CN111394508A - 一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用 - Google Patents

一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用。利用野生型与突变型辣椒材料构建了F2群体。利用BSA群体定位的方法获得与辣椒小果基因紧密连锁的染色体区域，并在候选区间内开发分子标记。根据单碱基突变设计了1个KASP分子标记，利用该标记对F2群体中的96个单株进行基因型鉴定，符合率达到100％。研究结果不仅有助于辣椒果实大小的鉴别及辅助育种，且为小果基因的图位克隆及解析果实大小发育的分子机理提供了基础，具有广泛的推广价值。

Description

一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用
技术领域
本发明属于辣椒育种分子生物学领域，涉及控制辣椒(Capsicum annuum L)果实大小的基因连锁分子标记及该分子标记在辣椒果重鉴定和育种中的应用。
背景技术
植物果实大小是影响产量的重要因素，在自然界，被子植物的果实形态(大小、形状、颜色等)和果实类型(果实发育部位、果皮质地、形成果实的花及子房数目等)具有很强的多样性，是自然选择和人工驯化的结果。影响果实大小的因素十分复杂，目前在水稻、小麦、玉米、番茄等农作物上已开展较多研究，然而调控机制仍不全面，这也是目前生物学研究的核心问题之一，有助于开展作物分子精细育种，提高产量和品质。目前在水稻中鉴定到的与粒重相关的基因主要有GS3、GS5、GL3、GL3.1、GW2、GW8、GIF1、GW5/qSW5、TGW6等，并且在小麦中的同源基因TaGW2有三个直系同源基因TaGW2-6A、TaGW2-6B、TaGW2-6D对籽宽和千粒重也有不同的功能，共同调控小麦籽粒的发育，玉米中也有相应的同源基因被证实有相似的功能。获知这些关键基因对籽粒发育的具体作用以及调控机制对于基因编辑定向育种十分关键。
辣椒(Capsicum annuum L.)茄科、辣椒属一年或有限多年生草本植物，产于中南美洲热带地区。近年来我国辣椒年播种面积在150万～200万hm2，目前已经占全国蔬菜总播种面积的8％～10％，整个蔬菜生产中具有重要地位。辣椒果实具有广泛的应用价值，不但为人类提供所必需的维生素、矿物质和营养素也可作为药物、天然染料和化妆品等。辣椒基因组内含有大量的重复序列，注释难度很大，也因此其基因定位和功能研究的难度要比一般的模式植物要大。通过开发与辣椒小果基因连锁的分子标记，采用杂交和回交等技术快速的将控制辣椒果重的基因与其他优良性状基因导入到植株中，为选育高质量的新品种提供基因资源。开发与小果基因连锁的分子标记，有利于辣椒果实大小的定向选育，且为克隆辣椒小果基因，研究辣椒果重的分子机制奠定了基础。
发明内容
本发明的首要目的在于针对辣椒果实发育中出现的小果突变现象，提供一种与辣椒小果基因连锁的分子标记PEPER-94。为辣椒果重突变体的筛选以及辣椒果重的定向育种等提供新的途径。其中大果的重量范围为30-40g，小果的重量范围为10-15g。
一种与辣椒小果基因连锁的分子标记，辣椒全基因组7号染色体上13399094位置)C向T的突变。所述的分子标记对应的基因型包括：C:C和C:T为大果的基因型、T:T为小果的基因型。
针对上述辣椒小果突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，
正向引物X：
AAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGC；见SEQ ID No.1所示；
正向引物Y：
AAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGT，见SEQ ID No.2所示；
两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列(LGC公司的FAM或HEX接头序列)
优选：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT，见SEQ ID No.3所示；
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT，见SEQ ID No.4所示。
分别连接不同的荧光接头序列后的引物序列如下：
正向引物PEPER-94X：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGC；见SEQ ID No.5所示；
正向引物PEPER-94Y：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGT，见SEQ ID No.6所示。
反向引物PEPER-94C：AGGATCAAACACACTAA，见SEQ ID No.7所示。
本发明的第二个目的是提供上述分子标记的应用，有利于辣椒果重的选育，且为克隆辣椒小果基因，研究果实变小的分子机制奠定基础。
具体包括：用于鉴定和辅助筛选辣椒果重。
进一步的，用于辣椒果重的鉴定、筛选或者定向育种。
上述分子标记应用时，采用PCR反应进行检测。
分子标记应用时，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到引物PEPER-94X对应的荧光信号，则检测位点为C:C基因型，判定为辣椒大果表型的单株；如果样品PCR产物只检测到引物PEPER-94Y对应的荧光信号，则检测位点为T:T基因型，判定为辣椒小果表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为C:T基因型，判定为辣椒具有大果表型的单株。
分子标记应用时，采用Touchdown PCR，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
本发明利用BSA定位的方法，定位到一个控制辣椒果实大小的基因，并依据该基因的突变位点，开发了与该辣椒小果基因相关联的KASP分子标记。可以直接用于辣椒果重和相对应的基因型的鉴定，进而依赖该分子标记进行辅助育种，能够有效的解决常规育种周期长，易受到环境影响的问题。通过早期利用该分子标记可以快速筛选到满意的植株，有效的减小了种植规模，减少了后期鉴定的工作量。提高了选择的效率和准确性。可以用于各种品种的辣椒鉴定，对研究辣椒果实的分子机制具有重大的意义。因此，本发明在辣椒果实大小育种实践和研究上均具有重要意义。
附图说明
图1为本发明的PEPER-94分子标记在WT(野生型)与MT(突变体)构建的F2群体中进行基因分型的部分结果；
A处表示：PCR产物为正向引物PEPER-94X对应的荧光信号，为大果的纯合单株；
B处表示：PCR产物具有引物PEPER-94X和PEPER-94Y两种荧光信号，为大果的杂合单株；
