CN106716128B - 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及筛选抗嗜肝DNA病毒物质的方法和用途，其中对该物质筛选抑制嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病毒)共价闭合环状(ccc)DNA的能力。所述方法和用途利用包含核酸序列的细胞，所述核酸序列编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，如乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。另外，本发明提供了编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列和因而编码的蛋白质。还提供用于筛选方法中的试剂盒。

Description

加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其在筛选抗病毒物质中的用途
本发明受美国政府支持在美国国家健康研究所资助的合同号 R01AI094474下做出。美国政府在本发明中享有某些权利。
本发明涉及筛选抗嗜肝DNA病毒物质的方法和用途，其中物质是 乙型肝炎e抗原(HBeAg)的抑制剂，所述抑制剂在本发明中所述的细胞 系中优势地为共价闭合环状(ccc)DNA依赖性并且可能充当cccDNA的 替代标记，其中对所述替代标记筛选抑制嗜肝DNA病毒(如乙型肝炎病 毒(HBV))ccc DNA的能力。所述方法和用途利用包含核酸序列的细胞， 所述核酸序列编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，如乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)。另外，本发明提供了编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原 的核酸序列和因此编码的蛋白质。还提供用于筛选方法中的试剂盒。
慢性乙型肝炎目前是重大公共卫生负担，全球侵袭大约35000万个 体并且在美国侵袭至少120万个体。这些患者具有升高的肝硬化、肝细 胞癌(HCC)和其他严重临床后遗症风险(1,2,12,14)。每年，全球存在约 1百万例因HBV相关肝病所致的死亡。因此，全球健康优先事项是治愈 慢性HBV感染并阻止其可怕结果。
乙型肝炎病毒(HBV)是属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非 细胞病变性、嗜肝DNA病毒。嗜肝DNA病毒是可以在人类和动物中造 成肝感染的有包膜双链病毒科。嗜肝DNA病毒共有相似的基因组结构。 它们具有部分为双链环状DNA的小基因组。基因组由两条DNA链组成， 一条链具有负义方向，另一条链具有正义方向。复制涉及称作前基因组 RNA的RNA中间体逆转录(15,19)。编码三个主要可读框(ORF)并且病 毒具有五种已知的mRNA(18,19)。
一旦感染，则病毒基因组松弛型环状(rc)DNA运输入细胞核并转化 成附加体性共价闭合环状(ccc)DNA，其充当病毒全部mRNA的转录模 板，尤其是3.5-3.6kb编码作为HBeAg前体的前核心蛋白的前核心蛋白 mRNA；3.5kb编码核心蛋白和病毒聚合酶的前基因组(pg)RNA；2.4 kb/2.1kb编码病毒包膜蛋白(大抗原(L)、中等抗原(M)和小(S)抗原)的表 面mRNA；和0.7kb编码X蛋白的X mRNA(18,19)。通过移除前核心 蛋白N端信号肽和C末端精氨酸丰富序列的两个蛋白酶解性事件产生 HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(10,21)。在转录和核输出后，胞 质病毒pgRNA随HBV聚合酶和衣壳蛋白一起装配以形成核衣壳，其内部聚合酶催化的逆转录产生负链DNA，后者随后拷贝成正链DNA以形 成后代rcDNA基因组。新合成的成熟核衣壳将用病毒包膜蛋白包装并 移出作为病毒粒粒子，或返回胞核以通过胞内cccDNA扩增途径放大 cccDNA储备(19)。因此，慢性乙型肝炎分子基础是病毒cccDNA在感染 的肝细胞的胞核中持续存在。
不存在确定的慢性乙型肝炎治愈。目前批准的HBV治疗药物是干 扰素-α(IFN-α)和5种核苷(酸)类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、 替比夫定和替诺福韦)。Xu(2010)JVirol(84)9332-9340公开了用小鼠干 扰素治疗小鼠肝细胞。在48周标准治疗后IFN-α仅在少量患者组中实 现持久的病毒学反应，并且存在明显的不良作用(9)。五种核苷(酸)类似物(NA)均充当病毒聚合酶抑制剂，但是几乎未治愈HBV感染(6)，并且 耐药性的出现大幅度限制其长期效力(16,24)。现在熟知，当前疗法的主 要局限是无法消除事先存在的cccDNA池和/或阻止cccDNA从痕量水平 的野生型或耐药性病毒形成。因此，对于开发直接靶cccDNA形成和维 持的新治疗药存在未满足的迫切需求。
Cai(2013)Methods in Mol Biol 1030(151-161)公开了从细胞培养物 检出HBVccc(共价闭合环状)DNA的DNA印迹测定法。然而，迄今， 抗cccDNA物质的筛选已经因缺少有效体外HBV感染模型受限，并且 以高通量至中等通量模式测量cccDNA的实用方案不可得。备选地，可 以在组成型或条件性复制HBV基因组的稳定转染的HBV细胞培养物 (如HepG2.2.15细胞和HepAD38细胞所代表)中通过胞内扩增途径实现 cccDNA形成(7,11,20)。
但是，通过DNA印迹杂交或实时PCR测定法从HBV细胞系直接 检出cccDNA将经不住筛选检验，原因分别在于灵敏度问题和特异性问 题。在另一方面，HepG2.2.15细胞中不存在合适的cccDNA替代标记， 因为绝大部分病毒产物衍生自整合的病毒转基因，其无法与cccDNA的 贡献区分。先前已经报告，分泌型HBeAg的产生在HepAD38细胞中优 势地为cccDNA依赖性斌并且可能充当cccDNA的替代标记(11,23)。最 近，Cai等人将改进形式的唯一依赖cccDNA产生HBeAg的细胞系(命 名为HepDE19细胞(7))应用成筛选cccDNA抑制剂的96孔模式测定法 并且鉴定到抑制cccDNA形成的两种小分子化合物(3)。这种工作因此提供了以下的坚实“概念验证”展示：可以通过化学分子直接靶向cccDNA 生物合成，并且可以从高通量筛选计划鉴定cccDNA抑制剂。然而，现 存HepDE19测定体系的某些缺点令筛选较大文库不切实际。例如，目 前用于HBeAg的传统ELISA测定法需要多重操作，因氨基酸序列同源 性而与病毒核心蛋白显示出某种程度的交叉反应，并且不适于较大模式 基于细胞的测定法。
因此，作为本发明基础的技术问题是提供手段和方法以可靠筛选嗜 肝DNA病毒cccDNA的抑制剂。
这个技术问题通过提供在权利要求书中表征的实施方案加以解决。
因此，本发明涉及一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒ccc(共 价闭合环状)DNA的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包 含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选 择候选分子。
这些方法总体上适用于与乙型肝炎病毒(HBV)共有相似基因构造和 复制策略的其他哺乳动物及鸟类嗜肝DNA病毒，如代表性土拨鼠肝炎 病毒(WHV)和鸭乙型肝炎病毒(DHBV)。本文中就乙型肝炎病毒提供的 解释和实验因此同样地适用于其他嗜肝DNA病毒。然而，本文中提供 的教导内容在优选的实施方案中涉及“乙型肝炎病毒”/HBV。术语“嗜肝DNA病毒”、“乙型肝炎病毒”、“鸭乙型肝炎病毒”、“土拨鼠肝炎病毒 (WHV)”是本领域熟知的并且因此用于本文中。缩写“HBV”、“DHBV” 或“WHV”在本文中分别与完整术语“乙型肝炎病毒”、“鸭乙型肝炎病毒” 和“土拨鼠肝炎病毒”互换使用。
本文优选的嗜肝DNA病毒优选地是乙型肝炎病毒(HBV)。乙型肝炎 病毒(HBV)是属于嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)的非细胞病变性、 嗜肝DNA病毒，即，HBV是一种嗜肝DNA病毒。HBV基因组的示例 性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中显示。
本文优选的嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。 术语“乙型肝炎病毒e抗原”和“HBeAg”在本文中互换地使用。HBeAg 的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:16和18中显示。 如本文所用，“嗜肝DNA病毒e抗原”(并且同样地“乙型肝炎病毒e抗原”) 主要指蛋白质/多肽，例如具有如SEQ ID NO:18中所显示的氨基酸序列 的蛋白质/多肽。
一旦感染，可以如下产生HBeAg：一旦感染，HBV病毒基因组松 弛型环状(rc)DNA运输入细胞核并转化成附加体性cccDNA，其充当病 毒全部mRNA的转录模板，包括3.5-3.6kb编码作为HBeAg前体的前 核心蛋白的前核心蛋白mRNA。术语“ccc DNA”和“共价闭合环状DNA” 在本文中互换地使用。
HBV前核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:15和17中显示。HBV前核心蛋白具有一个N末端19氨基酸信号 肽、一个10-氨基酸接头、一个中央氨基酸段和一个C末端34氨基酸精 氨酸丰富结构域。
HBV核心蛋白的示例性核酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO: 23和24中显示。核心蛋白对应于前核心蛋白(参见SEQ ID NO:17)，在 于它包含前核心蛋白的C末端精氨酸丰富序列；然而，核心蛋白不包含 前核心蛋白的N端信号肽和10氨基酸接头序列。
通过移除前核心蛋白N端信号肽和C末端精氨酸丰富序列的两个蛋 白酶解性事件产生HBeAg(Wang(1991)J Virol 65(9),5080(21)。因此， 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)对应于前核心蛋白(参见SEQ ID NO:17)， 在于它包含前核心蛋白的N末端10-aa接头肽；然而，HBeAg不包含前 核心蛋白的C末端精氨酸丰富序列。
慢性乙型肝炎分子基础是病毒cccDNA在感染的肝细胞的胞核中持 续存在。
术语“共价闭合环状DNA”和“cccDNA”在本文中互换地使用。术语 “共价闭合环状DNA”/“cccDNA”是本领域熟知的并且因此用于本文中。 通常，如本文所用的“共价闭合环状DNA”/“cccDNA”指充当嗜肝DNA 病毒mRNA的可靠附加体性转录模板的DNA。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)是接受的HBV嗜肝DNA病毒cccDNA 替代标记，所述替代标记转而反映慢性嗜肝DNA病毒感染。然而，使 用HBeAg的基于细胞的已知测定法具有缺点，如与病毒核心蛋白交叉 反应。
为了改善cccDNA报道分子检测法的特异性和灵敏度，本文中建立 了这样的细胞系，它们支持具有标签(如N末端嵌入的血凝素(HA)表位 标签)的重组HBeAg的cccDNA依赖性产生。另外，开发了检测加(HA-) 标签的HBeAg的化学发光ELISA(CLIA)和AlphaLISA测定法。该测定 体是适应于高通量筛选模式和完全自动化。
本文提供的方法利用建立的标签(如可以替代HA标签使用或除HA 标签之外使用的HA标签、或His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标 签或C9标签)的用途。这些标签可以用于纯化和检测加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原。通过使用与标签特异性结合的抗体(例如通过ELISA测定 法，如化学发光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地评 估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免与核心蛋白的交 叉反应。
本文提供的方法利用包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。该核酸分子可以包含编码 嗜肝DNA病毒前核心蛋白的序列或甚至嗜肝DNA病毒基因组以反映嗜 肝DNA病毒的cccDNA形成并且令其成为可能。本领域已知，HBV基 因组具有显示重叠ORF和多个顺式元件的高度紧凑型基因构造。因此， 认为基因插入/缺失或序列替换将很可能影响病毒DNA复制(13,22)。 (Liu等人,J Virol.2004；78(2):642-9)(Wang等人.PLoS One.2013 2； 8(4):e60306)。先前的工作已经通过GFP替换HBV序列，如在大多数情 况下pol/包膜蛋白编码区，以产生重组HBV基因组，但是需要病毒蛋白 的反式互补以支持病毒复制和病毒粒装配(17)(Protzer等人,PNAS (1999),96:10818-23)。另外，这种报告的重组HBV基因组仅可以产生 第一轮cccDNA合成，如果用来感染容许性细胞，则cccDNA的胞内扩 增被阻断，原因是缺陷型病毒DNA复制。
嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA中的5’茎-环结构(ε) 是病毒复制的必需顺式元件。它充当pgRNA包装信号和DNA引发位点。 ε与前核心蛋白ORF的5’部分重叠并含有衣壳(核心)蛋白ORF的起始 密码子。为了在不改变HBV基因组编码的ε结构的完整性的情况下， 在前核心蛋白ORF中的N端信号肽序列下游插入编码标签的核酸序列， 将一个三氨基酸接头序列(GTG GAC ATC)在(HA-)标签5'末端引入其 中，以替代如HBV基因组编码的ε的底部处右臂的原始病毒序列(ATG GAC ATC)。因而，维持如HBV基因组编码的ε的碱基配对并且将核心 蛋白ORF的起始密码子移动到HBV基因组编码的ε下游的位置。此外， 原始GGC序列安置在HA标签序列和核心蛋白AUG之间，以保持核心 蛋白起始密码子的可靠Kozak基序(图1)。图1显示HBV基因组的编码 ε结构的部分，其中根据本发明插入编码标签的核酸序列。
本文中构思了以上修饰对HBV pgRNA依赖性核心蛋白表达和 pgRNA衣壳化造成最小影响，因为保留了ε和核心蛋白表达盒，不过核 心蛋白的翻译起始位点在pgRNA模板中进一步向下游移动39-nt。实际 上，重组HBV基因组支持几乎野生型水平的病毒DNA复制，并且一旦 前核心蛋白ORF在cccDNA分子中重构，则成功产生加HA标签的 HBeAg。
插入编码标签的寡聚物的确不影响病毒DNA应用，从而本文提供 的方法允许产生cccDNA并且因此允许通过确定替代标记“加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原”的量，评估物质/候选分子抑制cccDNA形成的能力。 本文提供的手段和方法主要可用于筛选及鉴定可以在与嗜肝DNA病毒 相关的慢性病如(慢性)肝炎和尤其慢性乙型肝炎感染的疗法中使用的候 选分子。
将编码标签(如HA标签)的核酸序列插入嗜肝DNA病毒(如HBV) 前核心蛋白ORF中导致嗜肝DNA病毒(如HBV)可用于改善抗原检测特 异性的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg)的cccDNA依赖性产 生。在支持本发明时，本文中证实，(HA-)标签插入不影响前核心蛋白的 表达及其后续翻译后加工(N端信号肽切割和C末端结构域切割)和成熟 的HBeAg分泌(图2)。更重要地，本文中显示，嗜肝DNA病毒(如HBV) 基因组中的这种修饰不妨碍病毒pgRNA衣壳化和逆转录，这是通过胞 内扩增途径形成cccDNA的前提(图4、图6-8、图12)。
本发明涉及筛选药理学物质及评估其对抗嗜肝DNA病毒的活性。 特别地，本发明描述了设计和构建用于诱导型表达HBV cccDNA依赖性 表位(例如加人流感血凝素(HA)标签的HBV e抗原(HBeAg)的重组乙型 肝炎病毒(HBV)基因组和新细胞系。可以定量地测量分泌入培养液的加 标签的HBeAg，例如通过化学发光酶免疫测定法(CLIA)和/或 AlphaLISA。本发明提供基于细胞的有效HBV报道分子系统以筛选化 合物的抗嗜肝DNA病毒活性，尤其抑制cccDNA形成、维持和/或其转 录活性的那些化合物。
本发明进一步由图10说明。这里，显示3TC处理消除了HepBHAe13 细胞中的HA-HBeAg信号，不过这是一种其中3TC阻断病毒DNA复制 并且因此无cccDNA合成的极端情况。另外，作为原理的证据，在 HepBHAe13细胞中检验了两种cccDNA形成抑制剂(CCC-0975和CCC-0346)。两种化合物均剂量依赖地降低HA-HBeAg水平；参见图11。
例如，以下非限制性抗嗜肝DNA病毒测定法可以根据本发明进行：
1.使用HepBHAe细胞系筛选调节cccDNA稳定性和/或转录活性的 化合物/候选分子。
根据本发明，体外测定方法可以用来筛选/评价化合物/候选分子调 节胞核中cccDNA稳定性或转录活性的效力。化合物/候选分子因而改变 培养上清液中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的水平。 为了进行该测定法，细胞可以首先在含有四环素的培养板中接种，并且 在细胞达到汇合后，培养基将更换为无四环素的培养基以诱导嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA复制和cccDNA形成，这在正常情况下耗时6-8天。 此后，可以再添加四环素以关闭病毒DNA从整合型HBV基因组从头复 制，同时添加3TC(或其他HBV聚合酶抑制剂)以阻断cccDNA的胞内扩 增途径。在相同的时间，可以将测试化合物加入培养基持续某个时间段。 培养基随后可以用于加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的 ELISA测量。来自不含有测试化合物的孔的培养基可以用作对照。降低 培养基中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)水平的有效化合 物可以具有促进cccDNA翻转(turnover)或沉默cccDNA转录的活性。 短语“有效的或有效地”可以在本文中用来显示，化合物在某个检验浓度 足以阻止并且优选地减少本发明基于细胞的测定体系中加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)的产生至少50％、最优选至少90％。 通过qPCR或杂交直接测量cccDNA和前核心蛋白mRNA的稳态水平 可以用来区分测试化合物/候选化合物/候选分子是否分别减少cccDNA稳定性或转录。
2.使用HepBHAe细胞系筛选抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)cccDNA 形成的化合物/候选分子。
根据本发明的另一个方面，体外测定方法可以用来评价抑制 cccDNA形成的化合物/候选分子。简而言之，细胞可以接种在培养孔中 并且四环素可以在细胞单层变得汇合的当日省略。同时，可以添加测试 化合物并且可以在处理结束时通过ELISA测量培养基中加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)(大约6天)。导致加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原(如HA-HBeAg)减少的任何化合物表示它可以有效地阻断 cccDNA的形成。作为这种体外测定方法的扩展方面，值得指出的是， 在这种测定法中减少加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如HA-HBeAg)还可 以显示化合物具有抑制嗜肝DNA病毒(如HBV)DNA复制的潜力。可以 通过DNA印迹和/或qPCR直接测量病毒核心蛋白DNA，研究这种可能 性。从上文描述的测定法浮现的“命中”还可以包括影响cccDNA稳定性 和/或转录的化合物。在诱导时间段期间，早期产生的cccDNA的稳定性 和/或转录活性可以被检验性化合物靶向。
3.HepHA-HBe细胞系起到反筛选系统的作用。
理论上，来自前述测定法的化合物“命中”可以直接抑制加HA标签 的前核心蛋白翻译、或翻译后加工、或加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如 HA-HBeAg)分泌。为了排除这类非cccDNA抑制剂，“命中”可以在 HepHA-HBe细胞中反筛选，所述HepHA-HBe细胞使用转基因作为模 板产生加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(如加HA标签的HBeAg)。在另 一方面，HepHA-HBe细胞还可能用来筛选HBeAg抑制剂。
术语“抑制共价闭合环状DNA”及其语法形式可以指抑制共价闭合 环状DNA的稳定性(即指降低的共价闭合环状DNA稳定性)、指抑制共 价闭合环状DNA的转录活性(即指使用共价闭合环状DNA作为转录模 板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少)或指抑制共价闭合环状DNA的形 成(即无或更少cccDNA形成)。
术语“抑制共价闭合环状DNA”的这些示例性解释和定义不是互斥 的。例如，抑制的共价闭合环状DNA形成可以导致使用共价闭合环状 DNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA转录减少/与之相关(即抑制 共价闭合环状DNA的转录活性)。抑制的共价闭合环状DNA稳定性可 以导致使用共价闭合环状DNA作为转录模板的嗜肝DNA病毒mRNA 转录减少/与之相关。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以在本文中作为嗜肝DNA病毒 cccDNA的任何这类抑制作用的替代标记使用。
根据上文，本文提供的方法可以用于评估候选分子抑制嗜肝DNA 病毒cccDNA形成的能力。在这种情况下，细胞可以在cccDNA已经形 成之前与候选分子接触。
本文提供的方法可以用于评估候选分子降低嗜肝DNA病毒 cccDNA的稳定性(例如cccDNA的量或数目)的能力。这里，细胞可以在 cccDNA已经形成之后与候选分子接触。
本文提供的方法可以用于评估候选分子降低嗜肝DNA病毒 cccDNA转录(活性)的能力。这里，细胞可以在cccDNA已经形成之后与 候选分子接触。
根据本发明待评估其水平的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含 有一个或多个标签。如本文中显示，可以通过使用仅一个标签，例如通 过使用与该标签特异性结合的抗体，实现对加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的可靠评估。因此，本文中构思和优选加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原仅含有一个标签。
以下涉及一种或多种在本文待用的标签。
如本文所用的术语“标签”指可用作标志物的任何化学结构。主要地， 术语“标签”指“蛋白质标签”。术语“标签”和“蛋白质标签”是本领域已知 的；尤其参见Fritze CE,Anderson TR.“Epitope tagging:general method for tracking recombinantproteins”.Methods Enzymol.2000； 327:3-16；Brizzard B,Chubet R.Epitope taggingof recombinant proteins.Curr Protoc Neurosci.2001年5月；第5章：第5.8单元；和/ 或Terpe K.Overview of tag protein fusions:from molecular and biochemicalfundamentals to commercial systems.Appl Microbiol Biotechnol.2003Jan；60(5):523-33。
一般，本文待用的标签是与嗜肝DNA病毒e抗原融合的蛋白质标 签。例如，编码标签的核酸可以与编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸融 合，从而表达包含标签和嗜肝DNA病毒e抗原的融合蛋白。标签可以 融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入编码嗜肝DNA 病毒e抗原的核酸内部和/或融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的 3'末端。因此，所产生的融合蛋白可以在N末端、内部(即在嗜肝DNA 病毒e抗原内部/作为内部表位)、和/或在C末端包含标签。如本文中显 示，内部表位标签可以用于可靠评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的 水平并且因此是优选的。
各种标签是本领域已知的并且可以根据本发明使用。通常，本文待 用的标签具有约1-3kDa、优选地约1kDa的低分子量。示例性非限制 的低分子量标签是HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标 签或C9标签。本文中优选使用HA标签。本文待用的Flag标签可以是 1×Flag标签或3×Flag标签。
低分子量以标签长度(即组成标签的氨基酸残基数)反映。例如，可 以在本文中使用His标签(6个氨基酸)、HA标签(9个氨基酸)、FLAG- 标签(8个氨基酸)、或3XFLAG标签(22个氨基酸)。这些示例性标签支 持接近野生型水平的HBV DNA复制并且因此可用于实施本发明。
因此，本文待用的标签可以由6至22个氨基酸，例如6个氨基酸、 7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12 个氨基酸、13个氨基酸、14个氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17 个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸、20个氨基酸、21个氨基酸、或 22个氨基酸组成。
编码本文待用标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的 编码HA标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的 核酸序列、如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如 SEQ ID NO:5中所示的编码V5标签的核酸序列、或如SEQ IDNO:6 中所示的编码C9标签的核酸序列。本文中优选使用由SEQ ID NO:1 编码或如SEQ IDNO:8中所示氨基酸序列组成的HA标签。
编码本文待用的Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中 所显示的编码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编 码3×Flag标签的核酸序列。
本文待用的标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的 HA标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His标签的氨基酸序 列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO: 12中所示的V5标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:13中所示的C9标 签的氨基酸序列。
本文待用的Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中 所显示的1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的 3×Flag标签的氨基酸序列。
本文中主要构思使用多种表位标签，如血凝素(HA)标签、His标签、 Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。表位标签是因为可以在 许多不同物种中可靠产生高亲和力抗体而选择的短肽序列。这些标签经 常衍生自病毒基因，这解释了它们的高度免疫反应性。这些标签特别可 用于蛋白质印迹法、免疫荧光法、免疫组织化学、免疫亲和色谱及免疫沉淀实验。它们还用于抗体纯化。这类表位标签特别有用，因为可以根 据本发明使用与这些标签特异性结合的已知和市售抗体。
将亲和标签附加至蛋白质，从而使用亲和技术，可以从粗制生物学 来源中纯化所述蛋白质。这些包括壳多糖结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合 蛋白(MBP)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)。聚(His)标签是一种广泛使用的 蛋白质标签；它与金属基质结合。
色谱标签用来改变蛋白质的色谱特性以提供跨越特定分离技术的不 同分离度。经常，这些标签由聚阴离子氨基酸组成，如FLAG-标签。
基本上可以在本文中使用任何标签。如包含于本文待用的核酸分子 中的编码标签的核酸应当能够支持嗜肝DNA病毒DNA复制、cccDNA 形成和cccDNA依赖性加标签的嗜肝DNA病毒抗原e产生和分泌。可 以使用本文中提供的测定法例如实验中所提供的测定法，容易地验证这 种能力。例如，已经在本文中展示，HA标签插入导致在稳定细胞系中 野生型水平的HBV DNA复制和从cccDNA产生加HA标签的HBeAg。 可以对其他标签容易证实和检验这些能力。例如，插入His标签和Flag 标签的确在瞬时转染测定法中不影响病毒DNA复制。
其他标签可以在不背离本发明精神的情况下使用。
例如，报道蛋白可以用作本文中的标签，如萤光素酶(例如萤火虫萤 光素酶、海肾萤光素酶、长腹水蚤(Gaussia)萤光素酶、等)、绿色荧光蛋 白(GFP)等。这些报道蛋白允许容易评估加标签的嗜肝DNA病毒的水 平，例如通过视检、荧光测量等。荧光标签用来给出蛋白质的视觉读出 结果。GFP和其变体是最常使用的荧光标签。
可以在本发明筛选方法中使用的示例性报道蛋白尤其是萤光素酶、 (绿色/红色)荧光蛋白及其变体、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)、RFP(红 色荧光蛋白，如DsRed或DsRed2)、CFP(青色荧光蛋白)、BFP(蓝绿色 荧光蛋白)、YFP(黄色荧光蛋白)、β-半乳糖苷酶或氯霉素乙酰转移酶。
萤光素酶是熟知的报道分子；参见，例如，Jeffrey(1987)Mol.Cell. Biol.7(2),725-737。本领域技术人员可以容易地从相应的数据库和标准 教材/综述推断出在本发明的上下文中待使用的其他萤光素酶核酸序列 和氨基酸序列。
报道蛋白可以通过引起可检测信号的信号强度变化，允许检测/评估 抑制cccDNA的候选分子。所述可检测信号可以是荧光共振能量转移 (FRET)信号、荧光偏振(FP)信号或闪烁临近(SP)信号。可检测信号可以 与如上文定义的报道蛋白相关。例如，GFP可以衍生自维多利亚多管发 光水母(Aequorea victoria)(US5,491,084)。编码维多利亚多管发光水母 GFP的质粒从ATCC登录号87451可获得。这种GFP的其他突变形式， 包括但不限于pRSGFP、EGFP、RFP/DsRed、DSRed2、和EYFP、BFP、 YFP连同其他，尤其从ClontechLaboratories,Inc.(Palo Alto,California) 可商业获得。
可以监测包含核酸分子的培养的细胞/组织，所述核酸分子包含编码 与报道基因(如萤光素酶、GFP等)融合的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序 列，用于报道基因转录随培养基中测试化合物/候选分子浓度变化的证 据。报道基因的转录水平随测试化合物浓度变化而变动显示了测试化合 物/候选分子抑制cccDNA的能力。
报道蛋白通常大于上文所述的低分子量标签，如表位标签。归因于 例如包含编码萤光素酶的核酸序列的核酸分子与编码更小(表位)标签(如 HA标签)的核酸序列相比插入更长，下游病毒核心蛋白和pol从重组前 基因组RNA中的表达可能减少，从而可能需要核心蛋白/pol的反式互补 物以恢复病毒复制。例如，在这种情况下尤其可以根据本发明使用组成 型表达嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol) 的细胞/细胞系。
本文中构思了使用含有两个或更多个标签的加标签的嗜肝DNA病 毒e抗原。使用两个或更多个标签可以允许甚至更可靠和因此有利地评 估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。例如，如果两个或更多个标签是不 同的标签(例如一个标签是HA标签，第二个标签是His标签)，则可以 使用与两个标签均特异性结合的抗体。这种测定法可以因此使用例如两 个表位抗体例如用于ELISA检测，以进一步增加分析特异性。
本文中发现，插入一个22氨基酸的3×FLAG标签插入物支持有效 的HBV复制。因此，认为也可以在本文中使用例如串联嵌合表位标签， 如HA-接头-FLAG。
根据上文，当使用两个或更多个标签(例如两个或更多个不同标签) 时，一个标签可以由6至22个氨基酸组成。本文中特别地构思，本文待 用的标签的总长度(即两个或更多个标签的氨基酸残基总和)不超过最大 约22个氨基酸，因为下游病毒核心蛋白和pol从重组前基因组RNA中 的表达可能降低，如上文报道蛋白(如萤光素酶)的上下文中所述。如果这种下游病毒核心蛋白和pol表达减少出现，例如当两个或更多个标签 的总长度超过约22个氨基酸时，可能需要核心蛋白/pol的反式互补物以 恢复病毒复制。例如，在这种情况下尤其可以根据本发明使用组成型表 达嗜肝DNA病毒核心蛋白和嗜肝DNA病毒聚合酶(核心蛋白/pol)的细 胞/细胞系。
如同编码仅一个标签的核酸、编码两个或更多个标签的核酸可以融 合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的5'末端、插入编码嗜肝DNA病 毒e抗原的核酸内部和/或融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸的3' 末端。标签可以由标签分隔：如果使用两个标签，则标签-接头标签，如 果使用三个标签，则标签-接头-标签-接头-标签等。
因此，所产生的融合蛋白可以在N末端、内部(即在嗜肝DNA病毒 e抗原内部/作为内部表位)、和/或在C末端包含两个或更多个标签。如 本文中显示，内部表位标签可以用于可靠评估加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的水平并且因此是优选的。本文中构思了使用例如在N末端具有一 个标签和例如具有第二内部标签和/或例如在C末端具有第三标签的所 得融合蛋白。在不背离本发明精神的情况下，其他组合容易地显见和涵 盖的。
