CN103305593A

CN103305593A - 一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN103305593A
Application number: CN201210058670XA
Authority: CN
Inventors: 张长明; 于明辉; 方亮; 居金良
Original assignee: SHANGHAI RENDU BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: Shanghai Rendu Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2012-03-06
Filing date: 2012-03-06
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2032-03-06
Also published as: CN103305593B

Abstract

本发明涉及一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒，特别是涉及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙门氏菌(Sal.spp.)进行检测的试剂盒。本发明的检测试剂盒特异性高、灵敏度高，且扩增产物RNA在自然环境下易于降解而污染低。通过本发明的试剂盒可实现对食品等样品中沙门氏菌的检测。

Description

一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA及恒温核酸同步放大检测技术(SAT)对沙门氏菌(Sal.spp.)进行检测的试剂盒。通过本发明的试剂盒可实现对食品等样品中沙门氏菌的检测。

背景技术

沙门氏菌(Sal.spp.)是一大群寄生于人类和动物肠道内，生化反应和抗原构造相似的革兰氏阴性杆菌的统称，目前已发现的有近一千种，大多数仅能引起家畜、鼠类和禽类等动物的疾病，但有时也可污染人类的食物而引起食物中毒。

由沙门氏菌引起的人类疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒，另一类是急性肠胃炎。鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠炎沙门氏菌等是污染动物性产品，进而引起人类沙门氏菌食物中毒的主要致病菌。沙门氏菌是引起人类食物中毒的主要病原菌之一，在美国，每年大约报告40000例沙门氏菌感染病例，实际的感染人数可能要达20倍以上，因为许多轻型病人可能未确诊，据不完全统计，每年大约有1000人死于急性沙门氏菌感染。我国有些省、市该菌引起的食物中毒占据榜首。2009年8月，四川会东，由于食用了沙门氏菌污染的食物引起217人先后中毒。

目前常用的沙门氏菌检测方法包括：1)传统的培养方法。总体可分为4个阶段或步骤。预增菌，选择性增菌，分离，生化鉴定。需要4～7天，才能得出明确的诊断结果。2)免疫标记技术。利用抗原抗体的特异性反应，并结合一些生物化学或物理学方法进行检测，但该方法的灵敏度和特异性均较差。3)分子生物学检测方法。目前有PCR技术，实时荧光定量PCR和LAMP方法。以上几种方法易引起扩增物的污染，常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，并且不能区分活菌和死菌，阻碍了其大规模推广使用。

核酸恒温扩增技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术，其特点为扩增反应的全过程均在单一温度，反应时间大大缩短。而以RNA为模板快速扩增，产物为RNA的恒温扩增技术尤其适合RNA检测，且不易污染(扩增产物RNA在自然环境下易于降解)，满足沙门氏菌快速检测与监测工作的需要。本公司已申请了专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)；在此两项技术的基础上，本发明沙门氏菌核酸检测试剂盒采用的是SAT技术，核酸扩增使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现，反转录酶用于产生靶标核酸(RNA)的一个DNA拷贝，T7 RNA聚合酶从DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由检测仪器捕获。

在使用已知的磁珠-RNA富集技术和SAT技术检测临床样本中某特定靶核酸的实践中，为了减少和避免检测结果的假阴性或假阳性，提高检测的准确性，一个关键性的技术环节是如何基于已知的靶多核苷酸序列设计并制备适当的捕获探针、引物和单链核苷酸探针。本发明人将磁珠-RNA富集技术和SAT技术应用于沙门技术的检测，成功完成了本发明。

发明内容

本发明涉及一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒，特别是涉及以磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术早期、快速诊断食品等样品中沙门氏菌存在的试剂盒。