C处表示：PCR产物为正向引物PEPER-94Y对应荧光信号，为小果的纯合单株。
图2为BSR群体定位的2个亲本：E205(A)，8214(B)。
图3为8214与E205构建群体的BSA定位结果；Chr01-Chr12代表染色体号，辣椒小果基因位于7号染色体，区域大约在9-20M之间。
图4为本发明小果基因突变精细定位。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。本发明中所涉及的辣椒种质均由湖南省蔬菜研究所提供，也可保证对外出售至少20年。
实施例1辣椒小果基因连锁的分子标记BSA分子标记的获得
BSA定位方法
1.群体的构建
利用经过多代自交选育出的骨干辣椒亲本‘8214’(图2B所示)，及小果材料‘E205’为亲本(图2A所示)，将大果‘8214’亲本与小果‘E205’亲本进行杂交得到F1代，F1代自交后获得F2群体。
2.果实大小鉴定
待F2代群体盛果期对果实大小进行观察鉴定，已确定群体内果实大小分型。
3.小果基因初定位
在8214×E205的F2群体中分别选取30个大果植株叶片和30个小果植株的叶片，每个植株叶片等量混合构建大果/小果DNA混池。利用CTAB法提取4个混池总的DNA。利用TruSeq DNA LT Sample Prep Kit(Illumina公司)对4个混池DNA建库，通过IlluminaHiSeq2000平台测序，进行基因组测序，获得的数据利用samtools软件以及自主开发的Perl脚本提取多态性SNP，并且计算隐性池的最大等位基因型频率(SNP-index)，以及该基因型在显性池的频率，并且计算每个SNP位点的欧几里得距离(ED值)。过滤掉两池测序深度都低于10个reads，以及SNP-index都大于0.7的位点，最后对ED值取幂次方后进行线性回归拟合并作图，以所有位点幂次方拟合值的中位值及标准差之和的3倍作为阈值线，高于阈值线的区段作为候选区间，即将控制辣椒果重的基因定位在7号染色体上9-20M的区间内，如图3。Chr01-Chr12代表染色体号，辣椒小果基因定位于7号染色体。
4.小果基因精细定位
通过步骤3获得控制辣椒小果的染色体区域，为了进一步缩小控制果重基因的候选区域，分析区段内的DNA序列变异，开发InDel和KASP标记，利用开发的InDel和KSAP分子标记对F2群体的单株进行基因分型，确定交换单株。基于果实大小的表型调查数据和确定的交换单株的基因型，将小果基因定位在7号染色体的12.9-14M区间(图4)。辣椒7号染色体上13399094位置C向T的突变最终是通过测序获得的。
分子标记应用时，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
针对该突变位点设计的引物如下：
反向引物PEPER-94C：AGGATCAAACACACTAA；
正向引物PEPER-94X：
GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGC；
正向引物PEPER-94Y：
GAAGGTCGGAGTCAACGGATTAAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGT。
本发明引物经过辣椒全基因组序列测序验证，具有专一性。
两个正向引物分别连接不同的荧光接头序列；荧光接头序列为FAM或HEX。
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品PCR产物只检测到引物PEPER-94X对应的荧光信号，则检测位点为C:C基因型，判定为辣椒大果表型的单株；如果样品PCR产物只检测到引物PEPER-94Y对应的荧光信号，则检测位点为T:T基因型，判定为辣椒小果表型的单株；若同时检测到两种荧光信号，则检测位点为C:T基因型，判定为辣椒具有大果表型的单株。
分子标记应用时，采用Touchdown PCR，扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
利用PEPER-94标记对8214与E205构建的F2群体中选取96个单株的叶片进行基因分型验证，出现了3种荧光信号，其中C:C的荧光信号有个44单株，C:T的荧光信号有16个单株，T:T的荧光信号有36个单株。结合表型调查数据发现基因型与果实表型高度一致，符合率达到了100％。以上结果充分说明，PEPER-94标记具有通用性和准确性，可以应用于辣椒植株果实大小的预测、鉴定和筛选。
检测样本为叶片。
表1为PEPER-94标记在8214和E205构建的F2群体中部分单株果实大小类型及基因型
Figure BDA0002506172750000061
Figure BDA0002506172750000071
Figure BDA0002506172750000081
Figure BDA0002506172750000091
Figure BDA0002506172750000101
Figure BDA0002506172750000111
上述鉴定结果表明，在育种中通过分子标记鉴定筛选，保留检测到引物PEPER-94Y对应的C荧光信号的材料，就能够选育出辣椒小果的材料。保留检测到引物PEPER-94X对应的A荧光信号的材料，就能够选育出大果纯合材料。保留检测到B荧光信号(包含前面两种引物对应的荧光信号)的材料，就能够选育出大果的杂合材料，结果见图1。通过前期分子标记的筛选可以减少后期筛选鉴定的工作量，加速育种进程。
序列表
<110> 湖南省蔬菜研究所
<120> 一种与辣椒小果基因连锁的分子标记及应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagtcaattt tgaatgttct tagtgc 26
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aagtcaattt tgaatgttct tagtgt 26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaaggtgacc aagttcatgc t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gaaggtcgga gtcaacggat t 21
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaaggtgacc aagttcatgc taagtcaatt ttgaatgttc ttagtgc 47
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaaggtcgga gtcaacggat taagtcaatt ttgaatgttc ttagtgt 47
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aggatcaaac acactaa 17