两个或更多个标签可以是以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His 标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。Flag标签可以 是1×Flag标签或3×Flag标签。
在下文，更详细地描述根据本发明待使用的核酸分子。
核酸分子可以包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白(如HBV前核心 蛋白)的核酸序列。编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在 SEQ ID NO:15中显示并且嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸 序列在SEQ ID NO:17中显示。
核酸分子可以包含如上文限定和解释的编码一个或多个标签的核酸 序列。编码一个或多个标签的序列可以在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋 白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游(插入)。
相对于乙型肝炎病毒，N端信号肽和接头构成例如SEQ ID NO:17 中所示的前核心蛋白的N末端29个氨基酸。因此，编码一个或多个标 签的核酸序列可以在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的 核酸序列的3'下游(插入)。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列 可以在构成从编码HBV前核心蛋白的核酸(编码HBV前核心蛋白的核 酸例如在SEQ ID NO:15中显示)的5'末端起87个核酸残基的核酸序列 的3’下游(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病 毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位 置29相对应的氨基酸残基的C末端插入。
相对于HBeAg，接头构成例如SEQ ID NO:18中所示的HBeAg的 N末端10个氨基酸。就HBeAg而言，编码一个或多个标签的核酸序列 可以在编码HBeAg N端10个氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。换而 言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在构成从编码HBVHBeAg 的核酸(编码HBeAg的核酸例如在SEQ ID NO:16中显示)的5'末端起 30个核酸残基的核酸序列的3’下游(插入)。在蛋白质水平，一个或多个 标签可以在与HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示) 的位置10相对应的氨基酸残基的C末端插入。
更精确地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBV前 核心蛋白的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间(插入)。这些位置在 嗜肝DNA病毒的pgRNA的ε结构中或如嗜肝DNA病毒基因组编码的 ε中界定了接头的编码性序列和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列 的ORF起始密码子。相对于HBV，位置87是编码接头的序列的最末3’ 核苷酸并且位置88是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。
在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病毒前核心蛋白 (前核心蛋白的氨基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位置29和30相 对应的氨基酸残基之间插入。
同样地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBeAg的 核酸序列(编码HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置 30和31相对应的核苷酸之间(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可 以在与HBeAg(HBeAg的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示)的位置 10和11相对应的氨基酸残基之间插入。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白(如 HBV核心蛋白)的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示例性核 酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
编码一个或多个标签的核酸序列的上文限定的插入位点也可以由嗜 肝DNA病毒基因组中核苷酸的位置限定。相对于HBV基因组，根据上 文，包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入与HBV基因 组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间。这些位置可以根据 例如Galibert,F.等人(1979),Nature 281:646-650中所述的命名法确定。
显而易见，如本文中使用的核苷酸(位置)“C1902”和“A1903”分别指 前核心蛋白区域编码性序列的最末核苷酸和核心蛋白AUG的第一个核 苷酸。它们在不同HBV基因型(A-H)序列(还如本文中提供及在SEQ ID NO:27-34中显示)之间保守。因此，本文待用的HBV基因组的示例性 非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34中 显示。然而，核苷酸“C”，而非核心AUG中的“A”，或它们的位置可以 在序列上不同于一些罕见(临床)分离株。这类序列也包含于本发明中。
根据本发明，编码一个或多个标签的核酸序列可以插入除HBV基 因组之外的嗜肝DNA病毒基因组的位置C1902和位置A1903相对应的 核苷酸之间。可以容易地确定嗜肝DNA病毒基因组中这些相应的位置 (即嗜肝DNA病毒基因组中与HBV基因组的位置C1902和位置A1903 对应的位置)。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序列可以在嗜肝 DNA病毒pgRNA的、优选地HBV pgRNA的ε结构或嗜肝DNA病毒 基因组(优选地，HBV基因组)编码的ε和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白 的核酸序列的ORF起始密码子之间插入。
例如，如果核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序 列，则编码一个或多个标签的序列可以在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋 白的N端信号肽和接头的核酸序列的3'下游(插入)。可以以容易地确定 编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列。该序 列始于(并因此包含)编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列的ORF 起始密码子并止于编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始 密码子之前(即排除核心蛋白的编码性序列)。在蛋白质水平，一个或多 个标签可以在与接头(N端信号肽后的接头)C末端最末氨基酸相对应的 氨基酸残基的C末端插入。
因此，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码嗜肝DNA病毒e 抗原的N端氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。这些N端氨基酸构成嗜 肝DNA病毒前核心蛋白中的“接头”。在蛋白质水平，一个或多个标签 可以在接头的最末C端氨基酸残基的C末端插入。
更精确地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在与编码HBV前 核心蛋白的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间(插入)。在蛋白质水 平，一个或多个标签可以在与乙型肝炎病毒前核心蛋白(前核心蛋白的氨 基酸例如在SEQ ID NO:17中显示)的位置29和30相对应的氨基酸残基之间插入。这些位置在嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的 ε结构中或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构 中界定了接头的编码性序列和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列 的ORF起始密码子。相对于HBV，位置87是编码接头的序列的最末3’ 核苷酸并且位置88是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。可以容易确 定嗜肝DNA病毒HBV前核心蛋白中的相应位置(即嗜肝DNA病毒基因 组中与编码HBV前核心蛋白的核酸序列的位置87和88对应的位置)。
同样地，编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码嗜肝DNA病 毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列和编码嗜肝DNA病毒核 心蛋白的核酸序列之间(插入)。
例如，该核酸序列可以在与编码HBeAg的核酸序列(编码HBeAg 的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置30和31相对应的核苷 酸之间(插入)。在蛋白质水平，一个或多个标签可以在与HBeAg(HBeAg 的氨基酸例如在SEQ ID NO:18中显示)的位置10和11相对应的氨基酸 残基之间插入。这些位置界定了前核心蛋白中嗜肝DNA病毒N末端接 头的编码性序列(或嗜肝DNA病毒e抗原中嗜肝DNA病毒N末端接头 的编码性序列)和编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸序列的ORF起始 密码子。相对于HBV，位置30是编码HBeAg的核酸序列中编码接头的 序列的最末3’核苷酸。位置31是编码核心蛋白的序列的第一个核苷酸。 可以容易确定编码嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列中的相应位置(即嗜 肝DNA病毒e抗原中与编码HBeAg的核酸序列的位置30和31对应的 位置)。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白、 优选地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示 例性核酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序 列在SEQ ID NO:24中显示。换而言之，编码一个或多个标签的核酸序 列可以在嗜肝DNA病毒pgRNA的、优选地HBV pgRNA的ε结构或如 嗜肝DNA病毒基因组(优选地，HBV基因组)编码的ε结构和编码嗜肝 DNA病毒核心蛋白、优选地HBV核心蛋白的核酸序列的ORF起始密 码子之间插入。
如上文提到，本文中待使用/提供的核酸分子可以包含编码一个或多 个标签的序列，其中所述序列插入嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构，或插入如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因 组编码的ε结构。图1中显示HBV基因组编码的示例性ε结构。相对于 HBV，如HBV基因组编码的ε结构始于(并且包括)HBV基因组的位置 T1849并止于(并且包括)其位置A1909。HBV基因组编码的ε结构的示 例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
如上文所述，包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入 嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜 肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎中。如 HBV基因组编码的ε结构的示例性下部茎在SEQ ID NO:1中显示。例 如，编码一个或多个标签的核酸序列可以插入与编码HBV前核心蛋白 的核酸序列(编码HBV前核心蛋白的核酸序列例如在SEQ ID NO:15中 显示)的位置87和88相对应的核苷酸之间、或与编码HBeAg的核酸序 列(编码HBeAg的核酸序列例如在SEQ ID NO:16中显示)的位置30和 31相对应的核苷酸之间或与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相 对应的核苷酸之间。全部这些位置均在嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地 HBV pgRNA的ε结构的下部茎中或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地 HBV基因组编码的ε结构的下部茎中。
本文中构思和优选，核酸分子在编码一个或多个标签的序列的5’包 含能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部 茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部 茎形成碱基对的序列。认为本文中相对于乙型肝炎病毒/加标签的乙型肝 炎病毒e抗原描述和提供的实验和教导内容总体上适用于嗜肝DNA病 毒/加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。对于每种具体的嗜肝DNA病毒、 优选地HBV，对用于HBV的插入序列的唯一修饰可以涉及修饰编码(表 位)标签的核酸序列的5’侧翼序列以维持嗜肝DNA病毒pgRNA、优选 地HBV pgRNA的ε、或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组 编码的ε的碱基配对。基于本发明的教导内容，本领域技术人员能容易 地设计并制备编码标签的核酸序列的5’的核酸序列以维持与嗜肝DNA 病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、 优选地HBV基因组编码的ε结构的碱基配对。特别地就鸭乙型肝炎病 毒(DHBV)而言，由于其核心蛋白ORF的起始密码子位于ε的下游，因 此甚至不需要引入编码(表位)标签的核酸序列的5’侧翼序列以维持 DHBV的ε的碱基配对。
如图1中所示，核酸序列插入与HBV基因组的位置C1902和A1903 相对应的核苷酸之间，其中所述核酸序列含有9个核苷酸的5’-侧翼区(即 编码一个或多个标签的核酸序列的5’)，所述5’侧翼区与嗜肝DNA病毒 pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基 因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎(例如与对应于HBV 基因组位置T1849至T1855的核苷酸)形成碱基对。
本发明的一个重要和优选方面是，如本文定义和/或如上文所述待插 入的编码一个或多个标签的核酸序列还包含这样的核酸序列，其能够与 嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA 病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构形成碱基对，尤其与嗜 肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝 DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基 对。通过使用能够与ε结构形成碱基对的核酸序列，目的在于保留嗜肝 DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构。转而，认为ε结构对复制、 产生cccDNA和表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗原、优选地HBV e抗原重要。
优选地，能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε 结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε 结构的下部茎形成碱基对的序列能够与优选地对应于位置T1849至 A1854或任选地对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成 碱基对。一般，pgRNA中的碱基对形成在匹配的核糖核苷酸如A-U、 G-C和摇摆碱基对G-U之间发生。如果维持ε结构，则复制、产生cccDNA 和/或表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗原在本文中待使用/提供的 核酸分子中不受阻碍。
应当指出，ε结构的左臂是编码嗜肝DNA病毒e抗原(如HBeAg) 信号肽的核酸序列的组成部分并且因此应当是保持不变。如所述那样在 ε的右臂处设计的插入不应当改变下部茎的碱基配对。在图1中显示的 例举插入中，唯一核苷酸变化与A1903G相关(即在HBV基因组位置 1903处A替换为G)。在位置1903处的点突变从嗜肝DNA病毒pgRNA、 优选地HBVpgRNA的ε或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因 组编码的ε移出核心蛋白ORF、因而允许维持ε结构和在核心蛋白AUG 前方插入标签。核心蛋白从前核心蛋白ORF的起始密码子后转录的前 基因组RNA翻译，从而标签将不并入核心蛋白。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构(的下 部茎)或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构(的 下部茎)、嗜肝DNA病毒基因组的ε结构(的下部茎)形成碱基对的表位 标签5’侧翼序列由至多3、6或9个核苷酸、一般9个核苷酸组成。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下 部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下 部茎形成碱基对的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。能 够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形 成碱基对的示例性序列编码如SEQ ID NO:40中所示的多肽。
本文中待使用/提供的核酸分子还可以在编码一个或多个标签的序 列的3’包含编码接头的核酸序列。接头可以由一个或多个氨基酸残基组 成。优选地，接头仅由一个氨基酸残基如甘氨酸残基组成。
例如，编码接头的核酸序列由序列GGC组成；或核酸序列编码甘 氨酸残基。GGC从核心蛋白ORF的AUG前方的原始3个核苷酸拷贝 而来、所述3个核苷酸与AUG一起装配成用于最佳翻译起始的常见 Kozak基序。因此，优选并适当地选择可以使用/插入的接头，从而保持 核心蛋白起始密码子的真实Kozak基序。
例如，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸 分子可以包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。例如，包含编码加 标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可以包含编码如 SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。如SEQ IDNO:41中 所示的示例性核酸序列由能够与ε结构(的下部茎)形成碱基对的核酸序 列(GTGGACATC；尤其核苷酸GTGGACAT与对应于HBV基因组位 置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对)、编码HA标签的核酸序列和 编码甘氨酸残基作为接头的核酸序列(后一种核酸序列主要用来保持核 心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序)组成。
本文中构思了一个或多个标签符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e 抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。同样地，本文中构思了， 编码一个或多个标签的核酸序列(连同能够与ε结构(的下部茎)形成碱基 对的潜在5’侧翼核酸序列和/或连同保持核心蛋白起始密码子的可靠 Kozak基序或编码接头的潜在3’核酸序列)符合可读框地融合于编码嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核酸序列。
本发明中待使用和提供的核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因组、 优选地乙型肝炎病毒(HBV)基因组。例如，HBV基因组是HBV基因型 A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。本文待用的HBV基因组的示 例性非限制核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34 中显示。HBV基因组可以是HBV基因型D的基因组，尤其HBV亚基 因型ayw的基因组(如SEQ ID NO:27中所示的HBV基因组)。
根据本发明，仅允许(大量)表达/产生(加标签的)嗜肝DNA病毒e抗 原的那些核酸分子，如嗜肝DNA病毒基因组才会使用。例如，已知不 允许大量表达/产生嗜肝DNA病毒e抗原的一些临床HBV变体。在一 些临床HBV变体中，HBeAg阴性归因于基础核心启动子(BCP)双突变 (基因型D中A1764T/G1766A)或前核心蛋白(pC)突变(基因型D中 G1898A)。在BCP突变通过下调前核心蛋白mRNA转录减少HBeAg 的同时，pC突变引入过早终止密码子以阻碍前核心蛋白翻译。这类嗜肝 DNA病毒变体较不适用于本文提供的方法。
在本发明的一个优选实施方案中，加标签的HBeAg包含如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列或由其组成。编码加标签的HBeAg的相应 核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。这些序列在本发明的背景下特别有 用，但是仅为优选实施方案的例子。
编码加HA标签的前核心蛋白(即加标签的HBeAg的前体)的核酸序 列在SEQ IDNO:19中显示。因为这种核酸序列编码加标签的HBeAg 的前体，它可以视为编码加标签的HBeAg的核酸序列。相应的氨基酸 序列在SEQ ID NO:21中显示。
下文更详细地涉及产生加标签的嗜肝DNA病毒e抗原及其评估候 选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的用途。
文中待使用/提供的核酸可以转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒 RNA、尤其前基因组(pg)HBV RNA。
本文中构思了所述核酸可以设计成阻止加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的翻译。例如，核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原 的核酸5’上游的起始密码子ATG。相对于HBV，编码前核心蛋白的核 酸的起始密码子可以缺失或突变。例如，这种(待缺失/突变的)起始密码 子可以对应在(并包括)HBV基因组位置1816至(并包括)位置1818处的 核苷酸；参见例如图1。
避免翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可能是有利的，目的是避 免其在测定法开始时产生/表达。本发明的目的是使用加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原作为cccDNA的替代标记。如果加标签的嗜肝DNA病 毒e抗原在全部时间均产生，则其表达/产生并必然地与产生cccDNA相 关。如图5中所示，起始密码子可以在cccDNA形成时/之后在测定法的 后期恢复，从而加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的表达/产生(即水平)真 实反映嗜肝DNA病毒cccDNA的产生/水平。因此，为了甚至更可靠地 评估候选分子抑制cccDNA的能力，以下情况是有利：在测定法开始时 抑制加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的产生/表达，例如通过移除编码该 抗原的相应核酸的起始密码子/使其突变，以及允许稍后产生/表达加标 签的嗜肝DNA病毒e抗原以反映嗜肝DNA病毒cccDNA的产生/水平。
例如，在如上文限定和描述的编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原 的核酸5’上游的起始密码子ATG可以由核酸TG替换。因此，本文中 待使用和提供的核酸分子可以例如通过点突变修饰，以阻止加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原的翻译。
根据本发明待使用的方法的步骤(a)还可以包含步骤(aa)，所述骤(aa) 包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标 签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组(pg)RNA；
(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形 成双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原；
恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件可以涉及或是 恢复如上文定义和解释的起始密码子。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可 以包含于载体、尤其表达载体中。
载体可以例如包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在诱导型启动子的控制下。本 文待用的示例性非限制诱导型启动子是四环素诱导型启动子、强力霉素 诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动 子、类固醇诱导型启动子、或除草剂诱导型启动子。在本文提供的实验中使用的四环素诱导型启动子(从例如Clontech可商业获得)以tet-off方 式工作。认为以tet-on方式工作的四环素诱导型启动子可以同样地在本 文中使用。tet-on/off系统例如从Clontech和Invitrogen可获得或者在质 粒或病毒(逆转录病毒、腺病毒)主链中。除了四环素/强力霉素诱导型启 动子外，如上文所述的例如响应于抗生素、铜、醇、类固醇、或除草剂 连同其他化合物的其他诱导型启动子也是合适的。例如，诱导型启动子 是CMV启动子。诱导型启动子可以是tet-EF-1α启动子。
另外，可以将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病 毒包膜蛋白的编码区，如一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一种或 多种HBV包膜蛋白。一种或多种嗜肝DNA病毒(HBV)包膜蛋白可以是 表面大蛋白(L)、表面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。在一 个实施方案中，HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。一种或多种HBV包膜 蛋白的示例性编码区在SEQ ID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或 SEQ ID NO:38(S)中显示。在HBV中，可以将SEQ ID NO:38(S)的 HBV核苷酸217至222(TTGTTG)突变成例如TAGTAG以阻止包膜蛋 白的表达。
如果cccDNA的替代标记即加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水 平与对照相比降低，则确定候选分子能够抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。
应当理解加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的评估(表达)水平与对照比 较，如加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的评估(表达)水平的标准或参比值。 可以在尚未与候选分子接触的如本文定义的细胞、组织或非人类动物中 评估对照(标准/参比值)。备选地，可以在上述接触步骤之前在如本文定 义的细胞、组织或非人类动物中评估对照(标准/参比值)。与候选分子接 触时加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平下降也可以是与常规使 用的参比化合物(如已知不能抑制cccDNA的化合物)诱导的加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原的(表达)水平下降比较。技术人员容易地处于确定/评 估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平是否降低的地位。
反之和在不背离本发明精神的情况下，可以使用阳性对照，例如， 参比化合物，如已知能够抑制cccDNA的化合物。如果与这种(阳性)对照 相比，cccDNA的替代标记即加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的(表达)水平 等同或甚至增加，则确定候选分子能够抑制嗜肝DNA病毒cccDNA。
根据本发明，尤其本文所述的筛选或确定方法，细胞、组织或非人 类动物将与包含核酸分子的候选分子接触，其中所述核酸分子包含编码 如本文定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。
例如，所述细胞、组织或非人类动物可以能够表达如本文定义的加 标签的嗜肝DNA病毒e抗原。如本文中解释，可以因此通过测量编码 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的这类基因产物的表达水平、 尤其蛋白质表达水平，检测候选分子抑制/拮抗cccDNA的能力。(与对 照(标准或参比值)相比的)(较)低(蛋白质)表达水平指示了候选分子充当抑制剂/拮抗剂的能力。
归因于降低的转录物/表达水平，翻译的基因产物(即蛋白质水平)的 水平也将降低。上述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白的(蛋白质)水平 一般与加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白相关的可检测信号的信号强 度相关。示例性加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白包含可以包含如上 文所述的报道分子(例如萤光素酶、(绿色/红色)荧光蛋白及其变体、EGFP(增强型绿色荧光蛋白)等)。
因此，细胞/组织/非人类动物与候选分子接触时报道分子信号下降 将显示候选分子的确是cccDNA抑制剂/拮抗剂并且因此能够抑制 cccDNA。从测试的候选分子选出降低如上文定义的加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的水平的候选分子，其中优选地选择强烈降低加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的水平的那些分子(例如以报道分子信号下降反映)。
在本发明的上下文(尤其，本文所公开的筛选/鉴定方法)中构思，还 可以接触细胞提取物(例如包含核酸分子的细胞提取物，所述核酸分子包 含编码如本文中描述和定义的加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序 列)。例如，这些细胞提取物可以从本文待用、尤其待接触候选分子的(转 基因/基因工程化)细胞、组织和/或非人类动物获得。
使用这类细胞提取物是特别有利的，因为它允许在体外评估候选分 子的活性。利用这类(细胞)提取物的评估/筛选方法可以例如用于预筛选 候选分子，其中，在这种预筛选中选出的分子随后接受后续筛选，例如 在本文所公开的基于细胞的方法、尤其在(转基因)细胞、组织和/或非人 类动物与候选分子接触的方法中接受后续筛选。在这种情况下，因此优 选已经在上文和下文所述的体外预筛选方法中选出候选分子。
因此，如本文所用的术语“细胞”涵盖(转基因/基因工程化)细胞、(转 基因/基因工程化)组织和/或(转基因/基因工程化)非人类动物并且还涵盖 从中衍生的细胞提取物。
应当理解常规地在高通量筛选中，同时筛选许多(经常数千种)候选 分子。因此，在(第一)次筛选中，选出降低加标签的嗜肝DNA病毒e抗 原的水平的候选分子。
也可以通过添加含有所述候选分子或多种候选分子(即各种不同候 选分子)的(生物)样品或组合物至待分析的细胞(包含核酸分子的细胞/组 织/非人类动物，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原 的核酸序列)，实现本发明筛选方法的步骤(a)，即“接触步骤”。
通常，候选分子或包含/含有候选分子的组合物可以例如添加至包含 核酸分子的(转染的)细胞、组织或非人类动物，所述核酸分子包含编码 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。如本文定义和公开、术语“包 含了包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子”暗 示使用报道分子。还可以在本文中使用包含启动子和/或增强子区域的报 道分子构建体。
