CN101358235A - 副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法，试剂盒包括引物混合液，其序列为外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；内引物1：cy3－CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；内引物2：ACACCAACACGTCGCAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；Bst DNA聚合酶、蛋白酶K、RNA酶、溶菌酶溶液、LAMP反应缓冲液、磷酸缓冲液、通透性处理试剂、乙醇溶液、复染剂、阳性对照。利用该试剂盒通过副溶血弧菌菌体固定处理、细胞通透性处理、恒温基因扩增反应、判断反应产物结果实现对副溶血弧菌高特异性、快速、高效、高灵敏度、简便的原位检测。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测试剂与使用方法，具体涉及一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法。
背景技术
副溶血性弧菌是一种嗜盐性细菌。人由于生吃或食用未煮熟的海产品常引起食源性感染，导致急性胃肠炎。因此，需要建立一种安全可靠、简便快速的检测方法来保证食品的安全。常规检测副溶血性弧菌的方法大多要经过增菌、选择性培养、生化鉴定和血清学反应等过程，操作繁琐、耗时长、检出率低，不利于及时诊断和流行病学溯源，费时而且费力，已经不能满足食品生产的控制要求。
近年来，有大量的报道证实基于PCR的方法已经成功用于检测副溶血弧菌，PCR方法在操作时间上以及检测的特异性和灵敏度方面较常规方法有较大提高，但是，PCR方法必须有精密的温度循环装置，而且它的检测时间也还是比较长(4～8h)，并且反应过程很容易受污染物的影响，从而使得这种方法不能满足实地检测的需要。因此，需要开发一种灵敏度高并且反应迅速的方法，在一定程度上可以取代PCR检测方法。除了PCR方法以外，还有其他核酸扩增方法，比如核酸序列扩增法(NASBA)、自序列复制法(3SR)和链置换复制法(SDA)。这三种方法的检测水平都不少于10个拷贝，耗时1h左右就可以将目标核酸扩增到相似的范围内，尽管如此，它们对目标序列的扩增特异性不强，使得扩增后还需要详尽的实验操作手段来检测扩增产物。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以，将生物技术发展的最新成果应用于病原微生物检测，具有重要意义。
DNA环介导恒温核酸扩增技术(loop-mediated isothermal amplification of DNA，，LAMP)克服以往基因扩增方法的不足，在等温条件下能够特异性、高效、快速地进行核酸的扩增，具有很多的优越性，见文献Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，Yonekawa T，Watanabe K，Amino N，Hase T.Loop-mediated isothermal amplification ofDNA，Nucleic Acids Res.2000 Jun 15；28(12)：E63.。该方法通常是按如下步骤进行：步骤一、对被检标本进行预处理，快速提取被检标本的DNA或RNA；步骤二、特异性引物的制备：确定待测标本的靶基因后，取得特异性引物2对，内引物和外引物各一对；步骤三、进行环介导等温扩增技术(LAMP)反应：将经前处理的样品、引物、反应缓冲液与BstDNA聚合酶混合，在63～65℃保温0.5至1.5h进行循环链置换反应；步骤四、分析判断反应产物结果。虽然已公开的LAMP技术具有高灵敏性，能在等温条件下高效地扩增核酸，但是现有技术也有不足之处，主要是：1.特殊引物要求极为苛刻限制该方法的广泛应用；2.需要对细胞或组织破碎以提取DNA或RNA，不能够直接对细胞或组织中的病毒或基因进行定位；3.为了满足扩增所需要的DNA量，必须增殖病原菌的数量；4.仅凭反应生成的乳白色沉淀物判断结果，不够清楚准确，也不易实现反应小型化，限制其进一步发展。为了克服这些缺点有必要对现有的LAMP技术进行改进。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术缺陷，提供一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法。
为达到本发明的目的，采用以下技术方案：
按下列配方制备副溶血弧菌等温基因扩增快速检测试剂盒：
①引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，，引物序列如下：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；
外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
②Bst DNA聚合酶(嗜热脂肪芽胞杆菌DNA酶大片段)：浓度为8U/μl；
③蛋白酶K：浓度为0.1-0.2μg/ml；
④RNA酶：浓度为0.4-0.6mg/ml；
⑤溶菌酶溶液：浓度为0.2-0.4mg/ml；
⑥样品预处理液：pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷盐酸盐)，50mM EDTA(乙二胺四乙酸)；
⑦LAMP反应缓冲液：10mM dNTP(脱氧核糖核苷酸)∶10×ThermoPol(耐热聚合酶)反应缓冲液∶150mMMgSO4∶5mMBetina(甜菜碱)＝8∶5∶2∶10体积；
⑧磷酸缓冲液；
⑨通透性处理试剂1：为3-5％质量的多聚甲醛；
⑩通透性处理试剂2：为0.02-0.04％质量的多聚赖氨酸；
复染剂：荧光染料1-2mg/ml DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐)；