因此，本发明的目的是提供一种使用磁珠-RNA富集技术和SAT恒温扩增检测技术来定性检测样品中沙门氏菌的试剂盒，特别是涉及沙门氏菌的早期感染在实验室诊断中的应用。其基本原理为：首先由捕获探针对靶核酸进行捕获；然后利用带T7启动子的下游引物、特异上游引物和特异单链核酸探针，使用M-MLV反转录酶和T7 RNA多聚酶来同时实现核酸扩增，带有荧光标记的优化探针和扩增后产生的RNA拷贝特异结合，从而产生荧光，该荧光信号可由荧光检测仪器捕获。

本发明所提供利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒包括：(1)分别装有裂解液、核酸提取液、洗涤液、Sal.spp.反应液、Sal.spp.检测液、SAT酶液、Sal.spp.内标、Sal.spp.阳性对照、Sal.spp.阴性对照并加盖密封的多个试剂瓶或管和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒。

根据本发明的一个优选实施方案，核酸提取液中用于靶核酸捕获的探针序列为：SEQ IDNO 1：5’-GCCAGCTGGTATCTTCGACTGACTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。

根据本发明的另一个优选实施方案，Sal.spp.检测液中包含上游引物、5’端带有T7启动子序列的下游引物、两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸探针。Sal.spp.检测液中用于靶核酸扩增的上游引物和5’端带有T7启动子序列下游引物的序列分别为：

SEQ I D NO2：5’-GGGAGAAGGCACGCTGAC-3’，

SEQ I D NO3：5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGCCAGCTGGTATCTTCGACTGACTTCAG-3’。

根据本发明的另一个优选实施方案，Sal.spp.检测液中所使用的检测靶核酸的单链核酸探针和检测内标的单链核酸探针序列分别为：

SEQ ID NO4：5’-CCGAGAAGUGAUUUACUCGG-3’，其中5’端为FAM标记，3’端为DABCYL标记；

SEQ ID NO5：5’-CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3’，其中5’端为HEX标记，3’端为DABCYL标记。

根据本发明的另一个优选实施方案，本发明采用的内标为竞争性内标，即与检测靶标一样拥有相同的引物结合区，但是引物间隔区的核酸序列或排列不同，使其不能与检测探针结合，但能与内标探针结合，可通过靶标模板定点突变构建获得，内标的序列如下：

SEQ ID NO6：

5’-UCAGGUAACACGAAAUCGUACCCCAAACCGACACAGGUGGUCAGGUAGAGAAUACCAAGGCGCUUGAGAGAACUCG GGUGAAGGAACUAGGCAAAAUGGUGCCGUAACUUCGGGAGAAGGCACGCUGACACGUAGGUUGGAGCGUGGUGAGCUGGAGCUGAAGUCAGUCGAAGAUACCAGCUGGCUGCAACUGUUUAUUAAAAACACAGCACUGUGCAAACACGAAAGUGGACGUAUACGGUGUGACGCCUGCCCGGUGCCGGAAGGUUAAUUGAUGGGGUCAGCGUAAGCGAAGCUCCUGAUCGAAGCCCCGGUAAACGGCGGCCGUAACUAUAACGGUCCUAAGGU-3’。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中裂解液为含有50mM Tris(pH7.0)，0.1％(V/V)SDS，1％(V/V)Triton X-100，0.1％(V/V)NP-40的溶液。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中核酸提取液为含有250mg/mL磁珠和0.25μM捕获探针(TCO)的溶液。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中洗涤液为含有150mM NaCl的溶液。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中Sal.spp.反应液为含有25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5％(V/V)甘油的溶液。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中Sal.spp.检测液为含有0.27μM上游引物、0.27μM下游引物、0.18μM单链靶核酸检测探针和0.18μM单链内标检测探针的溶液。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中SAT酶液为含有2000U M-MLV反转录酶、2000UT7 RNA聚合酶，20mM Tris，0.1％(V/V)Triton X-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50％(V/V)甘油。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中Sal.spp.内标为含有SEQ.ID.NO6核酸序列的体外转录RNA稀释物，浓度为5×10⁷copies/mL。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中Sal.spp.阳性对照为含有沙门氏菌23S rRNA部分基因的体外转录RNA稀释物，浓度为1×10⁷copies/mL。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中用于SAT扩增的最佳温度和时间为：42℃，40min，每一分钟检测一次荧光。