在本发明中、尤其在筛选/鉴定方法的上下文中待使用或提供的细 胞、组织和/或非人类动物可以用包含编码本文公开的加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子稳定或瞬时染。
能够抑制cccDNA(如反映为加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平 降低)的化合物/分子预计作为本文公开的药物背景下的物质有益并且用 于医学目的，尤其用于治疗与嗜肝DNA病毒相关的疾病、尤其与嗜肝 DNA病毒相关的慢性病，如慢性肝炎和尤其慢性乙型肝炎。
可以作为嗜肝DNA病毒cccDNA的特异性“拮抗剂”或“抑制剂”发 挥作用的候选分子/化合物可以是小结合分子如小分子(有机)化合物。
在药物发现背景下，术语“小分子”是本领域已知的并且指具有小于 2,500道尔顿、优选地小于1,000道尔顿、更优选地50和350道尔顿之 间分子量的医用化合物。(小)结合分子包含天然化合物以及合成性化合 物。术语“化合物”(或同样地“分子”)在本发明的背景下包括单一物质或 多种物质。所述化合物/分子可以例如包含于样品(例如来自植物、动物 或微生物的细胞提取物)中。另外，所述化合物可以是本领域已知的，但 是迄今未知能够(不利)影响嗜肝DNA病毒cccDNA。可以将多种化合物 例如在体外添加至样品、添加至培养基或注入细胞。
候选物质还可以包含与蛋白质结构性相互作用必需的官能团、尤其 氢键，并且一般包含至少胺、羰基、羟基或羧基，优选地至少两种功能 性化学基团。候选物质经常包含经一个或多个上述官能团取代的碳环结 构或杂环结构和/或芳族或多芳族结构。
示例类别的候选物质可以包括杂环、肽、糖、类固醇等。可以修饰 化合物以提高效力、稳定性、药物相容性等。物质的结构性鉴定可以用 来鉴定、产生或筛选额外的物质。例如，在鉴定到肽物质的情况下，可 以将它们按多种方式修饰以增强其稳定性，如使用非天然氨基酸，如D- 氨基酸、尤其L-丙氨酸，通过使氨基末端或羧基末端官能化，例如对于 氨基，酰化或烷基化、并且对于羧基，酯化或酸化等，进行修饰。其他 稳定方法可以包括囊化，例如，在脂质体中囊化等。
如上文提到，候选物质还存在其他生物分子中，所述其他生物分子 包括氨基酸、脂肪酸、嘌呤、嘧啶、核酸和衍生物、其结构类似物或组 合。候选物质从多种来源获得，所述来源包括合成或天然化合物文库。 例如，多种手段可用于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子，所 述手段包括表达随机化的寡核苷酸和寡肽。可选地，处于细菌提取物、 真菌提取物、植物提取物和动物提取物形式的天然化合物文库是可获得 的或容易地产生。额外地，通过常规的化学、物理和生物化学手段容易 修饰天然或合成产生的文库和化合物，并且它们可以用来产生组合文库。 已知的药理学物质可以经历定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯 化、酸化等，以便产生结构类似物。
本发明中还构思，可以评估化合物/分子抑制cccDNA的能力，所述 化合物/分子尤其包括肽、蛋白质、核酸(包括cDNA表达文库)、小分子 有机化合物、配体、PNA等。所述化合物也可以是功能性衍生物或类似 物。
用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员熟知的并且 在例如Beilstein,"Handbook of Organic Chemistry",Springer Edition New York或在"Organic Synthesis",Wiley,New York中描述。另外， 可以根据本发明检验所述衍生物和类似物的作用，即它们对cccDNA的 拮抗作用。
另外，可以使用适宜的cccDNA拮抗剂或抑制剂的肽模拟物和/或计 算机辅助设计。本领域中描述了用于计算机辅助设计例如蛋白质和肽的 适宜计算机系统述，例如，在Berry(1994)Biochem.Soc.Trans. 22:1033-1036；Wodak(1987),Ann.N.Y.Acad.Sci.501:1-13；Pabo (1986),Biochemistry 25:5987-5991中描述。从上述计算机分析获得的结 果可以与本发明的方法组合用于例如优化已知的化合物、物质或分子。 也可以通过连续化学修饰法合成肽模似物组合文库并(例如，根据本文所 述的方法)检验所产生的化合物，鉴定适宜的化合物。现有技术中描述了 用于生成和使用肽模似物组合文库的方法，例如在Ostresh(1996) Methods in Enzymology 267:220-234和Dorner(1996)Bioorg.Med.Chem.4:709-715中描述。另外，cccDNA拮抗剂的三维和/或结晶学结构 可以用于设计cccDNA的(肽模拟物)拮抗剂(Rose(1996)Biochemistry 35:12933-12944；Rutenber(1996)Bioorg.Med.Chem.4:1545-1558)。
尤其可以通过用包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序 列的核酸分子转染适宜的宿主并使所述宿主与候选分子接触，鉴定/评估 能够抑制cccDNA的候选分子。
本文待用的细胞/宿主优选地是真核细胞、尤其是肝细胞来源的真核 细胞。真核细胞优选地是肝瘤细胞或肝细胞。真核细胞也可以衍生自肝 瘤细胞或肝细胞。本文待用的优选细胞是真核细胞HepG2 (ATCC#HB-8065)。HepG2细胞已知支持功能性HBV cccDNA形成和转 录。本文中构思使用其他细胞，如肝细胞衍生的细胞(例如Huh7)。也可 以根据本发明使用非肝细胞/宿主，前提是它们支持嗜肝DNA病毒 cccDNA形成(或在更广意义下，嗜肝DNA病毒DNA复制)。例如，如 果将病毒前基因组RNA引入细胞或通过外源启动子从DNA模板转录， 则可以修饰这种非肝细胞/宿主以支持嗜肝DNA病毒cccDNA形成(或嗜 肝DNA病毒DNA复制)。如果在这类非肝细胞中反式补足肝特异性转 录因子，则cccDNA转录可以进行。本发明的核酸分子或包含前者的载 体可以稳定整合在细胞的基因组中。
根据本发明待使用的核酸分子(即包含编码加标签的嗜肝DNA病毒 e抗原的核酸序列的核酸分子)或包含前者的载体优选地基本上由DNA 组成。
上文就“细胞”方面给出的解释还适用于并涵盖包含或衍生自这些细 胞的组织/非人类动物。本文待用的细胞可以包含于样品(例如，生物学 样品、医学样品或病理学样品)中。例如，构思了使用包含细胞、组织或 细胞培养物的流体。这种流体可以是体液或还可以是分泌物并也可以是 培养物样品。体液可以包括但不限于血清、血浆、尿、唾液、滑液、脊 液、脑脊液、泪、粪便等。
同样地，候选分子可以包含于(生物)样品或组合物中。(多种)候选分 子经常接受第一次筛选。在第一次筛选中测试呈阳性的样品/组合物可以 接受后续筛选，以验证此前结果并选出最强力的抑制剂/拮抗剂。依赖于 多个筛选和选择轮次，可以选出显示明显的如本文定义和公开的抑制/ 拮抗cccDNA的能力的那些候选分子。例如，含有多种候选分子的批次 (即组合物/样品)将复筛并且无候选分子抑制活性或候选分子抑制活性不 足的批次在不复筛的情况下弃去。
例如，如果检验具有有多种候选分子的(生物)样品或组合物并且一 个(生物)样品或组合物检验呈阳性，则随后可能在第二次筛选中筛选、 优选地在纯化后筛选(生物)样品或组合物的各个分子。也可以是在后续 筛选中筛选第一次筛选的(生物)样品或组合物的亚组。筛选具有此前筛 选轮次中检验过的那些候选分子亚组的组合物将因此缩小潜在强力 cccDNA抑制剂的范围。这可以促进并加速筛选过程，尤其当筛选众多 分子时。因此，与第一次(和后续)筛选中检验每种和每个单个候选分子(这 当然也还是可能的)相比，筛选轮次的循环次数减少。因此，取决于候选 分子的复杂性或数目，本文所述的筛选方法的步骤可以进行几次直至待 筛选的(生物)样品或组合物包含有限的数目、优选地仅一种物质，所述 物质指示所筛选的分子降低加标签的嗜肝DNA病毒e抗原水平的能力。
本文中构思使用允许在单个细胞水平或某组织的单个细胞水平(例 如在亚细胞水平)解析例如荧光的光学测量技术。这些技术可以涉及荧 光，例如共聚焦显微术、数字图像记录，如CCD照相机和合适的图像 分析软件。例如，通过执行对照在测量标准响应后实验实施步骤(b)。例 如，在第一次筛选中在不接触候选分子情况下确定包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的细胞、组织或非人类动物中加标签的嗜肝DNA病毒 e抗原的水平。在第二次筛选中，在接触候选分子后，测量/评估加标签 的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。水平的差异显示检验的候选分子是否 的确为cccDNA的拮抗剂/抑制剂。
可以通过本文中所述的任何方法、尤其蛋白质测量/检测/评估技术 测量例如基因产物的水平(尤其加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白质 水平)，定量加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平。
例如，可以通过利用免疫凝集、免疫沉淀法(例如免疫扩散、免疫电 泳、免疫固定)、蛋白质印迹技术(例如(原位)免疫组织化学、(原位)免疫 细胞化学、亲和色谱、酶免疫测定法)等在蛋白质水平确定表达。可以通 过物理方法例如光度法确定溶液中已纯化多肽的量。定量混合物中特定 多肽的方法依赖于(例如抗体的)特异性结合作用。利用抗体特异性的特 异性检测和定量方法包含例如免疫组织化学(原位)。例如，可以通过酶 联免疫吸附测定法(ELISA)确定细胞、组织或非人类动物中加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原蛋白水平的浓度/量。
本文中构思了根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水 平可以通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
本文提供的方法利用建立的标签(如可以替代HA标签使用或除HA 标签之外使用的HA标签、或His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标 签或C9标签)的用途。这些标签可以用于纯化和检测加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原。通过使用与标签特异性结合的抗体(例如通过ELISA测定 法，如化学发光-ELISA(CLIA)和AlphaLISA)，可以可靠地及快速地评 估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平并且可以避免与核心蛋白的交 叉反应。
根据本文所提供方法的步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原 的水平可以包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗体、优 选地乙型肝炎病毒e抗原(如，但不限于抗HBe：克隆29，批号20110305， Autobio Diagnostics)的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种 抗体(如，但不限于抗HA：目录号A01244-100，Genscript)。
以下抗体特异性识别乙型肝炎病毒e抗原并且可以根据本发明使 用：
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Ferns和Tedder.Monoclonal antibodies to hepatitis B antigen (HBeAg)derived from hepatitis B core antigen(HBcAg):their use in characterizationand detection of HBeAg.J Gen Virol.1984May；65(Pt 5):899-908。
Mondelli等人,Differential distribution of hepatitis B core and Eantigens in hepatocytes:analysis by monoclonal antibodies.Hepatology. 1986 6(2):199-204。
Stuckmann和Mushahwar.Re-examination and further characterization of amonoclonal antibody to hepatitis B e antigen (anti-HBe).J VirolMethods.1986Jul；13(4):351-62。
Korec等人,Monoclonal antibodies against hepatitis B e antigen:production,characterization,and use for diagnosis.J Virol Methods. 1990May；28(2):165-9。
Usuda等人,A monoclonal antibody against a hepatitis B e antigenepitope borne by six amino acids encoded by the precore region.J VirolMethods.1997Nov；68(2):207-15。
Sogut等人,Monoclonal antibodies specific for hepatitis B e antigenand hepatitis B core antigen.Hybridoma(Larchmt).2011Oct； 30(5):475-9。
备选地，可以进行蛋白质印迹分析或免疫组织化学染色。蛋白质印 迹法组合了通过电泳法分离蛋白质混合物和用抗体特异性检测。电泳可 以是多维的如2D电泳。通常，多肽在2D电泳中依照其表观分子量沿一 个维度分离并且依照其等电点沿另一个方向分离。
技术人员能够通过利用检测信号强度和待确定的例如多肽/蛋白质 的量之间的相关性、优选地线性相关性，确定上文所述的多肽/蛋白质、 尤其基因产物的量。因此，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平可以 基于加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的蛋白质水平定量。技术人员是知 晓待用于确定样品中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原蛋白表达产物水平 的量/浓度的标准方法或可以从标准教材(例如Sambrook，2001)推导出 相应方法。
如果加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(或相应报道分子信号)的水平强 烈地降低、优选地很低或不可检出，则选出候选分子。例如，与(对照) 标准值相比，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原(或相应报道分子信号)的水 平可以降低至少50％、60％、70％、80％、更优选地至少90％。
用于转染细胞或组织的方法是本领域已知的。因此，磷酸钙处理或 电穿孔法可以用于转染细胞或组织以表达所述报道分子构建体(参见 Sambrook(2001)，见上述引文)。另外，表达所述报道分子构建体的核 酸分子可以重构入脂质体以递送至靶细胞。作为又一种备选，可以使用 基因工程病毒载体转导细胞以表达特定报道分子构建体。
在另一个实施方案中，包含用于检测cccDNA抑制作用的所述报道 分子构建体的非人类动物是转基因非人类动物。所描述的筛选分析法中 待使用的非人类生物可以选自秀丽隐杆线虫(C.elegans)、酵母、果蝇、 斑马鱼、豚鼠、大鼠和小鼠。产生这种转基因动物处于技术人员的技能 范围内。相应的技术尤其在“Current Protocols in Neuroscience”(2001), John Wiley&Sons,第3.16章中描述。
因此，本发明还涉及一种用于产生非人类转基因动物的方法，所述 方法包括步骤：将包含编码如本文中公开的加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的核酸序列的核酸分子引入ES-细胞或生殖细胞中。本文提供和描 述的非人类转基因动物特别可用于上文所述的筛选方法和药理学试验 中。本文所述的非人类转基因动物可以用于药物筛选分析法中以及用于 其中追踪、选择和/或分离治疗嗜肝DNA病毒相关疾病的cccDNA拮抗 剂/抑制剂的科学研究和医学研究中。
在本发明背景、尤其筛选/鉴定方法下待使用的转基因/基因工程细 胞、组织和/或非人类动物包含本文描述和定义的包含编码加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。
本发明涉及使用细胞、组织或非人类动物筛选和/或验证疑似作为嗜 肝DNA病毒cccDNA的抑制剂的化合物。
如本文所用的术语“转基因非人类动物”、“转基因细胞”或“转基因组 织”，指不是人类的包含相应野生型动物、组织或细胞的不同遗传物质的 非人类动物、组织或细胞。术语“遗传物质”在这种背景下可以是任何种 类的核酸分子或其类似物，例如如本文定义的核酸分子或其类似物。术 语“不同”意指与野生型动物或动物细胞的基因组相比附加或较少的遗传 物质。待用于产生转基因细胞/动物的不同表达系统的概述例如参见 Methodsin Enzymology 153(1987),385-516、Bitter等人(Methods in Enzymology 153(1987),516-544)和Sawers等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46(1996),1-9)、Billman-Jacobe(Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4)、Hockney(Trendsin Biotechnology 12 (1994),456-463)、Griffiths等人,(Methods in MolecularBiology 75 (1997),427-440)。
本发明涉及如上文定义的核酸分子，即包含编码加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的核酸序列的核酸分子。上文给出的解释和定义在已作必要 修正的情况下适用于此处。嗜肝DNA病毒e抗原优选地是乙型肝炎病 毒e抗原(HBeAg)。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有仅一个标签。标签可以由6 至22个氨基酸组成。常见的和本文中优选的(表位)标签由8、9、10或 11个氨基酸组成。6xHis是可以在本文中使用的最小表位标签。可能的 是，少于6个氨基酸的插入可以与毗邻的HBeAg氨基酸一起装配成新 表位，从而这种插入还产生加标签的嗜肝DNA病毒。标签可以是血凝 素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签。 Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有两个或更多个标签。两个 或更多个标签优选地是不同的标签。所述两个或更多个标签的整个长度 可以是约12个至约31个氨基酸。例如，两个或更多个标签的整个长度 可以是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30或31个氨基酸。两个或更多个标签可以是以下两 者或更多者：HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/ 或C9标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
编码标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的编码HA 标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的核酸序列； 如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如SEQ ID NO: 5中所示的编码V5标签的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的编 码C9标签的核酸序列。
编码Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所显示的编 码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编码3×Flag 标签的核酸序列。
标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA标签的 氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所 示的V5标签的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9标签的 氨基酸序列。
Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所显示的 1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的3×Flag标签 的氨基酸序列。
编码HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:16中显示。HBeAg 的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:18中显示。
核酸分子可以包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。编 码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中显 示。嗜肝DNA病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:17 中显示。
核酸分子可以包含编码一个或多个标签的核酸序列，其中所述序列 在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N端信号肽和接头的核酸序列的3' 下游(插入)。
编码一个或多个标签的核酸序列可以在编码乙型肝炎病毒前核心蛋 白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游(插入)。
核酸分子可以包含嗜肝DNA病毒基因组。优选地，嗜肝DNA病毒 基因组是乙型肝炎病毒(HBV)基因组。HBV基因组可以是HBV基因型 A、B、C、D、E、F、G或H的基因组。HBV基因组可以是HBV基因 型D的基因组。优选地，HBV基因组是HBV基因型D亚基因型ayw 的基因组。
编码一个或多个标签的核酸可以在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白、 优选地HBV核心蛋白的核酸的5’上游(插入)。编码HBV核心蛋白的示 例性核酸序列在SEQ ID NO:23中显示。核心蛋白可以是HBV核心蛋 白。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子可以插入如本文定义的 嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA 病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构中。如HBV基因组编码 的ε结构的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。包含编码一个或 多个标签的序列的核酸分子可以插入嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地 HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV 基因组编码的ε结构的下部茎中。
将包含编码一个或多个标签的序列的核酸分子插入与HBV基因组 的位置C1902和A1903相对应的核苷酸之间。
核酸分子可以在编码一个或多个标签的序列的5’包含能够与嗜肝 DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA 病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的 序列。优选地，能够与嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV(编码)的ε 结构的下部茎形成碱基对的序列主要能够与优选地对应于位置T1849至 A1854或任选地对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成 碱基对。能够与嗜肝DNA病毒基因组的ε结构的下部茎形成碱基对的 序列可以由(至多)9个核苷酸组成。
能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下 部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下 部茎形成碱基对的示例性序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。能 够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎形 成碱基对的示例性序列编码如SEQ ID NO:40中所示的多肽。
核酸分子可以在编码一个或多个标签的序列的3’包含编码接头的序 列。接头可以由一个或多个氨基酸残基组成。优选地，接头仅由一个氨 基酸残基如甘氨酸残基组成。编码接头的序列可以由序列GGC组成。 编码接头的序列可以编码甘氨酸残基。编码序列可以用于并适当地经选 择以保持核心蛋白起始密码子的可靠Kozak基序。
核酸分子可以包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列， 所述核酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列。核酸分子可以 包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述核酸序列包 含编码如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
一个或多个标签优选符合可读框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原(或 融合入嗜肝DNA病毒e前核心蛋白)、优选地乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)(或融合入乙型肝炎病毒前核心蛋白)中。
编码加标签的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。 加标签的HBeAg的优选氨基酸序列在SEQ ID NO:22中显示。
编码加标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性核酸序在SEQ ID NO:19中显示。加标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的示例性氨基酸序列 在SEQ ID NO:21中显示。
HBV基因组的示例性核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、 32、33或34中显示。
核酸可以转录成前基因组(pg)嗜肝DNA病毒RNA。嗜肝DNA病毒 RNA优选地是HBVRNA。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子可 以包含于载体如表达载体中。优选地，嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝 炎病毒e抗原(HBeAg)。
核酸通常允许加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病 毒e抗原(HBeAg)的翻译。核酸可以包含于包含如SEQ ID NO:39中所 显示的序列的载体中。
在某些实施方案中，核酸设计成阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗 原的翻译。例如，核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的 核酸5’上游的起始密码子ATG。例如，在编码加标签的嗜肝DNA病毒 e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG可以由核酸TG替换。可以通过 点突变修饰核酸以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。载体可 以包含如SEQ IDNO:35中所显示的序列。
包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)的核酸序列的核酸分子可以在诱导型启动子的控制下。
诱导型启动子可以是四环素诱导型启动子、强力霉素诱导型启动子、 抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型启动子、类固醇诱导 型启动子或除草剂诱导型启动子。
诱导型启动子可以优选地是CMV启动子。诱导型启动子可以是 tet-EF-1α启动子。
另外，可以将一个或多个终止密码子引入一种或多种嗜肝DNA病 毒包膜蛋白的、优选地一种或多种HBV包膜蛋白的编码区。
一种或多种HBV包膜蛋白可以如下一者或多者：L、M和/或S。 HBV包膜蛋白可以是S。
一种或多种HBV包膜蛋白的示例性编码区(或编码所述包膜蛋白的 示例性核酸序列)在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中显示。SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至222(TTGTTG)可以突变成TAGTAG 以阻止包膜蛋白的表达。
本发明涉及如上文定义和提供的核酸分子编码的蛋白质。
该蛋白质包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原、优选地加标签的乙 型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)可以包含如SEQ ID NO:18中所示的 氨基酸序列。优选地，加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签。
标签可以由6至22个氨基酸组成。标签可以是血凝素(HA)标签、 His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签或C9标签。Flag标签可以 是1×Flag标签或3×Flag标签。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原可以含有两个或更多个标签。优选 地，两个或更多个标签是不同的标签。所述两个或更多个标签的整个长 度是约14个至约31个氨基酸。两个或更多个标签可以是以下两者或更 多者：HA标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9 标签。Flag标签可以是1×Flag标签或3×Flag标签。
编码标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:1中所示的编码HA 标签的核酸序列、如SEQ ID NO:2中所示的编码His标签的核酸序列； 如SEQ ID NO:4中所示的编码c-myc标签的核酸序列、如SEQ ID NO: 5中所示的编码V5标签的核酸序列、和/或如SEQ ID NO:6中所示的编 码C9标签的核酸序列。
编码Flag标签的示例性核酸序列是如SEQ ID NO:3中所显示的编 码1×Flag标签的核酸序列或如SEQ ID NO:7中所显示的编码3×Flag 标签的核酸序列。
标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:8中所示的HA标签的 氨基酸序列、如SEQ ID NO:9中所示的His标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:11中所示的c-myc标签的氨基酸序列、如SEQ ID NO:12中所 示的V5标签的氨基酸序列和/或如SEQ ID NO:13中所示的C9标签的 氨基酸序列。
Flag标签的示例性氨基酸序列是如SEQ ID NO:10中所显示的 1×Flag标签的氨基酸序列或如SEQ ID NO:14中所显示的3×Flag标签 的氨基酸序列。
蛋白质可以包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。编码嗜肝DNA病毒前 核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。嗜肝DNA病毒 前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQID NO:17中显示。
该蛋白质可以包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在 嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信号肽和接头的氨基酸序列的C末端。该 蛋白质可以在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的氨基酸序列 的C末端包含一个或多个标签的氨基酸序列。
该蛋白质可以包含一个或多个标签的氨基酸序列，其中所述序列在 嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序列的N末端、优选地HBV核心蛋 白的氨基酸序列的N末端。编码HBV核心蛋白的示例性核酸在SEQ ID NO:23中显示。HBV核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ IDNO:24 中显示。
一个或多个标签的氨基酸序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、 优选地HBV pgRNA的ε结构或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV 基因组编码的ε结构编码的氨基酸序列中。如HBV基因组编码的ε结构 的示例性核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。一个或多个标签的氨基酸 序列可以插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构 的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构 的下部茎编码的氨基酸序列；优选插入由嗜肝DNA病毒pgRNA、优选 地HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎编码的氨基酸序列。
