中任一项的方法，其中加标签的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
54.根据项24至53中任一项的方法，其中HBV基因组的核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一项中显示。
55.根据项中任一项的方法23至54，其中核酸转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒RNA、尤其前基因组(pg)HBV RNA。
56.根据项1至55中任一项的方法，其中所述核酸阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
57.项56的方法，其中所述核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。
58.项56或57的方法，其中在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG已经由核酸TG替换。
59.根据项56至58中任一项的方法，其中所述核酸已经通过点突变被修饰以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
60.根据项1至59中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于载体中。
61.项60的方法，其中载体包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
62.根据项1至61中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在诱导型启动子的控制下。
63.项56至62中任一项所述的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
64.项62或63的方法，其中诱导型启动子是四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子或除草剂诱导型启动子。
65.根据项62至64中任一项的方法，其中诱导型启动子是CMV启动子或tet-EF-1α启动子。
66.根据项23至65中任一项的方法，其中将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的编码区。
67.项66的方法，其中所述一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一种或多种HBV包膜蛋白。
68.项67的方法，其中一种或多种HBV包膜蛋白是表面大蛋白(L)、表面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。
69.项67的方法，其中HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。
70.根据67至69项中任一项的方法，其中一种或多种HBV包膜蛋白的编码区在SEQID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或SEQ ID NO:38(S)中显示。
71.项70的方法，其中将SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突变成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
72.根据项1至71中任一项的方法，其中细胞是真核细胞。
73.项72的方法，其中真核细胞是肝细胞来源的。
74.项72或73的方法，其中真核细胞是肝瘤细胞或衍生自肝瘤细胞。
75.根据项72至74中任一项的方法，其中真核细胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。
76.根据项1至75中任一项的方法，其中核酸分子或包含前者的载体稳定整合在细胞的基因组中。
77.根据项1至76中任一项的方法，其中所述步骤(a)还包括步骤(aa)，所述步骤(aa)包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组(pg)RNA；
(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)任选地恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。
78.项77的方法，其中恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件是恢复起始密码子。
79.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒ccc DNA形成的能力。
80.项79的方法，其中细胞在cccDNA已经形成之前与候选分子接触。
81.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子减少嗜肝DNA病毒ccc DNA的量或数目的能力。
82.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子减少嗜肝DNA病毒ccc DNA转录的能力。
83.项81或82的方法，其中细胞在cccDNA已经形成之后与候选分子接触。
84.根据项1至83中任一项的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
85.根据项1至84中任一项的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种抗体。
86.根据项77至85中任一项的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV))并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
87.核酸分子，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。
88.项87的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
89.项87或88的核酸分子，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
90.项89的核酸分子，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
91.项89或90的核酸分子，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
92.项91的核酸分子，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
93.项87或88的核酸分子，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个或更多个标签。
94.项93的核酸分子，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
95.项93或94的核酸分子，其中所述两个或更多个标签的整个长度是14至31个氨基酸。
96.项93至95中任一项的核酸分子，其中所述两个或更多个标签是以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。
97.项96的核酸分子，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
98.项91或96中任一项的核酸分子，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ ID NO:6中显示。
99.项92或97的核酸分子，
其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；或
其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
100.项91或96的核酸分子，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
101.项92或97的核酸分子，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
102.项88至101中任一项的核酸分子，其中编码HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:16中显示。
103.项88至101中任一项的核酸分子，其中HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中显示。
104.项87至103中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。
105.项104的核酸分子，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ IDNO:15中显示。
106.项104的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
107.项87至106中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含编码一个或多个标签的核酸序列，其中所述序列在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头(“前核心蛋白”区域)的核酸序列的3'下游。
108.项107的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3’下游。
109.项87至108中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因组。
110.项109的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是乙型肝炎病毒(HBV)基因组。
111.项110的核酸分子，其中所述HBV基因组是HBV基因型A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。
112.项110的核酸分子，其中所述HBV基因组是HBV基因型D的基因组。
113.项112的核酸分子，其中所述HBV基因型D的基因组是HBV亚基因型ayw的基因组。
114.项87至113中任一项的核酸分子，其中编码一个或多个标签的核酸在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。
115.项114的核酸分子，其中核酸序列编码HBV核心蛋白。
116.项115的核酸分子，其中编码HBV核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:23中显示。
117.项114的核酸分子，其中核心蛋白是HBV核心蛋白。
118.项116的核酸分子，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
119.项87至118中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构。
120.项119的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
121.项120的核酸分子，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
122.项87至121中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎。
123.项122的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
124.项87至123中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和A1903相对应的核苷酸之间。
125.项87至124中任一项的核酸分子，其中核酸分子在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列。
126.项125的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列能够与对应于HBV基因组位置T1849至A1854的核苷酸形成碱基对。
127.项125或126的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由至多9个核苷酸组成。
128.项127的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成，或其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
129.项87至128中任一项的核酸分子，其中核酸分子在编码一个或多个标签的序列的3’包含编码接头的序列。
130.项129的核酸分子，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。131.项129的核酸分子，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
132.项131的核酸分子，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
133.项129至131中任一项的核酸分子，其中所述编码接头的序列由序列GGC组成；或其中所述序列编码甘氨酸残基。
134.项87至133中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含编码如SEQID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
135.项87至134中任一项的核酸分子，其中所述一个或多个标签符合可读框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原中。
