JP2017518081A - タグ付きヘパドナウイルスe抗原、および抗ウイルス物質のスクリーニングにおけるそれの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
したがって、本発明は、候補分子がヘパドナウイルスのccc(共有結合閉環状)DNAを阻害する能力を査定するための方法であって、
(a)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる;
(b)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルを査定する;および
(c)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する;
工程を含む方法に関する。
用語“共有結合閉環状DNA”と“cccDNA”は、本明細書中で互換性をもって用いられる。用語“共有結合閉環状DNA”/“cccDNA”は当技術分野で周知であり、本明細書中でそれに従って用いられる。一般に、本明細書中で用いる“共有結合閉環状DNA”/“cccDNA”は、ヘパドナウイルスmRNAの基準エピソーム転写鋳型として使われるDNAを表わす。
1 .HepBHAe細胞系を用いる、cccDNAの安定性および/または転写活性を調節する化合物/候補分子のスクリーニング;
本発明によれば、in vitro アッセイ法を用いて、化合物/候補分子が核におけるcccDNA安定性または転写活性を調節する効力をスクリーニング/評価できる。それらの化合物/候補分子はそれにより培養上清中のタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)のレベルを変化させる。このアッセイを実施するために、細胞をまずテトラサイクリンの存在下で培養プレートに播種することができ、細胞が周密状態に達した後、培地を無テトラサイクリン培地と交換してヘパドナウイルス(たとえばHBV)のDNA複製およびcccDNA形成を誘導する;それには普通は6〜8日かかる。その後、テトラサイクリンを再び添加して、組み込まれたHBVゲノムからの de novo ウイルスDNA複製を遮断し、それと共に3TC(または他のHBVポリメラーゼ阻害剤)を添加してcccDNAの細胞内増幅経路をブロックすることができる。同時に、被験化合物を一定期間、培地に添加しておくことができる。培地を次いでタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)のELISA測定に使用できる。その化合物を含有しないウェルからの培地を対照として使用できる。培地中のタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)レベルを低下させる有効化合物は、cccDNAターンオーバーを促進する活性またはcccDNA転写を抑制する活性をもつ可能性がある。“有効または効果的に”という句は、本明細書中で、化合物が特定の試験濃度で本発明の細胞ベースのアッセイ系でタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)の産生を阻止し、好ましくは少なくとも50%、最も好ましくは少なくとも90%低減するのに十分であることを示すために使用できる。qPCRまたはハイブリダイゼーションによるcccDNAおよびプレコアmRNAの定常状態レベルの直接測定を用いて、被験化合物/候補化合物/候補分子がそれぞれcccDNAの安定性または転写を低減するかどうかを識別できる。
本発明の他の観点によれば、in vitro アッセイ法を用いてcccDNA形成を抑制する化合物/候補分子を評価することができる。簡単に述べると、細胞を培養ウェルに播種し、細胞単層が周密状態になった日にテトラサイクリンを除くことができる。同時に、被験化合物を添加し、処理の終了時(約6日目)に培地中のタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)をELISAにより測定することができる。タグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)の低減を生じる化合物はいずれも、それがcccDNAの形成を効果的にブロックする可能性があることを示す。この in vitro アッセイ法を拡張した観点として、このアッセイにおけるタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)の低減はその化合物がヘパドナウイルス(たとえばHBV) DNA複製を阻害する効力をもつことの指標となる可能性もあることを明記する価値がある。そのような可能性は、サザンブロットおよび/またはqPCRによりウイルス コアDNAを直接測定することによって調べることができる。上記アッセイから現れる“ヒット”には、cccDNAの安定性および/または転写に影響を及ぼす化合物が含まれる可能性もある。誘導期間中に、初期に形成されたcccDNAの安定性および/または転写活性を化合物の試験によりターゲティングすることができる。
理論的に、前記アッセイからの化合物“ヒット”は、HAタグ付きプレコアタンパク質の翻訳もしくは翻訳後プロセシング、またはタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHA−HBeAg)分泌を直接阻害する可能性がある。そのような非cccDNA阻害剤を除外するために、トランスジーンを鋳型として使ってタグ付きヘパドナウイルスe抗原(たとえばHAタグ付きHBeAg)を産生するHepHA−HBe細胞において、“ヒット”をカウンタースクリーニングすることができる。他方で、HepHA−HBe細胞はHBeAg阻害剤をスクリーニングするために用いることもできる。
前記によれば、本発明において提供する方法は、候補分子がヘパドナウイルスのcccDNAの形成を阻害する能力を査定するためのものであってもよい(査定するために使用できる)。これに関しては、cccDNAが形成される前に細胞を候補分子と接触させることができる。
本明細書中で用いる用語“タグ”は、マーカーとして有用であるいずれかの化学構造体を表わす。主に、用語“タグ”は“タンパク質タグ”を表わす。用語“タグ”および“タンパク質タグ”は当技術分野で知られている;参照:特にFritze CE, Anderson TR. “Epitope tagging: general method for tracking recombinant proteins”. Methods Enzymol. 2000; 327: 3-16; Brizzard B, Chubet R. Epitope tagging of recombinant proteins. Curr Protoc Neurosci. 2001 May; Chapter 5: Unit 5.8; および/またはTerpe K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 2003 Jan; 60(5):523-33。
たとえば、レポータータンパク質、たとえばルシフェラーゼ(たとえば、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ、ガウシア(Gaussia)(海生カイアシ類)ルシフェラーゼなど)、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein)(GFP)などを本発明においてタグとして使用できる。これらのレポータータンパク質は、たとえば目視検査、蛍光測定などによるタグ付きヘパドナウイルスのレベルの査定を容易にする。蛍光タグはタンパク質について目視読出しを得るために用いられる。GFPおよびそれのバリアントは最も一般的に用いられる蛍光タグである。
核酸分子は、ヘパドナウイルス プレコアタンパク質、たとえばHBVプレコアタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をSEQ ID NO:15に示し、ヘパドナウイルス プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をSEQ ID NO:17に示す。
本発明においては、タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳を阻止するようにその核酸を設計することができると想定される。たとえば、その核酸はタグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸の5’側上流に開始コドンATGを含まない。HBVに関して、プレコアタンパク質をコードする核酸の開始コドンを欠失または変異させることができる。たとえば、そのような開始コドン(欠失/変異させるべきもの)は、HBVゲノムの位置1816(を含む)〜位置1818(を含む)のヌクレオチドに相当するものであってもよい;たとえば図1を参照。