根据本发明的另一个优选实施方案，其中Sal.spp.阴性对照为生理盐水和裂解液1∶1混合的溶液。

本发明提供的RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒可以检测出沙门氏菌的最低浓度为200CFU/mL，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。

本发明针对沙门氏菌23S rRNA的保守基因片段设计特异的引物和探针，可以检测出沙门氏菌，但不能检测出非沙门氏菌的病原体，说明本试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒可以检测食品等样品中的沙门氏菌；可为灵敏、快速早期诊断沙门氏菌感染提供可靠的实验证据。

附图说明

图1显示灵敏度的检测图，将浓度为2×10⁶CFU/mL的阳性参考品，按10倍梯度稀释进行检测。当阳性参考品的浓度为200CFU/mL的时候，检测dt值为14.5，即检测下限灵敏度可以达到200CFU/mL。

图2显示阴性参考品的检测图，6个阴性参考品的扩增曲线平直且与基线无交叉，可明确判定为阴性。6例阴性参考品包括金黄色葡萄球菌(SA)、志贺氏菌(SH)、大肠杆菌O157(O157)、单核细胞增生李斯特氏菌(Lm)、霍乱弧菌(VC)、副溶血弧菌(VP)。

图3显示检测活菌与检测死菌的检测图，将2.2×10⁸CFU/mL的沙门氏菌培养液分成A、B两份，B份于121℃高压30分钟进行灭活；然后将上述两份培养液分别10倍梯度稀释，并添加于阴性食品样本中进行检测(模拟活菌、死菌检测)，结果a)活菌检测图可以检测到220CFU/mL，b)死菌检测图检测不到任何信号。

图4显示8例食品样品检测图，a)靶标检测图，b)内标检测图，其中4例样本有扩增曲线，可判定为阳性。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)检测试剂的研制

1、捕获探针(TCO)、引物和靶核酸检测探针的设计：通过对Genbank数据库已有的沙门氏菌核酸序列及国内外已发表文献中报导的核酸序列进行序列比对分析，以沙门氏菌的23SrRNA的保守基因片段为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段设计引物和探针。

2、内标检测探针的设计：依照竞争性内标探针要与检测探针GC含量相同，Tm类似的原则，设计与靶标检测探针序列完全不同，且荧光标记也不同的内标探针。

3、内标的构建：根据内标探针的序列信息，通过靶标模板定点突变构建竞争性内标模板，即将靶标模板中靶标探针的结合区替换成内标探针结合的区域，其余位置序列不变。

4、样本的选择：根据国内外文献报道表明，可以选择食品等样品。

5、提取体系和反应体系的建立与优化：

本发明的提取体系和反应体系参照专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)，除了捕获探针(TCO)、引物和检测探针序列、浓度及反应时间。因此本发明主要是对捕获探针(TCO)、引物和检测探针进行筛选，并对反应时间进行确定。

样本的准备：以培养和测序鉴定为阳性的沙门氏菌做为阳性参考品；以金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌作为阴性参考品。分别用TRIZOL提取上述阳性参考品和阴性参考品的RNA待用。

引物、靶核酸检测探针的筛选：以上述1中设计的多组引物、靶核酸检测探针分别检测上述的阳性参考品RNA与阴性参考品RNA，经过反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物和靶核酸检测探针(如序列表中的SEQ ID NO：2～SEQ ID NO：4)。

内标检测探针的筛选：根据上述筛选出的最佳靶核酸检测探针序列信息，设计多组内标检测探针，同时根据所设计的内标检测探针信息，按上述3所述方法，构建相对应的内标。将多组内标探针及其相对应的内标分别加入上述筛选出来的最佳引物、靶核酸检测探针中，检测上述的阳性参考品RNA与阴性参考品RNA，经过反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳内标检测探针和内标(如序列表中的SEQ ID NO：5～SEQ ID NO：6)。