136.项135的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
137.项88至136中任一项的核酸分子，其中编码加标签的HBeAg的核酸序列在SEQID NO:20中显示。
138.项88至137中任一项的核酸分子，其中加标签的HBeAg的氨基酸序列在SEQ IDNO:22中显示。
139.项88至138中任一项的核酸分子，其中编码加标签的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
140.项88至139中任一项的核酸分子，其中加标签的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
141.项110至140中任一项的核酸分子，其中HBV基因组的核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一项中显示。
142.项109至141中任一项的核酸分子，其中核酸转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒RNA。
143.项142的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒RNA是HBV RNA。
144.项87至143中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于载体中。
145.项144的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
146.项87至145中任一项的核酸分子，其中所述核酸允许加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
147.项146的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
148.项147的核酸分子，其中核酸包含于包含如SEQ ID NO:39中所显示的序列的载体中。
149.项87至148中任一项的核酸分子，其中所述核酸阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
150.项149的核酸分子，其中所述核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。
151.项147或150的核酸分子，其中在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG已经由核酸TG替换。
152.项147至151中任一项的核酸分子，其中所述核酸已经通过点突变被修饰以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
153.项144、145和149至152中任一项的核酸分子，其中载体包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
154.项87至153中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在诱导型启动子的控制下。
155.项149至154中任一项的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
156.项154或155的核酸分子，其中诱导型启动子是四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子，或除草剂诱导型启动子。
157.项154至156中任一项的核酸分子，其中诱导型启动子是CMV启动子或tet-EF-1α启动子。
158.项110至157中任一项的核酸分子，其中将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的编码区。
159.项158的核酸分子，其中所述一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一种或多种HBV包膜蛋白。
160.项159的核酸分子，其中一种或多种HBV包膜蛋白是以下一者或多者：L、M和/或S。
161.项159的核酸分子，其中HBV包膜蛋白是S。
162.项159至161中任一项的核酸分子，其中一种或多种HBV包膜蛋白的编码区在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中显示。
163.项162的核酸分子，其中将SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突变成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
164.蛋白质，如项87至163中任一项中所限定的核酸分子编码。
165.蛋白质，包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。
166.项165的蛋白质，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
167.项166的蛋白质，其中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)包含如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
168.项165至167中任一项的蛋白质，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
169.项168的蛋白质，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
170.项165至169中任一项的蛋白质，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
171.项170的蛋白质，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
172.项165至167中任一项的蛋白质，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个或更多个标签。
173.项172的蛋白质，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
174.项172或173的蛋白质，其中所述两个或更多个标签的整个长度是14至31个氨基酸。
175.项172至174中任一项的蛋白质，其中所述两个或更多个标签是以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。
176.项175的蛋白质，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
177.项170或175的蛋白质，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ ID NO:6中显示。
178.项171或176的蛋白质，
其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；或
其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
179.项170或175的蛋白质，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
180.项171或176的蛋白质，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
181.项165至180中任一项的蛋白质，包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。
182.项181的蛋白质，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。
183.项181的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
184.项165至183中任一项的蛋白质，其中蛋白质包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信号肽和接头的氨基酸序列序列的C末端。
185.项184的蛋白质，其中所述包含一个或多个标签的氨基酸序的蛋白质在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的氨基酸序列的C末端。
186.项165至183中任一项的蛋白质，其中蛋白质包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序列的N末端。
187.项186的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。
188.项187的蛋白质，其中编码HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO:23中显示。
189.项187的蛋白质，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
190.项165至189中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构编码的氨基酸序列。
191.项190的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
192.项191的蛋白质，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
193.项165至192中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎编码的氨基酸序列。
194.项193的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
195.项165至194中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基酸序列插入与HBV前核心蛋白(如SEQ ID NO:17中所显示的一种)的位置G29和位置M30相对应的氨基酸残之间。
196.项165至195中任一项的蛋白质，还在一个或多个标签的氨基酸序列的N末端包含至多3个氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3个氨基酸的氨基酸序列由能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基配对的核酸序列编码。
197.项196的蛋白质，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的核酸序列能够与对应于HBV基因组位置T1849至A1854的核苷酸形成碱基对。
198.项198的蛋白质，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。
199.项196至198中任一项的蛋白质，其中所述至多3个氨基酸的氨基酸序列在SEQID NO:40中显示。
200.项165至199中任一项的蛋白质，还在一个或多个标签的氨基酸序列的C末端包含接头。
201.项200的蛋白质，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。202.项201的蛋白质，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
203.项202的蛋白质，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
204.项1至46中任一项的蛋白质，其中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列编码的氨基酸序列；或
其中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列。
205.项165至204中任一项的蛋白质，其中所述一个或多个标签符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。
206.项205的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
207.项166至206中任一项的蛋白质，其中编码加标签的HBeAg的核酸序列在SEQID NO:20中显示。
208.项166至207中任一项的蛋白质，其中加标签的HBeAg的氨基酸序列在SEQ IDNO:22中显示。
209.项166至208中任一项的蛋白质，其中编码加标签的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
210.项166至209中任一项的蛋白质，其中加标签的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
211.宿主细胞，包含项87至163中任一项的核酸分子或项164至210中任一项的蛋白质。
212.项211的宿主细胞，其中细胞是真核细胞。
213.项212的宿主细胞，其中真核细胞是肝细胞来源的。
214.项212或213的宿主细胞，其中真核细胞是肝瘤细胞或衍生自肝瘤细胞。
215.项212至214中任一项的宿主细胞，其中真核细胞是HepG2(ATCC#HB-8065)。
216.用于产生如项164至210中任一项所限定的蛋白质的方法，所述方法包括在允许蛋白质表达的条件下培养项210至215中任一项的宿主并且从培养物回收产生的蛋白质。
217.试剂盒，用于项1至86中任一项的方法中。
218.试剂盒，包含特异性识别如项165至167中任一项所限定的嗜肝DNA病毒抗原e的抗体和特异性识别如项168至180中任一项所限定的一个或多个标签的一种或多种抗体。
219.项87至163中任一项的核酸分子、项164至210中任一项的蛋白质和/或项中211至215任一项的宿主细胞的用途，用于筛选疑似能够抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子。