(i)ヘパドナウイルスのプレゲノム(pg)RNAの合成;
(ii)合成されたpgRNAからマイナス鎖DNAへの逆転写;
(iii)第2のプラス鎖DNAの合成;それによりマイナス鎖DNAとプラス鎖DNAが二本鎖弛緩型閉環状DNAを形成する;
(iv)弛緩型閉環状二本鎖DNAからcccDNAの形成;
(v)タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳を可能にする条件の回復;
(vi)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードするmRNAの転写;
(vii)タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳。
タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子は、ベクター、特に発現ベクターに含まれていてもよい。
タグ付きヘパドナウイルスe抗原、好ましくはB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)をコードする核酸配列を含む核酸分子を、誘導性プロモーターの制御下に置くことができる。本発明に使用する代表的な、限定ではない誘導性プロモーター(単数または複数)は、テトラサイクリン誘導性プロモーター(単数または複数)、ドキシクリン誘導性プロモーター(単数または複数)、抗生物質誘導性プロモーター(単数または複数)、銅誘導性プロモーター(単数または複数)、アルコール誘導性プロモーター(単数または複数)、ステロイド誘導性プロモーター(単数または複数)、または除草剤誘導性プロモーター(単数または複数)である。本発明に用いたテトラサイクリン誘導性プロモーター(たとえばClontechから市販されている)は、tet−off様式で作動する。tet−on様式で作動するテトラサイクリン誘導性プロモーターも本発明に使用できると考えられる。tet−on/off系は、たとえばClontechおよびInvitrogenから、プラスミドまたはウイルス(レトロ−、アデノ)いずれかのバックボーンのものを入手できる。前記のテトラサイクリン/ドキシクリン誘導性プロモーターのほか、他の化合物のうちたとえば抗生物質、銅、アルコール、ステロイドまたは除草剤に応答する他の誘導性プロモーターも適している。たとえば、誘導性プロモーターはCMVプロモーターである。誘導性プロモーターはtet−EF−1 アルファプロモーターであってもよい。
本発明において提供する方法は、確立されたタグ(たとえば、HAタグ、またはHAタグの代わりにもしくはそれに加えて使用できるHisタグ、Flagタグ、c−mycタグ、V5タグもしくはC9タグ)の使用を利用する。これらのタグは、タグ付きヘパドナウイルスe抗原の精製および検出に使用できる。タグに特異的に結合する抗体の使用(たとえば、ELISAアッセイ、たとえば化学発光ELISA(CLIA)およびAlphaLISA)により、タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルを信頼性をもって迅速に査定することができ、かつコアタンパク質との交差反応が避けられる。
Imai, et al. Demonstration of two distinct antigenic determinants on hepatitis B e antigen by monoclonal antibodies. J Immunol. 1982 Jan; 128(1):69-72.
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Mondelli et al. Differential distribution of hepatitis B core and E antigens in hepatocytes: analysis by monoclonal antibodies. Hepatology. 1986 6(2):199-204.
Stuckmann and Mushahwar. Re-examination and further characterization of a monoclonal antibody to hepatitis B e antigen (抗HBe). J Virol Methods. 1986 Jul;13(4):351-62.
Korec et al. Monoclonal antibodies against hepatitis B e antigen: production, characterization, and use for diagnosis. J Virol Methods. 1990 May; 28(2):165-9.
Usuda et al. A monoclonal antibody against a hepatitis B e antigen epitope borne by six amino acids encoded by the precore region. J Virol Methods. 1997 Nov; 68(2):207-15.
Sogut et al. Monoclonal antibodies specific for hepatitis B e antigen and hepatitis B core antigen. Hybridoma (Larchmt). 2011 Oct; 30(5):475-9.
あるいは、ウェスタンブロット分析または免疫組織化学的染色を実施することができる。ウェスタンブロット法は、電気泳動によるタンパク質混合物の分離と抗体による特異的検出を組み合わせたものである。電気泳動は多次元、たとえば2D電気泳動であってもよい。通常、ポリペプチドは、2D電気泳動で一方の次元に沿ったそれらの見掛け分子量により、および他方の方向に沿ったそれらの等電点により分離される。
本明細書中で用いる用語“トランスジェニック非ヒト動物”、“トランスジェニック細胞”または“トランスジェニック組織”は、対応する野生型の動物、組織または細胞のものとは異なる遺伝子材料を含む、ヒトではない非ヒト動物、組織または細胞を表わす。これに関して用語“遺伝子材料”は、いずれかの種類の核酸分子またはその類似体、たとえば本発明において規定する核酸分子またはその類似体であってもよい。用語“異なる”は、野生型の動物または動物細胞のゲノムと比較して追加されたまたはより少ない遺伝子材料を意味する。トランスジェニック細胞/動物を作製するために用いる種々の発現系の概説は、たとえば、Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, Bitter et al (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) および Sawers et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9), Billman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-4), Hockney (Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463), Griffithset al., (Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440)を参照されたい。
核酸分子は、ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をSEQ ID NO:15に示す。ヘパドナウイルス プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をSEQ ID NO:17に示す。
核酸分子はヘパドナウイルスゲノムを含むことができる。好ましくは、ヘパドナウイルスゲノムはB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムである。HBVゲノムはHBV遺伝子型A、B、C、D、E、F、GまたはHのゲノムであってもよい。HBVゲノムはHBV遺伝子型Dのゲノムであってもよい。好ましくは、HBVゲノムはHBV遺伝子型D、遺伝子亜型aywのゲノムである。