可以将一个或多个标签的氨基酸序列插入与HBV前核心蛋白(如 SEQ ID NO:17中所显示的一种)的位置G29和位置M30相对应的氨基 酸残基之间。
该蛋白质还可以在一个或多个标签的氨基酸序列的N末端包含(至 多)3个氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3个氨基酸的氨基酸序列由 能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地HBV pgRNA的ε结构的下部茎 或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV基因组编码的ε结构的下部茎 形成碱基对的核酸序列编码。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地 HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV 基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的核酸序列主要能够与优选地 对应于位置T1849至T1855或任选地对应于HBV基因组位置T1849至 T1855的核苷酸形成碱基对。能够与嗜肝DNA病毒pgRNA、优选地 HBV pgRNA的ε结构的下部茎或如嗜肝DNA病毒基因组、优选地HBV 基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的示例性核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成。(至多)3个氨基酸的示例性氨基酸序列在 SEQ ID NO:40中显示。
该蛋白质还可以在一个或多个标签的氨基酸序列的C末端包含接 头。接头可以由一个或多个氨基酸残基组成。优选地，接头仅由一个氨 基酸残基如甘氨酸残基组成。
加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:41中所显示的核酸序列编码的氨基酸序列。其中加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的氨基酸序列可以包含如SEQ ID NO:42中所显示的氨基酸 序列。
一个或多个标签优选符合可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原、 优选地乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
编码加标签的HBeAg的示例性核酸序列在SEQ ID NO:20中显示。 优选地，加标签的HBeAg具有如SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。
编码加标签的HBV前核心蛋白的示例性核酸序列在SEQ ID NO: 19中显示。加标签的HBV前核心蛋白的示例性氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
本发明涉及包含如本文定义和提供的核酸分子的宿主细胞和/或涉 及包含如本文定义和提供的蛋白质的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细 胞。真核细胞可以是肝细胞来源的。真核细胞可以是肝瘤细胞或可以衍 生自肝瘤细胞。在一个优选实施方案中，真核细胞是 HepG2(ATCC#HB-8065)。
本发明涉及用于产生如上文定义的蛋白质的方法，所述方法包括在 允许蛋白质表达的条件下培养如上文定义的宿主并且从培养物回收产生 的蛋白质。
本发明涉及用于本发明方法中的试剂盒。同样地，本发明涉及筛选 疑似能够抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子的试剂盒的 用途。本文相对于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的 方法所提供的解释在已作必要修正的情况下适用于此处。
试剂盒可以包含特异性识别如本文定义的嗜肝DNA病毒抗原e的 抗体和特异性识别如本文定义的一个或多个标签的一种或多种抗体。
本发明(在本发明背景下待制备)的试剂盒或本发明的方法和用途还 可以包括或配有使用手册。例如，所述使用手册可以指导技术人员(如何) 评估候选分子抑制cccDNA的能力和/或如何评估本发明加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的水平。特别地，所述使用手册可以包含使用或应用本 文提供的方法或用途的指导。
本发明(在本发明背景下待制备)的试剂盒还可以包含适于实施本发 明方法和用途/本发明方法和用途所要求的物质/化学品和/或设备。例如， 这类物质/化学品和/或设备是用于稳定和/或储存化合物的溶剂、稀释剂 和/或缓冲液，所述化合物是特异性确定如本文定义的所述加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原(蛋白质(表达))水平所需的。
本发明涉及如本文定义和提供的核酸分子、如本文定义和提供的蛋 白质和/或如本文定义和提供的宿主细胞用于筛选疑似能够抑制嗜肝 DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子的用途。本文相对于评估候选 分子抑制嗜肝DNA病毒cccDNA的能力的方法所提供的解释在已作必 要修正的情况下适用于此处。
如本文所用，术语“包含”和“包括”或其语法变体将视为规定所述的 特征、整数、步骤或组分，但是不排除增加一个或多个附加特征、整数、 步骤、组分或其群组。这个术语涵盖术语“由……组成”和“基本上由…… 组成”。因此，术语“包含”/“包括”/”具有”意指任何其他组分(或同样意指 任何其他特征、整数、步骤等)可以存在。
术语“由……组成”意指无其他组分(或同样意指无其他特征、整数、 步骤等)可以存在。
在本文中使用时，术语“基本上由……组成”或其语法变体将视为规 定所述的特征、整数、步骤或组分，但是不排除增加一个或多个附加特 征、整数、步骤、组分或其群组，但条件是上述附加特征、整数、步骤、 组分或其群组不实质地改变要求保护的组合物、装置或方法的基本特征 和新特征。
因此，术语“基本上由……组成”意指特定其他组分(或同样地特定其 他特征、整数、步骤等)可以存在，即这些不实质地影响组合物、装置或 方法的必需特征。换而言之，术语“基本上由……组成”(其可以在本文中 与术语“基本上包含”互换使用)允许除强制性组分(或同样地强制性特 征、整数、步骤等)之外的其他组分在组合物、装置或方法中存在，前提 是装置或方法的必需特征并未实质地受其他组分的存在影响。
术语“方法”指用于实现给出任务的方式、手段、技术和程序，包括 但不限于化学、生物学和生物物理技术人员已知或从已知方式、手段、 技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文所用，术语“分离”指已经从其体内位置取出的组合物。优选 地，本发明的分离的组合物或化合物基本上不含在其体内位置存在的其 他物质(例如，其他蛋白质或其他化合物)(即纯化或半纯化的组合物或化 合物)。
如本文所用术语“约”指±10％。
本发明参考以下非限制性图和实施例进一步描述。
除非另外说明，否则既定的重组基因技术方法如通过引用方式完整 并入本文的例如Sambrook,Russell"Molecular Cloning,A Laboratory Manual",Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(2001)中所述那样使 用。
以下实施例说明本发明：
这些图显示：
图1.HA标签序列插入HBV前核心蛋白ORF中。
描述了HBV前核心蛋白(基因型D，亚型ayw，nt 1816-2454)的ORF， 5’部分(nt1816-1941)以核苷酸序列显示。在nt 1941和前核心蛋白ORF 的终止密码子之间的序列省略。加框表示前核心蛋白ORF的起始密码 子、同向重复序列1(DR1)和核心蛋白ORF的符合可读框的起始密码子。 在质粒pTREHBV-HAe中突变前核心蛋白ORF的5'末端起始密码子。 可靠的pgRNA转录启动位点(nt 1820)以箭头标记。HBV核苷酸位置依 据Galibert命名法确定(5)。以预测的内部结构(下部茎、凸起、上部茎、 环)说明充当HBV pgRNA中后续DNA复制的必需顺式元件的关键茎- 环结构(ε,ε)。为了将符合可读框地融合的HA标签序列在不改变ε的碱 基配对情况下置入前核心蛋白ORF，将含有HA标签的DNA序列 (gtggacatcTACCCATAC GACGTTCCAGATTACGCTggc；SEQ ID NO: 41)符合可读框地插入与核心蛋白ORF的起始密码子毗邻的上游位置 (参见插入物框)。这个序列修饰导致HA标签加接头序列符合可读框地 融合入前核心蛋白，并且核心蛋白的完整ORF在ε的下游维持。
图2.加HA标签的HBeAg的表达和分泌
(A)野生型和加HA标签的前核心蛋白的胞内表达。将HepG2细 胞用质粒pcHBe或pcHA-HBe转染，5天后，通过使用抗HBc(顶部小 图)和抗HA(中部小图)抗体，令全细胞裂解物接受蛋白质印迹分析。β- 肌动蛋白充当内参对照。标记野生型前核心蛋白和加HA标签的前核心 蛋白(HA-前核心蛋白)。
(B)检测培养液中加HA标签的HBeAg。将HepG2细胞模拟转染 或用质粒pcHBe或pcHA-HBe转染，在指示的时间点收集上清液样品 并且在转染后第5天收获细胞。使用抗HA抗体，对上清液样品进行免 疫沉淀(IP)并且通过蛋白质印迹法采用针对HA的抗体检测加HA标签 的HBeAg(HA-HBeAg)。显示抗体的轻链(LC)。通过HA蛋白质印迹法 揭示HA-前核心蛋白的胞内表达。
图3.HA-HBeAg在HepHA-HBe细胞系中的分泌。
将建立的加HA标签的HBeAg稳定表达细胞系，尤其HepHA-HBe4 和HepHA-HBe47细胞，在汇合条件下接种在胶原蛋白涂覆的12孔板中。 接种细胞的当日设为第0天，并且每隔1天补充培养基。在指示的时间 点收集上清液样品并且通过如“材料和方法”中所述的AlphaLISA分析 法检测HA-HBeAg。在直方图中AlphaLISA信号(相对光单位)(Y-轴)对 应于时间点(X-轴)作图
图4.HA-重组HBV基因组在瞬时染的细胞中的复制。
将HepG2细胞用pTREHBVDES或pTREHBV-HAe和质粒 pTet-off共转染。转染后5天收获细胞，并且分别通过RNA印迹法、蛋 白质印迹法和DNA印迹杂交法分析基于质粒的HBVRNA、核心蛋白、 衣壳化pgRNA的产生和病毒DNA复制。pgRNA：前基因组RNA；sRNA： 表面RNA；RC：松弛型环状DNA；SS：单链DNA。
图5.HepBHAe稳定细胞系中HBV cccDNA依赖性加HA标签的 HBeAg表达的合理设计的示意图。
在pTREHBV-HAe和pTet-off稳定转染的细胞中，转基因含有 tet-CMV启动子控制下的1.1倍超长HBV基因组。前核心蛋白的起始密 码子(ATG)在HBV DNA的5'末端突变，第二起始密码子在3’多余处未 改变。将含有HA标签的片段(以灰色显示)如材料和方法中所述插入前 核心蛋白ORF。转基因还在表面小蛋白(S)ORF中含有两个串联终止密 码子以阻止病毒包膜蛋白表达。(B)一旦移除Tet，则pgRNA转录并且 产生核心蛋白和聚合酶，导致pgRNA包装和(C)pgRNA逆转录成 rcDNA。DNA修复机制将(D)rcDNA转化成(E)环状cccDNA模板，其中 HA-前核心蛋白ORF得到恢复，产生HA-前核心蛋白mRNA、及(F)用 于从头病毒复制的pgRNA。(G)HA-前核心蛋白从HA-前核心蛋白 mRNA翻译并加工成可以通过ELISA检测到的分泌型HA-HBeAg。 preC、C、pol、L、M、S和X分别代表前核心蛋白、核心蛋白、聚合 酶、表面大抗原、中等抗原和小抗原和X蛋白的ORF起始密码子。DR 代表同向重复序列。CTD代表C末端结构域。
图6.HepBHAe13细胞中病毒DNA复制、cccDNA积累和加HA标 签的HBeAg生产的动力学。
将HepBHAe13细胞在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞单层 变得汇合时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。在指示的 时间点收获细胞样品和上清液样品。提取并通过DNA印迹杂交法分析 胞内核心蛋白DNA(上半小图)和cccDNA(底部小图)。DP-rc代表去蛋白 化(无蛋白质)的RC DNA。通过如上文所述的HA IP-蛋白质印迹法检测 分泌型加HA标签的HBeAg。
图7.支持HA-重组HBV DNA复制的额外诱导型HepBHAe细胞系。
将HepDES19细胞和新建立的克隆编号不同的HepBHAe细胞按相 同的密度在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞达到汇合时，将一组 细胞在四环素存在下培养，并且将另一组细胞在四环素不存在下培养。6 天后，收获细胞并通过DNA印迹分析病毒核心蛋白DNA。
图8.HepBHAe细胞系中cccDNA的真实性。
通过Hirt提取法提取HepDES19细胞和所示的HepBHAe细胞中产 生的cccDNA并对其进行凝胶电泳和DNA印迹杂交(泳道1、5、8、11、 14)。为了进一步验证HBV cccDNA的真实性，将Hirt DNA样品在装载 凝胶前加热到85℃持续5分钟，一种使DP-rcDNA变性成SS DNA，同时cccDNA保持非变性并且其电泳迁移率保持不变的条件(泳道2、6、 9、12、15)。将热变性的DNA样品进一步用EcoRI消化，在所述条件 下cccDNA线性化成基因组长度的双链DNA(泳道3、7、10、13、16)。
图9.AlphaLISA检测HepBHAe细胞系中的HA-HBeAg。
将HepBHAe细胞在四环素存在下接种于平板中。当细胞变得汇合 时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。在指示的时间点收 获上清液样品并对其进行AlphaLISA以检测HA-HBeAg。AlphaLISA 读数(相对光单位，RLU)表述为每秒的计数(CPS)。
图10.HBV复制抑制剂(3TC)阻断HepBHAe13细胞中的HA-HBeAg 表达。
将HepBHAe13细胞在6孔板中在四环素存在下培养直至汇合。一 组细胞在四环素存在下持续维持。第二组细胞随后转换成无四环素的培 养基。第三组细胞随后在含有10μM3TC的无四环素培养基中培养。每 隔1天补充培养基，并且对指示的时间点上收获的上清液样品进行化学 发光免疫测定(CLIA)以检测加HA标签的HBeAg。
图11.HBV cccDNA形成抑制剂降低HepBHAe13细胞中的 HA-HBeAg水平。将细胞接种于96孔板中并且当细胞变得汇合时，从 培养基移除四环素以诱导病毒复制。同时，将细胞不处理或用化合物在 所示的浓度处理，在处理组和未处理组中将DMSO浓度归一化为0.5％。 每4天重复处理。在处理后第12天，对培养液进行HA-HBeAg CLIA 并且将读数作为百分数(均值±SD)相对于对照作图。
图12.额外的HepBHAe细胞克隆中病毒RNA转录、DNA复制和 cccDNA积累的动力学。
将所示的HepBHAe细胞在四环素存在下接种于6孔板中。当细胞 单层变得汇合时，从培养基移除四环素并且每隔1天更换培养基。细胞 在指示的时间点收获。提取总病毒RNA(上半小图)、胞质核心蛋白 DNA(中部小图)并分别通过RNA印迹和DNA印迹杂交分析。将提取的 cccDNA在85℃热变性5分钟并且随后用EcoR I线性化，随后进行DNA 印迹分析(底部小图)。
图13.HA-HBeAg在额外的HepBHAe细胞克隆中的cccDNA依赖 性表达。
选出的HepBHAe细胞在96孔板中在四环素存在下培养直至汇合。 一组细胞在四环素存在下持续维持。第二组细胞随后转换成无四环素的 培养基。第三组细胞随后在含有10μM 3TC的无四环素培养基中培养。 每隔1天补充培养基，并且在处理后第9天收获的上清液样品进行化学 发光免疫测定法(CLIA)以检测加HA标签的HBeAg。
实施例说明本发明。
实施例1：诱导型表达乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA依赖性加表位标签的e抗原 的培养细胞系及其筛选抗病毒物质的用途
材料和方法
质粒
为了构建含有敲除其起始密码子的融合人流感血凝素(HA)的前核 心蛋白可读框的四环素诱导型HBV复制载体，将通过Genscript Inc化 学合成下述DNA片段，所述DNA片段含有CMV-IE启动子TATA框 基序和下游HBV片段(基因型D，亚型ayw，nt 1805-2335)，同时缺失 nt 1816(A)及在前核心蛋白ORF中插入HA标签序列。在这个DNA片 段内部，SacI限制性酶位点在5'末端存在并且真实BspEI限制性位点在 3'末端存在。通过将合成的DNA片段插入质粒pTREHBVDES中的 SacI/BspEI限制性位点，构建载体pTREHBV-HAe。pTREHBV-HAe 的完整序列在SEQ ID NO:35显示。
为了产生融合HA的前核心蛋白表达载体，通过使用引物 5’-ATTGGATCCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGC-3’和 5’-ACAGTAGTTTCCGGAAGTGTTGATAGGATAGGGG-3’从 pTREHBV-HAe扩增含有HBV nt 1816-2335连同HA序列插入物的 PCR片段。将该PCR片段用BamHI和BspEI限制性酶处理并插入前 核心蛋白表达载体(pcHBe)中的相同限制性位点以产生质粒pcHA-HBe。 pcHA-HBe的完整序列在SEQ ID NO:39显示。
细胞培养物
支持HBV复制的肝母细胞瘤细胞系HepG2细胞(
Figure BDA0001184466800000501
HB-8065TM)从ATCC获得。先前已经描述了诱导型表达HBV DNA和 cccDNA的HepG2衍生的HepDES19细胞系(7)。将细胞系在补充有10％ 胎牛血清、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM)-F12培养基(Cellgro)中维持。
为了建立HepBHAe细胞系，将HepG2细胞用表达Tet应答性转录 激活物的质粒pTet-off(Clontech)和其中修饰的HBV pgRNA的转录受 CMV-IE启动子连同四环素应答元件控制的质粒pTREHBV-HAe转染。 在1μg/ml四环素存在下用500μg/ml G418选择转染的HepG2细胞。挑 取G418耐药性集落并扩充成细胞系。通过在无四环素的培养基中培养 细胞诱导HBV复制，并且通过DNA印迹杂交测定病毒DNA复制中间 体的水平。选择HBV高水平复制的细胞系并命名为具有不同克隆编号 的HepBHAe。
通过用pcHA-HBe质粒转染HepG2细胞产生加HA标签的HBeAg 稳定表达细胞系HepHA-HBe，用500μg/ml G418选择集落并且通过抗 HA蛋白质印迹分析法鉴定阳性集落。
按照与HepG2相同的方式培养HepBHAe稳定细胞系和 HepHA-HBe稳定细胞系，除了添加500μg/ml的G418。对于HepBHAe 细胞，在维持期间按1μg/ml常规添加四环素以抑制HBVpgRNA转录。
细胞转染
将细胞(约1.0×106个)接种在胶原蛋白涂覆的35mm直径培养皿的 无抗生素DMEM/F12培养基中。在温育过夜后，通过遵循制造商的说 明，每个孔用总计4μg质粒以脂质转染胺2000(Life Technologies)转染。 在指示的时间点收获转染的细胞样品或上清液样品。
病毒核酸分析
通过遵循制造商的操作方案，用TRIzol试剂(Life Technologies)提 取细胞总RNA。将衣壳化的病毒pgRNA如下纯化：在250μl含有10mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、1％NP-40和50mM NaCl裂解缓冲液 中在37℃充分裂解来自一个12孔平板的细胞10分钟，并通过离心移 除胞核。将样品与6U微球菌核酸酶和15μl 100mM CaCl2在37℃温 育15分钟以消化游离的核酸。根据制造商的操作方案，通过添加750μl TRIzol LS试剂(Invitrogen)提取衣壳化的病毒pgRNA。将RNA样品通 过1.5％含有2.2M甲醛的琼脂糖凝胶电泳并转移到20×SSC缓冲液(1× SSC是0.15M NaCl加0.015M柠檬酸钠)中的Hybond-XL膜(GE Healthcare)上。
将胞质病毒核心蛋白DNA如下提取：在0.5ml含有10mM Tris-HCl，pH 8.0、10mMEDTA、1％NP40和2％蔗糖的裂解缓冲液 中在37℃裂解来自一个35mm直径培养皿的细胞10分钟。通过离心 移除细胞残片和胞核，并且将上清液在37℃与3μl 1M Mg(OAc)2和5 μl10mg/mlDNA酶I(Calbiochem)温育30分钟。上清液随后与15μl 0.5 M EDTA和130μl含有1.5M NaCl的35％聚乙二醇(PEG)8000混合以 沉淀核衣壳。在冰上温育1小时后，将病毒核衣壳通过在4℃按10,000 转/分钟离心5分钟沉淀，随后在37℃在400μl含有0.5mg/ml链霉蛋 白酶(Calbiochem)、0.5％十二烷基硫酸钠(SDS)、100mM NaCl、25mM Tris-HCl(pH 7.4)和10mM EDTA的消化缓冲液中消化1小时。消化混 合物苯酚提取，并且DNA用乙醇沉淀并溶解于TE(10mM Tris-HCl、 pH 8.0、1mM EDTA)缓冲液中。来自每块平板的三分之一核心蛋白DNA 样品由电泳法分离进入1.2％琼脂糖凝胶。凝胶随后在含有0.2N HCl的 缓冲液中进行脱嘌呤，在含有0.5M NaOH和1.5M NaCl的溶液中变性， 并在含有1M Tris-HCl(pH 7.4)和1.5M NaCl的缓冲液内中和。DNA 随后印迹到20×SSC缓冲液中的Hybond-XL膜上。
通过使用改良的Hirt提取程序实施无蛋白质的病毒DNA(cccDNA 和无蛋白质的rcDNA)的提取(4,8)。简而言之，在3ml 10mM Tris-HCl (pH 7.5)、10mM EDTA和0.7％SDS中裂解来自一个35mm直径培养 皿的细胞。在室温温育30分钟后，将裂解物转移至15ml管中，并且这 个步骤后是添加0.8ml 5M NaCl及在4℃温育过夜。裂解物随后通过 在4℃按10,000转/分钟离心30分钟澄清并用苯酚提取2次及用酚:氯仿: 异戊醇(25:24:1)提取一次。将DNA在室温在乙醇中沉淀过夜并溶解于 TE缓冲液中。随后将三分之一的无蛋白质的DNA样品在1.2％琼脂糖 凝胶中分离并转移到Hybond-XL膜上。
为了检测HBV RNA和DNA，用[α-32P]UTP(800Ci/mmol；Perkin Elmer)标记的正链或负链特异性全长HBV Riboprobe探测膜。杂交在5 ml EKONO杂交缓冲液(Genotech)中实施，在65℃预杂交1小时并在 65℃杂交过夜，随后在65℃于0.1×SSC和0.1％SDS中洗涤1小时。将膜对磷光成像仪屏曝光，并通过Typhoon FLA-7000系统(GE Healthcare)检测杂交信号。
蛋白质印迹分析
将35mm培养皿中的细胞用PBS缓冲液洗涤1次并在500μl 1× Laemmli缓冲液中裂解。将总计50μl细胞裂解物在SDS-12％聚丙烯酰 胺凝胶上分离并转移到聚偏二氟乙烯膜膜(Millipore)上。将膜用蛋白质 印迹Breeze封闭缓冲液(Life Technologies)封闭并用针对 HBcAg(aa170-183)、HA标签(Sigma-Aldrich，克隆M2)、β-肌动蛋白 (Sigma-Aldrich)的抗体探测。通过IRDye第二抗体揭示结合的抗体。将 免疫印迹信号用Li-COR Odyssey系统可视化和定量。
免疫沉淀
在0.5ml含有10mM Tris-HCl，pH 8.0、10mM EDTA、1％NP40、 2％蔗糖和1×蛋白酶抑制剂混合物(G-biosciences)的裂解缓冲液中裂解 来自一个35mm直径培养皿的细胞。在离心以除去细胞残片后，将澄清 的细胞裂解物与50μl Ezview Red抗HA(Sigma-Aldrich)在4℃温育过 夜伴以温和转动。来自一个35mm直径培养皿的0.5ml培养基样品(总 计1ml)直接进行免疫沉淀。将珠在4℃用TBS缓冲液(0.15M NaCl、 0.05M Tris-HCl[pH 7.4])洗涤3次。沉淀的珠用Laemmli缓冲液进行蛋 白质样品制备。使用针对HA标签的抗体(Sigma-Aldrich)通过蛋白质印 迹法检测免疫沉淀的加HA标签的蛋白质。
检测加HA标签的HBeAg的ELISA
对于化学发光酶免疫测定法(CLIA)检测加HA标签的HBeAg，将链 霉亲和素涂布的高灵敏平板(黑色，目录号：15525，Thermo Scientific) 用PBST(PBS外加0.05％Tween20)洗涤3次，并且随后在室温与50μl 抗HA-生物素(目录号：A00203，Genscript；PBS中5μg/ml)温育30分 钟，随后用200μlPBST洗涤3次。在移除洗涤缓冲液后，将50μl培养 上清液样品添加于ELISA孔中并在室温温育30分钟，随后用200 μlPBST洗涤3次。随后，将50μl辣根过氧化物酶(HRP缀合的抗HBe 抗体(来自HBeAg CLIA试剂盒，目录号：CL0312-2，AutobioDiagnostics) 添加于孔中并在室温温育30分钟。用200μlPBST洗涤5次后，添加来 自CLIA试剂盒的25μl每种底物A和B并且将平板温和地振摇10秒。 在光度计上读取平板。
对于AlphaLISA检测加HA标签的HBeAg，将抗HA-生物素(目录 号：A00203，Genscript)在1×分析缓冲液(25mM HEPES、0.1M NaCl、 0.1％BSA，pH 7.4)中稀释至2μg/ml并分配5μl至Proxiplate-384HS(目 录号：6008279，Perkin Elmer)的每个孔中。随后将5μl培养液样品添 加于各孔中并温和地混合，随后在室温温育30分钟。随后、添加5μl 0.2 μg/ml抗HBe(克隆29，批号20110305，Autobio Diagnostics)并温和地 混合，随后在室温温育30分钟。随后，将分析溶液与5μl稀释的抗小 鼠IgG AlphaLISA接纳体珠(目录号：AL105C，Perkin Elmer)(125μg/ml) 混合并在室温温育30分钟，随后在室温与5μlAlphaScreen链霉亲和素 供体珠(目录号：6760002S，Perkin Elmer)(125μg/ml)温育1小时。在温 育后，在Envision2104多标记读数仪(Perkin Elmer)上读取平板。
结果
本文提供两种类型的分别从转基因和HBV cccDNA表达加HA标签 的HBeAg(HA-HBeAg)的新细胞系及通过化学发光免疫测定法和 AlphaLISA测定法检测重组HBeAg的方法。细胞系和测定法适于高通 量筛选减少HBV cccDNA水平和/或沉默cccDNA转录的化合物。
紧凑的HBV DNA基因组小尺寸和重叠基因组构造在转染的细胞中 不影响病毒DNA复制和后续cccDNA形成的情况下限制了报道基因的 插入。
前核心蛋白/HBeAg可以在HepDE19细胞中工程化成cccDNA依赖 性(3)。本领域已知，HBV基因组具有显示重叠ORF和多个顺式元件的 高度紧凑型基因构造。因此，认为基因插入/缺失或序列替换将很可能影 响病毒DNA复制。先前的工作已经通过GFP替换HBV序列，如在大 多数情况下的包膜蛋白编码区，以产生重组HBV基因组，但是需要病 毒蛋白的反式互补以支持病毒复制和病毒粒装配(Protzer等人,PNAS (1999),96:10818-23)。另外，那些报告的重组HBV基因组如果用来感 染容许性细胞则仅可以产生第一轮cccDNA合成，cccDNA的胞内扩增 被阻断，原因是缺陷型病毒DNA复制。
即便有以上的现有技术知识，在本文中尝试以下情况并且其是合理 的：在前核心蛋白可读框(ORF)中符合可读框地融合外源短表位标签可 以由HBV基因组耐受并且从cccDNA模板表达，因此一对标签特异性 抗体和HBeAg抗体将显著地改善ELISA检测的特异性。
为了构建具有人流感血凝素(HA)融合的前核心蛋白可读框的四环 素诱导型HBV复制载体，将含有HA标签的DNA序列 (gtggacatcTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTggc；SEDID NO.：41) 插入与HBV表达载体pTREHBVDES中核心蛋白ORF的起始密码子毗邻 的符合可读框的上游位置，其中HBV pgRNA表达以Tet-off方式受四环 素(tet)调节的CMV-IE启动子控制。HA标签(大写)的侧翼序列(小写)设计 成维持HBV基因组茎环结构(ε)的碱基配对和核心蛋白ORF起始密码子 的Kozak基序(图1)。获得的重组质粒命名为pTREHBV-HAe(SEQ IDNO: 35)。除了HA标签插入外，质粒pTREHBV-HAe还在前核心蛋白ORF的 5'末端起始密码子中含有点缺失(ATG至TG)，藉此阻止前核心蛋白从 质粒模板中的HBV基因组表达。此外，将两个串联终止密码子引入小(S) 包膜蛋白氨基端的编码区中(217TTGTTG222 to217TAGTAG222；突 变加下划线)以阻断HBV感染性粒子的产生。
为了检验加表位标签的HBV前核心蛋白表达和HBeAg分泌的可行 性，如上文所述，将含有HA标签的DNA序列插入前核心蛋白表达质 粒pcHBe中的相同病毒DNA位置，并且构建体命名为pcHA-HBe(SEQ ID NO:39)。pcHA-HBe在HepG2细胞中的转染导致加HA标签的前核心蛋白的胞内表达和加HA标签的HBeAg的胞外积累(图2)，因此证实 HA标签插入前核心蛋白不影响前核心蛋白表达、翻译后加工和HBeAg 分泌。也已经建立用于检测加HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)的化学发 光ELISA和AlphaLISA，如材料和方法章节中所述。
根据上文，通过将pcHA-HBe稳定转染入HepG2细胞，建立以组 成型方式表达加HA标签的HBeAg的细胞系。通过AlphaLISA测定法 选出高水平表达加HA标签的HBeAg的两个克隆，并且将它们分别命 名为HepHA-HBe4和HepHA-HBe47(图3)。
在瞬时转染测定法中，重组HBV质粒pTREHBV-HAe能够复制 HBV DNA到与pTREHBVDES所实现水平可比较的水平(图4)，提示 HA标签插入由HBV基因组复制耐受。随后，将pTREHBV-HAe随 pTET-off(Clontech)一起稳定共转染入HepG2细胞以产生四环素诱导型 HBV细胞系。理论上，在这种细胞系中，一旦诱导，前核心蛋白和其衍 生物HBeAg将不从转基因产生，原因在于前核心蛋白ORF起始密码子 沉默。转录的pgRNA将表达病毒核心蛋白和聚合酶并启动逆转录以产 生rcDNA，从而通过胞内扩增途径导致cccDNA形成。前核心蛋白不完 整ORF在pgRNA的3’多余处的起始密码子将拷贝入病毒DNA序列， 并且加HA标签的前核心蛋白的完整ORF将在rcDNA转变成cccDNA 期间重构。因此，HA-前核心蛋白mRNA仅可以从cccDNA转录，产生 核内cccDNA的分泌型加HA标签的HBeAg替代标记(图5)。
我们已经获得5个以四环素依赖性方式支持高水平HBV DNA复制 的细胞系(HepBHAe1、HepBHAe13、HepBHAe34、HepBHAe45、 HepBHAe82)(图6和图7)。
在代表性株系HepBHAe13细胞中，当撤除四环素时观察到病毒产 物(包括复制型DNA中间体和cccDNA)合成和积累的时间依赖性动力 学。在HepBHAe13细胞的培养液中，移除四环素后第6天还通过蛋白 质印迹法检测到加HA标签的HBeAg，并且此后抗原水平逐渐增加。加 HA标签的HBeAg(HA-HBeAg)的水平与病毒核心蛋白DNA和cccDNA 的胞内水平成正比(图6)。已经通过热变性和进一步限制性酶消化证实从 HepBHAe细胞系产生的cccDNA的真实性(图8)。因此，已经建立了支 持前核心蛋白中插入含有HA标签的重组HBV的DNA复制和cccDNA 形成的诱导型细胞系。
在16天时间过程研究中，来自培养的HepBHAe细胞的上清液样品 上的AlphaLISA测定法展示加HA标签的HBeAg的水平增加(图9)。选 择HepHBAe13细胞以进一步验证。细胞在三种条件下培养：1)在四环 素存在下以抑制转基因表达；2)在四环素不存在下以诱导病毒DNA复 制；3)在四环素不存在下但是给予3TC处理以阻断病毒DNA复制及后 续cccDNA形成。化学发光免疫测定法(CLIA)显示，作为cccDNA建立 和基因表达的结果，培养基中加HA标签的HBeAg信号在撤除四环素 后的第6天出现并且此后逐渐增加。如预测，在四环素存在下或在3TC 处理(tet-)下的任何时间点在培养液中均未检出HA-HBeAg(图10)。另外， 两种先前鉴定的cccDNA形成抑制剂，具体为CCC-0975和 CCC-0346(3)、显示剂量依赖地抑制HA-HBeAg从HepBHAe13细胞产 生(图11)。因此，HepBHAe13细胞中加HA标签的HBeAg的产生是cccDNA依赖的。
此外，对其他HepBHAe细胞系(包括HepBHAe1、HepBHAe45和 HepBHAe82)的时间过程研究展示了撤除四环素时HBVmRNA、胞质核 心蛋白DNA和核cccDNA的时间依赖性积累(图12)。如图13中所示， 在这些三个额外的HepBHAe细胞系中验证了cccDNA依赖的加HA标 签的HBeAg产生。
总之，本文中已经建立了新的诱导性型细胞系，所述细胞系以HBV cccDNA依赖方式表达加HA标签的HBeAg，后者可以在用本文所述的 HA-HBeAg检测方法筛选抗病毒化合物中充当HBV cccDNA的替代标 记。
本发明参考以下核苷酸序列和氨基酸序列。
本文中提供的序列在NCBI数据库中可获得并且可以在 ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db＝gene从万维网取回；这些序列还涉及 注释的和修饰的序列。本发明还提供其中使用本文所提供之简洁序列的 同源序列和变体的技术和方法。优选地，这类“变体”是遗传变体。
SEQ ID NO：1：
编码血凝素(HA)标签的核苷酸序列
TACCCATACGACGTTCCAGATTACGCT
SEQ ID NO：2：
编码His标签的核苷酸序列
CATCATCATCATCATCAC
SEQ ID NO：3：
编码Flag标签的核苷酸序列
GACTACAAGCACGACGACGACAAG
SEQ ID NO：4：
编码c-myc标签的核苷酸序列
ATG GCA TCA ATG CAG AAG CTG ATC TCA GAG GAG GAC CTG
SEQ ID NO：5：
编码V5标签的核苷酸序列
GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG
SEQ ID NO：6：
编码C9标签的核苷酸序列
ACTGAAACATCTCAAGTAGCTCCAGCT