Claims (22)

1.一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状(ccc)DNA的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选择候选分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV)并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签；或其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个或更多个标签。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签(如1×Flag标签或3×Flag标签)、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。
5.根据权利要求4所述的方法，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；
其中编码His标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；
其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；
其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示；
其中编码c-myc标签的核酸序列在SEQ ID NO:4中显示；
其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；
和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ ID NO:6中显示；
或
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。
7.根据权利要求6所述的方法，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列是如SEQID NO:15中所显示的乙型肝炎病毒前核心蛋白的核酸序列；或
其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO:17中所显示的乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因组，如在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34任一者中所显示的乙型肝炎病毒(HBV))基因组。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述HBV基因组是HBV亚基因型ayw的基因组。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构中，如SEQ ID NO:25中所显示的HBV基因组编码的ε结构中。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中核酸分子在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列。
14.根据权利要求13所述的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列能够与对应于HBV基因组位置T1849至A1854的核苷酸形成碱基对。
15.根据权利要求14所述的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成，或其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含编码如SEQ IDNO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
17.根据权利要求2至16中任一项所述的方法，
其中编码加标签的HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:20中显示；或其中加标签的HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中显示；或
根据权利要求6至16中任一项所述的方法，其中编码加标签的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示；或其中加标签的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述步骤(a)还包括步骤(aa)，所述步骤(aa)包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组(pg)RNA；
(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)任选地恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，
其中恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件是恢复起始密码子。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种抗体。
21.核酸分子，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。
22.蛋白质，由如权利要求21中限定的核酸分子编码。
CN201580032914.9A 2014-06-20 2015-06-19 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途 Active CN106716128B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462014996P 2014-06-20 2014-06-20
US62/014,996 2014-06-20
PCT/EP2015/063838 WO2015193484A1 (en) 2014-06-20 2015-06-19 Tagged hepadnavirus e antigen and its use in screening antiviral substances