捕获探针(TCO)的筛选：以上述1中设计的多组捕获探针(TCO)对上述阳性参考品和内标进行提取，然后将提取产物用上述筛选出的最佳引物、靶核酸检测探针、内标检测探针进行进行检测，经过反复试验，筛选出灵敏度和重复性好的最佳捕获探针(TCO)。引物、靶核酸检测探针和内标检测探针的浓度优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1μM至1μM浓度的引物和从0.05μM至0.5μM浓度梯度的靶核酸检测探针和内标检测探针进行SAT反应，经过多次重复试验，最终确定最佳的上游引物浓度为0.27μM、下游引物浓度为0.27μM，靶标检测探针浓度为0.18μM，内标检测探针为0.18μM。

捕获探针(TCO)浓度的优化：在提取体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1μM至10μM浓度梯度的TCO进行靶核酸和内标提取，然后将提取产物用上述筛选好的引物、靶核酸检测探针和内标检测探针进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定最佳的TCO浓度为0.25μM。

内标浓度的优化：在提取体系和反应体系中各组分不变的情况下，分别使用从5×10⁵copies/mL至5×10¹⁰copies/mL浓度梯度的内标RNA进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定最佳的内标浓度为5×10⁷copies/mL。

反应液中各组分浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，参照专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)中反应液各组分的浓度范围进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定反应液中各组分最佳的浓度组合为：25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5％(V/V)甘油。

SAT酶液中各组分浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，参照专利核酸恒温同步放大检测方法(Simultaneous Amplification and Testing，SAT)(申请号：200810111479.0)中SAT酶液各组分的浓度范围进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定SAT酶液中各组分最佳的浓度组合为：2000U M-MLV反转录酶、2000U T7 RNA聚合酶，20mMTris，0.1％(V/V)Triton X-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50％(V/V)甘油。

裂解液中各组分浓度的优化：在提取体系其他组分不变的情况下，参照专利磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)进行RNA提取，然后将提取后的RNA进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定裂解液中各组分最佳浓度组合为：50mMTris(pH7.0)，0.1％(V/V)SDS，1％(V/V)Triton X-100，0.1％(V/V)NP-40。

核酸提取液体中磁珠浓度的优化：在提取体系其他组分不变的情况下，参照专利磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)进行RNA提取，然后将提取后的RNA进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定磁珠的最佳浓度为250mg/mL。洗涤液中各组分浓度的优化：在提取体系其他组分不变的情况下，参照专利磁珠-RNA富集技术提取纯化靶标RNA的方法(申请号：200810111478.6)进行RNA提取，然后将提取后的RNA 进行SAT检测，经过多次重复试验，最终确定洗涤液中组分浓度为：150mM NaCl。

6、反应时间的优化：根据扩增靶核酸的长度及二级结构，对反应时间进行优化，经过多次重复试验，最终确定最佳反应时间为42℃，40min，每一分钟检测一次荧光。

7、灵敏度实验：

测定浓度为2×10⁶CFU/mL的沙门氏菌培养物，10倍梯度稀释到20CFU/mL作为沙门氏菌线性灵敏度参考品，检测结果表明，本试剂盒的灵敏度为200CFU/mL。

8、样本检测：

以食品样品作为待检测样品，经上述优化建立的核酸提取体系和扩增体系进行检测，结果表明本试剂盒可以很灵敏的检测样品中的沙门氏菌。

实施例2：沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒(RNA恒温扩增)及其使用

1、制备包括下列组成组分的试剂盒：

试剂盒分为2～30℃储存的A盒(标本处理单元)和-15～-35℃储存的B盒(核酸扩增检测单元)。

A盒：裂解液(10ml/瓶)1瓶，核酸提取液(1ml/管)2管、洗涤液(40ml/瓶)1瓶。

裂解液：含有50mM Tris(pH7.0)，0.1％(V/V)SDS，1％(V/V)Triton X-100，0.1％(V/V)NP-40的溶液。

核酸提取液：含有250mg/mL磁珠和0.25μM捕获探针(TCO)的溶液。

洗涤液：含有150mM NaCl的溶液。

B盒：Sal.spp.反应液(0.8ml/管)1管、Sal.spp.检测液(0.05ml/管)1管、SAT酶液(0.2ml/管)1管、Sal.spp.内标(0.05ml/管)1管、Sal.spp.阳性对照(0.05ml/管)1管、Sal.spp.阴性(0.05ml/管)1管。