SEQ ID NO：7∶
编码3×Flag标签的核苷酸序列
GACTACAAAGACCACGACGGTGACTACAAAGACCACGACATCGACTACAAGGAC GACGACGACAAG
SEQ ID NO：8：
HA标签的氨基酸序列
YPYDVPDYA
SEQ ID NO：9：
His标签的氨基酸序列
HHHHHH
SEQ ID NO：10：
Flag标签的氨基酸序列
DYKDDDDK
SEQ ID NO：11：
c-myc标签的氨基酸序列
EQKLISEEDL
SEQ ID NO：12：
V5标签的氨基酸序列
GKPIPNPLLGLDST
SEQ ID NO：13：
C9标签的氨基酸序列
TETSQVAPA
SEQ ID NO：14：
3×Flag标签的氨基酸序列
DYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
SEQ ID NO：15：
编码乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列
前核心蛋白ORF序列：
ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCC TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAAT TTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTAC GAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAG CATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACT AATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACC TAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGG TTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCT TTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCT ATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGA AGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTC AATCTCGGGAACCTCAATGTTAG
SEQ ID NO：16：
编码乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列
HBeAg DNA序列：
TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAAT TTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTAC GAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAG CATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACT AATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACC TAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGG TTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCT TTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCT ATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTT
SEQ ID NO：17：
乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列
前核心蛋白的氨基酸序列：
MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDL LDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVS YVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETT VVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC
SEQ ID NO：18：
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列
HBeAg氨基酸序列(从前核心蛋白除去N端信号肽(19aa)和C末端 精氨酸丰富结构域(34aa))：
SKLCLGWLWGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHC SPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFH ISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
SEQ ID NO：19：
编码加HA标签乙型肝炎病毒前核心蛋白的核苷酸序列。
加HA标签的前核心蛋白DNA序列：
ATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCC TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACCACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAG TTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCG CCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCAT ACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTG GGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCA ACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCA CTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGC ACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAAC TACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGC AGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAAT GTTAG
SEQ ID NO：20：
编码加HA标签的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的核苷酸序列
加HA标签的HBeAg DNA序列：
TCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCGTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGCATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAG TTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCG CCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCAT ACTGCACTCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTG GGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCA ACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCA CTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGC ACTCCTCCAGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAAC TACTGTTGTT
SEQ ID NO：21：
加HA标签的乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列。HA标签加 下划线。
加HA标签的前核心蛋白的氨基酸序列：
MQLFHLCLIISCSCPTVQASKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDlDPYKEFGATVELL SFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGV NLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAY RPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQSREPQC
SEQ ID NO：22：
加HA标签的乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)的氨基酸序列。HA标签 加下划线。
加HA标签的HBeAg氨基酸序列：
SKLCLGWLWGVDIYPYDVPDYAGMDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTAS ALYREALESPEHCSPHHTALRQAILCWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTN MGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIEYLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVV
SEQ ID NO：23：
编码HBV核心蛋白的核苷酸序列 ATGGACATCGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTT GCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGATCTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTA TCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGC AAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAAT TTGGAAGATCCAGCATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGG CCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTT ATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGA CGACGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTC AATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCTCAATGTTAG
SEQ ID NO：24：
HBV核心蛋白的氨基酸序列
MDIDPYKEFGATVELLSFLPSDFFPSVRDLLDTASALYREALESPEHCSPHHTALRQAIL CWGELMTLATWVGVNLEDPASRDLVVSYVNTNMGLKFRQLLWFHISCLTFGRETVIE YLVSFGVWIRTPPAYRPPNAPILSTLPETTVVRRRGRSPRRRTPSPRRRRSQSPRRRRSQ SREPQC
SEQ ID NO：25：
如HBV基因组编码的ε结构的核苷酸序列
TGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACA
SEQ ID NO：26：
能够与嗜肝DNA病毒基因组的ε结构的下部茎形成碱基对的核苷 酸序列
GTGGACATC
SEQ ID NO：27：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型D，亚型ayw。Genbank 登录号U95551(C1902和A1903为粗体。前核心蛋白的ORF加下划线) AATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATTT CCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTC CCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACATC ACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC AAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGC ACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCAT CCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTC AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT TCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTAAC AAAACAAAGAGATGGGGTTACTCTCTGAATTTTATGGGTTATGTCATTGGAAGTTA TGGGTCCTTGCCACAAGAACACATCATACAAAAAATCAAAGAATGTTTTAGAAAA CTTCCTATTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTTTGGGTTTTGCTGCCCCATTTACACAATGTGGTTATCCTGCGTTAATGCCCTTGTATGC ATGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTG TAAACAATACCTGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAG TGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGTCATGGGCCATCAGCGCGTGCGTGGAACCTTTTCGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTG TTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCAAACATTATCGGGACTGATAACTCTGTTGTCC TCTCCCGCAAATATACATCGTATCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATC CTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGAC CACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGG ACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCC ACCGAATGTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTT GGGGGAGGAGATTAGATTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTG GTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCC TAATCATCTCTTGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATCGA CCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCAGTACGAGAT CTTCTAGATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGGAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCAC TCAGGCAAGCAATTCTTTGCTGGGGGGAACTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTTAATTTGGAAGATCCAGC ATCTAGAGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAACACTAATATGGGCCTAAAGTTCAGGCAACTCTTGTGGTTTCACATT TCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTTATAGAGTATTTGGTGTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAG CTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGCAGGTCCCC TAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAACCT CAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAAG GTGGGGAACTTTACTGGTCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTTAATCCTCATTGG AAAACACCATCTTTTCCTAATATACATTTACACCAAGACATTATCAAAAAATGTGA ACAGTTTGTAGGCCCACTTACAGTTAATGAGAAAAGAAGATTGCAATTGATTATGC CTGCTAGGTTTTATCCAAAGGTTACCAAATATTTACCATTGGATAAGGGTATTAAA CCTTATTATCCAGAACATCTAGTTAATCATTACTTCCAAACTAGACACTATTTACAC ACTCTATGGAAGGCGGGTATATTATATAAGAGAGAAACAACACATAGCGCCTCAT TTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCAGAATCTTTC CACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCCTTCAGAG CAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAACAAGGACACCTGGCCAGA CGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTTTCACCCCACCGCACGGA GGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACTACAAACTTTGCCAGCAA ATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGGCAGCCTACCCCGCTGTCT CCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：28：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型A(Genbank登录号 AP007263)
AATTCCACTGCCTTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTCAGGGGTCTGTATTT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAACCCTGCTCCGAATATTGCCTCTC ACATCTCGTCAATCTCCGCGAGGACTGGGGACCCTGTGGCGAACATGGAGAACAT CACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGA CAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTT CTAGGGGGATCACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCA CTCACCAACCTCCTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCG TTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTATTGGTTCTTCTG GATTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCAACAACAACCAG TACGGGACCATGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTTTCCCT CATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCG TCCTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCT CAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCT TTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCGTGAGTC CCTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTCTGGGTATACATTTAAACCCTAA CAAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCCTAAACTTCATGGGTTACATAATTGGAAGTT GGGGAACTTTGCCACAGGATCATATTGTACAAAAGATCAAACACTGTTTTAGAAA ACTTCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTT TGGGCTTTGCTGCTCCATTTACACAATGTGGATATCCTGCCTTAATGCCTTTGTATG CATGTATACAAGCTAAACAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTA AGTAAACAGTACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCA AGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCA TGCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCT TGTTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAGCTCATCGGAACTGACAATTCTGTCGT CCTCTCGCGGAAATATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGA TCCTTCGCGGAACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGAC CCCTCTCGGGGCCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCG ACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCG GTCCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGACCACCGTGAACGCC CATCAGATCCTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCCCAGCAATGTC AACGACCGACCTTGAGGCCTACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAGGACTGGGAGGAG CTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAAT TGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTAC ATGTCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACA TTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTG ACTTCTTTCCTTCCGTCAGAGATCTCCTAGACACCGCCTCAGCTCTGTATCGAGAA GCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTGCTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCAT TCTCTGCTGGGGGGAATTGATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAG ATCCAGCATCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAATACTAACATGGGTTTAAAG ATCAGGCAACTATTGTGGTTTCATATATCTTGCCTTACTTTTGGAAGAGAGACTGT ACTTGAATATTTGGTCTCTTTCGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCCTATAGACC ACCAAATGCCCCTATCTTATCAACAATTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGGG ACCGAGGCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGCAGATCTCA ATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATTCCTTGG ACTCATAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTTTATTCCTCTACAGTACCTATCTTTAA TCCTGAATGGCAAACTCCTTCCTTTCCTAAGATTCATTTACAAGAGGACATTATTA ATAGGTGTCAACAATTTGTGGGCCCTCTCACTGTAAATGAAAAGAGAAGATTGAA ATTAATTATGCCTGCTAGATTCTATCCTACCCACACTAAATATTTGCCCTTAGACAA AGGAATTAAACCTTATTATCCAGATCAGGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGAC ATTATTTACATACTCTTTGGAAGGCTGGTATTCTATATAAGAGGGAAACCACACGT AGCGCATCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGA GGTTGGTCATCAAAACCTCGCAAAGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAACCC TCTGGGATTCTTTCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACA ATCCAGATTGGGACTTCAACCCCATCAAGGACCACTGGCCAACAGCCAACCAGGT AGGAGTGGGAGCATTCGGGCCAGGGCTCACCCCTCCACACGGCGGTATTTTGGGG GGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATATTGACCACAGTGTCAACAATTCCTCCTCCTGC CTCCACCAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：29：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型B(Genbank登录号 AB602818)
AACTCCACCACTTTTCACCAAACTCTTCAAGATCCCAGAGTCCGGGCTCTGTACTT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACAGTAAGCCCTGCTCAGAATACTGTCTCTG CCATATCGTCAATCTTATCGAAGACTGGGGACCCTGTGCCGAACATGGAGAACAT CGCATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGA CAAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTT CTAGGGGGAACACCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCAAATCTCCAGTCA CTCACCAACCTGTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCG TTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTG GACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAG CACGGGACCATGCAAGACCTGCACAACTCCTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCT CATGTTGCTGTACAAAACCTACGGATGGAAACTGCACCTGTATTCCCATCCCATCA TCTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTC AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTT TCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCC CTTTATGCCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAACCCTCAC AAAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTTAACTTCATGGGATATGTAATTGGGAGTT GGGGCACATTGCCACAGGAACATATTGTACAAAAAATCAAACTATGTTTTAGGAA ACTTCCTGTAAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTT TGGGGTTTGCTGCCCCTTTTACGCAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTTTATATG CATGTATACAAGCAAAACAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTA AGTAAACAGTATCTAGCCCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCTGGTCTGTGCCA AGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCA TGCGTGGAACCTTTGTGTCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTT GTTTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATCGGGACTGACAATTCTGTCGTG CTCTCCCGCAAGTATACATCGTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGAT CCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACC CCTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTCTACCGCCCGCTTCTCCGTCTGCCGTACCGACCG ACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCGTCTGCC GGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAAACCACCGTGAACGC CCACCGGAACCTGCCCAAGGTCTTGCACAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGCAATGT CAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTCATGAGTGGGAGGA GCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAA TTGGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAGTCATCTCTTGTT CATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGAC ATTGACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCT GACTTCTTTCCGTCGGTACGAGACCTCCTAGATACCGCTGCTGCTCTGTATCGGGA AGCCTTAGAATCTCCTGAACATTGCTCACCTCACCACACAGCACTCAGGCAAGCTA TTCTGTGCTGGGGGGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTAGAA GATCCAGCGTCCAGGGATCTAGTAGTCAATTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAA GATCAGGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGT TCTTGAATATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCGGCCTACAGACC ACCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAG GCAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCACC GCGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCAT AAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTCTATTCTTCTACAGTACCTGTCTTTAATCCTGA ATGGCAAACTCCTTCTTTTCCAGACATTCATTTGCAGGAGGATATTGTTGATAGAT GTAAGCAATTTGTGGGACCCCTTACAGTAAATGAAAACAGGAGACTAAAATTAAT AATGCCTGCTAGATTTTATCCTAATGTTACCAAATATTTGCCCTTAGATAAAGGGA TCAAACCTTATTATCCAGAGCATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACAAGACATTAT TTGCATACTCTTTGGAAGGCGGGTATCTTATATAAGAGAGAGTCAACACATAGCGC CTCATTTTGCGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGATCTACAGCATGGGAGGTTGG TCTTCCAAACCTCGAAAAGGCATGGGGACAAATCTTTCTGTCCCCAATCCCCTGGG ATTCTTCCCCGATCATCAGTTGGACCCTGCATTCAAAGCCAACTCAGAAAATCCAG ATTGGGACCTCAACCCACACAAGGACAACTGGCCGGACGCCCACAAGGTGGGAGT GGGAGCATTCGGGCCAGGGTTCACCCCTCCCCACGGGGGACTGTTGGGGTGGAGC CCTCAGGCTCAGGGCATACTTACATCTGTGCCAGCAGCTCCTCCTCCTGCCTCCAC CAATCGGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACTCCCTTATCTCCACCTCTAAGGGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：30：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型C(Genbank登录号 AB540584)
