CN101899533A - 用于检测牛流行热病毒的试剂盒及相关方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于检测牛流行热病毒的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。本发明的检测试剂盒中至少有两对用于进行环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP；本发明所涉及的方法是利用环介导等温核酸扩增技术进行检测。本发明具有不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，所使用的设备简单，耗时较短的优点。

Description

用于检测牛流行热病毒的试剂盒及相关方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是一种用于检测牛流行热病毒的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。

背景技术

牛流行热(bovine ephemeral fever，BEF)是由牛流行热病毒(bovineephemeral fever virus，BEFV)引起的牛和水牛的急性传染病，其特征是突发高热、呼吸迫促、消化机能障碍、全身虚弱、僵硬、跛行。该病传播迅速，流行面广，有一定的周期性，曾在我国多个省份多次发生。该病可导致奶牛产奶量降低，乳品质下降，役用牛跛行或瘫痪，部分怀孕母牛流产，给养牛业造成重大经济损失(Yeruhan，et al.，2003，2005)。

BEF于1867年首先发生于东非，随后在广大的非洲和南亚地区流行，并且养牛业的快速发展又促使本病向更广泛的地区蔓延，至今已有百余年历史。我国在1976年本病暴发流行期间，从北京暴发流行本病的某奶牛场，采集了病牛高热期的抗凝血或脱纤血，通过乳鼠脑内传代和BHK-21细胞盲传的方法成功分离出第一株牛流行热病毒，1977年和1983年又分别从广东、安徽分离出该病毒(Bai，1991)。

我国在1991年以前有25个省市多次爆发流行，1991年至今虽然没有大规模流行的报道，但在华南和华北的一些省份一直有区域性流行，如广东省在2005年、福建省在2007和2009年、浙江省在2003年、湖南省在2004年，安徽省在1991和2007年、河南省在1993、1998、2004和2009年都发生了该病，危害很大。这就需要快速的诊断技术，能及时确诊本病以便更好的预防和治疗。

在检测和控制本病方面，目前尚未建立起国际标准化的诊断技术，但许多国家的研究者都在特异性血清学诊断方法方面进行了大量有意义的研究工作，但对病原的诊断方法研究的较少。在2005年，有报道用实时定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)和巢式PCR对BEFV进行检测，这些方法必须在实验室内完成。目前我国检测和确诊BEFV的方法是病毒分离，但这种方法耗时较长，大概需一个月左右；成本较高；必须要专业技术人员才能操作完成。这种延时诊断使得对病牛采取治疗和对易感牛积极进行疫苗预防非常不利，因此研究一种能在基层应用，可简单快速的检测BEFV的试剂盒非常必要。

发明内容

本发明提供一种实际应用中用时较短、成本较低，进行检测时无需专业技术的检测牛流行热病毒的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。

本发明的检测试剂盒中至少有两对用于进行环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP，其序列如下：

上游外引物F3：5’-tgacagtaagacaaagggatgt-3’

下游外引物B3：5’-catcctcgaaaatgatgccat-3’

上游内引物FIP：5’-ggacttaactgtaatgcattccca-

                   ggacatggataccagatgtgag-3’

下游内引物BIP：5’-atgagacagagagattgtggga-

                   tccacaaaacgtagacagacat-3’

本发明所述的检测牛流行热病毒的试剂盒中所用的其它物质可以临时购置。为方便起见，本发明的检测试剂盒可以有以下的内容：甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液、AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶。在试剂盒内还可以有显色剂SYBR GREEN I。

本发明的试剂盒的使用方法是：

a.从待检测的牛的静脉采集血样，并在其中加入抗凝血剂；

b.从待测血样中提取RNA；

c.用试剂盒中的RT-LAMP反应液(包括甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液)、AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶，以及提取的RNA模板配制成RT-LAMP反应混合物；

d.用上述RT-LAMP反应混合物进行RT-LAMP反应：将反应混合物在62℃水浴锅中恒温反应1h，然后将温度升至80℃维持2min，终止反应；

e.用RT-LAMP反应产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品的阴、阳性。

当本发明的试剂盒中有显色剂时，可在RT-LAMP反应终止后，在反应产物中加入显色剂，根据反应产物是否呈现绿色判定被测样品的阴、阳性。显然这一方法将更加简单。

本发明是利用环介导等温核酸扩增技术进行检测，其优点是：不需要热循环反应，不必在PCR仪中进行扩增，只需要简单的恒温装置，如水浴锅等即可；与耗时2～5h的常规RT-PCR相比，反应时间大大缩短，一般只需要1～2小时；其检测结果可根据反应液颜色变化肉眼判定结果，简单方便；这种技术不需要特殊的专业知识，可在小型实验室和基层养殖场作快速诊断用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述，但实施例不应作为对本发明内容的限制。

