CN103725763A - 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：步骤1）制备反应液；步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测单核细胞增生李斯特氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。

Description

一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
技术领域
 本发明涉及疾病检测技术领域，具体的说，是一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法。
背景技术
单核增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种常见的土壤细菌，它也是某些食物（主要是鲜奶产品）中的一种污染物，能引起严重食物中毒。单核细胞增生李斯特氏菌是一种人畜共患病的病原菌。它能引起败血症、脑膜炎和单核细胞增多。食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。急需特异性和敏感度高的快速诊断试剂。
环介导等温扩增技术是由日本荣研（EIKEN）株式会社开发的高特异性敏感度的核酸检测系统，无须昂贵的设备，已经成为核酸快速检测法的良好手段，本发明结合环介导等温扩增技术，设计针对单核增生李斯特菌特异性基因序列的一对外引物（L-F3和L-B3）和一对内引物（L-FIP和L-BIP）进行环介导等温扩增。
发明内容
本发明公开了一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，提高了它的检测和诊断效率。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X,MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                            400μM
内引物
  L-FIP                                  40umol
  L-BIP                                  40umol
外引物
      L-F3                                    5umol
      L-B3                                    5umol
标本核酸                                      20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
进一步的，所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
进一步的，所述外引物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。  
进一步的，所述内引物L-FIP的序列为
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCC。
进一步的，所述内引物L-BIP的序列为TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
本发明的有益效果是：
    本发明通过配制反应液，设计引物序列，能快速、准确的检测单核细胞增生李斯特氏菌，并及时采取相应的措施，减少了疾病的发生率。
具体实施方式
下面将结合实施例，来详细说明本发明。
 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X,MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                            400μM
内引物
  L-FIP                                  40umol
  L-BIP                                  40umol
外引物
      L-F3                                    5umol
      L-B3                                    5umol
标本核酸                                      20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul。
选取单核细胞增生李斯特氏菌特异性基因hly基因（基因序列来源美国国立生物技术信息中心-NCBI），设计引物序列。所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT，所述外引物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT，所述内引物L-FIP的序列为
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCC，所述内引物L-BIP的序列为TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
进一步的，所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌2株，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。结果显示：2株单核细胞增生李斯特氏菌每次均为阳性，其余菌种为阴性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<110>  苏州四同医药科技有限公司
 
<120>  一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法
 
 
<160>  4   
 
 
<210>  1
<211>  25
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  1
1 GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT
                              
 
<210>  2
<211>  22
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  2 
1 GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT
 
      
<210>  3
<211>  46
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  3 
1 GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCC
 
 
<210>  4
<211>  47
<212>  DNA
<213>  人工序列
 
<400>  4 
1 TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC  

Claims (6)

1. 一种高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法,其特征在于，包括以下步骤：
步骤1）制备反应液
反应液组成及含量为
8u/ul Bst核酸聚合酶                         8u
10X耐热聚合酶反应缓冲液                 1X,MgSO4 2mM
4M 甜菜碱                                    1M
10mM d-NTP混合液                            400μM
内引物
  L-FIP                                  40umol
  L-BIP                                  40umol
外引物
      L-F3                                    5umol
      L-B3                                    5umol
标本核酸                                      20ng
添加焦碳酸二乙酯处理水至总量达到25ul;
步骤2）将上述反应液放入63℃烘箱进行反应30-60min，浑浊为阳性;
步骤3）提取临床分离单核细胞增生李斯特氏菌，以及若干临床分离金黄色葡萄球菌、头皮葡萄球菌、人型葡萄球菌、表皮葡萄球菌、草绿色链球菌、大肠杆菌、克雷伯菌的核酸，多次进行反应，观察它们的阴阳性。
2.根据权利要求1所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：所述外引物L-F3的序列为GCTTTTACTTTAGTACTATGGGAAT。
3.根据权利要求2所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：所述外引物L-B3的序列为GGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT。
4.根据权利要求3所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：所述内引物L-FIP的序列为
GGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCT-ATTTCAAATAAACTTGACGGCC。
5.根据权利要求4所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：所述内引物L-BIP的序列为TGCAACTGCTCTTTAGTAACAGC-CTATAACGTGAATGTTAATGAACC。
6.根据权利要求5所述的高特异高敏感检测单核细胞增生李斯特氏菌的方法，其特征在于：所述反应液中加入荧光显示物质溴化乙锭、钙黄绿素进行实时检查。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593866A (zh) * 2018-06-20 2019-04-09 齐鲁工业大学 环介导等温扩增单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260424A (zh) * 2008-04-25 2008-09-10 青岛科技大学 环介导等温扩增-纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法
CN101307351A (zh) * 2008-04-29 2008-11-19 广州华峰生物科技有限公司 基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
CN101368203A (zh) * 2008-09-16 2009-02-18 中国计量学院 单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN101748201A (zh) * 2008-11-28 2010-06-23 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌
CN101880711A (zh) * 2010-03-11 2010-11-10 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101260424A (zh) * 2008-04-25 2008-09-10 青岛科技大学 环介导等温扩增-纳米硫化镉标记电化学检测单增李斯特菌的方法
CN101307351A (zh) * 2008-04-29 2008-11-19 广州华峰生物科技有限公司 基于环介导等温扩增技术的单核增生李斯特菌基因快速诊断试剂盒及其检测方法
CN101368203A (zh) * 2008-09-16 2009-02-18 中国计量学院 单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
CN101748201A (zh) * 2008-11-28 2010-06-23 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心 环介导恒温扩增方法检测单核细胞增生李斯特菌
CN101880711A (zh) * 2010-03-11 2010-11-10 中华人民共和国徐州出入境检验检疫局 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、志贺氏菌及单核细胞增生李斯特菌核酸筛查方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109593866A (zh) * 2018-06-20 2019-04-09 齐鲁工业大学 环介导等温扩增单增李斯特菌的引物、试剂盒及检测方法

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