AACTCCACAACTTTCCACCAAGCTCTGCTAGATCCCAGAGTGAGGGGCCTATACTT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCTC CCATATCGTCAATCTTCACGAGGACTGGGGACCCTGTACCGAACATGGAGAACAC AACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGA CAAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTT CTAGGGGGAGCACCCACGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATC ACTCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGC GTTTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCT GGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGAACATCAACTACAA GCACGGGACCATGCAAGACCTGCACGATTCCTGCTCAAGGAAMCTCTATGTTTCC CTCTTGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCAT CATCCTGGGCTTTCGCAAGATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGG CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGG CTTTCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAG TCCCTTTTTACCTCTATTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTGAACCCTA ATAAAACCAAGCGTTGGGGCTACTCCCTTAACTTTATGGGATATGTAATTGGAAGT TGGGGTACTTTACCACAGGAACATATTGTTCTAAAAATCAAACAATGTTTTCGGAA ACTGCCTGTAAATAGACCTATTGATTGGAAAGTATGTCAACGAATTGTGGGTCTTC TGGGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGGTATCCTGCCTTGATGCCTTTGTATG CATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTGT GTAAACAATATCTGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGTCAGGTCTCTGCCAA GTATTTGCTGACGCAACCCCCACTGGATGGGGCTTGGCAATAGGCCATCAGCGCAT GCGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCTTAGCAGCCT GCTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCRAATCTTATTGGAACCGACAACTCCGTTGTC CTCTCTCGGAAATACACCTCCTTTCCATGGCTGCTAGGGTGTGCTGCAAACTGGAT CCTGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCAGCGGACGACC CGTCTCGGGGCCGTTTGGGACTCTACCGTCCCCTTCTTCGTCTGCCGTTCCGGCCGA CCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGG ACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCC ACCAGGTCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCGGCAATGTCA ACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTGTGTTTAAAGACTGGGAGGAGT TGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATT GGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCA TGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACAT TGACCCGTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGA CTTCTTTCCTTCCATTCGAGATCTCCTCGACACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGAGGC CTTAGAGTCTCCGGAACATTGTTCACCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCTATTC TGTGTTGGGGTGAGTTGATGAATCTGGCCACCTGGGTGGGAAGTAATTTGGAAGA CCCAGCATCTAGGGAATTAGTAGTCAGTTATGTTAATGTTAATATGGGCCTAAAGA TCAGACAACTATTGTGGTTTCACATTTCCTGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTC TTGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATACGCACTCCTCCCGCTTACAGACCA CCAAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGG CAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGGTCTCAATCGCCG CGTCGCAGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTCAATGTTAGTATCCCTTGGACTCATA AGGTGGGAAATTTTACTGGGCTTTATTCTTCTACTGTACCTGTCTTCAATCCTGAGT GGCAAACTCCCTCCTTTCCTCACATTCATTTGCAGGAGGACATTATTAATAGATGT CAACAATATGTGGGCCCTCTTACAGTTAATGAAAAAAGGAGATTAAAATTAATTA TGCCTGCCAGGTTTTATCCTAACCGTACCAAATATTTGCCCCTAGATAAAGGCATT AAACCTTATTATCCTGAATATACAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGGCATTATTT ACATACTCTGTGGAAGGCTGGCATTCTATATAAGAGAGAAACTACACGCAGCGCC TCATTTTGTGGGTCACCATATTCTTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGGTTGGT CCTCCAAACCTCGAAAGGGCATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATCCTCTGGGC TTCTTTCCCGATCACCAGTTGGACCCTGCATTCGGAGCCAACTCAAACAATCCGGA TTGGGACTTCAATCCCAACAAGGATCACTGGCCAGCAGCAAACCAGGTAGGAGCG GGAGCCTTCGGGCCAGGGTTCACCCCACCGCACGGCGGTCTTTTGGGGTGGAGCC CTCAGGCTCAGGGCGTATTGACAACAGTGCCAGCAGCGCCTCCTCCTGCCTCCACC AATCGGCAGTCAGGCAGACAGCCTACTCCCATCTCTCCACCTCTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：31：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型E(Genbank登录号 AP007262)
AATTCCACAACATTCCACCAAGCTCTGCAGGATCCCAGAGTAAGAGGCCTGTATCT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCCGGAACAGTGAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCAC TCATCTCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAAGGCATC ACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC AAAAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGAGCTCCCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCAC TCACCAACCTCTTGTCCTCCAATTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCATCAACCACCAGT ACGGGACCCTGCCGAACCTGCACGACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTC ATGTTGTTGTTTAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACTTGTATTCCCATCCCATCATC ATGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTCA GTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGCCGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTTT CAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAACATCTTGAGTCCC TTTATACCTCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAAATCCCAACA AAACAAAAAGATGGGGATATTCCCTAAATTTCATGGGTTATGTAATTGGTAGTTGG GGGTCATTACCACAAGAACACATCAGACTGAAAATCAAAGACTGTTTTAGAAAGC TCCCTGTTAACAGGCCTATTGATTGGAAAGTATGTCAAAGAATTGTGGGTCTTTTG GGCTTTGCTGCCCCTTTTACACAATGTGGATATCCTGCTTTAATGCCTCTATATGCG TGTATTCAATCTAAGCAGGCTTTCACTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTGTGT AAACAATATATGAACCTTTACCCCGTTGCCCGGCAACGGCCAGGTCTGTGCCAAGT GTTTGCTGATGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCCATAGGCCATCAGCGCATGC GTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTGT TTTGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGAAACTCATAGGGACAGATAATTCTGTCGTTCT CTCCCGGAAATATACATCATTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCC TGCGAGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCC TCTCGGGGCCGCTTGGGGGTCTATCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGGCCGACC ACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGAC CGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCAC CAGATCTTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCTGCAATGTCAAC GACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTG GGGGAGGAGACTAGATTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG TCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCATG TCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACATTG ACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTACTGTGGAGTTACTCTCGTTTTTGCCTTCTGACT TCTTTCCTTCAGTAAGAGATCTTCTAGATACCGCCTCTGCTCTGTATCGGGATGCCT TAGAATCTCCTGAGCATTGTTCACCTCACCATACTGCACTCAGGCAAGCCATTCTT TGCTGGGGAGAATTAATGACTCTAGCTACCTGGGTGGGTGTAAATTTGGAAGATCC AGCATCCAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTCAATACTAATATGGGCCTAAAGTTCA GGCAATTATTGTGGTTTCACATTTCTTGTCTCACTTTTGGAAGAGAAACCGTCATA GAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCAGCTTATAGACCACC AAATGCCCCTATCTTATCAACACTTCCGGAGAATACTGTTGTTAGACGAAGAGGCA GGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCG TCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAG GTGGGAAATTTTACGGGGCTTTATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTAACTGG AAAACTCCATCTTTTCCTGATATTCATTTGCACCAGGACATTATTAACAAATGTGA ACAATTTGTAGGTCCTYTAACAGTAAATGAAAAACGAAGATTAAACTTAGTCATG CCTGCTAGATTTTTTCCCATCTCCACGAAATATTTGCCCCTAGAGAAAGGTATAAA ACCTTATTATCCAGATAATGTAGTTAATCATTACTTCCAAACCAGACACTATTTAC ATACCCTATGGAAGGCGGGCATCTTATATAAAAGAGAAACTACCCGTAGCGCCTC ATTTTGTGGGTCACCTTATTCTTGGGAACACGAGCTACATCATGGGGCTTTCTTGG ACGGTCCCTCTCGAATGGGGGAAGAATCATTCCACCACCAATCCTCTGGGATTTTT TCCCGACCACCAGTTGGATCCAGCATTCAGAGCAAACACCAGAAATCCAGATTGG GACCACAATCCCAACAAAGACCACTGGACAGAAGCCAACAAGGTAGGAGTGGGA GCATTTGGGCCGGGGTTCACTCCCCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCA GGCTCAAGGCATGCTAAAAACATTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATC GGCAGTCAGGAAGGCAGCCTACCCCAATCACTCCACCTTTGAGAGACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：32：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型F(Genbank登录号 HE974366)
AACTCAACCCAGTTCCATCAGGCTCTGTTGGATCCCAGGGTAAGGGCTCTGTATCT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAACACAAAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTC TCACATCCTCAATCTTCTCGACGACTGGGGGCCCTGCTATGAACATGGACAACATT ACATCAGGACTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGAC AAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGACTACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTACCAGGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTACTTCCAGGATCCACGACCACCAGC ACGGGACCCTGCAAAACCTGCACAACTCTTGCACAAGGAACCTCTATGTTTCCCTC CTGTTGCTGTTCAAAACCCTCGGACGGAAACTGCACTTGTATTCCCATCCCATCAT CCTGGGCTTTAGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCATGGCTC AGTTTACTAGTGCAATTTGTTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTT TTAGTTATATTGATGATCTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCACCTTGAGTCC CTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTGTTATCTGTGGGTATCCATTTAAATACTTCT AAAACTAAGAGATGGGGTTACACCCTACATTTTATGGGTTATGTCATTGGTAGTTG GGGATCATTACCTCAAGATCATATTGTACACAAAATCAAAGAATGTTTTCGGAAAC TGCCTGTAAATCGTCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTG GGCTTTGCTGCCCCTTTCACACAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCTCTGTATGCT TGTATTACTGCTAAACAGGCTTTTGTTTTTTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGT AAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCCAGGCAACGGCCGGGCCTGTGCCAAG TGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATTGGCCATCAGCGCATG CGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTTGCAGCTTG TTTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGACTCTCATCGGCACGGACAACTCTGTTGTCC TCTCTAGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTCGGGTGTGCTGCAAACTGGATC CTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCCGCGGACGACCC CTCCCGGGGCCGCTTGGGGCTGTACCGCCCTCTTCTCCGTCTGCCGTTCCAGCCGA CAACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTTCCTTCTCATCTGCCGG ACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCC CTTGGAGTTTGCCAACAGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCAGGAGGGTCA ATGACCCGGATTGCAGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGT TGGGGGAGGAGACTAGGTTAATGATCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATT GGTCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCA TGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGACATGGACAT TGACCCTTATAAAGAATTTGGCGCTTCTGTGGAGTTACTCTCTTTTTTGCCTTCTGA TTTCTTTCCATCGGTTCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTTTACCGGGATGC TTTAGAGTCACCTGAACATTGCACTCCCCATCACACTGCCCTCAGGCAAGTTATTT TGTGCTGGGGTGAGTTAATGACTTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAACTTGGAAGAC CCTGCTGCCAGGGATTTAGTAGTTAACTATGTTAACACTAACATGGGCCTAAAAAT TAGACAACTACTGTGGTTTCACATTTCCTGCCTTACTTTTGGAAGAGATATAGTTCT TGAGTATTTGGTGTCCTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTACAGACCAC AAAATGCCCCTATCCTATCCACACTTCCGGAAACTACTGTTGTTAGACGACGAGGC AGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGC GTCGCCGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAA GGTGGGAAATTTTACGGGGCTTTACTCTTCTACTGTGCCTGCTTTTAATCCTGACTG GTTAACTCCTTCTTTTCCTAATATTCATTTACATCAAGACCTAATTTCTAAATGTGA ACAATTTGTAGGCCCACTCACTAAAAATGAATTAAGGAGGTTAAAATTGGTTATGC CAGCTAGATTTTATCCTAAGGTTACCAAATATTTTCCTATGGAGAAAGGAATCAAG CCTTATTATCCTGAGCATGCAGTTAATCATTACTTTAAAACAAGACATTATTTGCATACTTTATGGAAGGCGGGAATTTTATATAAGAGAGAATCCACACGTAGCGCATCAT TTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTCTC AACGACAAGAAGAGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGATTC TTTCCAGACCATCAGCTGGATCCGCTATTCAAAGCAAATTCCAGCAGTCCCGACTG GGACTTCAACACAAACAAGGACAGTTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTGGG AGCATACGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTGCTGGGGTGGAGCCCT CAGGCACAAGGTATGTTAACAACCTTGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCTTCCACCAA TCGGCGGTCCGGGAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGAGACACTCATCCACAGGCAATGCAGTGG
SEQ ID NO：33：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型G(Genbank登录号 AP007264)
AACTCTACAGCATTCCACCAAGCTCTACAAAATCCCAAAGTCAGGGGCCTGTATTT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGGATAGTGAACCCTGTTCCGACTATTGCCTCTC ACATCTCGTCAATCTTCTCCAGGATTGGGGACCCTGCACCGAACATGGAGAACATC ACATCAGGATTCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC AAGAATCCTCACAATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGAGTGCCCGTGTGTCCTGGCCTAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAATCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATATTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTGATTCCAGGATCCTCGACCACCAGT ACGGGACCCTGCAAAACCTGCACGACTCCTGCTCAAGGCAACTCTATGTATCCCTC ATGTTGCTGTACAAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCAT CTTGGGCTTTCGCAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCTTGGCTC AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTT TCAGCTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTACAACATCTTGAGTCC CTTTATACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATCTAAACCCTAAC AAAACAAAAAGATGGGGTTATTCCTTAAATTTTATGGGATATGTAATTGGAAGTTG GGGTACTTTGCCACAAGAACACATCACACAGAAAATTAAGCAATGTTTTCGGAAA CTCCCTGTTAACAGGCCAATTGATTGGAAAGTCTGTCAACGAATAACTGGTCTGTT GGGTTTCGCTGCTCCTTTTACCCAATGTGGTTACCCTGCCTTAATGCCTTTATATGC ATGTATACAAGCTAAGCAGGCTTTTACTTTCTCGCCAACTTATAAGGCCTTTCTCTG TAAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTAGGCAACGGCCCGGTCTGTGCCAAG TGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCTTGGCCATCGGCCATCAGCGCATG CGTGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCTGCTTG TTTTGCTCGCAGCCGGTCTGGAGCAAAACTCATTGGGACTGACAATTCTGTCGTCC TTTCTCGGAAATATACATCCTTTCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATC CTTCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCAGCGCTGAATCCAGCGGACGACCC CTCCCGGGGCCGTTTGGGGCTCTGTCGCCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCTGCCGAC CACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGTCTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGA CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTACATGGAAACCGCCATGAACACCTC TCATCATCTGCCAAGGCAGTTATATAAGAGGACTCTTGGACTGTTTGTTATGTCAA CAACCGGGGTGGAGAAATACTTCAAGGACTGTGTTTTTGCTGAGTGGGAAGAATT AGGCAATGAGTCCAGGTTAATGACCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTG GTCTGCGCACCAGCACCATGTAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTCTTGTTCAT GTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTAGGGCATGGATAGA ACAACTTTGCCATATGGCCTTTTTGGCTTAGACATTGACCCTTATAAAGAATTTGG AGCTACTGTGGAGTTGCTCTCGTTTTTGCCTTCTGACTTTTTCCCGTCTGTTCGTGAT CTTCTCGACACCGCTTCAGCTTTGTACCGGGAATCCTTAGAGTCCTCTGATCATTGT TCGCCTCACCATACAGCACTCAGGCAAGCAATCCTGTGCTGGGGTGAGTTGATGAC TCTAGCTACCTGGGTGGGTAATAATTTGGAAGATCCAGCATCCAGAGATTTGGTGG TCAATTATGTTAATACTAATATGGGTTTAAAAATCAGGCAACTATTGTGGTTTCAC ATTTCCTGTCTTACTTTTGGGAGAGAAACCGTTCTTGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATTCGCACTCCTCCTGCTTATAGACCACCAAATGCCCCTATCCTATCAAC ACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACGAAGAGGCAGGTCCCCTCGAAGAAGAACT CCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCGCCGCGTCGCAGAAGATCTGCATCTCC AGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCACAAGGTGGGAAACTTTACGGGGCTG TATTCTTCTACTATACCTGTCTTTAATCCTGATTGGCAAACTCCTTCTTTTCCAAAT ATCCATTTGCATCAAGACATTATAACTAAATGTGAACAATTTGTGGGCCCTCTCAC AGTAAATGAGAAACGAAGATTAAAACTAGTTATGCCTGCCAGATTTTTCCCAAACT CTACTAAATATTTACCATTAGACAAAGGTATCAAACCGTATTATCCAGAAAATGTAGTTAATCATTACTTCCAGACCAGACATTATTTACATACCCTTTGGAAGGCGGGTAT TCTATATAAGAGAGAAACGTCCCGTAGCGCTTCATTTTGTGGGTCACCATATACTT GGGAACAAGATCTACAGCATGGGGCTTTCTTGGACGGTCCCTCTCGAGTGGGGAA AGAACCTTTCCACCAGCAATCCTCTAGGATTCCTTCCCGATCACCAGTTGGACCCA GCATTCAGAGCAAATACCAACAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAAAAAGGACC CTTGGCCAGAGGCCAACAAAGTAGGAGTTGGAGCCTATGGACCCGGGTTCACCCC TCCACACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGTCTCAGGGCACACTAACAACTT TGCCAGCAGATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGTCAGTCAGGGAGGCAGCCTACT CCCATCTCTCCACCACTAAGAGACAGTCATCCTCAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：34：