首先采集36份临床血液样本。这些样品中的8份是保存在-70℃的于2002年从浙江省台州市一发生了牛流行热的奶牛场采集到的病牛的高热期抗凝血。其它28份采自试验感染动物。其做法是用采自台州的奶牛感染血静脉注射2头(编号为LD和LX)1岁左右的健康黄牛，注射剂量为4ml/头。从感染后的第1天开始，每天从每头黄牛的静脉分别采血10ml，加入抗凝剂后-70℃冻存，一直持续到感染后第14天。这样，我们从编号为LD的牛采集了14份样品(编号LD1到LD14)；从编号为LX的牛也采集了14份样品(编号LX1到LX14)。两头牛在感染后的第6-7天均发病，表现出了特征性的牛流行热症状。

对上述血样提取RNA后，用本发明提供的引物和前述的方法进行RT-LAMP检测，同时也用常规RT-PCR方法和病毒分离方法对样品进行检测，比较这三种方法的敏感性和特异性。其中常规RT-PCR方法所用的引物为：上游引物420F(5’-agagcttggtgtgaatac-3’)，下游引物420B(5’-ccaacctacaacagcagata-3’)。用大连宝生物工程有限公司生产的一步RNA PCR kit进行扩增，反应混合物首先在50℃孵育30min进行反转录反应，然后94℃预变性2min，接着进行35个循环(循环程序为94℃40s，46℃1min，72℃40s)，最后72℃延伸5min。扩增产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳。病毒分离方法参见《动物病毒学》，殷震、刘景华主编，1997年第二版，科学出版社出版。

采用两对特异引物F3、B3、FIP和BIP。其中F3为上游外引物，B3为下游外引物，FIP为上游内引物，BIP为下游内引物。引物序列如下：

F3：5’-tgacagtaagacaaagggatgt-3’

B3：5’-catcctcgaaaatgatgccat-3’

FIP：5’-ggacttaactgtaatgcattccca-

     ggacatggataccagatgtgag-3’

BIP：5’-atgagacagagagattgtggga-

     tccacaaaacgtagacagacat-3’

建立检测BEFV的RT-LAMP试剂盒，这一试剂盒可检测50份样品，盒中包括的试剂如下：

1)50支0.5ml的离心管，每支离心管中装有18μl的RT-LAMP反应液。RT-LAMP反应液包括0.2μM F3和B3，1.6μM FIP和BIP，1M甜菜碱，4mM硫酸镁，1.0mM dNTPs，1×ThermoPol reaction buffer。以上各成分的浓度均为在反应液中的终浓度。RT-LAMP反应液的具体配制方法如下：

5pM的引物F3/B3                    各1μl

20pM的引物FIP/BIP                 各2μl

25mM的dNTPs                       1μl

5M的甜菜碱                        5μl

100mM的硫酸镁                     1μl

10×ThermoPol reaction buffer     2.5μl

DEPC水                            2.5μl

总计                              18μl

2.50μl(250units)AMV反转录酶。

3.50μl(400units)Bst DNA聚合酶(New England Biolabs，USA)。

4.显色剂：125μl 10％的荧光染料SYBR GREEN I。

36份血样品的RT-LAMP检测方法如下：

1.BEFV RNA的提取

取100μl血液，用大连宝生物工程有限公司生产的病毒RNA提取试剂盒(Catrimox-14 RNA Isolation Kit)提取总RNA。

2.RT-LAMP反应体系

RT-LAMP反应液        18μl

AMV反转录酶     1μl(5units)

模板BEFV RNA    5μl

Bst DNA聚合酶   1μl(8units)