所述的磷酸缓冲液组分为：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4。用上述试剂盒检测副溶血弧菌的方法包括以下步骤：
(1)被检样品的预处理：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；离心，沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3-5％多聚甲醛固定；细胞悬浮液10-40μl滴加到用0.02-0.04％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；
(2)细胞壁通透性处理：将固定好的细胞分别置于30-60％，60-80％，80-100％浓度的乙醇液中各处理1-3min，进行脱水；用0.2-0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8-12min；其中溶菌酶用样品预处理液溶解；然后用0.1-0.2μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min，最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理12-17min；
(3)环介导等温扩增反应；在50-200μlPCR管配置反应体系：加入3-12μl引物混合液，反应缓冲液4.75-19μl，Bst DNA聚合酶0.25-1μl，模板DNA1-4μl，加水至12.5-50μl；将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应1-2h；所用阳性对照：副溶血弧菌基因组DNA；
(4)反应结束后，将玻片置于1-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，无菌水中漂洗，自然干；
(5)将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果；
步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65℃范围。
步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为8-12h。
步骤(1)所述的离心取上清液的转速为1000-2000rpm，时间为1-2min。
步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的转速为10000-15000rpm，时间为1-3min。
步骤(4)所述的漂洗次数为2次以上，优选2次，时间为每次12-15min。
本发明的一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒及使用方法有以下有益效果：
1、高特异性：本发明根据副溶血弧菌tlh基因保守区设计了四条特异性引物：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
应用上述四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99％假阳性率小于1％；
2、无需增菌：检测之前不需要对待检菌进行培养；
3、实现样品原位检测：在不增菌的条件下，直接对样本中的病原菌微生物进行原位基因扩增；
4、快速、高效扩增：扩增在不到2h即可完成，且产率高；
5、灵敏度高：在复杂体系中可检测到单个细胞的靶目标，最低检测极限达到10CFU/ml，标本的检出率达到99％；
6、鉴定简便：通过荧光显微镜观察细胞是否发荧光进行鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤。
具体实施方式
实施例1
按下列配方制备副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒：
引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；
外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；
蛋白酶K：浓度为0.1μg/ml；
RNA酶：浓度为0.4mg/ml；
溶菌酶溶液：浓度为0.2mg/ml；
样品预处理液：pH＝7.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；
LAMP反应缓冲液：80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThemoPol Buffer，20μl 150Mm MgSO4，100μl5mM Betina；
磷酸缓冲液；137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4；
通透性处理试剂1：为3％质量的多聚甲醛；
通透性处理试剂2：为0.02％质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液：为30％体积乙醇、60％体积乙醇、80％体积乙醇；
复染剂：荧光染料1mg/ml DAPI；
阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测：
1、被检样品的菌体固定处理：
(1)取0.5ml细胞悬浮液于离心管中，1000rpm离心2min，取上清；
(2)10000rpm离心3min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3％多聚甲醛固定12h；
(3)细胞悬浮液10μl滴加到用0.02％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。
2、被检样品的细胞壁通透性处理：