Sal.spp.反应液：含有25mM Tris，20mM KCl，10mM MgCl₂，5mM NTPs，1mM dNTPs，5％(V/V)甘油的溶液。

Sal.spp.检测液：含有0.27μM上游引物、0.27μM下游引物、0.18μM单链靶核酸检测探针和0.18μM单链内标检测探针的溶液。

SAT酶液：含有2000U M-MLV反转录酶、2000U T7 RNA聚合酶，20mM Tris，0.1％(V/V)TritonX-100，30mM KCl，0.01mM EDTA，0.1mM DTT，50％(V/V)甘油。

Sal.spp.内标：含有SEQ.ID.NO6核酸序列的体外转录RNA稀释物，浓度为5×10⁷copies/mL。

Sal.spp.阳性对照：含有沙门氏菌23S rRNA部分基因的体外转录RNA稀释物，浓度为1×10⁷copies/mL。

Sal.spp.阴性：为生理盐水和裂解液1∶1混合的溶液。

2、样品采集、运送和保存

(1)样品采集，预处理

处理的方法如下：食品样品：称取25g(mL)样品装入盛有225mL营养肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，不需要均质，震荡混匀。如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min，或2℃～5℃不超过18h解冻。

(2)增菌和保存：

直接将均质袋置36℃±1℃培养6～8h。取上清立即用于测试，也可保存于-20℃待测，保存期为4个月；长期保存，请置于-70℃。

(3)样本运输

0～8℃运输。

3、检测步骤

(1)核酸提取

内标：取400μl裂解液，加入10μl Sal.spp.内标，混匀备用。

阳性对照：取200μl生理盐水，然后加入10μl Sal.spp.阳性对照品，混匀备用。

阴性对照：取200μl生理盐水，然后加入10μl Sal.spp.阴性对照品，混匀备用。

使用洁净Tip头分别吸取200μl待测样品(不足200μl用生理盐水补足)、阳性对照和阴性对照，加入样品处理管。

每管分别加入200μl裂解液和100μl核酸提取液(用前混匀)，10μl上述准备的内标，关盖震荡30秒；置于60℃保温5分钟；然后室温放置10分钟。

将样品处理管置于磁珠分离装置上，静置5分钟(如果在磁珠吸附过程中有个别磁珠难以吸附至管壁则应适当延长吸附时间)。

待磁珠吸附于管壁后，保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。

用洗涤液(洗涤液如果有白色絮状沉淀物，用之前应先42℃加热，直至澄清)洗涤两次，每次加入1ml洗涤液后取下样品处理管震荡30秒后置磁珠分离装置上，静置5分钟；保持样品处理管于磁珠分离装置上，吸弃液体，保留磁珠。

将样品处理管移离磁珠分离装置，管中的磁珠-核酸复合物备用(此步应清晰可见磁珠)。

向每个样品处理管中加入40μl扩增检测液(40μl Sal.spp.反应液+2.5μl Sal.spp.检测液)洗涤磁珠。

(2)SAT扩增

从震荡混匀后的上述扩增检测液中取30μl扩增检测液(包含磁珠)至洁净微量反应管，60℃保温10分钟，42℃保温5分钟；同时将SAT酶液也预热到42℃。

向微量反应管中加入10μl已预热的SAT酶液(加样tip头不要接触微量反应管，如有接触请务必更换tip头)，加酶后盖上管盖1200rpm震荡15秒钟混匀。

将微量反应管快速转至合适的恒温荧光检测仪器，42℃反应40分钟，设定每1分钟检测一次荧光，共检测40次。

反应结束后，直接将微量反应管取出浸泡于10％84消毒液中，取微量反应管应小心操作，严禁打开反应管(防止污染反应区)！实验结束后用10％84消毒液清洁工作区及用具，最后用清水擦拭干净。