核酸分子は、1以上のタグをコードする配列の5’側に、ヘパドナウイルスpgRNA、好ましくはHBV pgRNAのイプシロン構造の、またはヘパドナウイルスゲノム、好ましくはHBVゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含むことができる。ヘパドナウイルスゲノム、好ましくはHBVの(または、それによりコードされる)イプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列は、主に、好ましくはHBVゲノムの位置T1849〜A1854、または所望により位置T1849〜T1855に相当する位置のヌクレオチドとの塩基対を形成できる。ヘパドナウイルスゲノムのイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列は、(最大)9個のヌクレオチドからなることができる。
タグ付きB型肝炎ウイルス プレコアタンパク質をコードする代表的な核酸配列をSEQ ID NO:19に示す。タグ付きB型肝炎ウイルス プレコアタンパク質の代表的なアミノ酸配列をSEQ ID NO:21に示す。
核酸はプレゲノム(pg)ヘパドナウイルスRNAに転写可能である。ヘパドナウイルスRNAは、好ましくはHBV RNAである。
1以上の終止コドンを、1以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質、好ましくは1以上のHBVエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入することができる。
1以上のHBVエンベロープタンパク質の代表的なコーディング領域(または、それをコードする代表的な核酸配列)を、SEQ ID NO:36(L)、37(M)または38(S)に示す。エンベロープタンパク質の発現を阻止するために、SEQ ID NO:38(S)のHBVヌクレオチド217〜222(TTGTTG)をTAGTAGに変異させることができる。
そのタンパク質は、タグ付きヘパドナウイルスe抗原、好ましくはタグ付きB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)を含む。
タグ付きHBeAgをコードする代表的な核酸配列をSEQ ID NO:20に示す。好ましくは、タグ付きHBeAgはSEQ ID NO:22に示すアミノ酸配列をもつ。
本発明または本発明方法および使用の(に関して調製される)キットは、さらに指示マニュアル(単数または複数)を含むか、または備えていることができる。たとえば、その指示マニュアル(単数または複数)は、本発明に従って候補分子がcccDNAを阻害する能力を査定する(方法)および/またはタグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルを査定する方法について当業者をガイドすることができる。特に、その指示マニュアル(単数または複数)は本発明において提供する方法または使用の採用または適用に対するガイダンスを含むことができる。
用語“本質的に・・・からなる(consisting essentially of)”またはその文法上の変形は、本明細書中で用いる場合、記載された特色、整数、工程または成分を明示しているけれども、さらに他の1以上の特色、整数、工程、成分またはそのグループの追加を排除しないと解釈すべきである;ただし、追加の特色、整数、工程、成分またはそのグループが特許請求の範囲に定める組成物、デバイスまたは方法の基本的な新規特徴を実質上変更しない場合のみである。
本発明を限定ではない下記の図面および例を参照することによってさらに記載する。
別に指示しない限り、組換え遺伝子技術の確立された方法、たとえばSambrook, Russell “Molecular Cloning, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001))に記載されたものを用いる。
図面は下記のものを示す:
図1. HBVプレコアORF中へのHAタグ配列の挿入;
HBVプレコアタンパク質のORF(遺伝子型D,亜型ayw,ヌクレオチド1816−2454)を描いてある;5’側部分(ヌクレオチド1816−1941)をヌクレオチド配列で示す。プレコアORFのヌクレオチド1941と終止コドンの間の配列は省略してある。プレコアORFの開始コドン、ダイレクトリピート配列1(direct repeat sequence 1)(DR1)、およびコアORFのインフレーム開始コドンは四角で囲んである。プラスミドpTREHBV−HAeにおいては、5’末端プレコアORFの開始コドンが変異している(ATGからTGに)。基準pgRNA転写開始部位(ヌクレオチド1820)を矢印でマークしてある。HBVヌクレオチド位置はGalibert命名法に従っている(5)。HBV pgRNAにおいて後続のDNA複製に際して必須のシス−エレメントとして作動する重要なステム−ループ構造(イプシロン,ε)を、推定内部構造(下側ステム、バルジ、上側ステム、ループ)で示す。インフレーム融合HAタグ配列をプレコアORF内へイプシロンの塩基対合を変化させることなく配置するために、HAタグ含有DNA配列(gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc;SEQ ID NO:41)をコアORFの開始コドンに隣接した上流位置にインフレーム挿入する(参照:挿入ボックス)。この配列修飾の結果、HAタグ+リンカー配列がプレコアタンパク質内へインフレーム融合し、イプシロンの下流にコアタンパク質の無傷ORFが保持される。
(A)野生型およびHAタグ付きプレコアの細胞内発現。HepG2細胞にプラスミドpcHBeまたはpcHA−HBeをトランスフェクションし、5日後、全細胞溶解物に抗HBc抗体(上パネル)および抗HA抗体(中パネル)を用いるウェスタンブロット分析を施した。β−アクチンを装填対照として用いた。野生型プレコアおよびHAタグ付きプレコア(HA−プレコア)をラベルする。
樹立したHAタグ付きHBeAg安定発現細胞系、具体的にはHepHA−HBe4およびHepHA−HBe47細胞を、コラーゲンコートした12ウェルプレートに周密状態で播種した。細胞を播種した日を0日目と設定し、隔日に培地を補充した。指示した時点で上清試料を採集し、材料および方法に記載するようにAlphaLISA分析によりHA−HBeAgを検出した。AlphaLISA信号(相対光単位)(Y軸)を時点(X軸)に対応してヒストグラムにプロットした。
HepG2細胞にpTREHBVDESまたはpTREHBV−HAeおよびプラスミドpTet−offをトランスフェクションした。トランスフェクションの5日後に細胞を回収し、ウイルスベースのHBV RNA、コアタンパク質、キャプシド被包されたpgRNAの産生、およびウイルスDNA複製を、それぞれノーザンブロット、ウェスタンブロットおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。pgRNA:プレゲノムRNA;sRNA:表面RNA;RC:弛緩型閉環状DNA;SS:一本鎖DNA。
図5. HepBHAe安定細胞系におけるHBV cccDNA依存性HAタグ付きHBeAg発現の合理的設計の模式図;
pTREHBV−HAeおよびpTet−offを安定トランスフェクションした細胞において、トランスジーンは1.1オーバーレングス(overlength)のHBVゲノムをtet−CMVプロモーターの制御下に含む。プレコアの開始コドン(ATG)をHBV DNAの5’末端で変異させ、3’側冗長配列(redundancy)にある第2のものは変化させなかった。材料および方法に記載するように、HAタグを含むフラグメント(灰色で示す)をプレコアORFに挿入した。このトランスジーンは、ウイルスエンベロープタンパク質発現を阻止するために、スモール表面(S) ORF中に2つのタンデム終止コドンをも含む。(B)テトラサイクリンを除くと、pgRNAが転写され、コアおよびポリメラーゼが産生されて、pgRNAパッケージング、および(C)pgRNAからrcDNAへの逆転写が起きる。DNA修復メカニズムは、(D)rcDNAを、(E)HA−preコアORFが再生された環状cccDNA鋳型に変換して、HA−プレコアmRNA、および(F)de novo ウイルス複製のためのpgRNAを生成する。(G)HA−プレコアmRNAからのHA−プレコア翻訳、およびELISAにより検出できる分泌型HA−HBeAgへのプロセシング。preC、C、pol、L、M、SおよびXは、それぞれプレコア、コア、ポリメラーゼ、ラージ、ミディアムおよびスモール表面抗原、ならびにXタンパク質のためのORF開始コドンを表わす。DRはダイレクトリピート配列を表わす。CTDはC末端ドメインを表わす。