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106716128A true CN106716128A (zh) 2017-05-24
CN106716128B CN106716128B (zh) 2020-06-23

Family

ID=53498969

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580032914.9A Active CN106716128B (zh) 2014-06-20 2015-06-19 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途

Country Status (10)

Country Link
US (2) US10072047B2 (zh)
EP (2) EP3157944B1 (zh)
JP (1) JP6543338B2 (zh)
KR (1) KR102309355B1 (zh)
CN (1) CN106716128B (zh)
BR (1) BR112016024458A2 (zh)
CA (1) CA2943047C (zh)
MX (1) MX2016014359A (zh)
RU (1) RU2711750C2 (zh)
WO (1) WO2015193484A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022543A (zh) * 2017-05-25 2017-08-08 郑州市第六人民医院 一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒
CN108611395A (zh) * 2016-12-12 2018-10-02 中山大学 一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法
CN113293179A (zh) * 2021-05-10 2021-08-24 武汉科技大学 一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法和应用
CN113832169A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 厦门大学 靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020072207A1 (en) * 2018-10-04 2020-04-09 The Rockefeller University Rna-based methods to launch hepatitis b virus infection
KR20220095183A (ko) * 2019-08-29 2022-07-06 지 테크 바이오 엘엘씨 바이러스 감염을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104867A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法
WO2013181584A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Guo, Ju-Tao Modulation of hepatitis b virus cccdna transcription

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101104867A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 中国人民解放军第四军医大学 检测乙型肝炎病毒cccDNA的巢式-实时定量PCR方法
WO2013181584A2 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 Guo, Ju-Tao Modulation of hepatitis b virus cccdna transcription