(3)结果与分析

反应结束后保存检测数据文件。

阈值设定：以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点。读取dt值，dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数(与一般实时荧光PCR实验结果的ct值类似)。

阳性结果判断：

F1通道：dt≤35的样本为阳性，35＜dt＜40的样本建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性。

阴性结果判断：

F1通道：dt无数值或为40，同时F2通道：dt≤35。

如果标本F1通道为dt无数值或为40，F2通道也为dt无数值或为40，则说明反应可能受到抑制，此标本结果无效，建议重新检测。

实施例3：检测沙门氏菌活菌与死菌

沙门氏菌培养液来自上海出入境检验检疫局提供。将2.2×10⁸CFU/mL的沙门氏菌培养液分成A、B两份，B份于121℃高压30分钟进行灭活；然后将上述两份培养液分别10倍梯度稀释，并添加于阴性食品样本中进行检测(模拟活菌、死菌检测)。标本的核酸提取、SAT扩增检测及判定参照实施例2，所使用的荧光PCR仪为ABI7500 PCR仪。检测结果见图3，从图上可见，活菌可以检测到220CFU/mL，死菌检测不到任何信号，即本发明可以区分“活菌”与“死菌”。

Claims

1.一种利用RNA恒温扩增的沙门氏菌(Sal.spp.)核酸检测试剂盒，试剂盒包括：(1)分别装有裂解液、核酸提取液、洗涤液、Sal.spp.反应液、Sal.spp.检测液、SAT酶液、Sal.spp.内标、Sal.spp.阳性对照、Sal.spp.阴性对照并加盖密封的多个试剂瓶或管，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或者管的包装盒，其中所述的核酸提取液包含磁珠、捕获探针(TCO)，其特征在于捕获探针(TCO)序列为：

5’-GCCAGCTGGTATCTTCGACTGACTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3’。

2.根据权利要求1的试剂盒，所述的Sal.spp.检测液包含上游引物、5’端带有T7启动子序列的下游引物、两端分别共价标记有荧光染料和淬灭剂的单链核酸探针，其特征还在于Sal.spp.检测液中上游引物序列为：5’-GGGAGAAGGCACGCTGAC-3’，下游引物的序列为：

5’-AATTTAATACGACTCACTATAGGGAGACAGCCAGCTGGTATCTTCGACTGACTTCAG-3’。

3.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所述的Sal.spp.检测液中用于检测靶核酸的单链核酸探针序列为：5’-CCGAGAAGUGAUUUACUCGG-3’，其中5’端为FAM标记，3’端为DABCYL标记，用于检测内标的单链核酸探针序列为：5’-CGCUGGAGCGUGGUGAGCAGCG-3’，其中5’端为HEX标记，3’端为DABCYL标记。

4.根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于所述的Sal.spp.内标序列为：

5’-UCAGGUAACACGAAAUCGUACCCCAAACCGACACAGGUGGUCAGGUAGAGAAUACCAAGGCGCUUGAGAGAACUCGGGUGAAGGAACUAGGCAAAAUGGUGCCGUAACUUCGGGAGAAGGCACGCUGACACGUAGGUUGGAGCGUGGUGAGCUGGAGCUGAAGUCAGUCGAAGAUACCAGCUGGCUGCAACUGUUUAUUAAAAACACAGCACUGUGCAAACACGAAAGUGGACGUAUACGGUGUGACGCCUGCCCGGUGCCGGAAGGUUAAUUGAUGGGGUCAGCGUAAGCGAAGCUCCUGAUCGAAGCCCCGGUAAACGGCGGCCGUAACUAUAACGGUCCUAAGGU-3’。