HepBHAe13細胞をテトラサイクリンの存在下で6ウェル−プレートに播種した。細胞単層が周密状態になった時点で、テトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。指示した時点で細胞および上清試料を回収した。細胞内コアDNA(上パネル)およびcccDNA(下パネル)を抽出し、サザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。DP−rcは脱タンパク質(deproteinized)(無タンパク質)RC DNAを表わす。分泌されたHAタグ付きHBeAgを前記に従ってHA IP−ウェスタンブロットにより検出した。
HepDES19細胞、および種々のクローン番号をもつ新たに樹立したHepBHAe細胞を同一密度で6ウェル−プレートにテトラサイクリンの存在下に播種した。細胞が周密状態に達した時点で、1セットの細胞をテトラサイクリンの存在下で培養し、他の1セットの細胞をテトラサイクリンの非存在下で培養した。6日後に細胞を回収し、ウイルス コアDNAをサザンブロットにより分析した。
HepDES19細胞および指示したHepBHAe細胞において産生されたcccDNAを、Hirt抽出法により抽出し、ゲル電気泳動およびサザンブロットハイブリダイゼーションを施した(レーン1、5、8、11、14)。HBV cccDNAの確実性をさらに確認するために、Hirt DNA試料をゲル装填前に85℃に5分間加熱した;これはDP−rcDNAをSS DNAに変性させ、一方でcccDNAは変性せずにそれの電気泳動移動性が変化しないまま保持される条件である(レーン2、6、9、12、15)。熱変性DNA試料をさらにEcoRIで消化した;この条件で、cccDNAは線状化してゲノム長の二本鎖DNAになる(レーン3、7、10、13、16)。
HepBHAe細胞をテトラサイクリンの存在下でプレートに播種した。細胞が周密状態になった時点でテトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。上清試料を指示した時点で回収し、HA−HBeAg検出のためにAlphaLISAを施した。AlphaLISA読出し(相対光単位,RLU)をカウント毎秒(CPS)として表わした。
HepBHAe13細胞を6ウェル−プレートにおいてテトラサイクリンの存在下で周密状態になるまで培養した。1セットの細胞を継続してテトラサイクリンの存在下に維持した。第2セットの細胞を次いで無テトラサイクリン培地に切り換えた。第3セットの細胞を次いで10μMの3TCを含有する無テトラサイクリン培地で培養した。培地を隔日に補充し、指示した時点で回収した上清試料にHAタグ付きHBeAgについての化学発光イムノアッセイ(CLIA)を施した。
細胞を96ウェル−プレートに播種し、細胞が周密状態になった時点で、ウイルス複製を誘導するためにテトラサイクリンを培地から除いた。同時に、細胞を非処理のままとし、または指示した濃度の化合物で処理した;処理グループおよび非処理グループにおいてDMSO濃度を0.5%に正規化した。4日毎に処理を繰り返した。処理後12日目に、培養液にHA−HBeAg CLIAを施し、読出しを対照に対するパーセント(平均±SD)としてプロットした。
指示したHepBHAe細胞をテトラサイクリンの存在下で6ウェル−プレートに播種した。細胞単層が周密状態になった時点で、テトラサイクリンを培地から除き、培地を隔日に交換した。細胞を指示した時点で回収した。総ウイルスRNA(上パネル)、細胞質コアDNA(中パネル)を抽出し、それぞれノーザンブロットおよびサザンブロットハイブリダイゼーションにより分析した。抽出したcccDNAを85℃で5分間、熱変性させ、次いでEcoR Iにより線状化し、続いてサザンブロット分析を行なった(下パネル)。
選択したHepBHAe細胞を96ウェル−プレートにおいてテトラサイクリンの存在下で周密状態まで培養した。1セットの細胞を継続してテトラサイクリンの存在下に維持した。第2セットの細胞を次いで無テトラサイクリン培地に切り換えた。第3セットの細胞を次いで10μMの3TCを含有する無テトラサイクリン培地で培養した。培地を隔日に補充し、処理後9日目に回収した上清試料にHAタグ付きHBeAg検出のための化学発光イムノアッセイ(CLIA)を施した。
実施例1:B型肝炎ウイルス共有結合閉環状DNA依存性エピトープタグ付きe抗原を誘導発現する培養細胞系、および抗ウイルス物質をスクリーニングするためのその使用
材料および方法
プラスミド
ヒトインフルエンザヘマグルチニン(HA)融合プレコアオープンリーディングフレームの開始コドンをノックアウトしたものを収容したテトラサイクリン誘導性HBV複製ベクターを構築するために、CMV−IEプロモーターのTATAボックスモチーフおよび下流のHBVフラグメント(遺伝子型D,亜型ayw,ヌクレオチド1805−2335)を含み、プレコアORFのヌクレオチド1816(A)を欠失し、HAタグ配列が挿入されたDNAフラグメントを、Genscript Inc.により化学合成した。このDNAフラグメント内には、5’末端にSacI制限酵素部位が存在し、3’末端に基準BspEI制限部位が存在する。ベクターpTREHBV−HAeは、この合成DNAフラグメントをプラスミドpTREHBVDESのSacI/BspEI制限部位に挿入することにより構築された。pTREHBV−HAeの完全配列をSEQ ID NO.35に示す。
5’−ATTGGATCCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC−3’および
5’−ACAGTAGTTTCCGGAAGTGTTGATAGGATAGGGG−3’
を用いて増幅した。PCRフラグメントをBamHIおよびBspEIで制限消化し、プレコア発現ベクター(pcHBe)の同じ制限部位に挿入して、プラスミドpcHA−HBeを得た。pcHA−HBeの完全配列をSEQ ID NO.39に示す。
HepG2細胞(ATCC(登録商標) HB−8065(商標))、すなわちHBV複製を支持する肝芽腫細胞系を、ATCCから入手した。HBV DNAおよびcccDNAを誘導発現するHepG2由来HepDES19細胞系が以前に記載されている(7)。10%のウシ胎仔血清、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補充したダルベッコの改変イーグル培地(DMEM)−F12培地(Cellgro)中に細胞系を維持した。
細胞(約1.0×106)を、コラーゲンコートした35mm径の皿において、抗生物質を含まないDMEM/F12培地に播種した。一夜のインキュベーション後、Lipofectamine 2000(Life Technologies)を製造業者の指示に従って用いて各ウェルに合計4μgのプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞または上清の試料を指示した時点で回収した。
総細胞RNAを、TRIzol試薬(Life Technologies)で製造業者のプロトコルに従って抽出した。キャプシド被包されたウイルスpgRNAを下記に従って精製した;12ウェルプレートの1ウェルからの細胞を、10mMのTris−HCl(pH8.0)、1mMのEDTA、1%のNP−40および50mMのNaClを含有する細胞溶解緩衝液250μl中、37℃で10分間溶解し、遠心により核を除去した。試料を6Uのミクロコッカスヌクレアーゼおよび15μlの100mM CaCl2と共にインキュベートし、37℃で15分間インキュベートして遊離核酸を消化した。キャプシド被包されたウイルスpgRNAを、750μlのTRIzol LS試薬(Invitrogen)により製造業者のプロトコルに従って抽出した。RNA試料を、2.2Mのホルムアルデヒドを含有する1.5%アガロースゲルにより電気泳動し、20×SSC緩衝液(1×SSCは0.15M NaCl+0.015Mクエン酸ナトリウムである)中でHybond−XL膜(GE Healthcare)に写し取った。
35mm皿内の細胞をPBS緩衝液で1回洗浄し、1×Laemmli緩衝液中で溶解した。合計50μlの細胞溶解物をSDS−12%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜(Millipore)に写し取った。膜をWestern Breezeブロッキング緩衝液(Life Technologies)でブロックし、HBcAg(アミノ酸170−183)、HAタグ(Sigma−Aldrich,クローンM2)、β−アクチン(Sigma−Aldrich)に対する抗体で調べた。結合した抗体をIRDye二次抗体により解明した。イムノブロット信号をLi−COR Odysseyシステムで視覚化および定量した。
