CN116411136A - 一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，属于生物技术领域，能够解决现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA‑LFD方法的技术问题。该引物探针组合中的引物分别为BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R，BNoV‑F、BNoV‑R和BRV‑F、BRV‑R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27‑28和SEQ ID NO.53‑54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV‑P和BRV‑P，所述BNoV‑P和BRV‑P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59‑60所示。本发明能够从导致犊牛腹泻的病毒中快速、准确地检测出牛诺如病毒和牛轮状病毒，在39℃较低反应温度下反应时间仅需30min，试纸条结果仅需5min即可完成检测。本发明能够应用于基层现场牛诺如病毒和牛轮状病毒的可视化检测方面。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用。
背景技术
新生犊牛腹泻(Neonatalcalfdiar-rhea，NCD)是断奶前造成犊牛死亡的主要原因之一。肠道病原感染是造成犊牛腹泻的主要原因，而牛诺如病毒(Bovine Norovirus，BNoV)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)是引起犊牛腹泻较常见的病原。其中，诺如病毒(Norovirus，NoV)属于杯装病毒科诺如病毒属，为无囊膜的、单正链RNA病毒，直径27～35nm，正20面体结构，病毒衣壳由90个主要衣壳蛋白的二聚体和1～2个次要结构蛋白组成。BNoV属于GIII型的NoV，BNoV全基因组长约为7.3kb，除鼠诺如病毒(MN oV)外都包含3个开放阅读框(ORF)。犊牛感染BNoV后主要表现为非出血性肠炎、轻度腹泻，腹泻可持续3～4天、短暂性厌食以及木糖吸收不良等症状。其中，3周大的牛比新生犊牛感染BNoV更严重。牛轮状病毒(Bovin e rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科轮状病毒属的无囊膜的、双股RNA病毒，形似车轮的粒子，完整的病毒粒子呈二十面体，直径约65～75nm，外缘光滑。BRV感染主要发生在犊牛，患病犊牛早期表现为精神沉郁、食欲减退、流诞、不愿站立，随后出现严重的厌食和腹泻。此外，BNoV和BRV两者还会发生混合感染，会加重犊牛腹泻的程度，最终会导致生产性能和免疫力低下，饲养以及治疗成本增加，严重制约养牛场的良种选育和扩繁，给养牛业带来了巨大的经济损失。
由于上述两种病毒普遍存在，使得对该病的快速、准确的检测显得尤为重要，及时检出病原，实施针对性治疗方案，挽回财产的损失，故在生产实践中急需要建立适用于基层病原快速检测的方法。目前，常用的检测方法主要有酶联免疫吸附试验(ELISA)、RT-PCR检测技术、荧光定量PCR检测技术以及环介导等温扩增技术(LAMP)等，但这几种方法各有优缺点。其中，RT-PCR和荧光定量PCR灵敏度较高，但流程复杂、耗费时间长、成本高、仅限于实验室操作；LAMP技术无需复杂的仪器，适用于现场检测，但引物设计复杂、严苛，且开盖后容易形成气溶胶污染，假阳性问题较严重。
重组酶介导扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)是一种新型的体外等温核酸扩增技术。37℃恒温下可实现核酸扩增产物的指数增长，不需要高温热变性，一般25min内即能完成扩增反应。目前该技术已经应用于多种病毒和细菌检测。RAA技术可以通过琼脂糖凝胶电泳、实时荧光信号和侧流层析试纸条等不同的方式对RAA结果进行监测。但是，目前还没有双重RAA-LFD法同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒，双重RAA-LFD检测方法能及时快速的检测出牛诺如病毒、牛轮状病毒或二者的混合感染，适用于基层牛场的疾病诊断。
发明内容
本发明针对上述的现有技术中尚无同时用于检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD方法的技术问题，提出一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，通过建立一种双重RAA-LFD技术能同时检测牛诺如病毒、牛轮状病毒或二者的混合感染，以实现对基层养殖环境中对相关病原进行快速、准确的检测。
一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中的引物分别为BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R，所述BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27-28和SEQ ID NO.53-54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV-P和BRV-P，所述BNoV-P和BRV-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59-60所示。
在一实施方式中，所述BNoV-F、BNoV-R是以牛诺如病毒的RdRp基因作为模板设计得到，所述BRV-F、BRV-R是以牛轮状病毒的VP7基因作为模板设计得到；
所述BNoV-R和BRV-R的5’端进行生物素修饰；所述BNoV-P的5’端进行生物素修饰，第30位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰；所述BRV-P的5’端进行生物素修饰，第31位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰。
本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA基础检测试剂盒，包括基础磷酸盐缓冲溶液、乙酸镁溶液、纯化水以及如上述任一实施方式所述的引物探针组合。
本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA-LFD检测试剂盒，包括反应复合缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、酶混合液、乙酸镁溶液以及如上述任一实施方式所述的引物探针组合。
本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条用于检测如上述实施方式所述RAA-LFD检测试剂盒扩增得到的产物，所述侧流层析试纸条包括：样品垫、检测线和质控线，其中，所述检测线进一步包括T1检测线和T2检测线；
所述样品垫含有抗FAM的鼠源单抗，所述T1检测线上标记有链霉亲和素，T2检测线上标记有抗罗丹明的抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗体，并将抗FAM单克隆抗体用作标记胶体金。
本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，包括以下步骤：
提取待检样品的RNA，将如上述任一实施方式所述的引物探针组合与所述待检样品的RNA混合，配置RAA反应体系，并在39℃温度条件下扩增反应15-30min，得到扩增产物；
取扩增产物10μL，加入到90μL的ddH2O进行稀释后滴加到如权利要求5所述侧流层析试纸条的样品垫末端，反应5min即可读取结果，根据结果判断所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒。
在一实施方式中，所述BNoV-R标记罗丹明，所述BRV-R标记生物素；
所述RAA反应体系为：
反应复合缓冲液23.6μL、dNTPs(25mM)0.6μL、BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R各1μL、BNoV-P 0.3μL、BRV-F和标记生物素的BRV-R各2μL、BRV-P 0.6μL、酶混合液12.6μL、乙酸镁溶液2.5μL、待检样品的RNA 3.8μL，总体积50μL。
在一实施方式中，所述BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R的浓度为200nM，所述BNoV-P的浓度为60nM；所述BRV-F和标记生物素的BRV-R的浓度为400nM，所述BRV-P的浓度为120nM。
在一实施方式中，所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒的判断标准为：
当T1检测线、T2检测线和质控线均出现条带时，表明所述待检样品中同时含有牛轮状病毒和牛诺如病毒；
当只有T1检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛轮状病毒，不含牛诺如病毒；
当只有T2检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛诺如病毒，不含牛轮状病毒；
当只有质控线出现条带，检测线没有条带时，表明结果为阴性，即所述待检样品中不含牛轮状病毒和牛诺如病毒，或牛轮状病毒和牛诺如病毒的含量低于RAA-LFD法的检出限；
当检测线和质控线均没有出现条带，表明检测结果无效。
本发明还提供一种引物探针组合或RAA基础检测试剂盒或RAA-LFD检测试剂盒或侧流层析试纸条在同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒中的应用。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，由于RAA技术适用于现场快速检测，同时本发明引入侧向流免疫层析技术，将核酸等温扩增与侧向流试纸条相结合，从而实现牛诺如病毒和牛轮状病毒的快速、准确以及可视化检测，整个检测过程不需要昂贵的仪器，可在较低反应温度(39℃)下进行反应，反应时间仅需30min，侧向流试纸条结果仅需5min便可完成检测，且检测结果可通过肉眼直接观察到，本发明对设备要求低(不需要使用热循环仪器)，检测时间段，更适用于基层检测；
2、本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，基于引物探针组合进行牛诺如病毒和牛轮状病毒目的基因序列的扩增，再将扩增产物滴加到侧流层析试纸条的样品垫末端，只需反应5min即可读取结果，该方法操作简便、反应迅速、对仪器要求简单，借助侧向流试纸条可以对检测结果进行肉眼判读，本发明在牛诺如病毒和牛轮状病毒的现场快速可视化检测方面具有广阔的应用前景；
3、本发明提供一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，该引物探针组合中包含了用于检测牛诺如病毒的上下游引物和探针以及用于检测牛轮状病毒的上下游引物和探针，其中，在设计相关引物时以上述两种病毒的特异性基因作为引物设计的靶点，通过寻找保守序列，根据RAA引物设计原则进行引物设计，再进行三轮筛选试验最终筛选得到最适宜的引物，最终筛选得到的引物探针组合能够很好的应用于上述两种病毒的检测，扩增效率高。
附图说明
图1为本发明实施例1标准质粒构建的质粒电泳结果图，其中，泳道M为DNA MarkerDL500，泳道3、4为BRV质粒电泳结果图，泳道7、8为BNoV质粒电泳结果图；
图2为本发明实施例1标准质粒构建的酶切结果图，其中图A为BNoV质粒酶切鉴定结果图，泳道M为DNA Marker DL15000、泳道M1为DNA Marker DL500，泳道2为BNoV质粒酶切结果图，图B为BRV质粒酶切鉴定结果图，泳道M为DNA Marker DL500、泳道M1为DNA MarkerDL15000，泳道3为BRV质粒酶切结果图；
图3为本发明实施例2中的引物初级筛选结果，其中图A为BNoV引物初级筛选结果图，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～5分别代表阴性对照、F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4，图B为BRV引物初级筛选结果图，泳道M为DNA Marker DL500。泳道1～6分别代表F1/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4、F5/R5、阴性对照；
图4为本发明实施例2中的BNoV引物二级筛选结果，其中图A为BNoV固定上游引物筛选下游引物结果图，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～11分别代表F4/R4(PCR结果)、F4/R4、F4/R4、F4/R4、阴性对照、F4/R5、F04/R06、F04/R07、F04/R08、F04/R09、F04/R010，图B为BNoV上游引物筛选结果，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～8分别代表F4/R4、阴性对照、F5/R4、F6/R9、F7/R9、F8/R9、F9/R9、F10/R9；
图5为本发明实施例2中的BRV引物二级筛选结果图，其中图A为BRV固定上游引物筛选下游引物结果，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～5分别代表F1/R1、F1/R6、F1/R7、F1/R8、F1/R9，泳道7代表阴性对照，图B为BRV上游引物筛选结果，泳道M为DNA MarkerDL500，泳道1～5分别代表F6/R6、F7/R6、F8/R6、F9/R6、阴性对照；
图6为本发明实施例2中的引物三级筛选结果，其中A为BNoV引物筛选结果，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～5分别代表F4/R9、F14/R14、F13/R13、F12/R12、F11/R11，B为BRV引物筛选结果，泳道M为DNA Marker DL500，泳道1～5分别代表F9/R6、F10/R10、F11/R11、F12/R12、F13/R13，6代表阴性对照；
图7为本发明实施例3中单重RAA-LFD反应结果，其中图A为BNoV结果，编号1和2分别代表阳性和阴性，图B为BRV结果，编号1和2分别代表阳性和阴性；
图8为本发明实施例4中单重RAA-LFD敏感性试验结果，其中A为BNoV敏感性分析，将BNoV标准质粒进行倍比稀释，其中1～5分别代表10-3、10-5、10-7、10-8、10-9，6代表阴性对照，B为BRV敏感性分析，将BRV标准质粒进行倍比稀释，其中1～5分别代表10-3、10-5、10-7、10-8、10-9，6代表阴性对照；
图9为本发明实施例4中敏感性试验结果，使用数字微滴式PCR对阳性质控质粒的最低检测线进行验证，其中A为BNoV结果，B为BRV结果；
图10为本发明实施例5中单重RAA-LFD特异性试验结果，其中图A为BNoV特异性分析，以质粒pEASY-BNoV以及牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒核酸为模板进行RAA-LFD检测扩增结果，6代表ddH2O为模板作为空白对照；其中，1代表pEASY-BNoV，结果除pEASY-BNoV质粒有检测线出现，其他样品均无检测线出现，图B为实施例5中的BRV试纸条特异性试验结果图，结论：以质粒pEASY-BRV以及牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒核酸为模板进行RAA-LFD检测扩增结果，6代表ddH2O为模板作为空白对照，其中，1代表pEASY-BRV，结果除pEASY-BRV质粒有检测线出现，其他样品均无检测线出现；
图11为本发明实施例6中荧光标记物交叉反应，其中A为BNoV选择了TAM荧光标记进行交叉实验。其中，1和2是TAM标记的试纸条，3和4是Biotin标记的试纸条；1和3为阳性扩增，2和4为阴性扩增；B为BRV选择了Biotin荧光标记进行交叉实验；其中，1和2是TAM标记的试纸条，3和4是Biotin标记的试纸条；1和3为阳性扩增，2和4为阴性扩增；
图12为本发明实施例6中的双重RAA-LFD的引物和探针浓度的优化，其中A为引物浓度优化，牛诺如病毒引物浓度为200nM，编号1～4分别为牛轮状病毒的引物浓度200nM、300nM、400nM和500nM，编号5为阴性对照。其中B为探针浓度优化，牛诺如病毒引物浓度为60nM，编号1～4分别为牛轮状病毒的引物浓度30nM、60nM、120nM和180nM，编号5为阴性对照；
图13为本发明实施例6中双重RAA-LFD反应时间的优化，编号1～6分别为5min、10min、15min、20min、25min、30min，编号7为阴性对照；
图14为本发明实施例6中双重RAA-LFD反应温度的优化，编号1为阴性对照，编号，2～7分别为37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃；
图15为本发明实施例7中的双重RAA-LFD敏感性试验，编号1为阴性对照，编号2～6分别为10-3、10-5、10-7、10-8、10-9质粒浓度；
图16为本发明实施例8中的双重RAA-LFD特异性试验，编号1为双重RAA-LFD结果，编号2为阴性对照，编号3为BRV阳性，编号4为BNoV阳性，编号5～8为其他样本。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，所述引物探针组合中的引物分别为BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R，所述BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27-28和SEQ ID NO.53-54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV-P和BRV-P，所述BNoV-P和BRV-P的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.59-60所示。
上述实施例提供一种用于同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，在设计相关引物时以上述两种病毒的特异性基因作为引物设计的靶点，即，BNoV-F、BNoV-R是以牛诺如病毒的RdRp基因作为设计靶点，BRV-F、BRV-R是以牛轮状病毒的VP7基因作为设计靶点，通过寻找保守序列，根据RAA引物设计原则进行引物设计，再进行三级筛选试验最终筛选得到最适宜的引物，最终筛选得到的引物探针组合能够很好的应用于上述两种病毒的检测，扩增效率高。
其中，BNoV-R和BRV-R的5’端进行生物素修饰；所述BNoV-P的5’端进行生物素修饰，第30位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰；所述BRV-P的5’端进行生物素修饰，第31位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰
进一步的，上述三级筛选的筛选标准如下，具体的筛选过程参见实施例2：
(1)初级筛选：筛选不同的结合位点找扩增效率高的；
(2)二级筛选：在初级筛选出的最佳引物的周围，以一个1bp的量左右平移，从而产生不同的引物，用于筛选更好的引物组合；
(3)三级筛选：本次筛选以二级筛选的最佳引物为基础，以一个1bp的量增加或较少引物长度，从而产生不同的引物，用于筛选更好的引物组合。
本发明实施例提供了一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA基础检测试剂盒，包括基础磷酸盐缓冲溶液、乙酸镁溶液、纯化水以及如上述任一实施例所述的引物探针组合。
本发明实施例提供了一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA-LFD检测试剂盒，包括反应复合缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、酶混合液、乙酸镁溶液以及如上述任一实施例所述的引物探针组合。
本发明实施例提供了一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的侧流层析试纸条，所述侧流层析试纸条用于检测如上述实施例所述RAA-LFD检测试剂盒扩增得到的产物，所述侧流层析试纸条包括：样品垫、检测线和质控线，其中，所述检测线进一步包括T1检测线和T2检测线；
所述样品垫含有抗FAM的鼠源单抗，所述T1检测线上标记有链霉亲和素，T2检测线上标记有抗罗丹明的抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗体，并将抗FAM单克隆抗体用作标记胶体金。
本发明实施例提供了一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，包括以下步骤：
S1、提取待检样品的RNA，将如上述实施例所述的引物探针组合与所述待检样品的RNA混合，配置RAA反应体系，并在39℃温度条件下扩增反应15-30min，优选39℃温度条件下扩增反应15min，得到扩增产物；
S2、取扩增产物10μL，加入到90μL的ddH2O进行稀释后滴加到如上述实施例所述侧流层析试纸条的样品垫末端，反应5min即可读取结果，根据结果判断所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒。
在一具体实施方式中，所述BNoV-R标记罗丹明，所述BRV-R标记生物素；
所述RAA反应体系为：
反应复合缓冲液23.5μL、dNTPs(25mM)0.6μL、BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R各1μL、BNoV-P 0.3μL、BRV-F和标记生物素的BRV-R各2μL、BRV-P 0.6μL、酶混合液12.6μL、乙酸镁溶液2.5μL、待检样品的RNA 3.8μL，总体积50μL。
在一具体实施方式中，所述BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R的浓度为200nM，所述BNoV-P的浓度为60nM；所述BRV-F和标记生物素的BRV-R的浓度为400nM，所述BRV-P的浓度为120nM。
在一具体实施方式中，所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒的判断标准为：
当T1检测线、T2检测线和质控线均出现条带时，表明所述待检样品中同时含有牛轮状病毒和牛诺如病毒；
当只有T1检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛轮状病毒，不含牛诺如病毒；
当只有T2检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛诺如病毒，不含牛轮状病毒；
当只有质控线出现条带，检测线没有条带时，表明结果为阴性，即所述待检样品中不含牛轮状病毒和牛诺如病毒，或牛轮状病毒和牛诺如病毒的含量低于RAA-LFD法的检出限；
当检测线和质控线均没有出现条带，表明检测结果无效。
本发明实施例还提供了一种引物探针组合或RAA基础检测试剂盒或RAA-LFD检测试剂盒或侧流层析试纸条在同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒中的应用。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合、试剂盒及其应用，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
本实施例提供一种pEASY-BNoV、pEASY-BRV的标准质粒的构建方法，具体为：
根据Gen Bank中登录的BNoV和BRV基因序列进行分析和比对，结合相关文献筛选出BNoV和BRV基因组中保守序列(扩增保守序列所用的引物见表1)，提取病毒RNA并进行反转录，以基因组cDNA为模板扩增基因组中保守序列，并将扩增产物纯化后按照pEASY-T1Cloning Kit说明克隆到pEASY-T1载体上，按照OMEGA质粒小量提取试剂盒说明书将10mL菌液提取质粒。重组质粒经测序鉴定正确后，命名为pEASY-BNoV和pEASY-BRV，测定其浓度并计算拷贝数，作为RAA阳性标准品。
(1)病毒基因组RNA的提取：
使用TIANGEN病毒基因组RNA提取试剂盒提取牛诺如病毒(BNoV)阳性样本和牛轮状病毒(BRV)阳性样本，操作步骤按照说明书进行；
(2)反转录：
反转录体系为20μL，体系为：5×Mutiscript II MMLV buffer 4μL，dNTP mix0.4μL，Mutiscript II MMLV Reverse Transcriptase 1μL，RNase inhibitor 0.12μL，上下游引物(20μM)各0.5μL，待测RNA2μL，ddH2O 11.48μL；反应程序为25℃反应5min，50℃反应15min，85℃反应5min，反应结束后得到cDNA；
表1载体克隆引物序列
注释：表1中的引物序列仅用于载体克隆。
(3)RT-PCR反应：
以步骤(2)所得cDNA为模板，进行PCR反应，反应体系25μL，反应体系如下：上游引物(20μM)0.5μL，下游引物(20μM)0.5μL，2^×Easytaq PCR SuperMix 12.5μL，Nuclease-free Water 9.5μL，cDNA为模板加2μL；
反应程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，64℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃终延伸5min；扩增结束后，制备1％的琼脂糖凝胶板，凝胶板的边孔中加入DNAMarker将PCR反应产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中；在110V恒定电压下电泳20min，电泳结束后用凝胶成像系统进行结果分析并拍照；
(4)PCR产物纯化：
使用OMEGA产物纯化试剂盒，对扩增产物进行纯化。产物纯化后，制备1％的琼脂糖凝胶板，凝胶板的边孔中加入DNA Marker将纯化产物按编号依次加入到对应的凝胶板的胶孔中。在110V恒定电压下电泳20min，电泳结束后用凝胶成像系统进行结果分析并拍照。
(5)目的基因的克隆：
将步骤(4)纯化的产物分别与载体pEASY-T1连接，连接体系为：pEASY-T1 CloningVector 1μL，PCR纯化产物4μL，连接参数为25℃，30min；将连接产物转化进入感受态细胞pEASY-T1中，具体方法为：
a.将5μL连接产物加入刚解冻的50μL pEASY-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min；
b.42℃水浴热激30s，立即至于冰上2min；
c.加250μL平衡至室温的LB培养基，200rmp、37℃培养1h；
d.将250μL菌液均匀地涂在含氨苄霉素的LB固体培养基上，在37℃培养箱中过夜培养；
e.以克隆菌为模板，进行菌液PCR鉴定，其中，反应体系25μL，反应体系如下：
上游引物(20μM)0.5μL，下游引物(20μM)0.5μL，2^×Easytaq PCR SuperMix 12.5μL，Nuclease-free Water 9.5μL，菌液为模板加2μL；
反应程序为94℃，3min；94℃，30s，64℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，5min；反应结束后参照步骤(3)进行琼脂糖凝电泳检测。对确定为含有阳性重组质粒的克隆菌进行质粒提取，具体操作步骤按照质粒提取试剂盒进行，得到阳性重组质粒pEASY-BNoV、pEASY-BRV。以提取的质粒取5μL电泳，一般呈现2～3个条带。
鉴定结果见图1，再进一步对提取的质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图2A和图2B。测序正确的重组质粒命名为pEASY-BNoV和pEASY-BRV，用紫外分光光度计测定重组质粒的浓度，按照下列公式计算拷贝数：
实施例2
本实施例提供一种BNoV、BRV的RAA实验引物对和探针设计、筛选及优化方法，具体为：
从GenBank网站上下载牛诺如病毒的特异性基因(RdRp基因)和牛轮状的特异性基因(VP7基因)序列作为引物设计的靶点，用DNAMAN寻找其保守序列，根据RAA引物设计原则用NCBI Primer-BLAST设计引物，进行筛选，引物探针序列如下表2和表3。
表2BNoV引物序列(待筛选)
表3BRV引物序列(待筛选)
主要操作步骤如下：
RAA基础反应体系按照说明书操作(RAA核酸扩增试剂盒，武汉当康兴众)。按RAA试剂盒要求构建反应体系50μL，其中RAA反应预混液35μL、上下游引物(20μM)各1.05μL、DNA模板2μL、DEPC水10.1μL、最后加乙酸镁0.8μL，扩增条件为39℃反应30min，结合2％琼脂糖凝胶电泳对不同引物的扩增效率进行分析，筛选出最优的引物对。
为进一步提高RAA的扩增效率，需要对所设计的引物进行三级筛选，以选择最佳引物对，三级筛选试验包括：
初级筛选：筛选不同的结合位点找扩增效率高的，初级筛选出BNoV-F4/R4、BRV-F1/R1(初级筛选结果见图3)；
二级筛选：在初级筛选出的最佳引物的周围，以一个1bp的量左右平移，从而产生不同的引物，用于筛选更好的引物组合，二级筛选出BNoV-F4/R9、BRV-F9/R6(二级筛选结果见图4、图5)；
三级筛选：本次筛选以二级筛选的最佳引物为基础，以一个1bp的量增加或较少引物长度，从而产生不同的引物，用于筛选更好的引物组合，三级筛选出BNoV-F12/R12、BRV-F11/R11作为最终扩增引物(三级筛选结果见图6)。
实施例3
本实施例提供一种单重RAA-LFD反应体系的建立方法，具体为：
将实施例2中三级筛选得到的引物进行标记，即对BNoV-R(对应实施例2的BNoV-R12)和BRV-R(对应实施例2的BRV-R11)的5′端标记生物素(Biotin)，对探针BNoV-P和BRV-P标记羧基荧光素(6-FAM)，引物探针序列见表4。按RAA-LFD试剂盒要求构建反应体系25μL，反应体系见表5：
表4 RAA-LFD检测方法最佳引物及探针核苷酸序列
表5 RAA-LFD反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| 反应复合缓冲液 | 12.5μL |
| dNTPs(25mM) | 0.3μL |
| 上游引物(10μM) | 1μL |
| 下游引物(10μM) | 1μL |
| DNA模板 | 1.9μL |
| 乙酸镁溶液 | 1.3μL |
| 酶混合液 | 6.3μL |
| 探针(10μM) | 0.3μL |
| ddH2O | 0.4μL |
| 总体积 | 25μL |
混合后将反应液离心至管底，立即放入恒温设备中39℃孵育30min，反应结束后，将吸取10μL的RAA反应产物加90μL ddH2O，混匀后，吸取50μL稀释后的产物直接滴加在样品垫上，10min后观察质控线与检测线判读结果，结果见图7，表明单重RAA-LFD方法成功建立。
实施例4
本实施例提供一种单重的RAA-LFD的敏感性分析，具体为：
利用质粒提取试剂盒提取实施例1制得的pEASY-BNoV和pEASY-BRV阳性重组质粒，测定其浓度分别为5.27×1010copies/uL、1.12×1010copies/uL。
(1)牛诺如病毒RAA-LFD反应灵敏度分析，步骤如下：
将构建的阳性标准品(pEASY-BNoV)10倍比稀释，选择10-3、10-5、10-7、10-8、10-9质粒浓度，设ddH2O为阴性对照，进行RAA-LFD反应，反应结束后采用侧流层析试纸条检测扩增产物，结果表明BNoV的RAA-LFD的敏感性为10-8copies/uL(参见图8A)。
(2)牛轮状病毒RAA-LFD反应灵敏度分析，步骤如下：
将构建的阳性标准品(pEASY-BRV)10倍比稀释，选择10-3、10-5、10-7、10-8、10-9质粒浓度，设ddH2O为阴性对照，进行RAA-LFD反应，反应结束后采用侧流层析试纸条检测扩增产物，结果表明BRV的RAA-LFD的敏感性为10-8copies/uL(参见图8B)。
使用数字微滴式PCR对阳性质控质粒的最低检测线进行验证，因BNoV和BRV是RNA病毒，所以要去除逆转录酶带来的扩增效率，进行BNoV和BRV的体外转录。如图9A所示，使用ddPCR检测BNoV mRNA最低限度值的实验结果为1.90×101copies/μL；如图9B所示，使用ddPCR检测BRV mR NA最低限度值的实验结果为5.50×101copies/μL；综上所述，使用ddPCR进行绝对值定量比阳性质控质粒的灵敏度高。
实施例5
本实施例提供一种单重RAA-LFD的特异性分析，具体为：
(1)牛诺如病毒RAA-LFD反应特异性分析，步骤如下：
以pEASY-BNoV、BCoV、BRV、BVDV、IBRV质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行特异性反应，结果除pEASY-BNoV质粒在试纸条上有检测线出现，其他样品无检测线出现(结果见图10A)。
(2)牛轮状病毒RAA-LFD反应特异性分析，步骤如下：
以pEASY-BRV、pEASY-BCoV、pEASY-BNoV、pEASY-BVDV、pEAS Y-IBRV质粒为模板，ddH2O为阴性对照进行特异性反应，结果除pEASY-BR V质粒在试纸条上有检测线出现，其他样品无检测线出现(结果见图10B)。
实施例6
本实施例提供一种双重RAA-LFD反应体系的建立及优化方法，具体为：
(1)标记物交叉反应：
选择了Biotin和TAM两种荧光标记进行实验。其中，FAM单克隆抗体用作标记胶体金。牛诺如病毒和牛轮状病毒下游RAA引物均分别标记TAM和Biotin。使用提取的质粒作为模板进行单重RAA-LFD标记物交叉反应的实验。39℃恒温条件下，扩增30min；使用侧流层析试纸条检测扩增产物，看两种标记物之间是否会有交叉反应，结果无交叉反应(结果参见图11)。
(2)双重RAA-LFD反应体系的建立：
BNoV下游引物标记罗丹明(TAM)，BRV下游引物标记生物素(Biotin)，构建50μL初始双重RAA-LFD反应体系(结果参见表6)，反应程序为39℃，孵育30min。
表6初始双重RAA-LFD反应体系
| 组分 | 体积(μL) |
| 反应复合缓冲液 | 25μL |
| dNTPs(25mM) | 0.6μL |
| 上游引物(10μM) | 2μL(两条引物各1μL) |
| 下游引物(10μM) | 2μL(两条引物各1μL) |
| DNA模板 | 3.8μL(两种病毒模板各1.9μL) |
| 乙酸镁溶液 | 2.5μL |
| 酶混合液 | 12.6μL |
| 探针(10μM) | 0.6μL(两条探针各0.3μL) |
| ddH2O | 0.9μL |
| 总体积 | 50μL |
(3)双重RAA-LFD引物探针浓度的优化：
根据预实验的结果进行调配，预实验中发现牛诺如病毒的扩增效率较高，基于预实验的结果，将牛诺如病毒的引物组终浓度调整为200nM，探针浓度调整为60nM，将牛轮状病毒引物组终浓度设置为200nM、300nM、400nM和500nM四个梯度，通过侧流层析试纸条分析结果，确定双重RAA扩增两组引物的最佳浓度比例。探针浓度选取终浓度为30nM、60nM、120nM和180nM四个梯度进行探针浓度的筛选，确定双重RAA扩增两组探针的最佳浓度比例。
试验结果分析：结果表明(参见图12)牛诺如病毒的引物浓度为200nM、探针浓度为60nM；牛轮状病毒的引物浓度为400nM，探针浓度为120nM为最佳反应。
(4)双重RAA-LFD反应时间的优化：
设置5min、10min、15min、20min、25min、30min共6个时间梯度进行双重RAA-LFD反应，根据优化的双重RAA-LFD反应体系(参照表6进行)和优化的反应参数进行反应。反应结束后采用侧流层析试纸条检测扩增产物，结果表明BNoV和BRV的双重RAA-LFD的最佳反应时间为15min(结果参见图13)。
(5)双重RAA-LFD反应温度的优化：
根据试剂盒中重组酶的最适反应温度在37～42℃之间，所以37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃共6个温度梯度进行双重RAA-LFD反应，根据优化的双重RAA-LFD反应体系(参照表6进行)和反应参数进行反应。反应结束后采用侧流层析试纸条检测扩增产物，结果表明BNoV和BRV的双重RAA-LFD的最佳反应温度为39℃(结果参见图14)。
双重RAA-LFD反应体系的建立及优化完成后，优化后的反应体系如表7所示，优化后的反应时间和温度为15min，39℃。
表7优化后的双重RAA-LFD反应体系
实施例7
本实施例提供一种双重RAA-LFD的敏感性分析，具体为：
利用质粒提取试剂盒提取实施例1制得的pEASY-BNoV和pEASY-BRV阳性重组质粒，测定其浓度分别为5.27×1010copies/uL、1.12×1010copies/uL。用RNase Free ddH2O两种阳性重组质粒将连续10倍倍比稀释，选择10-3、10-5、10-7、10-8、10-9质粒浓度，设ddH2O为阴性对照，进行双重RAA-LFD反应，反应结束后采用侧流层析试纸条检测扩增产物。
试验结果分析：通过分析图15可知，BNoV和BRV的双重RAA-LFD的敏感性分别为10- 7copies/uL。
实施例8
本实施例提供一种双重RAA-LFD的特异性分析，具体为：
利用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取阳性牛诺如病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的核酸进行双重RAA-LFD反应。在双重RAA-LFD反应体系中分别加入两种阳性病毒模板、一种阳性病毒模板，进行RAA-LFD扩增，扩增结果使用侧流层析试纸条进行分析，验证其特异性。
试验结果分析：通过分析图16可知，BNoV和BRV的双重RAA-LFD具有良好的特异性。
实施例9
本实施例提供一种实际临床样本的检测应用，具体为：
利用本发明所建立的双重RAA-LFD检测方法，检测从牛场采集的疑似腹泻的肛拭子样品168份，使用RNA提取试剂盒(Simpiy P Total RNA Extraction Kit)提取送检肛拭子样品的核酸。使用提取的RNA为模板，然后利用优化后的反应体系和反应参数进行双重RAA-LFD反应，反应结束后，将吸取10μL的RAA扩增产物加90μL ddH2O，混匀后，吸取50μL溶液直接滴加在侧流层析试纸条，10min后观察质控线与检测线判读结果，并与普通PCR和实时荧光定量PCR做比较。
表8临床样品检测结果
以上实施例说明利用本发明所提供的双重RAA-LFD方法可以实现对牛诺如病毒和牛轮状病毒简便、快速、特异、可视化的检测。该方法对仪器设备要求低，不需要使用热循环仪器，可适用于在基层现场的可视化检测。