(1)将固定好的细胞分别置于30％，60％，80％体积的乙醇液中各处理3min，进行脱水；
(2)用0.2mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞12min；
(3)用0.1μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min；
(4)用0.4mg/ml的RNA酶处理17min，。
3、环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1)在50μl PCR管配置反应体系：加入3μl引物混合液，反应缓冲液4.75μl，Bst DNA聚合酶0.25μl，模板DNA1μl，加水至12.5μl；
(2)将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；
(3)置于63℃恒温反应2h。
4、样品复染：
反应结束后，将玻片置于1mg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂洗两次，每次12min，自然干。
5、分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
实施例2
按下列配方制备副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒：
引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；
外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；
蛋白酶K：浓度为0.1μg/ml；
RNA酶：浓度为0.5mg/ml；
溶菌酶溶液：浓度为0.3mg/ml；
样品预处理液：pH 8.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；
LAMP反应缓冲液：80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThemoPol Buffer，20μl 150Mm MgSO4，100μl5mM Betina；
磷酸缓冲液：137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4；
通透性处理试剂1：为4％质量的多聚甲醛；
通透性处理试剂2：为0.03％质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液：为30％体积乙醇、70％体积乙醇、95％体积乙醇；
复染剂：荧光染料1mg/ml DAPI；
阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测：
1、被检样品的菌体固定处理：
(1)取1ml细胞悬浮液于离心管中，1000rpm离心2min，取上清；
(2)12000rpm离心2min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，4％多聚甲醛固定10h；
(3)细胞悬浮液20μl滴加到用0.03％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。
2、被检样品的细胞壁通透性处理：
(1)将固定好的细胞分别置于30％，70％，95％体积的乙醇液中各处理2min，进行脱水；
(2)用0.3mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞10min；
(3)用0.1μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞5min；
(4)用0.5mg/ml的RNA酶处理15min，。
3、环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1)在50μlPCR管配置反应体系：10pmol/μl四种引物各加1μl，LAMP反应缓冲液12.5μl，BstDNA聚合酶1μl(8U)，加水至25μl；
(2)将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；
(3)置于63℃恒温反应2h。
4、样品复染：
反应结束后，将玻片置于1mg/mlDAPI染料中染色10min，然后在无菌水中漂洗两次，每次15min，自然干。
5、分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
实施例3
引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，引物序列如下：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；
外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；
蛋白酶K：浓度为0.2μg/ml；
RNA酶：浓度为0.6mg/ml；
溶菌酶溶液：浓度为0.4mg/ml；
样品预处理液：pH 9.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；
LAMP反应缓冲液：80μl 10mM dNTP，50μl 10×ThemoPol Buffer，20μl 150Mm MgSO4，100μl5mM Betina；
磷酸缓冲液；137mM NaCl，2.7mM KCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4；
通透性处理试剂1：为5％质量的多聚甲醛；
通透性处理试剂2：为0.04％质量的多聚赖氨酸；
系列浓度乙醇溶液：为60％体积乙醇、80％体积乙醇、100％体积乙醇；
复染剂：荧光染料2mg/ml DAPI；
阳性对照副溶血弧菌基因组DNA。
用上述试剂盒按以下方法对副溶血弧菌进行检测：