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHIH-YUNG YANG ET AL.: "Human Hepatitis B Viral e Antigen Interacts with Cellular Interleukin-1 Receptor Accessory Protein and Triggers Interleukin-1 Response", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 *
DAWEI CAI ET AL.: "Identification of Disubstituted Sulfonamide Compounds as Specific Inhibitors of Hepatitis B Virus Covalently Closed Circular DNA Formation", 《ANTIMICROBIAL AGENTS AND CHEMOTHERAPY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108611395A (zh) * 2016-12-12 2018-10-02 中山大学 一种抗人乙肝病毒药物的筛选方法
CN107022543A (zh) * 2017-05-25 2017-08-08 郑州市第六人民医院 一种提取乙型肝炎病毒核酸用磁珠、提取试剂、提取方法、定量检测用试剂盒
CN113832169A (zh) * 2020-06-24 2021-12-24 厦门大学 靶向HBV cccDNA的药物筛选模型及方法
CN113293179A (zh) * 2021-05-10 2021-08-24 武汉科技大学 一种靶向敲除HBx蛋白的质粒及其构建方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2943047A1 (en) 2015-12-23
RU2016152429A (ru) 2018-07-23
US10072047B2 (en) 2018-09-11
US10214567B2 (en) 2019-02-26
EP3521303A1 (en) 2019-08-07
RU2016152429A3 (zh) 2019-02-27
JP6543338B2 (ja) 2019-07-10
CN106716128B (zh) 2020-06-23
CA2943047C (en) 2023-03-14
EP3157944A1 (en) 2017-04-26
MX2016014359A (es) 2017-06-12
KR102309355B1 (ko) 2021-10-06
US20180312546A1 (en) 2018-11-01
WO2015193484A1 (en) 2015-12-23
US20170240600A1 (en) 2017-08-24
EP3157944B1 (en) 2019-10-09
JP2017518081A (ja) 2017-07-06
KR20170068411A (ko) 2017-06-19
RU2711750C2 (ru) 2020-01-21
BR112016024458A2 (pt) 2017-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106716128A (zh) 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途
Suzuki et al. Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein
Zhong et al. Sodium taurocholate cotransporting polypeptide mediates woolly monkey hepatitis B virus infection of Tupaia hepatocytes
Modahl et al. RNA-dependent replication and transcription of hepatitis delta virus RNA involve distinct cellular RNA polymerases
Nakanishi et al. Association with capsid proteins promotes nuclear targeting of simian virus 40 DNA.
Li et al. The unexpected roles of eukaryotic translation elongation factors in RNA virus replication and pathogenesis
Tang et al. The transcriptional transactivation function of HBx protein is important for its augmentation role in hepatitis B virus replication
Blanchet et al. Infectivity determinants of the hepatitis B virus pre-S domain are confined to the N-terminal 75 amino acid residues
Liu et al. White spot syndrome virus annexes a shrimp STAT to enhance expression of the immediate-early gene ie1
Griffin et al. Signal peptide cleavage and internal targeting signals direct the hepatitis C virus p7 protein to distinct intracellular membranes
Cai et al. Establishment of an inducible HBV stable cell line that expresses cccDNA-dependent epitope-tagged HBeAg for screening of cccDNA modulators
Müller et al. Characterisation of the hepatitis B virus cross-species transmission pattern via Na+/taurocholate co-transporting polypeptides from 11 New World and Old World primate species
CN104662036A (zh) 乙肝肝炎病毒功能性受体的组成以及相关应用
JPH05508219A (ja) 抗ｈｃｖ抗体の免疫アッセイに使用するｃ型肝炎ウイルス（ｈｃｖ）抗原の組合せ
US20100316989A1 (en) Method for screening an inhibitory agent of hbv proliferation by using the interaction between hbv capsid and surface proteins based on cellular imaging
Guo et al. Membrane association of greasy grouper nervous necrosis virus protein A and characterization of its mitochondrial localization targeting signal
CN102653771B (zh) 谷氨酰胺转运蛋白1融合蛋白表达载体的应用
Peng et al. Borna disease virus P protein affects neural transmission through interactions with gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein
CN110747199B (zh) 蜜蜂抗逆相关基因nf-y及其应用
JPWO2015178444A1 (ja) オートファジーの測定に好適な融合タンパク質、前記融合タンパク質をコードする核酸、及びそれらの利用
WO2011145885A2 (ko) B형 간염 치료활성 물질의 스크리닝용 조성물 및 스크리닝 방법
Stapleford et al. Mitochondrion-enriched anionic phospholipids facilitate flock house virus RNA polymerase membrane association
Dalton et al. Olfactory and vomeronasal receptor feedback employ divergent mechanisms of PERK activation
CN102174518B (zh) 虾白斑综合征病毒iel启动子主要顺式作用元件及与其结合的转录因子和应用
TWI515203B (zh) 衍生自雞貧血病毒（ｃａｖ）ｖｐ２蛋白質的細胞核定位信號胜肽以及它們的應用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1237030

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant