CN107227375B - 五指毛桃的rpa快速鉴定方法及鉴定用rpa引物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及五指毛桃的RPA快速鉴定方法及鉴定用RPA引物，具体涉及一种食药同源五指毛桃的鉴定方法；此外本发明还涉及鉴定五指毛桃的特异性RPA引物。本发明旨在鉴别药食同源的广东道地药材五指毛桃真伪，通过设计特异性的RPA引物，优化RPA反应条件，并结合样品DNA快速提取方法，以达到快速、准确的鉴定五指毛桃药材真伪的目的。

Description

五指毛桃的RPA快速鉴定方法及鉴定用RPA引物

技术领域

本发明涉及植物类食品或药材真伪鉴定技术领域，具体涉及一种食药同源五指毛桃的鉴定方法。

背景技术

中药鉴定是中药研究工作的基础和前提，直接关系到中药各项研究工作的结论和临床疗效。其任务是鉴定中药的真、伪、优、劣，整理中药复杂品种，寻找和扩大新药源。传统的中药鉴定方法主要包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定四大类，各种方法均有其特点和适用对象，有时候还需要几种方法配合才能完成对一种中药材的准确鉴定。目前传统的鉴定方法，存在在不同程度的局限性，如主观性强、稳定性和重复性差等。近年，DNA分子标记技术的兴起，为中药的快速和准确鉴定带来了新的契机。随着RFLP，RAPD，DNA条形码(DNA barcoding)等分子标记技术研究的不断深入，中药的质量评价也迎来了一次新的技术革命。虽然这些技术的发展为物种的快速鉴定提供了分子水平的精细分类学标准，使药材的准确、快速鉴定成为可能，但是DNA分子标记技术都涉及到PCR过程：(1)必须依赖热循环仪(如PCR仪)对解链、退火、延伸等过程进行温度控制(2)实验操作步骤复杂，扩增时间较长，通常扩增时间需要至少2-3小时，甚至1-2天；(3)对待测物种DNA模板质量要求高。因此，探索出一种准确、快速、可靠的鉴别中药材的方法就非常有必要。

重组酶聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)技术是近10年发展起来的一种新型的在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。该技术在37℃-39℃恒温下，利用重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的复合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding,SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链。反应产物呈指数级增长，通常在，15min内即完成扩增，整个反应过程无需特殊的辅助仪器(如核酸扩增仪)，对操作人员的要求也不高，具备简单、节能、快速等特点，因为不需要高温循环，所以特别适合中药材大量样品的快速检测。目前，RPA技术已广泛应用于各种病毒、细菌、转基因物种等方面的检测，因此该发明技术在中药材快速鉴别的实践具有广阔的应用前景，本发明即采用RPA技术进行五指毛桃快速鉴别。若把该技术引入到法医鉴定、临床诊断、海关违禁生物检测、企业质检等领域，同样也具有明显的实用价值。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种五指毛桃的RPA快速鉴定方法。

本发明一个方面提供一种五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物，其序列为

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2。

本发明另一个方面提供了提供五指毛桃鉴定方法，其包括如下步骤：

将待测样品以权利要求1所述的RPA特异性引物组合物进行重组酶聚合酶扩增，检测扩增产物。

在本发明的技术方案中，待测样品的制备方法为粉碎样品后加入提取缓冲液混匀；煮沸后取出，加入0.1mol/L Tris–HCl，离心后取上清得到待测样品。

在本发明的技术方案中，扩增反应的温度为27℃-52℃，优选为37℃-42℃。

在本发明的技术方案中，扩增反应的时间为15分钟以上。

在本发明的技术方案中，待测样品的临界最低浓度为10^-2ng/μL

本发明另一个方面提供了一种检测五指毛桃的试剂盒，其包含五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物，所述五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物序列为

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2。

本发明再一个方面提供了本发明所述的五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物在制备鉴定五指毛桃的试剂盒中的用途。

本发明的另一个目的是优化五指毛桃RPA快速鉴定方法的扩增条件。以解决快速、准确、可靠的用RPA技术鉴定五指毛桃的真伪。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

(1)RPA特异性引物设计：一种用于五指毛桃的RPA快速鉴定的特异性引物，其主要特点是上下游引物长度均为30bp，序列如下：

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2

(2)样品DNA的提取

(3)采用步骤(1)设计的特异性引物进行RPA检测。

步骤(2)具体为：取药材粉末约5mg，加入PCR管中，加入提取缓冲液(0.5mol/LNaOH,1％PVP和1％Triton X 100)20μl，使用漩涡振荡器振荡10second混匀；煮沸10second，取出；加入0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)80μl，轻微漩涡混匀；300×g下离心5min；取上清用于RPA反应。

步骤(3)中，所述RPA鉴定的反应体系为50μl，包括上下游引物(10μM)各2.4μl，Rehydration Buffer 29.5μl，DNA模板2μl，启动反应液乙酸镁(280mM)2.5μl，超纯水补至50μl。

步骤(3)中，所述RPA鉴定的反应程序：恒温37-42℃，15min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明(1)摆脱了PCR过程中必须依赖热循环仪(如PCR仪)对解链、退火、延伸等过程进行温度控制，只需在恒温下(37-42℃)进行扩增反应；(2)实验操作步骤简单，扩增时间短(15min)；(3)检测灵敏度高。本发明提供了一种快速、准确鉴定五指毛桃的方法，为中药质量控制、临床用药安全提供保障，同时为中药快速、现场鉴别提供新思路以及新方法。该方法也可引入到法医鉴定、临床诊断、海关违禁生物检测、企业质检等领域，为其提供技术支持，也具有明显的实际应用价值。

附图说明

图1A-图1B分别为五指毛桃(广东肇庆鼎湖山样品WZS-2)RPA反应扩增温度和扩增时间优化电泳图

图1A中泳道1和9为maker，泳道2-7为扩增温度梯度：22℃,27℃,32℃,37℃,42℃,47℃,52℃。

图1B中泳道9为maker，泳道1-8为扩增时间梯度：5min,10min,15min,20min,30min,40min,50min,60min。

图2A-图2B分别为五指毛桃RPA反应特异性和灵敏度实验

图2A为五指毛桃RPA反应特异性实验图，其中泳道1和12为maker，泳道2-6为5个不同产地五指毛桃(粗叶榕)样品：广东从化(WZS-1)、广东肇庆鼎湖山(WZS-2)、广东广州华南植物园(WZS-3)、广东梅州大浦(WZS-4)、广东广州火炉山(WZS-5)；泳道7-9为极简榕样品：海南万宁(GW-1)、海南定安(GW-2)、海南海口(GW-3)；泳道10-11为钩吻(断肠草)样品：广东从化(GW-4)、广东肇庆鼎湖山(GW-5)。

图2B中为五指毛桃(广东肇庆鼎湖山样品WZS-2)RPA反应灵敏度检测实验图，其中泳道8为maker，泳道1-7为样品浓度梯度：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。

图3五个不同产地的10份五指毛桃药材RPA真伪鉴结果图

图3中泳道1和12为maker，泳道2-11分别为5个药材产地的五指毛桃药材样品：福建沙县(Sha-1)、福建沙县(Sha-2)、江西井冈山(JX-1)、江西井冈山(JX-2)、广东鼎湖山(DHS-1)、广东鼎湖山(DHS-2)、福建宁德(ND-1)、福建宁德(ND-2)、海南万宁(WN-1)、海南万宁(WN-1)。

具体实施方案

以下将参照附图，对本发明的RPA反应扩增条件、引物的特异性和灵敏度以及市售药材真伪鉴别进行描述。

实施例1.RPA特异性引物设计

针对植物进化上较不保守的核基因内转录间隔区(ITS)，利用NCBI中核酸序列数据库，扩增五指毛桃原植物粗叶榕、断肠草原植物钩吻的ITS片段并测序，用MEGA5.0软件对全部序列进行比对，寻找粗叶榕ITS特异性变异位点区域，针对粗叶榕(GeneBankaccession NO.JQ773900)ITS序列，根据RPA引物设计原则设计一对特异性引物(扩增产物片段大小为412bp)：

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2

实施例2.样品DNA快速提取

取药材粉末约5mg，加入PCR管中，加入提取缓冲液(0.5mol/L NaOH,1％PVP和1％Triton X 100)20μl，使用漩涡振荡器振荡10second混匀；煮沸10second，取出；加入0.1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)80μl，轻微漩涡混匀；300×g下离心5min；取上清用于RPA反应。

实施例3.五指毛桃RPA快速鉴定的扩增反应条件优化

1)RPA反应扩增温度优化

扩增反应使用英国TwistDX公司生产的TwistAmp Basic试剂盒，根据TwistDxmanual按照下述配方配制RPA反应溶液：

将上述试剂加入一个PCR管中，摇匀。将上述的47.5μl反应液移至试剂盒中的反应管中，混匀，使其中的白色状物体完全混悬。加入2.5μl Mg+(280nM)，混匀。反应开始启动。实验中使用的模板为样品WZS-2，设定温度梯度：22℃,27℃,32℃,37℃,42℃,47℃,52℃，RPA反应时间参考TwistDx manual，设定为40min。待反应完成后进行琼脂糖(1.5％)电泳检测。

RPA产物检测结果如附图1A：结果显示，可实现扩增的RPA反应温度范围为27℃-52℃，反应的最佳温度范围为37℃-42℃。同时RPA反应在常温(27℃)条件下也可实现扩增(图1A)。

2)RPA反应扩增时间优化

RPA反应液的配置与(1)相同，在最佳温度范围下的实验条件下(37℃-42℃)，选用38℃作为温度条件来优化RPA的反应时间。

琼脂糖凝胶电泳检测结果如附图1B：扩增反应在进行到15分钟的时候，便出现扩增信号。扩增时间在15分钟到60分钟的范围内均可扩增出单一且稳定的条带，本实验表明RPA反应的最短时间是15分钟(图1B)。

实施例4.五指毛桃RPA鉴定引物的特异性和灵敏度实验

1)特异性实验

对5个不同产地五指毛桃(粗叶榕)5份样品：广东从化(WZS-1)、广东肇庆鼎湖山(WZS-2)、广东广州华南植物园(WZS-3)、广东梅州大浦(WZS-4)、广东广州火炉山(WZS-5)；2个产地的极简榕样品：海南万宁(GW-1)、海南定安(GW-2)、海南海口(GW-3)；2个产地的钩吻(断肠草)样品：广东从化(GW-4)、广东肇庆鼎湖山(GW-5)共计10个样品采用快速提取法提取DNA，经检测，10个样品的DNA浓缩范围为40到50ng/μL，OD260/OD280值均为1.8左右。以此为模板验证所设计的RPA引物的特异性。RPA反应液的配置同实施例3中的1)。扩增温度设定为37℃，扩增时间仍然为40min。

特异性实验电泳检测结果如附图2A，结果显示，5份五指毛桃样品出现稳定地阳性扩增，产物大小为412bp。而钩吻样品无扩增条带，说明所设计的RPA引物具有较高的特异性。(图2A)

2).灵敏度检测实验

选取样品五指毛桃样品WZS-2的基因组DNA作为模板，经紫外分光光度计检测其起始浓度为46.8ng/μL，对样品浓度进行稀释，设置浓度梯度：10⁰、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6。

灵敏度检测实验结果如附图2B，当把模板原液稀释至100时(10^-2ng/μL)仍然可以扩增检测到，这就表明了该RPA实验临界浓度最低值是为10^-2ng/μL(图2B)，实验也表明RPA反应具有较高的灵敏度。

实施例5.市售五指毛桃药材样品的RPA真伪鉴定

采用快速DNA提取方法提取来自5个产区的10份五指毛桃药材：福建沙县(Sha-1)、福建沙县(Sha-2)、江西井冈山(JX-1)、江西井冈山(JX-2)、广东鼎湖山(DHS-1)、广东鼎湖山(DHS-2)、福建宁德(ND-1)、福建宁德(ND-2)、海南万宁(WN-1)、海南万宁(WN-1)。经紫外分光光度计检测，样品浓度为30-50ng/μl，OD260/OD280值均为1.8左右。以此为模板，进行药材真伪鉴定。

RPA反应溶液如下：

将上述试剂加入一个PCR管中，摇匀。将上述的47.5μl反应液移至TwistAmp Basic试剂盒反应管中，混匀，使其中的白色状物体完全混悬。加入2.5μl Mg+(280nM)，混匀。反应开始启动。实验中使用的扩增条件：扩增温度38℃，扩增时间为15min。待反应完成后进行琼脂糖(1.5％)电泳检测。

市售五指毛桃药材样品的RPA真伪鉴定的电泳检测如附图3.结果显示产自5个不同地区的10份药材全部为正品药材。这说明利用本实验所设计的RPA特异性引物及对扩增条件的优化，采用RPA技术并结合DNA快速提取法可实现中药材的快速(20min)鉴定。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 五指毛桃的RPA快速鉴定方法及鉴定用RPA引物

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tcaaggaaag acaacgagac gatcccagcc 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgactacctg ttgccaagac gacgtgacag 30

Claims (9)

1.一种五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物，其序列为

上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2

扩增产物片段大小为412bp。

2.一种五指毛桃鉴定方法，其包括如下步骤：

将待测样品以五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物进行重组酶聚合酶扩增，检测扩增产物；

所述五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物，其序列为上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2。

3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，待测样品的制备方法为粉碎样品后加入提取缓冲液混匀；煮沸后取出，加入0.1mol/L Tris–HCl，离心后取上清得到待测样品。

4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，扩增反应的温度为27℃-52℃。

5.根据权利要求4所述的鉴定方法，其中，扩增反应的温度为37℃-42℃。

6.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，扩增反应的时间为15分钟以上。

7.根据权利要求2所述的鉴定方法，其中，待测样品的临界最低浓度为10^-2ng/μL。

8.一种检测五指毛桃的试剂盒，其包含五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物，所述五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物序列为上游引物RPA-ITS-F:5'-TCAAGGAAAGACAACGAGACGATCCCAGCC-3'SEQ ID No.1

下游引物RPA-ITS-R:5'-CGACTACCTGTTGCCAAGACGACGTGACAG-3'SEQ ID No.2。

9.权利要求1所述的五指毛桃鉴定的RPA特异性引物组合物在制备鉴定五指毛桃的试剂盒中的用途。

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