1、被检样品的菌体固定处理：
(1)取2ml细胞悬浮液于离心管中，2000rpm离心1min，取上清；
(2)15000rpm离心1min沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，5％多聚甲醛固定8h；
(3)细胞悬浮液40μl滴加到用0.04％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，生物安全柜中自然风干。
2、被检样品的细胞壁通透性处理：
(1)将固定好的细胞分别置于60％，80％，100％体积的乙醇液中各处理1min，进行脱水；
(2)用0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8min；
(3)用0.2μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2min；
(4)用0.6mg/ml的RNA酶处理12min，。
3、环介导等温扩增(LAMP)反应；
(1)在200μlPCR管配置反应体系：加入12μl引物混合液，LAMP反应缓冲液19μl，Bst DNA聚合酶1μl(8U)，模板DNA4μl，加水至50μl；
(2)将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；
(3)置于65℃恒温反应1h。
4、样品复染：
反应结束后，将玻片置于2mg/mlDAPI染料中染色5min，然后在无菌水中漂洗两次，每次15min，自然干。
5、分析判断反应产物结果
将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而荧光激发下看不到的细胞即为阴性结果。
Claims (8)
1、一种副溶血弧菌恒温基因扩增快速检测试剂盒，其特征在于，其试剂包括：
①引物混合液：混合液中四条引物浓度均为10pmol/μl，，引物序列如下：
外引物1：CGCACCAGCTACTCGAAAG；
外引物2：CGGCGAAGAACGTAATGTCT；
内引物1：cy3-CCACCAGTAGCCGTCAATGGTGGVGACCGATTGGGAATGG；
内引物2：ACACCAACACGTCGCAAAACGTGCGTTCTCGTTCGCCAAAT；
②Bst DNA聚合酶：浓度为8U/μl；
③蛋白酶K：浓度为0.1-0.2μg/ml；
④RNA酶：浓度为0.4-0.6mg/ml；
⑤溶菌酶溶液：浓度为0.2-0.4mg/ml；
⑥样品预处理液：pH 7.0-9.0、100mM Tris-HCl，50mM EDTA；
⑦LAMP反应缓冲液：10mM dNTP∶10×ThermoPol反应缓冲液∶150mM MgSO4∶5mMBetina＝8∶5∶2∶10体积；
⑧磷酸缓冲液；
⑨通透性处理试剂1：为3-5％质量的多聚甲醛；
⑩通透性处理试剂2：为0.02-0.04％质量的多聚赖氨酸；
2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的磷酸缓冲液组分为：137mM NaCl，2.7mMKCl，8.1mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4。
3、权利要求1或2所述的试剂盒检测副溶血弧菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)被检样品的预处理：将待检测样品悬浮于磷酸缓冲液中，离心，取上清；离心，沉淀上清中的细胞，然后用磷酸缓冲液冲洗细胞两次，3-5％多聚甲醛固定；细胞悬浮液10-40μl滴加到用0.02-0.04％多聚赖氨酸处理过的玻璃板孔中，风干；
(2)细胞壁通透性处理：将固定好的细胞分别置于30-60％，60-80％，80-100％浓度的乙醇液中各处理1-3min，进行脱水；用0.2-0.4mg/ml浓度的溶菌酶溶液室温下处理细胞8-12min；其中溶菌酶用样品预处理液溶解；然后用0.1-0.2μg/ml的蛋白酶K室温下处理细胞2-5min，最后用0.4-0.6mg/ml的RNA酶处理12-17min；
(3)环介导等温扩增反应；在50-200μlPCR管配置反应体系：加入3-12μl引物混合液，反应缓冲液4.75-19μl，Bst DNA聚合酶0.25-1μl，模板DNA1-4μl，加水至12.5-50μl；将配置好的反应混合液滴加到固定有细胞的玻板孔中，聚酯封层；恒温反应1-2h；
所用阳性对照：副溶血弧菌基因组DNA；
(4)反应结束后，将玻片置于1-2mg/mlDAPI染料中染色5-10min，无菌水中漂洗，自然干；
(5)将干燥的玻片置于荧光显微镜下观察，调整焦距，打开荧光，在视野中看到激发荧光的细胞就是阳性结果，细胞形态以阳性对照为准，反之，紫外光下可以看到而绿色光激发下看不到的细胞即为阴性结果；
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(3)所述的恒温反应温度在63-65℃范围。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的多聚甲醛固定时间为8-12h。
6、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心取上清液的转速为1000-2000rpm，时间为1-2min。
7、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)所述的离心沉淀上清液中细胞的转速为10000-15000rpm，时间为1-3min。
8、根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(4)所述的漂洗次数为2次，每次12-15min。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Open date: 20090204 |