35mm径の1つの皿からの細胞を、10mMのTris−HCl,pH8.0、10mMのEDTA、1%のNP40、2%のスクロース、および1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(G−biosciences)を含有する細胞溶解緩衝液0.5mlで溶解した。遠心して細胞屑を除去した後、澄明な細胞溶解物を50μlのEzview Red 抗HA(Sigma−Aldrich)と共に4℃で一夜、穏やかに回転させながらインキュベートした。35mm径の1つの皿からの培地試料(合計1ml)のうち0.5mlに、そのまま免疫沈降を施した。ビーズをTBS緩衝液(0.15MのNaCl、0.05MのTris−HCl[pH7.4])で4℃において3回洗浄した。ペレット化したビーズをLaemmli緩衝液でタンパク質試料調製した。免疫沈降したHAタグ付きタンパク質を、HAタグに対する抗体(Sigma−Aldrich)を用いるウェスタンブロットにより検出した。
HAタグ付きHBeAgの化学発光エンザイムイムノアッセイ(CLIA)検出のために、高感度のストレプトアビジンコートしたプレート(黒色,カタログ#:15525,Thermo Scientific)をPBST(PBS+0.05% Tween 20)により3回洗浄し、次いで50μlの抗HA−ビオチン(カタログ#:A00203,Genscript;PBS中、5μg/ml)と共に室温で30分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。洗浄緩衝液を除去した後、50μlの培養上清試料をELISAウェルに添加し、室温で30分間インキュベートし、続いて200μlのPBSTで3回洗浄した。次いで50μlの西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲートした抗HBe抗体(HBeAg CLIAキットから,カタログ#:CL0312−2,Autobio Diagnostics)をウェルに添加し、室温で30分間インキュベートした。200μlのPBSTで5回洗浄した後、CLIAキットからの基質AおよびBをそれぞれ25μl添加し、プレートを穏やかに10秒間、振とうした。プレートをルミノメーターで読み取った。
本発明において、それぞれトランスジーンおよびHBV cccDNAからHAタグ付きHBeAg(HA−HBeAg)を発現させるための2タイプの新規細胞系、ならびに組換えHBeAgを化学発光イムノアッセイおよびAlphaLISAアッセイにより検出するための方法を提供する。これらの細胞系およびアッセイ法は、HBV cccDNAレベルを低減する化合物および/またはcccDNA転写を抑制する化合物のハイスループットスクリーニングに適切である。
本明細書に提示する配列はNCBIデータベースにおいて入手でき、世界規模ウェブからncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=geneで検索できる;これらの配列はアノーテーションおよび修飾した配列にも関係する。本発明は本発明において提供する簡潔な配列の相同配列およびバリアントを使用する手法および方法をも提供する。好ましくは、そのような“バリアント”は遺伝子バリアントである。
1. 候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状(ccc)DNAを阻害する能力を査定するための方法であって、
(a)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる;
(b)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルを査定する;および
(c)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する;
工程を含む方法。
3. タグ付きヘパドナウイルスe抗原が1つのタグのみを含む、項目1または2の方法。
5. タグが、ヘマグルチニン(HA)タグ、Hisタグ、Flagタグ、c−mycタグ、V5タグおよび/またはC9タグからなる群から選択される、項目3または4の方法。
7. タグ付きヘパドナウイルスe抗原が2以上のタグを含む、項目1または2の方法。
9. タグが6〜22個のアミノ酸を含む、項目7または8の方法。
10. 2以上のタグが2以上のヘマグルチニン(HA)タグ、Hisタグ、Flagタグ、c−mycタグ、V5タグおよび/またはC9タグである、項目7〜9のいずれか1項の方法。
12. HAタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:1に示される;
Hisタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:2に示される;
c−mycタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:4に示される;
V5タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:5に示される;
および/または
C9タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:6に示される;
項目5または10の方法。
Hisタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:9に示される;
c−mycタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:11に示される;
V5タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:12に示される;
および/または
C9タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:13に示される;
項目5または10の方法。
17. HBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO.18に示される、項目2〜15のいずれか1項の方法。
19. ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列がSEQ ID NO:15に示される、項目18の方法。
21. 核酸分子が1以上のタグをコードする核酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス プレコアタンパク質のN末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列の3’側下流にある、項目1〜17のいずれか1項の方法。
23. 核酸分子がヘパドナウイルスゲノムを含む、項目1〜22のいずれか1項の方法。
25. HBVゲノムがHBV遺伝子型A、B、C、D、E、F、GまたはHのゲノムである、項目24の方法。
27. HBV遺伝子型DのゲノムがHBV遺伝子亜型aywのゲノムである、項目26の方法。
29. ヘパドナウイルス コアタンパク質がHBVコアタンパク質である、項目28の方法。
31. HBVコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:24に示される、項目29の方法。
34. HBVゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がSEQ ID NO:25に示される、項目33の方法。
37. 1以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、HBVゲノムの位置C1902と位置A1903に相当するヌクレオチド間に挿入されている、項目1〜36のいずれか1項の方法。
43. リンカーが1以上のアミノ酸残基からなる、項目42の方法。
45. アミノ酸がグリシン残基である、項目44の方法。
46. リンカーをコードする配列が配列GGCからなる;またはその配列がグリシン残基をコードする、項目42〜44のいずれか1項の方法。
タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、SEQ ID NO:42に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む;