HBV基因组的核苷酸序列，HBV基因型H(Genbank登录号 AB516393)
AACTCAACACAGTTCCACCAAGCACTGTTGGATTCGAGAGTAAGGGGTCTGTATTT TCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGAAACACAGAACCCTGCTCCGACTATTGCCTCTC TCACATCATCAATCTTCTCGAAGACTGGGGACCCTGCTATGAACATGGAGAACATC ACATCAGGACTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGTGTGTTTCTTGTTGAC AAAAATCCTCACAATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGTACCACCCGGGTGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAATCTCCAATCAC TTACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGCTATCGTTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTATCAAGGTATGTTGCCCGTGTGTCCTCTACTTCCAGGATCTACAACCACCAGC ACGGGACCCTGCAAAACCTGCACCACTCTTGCTCAAGGAACCTCTATGTTTCCCTC CTGCTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCAT CTTGGGCTTTCGGAAAATACCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCTTGGCTC AGTTTACTAGTGCAATTTGCTCAGTGGTGCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTCTGGCTT TTAGTTATATGGATGATTTGGTATTGGGGGCCAAATCTGTGCAGCATCTTGAGTCC CTTTATACCGCTGTTACCAATTTTTTGTTATCTGTGGGCATCCATTTGAACACAGCT AAAACAAAATGGTGGGGTTATTCCTTACACTTTATGGGTTATATAATTGGGAGTTG GGGGACCTTGCCTCAGGAACATATTGTGCATAAAATCAAAGATTGCTTTCGCAAAC TTCCCGTGAATAGACCCATTGATTGGAAGGTTTGTCAACGCATTGTGGGTCTTTTG GGCTTTGCAGCCCCTTTTACTCAATGTGGTTATCCTGCTCTCATGCCCTTGTATGCC TGTATTACCGCTAAGCAGGCTTTTGTTTTCTCGCCAACTTACAAGGCCTTTCTCTGT CAACAATACATGAACCTTTACCCCGTTGCTCGGCAACGGCCAGGCCTTTGCCAAGT GTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTTGGCGATTGGCCATCAGCGCATGC GCGGAACCTTTGTGGCTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCAGCCTGT TTCGCTCGCAGCAGGTCTGGAGCGGACGTTATCGGCACTGACAACTCCGTTGTCCT TTCTCGGAAGTACACCTCCTTCCCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCC TGCGCGGGACGTCCTTTGTCTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCC TCTCGTGGTCGCTTGGGGCTCTGCCGCCCTCTTCTCCGCCTACCGTTCCGGCCGACG ACGGGTCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGCCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGCC CGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCCT TGGAACTTGCCAACAACCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTTTCGCCCCGGTCAAC GACCTGGATTGAGGAATACATCAAAGACTGTGTATTTAAGGACTGGGAGGAGTCG GGGGAGGAGTTGAGGTTAAAGGTCTTTGTATTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG TCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCTAATCATCTTTTGTTCATG TCCCACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTG ACCCTTATAAAGAATTTGGAGCTTCTGTGGAGTTACTCTCATTTTTGCCTTCTGACT TCTTCCCGTCTGTCCGGGACCTACTCGACACCGCTTCAGCCCTCTACCGAGATGCC TTAGAATCACCCGAACATTGCACCCCCAACCACACTGCTCTCAGGCAAGCTATTTT GTGCTGGGGTGAGTTGATGACCTTGGCTTCCTGGGTGGGCAATAATTTAGAGGATC CTGCAGCAAGAGATCTAGTAGTTAATTATGTCAATACTAACATGGGTCTAAAAATT AGACAATTATTATGGTTTCACATTTCCTGCCTTACATTTGGAAGAGAAACTGTGCT TGAGTATTTGGTGTCTTTTGGAGTGTGGATCCGCACTCCACCTGCTTACAGACCAC CAAATGCCCCTATCCTATCAACACTTCCGGAGACTACTGTTGTTAGACAACGAGGC AGGGCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAGATCTCAATCACCGC GTCGCAGAAGATCTCAATCTCCAGCTTCCCAATGTTAGTATTCCTTGGACTCATAA GGTGGGAAACTTTACCGGTCTTTACTCCTCTACTGTACCTGTTTTCAATCCTGACTG GTTAACTCCTTCTTTTCCTGACATTCACTTGCATCAAGATCTGATACAAAAATGTGA ACAATTTGTAGGCCCACTCACTACAAATGAAAGGAGACGATTGAAACTAATTATG CCAGCTAGGTTTTATCCCAAAGTTACTAAATACTTCCCTTTGGATAAAGGTATTAA GCCTTACTATCCAGAGAATGTGGTTAATCATTACTTTAAAACTAGACATTATTTAC ATACTTTGTGGAAGGCAGGAATTCTATATAAGAGAGAATCCACACATAGCGCCTC ATTTTGTGGGTCACCATATTCCTGGGAACAAGAGCTACAGCATGGGAGCACCTCTC TCAACGGCGAGAAGGGGCATGGGACAGAATCTTTCTGTGCCCAATCCTCTGGGAT TCTTTCCAGACCACCAGTTGGATVCACTATTCAGAGCAAATTCCAGCAGTCCCGAT TGGGACTTCAACACAAACAAGGACAATTGGCCAATGGCAAACAAGGTAGGAGTG GGAGGCTTCGGTCCAGGGTTCACACCCCCACACGGTGGCCTTCTGGGGTGGAGCC CTCAGGCACAGGGCATTCTGACAACCTCGCCACCAGATCCACCTCCTGCTTCCACC AATCGGAGGTCAGGAAGAAAGCCAACCCCAGTCTCTCCACCTCTAAGGGACACACATCCACAGGCCATGCAGTGG
SEQ ID NO：35：
载体pTREHBV-HAe的核苷酸序列(5，980nt)
载体：pTRE2(Clontech)
nt 356-452：HBV nt 1805-1902，具有A1816缺失
nt 453-491：HA标签插入，含侧翼序列
nt 462-488：HA标签序列
nt 492-3761：HBV nt 1903-3182/1-1990
Figure BDA0001184466800000781
Figure BDA0001184466800000791
Figure BDA0001184466800000801
SEQ ID NO:36：
编码HBV包膜蛋白表面大蛋白(L)的核苷酸序列
ATGGGGCAGAATCTTTCCACCAGCAATCCTCTGGGATTCTTTCCCGACCACCAGTT GGATCCAGCCTTCAGAGCAAACACAGCAAATCCAGATTGGGACTTCAATCCCAAC AAGGACACCTGGCCAGACGCCAACAAGGTAGGAGCTGGAGCATTCGGGCTGGGTT TCACCCCACCGCACGGAGGCCTTTTGGGGTGGAGCCCTCAGGCTCAGGGCATACT ACAAACTTTGCCAGCAAATCCGCCTCCTGCCTCCACCAATCGCCAGACAGGAAGG CAGCCTACCCCGCTGTCTCCACCTTTGAGAAACACTCATCCTCAGGCCATGCAGTG GAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAGGCCTGTATT TCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACTACTGCCTCT CCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACATGGAGAACAT CACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGAC AAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTC TAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACCTCCAATCAC TCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGT TTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGG ACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCAACCACCAGC ACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTATGTATCCCTC CTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCCATCCCATCAT CCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTTCTCCTGGCTC AGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTT TCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCATCTTGAGTCC CTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTAA
SEQ ID NO：37：
编码HBV包膜蛋白表面中等蛋白(M)的核苷酸序列
ATGCAGTGGAATTCCACAACCTTTCACCAAACTCTGCAAGATCCCAGAGTGAGAG GCCTGTATTTCCCTGCTGGTGGCTCCAGTTCAGGAGCAGTAAACCCTGTTCCGACT ACTGCCTCTCCCTTATCGTCAATCTTCTCGAGGATTGGGGACCCTGCGCTGAACAT GGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTT TCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTTCT CTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAAC CTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATGTG TCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTG GTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCTCA ACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTCTA TGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCCC ATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTTT CTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCAC TGTITGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGCA TCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTTA A
SEQ ID NO：38：
编码HBV包膜蛋白表面小蛋白(S)的核苷酸序列
ATGGAGAACATCACATCAGGATTCCTAGGACCCCTTCTCGTGTTACAGGCGGGGTT TTTCTTGTTGACAAGAATCCTCACAATACCGCAAAGTCTAGACTCGTGGTGGACTT CTCTCAATTTTCTAGGGGGAACTACCGTGTGTCTTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCA ACCTCCAATCACTCACCAACCTCCTGTCCTCCAACTTGTCCTGGTTATCGCTGGATG TGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGT TGGTTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGATCCT CAACCACCAGCACGGGACCATGCCGAACCTGCATGACTACTGCTCAAGGAACCTC TATGTATCCCTCCTGTTGCTGTACCAAACCTTCGGACGGAAATTGCACCTGTATTCC CATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATTCCTATGGGAGTGGGCCTCAGCCCGTT TCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCA CTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGGGGCCAAGTCTGTACAGC ATCTTGAGTCCCTTTTTACCGCTGTTACCAATTTTCTTTTGTCTTTGGGTATACATTT AA
SEQ ID NO：39：
表达载体pcHA-HBe的核苷酸序列(6，682nt)
载体：pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)
nt 929-1015：HBVnt 1816-1902
nt 1016-1054：插入
nt 1025-1051：HA标签序列
nt 1055-21 12：HBV1903-2605/1573-1926
Figure BDA0001184466800000831
Figure BDA0001184466800000841
Figure BDA0001184466800000851
SEQ ID NO:40：
标签N末端的氨基酸序列
VDI
SEQ ID NO:41：
包含5’和3’额外核苷酸的编码HA标签核苷酸序列。加下划线的核 苷酸显示编码HA标签的序列。
GTGGACATCTACCCATACGACGTTCCAGATTACGCTGGC
SEQ ID NO:42：
包含N末端和C末端额外氨基酸的HA标签的氨基酸序列。加下划 线的氨基酸残基显示HA标签的序列。
VDIYPYDVPDYAG
如本文中讨论的额外参考文献
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本文中提到的全部参考文献通过引用的方式完整并入。现在已经充分 描述了本发明，本领域技术人员将理解，可以在宽大和等同的条件、参数 等范围内实施本发明而不影响本发明或其任何实施方案的精神或范围。
根据上文并且还如所附权利要求中所阐述，本发明尤其涉及以下项：
1.一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状(ccc)DNA 的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包含编码 加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选择候选 分子。
2.项1的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV))并且其 中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
3.项1或2的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个 标签。
4.项3的方法，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
5.项3或4的方法，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag 标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
6.项5的方法，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
7.项1或2的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个 或更多个标签。
8.项7的方法，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
9.项7或8的方法，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
10.根据项7至9中任一项的方法，其中所述两个或更多个标签是以下两 者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5 标签和/或C9标签。
11.项10的方法，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
12.项5或10的方法，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His 标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸 序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ IDNO:6中显 示。
13.项6或11的方法，其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO: 3中显示；或其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
14.项5或10的方法，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；其中c-myc标签 的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
15.项6或11的方法，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
16.根据项2至15中任一项的方法，其中编码HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:16中显示。
17.根据项2至15中任一项的方法，其中HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:18中显示。
18.根据项1至17中任一项的方法，其中核酸分子包含编码嗜肝DNA 病毒前核心蛋白的核酸序列。
19.项18的方法，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:15中显示。
20.项18的方法，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:17中显示。
21.根据项1至17中任一项的方法，其中核酸分子包含编码一个或多个 标签的核酸序列，其中所述序列在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的N 端信号肽和接头的核酸序列的3'下游。
22.项21的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码乙型 肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游。
23.根据项1至22中任一项的方法，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒 基因组。
24.项23的方法，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是乙型肝炎病毒(HBV) 基因组。
25.项24的方法，其中所述HBV基因组是HBV基因型A、B、C、D、 E、F、G或H的基因组。
26.项24的方法，其中所述HBV基因组是HBV基因型D的基因组。
27.项26的方法，其中所述HBV基因型D的基因组是HBV亚基因型 ayw的基因组。
28.根据项中任一项的方法1至27，其中编码一个或多个标签的核酸在 编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。
29.项28的方法，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。
30.项29的方法，其中编码HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO:23中 显示。
31.项29的方法，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24 中显示。
32.根据项1至31中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的 序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构。
33.项32的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
34.项33的方法，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列在SEQ ID NO:25中显示。
35.根据1至34项中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的 序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎。
36.项35的方法，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
37.根据项1至36中任一项的方法，其中将包含编码一个或多个标签的 序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应 的核苷酸之间。
38.根据项1至37中任一项的方法，其中核酸分子在编码一个或多个标 签的序列的5’包含能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部 茎形成碱基对的序列。
39.项38的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下 部茎形成碱基对的序列能够与对应于HBV基因组位置T1849至A1854 的核苷酸形成碱基对。
40.项38或39的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结 构的下部茎形成碱基对的序列由至多9个核苷酸组成。
41.项40的方法，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下 部茎形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成，或其中能 够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基对的序列 编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
42.根据项1至41中任一项的方法，其中核酸分子在编码一个或多个标 签的序列的3’包含编码接头的序列。
43.项42的方法，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。
44.项42的方法，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
45.项44的方法，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
46.根据项42至44中任一项的方法，其中所述编码接头的序列由序列 GGC组成；或其中所述序列编码甘氨酸残基。
47.根据项1至46中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸 序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包 含编码如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
48.根据项1至47中任一项的方法，其中所述一个或多个标签符合可读 框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。
49.项48的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原 (HBeAg)。
50.根据项2至49中任一项的方法，其中编码加标签的HBeAg的核酸序 列在SEQ IDNO:20中显示。
51.根据项2至50中任一项的方法，其中加标签的HBeAg的氨基酸序列 在SEQ IDNO:22中显示。
52.根据项2至51中任一项的方法，其中编码加标签的HBV前核心蛋 白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
53.根据项2至52中任一项的方法，其中加标签的HBV前核心蛋白的 氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
54.根据项24至53中任一项的方法，其中HBV基因组的核酸序列在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一项中显示。
55.根据项中任一项的方法23至54，其中核酸转录成前基因组(pg)嗜肝 DNA病毒RNA、尤其前基因组(pg)HBV RNA。
56.根据项1至55中任一项的方法，其中所述核酸阻止加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的翻译。
57.项56的方法，其中所述核酸不含有在编码加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。
58.项56或57的方法，其中在编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核 酸5’上游的起始密码子ATG已经由核酸TG替换。
59.根据项56至58中任一项的方法，其中所述核酸已经通过点突变被修 饰以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
60.根据项1至59中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于载体中。
61.项60的方法，其中载体包含如SEQ ID NO:35中所显示的序列。
62.根据项1至61中任一项的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA 病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在诱导型启动子的控制下。
63.项56至62中任一项所述的方法，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型 肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
64.项62或63的方法，其中诱导型启动子是四环素诱导型启动子、强力 霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、醇诱导型 启动子、类固醇诱导型启动子或除草剂诱导型启动子。
65.根据项62至64中任一项的方法，其中诱导型启动子是CMV启动子 或tet-EF-1α启动子。
66.根据项23至65中任一项的方法，其中将一个或多个终止密码子引入 一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的编码区。
67.项66的方法，其中所述一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白是一种 或多种HBV包膜蛋白。
68.项67的方法，其中一种或多种HBV包膜蛋白是表面大蛋白(L)、表 面中等蛋白(M)和表面小蛋白(S)的一者或多者。
69.项67的方法，其中HBV包膜蛋白是表面小蛋白(S)。
70.根据67至69项中任一项的方法，其中一种或多种HBV包膜蛋白的 编码区在SEQID NO:36(L)、SEQ ID NO:37(M)和/或SEQ ID NO:38 (S)中显示。
71.项70的方法，其中将SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217至 222(TTGTTG)突变成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
72.根据项1至71中任一项的方法，其中细胞是真核细胞。
73.项72的方法，其中真核细胞是肝细胞来源的。
74.项72或73的方法，其中真核细胞是肝瘤细胞或衍生自肝瘤细胞。
75.根据项72至74中任一项的方法，其中真核细胞是HepG2 (ATCC#HB-8065)。
76.根据项1至75中任一项的方法，其中核酸分子或包含前者的载体稳 定整合在细胞的基因组中。