总计            25μl

3.RT-LAMP反应程序

将25μl的反应体系在62℃恒温反应1h，然后将温度升至80℃维持2min终止反应。

4.RT-LAMP反应结果判定

将2.5μl显色剂加入反应体系中，若反应液呈现绿色，可判定样品中含有BEFV；若反应液呈现橙色，则判定样品中不含BEFV。另外，取2μl反应液在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，在全自动凝胶成像分析仪内观察电泳结果，若反应产物电泳后呈现清晰的梯度条带判为阳性，否则判为阴性。

用RT-LAMP、RT-PCR和病毒分离三种方法对36份血液样本的检测结果如表1所示。有3份样品LD3、LD10和LX4在三种方法中的检测结果不一致，用RT-LAMP方法检测全为阳性。为了进一步验证是否为假阳性，我们用RT-LAMP方法对这3份样品再次检测，并且同时设置了阳性和阴性对照。阳性对照所用的BEFV RNA模板是从感染了BEFV的BHK-21细胞中提取的，阴性对照所用的RNA模板是从牛血液样品LDN和LXN中提取的，LDN和LXN是在试验牛LD和LX人工接种BEFV感染血前采集的。检测结果显示，样品LD3、LD10和LX4的RT-LAMP反应液和阳性对照的反应液一致，加入显色剂后呈现绿色，而阴性对照样品LDN和LXN的反应液加入显色剂后呈现橙色，这说明样品LD3、LD10和LX4在RT-LAMP方法中的检测结果是正确的，RT-LAMP比RT-PCR和病毒分离有更高的敏感性。

表1 36份血液样品在三种方法中的检测结果

基因序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>用于检测牛流行热病毒的试剂盒及相关方法

<160>4

 

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(上游外引物F3)

 

<400>

tgacagtaag acaaagggat gt                                  22

 

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列(下游外引物B3)

 

<400>

catcctcgaa aatgatgcca t                                   21

 

<210>3

<211>46

<212>DNA

<213>人工序列(上游内引物FIP)

 

<400>

ggacttaact gtaatgcatt cccaggacat ggataccaga tgtgag    46

 

<210>4

<211>44

<212>DNA

<213>人工序列(下游内引物BIP)

 

<400>

atgagacaga gagattgtgg gatccacaaa acgtagacag acat      44

Claims (5)

1.用于检测牛流行热病毒的试剂盒，其特征是试剂盒中至少包括两对用于环介导等温扩增的特异性引物F3、B3、FIP和BIP，其序列如下：

上游外引物F3：5’-tgacagtaagacaaagggatgt-3’

下游外引物B3：5’-catcctcgaaaatgatgccat-3’

上游内引物FIP：5’-ggacttaactgtaatgcattccca-

                   ggacatggataccagatgtgag-3’

下游内引物BIP：5’-atgagacagagagattgtggga-

                   tccacaaaacgtagacagacat-3’

2.如权利要求1所述的用于检测牛流行热病毒的试剂盒，其特征是试剂盒中还有：甜菜碱、硫酸镁、dNTPs、ThermoPol反应缓冲液、AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶。

3.如权利要求2所述的用于检测牛流行热病毒的试剂盒，其特征是试剂盒中还有显色剂SYBR GREEN I。

4.权利要求2所述的试剂盒的使用方法，其特征是：

a.从待检测的牛的静脉采集血样，并在其中加入抗凝血剂；

b.从待测血样中提取RNA；

c.用试剂盒中的RT-LAMP反应液、AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶，以及提取的RNA配制成RT-LAMP反应混合物；

d.用上述RT-LAMP反应混合物进行RT-LAMP反应：将反应混合物在62℃水浴锅中恒温反应1h，然后将温度升至80℃维持2min，终止反应；

e.用RT-LAMP反应产物在2％的琼脂糖凝胶上进行电泳，根据反应产物电泳后能否呈现清晰的梯度条带判定被检样品的阴、阳性。

5.权利要求3所述的试剂盒的使用方法，其特征是：

a.从待检测的牛的静脉采集血样，并在其中加入抗凝血剂；

b.从待测血样中提取RNA；

c.用试剂盒中的RT-LAMP反应液、AMV反转录酶和Bst DNA聚合酶，以及提取的RNA模板配制成RT-LAMP反应混合物；

d.用上述RT-LAMP反应混合物进行RT-LAMP反应：将反应混合物在62℃水浴锅中恒温反应1h，然后将温度升至80℃维持2min，终止反应；

e.在反应产物中加入显色剂，根据反应产物是否呈现绿色判定被测样品的阴、阳性。