項目1〜46のいずれか1項の方法。
49. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目48の方法。
51. タグ付きHBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22に示される、項目2〜50のいずれか1項の方法。
53. タグ付きHBVプレコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:21に示される、項目2〜52のいずれか1項の方法。
56. 核酸がタグ付きHBVプレコアタンパク質の翻訳を阻止する、項目1〜55のいずれか1項の方法。
58. タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸の5’側上流にある開始コドンATGが、核酸TGで置き換えられている、項目56または57の方法。
60. タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、ベクター中に含まれている、項目1〜59のいずれか1項の方法。
62. タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、誘導性プロモーターの制御下にある、項目1〜61のいずれか1項の方法。
64. 誘導性プロモーターが、テトラサイクリン誘導性プロモーター、ドキシクリン誘導性プロモーター、抗生物質誘導性プロモーター、銅誘導性プロモーター、アルコール誘導性プロモーター、ステロイド誘導性プロモーター、または除草剤誘導性プロモーターである、項目62または63の方法。
66. 1以上の終止コドンを1以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入する、項目23〜65のいずれか1項の方法。
68. 1以上のHBVエンベロープタンパク質が、1以上のラージ表面タンパク質(L)、ミドル表面タンパク質(M)およびスモール表面タンパク質(S)である、項目67の方法。
70. 1以上のHBVエンベロープタンパク質のコーディング領域が、SEQ ID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)および/またはSEQ ID NO:38(S)に示される、項目67〜69のいずれか1項の方法。
73. 真核細胞が肝細胞由来のものである、項目72の方法。
74. 真核細胞が肝癌細胞であるか、または肝癌細胞由来のものである、項目72または73の方法。
76. 核酸分子またはそれを含むベクターが細胞のゲノム中に安定に組み込まれた、項目1〜75のいずれか1項の方法。
(i)ヘパドナウイルスのプレゲノム(pg)RNAの合成;
(ii)合成されたpgRNAからマイナス鎖DNAへの逆転写;
(iii)第2のプラス鎖DNAの合成;それによりマイナス鎖DNAとプラス鎖DNAが二本鎖弛緩型閉環状DNAを形成する;
(iv)弛緩型閉環状二本鎖DNAからcccDNAの形成;
(v)所望により、タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳を可能にする条件の回復;
(vi)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードするmRNAの転写;
(vii)タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳。
79. 候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状(ccc)DNAを阻害する能力を査定するための方法である、項目1〜78のいずれか1項の方法。
81. 候補分子がヘパドナウイルスのcccDNAの量または数を低減する能力を査定するための方法である、項目1〜78のいずれか1項の方法。
83. cccDNAが形成された後に細胞を候補分子と接触させる、項目81または82の方法。
88. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目87の核酸分子。
90. タグが6〜22個のアミノ酸を含む、項目89の核酸分子。
93. タグ付きヘパドナウイルスe抗原が2以上のタグを含む、項目87または88の核酸分子。
95. 2以上のタグの全長が14アミノ酸から31アミノ酸までの長さである、項目93または94の核酸分子。
98. HAタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:1に示される;
Hisタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:2に示される;
c−mycタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:4に示される;
V5タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:5に示される;
および/または
C9タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:6に示される;
項目91または96の核酸分子。
3×Flagタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:7に示される;
項目92または97の核酸分子。
Hisタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:9に示される;
c−mycタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:11に示される;
V5タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:12に示される;
および/または
C9タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:13に示される;
項目91または96の核酸分子。
3×Flagタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14に示される;
項目92または97の核酸分子。
103. HBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO.18に示される、項目88〜101のいずれか1項の核酸分子。
105. ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列がSEQ ID NO:15に示される、項目104の核酸分子。
107. 核酸分子が1以上のタグをコードする核酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス プレコアタンパク質のN末端シグナルペプチドおよびリンカーをコードする核酸配列(“プレコア”領域)の3’側下流にある、項目87〜106のいずれか1項の核酸分子。
110. ヘパドナウイルスゲノムがB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムである、項目109の核酸分子。
112. HBVゲノムがHBV遺伝子型Dのゲノムである、項目110の核酸分子。
114. 1以上のタグをコードする核酸が、ヘパドナウイルス コアタンパク質をコードする核酸の5’側上流にある、項目87〜113のいずれか1項の核酸分子。
116. HBVコアタンパク質をコードする核酸がSEQ ID NO:23に示される、項目115の核酸分子。
118. HBVコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:24に示される、項目116の核酸分子。
121. HBVゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がSEQ ID NO:25に示される、項目120の核酸分子。
124. 1以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、HBVゲノムの位置C1902と位置A1903に相当するヌクレオチド間に挿入されている、項目87〜123のいずれか1項の核酸分子。
130. リンカーが1以上のアミノ酸残基からなる、項目129の核酸分子。
132. アミノ酸がグリシン残基である、項目131の核酸分子。