Claims (10)
1.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合中的引物分别为BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R，所述BNoV-F、BNoV-R和BRV-F、BRV-R的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.27-28和SEQ ID NO.53-54所示，所述引物探针组合中的探针为BNoV-P和BRV-P，所述BNoV-P和BRV-P的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.59-60所示。
2.根据权利要求1所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的引物探针组合，其特征在于，所述BNoV-F、BNoV-R是以牛诺如病毒的RdRp基因作为模板设计得到，所述BRV-F、BRV-R是以牛轮状病毒的VP7基因作为模板设计得到；
所述BNoV-R和BRV-R的5’端进行生物素修饰；所述BNoV-P的5’端进行生物素修饰，第30位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰；所述BRV-P的5’端进行生物素修饰，第31位碱基被四氢呋喃替代，3’端进行亚磷酰胺修饰。
3.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA基础检测试剂盒，其特征在于，包括基础磷酸盐缓冲溶液、乙酸镁溶液、纯化水以及如权利要求1或2所述的引物探针组合。
4.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的RAA-LFD检测试剂盒，其特征在于，包括反应复合缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、酶混合液、乙酸镁溶液以及如权利要求1或2所述的引物探针组合。
5.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的侧流层析试纸条，其特征在于，所述侧流层析试纸条用于检测如权利要求4所述RAA-LFD检测试剂盒扩增得到的产物，所述侧流层析试纸条包括：样品垫、检测线和质控线，其中，所述检测线进一步包括T1检测线和T2检测线；
所述样品垫含有抗FAM的鼠源单抗，所述T1检测线上标记有链霉亲和素，T2检测线上标记有抗罗丹明的抗体，所述质控线含有羊抗鼠抗体，并将抗FAM单克隆抗体用作标记胶体金。
6.一种同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取待检样品的RNA，将如权利要求1或2所述的引物探针组合与所述待检样品的RNA混合，配置RAA反应体系，并在39℃温度条件下扩增反应15-30min，得到扩增产物；
取扩增产物10μL，加入到90μL的ddH2O进行稀释后滴加到如权利要求5所述侧流层析试纸条的样品垫末端，反应5min即可读取结果，根据结果判断所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒。
7.根据权利要求6所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，所述BNoV-R标记罗丹明，所述BRV-R标记生物素；
所述RAA反应体系为：
反应复合缓冲液23.5μL、dNTPs(25mM)0.6μL、BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R各1μL、BNoV-P 0.3μL、BRV-F和标记生物素的BRV-R各2μL、BRV-P 0.6μL、酶混合液12.6μL、乙酸镁溶液2.5μL、待检样品的RNA 3.8μL，总体积50μL。
8.根据权利要求6所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，所述BNoV-F和标记罗丹明的BNoV-R的浓度为200nM，所述BNoV-P的浓度为60nM；所述BRV-F和标记生物素的BRV-R的浓度为400nM，所述BRV-P的浓度为120nM。
9.根据权利要求6所述的同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒的双重RAA-LFD检测方法，其特征在于，所述待检样品中是否含有牛诺如病毒和/或牛轮状病毒的判断标准为：
当T1检测线、T2检测线和质控线均出现条带时，表明所述待检样品中同时含有牛轮状病毒和牛诺如病毒；
当只有T1检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛轮状病毒，不含牛诺如病毒；
当只有T2检测线和质控线出现条带时，表明所述待检样品中含有牛诺如病毒，不含牛轮状病毒；
当只有质控线出现条带，检测线没有条带时，表明结果为阴性，即所述待检样品中不含牛轮状病毒和牛诺如病毒，或牛轮状病毒和牛诺如病毒的含量低于RAA-LFD法的检出限；
当检测线和质控线均没有出现条带，表明检测结果无效。
10.一种权利要求1或2所述的引物探针组合或权利要求3所述的RAA基础检测试剂盒或权利要求4所述的RAA-LFD检测试剂盒或权利要求5所述的侧流层析试纸条在同时检测牛诺如病毒和牛轮状病毒中的应用。
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