Claims (10)

1.一种与辣椒果实大小连锁的分子标记，其特征在于：为辣椒基因组7号染色体上的13399094位置处发生C向T的突变。
2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述的分子标记对应的基因型包括：C:C为表现为大果的基因型，C:T为表现为大果的基因型；T:T为表现为小果的基因型。
3.根据权利要求2所述的分子标记，其特征在于，针对辣椒小果突变设计的引物包括两条正向引物和一条反向引物，
正向引物X：
AAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGC；
正向引物Y：
AAGTCAATTTTGAATGTTCTTAGTGT。
4.根据权利要求3所述的分子标记，其特征在于：两条正向引物分别连接不同的荧光接头序列；
优选：
FAM：GAAGGTGACCAAGTTCATGCT
HEX：GAAGGTCGGAGTCAACGGATT。
5.权利要求1-4任一项所述的分子标记的应用，其特征在于，用于鉴定和辅助筛选辣椒果实大小。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，用于辣椒果实小果突变体鉴定、筛选或者育种。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用PCR反应进行检测。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)以待测样品基因组DNA为模板，利用分子标记的扩增引物进行PCR扩增，获得扩增产物；
(2)对扩增产物进行检测与分析。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，对扩增产物进行荧光检测时，若是C:C基因型，则判定为大果的野生纯合单株；若是T:T基因型，则判定为小果的突变纯合单株；若是C:T基因型，则判定为大果的杂合单株。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用Touchdown PCR；Touchdown PCR扩增程序为：94℃15min；95℃20s；65℃-56℃60s，10个循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；94℃20s；57℃60s，26个循环。
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