133. リンカーをコードする配列が配列GGCからなる;またはその配列がグリシン残基をコードする、項目129〜131のいずれか1項の核酸分子。
タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、SEQ ID NO:42に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む;
項目87〜133のいずれか1項の核酸分子。
136. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目135の核酸分子。
138. タグ付きHBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22に示される、項目88〜137のいずれか1項の核酸分子。
140. タグ付きHBVプレコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:21に示される、項目88〜139のいずれか1項の核酸分子。
143. ヘパドナウイルスRNAがHBV RNAである、項目142の核酸分子。
145. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目144の核酸分子。
147. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目146の核酸分子。
149. 核酸がタグ付きHBVプレコアタンパク質の翻訳を阻止する、項目87〜148のいずれか1項の核酸分子。
151. タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸の5’側上流にある開始コドンATGが、核酸TGで置き換えられている、項目147または150の核酸分子。
153. ベクターがEQ ID NO:35に示す配列を含む、項目144、145および149〜152のいずれか1項の核酸分子。
155. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目149〜154のいずれか1項の核酸分子。
158. 1以上の終止コドンを1以上のヘパドナウイルスエンベロープタンパク質のコーディング領域に導入する、項目110〜157のいずれか1項の核酸分子。
160. 1以上のヘHBVエンベロープタンパク質が、1以上のL、Mおよび/またはSである、項目159の核酸分子。
162. 1以上のHBVエンベロープタンパク質のコーディング領域が、SEQ ID NO:36(L)、37(M)または38(S)に示される、項目159〜161のいずれか1項の核酸分子。
165. タグ付きヘパドナウイルスe抗原を含むタンパク質。
167. B型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)がSEQ ID NO:18に示すアミノ酸配列を含む、項目166のタンパク質。
169. タグが6〜22個のアミノ酸を含む、項目168のタンパク質。
172. タグ付きヘパドナウイルスe抗原が2以上のタグを含む、項目165〜167のいずれか1項のタンパク質。
174. 2以上のタグの全長が14アミノ酸から31アミノ酸までの長さである、項目172または173のタンパク質。
177. HAタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:1に示される;
Hisタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:2に示される;
c−mycタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:4に示される;
V5タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:5に示される;
および/または
C9タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:6に示される;
項目170または175のタンパク質。
3×Flagタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:7に示される;
項目171または176のタンパク質。
Hisタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:9に示される;
c−mycタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:11に示される;
V5タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:12に示される;
および/または
C9タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:13に示される;
項目170または175のタンパク質。
3×Flagタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14に示される;
項目171または176のタンパク質。
182. ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列がSEQ ID NO:15に示される、項目181のタンパク質。
184. タンパク質が1以上のタグのアミノ酸配列を含み、その配列がヘパドナウイルス プレコアタンパク質のシグナルペプチドおよびリンカーの配列のアミノ酸配列のC末端にある、項目165〜183のいずれか1項のタンパク質。
188. HBVコアタンパク質をコードする核酸がSEQ ID NO:23に示される、項目187のタンパク質。
190. 1以上のタグのアミノ酸配列が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造によりコードされるアミノ酸配列中へ挿入されている、項目165〜189のいずれか1項のタンパク質。
192. HBVゲノムによりコードされるイプシロン構造の核酸配列がSEQ ID NO:25に示される、項目191のタンパク質。
195. 1以上のタグのアミノ酸配列が、HBVプレコアタンパク質(たとえばSEQ ID NO.17に示すもの)の位置G29と位置M30に相当するアミノ酸残基間に挿入されている、項目165〜194のいずれか1項のタンパク質。
200. さらに、1以上のタグのアミノ酸配列のC末端にリンカーを含む、項目165〜199のいずれか1項のタンパク質。
202. リンカーが1個のアミノ酸残基のみからなる、項目201のタンパク質。
203. アミノ酸がグリシン残基である、項目202のタンパク質。
タグ付きヘパドナウイルスe抗原のアミノ酸配列が、SEQ ID NO.42に示すアミノ酸配列を含む;または
項目1〜46のいずれか1項のタンパク質。
206. ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、項目205のタンパク質。
208. タグ付きHBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22に示される、項目166〜207のいずれか1項のタンパク質。
210. タグ付きHBVプレコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:21に示される、項目166〜209のいずれか1項のタンパク質。
212. 細胞が真核細胞である、項目211の宿主細胞。
214. 真核細胞が肝癌細胞であるか、または肝癌細胞由来のものである、項目212または213の宿主細胞。
216. 項目164〜210のいずれか1項に定めるタンパク質の製造方法であって、項目210〜215のいずれか1項の宿主細胞を、そのタンパク質の産生が可能な条件下で培養し、産生されたタンパク質を培養物から回収することを含む方法。
218. 項目165〜167のいずれか1項に定めるヘパドナウイルスe抗原を特異的に認識する抗体、および項目168〜180のいずれか1項に定める1以上のタグを特異的に認識する1以上の抗体を含むキット。
Claims (22)
- 候補分子がヘパドナウイルスの共有結合閉環状(ccc)DNAを阻害する能力を査定するための方法であって、
(a)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を、その候補分子と接触させる;
(b)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルを査定する;および