77.根据项1至76中任一项的方法，其中所述步骤(a)还包括步骤(aa)， 所述步骤(aa)包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子 包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组(pg)RNA；
(ii)逆转录所述合成的pgRNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成 双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)任选地恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。
78.项77的方法，其中恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条 件是恢复起始密码子。
79.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子抑 制嗜肝DNA病毒ccc DNA形成的能力。
80.项79的方法，其中细胞在cccDNA已经形成之前与候选分子接触。
81.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子减 少嗜肝DNA病毒ccc DNA的量或数目的能力。
82.根据项1至78中任一项的方法，其中所述方法用于评估候选分子减 少嗜肝DNA病毒ccc DNA转录的能力。
83.项81或82的方法，其中细胞在cccDNA已经形成之后与候选分子接 触。
84.根据项1至83中任一项的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的水平通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
85.根据项1至84中任一项的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的水平包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原 的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种抗体。
86.根据项77至85中任一项的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝 炎病毒(HBV))并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗 原(HBeAg)。
87.核酸分子，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列。
88.项87的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)。
89.项87或88的核酸分子，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅 含有一个标签。
90.项89的核酸分子，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
91.项89或90的核酸分子，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标 签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
92.项91的核酸分子，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
93.项87或88的核酸分子，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含 有两个或更多个标签。
94.项93的核酸分子，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
95.项93或94的核酸分子，其中所述两个或更多个标签的整个长度是 14至31个氨基酸。
96.项93至95中任一项的核酸分子，其中所述两个或更多个标签是以下 两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、 V5标签和/或C9标签。
97.项96的核酸分子，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
98.项91或96中任一项的核酸分子，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His 标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸 序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ IDNO:6中显 示。
99.项92或97的核酸分子，
其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；或
其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
100.项91或96的核酸分子，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
101.项92或97的核酸分子，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
102.项88至101中任一项的核酸分子，其中编码HBeAg的核酸序列 在SEQ ID NO:16中显示。
103.项88至101中任一项的核酸分子，其中HBeAg的氨基酸序列在 SEQ ID NO:18中显示。
104.项87至103中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含编码嗜肝 DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。
105.项104的核酸分子，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序 列在SEQ IDNO:15中显示。
106.项104的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列 在SEQ IDNO:17中显示。
107.项87至106中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含编码一个或 多个标签的核酸序列，其中所述序列在编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白 的N端信号肽和接头(“前核心蛋白”区域)的核酸序列的3'下游。
108.项107的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码 乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3’下游。
109.项87至108中任一项的核酸分子，其中核酸分子包含嗜肝DNA 病毒基因组。
110.项109的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是乙型肝炎病 毒(HBV)基因组。
111.项110的核酸分子，其中所述HBV基因组是HBV基因型A、B、 C、D、E、F、G或H的基因组。
112.项110的核酸分子，其中所述HBV基因组是HBV基因型D的基 因组。
113.项112的核酸分子，其中所述HBV基因型D的基因组是HBV亚 基因型ayw的基因组。
114.项87至113中任一项的核酸分子，其中编码一个或多个标签的核 酸在编码嗜肝DNA病毒核心蛋白的核酸的5’上游。
115.项114的核酸分子，其中核酸序列编码HBV核心蛋白。
116.项115的核酸分子，其中编码HBV核心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:23中显示。
117.项114的核酸分子，其中核心蛋白是HBV核心蛋白。
118.项116的核酸分子，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:24中显示。
119.项87至118中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标 签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构。
120.项119的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因 组。
121.项120的核酸分子，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列 在SEQ ID NO:25中显示。
122.项87至121中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标 签的序列的核酸分子插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部 茎。
123.项122的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因 组。
124.项87至123中任一项的核酸分子，其中将包含编码一个或多个标 签的序列的核酸分子插入与HBV基因组的位置C1902和A1903相对应 的核苷酸之间。
125.项87至124中任一项的核酸分子，其中核酸分子在编码一个或多 个标签的序列的5’包含能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的 下部茎形成碱基对的序列。
126.项125的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε 结构的下部茎形成碱基对的序列能够与对应于HBV基因组位置T1849 至A1854的核苷酸形成碱基对。
127.项125或126的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码 的ε结构的下部茎形成碱基对的序列由至多9个核苷酸组成。
128.项127的核酸分子，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε 结构的下部茎形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成， 或其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎形成碱基 对的序列编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
129.项87至128中任一项的核酸分子，其中核酸分子在编码一个或多 个标签的序列的3’包含编码接头的序列。
130.项129的核酸分子，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。 131.项129的核酸分子，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
132.项131的核酸分子，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
133.项129至131中任一项的核酸分子，其中所述编码接头的序列由 序列GGC组成；或其中所述序列编码甘氨酸残基。
134.项87至133中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示 的核酸序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包 含编码如SEQ ID NO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
135.项87至134中任一项的核酸分子，其中所述一个或多个标签符合 可读框地融合于嗜肝DNA病毒e抗原中。
136.项135的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病 毒e抗原(HBeAg)。
137.项88至136中任一项的核酸分子，其中编码加标签的HBeAg的 核酸序列在SEQID NO:20中显示。
138.项88至137中任一项的核酸分子，其中加标签的HBeAg的氨基 酸序列在SEQID NO:22中显示。
139.项88至138中任一项的核酸分子，其中编码加标签的HBV前核 心蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
140.项88至139中任一项的核酸分子，其中加标签的HBV前核心蛋 白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
141.项110至140中任一项的核酸分子，其中HBV基因组的核酸序列 在SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34的任一项中显示。
142.项109至141中任一项的核酸分子，其中核酸转录成前基因组(pg) 嗜肝DNA病毒RNA。
143.项142的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒RNA是HBV RNA。
144.项87至143中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含于载体中。
145.项144的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病 毒e抗原(HBeAg)。
146.项87至145中任一项的核酸分子，其中所述核酸允许加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原的翻译。
147.项146的核酸分子，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病 毒e抗原(HBeAg)。
148.项147的核酸分子，其中核酸包含于包含如SEQ ID NO:39中所 显示的序列的载体中。
149.项87至148中任一项的核酸分子，其中所述核酸阻止加标签的嗜 肝DNA病毒e抗原的翻译。
150.项149的核酸分子，其中所述核酸不含有在编码加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG。
151.项147或150的核酸分子，其中在编码加标签的嗜肝DNA病毒e 抗原的核酸5’上游的起始密码子ATG已经由核酸TG替换。
152.项147至151中任一项的核酸分子，其中所述核酸已经通过点突 变被修饰以阻止加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的翻译。
153.项144、145和149至152中任一项的核酸分子，其中载体包含如 SEQ ID NO:35中所显示的序列。
154.项87至153中任一项的核酸分子，其中包含编码加标签的嗜肝 DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子在诱导型启动子的控制下。
155.项149至154中任一项的核酸分子，其中嗜肝DNA病毒e抗原是 乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
156.项154或155的核酸分子，其中诱导型启动子是四环素诱导型启 动子、强力霉素诱导型启动子、抗生素诱导型启动子、铜诱导型启动子、 醇诱导型启动子、类固醇诱导型启动子，或除草剂诱导型启动子。
157.项154至156中任一项的核酸分子，其中诱导型启动子是CMV 启动子或tet-EF-1α启动子。
158.项110至157中任一项的核酸分子，其中将一个或多个终止密码 子引入一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白的编码区。
159.项158的核酸分子，其中所述一种或多种嗜肝DNA病毒包膜蛋白 是一种或多种HBV包膜蛋白。
160.项159的核酸分子，其中一种或多种HBV包膜蛋白是以下一者或 多者：L、M和/或S。
161.项159的核酸分子，其中HBV包膜蛋白是S。
162.项159至161中任一项的核酸分子，其中一种或多种HBV包膜蛋 白的编码区在SEQ ID NO:36(L)、37(M)或38(S)中显示。
163.项162的核酸分子，其中将SEQ ID NO:38(S)的HBV核苷酸217 至222(TTGTTG)突变成TAGTAG以阻止包膜蛋白的表达。
164.蛋白质，如项87至163中任一项中所限定的核酸分子编码。
165.蛋白质，包含加标签的嗜肝DNA病毒e抗原。
166.项165的蛋白质，其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒 e抗原(HBeAg)。
167.项166的蛋白质，其中乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)包含如SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列。
168.项165至167中任一项的蛋白质，其中所述加标签的嗜肝DNA病 毒e抗原仅含有一个标签。
169.项168的蛋白质，其中所述标签由6至22个氨基酸组成。
170.项165至169中任一项的蛋白质，其中所述标签选自血凝素(HA) 标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和C9标签。
171.项170的蛋白质，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标 签。
172.项165至167中任一项的蛋白质，其中所述加标签的嗜肝DNA病 毒e抗原含有两个或更多个标签。
173.项172的蛋白质，其中所述两个或更多个标签是不同的标签。
174.项172或173的蛋白质，其中所述两个或更多个标签的整个长度 是14至31个氨基酸。
175.项172至174中任一项的蛋白质，其中所述两个或更多个标签是 以下两者或更多者：血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标 签、V5标签和/或C9标签。
176.项175的蛋白质，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标 签。
177.项170或175的蛋白质，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；其中编码His 标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；其中编码c-myc标签的核酸 序列在SEQ ID NO:4中显示；其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ IDNO:6中显 示。
178.项171或176的蛋白质，
其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；或
其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
179.项170或175的蛋白质，
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
180.项171或176的蛋白质，
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；或
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示。
181.项165至180中任一项的蛋白质，包含嗜肝DNA病毒前核心蛋白。
182.项181的蛋白质，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列 在SEQ IDNO:15中显示。
183.项181的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列在 SEQ ID NO:17中显示。
184.项165至183中任一项的蛋白质，其中蛋白质包含一个或多个标 签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒前核心蛋白的信号肽 和接头的氨基酸序列序列的C末端。
185.项184的蛋白质，其中所述包含一个或多个标签的氨基酸序的蛋 白质在乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的氨基酸序列的C末 端。
186.项165至183中任一项的蛋白质，其中蛋白质包含一个或多个标 签的氨基酸序列，其中所述序列在嗜肝DNA病毒核心蛋白的氨基酸序 列的N末端。
187.项186的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒核心蛋白是HBV核心蛋白。
188.项187的蛋白质，其中编码HBV核心蛋白的核酸在SEQ ID NO: 23中显示。
189.项187的蛋白质，其中HBV核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO: 24中显示。
190.项165至189中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基 酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构编码的氨基酸序列。
191.项190的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
192.项191的蛋白质，其中如HBV基因组编码的ε结构的核酸序列在 SEQ ID NO:25中显示。
193.项165至192中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基 酸序列插入如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下部茎编码的氨基 酸序列。
194.项193的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒基因组是HBV基因组。
195.项165至194中任一项的蛋白质，其中将一个或多个标签的氨基 酸序列插入与HBV前核心蛋白(如SEQ ID NO:17中所显示的一种)的位 置G29和位置M30相对应的氨基酸残之间。
196.项165至195中任一项的蛋白质，还在一个或多个标签的氨基酸 序列的N末端包含至多3个氨基酸的氨基酸序列，其中所述至多3个氨 基酸的氨基酸序列由能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε结构的下 部茎形成碱基配对的核酸序列编码。
197.项196的蛋白质，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε 结构的下部茎形成碱基对的核酸序列能够与对应于HBV基因组位置 T1849至A1854的核苷酸形成碱基对。
198.项198的蛋白质，其中能够与如嗜肝DNA病毒基因组编码的ε 结构的下部茎形成碱基对的核酸序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组 成。
199.项196至198中任一项的蛋白质，其中所述至多3个氨基酸的氨 基酸序列在SEQ ID NO:40中显示。
200.项165至199中任一项的蛋白质，还在一个或多个标签的氨基酸 序列的C末端包含接头。
201.项200的蛋白质，其中所述接头由一个或多个氨基酸残基组成。 202.项201的蛋白质，其中所述接头仅由一个氨基酸残基组成。
203.项202的蛋白质，其中所述氨基酸是甘氨酸残基。
204.项1至46中任一项的蛋白质，其中加标签的嗜肝DNA病毒e抗 原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列编码的氨基酸 序列；或
其中加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:42 中所示的氨基酸序列。
205.项165至204中任一项的蛋白质，其中所述一个或多个标签符合 可读框地融合入嗜肝DNA病毒e抗原。
206.项205的蛋白质，其中嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e 抗原(HBeAg)。
207.项166至206中任一项的蛋白质，其中编码加标签的HBeAg的核 酸序列在SEQID NO:20中显示。
208.项166至207中任一项的蛋白质，其中加标签的HBeAg的氨基酸 序列在SEQ IDNO:22中显示。
209.项166至208中任一项的蛋白质，其中编码加标签的HBV前核心 蛋白的核酸序列在SEQ ID NO:19中显示。
210.项166至209中任一项的蛋白质，其中加标签的HBV前核心蛋白 的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
211.宿主细胞，包含项87至163中任一项的核酸分子或项164至210 中任一项的蛋白质。
212.项211的宿主细胞，其中细胞是真核细胞。
213.项212的宿主细胞，其中真核细胞是肝细胞来源的。
214.项212或213的宿主细胞，其中真核细胞是肝瘤细胞或衍生自肝 瘤细胞。
215.项212至214中任一项的宿主细胞，其中真核细胞是HepG2 (ATCC#HB-8065)。
216.用于产生如项164至210中任一项所限定的蛋白质的方法，所述 方法包括在允许蛋白质表达的条件下培养项210至215中任一项的宿主 并且从培养物回收产生的蛋白质。
217.试剂盒，用于项1至86中任一项的方法中。
218.试剂盒，包含特异性识别如项165至167中任一项所限定的嗜肝 DNA病毒抗原e的抗体和特异性识别如项168至180中任一项所限定的 一个或多个标签的一种或多种抗体。
219.项87至163中任一项的核酸分子、项164至210中任一项的蛋白 质和/或项中211至215任一项的宿主细胞的用途，用于筛选疑似能够抑 制嗜肝DNA病毒共价闭合环状DNA的候选分子。
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Claims (21)

1.一种用于评估候选分子抑制嗜肝DNA病毒共价闭合环状(ccc)DNA的能力的方法，包括步骤
(a)使包含核酸分子的细胞与所述候选分子接触，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；其中所述核酸分子包含编码一个或多个标签的序列和在编码一个或多个标签的序列的5'这样的序列，其能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对，
其中将核酸插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间由此获得所述核酸分子，所述核酸包含编码一个或多个标签的序列和在编码一个或多个标签的序列的5'这样的序列，其能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对；
(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平；并且
(c)当加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平与对照相比降低时选择候选分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述嗜肝DNA病毒是乙型肝炎病毒(HBV)并且其中所述嗜肝DNA病毒e抗原是乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原仅含有一个标签；或其中所述加标签的嗜肝DNA病毒e抗原含有两个或更多个标签。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述标签选自血凝素(HA)标签、His标签、Flag标签、c-myc标签、V5标签和/或C9标签。
5.根据权利要求4所述的方法，
其中编码HA标签的核酸序列在SEQ ID NO:1中显示；
其中编码His标签的核酸序列在SEQ ID NO:2中显示；
其中编码c-myc标签的核酸序列在SEQ ID NO:4中显示；
其中编码V5标签的核酸序列在SEQ ID NO:5中显示；
和/或其中编码C9标签的核酸序列在SEQ ID NO:6中显示；
或
其中HA标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:8中显示；
其中His标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:9中显示；
其中1×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:10中显示；
其中3×Flag标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:14中显示；
其中c-myc标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:11中显示；
其中V5标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:12中显示；和/或
其中C9标签的氨基酸序列在SEQ ID NO:13中显示。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述Flag标签是1×Flag标签或3×Flag标签。
7.根据权利要求6所述的方法，其中编码1×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:3中显示；
并且其中编码3×Flag标签的核酸序列在SEQ ID NO:7中显示。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中核酸分子包含编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列。
9.根据权利要求8所述的方法，其中编码嗜肝DNA病毒前核心蛋白的核酸序列是如SEQID NO:15中所显示的乙型肝炎病毒前核心蛋白的核酸序列；或
其中嗜肝DNA病毒前核心蛋白的氨基酸序列是如SEQ ID NO:17中所显示的乙型肝炎病毒前核心蛋白的氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述编码一个或多个标签的核酸序列在编码乙型肝炎病毒前核心蛋白N端29个氨基酸的核酸序列的3'下游。
11.根据权利要求1或2所述的方法，其中核酸分子包含嗜肝DNA病毒基因组。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述嗜肝DNA病毒基因组是如SEQ ID NO:27、28、29、30、31、32、33或34任一者中所显示的乙型肝炎病毒(HBV)基因组。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述HBV基因组是HBV亚基因型ayw的基因组。
14.根据权利要求1或2所述的方法，其中能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对的序列由SEQ ID NO:26中所示的序列组成，或其中能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对的序列编码如SEQ ID NO:40中所显示的多肽。
15.根据权利要求1或2所述的方法，其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含如SEQ ID NO:41中所示的核酸序列，或
其中包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列的核酸分子包含编码如SEQ IDNO:42中所示的氨基酸序列的核酸序列。
16.根据权利要求1或2所述的方法，
其中编码加标签的HBeAg的核酸序列在SEQ ID NO:20中显示；
或其中加标签的HBeAg的氨基酸序列在SEQ ID NO:22中显示。
17.根据权利要求8所述的方法，其中编码加标签的HBV前核心蛋白的核酸序列在SEQID NO:19中显示；或其中加标签的HBV前核心蛋白的氨基酸序列在SEQ ID NO:21中显示。
18.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述步骤(a)还包括步骤(aa)，所述步骤(aa)包括在以下条件培养包含核酸分子的细胞，所述核酸分子包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列，所述条件允许
(i)合成嗜肝DNA病毒前基因组RNA；
(ii)逆转录所述合成的前基因组RNA成为负链DNA；
(iii)合成第二正链DNA，从而所述负链DNA和所述正链DNA形成双链松弛型环状DNA；
(iv)从所述松弛型环状双链DNA形成cccDNA；
(v)任选地恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件；
(vi)转录编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的mRNA；
(vii)翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原，
其中恢复允许翻译加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的条件是恢复起始密码子。
19.根据权利要求1或2所述的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平通过ELISA、CLIA或AlphaLISA进行。
20.根据权利要求1或2所述的方法，其中根据步骤(b)评估加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的水平包括使用特异性识别所述嗜肝DNA病毒e抗原的抗体和特异性识别一个或多个标签的一种或多种抗体。
21.核酸分子，包含编码加标签的嗜肝DNA病毒e抗原的核酸序列；其中核酸分子包含编码一个或多个标签的序列，并且在编码一个或多个标签的序列的5'这样的序列，其能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对，
其中将核酸插入与HBV基因组的位置C1902和位置A1903相对应的核苷酸之间由此获得所述核酸分子，所述核酸包含编码一个或多个标签的序列和在编码一个或多个标签的序列的5'这样的序列，其能够与嗜肝DNA病毒pgRNA的ε结构形成碱基对，即与对应于HBV基因组位置T1849至T1855的核苷酸形成碱基对。
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