(c)タグ付きヘパドナウイルスe抗原のレベルが対照と比較して低下した場合に候補分子を選択する;
工程を含む方法。 - ヘパドナウイルスがB型肝炎ウイルス(HBV)であり、ヘパドナウイルスe抗原がB型肝炎ウイルスe抗原(HBeAg)である、請求項1に記載の方法。
- タグ付きヘパドナウイルスe抗原が1つのタグのみを含む;またはタグ付きヘパドナウイルスe抗原が2以上のタグを含む、請求項1または2に記載の方法。
- タグが、ヘマグルチニン(HA)タグ、Hisタグ、Flagタグ(1×Flagタグまたは3×Flagタグなど)、c−mycタグ、V5タグおよび/またはC9タグからなる群から選択される、請求項3に記載の方法。
- HAタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:1に示される;
Hisタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:2に示される;
1×Flagタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:3に示される;
3×Flagタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:7に示される;
c−mycタグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:4に示される;
V5タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:5に示される;
および/または
C9タグをコードする核酸配列がSEQ ID NO:6に示される;
あるいは
HAタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:8に示される;
Hisタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:9に示される;
1×Flagタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:10に示される;
3×Flagタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:14に示される;
c−mycタグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:11に示される;
V5タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:12に示される;
および/または
C9タグのアミノ酸配列がSEQ ID NO:13に示される;
請求項4に記載の方法。 - 核酸分子が、ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- ヘパドナウイルス プレコアタンパク質をコードする核酸配列がSEQ ID NO:15に示すB型肝炎ウイルス プレコアタンパク質の核酸配列である;または
ヘパドナウイルス プレコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:17に示すB型肝炎ウイルス プレコアタンパク質のアミノ酸配列である;
請求項6に記載の方法。 - 1以上のタグをコードする核酸配列が、B型肝炎ウイルス プレコアタンパク質のN末端29アミノ酸をコードする核酸配列の3’側下流にある、請求項6または7に記載の方法。
- 核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノム、たとえばSEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33または34のいずれか1つに示すB型肝炎ウイルス(HBV)ゲノムを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- HBVゲノムがHBV遺伝子亜型aywのゲノムである、請求項9に記載の方法。
- 1以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造、たとえばSEQ ID NO:25に示すHBVゲノムによりコードされるイプシロン構造中へ挿入されている、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 1以上のタグをコードする配列を含む核酸分子が、HBVゲノムの位置C1902と位置A1903に相当するヌクレオチド間に挿入されている、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 核酸分子が、1以上のタグをコードする配列の5’側に、ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
- ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列が、HBVゲノムの位置T1849〜A1854に相当するヌクレオチドとの塩基対を形成できる、請求項13に記載の方法。
- ヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がSEQ ID NO:26に示す配列からなる;またはヘパドナウイルスゲノムによりコードされるイプシロン構造の下側ステムとの塩基対を形成できる配列がSEQ ID NO:40に示すポリペプチドをコードする、請求項14に記載の方法。
- タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、SEQ ID NO:41に示す核酸配列を含む;または
タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子が、SEQ ID NO:42に示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む;
請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。 - タグ付きHBeAgをコードする核酸配列がSEQ ID NO:20に示され;またはタグ付きHBeAgのアミノ酸配列がSEQ ID NO:22に示される、請求項2〜16のいずれか1項に記載の方法;
あるいは
タグ付きHBVプレコアタンパク質をコードする核酸配列がSEQ ID NO:19に示され;またはタグ付きHBVプレコアタンパク質のアミノ酸配列がSEQ ID NO:21に示される、請求項6〜16のいずれか1項に記載の方法。 - 工程(a)がさらに、タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む細胞を下記のことが可能な条件で培養する工程(aa)を含む、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法:
(i)ヘパドナウイルスのプレゲノム(pg)RNAの合成;
(ii)合成されたpgRNAからマイナス鎖DNAへの逆転写;
(iii)第2のプラス鎖DNAの合成;それによりマイナス鎖DNAとプラス鎖DNAが二本鎖弛緩型閉環状DNAを形成する;
(iv)弛緩型閉環状二本鎖DNAからcccDNAの形成;
(v)所望により、タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳を可能にする条件の回復;
(vi)タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードするmRNAの転写;
(vii)タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳;
その際、タグ付きヘパドナウイルスe抗原の翻訳を可能にする条件の回復は開始コドンの回復である。 - 工程(b)によるタグ付きヘパドナウイルスe抗原レベルの査定が、ELISA、CLIAまたはAlphaLISAにより行なわれる、請求項1〜18のいずれか1項に記載の方法。
- 工程(b)によるタグ付きヘパドナウイルスe抗原レベルの査定が、ヘパドナウイルスe抗原を特異的に認識する抗体および1以上のタグを特異的に認識する1以上の抗体の使用を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の方法。
- タグ付きヘパドナウイルスe抗原をコードする核酸配列を含む核酸分子。
- 請求項21に記載の核酸分子によりコードされるタンパク質。
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